ES2911458T3 - Procedimiento para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas - Google Patents

Procedimiento para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas (diana), que comprende las siguientes etapas: a) nueva síntesis de ADN dependiente de la matriz del ácido nucleico diana; b) hibridación de sonda específica de la diana; y c) detección del evento de hibridación; donde en la etapa a) al menos un oligonucleótido 1 marcado por un marcador 1, que es total o parcialmente complementario a la secuencia diana, funciona como un cebador en la nueva síntesis dependiente de la matriz del ácido nucleico diana y en la etapa b) al menos un oligonucleótido 2 marcado por un marcador 2, que está presente en la etapa a) pero no participa en la etapa a) debido a su temperatura de fusión más baja que el oligonucleótido 1, pero que está parcial o completamente hibridado con el producto de nueva síntesis de ADN del oligonucleótido 1 y se utiliza para la hibridación de sonda específica de la diana, caracterizado porque el evento de hibridación se detecta en la cavidad de reacción en la que tiene lugar la reacción de amplificación/hibridación y que los dos marcadores 1 y 2 funcionan como un par FRET, donde la detección tiene lugar como resultado del efecto FRET mediante una detección de punto final.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas
La presente invención se refiere a un procedimiento y un kit de prueba para detectar secuencias de ácido nucleico específicas, que comprenden las etapas de 1. nueva síntesis dependiente de la matriz del ácido nucleico diana, 2. hibridación de sonda específica de diana y 3. detección del evento de hibridación. La reacción de hibridación se detecta fluorométricamente en forma de un par FRET. Además, posteriormente se puede verificar el resultado inmunológicamente. La reacción de detección siempre tiene lugar en el tiempo después de que haya tenido lugar la nueva síntesis dependiente de la matriz.
Estado de la técnica
El diagnóstico genético se ha convertido en un componente indispensable de los diagnósticos de laboratorio médico modernos, los diagnósticos forenses, los diagnósticos de laboratorio veterinario o los diagnósticos alimentarios y ambientales.
El diagnóstico genético se revolucionó con la invención de la tecnología PCR, que permite multiplicar de manera específica, a voluntad, cualquier secuencia de ácido nucleico.
Utilizando PCR, hay una pluralidad de procedimientos que, en combinación con la tecnología PCR, también hacen posible la detección específica de una amplificación que ha tenido lugar. En particular, las especificaciones de los diagnósticos genéticos exactos deben utilizar procedimientos que garanticen que un producto de amplificación producido también corresponde a la secuencia diana a detectar específicamente. El uso generalizado de la visualización de un producto de PCR por medio de electroforesis en gel no es suficiente para este propósito.
Una posibilidad para la detección de ácidos nucleicos específicos que, en principio, es muy rápida y puede realizarse sin grandes esfuerzos experimentales, es la que ofrecen los llamados procedimientos de PCR en tiempo real. En este caso, la reacción de amplificación se acopla directamente a la reacción de detección real.
Un procedimiento ampliamente utilizado para detectar ácidos nucleicos específicos es la tecnología de LightCycler (Roche). Con este fin, Roche desarrolló sondas de hibridación especiales que consisten en dos oligonucleótidos diferentes, cada uno marcado con un solo fluorocromo. El receptor se encuentra en el extremo 3' de una sonda, y el otro oligonucleótido está provisto con un donante en el extremo 5'. Las sondas se seleccionan de tal manera que ambos se unen a la misma cadena de ADN, donde la distancia permitida entre el receptor y el donante es de un máximo de solo 1 a 5 nucleótidos, de modo que puede producirse el llamado efecto FRET. La fluorescencia se mide durante la etapa de anillado, donde solo la luz de esta longitud de onda es detectable siempre que ambas sondas estén unidas al ADN. El punto de fusión de ambas sondas debe ser idéntico en este sistema. Debido al uso de dos sondas de hibridación además de los cebadores utilizados, la especificidad de este sistema de detección es extremadamente alta.
Otra aplicación de PCR en tiempo real para detectar dianas de ácido nucleico específicas se puede llevar a cabo con las llamadas sondas de doble tinte que se han dado a conocer en las patentes estadounidenses n.° 5210015 y n.° 5487972 (sondas TaqMan). Las sondas de doble tinte llevan dos fluorocromos en una sonda. El colorante indicador se encuentra aquí en el extremo 5', y el colorante desactivador de fluorescencia se encuentra en el extremo 3'. Además, un grupo fosfato también puede estar presente en el extremo 3' de la sonda, de modo que la sonda no puede funcionar como un cebador durante la elongación. Mientras la sonda esté intacta, la intensidad luminosa liberada es baja, ya que casi toda la energía luminosa producida después de la excitación del reportero es absorbida y transformada por el desactivador de fluorescencia debido a la proximidad espacial. La luz emitida por el colorante reportero se apaga. Este efecto FRET se retiene incluso después de que la sonda se haya unido a la cadena de ADN complementaria. Durante la fase de elongación, la polimerasa incide en la sonda y la hidroliza. La capacidad de la polimerasa para hidrolizar un oligonucleótido (o una sonda) durante la síntesis de cadenas se denomina actividad de exonucleasa 5' -3'. No todas las polimerasas tienen una actividad de exonucleasa 5'-3' (Taq y Tth polimerasa). Este principio se describió por primera vez para la polimerasa Taq. El principio se llama el principio TaqMan. Después de la hidrólisis de la sonda, el colorante indicador ya no está en proximidad espacial al desactivador de fluorescencia. La fluorescencia emitida ya no es remodelada, y este aumento en la fluorescencia es medido.
