ES2911663T3 - Anticuerpos humanos anti-IFN-alfa - Google Patents

Anticuerpos humanos anti-IFN-alfa Download PDF

Info

Publication number
ES2911663T3
ES2911663T3 ES14750320T ES14750320T ES2911663T3 ES 2911663 T3 ES2911663 T3 ES 2911663T3 ES 14750320 T ES14750320 T ES 14750320T ES 14750320 T ES14750320 T ES 14750320T ES 2911663 T3 ES2911663 T3 ES 2911663T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
positions
ifn
antibody
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14750320T
Other languages
English (en)
Inventor
Syeda F Y Haque
Adrian Hayday
Kai Kisand
Kai Krohn
Annalisa Macagno
Steffen Meyer
Pärt Peterson
Mike Rothe
Philip Vlaicu
Martin Woodward
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunoqure AG
Original Assignee
Immunoqure AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunoqure AG filed Critical Immunoqure AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2911663T3 publication Critical patent/ES2911663T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/56—IFN-alpha

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

Un anticuerpo humano anti-interferón-alfa (IFN-α) o un fragmento de unión a IFN-α del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-α se une a los subtipos de IFN-α humano IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA10 e IFNA14; y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a comprender en su región variable las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 y VL-CDR1, VL-CDR2 y VL- CDR3 seleccionadas a partir de: a) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 2 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 2 VH-CDR3: posiciones 99-111 de la SEQ ID NO: 2 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 4 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 4 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 4; b) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 10 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 10 VH-CDR3: posiciones 99-112 de la SEQ ID NO: 10 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 12 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 12 VL-CDR3: posiciones 89-95 de la SEQ ID NO: 12; c) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 18 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 18 VH-CDR3: posiciones 99-115 de la SEQ ID NO: 18, VL-CDR1: posiciones 24-35 de la SEQ ID NO: 20 VL-CDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 20 VL-CDR3: posiciones 90-100 de la SEQ ID NO: 20; d) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 22 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 22 VH-CDR3: posiciones 99-111 de la SEQ ID NO: 22 VL-CDR 1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 24 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEO ID NO: 24 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 24; e) VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 30 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 30 VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 30 VL-CDR 1: posiciones 24-40 de la SEQ ID NO: 32 VL-CDR2: posiciones 56-62 de la SEQ ID NO: 32 VL-CDR3: posiciones 95-103 de la SEQ ID NO: 32; f) VH-CDR 1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 38 VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 38 VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 38 VL-CDR1: posiciones 24-40 de la SEQ ID NO: 40 VL-CDR2: posiciones 56-62 de la SEQ ID NO: 40 VL-CDR3: posiciones 95-103 de la SEQ ID NO: 40; g) VH-CDR 1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 76 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 76 VH-CDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 76 VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 78 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 78 VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 78; y h) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 84 VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 84 VH-CDR3: posiciones 99-112 de la SEQ ID NO: 84, VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEO ID NO: 86 VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 86 VL-CDR3: posiciones 89-98 de la SEO ID NO: 86.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanos anti-IFN-alfa
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales humanos, así como también a fragmentos, derivados y variantes de los mismos como se define en las reivindicaciones que reconocen diferentes subtipos de IFN-a. En particular, se proporcionan anticuerpos anti-IFN-a recombinantes humanos derivados de pacientes y los métodos para prepararlos. Además, se describen composiciones que comprenden dichas moléculas de unión y anticuerpos útiles en el tratamiento y diagnóstico de trastornos. Además, la presente invención se refiere a autoanticuerpos como agentes para su uso en la inmunoterapia, así como también dianas en la intervención terapéutica de trastornos autoinmunitarios y autoinflamatorios, así como también otras enfermedades, tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE) y la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM). Más específicamente, la presente invención se refiere a autoanticuerpos monoclonales que se han aislado de linfocitos B derivados de sujetos afectados por una tolerancia central y/o periférica deteriorada o con pérdida de la autotolerancia, típicamente debido a una mutación en un gen implicado en la regulación inmunitaria.
Antecedentes de la invención
Las respuestas inapropiadas del sistema inmunitario pueden causar síntomas estresantes para el organismo implicado. Las respuestas inmunitarias exageradas a sustancias extrañas o estados físicos que normalmente no tienen un efecto significativo en la salud de un animal o humano pueden conducir a alergias con síntomas que varían desde reacciones leves, tales como irritaciones de la piel, hasta situaciones que amenazan la vida, tales como un choque anafiláctico o varios tipos de vasculitis. Las respuestas inmunitarias a los antígenos endógenos pueden causar trastornos autoinmunitarios tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE), la diabetes mellitus tipo 1 o dependiente de insulina (T1DM o IDDM) y diferentes formas de artritis.
Las respuestas inmunitarias ocurren de manera coordinada, implican a varias células y requieren la comunicación entre las células implicadas mediante moléculas de señalización, tales como las citocinas. Esta comunicación puede influenciarse o inhibirse mediante, por ejemplo, interceptación de las señales o bloqueo de los respectivos receptores.
Las citocinas son proteínas, péptidos y glicoproteínas solubles secretadas que actúan como reguladores humorales en concentraciones nanomolares a picomolares y se comportan como las hormonas clásicas en el sentido de que actúan a nivel sistémico y que, en condiciones normales o patológicas, modulan las actividades funcionales de células y tejidos individuales. Las citocinas difieren de las hormonas en que no las producen células especializadas organizadas en glándulas especializadas, es decir no existe un único órgano o fuente celular para estos mediadores, ya que se expresan en prácticamente todas las células implicadas en la inmunidad innata y adaptativa, tales como las células epiteliales, los macrófagos, las células dendríticas (DC), las células asesinas naturales (NK) y, especialmente, los linfocitos T, entre los que destacan los linfocitos T cooperadores (Th).
En dependencia de sus respectivas funciones, las citocinas pueden clasificarse en tres categorías funcionales: regulación de las respuestas inmunitarias innatas, regulación de las respuestas inmunitarias adaptativas y estimulación de la hematopoyesis. Debido a sus actividades pleiotrópicas dentro de dichas tres categorías, por ejemplo, con respecto a la activación, proliferación, diferenciación, reclutamiento celular u otras respuestas fisiológicas, por ejemplo, la secreción de proteínas por parte de las células diana, característica de la inflamación, se han encontrado alteraciones de la señalización celular mediadas por la producción de citocinas regulada de forma anómala, como una causa de muchos trastornos asociados con una respuesta inmunitaria defectuosa, por ejemplo, inflamación y cáncer.