También hay otros procedimientos basados en el efecto FRET que detectan tanto la disminución como el aumento de la fluorescencia de la muestra.
En la publicación (JP002001029072AA), los reporteros y desactivadores de fluorescencia se acoplan a los dNTP individuales (desoxirribonucleótidos) añadidos a la reacción. Cuando estos nucleótidos se incorporan en el ácido nucleico amplificado, la fluorescencia de la muestra se reduce por el efecto FRET. La desventaja del procedimiento es la incorporación de los nucleótidos marcados incluso en el caso de mal cebado y en el caso de los dímeros de cebador. Por lo tanto, dicho procedimiento no se puede utilizar para aplicaciones de diagnóstico.
Otras publicaciones se refieren a procedimientos en los que los marcadores de pares FRET no se aplican a un oligonucleótido, sino que se distribuyen sobre varias moléculas de cebador o sonda.
En la publicación para información de solicitud de patente WO 2009/126678 A2, dos sondas de hibridación forman una formación de horquilla a través de la cual los reporteros y los desactivadores de fluorescencia se unen espacialmente.
En la publicación para información de solicitud de patente DE 10250948 A1, las sondas marcadas respectivamente se hibridan entre sí. Si está presente un ácido nucleico diana, una de las sondas puede formar un dúplex con el ácido nucleico diana, como resultado de lo cual se cancela la interacción FRET.
En la publicación para información de solicitud de patente DE 102005000021 A1, dos sondas marcadas forman un tríplex con el ácido nucleico diana, y la fluorescencia se libera por la actividad de la exonucleasa de la polimerasa Taq. En el documento de patente EP 1384789 B1 y una publicación citada en la patente (Bernard, P. S., y col. Anal Biochem 255 (1998) 101-7), en cada caso se utiliza un cebador marcado y una sonda marcada para una observación en tiempo real de la amplificación.
Otra posibilidad para la detección específica de productos de amplificación mediante tecnología de PCR en tiempo real es el uso de colorantes intercalantes (bromuro de etidio, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 o SYBR Green™, etc.). Después de la excitación por luz UV de alta energía, estos colorantes emiten luz en el intervalo de longitud de onda visible de baja energía (fluorescencia). Si el colorante está presente como colorante libre en la mezcla de reacción, la emisión es muy baja. Solo mediante la intercalación del colorante, es decir, mediante la incorporación en el pequeño surco de moléculas de ADN de doble hebra, se incrementa considerablemente la emisión de luz. Los colorantes son económicos y universalmente utilizables, ya que en principio se pueden utilizar para seguir cualquier reacción de PCR en tiempo real. Además, tienen una alta intensidad de señal, ya que cada molécula de ADN se une a varias moléculas de colorante. Sin embargo, las ventajas también resultan en una desventaja extrema de la aplicación: En principio, los colorantes intercalados no pueden distinguir entre el producto correcto y los artefactos de amplificación (como los dímeros de cebador o los productos defectuosos). Los dímeros cebadores resultantes y otros artefactos naturalmente también se unen a los colorantes intercalantes y, por lo tanto, conducen a un aumento inespecífico de la fluorescencia incluso en muestras negativas. Sin embargo, es absolutamente necesaria una clara diferenciación entre eventos o artefactos de amplificación específicos. Sin embargo, para lograr esto, se utiliza un llamado análisis del punto de fusión al final de la reacción real de PCR. La mezcla de reacción se calienta de 50 °C a 95 °C en etapas de 1 grado. En este proceso, la fluorescencia se mide continuamente. El punto en el que el ADN bicatenario se funde se caracteriza por una caída (pico) en la fluorescencia del colorante intercalado, ya que el colorante intercalado se disocia del ADN monocatenario. Si la PCR está configurada de manera óptima, debe esperarse un pico de punto de fusión que converge. Este punto de fusión representa el producto específico que se espera. Los productos de diferentes tamaños y productos de diferente secuencia tienen diferentes puntos de fusión.
Además, también es posible cuantificar las dianas que se detectarán mediante aplicaciones de PCR en tiempo real. Como ya se mencionó, los procedimientos descritos satisfacen la necesidad de detección específica de un producto de amplificación.
Sin embargo, una desventaja importante es que se implementan en plataformas de dispositivos muy costosas, que deben combinar el proceso de amplificación y la detección óptica posterior correspondiente al problema en una solución de hardware. Además, muchos de estos procedimientos de detección descritos siempre se basan en el seguimiento en tiempo real del proceso de amplificación. Con base en esta estrategia, los valores de fluorescencia medidos también se elaboran en el transcurso de la reacción de amplificación. Está claro para el experto en la materia que también debe estar integrado un alto grado de algoritmos de análisis en los sistemas de tiempo real. Esto en última instancia explica el alto desembolso económico que se debe invertir para el uso de los sistemas de PCR en tiempo real. En última instancia, el funcionamiento de dichos sistemas de dispositivos también está vinculado a un alto grado de experiencia.
Además de las detecciones diagnósticas basadas en PCR en tiempo real mostradas, también hay variantes alternativas para la detección específica de ácidos nucleicos.
Los procedimientos más económicos para detectar ácidos nucleicos en este contexto son, por ejemplo, PCR-ELISA.
En este procedimiento, la secuencia de ADN a investigar se amplifica y el fragmento de ADN producido se inmoviliza posteriormente de forma covalente en una fase sólida (por ejemplo, placa o tira de microtitulación), posteriormente se desnaturaliza para formar una única cadena y se hibrida con una sonda específica de secuencia. La unión satisfactoria de la sonda puede hacerse visible mediante una reacción de color mediada por anticuerpos. Otra variante se basa en el hecho de que las sondas se inmovilizan en una fase sólida y, después de que el producto de PCR se ha desnaturalizado, este último se pone en contacto con la sonda inmovilizada. Un evento de hibridación que ha tenido lugar se detecta de forma análoga a la primera variante del procedimiento.
Las PCR-ELISA son en principio fáciles de llevar a cabo, pero comprenden múltiples etapas del procedimiento, de modo que además del tiempo requerido para llevar a cabo la PCR, también se requieren varias horas de tiempo de trabajo para llevar a cabo el procedimiento de detección posterior. Este procedimiento generalmente requiere 8 horas y, por lo tanto, tampoco es adecuado como prueba rápida.
Además, también se requieren algunos dispositivos tales como una estación de control de temperatura, una lavadora o un dispositivo de medición para detectar la señal de hibridación. Además, pueden ser necesarios equipos especiales adicionales o consumibles especiales.
Otros procedimientos sencillos para detectar productos de amplificación se basan en la amplificación de las secuencias diana y la hibridación posterior de productos de amplificación en una membrana. También en este
procedimiento hay varias variantes conocidas por el experto en la materia. Sin embargo, estos procedimientos son de nuevo complicados de llevar a cabo, requieren una pluralidad de etapas del procedimiento a realizar y, por lo tanto, no son adecuados para pruebas rápidas. Esto también se aplica al uso de estrategias de biochip que utilizan la hibridación de productos de PCR con sondas de hibridación para demostrar la especificidad. Estos procedimientos también son complejos y están vinculados a plataformas de equipos muy caros.
Se describe una reducción marcada de las etapas de trabajo en la publicación KR 1020060099022 A (Procedimiento y kit para la detección y análisis rápidos y precisos de la secuencia de nucleótidos a simple vista mediante el uso de análisis de flujo lateral de membrana).
En este caso, se utiliza el llamado procedimiento de flujo lateral para detectar ácidos nucleicos. Este procedimiento también hace uso de la tecnología de hibridación de ácidos nucleicos a una fase sólida. Es ventajoso que un procedimiento de flujo lateral sea un formato de prueba pequeño y práctico (prueba de tira).
Una metodología de detección muy rápida, que también se utiliza para detectar productos de amplificación mediante una tira reactiva y está disponible comercialmente, se basa de nuevo en un principio completamente diferente en contraste con la publicación anterior. En este caso, la reacción de PCR se lleva a cabo mediante un cebador biotinilado y un cebador no biotinilado. Después de realizar la PCR, está presente un producto de PCR que, por lo tanto, está marcado con biotina en un extremo. La prueba utiliza una tira de prueba (por ejemplo Millenia, Amodia, etc.), que contiene dos sitios de unión separados. Un sitio de estreptavidina para acoplar la cadena de ADN marcada con biotina y un sitio de unión a FITC para el control funcional de la tira reactiva.
El producto de PCR se detecta desnaturalizando la carga de la PCR después de que se ha llevado a cabo la PCR y se ha hibridado con una sonda complementaria a la cadena de ADN marcada con biotina. La sonda está marcada con FITC.
Para la detección, la carga de hibridación de PCR se mezcla con un tampón de carrera y se aplica a la tira de prueba. Según la descripción de la prueba, la cadena de ADN biotinilado se une al sitio de unión a estreptavidina de la tira. La detección se lleva a cabo a través del marcador FITC de la sonda hibridada con la cadena de ADN. Se forma una señal típica en forma de tira. Esta señal está destinada a ser la detección específica del producto de amplificación. Sin embargo, el procedimiento no combina la hibridación de la sonda con el proceso de PCR, sino que lo lleva a cabo como una etapa de procedimiento independiente.
La publicación para información de solicitud de patente WO 2009/000764 A2 permite llevar a cabo una amplificación e hibridación del producto de PCR en una carga de reacción. Esto da como resultado un dímero de sonda amplificada doblemente marcada que posteriormente se puede visualizar, por ejemplo, mediante una tira de flujo lateral. Esta es una posibilidad muy económica y, sobre todo, independiente del dispositivo para visualizar un producto de hibridación por PCR. Sin embargo, la desventaja de este procedimiento es que no es principalmente un ensayo homogéneo, ya que después de que se ha producido la reacción de amplificación/ hibridación del recipiente de reacción, es necesario abrirlo para poder transferir la mezcla de amplificación a una tira de flujo lateral.