Los interferones (IFN), que consisten en tres familias de proteínas conocidas, los interferones de tipo I, II y III constituyen una de las clases más importantes de citocinas. Todos los interferones de tipo I humanos se unen a un receptor de la superficie celular (receptor de IFN alfa, IFNAR) que consiste de dos proteínas transmembrana, IFNAR-1 e IFNAR-2, lo que conduce a la activación de JAK-STAT, la formación de ISGF3 y el subsecuente inicio de la expresión génica (Platanias y Fish, Exp. Hematol. (1999), 1583-1592). La composición, los receptores y las vías de señalización de los IFN de tipo I se han revisado, por ejemplo, en Starky otros, Annu. Rev. Biochem. (1998), 227-64; Pestka S., Biopolymers (2000), 254-87. Los interferones de tipo I forman una familia estructuralmente relacionada (IFN-a (alfa), IFN-p (beta), IFN-k (kappa), IFN-8 (delta), IFN-£ (épsilon), IFN-t (tau), IFN-w (omega) e IFN-Z (zeta)), de los cuales el IFN-8 y el IFN-t no existen en humanos. Los genes del interferón de tipo I humano (IFN) están agrupados en el cromosoma humano 9p21 y los genes de ratón se ubican en la región de sintenia conservada en el cromosoma 4 de ratón. Hasta el momento, se han identificado 14 genes de IFN-a y 3 pseudogenes en el ratón. En humanos se han identificado 13 genes de IFN-a (o IFNA) (IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17 e IFNA21) y 1 pseudogén, en donde dos genes humanos de IFN-a (IFNA1/IFN-a1 e IFNA13/IFN-a13) codifican proteínas idénticas (van Pesch y otros, J. Virol. (2004), 8219-8228).
El IFN-y es el único interferón de tipo II. Está implicado principalmente en la inducción de mecanismos antimicrobianos y antitumorales por estimulación de macrófagos. El receptor de IFN-y (IFNGR) es un receptor heterodimérico que comprende dos cadenas de unión a ligando IFNGR1 asociadas con dos cadenas de transducción de señales IFNGR2 Schroder y otros, J. Leukoc. Biol. 75 (2004), 163-189; Bach y otros, Annu. Rev. Immunol. 15 (1997), 563-591). Los interferones de tipo III consisten de tres subtipos y también se denominan IFNA (IFNA1 o IL-29, IFNA2 o IL-28A e IFNA3 o IL-28B) y tienen actividad antiviral, antitumoral e inmunorreguladora. El receptor de IFN-A también es un complejo heterodimérico que consiste de una cadena única de unión a ligando, IFN-AR1 (también designada como IL-28Ra), y una cadena accesoria IL-10R2, que comparte con los receptores de citocinas relacionadas con la IL-10. (Li y otros, J. Leukoc. Biol. 86 (2009), 23-32)
Los interferones de tipo I son citocinas pleiotrópicas con funciones antivirales, antitumorales e inmunorreguladoras. En dependencia del contexto, pueden ser antiinflamatorios y protectores de tejidos o proinflamatorios y promover la autoinmunidad. El IFN-p1a o 1b se usa para el tratamiento de la esclerosis múltiple y la terapia con IFN-a2b para muchos cánceres (melanoma, neoplasias hematológicas). La actividad elevada de IFN-a se ha detectado con frecuencia en el suero de pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE), lo que indica que el IFN-a juega un papel central en el desarrollo del SLE. (Ronnblom y Alm, J. Exp. Med. (2001), F59-F63; Crow MK, Arthritis Rheum. (2003), 2396-2401; Crow MK., Curr Top Microbiol. Immunol. (2007), 359-386; Crow MK. Rheum Dis Clin North Am. (2010), 173-186).
Por otro lado, se muestra un patrón de expresión específico de genes dependientes de interferón (denominado "firma de interferón") en los leucocitos de pacientes con diversos trastornos autoinmunitarios tales como SLE, T1DM, síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerosis múltiple (EM), pacientes con psoriasis y artritis reumatoide (AR). Además, el desarrollo de artritis inflamatoria, EM y T1DM se ha observado repetidamente durante la terapia con IFN-a, lo que indica que el IFN-a al menos promueve esas enfermedades (Crow m K., Arthritis Res Ther. (2010), Supl 1:S5). Datos adicionales sugieren una implicación del IFN-a en la miositis, la esclerodermia sistémica, la psoriasis crónica Higgs y otros, Eur Musc Rev (2012), 22-28; Bissonnette y otros, J Am Acad Dermatol (2009), 427-436; Greenberg SA, Arth Res Ther (2010): S4;) y tiroiditis autoinmunitaria (Prummel y Laurberg, Thyroid (2003), 547-551).
En consecuencia, en dependencia del contexto de la situación, el tratamiento con interferones de tipo I, como en la AR, EM y diferentes leucemias o el tratamiento con anticuerpos que neutralizan los interferones de tipo I, por ejemplo, en el SLE puede indicarse, el mismo tratamiento puede ser perjudicial para el paciente al promover la autoinmunidad, la inflamación y las toxicidades relacionadas con el tratamiento con interferón o incluso conducir al desarrollo de enfermedades tales como EM y T1DM. Un factor en estos diferentes efectos puede surgir del hecho de que, a pesar de que diferentes subtipos de IFN activan el mismo complejo receptor de superficie celular, median respuestas variables que también dependen del tipo de célulavan Pesch y otros, J Virol 78 (2004), 8219-8228; Antonelli G., New Microbiol. 31 (2008), 305-318; Gibbert y otros, PLoS Pathog. 8 (2012), e1002868). Por lo tanto, el tratamiento debe realizarse preferentemente de manera selectiva, en donde solo se administran a un paciente subtipos de IFN-a particulares, o se neutralizan subtipos de IFN-a particulares, que están asociados con una afección patológica dada. En cuanto al tratamiento con IFN-a, dicha selectividad puede obtenerse mediante el uso de preparados de IFN-a altamente purificados con fines terapéuticos (Antonelli G., New Microbiol. 31 (2008), 305-318). Sin embargo, en cuanto al uso de anticuerpos IFN-a, es más difícil obtener selectividad con respecto a subtipos específicos de IFN-a, porque existe un alto grado de homología a nivel de aminoácidos, con un 80-95 % de homología entre los subtipos de IFN-a y 50 % de homología con el IFN-p. Por lo tanto, sería conveniente proporcionar un grupo de anticuerpos IFN-a tolerables en humanos de especificidad variable hacia todos los subtipos de IFNA humanos seleccionados o particulares, que podrían usarse, de manera selectiva, en dependencia de la indicación terapéutica y/o diagnóstica.