Por lo tanto, la reacción de detección real tiene lugar fuera de la cavidad de reacción en la que se lleva a cabo la reacción de amplificación/hibridación.
El procedimiento tampoco permite una representación numérica del resultado de la detección, pero siempre se limita a una declaración de sí-no que se obtiene visualmente. Tampoco se proporciona una cuantificación de los productos de reacción en una tira de flujo lateral, ya que el límite superior está predeterminado por la capacidad de unión de la tira.
La solicitud de patente internacional WO 2005/51967 A2 describe oligonucleótidos marcados que tienen varios fluoróforos. El procedimiento para separar los fluoróforos, que incluye la escisión de los oligonucleótidos marcados, utiliza enzimas con actividad de 5' exonucleasa.
El objeto de la publicación WO 03/072051 A2 es una sonda marcada con transferencia de energía de fluorescencia (FET) con un intercalador de ácido nucleico que contiene un compuesto policíclico que se une a un oligonucleótido marcado con FET, donde el intercalador de ácido nucleico se une de forma covalente al extremo 3' del oligonucleótido marcado con FET, y donde el oligonucleótido marcado con FET es un DarkQuencher que se coloca en su extremo 3', y donde la sonda marcada con FET es resistente a 3'-5' exonucleasa.
La publicación de E Lyon y col. "LightCycler Technology in Molecular Diagnostics", J. Mol. Diagn (2009) 11 (2) 93-101 reporta una PCR con monitoreo fluorescente en tiempo real y análisis de curva de fusión. La PCR se puede realizar en 15 minutos. La revisión describe los avances significativos en la tecnología LightCycler en los últimos 15 años. El objetivo de la presente invención era proporcionar un procedimiento universalmente utilizable para la detección específica de ácidos nucleicos diana que hace posible llevar a cabo la reacción de detección también en forma de un ensayo homogéneo, es decir, la detección de la reacción de detección ya tiene lugar en la cavidad de reacción en la que también tiene lugar la reacción de amplificación/hibridación real. El objetivo también era permitir la seguridad de diagnóstico de una reacción de detección por medio de una detección doble casi adicional, ya que una serie de procedimientos de prueba requieren una segunda detección de control (por ejemplo, la aplicación de los productos de amplificación a un gel de agarosa). En una extensión del objetivo, dicho procedimiento novedoso también podría usarse en la forma en que la reacción de detección tiene lugar como un ensayo homogéneo (asociado al dispositivo) o alternativamente como una prueba basada en una tira de flujo lateral (independiente del dispositivo).
Piepenburg y col. han descrito un procedimiento con un objetivo similar. (PLOS Biology, julio de 2006, Volumen 4, Número 7, 1115-1121). En este caso, se lleva a cabo una PCR isoterminal acoplada a recombinasa. La sonda de doblemente marcada tiene un sitio de corte integrado para una nucleasa. Durante la hibridación de la sonda, la nucleasa corta la cadena doble formada y, por lo tanto, se libera la fluorescencia. Después de la fragmentación con la nucleasa, la sonda marcada puede actuar como un cebador. Junto con el otro cebador marcado, se forma un producto de PCR doblemente marcado que se puede detectar en una tira de LFA. La desventaja es que este procedimiento es químicamente muy complejo y difícil. Además, antes de iniciar el experimento debe decidirse cuál de los procedimientos de detección y, por tanto, qué marcadores se prefieren. Si no se toma dicha decisión, deberá prepararse la sonda en al menos cuatro sitios: 1. Fluoróforo reportero, 2. Desactivador de fluorescencia, 3. Sitio de corte de la nucleasa, 4a Bloqueo de amplificación en el extremo 3'.
El objetivo existente se ha logrado de una manera sorprendentemente sencilla según las características de las reivindicaciones. El procedimiento según la invención combina una nueva síntesis de ADN dependiente de la matriz con una etapa de hibridación. La selección según la invención de los marcadores de los oligonucleótidos involucrados en las reacciones permite tanto una medición de fluorescencia dependiente de la reacción, donde los marcadores funcionan como un par FRET y la detección tiene lugar como resultado del efecto FRET mediante una detección de punto final. Esto se asocia con una evaluación numérica y, si corresponde, cuantitativa. Además, una visualización independiente del dispositivo de la reacción también puede tener lugar, por ejemplo, en una tira de flujo lateral. Dicho principio de medición también puede prescindir del uso de sistemas de dispositivos en tiempo real costosos en términos de tecnología de dispositivos.