Los primeros intentos para lograr este objetivo ya se han hecho. Por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos 2009/0214565 A1 describe el aislamiento de varios anticuerpos de ratón anti-IFN-a humano que neutralizan entre tres y trece subtipos diferentes de IFN-a humano y la patente de Estados Unidos núm. 7.087.726 B2 describe un anticuerpo murino anti-IFN-a humano y su versión humanizada que reconoce siete subtipos de IFN-a humano. También, los documentos WO 02/066649 A2 y WO 2005/059106 A2 describen otros anticuerpos anti IFN-a. Sin embargo, la mayoría, si no todos, los anticuerpos anti-IFN proporcionados hasta ahora son de origen murino y, por tanto, propensos a una reacción adversa en humanos.
Debido a las respuestas inmunitarias a anticuerpos extraños, como anticuerpos de ratón en humanos (respuesta HAMA; Schroff y otros, Cancer Res. 45 (1985), 879-885; Shawler y otros, J. Immunol. 135 (1985), 1530-1535), en los enfoques terapéuticos actuales se usan sobre todo las versiones humanizadas de anticuerpos (Chan y Carter, Nature Reviews Immunology 10 (2010), 301-316; Nelson y otros, Nature Reviews Drug Discovery 9 (2010), 767-774). Un enfoque para obtener dichos anticuerpos fue trasplantar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) a un marco completamente humano, un proceso conocido como humanización de anticuerposJones y otros, Nature 321 (1986), 522-525). Este enfoque a menudo se complica por el hecho de que las CDR de ratón no se transfieren fácilmente a un marco de dominio variable humano, lo que da como resultado una menor afinidad del anticuerpo humanizado sobre su anticuerpo murino parental. Por lo tanto, a menudo se requieren experimentos de mutagénesis adicionales y elaborados para aumentar la afinidad de los anticuerpos manipulados así. Otro enfoque para lograr anticuerpos humanizados es inmunizar ratones a los que se les han reemplazado sus genes de anticuerpos innatos con genes de anticuerpos humanos y aislar los anticuerpos producidos por estos animales. Sin embargo, este método aún requiere la inmunización con un antígeno, lo que no es posible con todos los antígenos debido a la toxicidad de algunos de ellos. Además, este método se limita a la producción de ratones transgénicos de una cepa específica.
Otro método es usar bibliotecas de anticuerpos humanos, tales como la presentación en fagos, como se describió, por ejemplo, para la generación de anticuerpos específicos de IL-13 en la solicitud internacional WO 2005/007699. Aquí, los bacteriófagos se manipulan para presentar fragmentos scFv/Fab humanos en su superficie mediante la inserción de un gen de anticuerpo humano en la población de fagos. Desafortunadamente, también hay una serie de desventajas de este método, que incluyen la limitación del tamaño de la secuencia de proteínas para la presentación polivalente, el requisito de secreción de las proteínas, es decir fragmentos de anticuerpos scFv/Fab, de bacterias, los límites de tamaño de la biblioteca, un número limitado de posibles anticuerpos producidos y probados, una proporción reducida de anticuerpos con hipermutaciones somáticas producidas mediante inmunización natural y que todas las proteínas codificadas en fagos son proteínas de fusión, lo que pueden limitar la actividad o accesibilidad para la unión de algunas proteínas. De manera similar, la solicitud de patente europea EP 0 616 640 A1 describe la producción de autoanticuerpos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos presentados en fagos. Las bibliotecas de presentación en fagos se generan a partir de humanos no inmunizados a este respecto (ver, por ejemplo, Ejemplo 1; página 16, líneas 43-51; Ejemplo 2, en la página 17, párrafo [0158], líneas 57-58). Sin embargo, los métodos descritos en esta solicitud de patente también se ven afectados por las desventajas generales mencionadas anteriormente, de los anticuerpos generados a partir de bibliotecas de presentación en fagos, en comparación con los anticuerpos producidos y madurados en un mamífero, es decir el cuerpo humano.
Lo mismo se aplica al anticuerpo monoclonal anti-IFNa más destacado, el sifalimumab (antes, MEDI-545), que se une a la mayoría de los subtipos de IFN-a y los neutraliza específicamente, lo que evita la señalización a través del receptor de IFN tipo I. Se dice que el sifalimumab es un anticuerpo monoclonal anti-IFNa "humano", pero en realidad se ha derivado de ratones humanizados, es decir de la plataforma UltiMab de la antigua empresa Medarex, que se basa en ratones transgénicos en los que se introdujo la fracción más grande del repertorio de la línea germinal humana.
Sin embargo, aunque las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que derivan de ratones humanizados son de origen humano, estos anticuerpos son artificiales y no son verdaderamente humanos, ya que no se han sometido a inmunización, recombinación, selección y maduración de la afinidad en un ser humano, por esa razón aún existe el riesgo de que sean inmunogénicos y menos efectivos, en particular en comparación con los anticuerpos derivados de humanos.
En vista de lo anterior, todavía existe la necesidad de compuestos adicionales y nuevos, como moléculas de unión de alta especificidad para subtipos de IFN-a humanos particulares, específicos para un intervalo seleccionado o para todos los subtipos de IFN-a que son tolerables en humanos, ya sea para monoterapia o enfoques combinatorios.
La solución a este problema la proporcionan las modalidades de la presente invención, como se caracterizan en las reivindicaciones y se describen en la descripción y se ilustran en los Ejemplos y Figuras más abajo.
Resumen de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones. En particular, los anticuerpos anti-IFN-a monoclonales humanos se proporcionan con un perfil de unión selectiva hacia los subtipos de IFN-a y presentan actividad de unión y neutralización, como se muestra en los Ejemplos y las Figuras. Debido a su propiedad neutralizante, los anticuerpos de la presente invención tienen utilidad terapéutica, pronóstica y diagnóstica, lo que los hace particularmente valiosos para aplicaciones en relación con diversos trastornos y afecciones autoinmunitarias o autoinflamatorias asociadas con/que implican la actividad del IFN-a en el inicio y/o mantenimiento de respuestas inmunitarias indeseadas, tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE), diversas formas de artritis que incluyen, pero no se limitan a, la artritis reumatoide (AR), diabetes mellitus tipo 1 o dependiente de insulina (T1DM o iDd M), síndrome de Sjogren, dermatomiositis, Esclerosis Múltiple (EM), psoriasis, psoriasis crónica, miositis, esclerodermia sistémica, tiroiditis autoinmunitaria y cáncer, que incluye la leucemia (ALL; Einav y otros, Oncogen 24 (2005), 6367-6375); véase también la sección anterior "Antecedentes de la invención", que describe los subtipos de IFN-a y sus posibles trastornos involucrados e implicaciones, hacia posibles indicaciones de los anticuerpos de la presente invención en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y/o de pronóstico relacionadas.
Los anticuerpos de la presente invención se aíslan de seres humanos, que se ven afectados con una tolerancia central y/o periférica deteriorada o con pérdida de la autotolerancia que puede deberse o estar asociada con una génesis alterada o desregulada de la autotolerancia, preferentemente causada por un trastorno autoinmunitario monogénico. Los ejemplos de mamíferos que proporcionan una fuente particularmente adecuada de autoanticuerpos de acuerdo con la presente invención son humanos que tienen un trastorno asociado con una mutación en el gen AIRE (Regulador autoinmunitario) como el síndrome de poliendocrinopatía autoinmunitaria tipo 1 (APS1) (Peterson y otros, Nat. Rev. Inmunol. 8 (2008), 948-957), Síndrome de poliendocrinopatía autoinmunitaria tipo 2 (APS2) (Baker y otros, J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (2010), E263-E270) y el síndrome de inmunodesregulación, poliendocrinopatía y enteropatía ligado al cromosoma X (IPEX) (Powell y otros, J. Pediatr. 100 (1982), 731-737; Ochs y otros, Immunol. Rev. 203 (2005), 156-164). Preferentemente, los pacientes de los que se aislaron los anticuerpos son pacientes con APS1 que se caracterizan por no tener síntomas de lupus eritematoso (SLE) y presentar serorreactividad contra el ADNdc y al menos uno de los subtipos de IFN-a humano.
En particular, de acuerdo con la presente invención, por primera vez se proporcionan anticuerpos anti-IFN-a humanos y derivados de pacientes humanos con diferentes perfiles de unión a IFN-a y actividad neutralizante de IFN-a, de esta manera cubren sustancialmente, solos o en combinación, todos los subtipos de IFN-a.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente descripción se refiere generalmente a anticuerpos monoclonales neutralizantes de alta afinidad para varios subtipos de IFN-a. En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a anticuerpos monoclonales humanos (AcM o ACM) contra varios subtipos de IFN-a, es decir al menos uno de los subtipos de IFN-a (IFNA) humano IFN-a1/13 (IFNA1/13; IFNAIb), IFN-a2 (IFNA2), IFN-a4 (IFNA4), IFN-a5 (IFNA5), IFN-a6 (IFNA6), IFN-a8 (IFNA8), IFN-a10 (IFNA10), IFN-a14 (IFNA14) o IFN-a21 (IFNA21), descritos en detalle más abajo, los que se consideran tratamientos seguros y efectivos para trastornos en los que esas citocinas están implicadas. En un ejemplo, la molécula de unión a IFN-a de la presente descripción no se une y/o neutraliza en cualquier grado significativo al IFN-p (interferón beta, IFNB), IFN-y (interferón gamma, IFNG) o IFN-w (interferón omega, iFnW).
En otro ejemplo, de acuerdo con la presente descripción, se proporcionan anticuerpos anti-IFN-a, que además se unen y neutralizan la actividad del IFN-w , respectivamente, descrito hasta ahora sin relación con el IFN-a en sus propiedades antigénicas, como por lo general, no reacciona de forma cruzada con antisueros o anticuerpos monoclonales en los inmunoensayos o en ensayos biológicos de neutralización antiviral. Por tanto, en un aspecto, la presente solicitud describe nuevas moléculas de unión a IFN, preferentemente anticuerpos monoclonales derivados de humanos, así como también fragmentos de los mismos que son capaces de unirse a/o neutralizar la actividad de al menos un subtipo de IFN-a humano y de IFN-w humano. Preferentemente, la actividad de unión y neutralización, respectivamente, de la molécula de unión al IFN es esencialmente la misma o al menos está en el mismo orden de magnitud para el/los subtipo(s) de IFN-a e IFN-u>.
Naturalmente, la presente descripción se extiende a los ácidos nucleicos, en particular el ADNc que codifica al menos una región variable, constante y/o determinante de la complementariedad de los anticuerpos de la presente invención, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, líneas celulares productoras de anticuerpos y células recombinantes. La presente descripción se refiere además a composiciones farmacéuticas, ensayos de diagnóstico y kits que comprenden las moléculas de unión o péptidos reconocidos por los anticuerpos aislados de acuerdo con la presente invención y los métodos terapéuticos basados en ellos.
Además, la presente solicitud también describe un proceso para la fabricación de un anticuerpo monoclonal anti-IFNA derivado de humanos, o un fragmento de unión a iFn del mismo, o de una composición que comprende el anticuerpo monoclonal anti-IFNA, o un fragmento de unión a IFN del mismo, cuya fabricación comprende la etapa de preparación del anticuerpo, fragmento de unión a IFN del mismo mediante la expresión en un organismo huésped recombinante del ADN transformante que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a IFN del mismo. En una descripción, la composición es una composición farmacéutica, en donde la etapa de preparación del anticuerpo o fragmento de unión a IFN del mismo va seguida de la mezcla del anticuerpo o fragmento de unión de IFN del mismo con un portador farmacéuticamente aceptable en la fabricación de una composición farmacéutica.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Secuencias de aminoácidos de la región variable, es decir cadena pesada y cadena ligera kappa/lambda (VH, VL) de anticuerpos humanos específicos anti-IFN-a de la presente invención. IgG1, kappa, anticuerpos específicos anti-IFN-a A: 5D1; B: 13B11; C: 19D11; D: 25C3; E: 26B9; F: 31B4, G: 8H1, H: 12H5 y del anticuerpo ilustrativo I: 50E11. Las regiones marco (FR) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se indican con las CDR subrayadas. Los aminoácidos en cursiva indican secuencias que no se han secuenciado pero que se obtienen de la base de datos. Debido a la estrategia de clonación, la secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal de la cadena pesada y la cadena ligera puede contener potencialmente alteraciones inducidas por el cebador en FR1, las que, sin embargo, no afectan sustancialmente la actividad biológica del anticuerpo.
Figura 2: Competencia cruzada - Mapeo de epítopos. La unión diferencial de los ACM anti-IFNA ilustrativos de la presente invención, a distintos sitios de unión se investigó en experimentos de competencia cruzada en A: IFNA2, B: IFNA4 y C: IFNA14. Como control que no se une al IFN-a (hIgG1) se ha usado un anticuerpo humano que se une a un antígeno no relacionado.
Figura 3: Determinación de la CE50 mediante ELISA. CE50 de unión del ACMh 5D1, 13B11,25C3 y 26B9 a A: IFNA2, B: IFNA4 y C: IFNA14. CE50 de unión a IFNA2/-4/-14 del ACMh D: 19D11 y E: 31B4.