El procedimiento según la invención se basa en las siguientes etapas:
A. Puesta a disposición de una carga de reacción, compuesta por:
♦ una muestra que contiene un ácido nucleico, en la cual debe detectarse el ácido nucleico diana
♦ al menos un oligonucleótido marcado por un marcador 1, que es completamente o parcialmente complementario con respecto a la secuencia diana, y que actúa como un iniciador en una nueva síntesis, dependiente de la matriz, del ácido nucleico diana (oligo tipo 1)
♦ al menos un oligonucleótido marcado por un marcador 2, que debido a su temperatura de fusión más reducida, como oligonucleótido 1, no participa en el proceso de nueva síntesis de ADN, pero puede hibridar, de forma parcial o completa, con el producto de la nueva síntesis de ADN de oligonucleótido 1, (oligo tipo 2)
♦ una mezcla de productos químicos / enzima, eventualmente también con otros oligonucleótidos no marcados, que posibilita una nueva síntesis, dependiente de la matriz, del ácido nucleico diana.
A los efectos de la invención, el término “parcialmente complementario” significa que debe estar presente suficiente complementariedad. En el presente caso, al menos un 50 %, preferentemente un 70 %, del oligonucleótido marcado debe ser complementario al ácido nucleico diana.
A los efectos de la invención, el término “dependiente de la matriz” significa que la nueva síntesis del ácido nucleico diana se controla mediante los cebadores utilizados.
Según la invención, los marcadores de los dos oligonucleótidos (oligo tipo 1 y oligo tipo 2) se seleccionan de manera que los mismos forman juntos un par FRET (por ejemplo, FITC/TAMRA, FAM/TAMRA, FAM/BHQ1, y similares), y con respecto a la detección doble según la invención pueden tener también ligandos complementarios en una tira de flujo lateral.
B. Realización de una nueva síntesis de ADN, dependiente de la matriz, con hibridación de sondas integrada En función de la clase del ácido nucleico diana se realiza una reacción de transcriptasa reversa (en el caso de ARN que se presenta en un número de copias muy elevado, por ejemplo, ARN ribosomal, ARN mensajero de transferencia) o una amplificación (en el caso de ADN), o también las dos reacciones de forma consecutiva (en el caso de un ARN poco común, por ejemplo, ARN mensajero, muestras con un número de partículas reducido).
En esa primera reacción, debido al procedimiento según la invención, solo participa el oligo tipo 1. El oligo tipo 1 actúa como un iniciador, en una transcripción reversa dependiente del ARN (debido a ello se produce una cadena de ADN complementario marcada) o en una amplificación del ADN diana, así como ADN complementario (debido a ello se produce un producto PCR marcado). Puede realizarse igualmente una PCR en tiempo real de un paso. De este modo, un segundo oligonucleótido iniciador, no marcado, aumenta el rendimiento de la reacción PCR.
El oligo tipo 2, debido a su temperatura de renaturalización, según el procedimiento según la invención, no participa en la nueva síntesis de ADN. A continuación, la carga de reacción se calienta a una temperatura > 90 °C. Esa etapa conduce a la separación de cadenas térmica. Después del desarrollo de esa reacción de desnaturalización térmica, la carga de reacción se enfría a la temperatura de hibridación del oligo tipo 2. Durante esa etapa, el oligo tipo 2 se une específicamente a la cadena de ADN complementaria. Esa cadena porta el marcador 1, que fue incorporado en el producto de reacción a través del oligo tipo 1.
C. Detección del evento de hibridación
La reacción de detección se puede llevar a cabo en dos variantes, según la invención mediante una medición de fluorescencia. Además, sin embargo, ambas variantes de detección también se pueden utilizar en paralelo, donde adicionalmente es posible llevar a cabo la reacción de detección fuera del recipiente de reacción en una fase sólida.
1. Detección de la reacción de hibridación mediante una medición de fluorescencia.
Los marcadores incorporados a través de los dos oligos tipo 1 y tipo 2 forman un par FRET. La hibridación del oligo tipo 2 en el producto de síntesis del oligo tipo 1, que tiene lugar en el procedimiento según la invención, conduce a un efecto FRET entre el marcador 1 y 2. Ese efecto conduce ahora a una reducción mensurable de la fluorescencia. Esa reducción de la fluorescencia se evalúa numéricamente, posibilitando así la detección unívoca de la reacción.
2. Detección de la reacción de hibridación fuera o dentro del recipiente de reacción en una fase sólida, caracterizada porque:
la fase sólida (por ejemplo, una tira de flujo lateral, placa de microtitulación, micropartícula) contiene un punto de unión para uno de los marcadores de los oligos tipo1 y tipo 2 y/o anticuerpos u otras moléculas de unión contra las moléculas del marcador de los oligos tipo 1 y tipo 2 que pueden unirse a la molécula del marcador tipo1 o tipo 2 (por ejemplo, enlaces covalentes o de puente de hidrógeno o mediante moléculas de puente). Además, sobre la fase sólida se encuentra una molécula de detección para una visualización o medición del suceso de hibridación, o a la reacción de detección se suministra una molécula de detección de esa clase. La molécula de detección, sin embargo, también ya puede haber sido incorporada al producto de hibridación que debe detectarse durante la reacción de amplificación /reacción de hibridación.
A modo de resumen, con el procedimiento según la invención se pone a disposición un procedimiento de detección de diagnóstico genético extremadamente sencillo y que puede utilizarse de forma universal.