Figura 4: La correlación de la presencia de autoanticuerpos, protectores y asociados a enfermedades, conocidos en pacientes con APS1 indica que los autoanticuerpos contra IFN-a evitan la aparición de lupus eritematoso en pacientes con APS1 (columnas ADNdc a IFNa14). Diana: Número de codificación del paciente con APS1 particular examinado en el estudio de correlación. Los anticuerpos anti-ADNdc son altamente específicos para el SLE y se usan en el diagnóstico de la enfermedad. Ningún de los pacientes con APS1 tiene lupus a pesar de la frecuente presencia de anticuerpos anti-ADNdc según lo evaluado por el análisis ProtoArray (Life Technologies). Los pacientes con APS1 presentan una serorreactividad pronunciada contra varios subtipos de IFN-a que son dianas farmacológicas clínicamente relevantes implicadas en muchos mecanismos moleculares implicados en el lupus. Los círculos indican la presencia, las celdas vacías la ausencia de anticuerpos particulares. Los pacientes 2,4, 13 y 21 (flechas negras) son TIDM. Los pacientes 10, 14, 16, 17 y 18 (flechas blancas) tienen características de ser T1DM pero no lo son. Los resultados sugieren una actividad neutralizante diferencial en el suero de pacientes con APS1 que padecen T1DM y los que no la padecen. Como se puede inferir de las Figuras 31 y 32, esta diferencia observada aquí parece deberse a las diferencias en los títulos de anticuerpos anti-IFN en ambas clases de pacientes, con títulos de anticuerpos mucho más altos en pacientes con APS1 que no padecen T1DM, en lugar de diferencias en la actividad neutralizante de anticuerpos anti-IFN individuales.
Figura 5: Los anticuerpos monoclonales anti-IFN-a derivados de humanos neutralizan la activación de STAT1 mediada por rhIFNA en células HEK 293T. Las células HEK 293T se dejaron sin tratar (-) o se estimularon (+) con rhIFNA humano recombinante o proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia (IFN g1), en ausencia de anticuerpos o en presencia de anticuerpos monoclonales de IFNA derivados de humanos o una IgG de control humana como se indica (Control). Los lisados celulares se sometieron a SDS-PAGE y los niveles de STAT1 fosforilada (pSTAT1) se visualizaron mediante inmunotransferencia. Los niveles totales de STAT1 o los niveles de tubulina sirven como control de carga. Concentración de anticuerpo: 5 pg/ml. Concentración de rhIFNA: 10 ng/ml (rhIFNA1), 2 ng/ml (todos los demás rhIFN); se usaron sobrenadantes que contenían IFNA g1 de células 293T que expresaban transitoriamente proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia en sus respectivas diluciones CE80. A1: Control: detección de STAT1 total y fosforilada (pSTAT1) mediante inmunotransferencia (WB) en células 293T después de la estimulación con 100 ng/ml de IFNA2/-4/-14. Estimulación de células 293T por IFNA2/-4/-14. (i): STAT1 fosforilado, (ii): STAT1 total, (iii): Control de carga de tubulina. Tiempo: indica la duración del tratamiento de las células con el respectivo IFN. Después de la estimulación, puede observarse STAT1 fosforilado para los tres subtipos de IFNA. Las posiciones de las respectivas bandas estándar de peso molecular (kDa) se indican a la izquierda de la transferencia, para comparación. A2: Control: detección de STAT1 total y fosforilada (pSTAT1) mediante inmunotransferencia (WB) en células 293T después de la estimulación con diferentes dosis de rhIFNA1, rhIFNA2 y rhIFNA16. B: Estimulación con IFNA1, IFNA2, IFNA4, g1 IFNA5 e IFNA6. Todos los anticuerpos ilustrativos, excepto 5D1, neutralizan IFNA1 de manera eficiente, y todos los anticuerpos ilustrativos neutralizan IFNA2, IFNA4 y g1 IFNA5. Los anticuerpos ilustrativos 25C3, 5D1 y 13B11 presentan una neutralización más débil de IFNA6. C: Estimulación con IFNA7, g1 IFNA8, IFNA10, IFNA14 e IFNA16. Todos los anticuerpos ilustrativos neutralizan IFNA7. Todos los anticuerpos ilustrativos, excepto 25C3 y 13B11, neutralizan g1 IFNA8 de manera eficiente. El IFNA10 es neutralizado de manera eficiente por todos los anticuerpos ilustrativos, excepto 25C3, mientras que el IFNA16 es neutralizado de manera eficiente solo por los anticuerpos ilustrativos 19D11, 5D1 y 13B11. D: Estimulación con IFNA17, IFNA21, IFNW, IFNB y g1 IFNG. Todos los anticuerpos ilustrativos neutralizan IFNA17, ytodos los anticuerpos ilustrativos, excepto 13B11, neutralizan IFNA21 de manera eficiente. Aparentemente, el IFNW solo se neutraliza de manera eficiente por los anticuerpos ilustrativos 26B9 y 31B4. Ninguno de los anticuerpos ilustrativos neutraliza el IFNB o g1 IFNG.
Figura 6: Representación esquemática de la construcción del indicador de luciferasa de luciérnaga (Firefly-Luciferase) y la construcción de luciferasa de Renilla (Renilla-Luciferase) usada como control interno de normalización. Elemento de respuesta de la transcripción TRE; CMV - citomegalovirus.
Figura 7: Los anticuerpos monoclonales anti-IFN-a derivados de humanos neutralizan la activación del gen indicador ISRE-Luciferasa inducido por rhIFNA en células HEK 293T. A y B: Prueba de anticuerpos ilustrativos anti-IFN-a 19D11,25C3, 26B9 y 31B4. Las células HEK293T que expresan transitoriamente construcciones del indicador dual de luciferasa ISRE se dejaron sin tratar (-) o se estimularon con rhIFN (+), en ausencia de anticuerpos o en presencia de anticuerpos monoclonales IFNA derivados de humanos o una IgG de control humana, como se indica. concentración de rhIFN: 2 ng/ml; concentración de anticuerpo: 5 pg/ml, C y D: Prueba de anticuerpos ilustrativos anti-IFN-a 5D1 y 13B11. Las células HEK 293T que expresan transitoriamente construcciones del indicador dual de luciferasa ISRE se trataron como en (A/B) y la actividad del indicador ISRE se analizó después de 24 horas. Concentración de rhIFNA: 1 ng/ml; concentración del anticuerpo: 5 ng/ml.) A/C: mediciones de las unidades relativas de luciferasa, B/D: cálculo del número de veces de cambio de la expresión. E: Neutralización de rhIFNA1, A2, A4, A5, A6, A7, A8, A10, A14, A16, A17, A21, rhIFNW y rhIFNB mediante los anticuerpos monoclonales ilustrativos derivados de humanos de la presente invención 8H1 y 12H5. El anticuerpo ilustrativo 8H1 neutraliza completamente al IFNW, junto con el IFNA1, A4, A5, A6, A7, A10, A16, A17 y A21, mientras que presenta una neutralización ligeramente más débil de IFNA2, A8 y A14. El anticuerpo ilustrativo 12H5 neutraliza todos los subtipos de IFNA y no el IFNW. Ni el anticuerpo ilustrativo 8H1, ni el 12H5, neutralizan el IFNB. Las HEK293T MSR se trataron como en A y la actividad del indicador ISRE se analizó después de 24 horas. concentración de rhIFN: 10 ng/ml (IFNA1), 1,3 ng/ml (IFNA16), 4 ng/ml (IFNA21), 1 ng/ml (IFNB) y 2 ng/ml (todos los demás IFN). Concentración de anticuerpo: 5 pg/ml.