La detección de un ácido nucleico diana relevante para el diagnóstico a detectar tiene lugar en forma de un ensayo homogéneo según la invención a través de la medición de fluorescencia de punto final de un enfriamiento de fluorescencia según el principio FRET. El resultado se puede registrar numéricamente y también permite la cuantificación del ácido nucleico diana a detectar (utilizando un estándar interno) detectado y cuantificado. Además, el procedimiento según la invención también hace posible una doble detección altamente específica ya que, después de que se haya producido la detección de fluorescencia, posteriormente se puede realizar una verificación de resultados en una tira de flujo lateral. Una verificación de esa clase, de este modo, es mucho más exacta en cuanto al diagnóstico que una detección, posible hasta el momento, de productos PCR en tiempo real en un gel de agarosa. Si es necesario, el procedimiento también permite que los ensayos se realicen independientemente unos de otros (ensayo mediante detección de fluorescencia o ensayo mediante detección, por ejemplo, en una tira de flujo lateral). Esa novedosa y sofisticada realización de la prueba, en particular también la realización de la prueba combinada (detección de fluorescencia y verificación subsiguiente de la primera reacción de prueba en una fase sólida), según la invención, se posibilitan debido a que durante la amplificación / hibridación la sonda hibridada (oligo tipo 2) no se destruye a través de la Taq-polimerasa, sino que también después del desarrollo de la reacción permanece en el estado hibridado, a diferencia del ensayo homogéneo de exonucleasa TaqMan.
La integración según la invención de una sonda de hibridación en la reacción ofrece la seguridad de que el fragmento amplificado contiene realmente la secuencia diana. Debido a esto se excluyen los resultados falsos positivos que se producen a través de mispriming (apareamiento incorrecto). La utilización de la sonda modificada de forma química (preferentemente fosforilación del último nucleótido de la sonda) impide la prolongación de la sonda a través de la actividad 5 '^3 '- polimerasa, impidiendo con ello que la sonda actúe como iniciador y genere artefactos PCR no específicos (dímeros del iniciador), que se detectarían como señales falsamente positivas.
A diferencia del procedimiento de PCR en tiempo real, la detección de la señal de detección específica no tiene lugar durante la amplificación, donde la fluorescencia se libera a través de la hidrólisis de sondas realizada por la Taqpolimerasa (solicitud EP 0972 848 A2) o se reduce a través del efecto FRET (solicitud EP1384789 B1), sino solo después de finalizada la reacción de amplificación-hibridación. Esto también tiene el efecto positivo de que el procedimiento es independiente del equipo. Las mediciones se pueden llevar a cabo tanto en un aparato de PCR en tiempo real como después de completar la reacción con un lector de fluorescencia (ver ejemplos de realización). El procedimiento según la invención también se diferencia del documento de patente (EP 0 826 066 B1) que igualmente representa una combinación de PCR e hibridación. También en ese procedimiento, por otra parte, se detecta una señal de fluorescencia proporcionada a través del efecto FRET. La misma se produce durante el proceso de amplificación, a través de la hibridación de una sonda doblemente marcada, que tiene una temperatura de renaturalización más reducida que el iniciador. La liberación de la fluorescencia, de este modo, no tiene lugar a través de hidrólisis de la sonda a causa de la actividad exonucleasa de la polimerasa, sino debido a que en la hibridación se disuelve la estructura secundaria de la sonda, y a través de la eliminación del reportero, desde el desactivador de fluorescencia, se libera la fluorescencia. En este caso, para la amplificación solo pueden utilizarse enzimas que no posean una actividad exonucleasa (por ejemplo, fragmento Klenow o polimerasas T4 o T7).
Por primera vez, se ha proporcionado un procedimiento homogéneo para detectar la presencia de un ácido nucleico diana en una muestra, donde la carga de reacción contiene:
- muestra de ácido nucleico en la que se sospecha el ácido nucleico diana
- al menos un oligonucleótido marcado por un marcador 1, que es completamente o parcialmente complementario con respecto a la secuencia diana, y que actúa como un iniciador en una nueva síntesis, dependiente de la matriz, del ácido nucleico diana (oligo tipo 1)
- al menos un oligonucleótido marcado por un marcador 2, que debido a la temperatura de fusión más reducida, como oligonucleótido 1, no participa en el proceso de nueva síntesis de ADN, pero puede hibridar, de forma parcial o completa, con el producto de la nueva síntesis de ADN de oligo tipo 1, (oligo tipo 2)
- una mezcla de productos químicos / enzima, eventualmente también con otros oligonucleótidos no marcados, que posibilita una nueva síntesis, dependiente de la matriz, del ácido nucleico diana.
El procedimiento comprende las siguientes etapas:
- la nueva síntesis dependiente de la matriz del ácido nucleico diana que debe detectarse con al menos un oligo del tipo 1 y, si procede, la posterior separación de la cadena
- hibridación del producto de síntesis del oligo tipo 1 respectivo con al menos un oligo tipo 2
- detección de la reacción de hibridación mediante una medición de fluorescencia según el principio FRET mediante una detección de punto final.
Los marcadores 1 y 2 forman un par FRET. La hibridación del oligo tipo 2 con el producto de síntesis del oligo tipo 1 conduce a una reducción medible de la fluorescencia causada por el efecto FRET entre el marcador 1 y 2.
La detección de la reacción de hibridación también es posible fuera del recipiente de reacción. En el caso de detección en una fase sólida, la fase sólida contiene un sitio de unión para una de los marcadores del oligo tipo 1 o tipo 2 y/o anticuerpos u otras moléculas de unión contra las moléculas de etiquetado del oligo tipo 1 o tipo 2 que se unen a las moléculas del marcador tipo 1 o tipo 2 (por ejemplo, unión a puente de hidrógeno o covalente o a través de moléculas de puente) y al mismo tiempo una molécula de detección para visualización o medición del evento de hibridación, o dicha molécula se agrega a la muestra unida a la fase sólida.
Los oligos de tipo 1 y tipo 2 también pueden llevar marcadores distintos de los mencionados en la reivindicación 4. Los marcadores adicionales se pueden utilizar para detectar el evento de hibridación en la fase sólida (1e).
También es posible realizar una amplificación asimétrica en lugar de la amplificación estándar.
Según una modalidad preferida de la invención, la temperatura de fusión (Tm ) del oligo tipo 1 es preferentemente de 5 °C a 15 °C más alta que la Tm del oligo tipo 2. Después de la hibridación, los marcadores 1 y 2 preferentemente están separadas una de otra entre 1y 50 pb.
También es posible que el oligo con un marcador de reportero esté presente en la reacción en una concentración menor que el oligo con el marcador de desactivador de fluorescencia, preferentemente en la relación de 1:10 a 1:20. El procedimiento según la invención se explica a continuación con referencia a los ejemplos de realización, donde los ejemplos de realización no pretenden representar ninguna restricción del procedimiento.
Ejemplos de realización
Ejemplo 1:
Detección de la influenza de tipo H1N1 (ADNc de origen porcino) mediante un procedimiento de hibridación integrado en la PCR y medición de la fluorescencia de un punto final de enfriamiento de la fluorescencia
En la carga se utilizan muestras negativas (NTC), muestras positivas de ADNc H1N1 (POS) y muestras que contienen material de ADN humano (hisopado de la mucosa nasal) pero no H1N1 (NEG).
Este ejemplo demuestra la posibilidad de una medición de fluorescencia de punto final según la invención y la especificidad del procedimiento.
Sonda/cebador de PCR
H1 N1 cebador de sentido (5'-tgg gaa atc cag agt gtg aat cac tct c-3')
Cebador antisentido H1N1 (oligo tipo 1) (5'-BHQ1-cgt tcc att gtc tga act agr tgt ttc c-3')
Sonda H1N1 (oligo tipo 2) (5'- agc aag ctc atg gtc cta cat t-FAM- 3')
Muestras: 3x POS; 3x NEG; 3x NTC
Por muestra:
cebador de sentido (25 pmol/jl) 0,1 j l
cebador antisentido (50 pmol/jl) 0,1 j l
Sonda (5 pmol/jl) 0,1 j l
mezcla dNTP (12,5 mM) 0,3 j l
10X tampón de PCR (MgCl2 incluido) 1,5 j l
Taq ADN polimerasa 0,75 U
H2O de calidad PCR añadir 15 |jl
La PCR se realiza en el SpeedCycler (Analytik Jena) utilizando la tecnología de RapidCycler:
Condiciones de amplificación/hibridación
Etapa 1: Desnaturalización 98 °C/90"
Etapa 2: Amplificación 41 ciclos (98 °C/4"; 57 °C /4"; 72 °C /10
Etapa 3: Desnaturalización 95 °C/900"
Etapa 4: Hibridación 43 °C/600"
La reacción del evento de amplificación/hibridación se detecta mediante una medición del punto final utilizando el lector de fluorescencia SpeedScan (Analytik Jena AG; Figura 2). Al mismo tiempo, el cambio en la intensidad de fluorescencia de la muestra se midió en tiempo real durante toda la reacción (Figura 3). Los datos de medición del dispositivo SpeadScan se sometieron a una determinación Pos/Neg según la siguiente fórmula:
xN — xNmin %xN = A
Figure imgf000009_0001
si A — B > 0 la muestra es negativa
si A — B < 0 la muestra es positiva
Donde xN es el valor medio de los valores de NTC; xNmin es el valor de NTC más pequeño; la desviación porcentual deseada del valor positivo del negativo (por ejemplo, el 20 % del xN) y P- es el valor medido de la muestra a probar. Además, la muestra se puede evaluar semicuantitativamente mediante el uso de un estándar de concentración. Sin embargo, una evaluación cuantitativa real solo puede tener lugar si hay un control interno y una reacción competitiva.
Los resultados de la evaluación cualitativa de la fluorescencia de la muestra se resumen en la Tabla 1.
Figure imgf000009_0002
Ejemplo 2:
Dependencia de la intensidad de la señal en la concentración del ADN diana en comparación con una PCR convencional en tiempo real
Se realizaron dos cargas: para el procedimiento según la invención y una carga de PCR en tiempo real con una sonda marcada con FAM-BHQ1. Las muestras utilizadas fueron los ADNc sintetizados a partir de cepas del virus de la influenza H1N1 (número de partículas/carga de PCR ver tabla).