Figura 8: Análisis de la CI50 del AcM 26B9 de IFNA ilustrativo derivado de humanos mediante ensayo de neutralización del indicador ISRE-Luciferasa. Gráficos de CI50 de neutralización por el anticuerpo ilustrativo 26B9 de A: IFNA2; B: IFNA4; C: IFNA5; D: IFNA8; E: IFNA14. Se muestran los resultados del análisis de la CI50 de una ronda confirmatoria de ensayos de neutralización para el anticuerpo ilustrativo 26B9 de F: IFNA1, G: IFNA2, H: IFNA4, I: IFNA5, J: IFNA6, K: IFNA7, L: IFNA8, M: IFNA10, N: IFNA14, O: IFNA16, P: IFNA17, Q: IFNA21 y R: IFNW. Los datos de la CI50 se resumen en la Tabla 4. URL en el eje Y = unidades relativas de luz, como en las figuras precedentes.
Figura 9: Análisis de la CI50 del AcM 25C3 anti-IFN-a ilustrativo derivado de humanos mediante el ensayo de neutralización del indicador ISRE Luciferasa. Ensayo realizado como se describe en la Figura 8. Gráficos de CI50 de neutralización por el anticuerpo ilustrativo 26B9 de: A: IFNA2; B: IFNA4; C: IFNA5; D: IFNA8 y E: IFNA14.
Figura 10: Análisis de la CI50 del AcM 19D11 anti-IFN-a ilustrativo derivado de humanos mediante el ensayo de neutralización del indicador ISRE Luciferasa. Ensayo realizado como se describe en la Figura 8. Gráficos de CI50 de neutralización por el anticuerpo ilustrativo 19D11 de: A: IFNA2; B: IFNA4; C: IFNA5; D: IFNA8; E: IFNA14. Gráficos de CI50 de neutralización de una ronda experimental confirmatoria por el anticuerpo ilustrativo 19D11 de F: IFNA1, G: IFNA2, H: IFNA4, I: IFNA5, J: IFNA6, K: IFNA7, L: IFNA8, M: IFNA10, N: IFNA14, O: IFNA16, P: IFNA17 y Q: IFNA21. Los datos de la CI50 se resumen en la Tabla 4.
Figura 11: A: Determinación y comparación de la unión de los ACM 19D11, 25C3, 26B9, 5D1 y 13B11 ilustrativos de la presente invención al IFNA1 e IFNA2 (ImmunoTools) mediante ELISA. El anticuerpo anti-IFNA-a 5D1 ilustrativo no reacciona de forma cruzada con el IFNA1. B: Determinación y comparación de la unión de los ACM 5D1, 13B11, 19D11, 25C3, 26B9 y 31B4 ilustrativos de la presente invención al IFNA8 e IFNA14 (proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia) mediante LIPS. El ACM 13B11 ilustrativo no reacciona de forma cruzada con el IFNA8 (g1IFNA8). C: Determinación y comparación de la unión de los ACM 5D1, 13B11 19D11, 25C3, 26B9 y 31B4 ilustrativos de la presente invención al IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA21 (todos de PBL) e IFNA14 (ATGen). El anticuerpo anti-IFNA-a 13B1 ilustrativo no reacciona de forma cruzada con el IFNA8 e IFNA21. El anticuerpo 19D11 reacciona de forma cruzada con el IFNA21, con una menor afinidad que con los otros subtipos de IFNA. Los ACM se probaron a 1 pg/ml en (C).
Figura 12: Ensayo LIPS - determinación de la unión de los anticuerpos de la presente invención a diferentes subtipos de IFNa (proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia). Unión de los anticuerpos ilustrativos de la presente invención a A: IFNA5; B: IFNA6 y C: INFA8. El anticuerpo anti-IFN-a 13B11 ilustrativo no muestra una reactividad cruzada sustancial con el IFNA8. Como control que no se une al IFN-a (hIgG1), se usó un anticuerpo humano que se une a un antígeno sin relación.
Figura 13: Ensayo LIPS - determinación de las características de unión de los anticuerpos 5D1, 13B11, 19D11, 25C3, 26B9 y 31B4 ilustrativos de la presente invención hacia el IFNA1, IFNA2, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA 21 (proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia). Como control que no se une a IFN-a (hIgG1), se usó un anticuerpo humano que se une a un antígeno no relacionado. Todos los anticuerpos se probaron a 0,5 pg/ml. Todos los subtipos de IFN-a usados en las Figuras 12 y 13 son proteínas de fusión de IFN-a-luciferasa Gaussia (g1IFNA).
Figura 14: Ensayo de inflamación de la oreja: prueba del efecto proinflamatorio de los subtipos de IFN humano en ratones. A: Cronograma experimental ilustrativo de 6 días. B: Las mediciones del grosor de la oreja de CytoEar se calcularon como el número de veces de cambio con relación a las mediciones del día 0 que las normalizadas para los controles de PBS relevantes, para cada cohorte. B1: Descripción general del efecto de todas las mediciones normalizadas. B2: Efectos de las inyecciones de IFNa2a e IFNa2b. B3: Efectos de las inyecciones de IFNa4 e IFNa14. Los cuatro subtipos de IFNA humanos probados pudieron inducir significativamente la hinchazón de la oreja después de la ID. Todas las orejas eran marcadamente más gruesas que las orejas tratadas con PBS. El IFNa14 fue el agente proinflamatorio más potente. Media /-EEM, 11-3 o ID = inyecciones intradérmicas de citocinas, M = Mediciones - grosor de la oreja y peso del animal, S = Sacrificio de los animales; flechas cortas - inyecciones de citocinas; flechas largas - días ilustrativos de inyecciones de anticuerpos anti-IFN-a.
Figura 15: Ensayo de inflamación de la oreja: prueba del efecto proinflamatorio de los subtipos de IFN humano en ratones. Las mediciones del grosor de la oreja de CytoEar se muestran como valores absolutos (mm) para cada cohorte. A: Descripción general del efecto de todas las mediciones. B: Efectos de las inyecciones de IFNa2a e IFNa2b. C: Efectos de las inyecciones de IFNa4 e IFNa14. Todas las indicaciones como en la Figura 14.
Figura 16: Ensayo de inflamación de la oreja: prueba del efecto proinflamatorio de los subtipos de IFN humano en ratones. Las mediciones del grosor de la oreja de CytoEar se muestran el número de veces de cambio desde el día 0 para cada cohorte. El grosor del día 0 se ha establecido en 1. A: Descripción general del efecto de todas las mediciones. B: Efectos de las inyecciones de IFNa2a e IFNa2b. C: Efectos de las inyecciones de IFNa4 e IFNa14. Todas las indicaciones como en la Figura 14.
Figura 17: Resumen del ensayo de inflamación de la oreja con respecto a las capacidades del subtipo de IFN-a humano para inducir la inflamación del oído. Valores de P obtenidos mediante la prueba ANOVa de 2 vías, ns (no significativo) = P > 0,05; * = P < 0,05; ** = P < 0,01; *** = P<0,001, **** = p<0,0001. Todas las orejas eran marcadamente más gruesas que las orejas tratadas con PBS; esto fue significativo en todos los grupos después de la 2a ID, desde el Día 3 hasta el final del experimento.
Figura 18: Ensayo LIPS: determinación y comparación de las características de unión de los anticuerpos anti-IFN-a 5D1, 13B11, 19D11, 25C3, 26B9 y 31B4 ilustrativos de la presente invención hacia el IFNy (IFNG), lFN-p1 (IFNB1), IFNe (IFNE), IFN-w (IFNW), tres IFNA (IL28A, IL28B e IL29) e IFNA10 (todas las proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia). A: Unión de los anticuerpos a los diferentes tipos de IFN. B: Diagrama recíproco, unión de los IFN por los anticuerpos. Los anticuerpos ilustrativos 26B9 y 31B4 muestran la unión del IFN-w (IFNW) además de su afinidad hacia el IFNA10. No pudo observarse una unión sustancial de los anticuerpos ilustrativos del lFNp1 (IFNB1), IFNe (IFNE), los tres IFNA e IFNy (IFNG).
Figura 19: Reactividad cruzada de los ACM hacia los IFNA de ratón (ELISA). hlgG1= anticuerpo sin especificidad relacionada con los IFNA (control negativo). A: Prueba de reactividad cruzada de los anticuerpos 5D1, 13B11, 19D11, 25C3, 26B9 y 31B4 ilustrativos contra el IFNA2, IFNA4 e IFNA14 humano y murino en un ensayo ELISA. Excepto el anticuerpo 25C3 que muestra reactividad cruzada hacia el IFNA2 murino, los otros anticuerpos no muestran, o solo muestran especificidad de unión residual, hacia los subtipos de IFNA murino probados. B: Reactividad cruzada de los ACM en IFNA de ratón (ensayo LIPS). Los anticuerpos 5D1 y 19D11 muestran reactividad cruzada hacia el g1mlFNA1 murino, en donde los otros anticuerpos solo muestran reactividad por debajo del nivel observado para el control negativo. Ninguno de los anticuerpos muestra reactividad cruzada hacia el subtipo g1mlFNA9 de IFN-a murino.
Figura 20: Análisis de la Cl50 del AcM 8H1 anti-lFN-a ilustrativo derivado de humanos mediante el ensayo de neutralización del indicador ISRE Luciferasa. Gráficos de Cl50 de neutralización del anticuerpo ilustrativo 8H1. A: IFNA1, B: IFNA2, C: IFNA4, D: IFNA5, E: IFNA6, F: IFNA7, G: IFNA8, H: IFNA10, l: IFNA14, J: IFNA16, K: IFNA17, L: IFNA21 y M: IFNW. Los datos de la Cl50 se resumen en la Tabla 4.
Figura 21: Análisis de la Cl50 del AcM 12H5 anti-lFN-a ilustrativo derivado de humanos mediante el ensayo de neutralización del indicador ISRE Luciferasa. Gráficos de Cl50 de neutralización del anticuerpo ilustrativo 12H5. A: IFNA1, B: IFNA2, C: IFNA4, D: IFNA5, E: IFNA6, F: IFNA7, G: IFNA8, H: IFNA10, l: IFNA14, J: IFNA16, K: IFNA17 y L: IFNA21. Los datos de la Cl50 se resumen en la Tabla 4.
Figura 22: Análisis de la Cl50 del AcM 50E11 anti-lFN-a ilustrativo derivado de humanos mediante el ensayo de neutralización del indicador ISRE Luciferasa. Gráficos de Cl50 de neutralización del anticuerpo ilustrativo 50E11. A: IFNA1, B: IFNA2, C: IFNA4, D: IFNA5, E: IFNA6, F: IFNA7, G: IFNA8, H: IFNA10, l: IFNA14, J: IFNA16, K: IFNA17, L: IFNA21 y M: IFNW. Los datos de la Cl50 se resumen en la Tabla 4.
Figura 23: Los anticuerpos monoclonales anti-lFN-a derivados de humanos neutralizan la unión de proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia a células HEK293T MSR que expresan endógenamente receptores de IFN en el ensayo de unión celular luminiscente. Las células se incubaron con los sobrenadantes de células HEK 293T que expresan proteínas de fusión de interferón-luciferasa gaussia en ausencia de inhibidores (-) o en presencia de inhibidores competitivos como se indica. A: Representación esquemática del ensayo de unión celular quimioluminiscente basado en la luciferasa. Un ligando de interés (3) se fusiona con la luciferasa Gaussia(4). La proteína de fusión se une a las células (1) que expresan receptores para el ligando de interés (2). Después de eliminar las proteínas de fusión que no se han unido, se añade un sustrato de la luciferasa (5) y se registra la emisión de luz (6). La salida de luz es proporcional a la cantidad de proteína de fusión unida. Los anticuerpos anti-ligando que compiten con los receptores por la unión del ligando de interés (7) conducen a una disminución del ligando unido y a una reducción de la producción de luz. B: Control: Las proteínas de fusión de IFNA-luciferasa Gaussia humanas se unen específicamente a las células HEK 293T MSR. La unión de las proteínas de fusión de lFNA5-luciferasa Gaussia (g1 IFNA5) a las células HEK 293T MSR se inhibe mediante el rhlFNA2 sin marcar (3 pg/ml) y mediante el anticuerpo monoclonal de IFNA derivado de humanos 19D11 (1,7 pg/ml). Un anticuerpo de control humano (hulgG, 15 pg/ml) no muestra ningún efecto. C: La unión de las proteínas de fusión del g1 IFNA2, A4, A5, a 6, A7, A8, A10, a 14, A16, A17 y A21 a las células HEK 293T m Sr se inhibe mediante el anticuerpo monoclonal ilustrativo 19D11 de IFN derivado humanos. La unión del g1 IFNB e IFNW no se ve afectada por el 19D11. La unión de todos los IFN g1 no se ve afectada por un anticuerpo humano de control (hulgG). Concentración de anticuerpo: 5 pg/ml. D: Neutralización de la unión del g1 IFNA16 y g1 IFNWpor los anticuerpos ilustrativos 19D11 y 26B9. Las células se trataron con el g1 IFNA16 o g1 IFNw como se indica en ausencia de anticuerpos (-) o en presencia de los anticuerpos ilustrativos 19D11, 26B9 o de un anticuerpo humano de control (hulgG). Concentración de anticuerpo: 10 pg/ml. El anticuerpo ilustrativo 19D11 es más potente que el 26B9 para neutralizar al g1 IFNA16. El anticuerpo ilustrativo 26B9 bloquea de manera eficiente la unión del g1 lFNW a sus receptores en las células 293T MSR, mientras que el anticuerpo ilustrativo 19D11 no muestra ningún efecto aparente contra este ligando.