Carga 1: Las condiciones de reacción ver Ejemplo 1
Carga 2:
Sonda/cebador de PCR
H1N1 RT cebador de sentido (5'- tgg gaa atc cag agt gtg aat cac t-c-3')
H1N1 RT cebador antisentido (5'- cgt tcc att gtc tga act agr tgt t-3')
H1N1 RT sonda (5'- FAM-cca caa tgt agg acc atg agc ttg ctg t-BHQ1- 3')
Por muestra:
cebador de sentido (50 pmol/pl) 0,1 pl
cebador antisentido (50 pmol/pl) 0,1 pl
Sonda (25 pmol/pl 0,1 pl
mezcla dNTP (12,5 mM) 0,3 pl
10X tampón de PCR (MgCh incluido) 1,5 pl
Taq ADN polimerasa 0,75 U
H2O de calidad PCR añadir 15 pl
La PCR se realiza en el SpeedCycler (Analytik Jena) utilizando la tecnología de RapidCycler:
Condiciones de amplificación/hibridación
Etapa 1: Desnaturalización 98 °C/90"
Etapa 2: Amplificación 41 ciclos (98 °C/4"; 57 °C/4"; 72 °C/10"
El evento de amplificación/reacción de hibridación en la carga 1 se detectó mediante una medición de punto final de la fluorescencia mediante SpeedScan (Analytik Jena AG; Fig. 4). Al mismo tiempo, se observó el cambio en la intensidad de fluorescencia de la muestra durante todo el tiempo de reacción en tiempo real (PCR en tiempo real) (Figura 5). Los datos medidos del aparato SpeadScan se sometieron a una determinación de Pos/Neg de según la fórmula descrita anteriormente (ver Ejemplo 1n). En la carga 2, la liberación de la fluorescencia se midió convencionalmente mediante PCR en tiempo real.
Los resultados de la evaluación cualitativa de la fluorescencia de la muestra se resumen en la Tabla 2.
Figure imgf000010_0001
Explicación sobre las figuras
La figura 1 muestra un diagrama de la secuencia del procedimiento.
La figura 2 muestra una medición de fluorescencia después del proceso de la reacción de amplificación/ hibridación. Los campos B3-B5 son muestras pos, B6-B8 son muestras neg, B9-B11 son muestras NTC (medición de fluorescencia mediante SpeedScan (Analytik Jena AG)).
La figura 3 muestra una medición de fluorescencia en tiempo real durante toda la reacción de amplificación/hibridación. Las curvas 1-3 son muestras pos, 4-6 son muestras neg, 7-9 son muestras NTC (medición en tiempo real para rastrear la reacción de detección).
La figura 4 muestra una medición de fluorescencia después del proceso de la reacción de amplificación/ hibridación. Los campos B3/C3 son muestras POS con un contenido de partículas de virus de 10000; B4/C4 - son muestras POS con un contenido de partículas de virus de 5000; B5/C5 - son muestras POS con un contenido de partículas de virus de 500; B6/C6 - son muestras POS con un contenido de partículas de virus de 50; B7/C7 - son

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. 1. Procedimiento para la detección de secuencias de ácido nucleico específicas (diana), que comprende las siguientes etapas:
a) nueva síntesis de ADN dependiente de la matriz del ácido nucleico diana;
b) hibridación de sonda específica de la diana; y
c) detección del evento de hibridación;
donde en la etapa a) al menos un oligonucleótido 1 marcado por un marcador 1, que es total o parcialmente complementario a la secuencia diana, funciona como un cebador en la nueva síntesis dependiente de la matriz del ácido nucleico diana y en la etapa b) al menos un oligonucleótido 2 marcado por un marcador 2, que está presente en la etapa a) pero no participa en la etapa a) debido a su temperatura de fusión más baja que el oligonucleótido 1, pero que está parcial o completamente hibridado con el producto de nueva síntesis de ADN del oligonucleótido 1 y se utiliza para la hibridación de sonda específica de la diana,
caracterizado porque
el evento de hibridación se detecta en la cavidad de reacción en la que tiene lugar la reacción de amplificación/hibridación y que los dos marcadores 1 y 2 funcionan como un par FRET, donde la detección tiene lugar como resultado del efecto FRET mediante una detección de punto final.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el par FRET es preferentemente FITC/TAMRA, FAM/TAMRA o FAM/BHQ1, y la detección de la reducción en la fluorescencia que se produce como resultado de un efecto FRET conduce a una reducción medible en la fluorescencia.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque después de la etapa a), la carga de reacción se calienta a una temperatura >90 °C, se produce la separación de la cadena térmica y la carga de reacción se enfría a la temperatura de hibridación del oligonucleótido 2.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque durante la nueva síntesis/ hibridación de ADN, el oligonucleótido hibridado 2 no es destruido por la polimerasa Taq, sino que también permanece en el estado hibridado después del proceso de la reacción.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el evento de hibridación se detecta solo después de que se haya completado la nueva síntesis/ hibridación de ADN.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , caracterizado porque el oligonucleótido 2 está protegido contra la actividad de la polimerasa 5'^3', preferentemente por el propio marcador o por fosforilación.
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