Figura 24: Las proteínas de fusión IFNW-luciferasa Gaussia humanas se unen específicamente a las células HEK 293T MSR que expresan un AcM anti-IFNW transmembrana. Las células HEK 293T MSR se transfectaron inversamente con las cantidades indicadas de ADNc que codifica una versión unida a la membrana del AcM 26B9 anti-IFNW (26B9-TM) o con un vector vacío (simulación). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se añadió IFNW-luciferasa Gaussia (g1 IFNW) y se analizó la unión en el ensayo de unión celular quimioluminiscente. A: Control: El 26B9-TM se expresa en la superficie celular de las células HEK 293T MSR transfectadas. La expresión de anticuerpos de superficie se analizó 48 horas después de la transfección en un ELISA basado en células. B: El g1 IFNW se une específicamente a las células que expresan 26B9-TM en el ensayo de unión celular luminiscente.
Figura 25: Ensayo de competencia cruzada de anticuerpos anti-IFNW. La unión del g1 IFNW al 26B9-TM está sujeta a competencia, de forma dependiente de la dosis, por el 26B9 soluble y por el anticuerpo 31B4 clonalmente relacionado. Por el contrario, la unión no se ve afectada por una IgG de control o por el anticuerpo 8H1 anti-IFNW ilustrativo.
Figura 26: Análisis por SPR. A: Análisis detallado de los sensogramas relativos a la unión de los IFN humanos A1/B1:
IFNA2b, A2/B2: IFNA4, A3/B3: IFN14 y A4/B4: IFNco a los anticuerpos ilustrativos 19D11 (A1-A4) y 26B9 (B1-B4) de la presente invención. Se observó una cinética de unión de 1:1. Los antígenos se inyectaron en concentraciones de 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 15 nM, 25 nM, 50 nM y 100 nM. Las afinidades calculadas (valores KD [M]) se indican en los diagramas. C: El gráfico muestra los parámetros cinéticos derivados de las curvas ajustadas para la asociación (velocidad de asociación ka) y disociación (velocidad de disociación kd) de todos los anticuerpos probados. Las diagonales discontinuas indican las afinidades (KD). D: Valores de KD de anticuerpos ilustrativos de esta invención en comparación con el valor de SPR, citado en la bibliografía para la unión de biotina-estreptavidina. Las afinidades hacia el IFNA4 e IFNA14 humano están en el intervalo subpicomolar y en el intervalo subnanomolar para el IFN2b, respectivamente. El 26B9 también se une al IFNw humano con una afinidad subpicomolar.
Figura 27: Mapeo de epítopos. A: Unión de los anticuerpos de la presente invención a antígenos de longitud completa acoplados a la micromatriz. El eje Y indicaba la intensidad de la fluorescencia (URF) tras la detección con un anticuerpo secundario conjugado con Cy5. B: Matriz peptídica primaria de péptidos de 18 monómeros de IFNA2 humano contra el anticuerpo 19D11 de la presente invención. En el panel inferior se representan los péptidos que cubren la secuencia desde la asparagina 65 a la lisina 98 y de la lisina 117 a la serina 150. El anticuerpo 19D11 se une específicamente a los péptidos 19 y 32. C: Matriz peptídica primaria de péptidos de 18 monómeros de IFNA2 humano contra el anticuerpo 26B9 de la presente invención. En el panel inferior se representan los péptidos que cubren la secuencia desde el ácido aspártico 77 hasta la lisina 110. El anticuerpo 26B9 se une específicamente al péptido 22. D: Matriz peptídica primaria de péptidos de 18 monómeros de IFNAW humano contra el anticuerpo 26B9 de la presente invención. En el panel inferior se representan los péptidos que cubren la secuencia desde la metionina 102 a la alanina 135. El anticuerpo 26B9 se une específicamente al péptido 23.
Figura 28: Ensayo de inflamación de la oreja CytoEar IFNA14. Probar el efecto de diferentes anticuerpos bloqueadores del IFNA de la presente invención después de la inflamación inducida por hIFNA14. Para inducir la inflamación, se inyectaron 20 pl de IFNa14 por oreja a una concentración de 25 pg/ml. También se realizó la medición del grosor antes de aplicar la inyección, y con dos mediciones por oreja. A: Cronograma experimental ilustrativo de 10 días. B: Descripción general del tratamiento experimental de los grupos de animales experimentales A a I. Ref. A - Anticuerpo de referencia específico del IFNA. Las mediciones del grosor de la oreja de CytoEar se calcularon como el número de veces de cambio con relación a las mediciones del día 0 que las normalizadas para los controles de PBS relevantes, para cada cohorte. C: Descripción general del efecto de todas las mediciones normalizadas. D: Efectos del tratamiento con 26B9 después de las inyecciones de IFNa14. E: Efectos del tratamiento con 19D11 después de las inyecciones de IFNa14. F: Efecto del tratamiento con el anticuerpo anti-IFN-a de referencia Ref. A después de las inyecciones de IFNa14. El tratamiento con los anticuerpos 26B9 y 19D11 (reducción significativa del grosor de la oreja en los días 7, 9, 10, respectivo a los días 4, 7-10 para el 19D11) de la presente invención conduce a una reducción pronunciada del grosor de la oreja, resultante de las inyecciones de IFNa14, en comparación con el tratamiento de control con IgG (sin especificidad de unión relacionada con el IFN-a) y de tratamiento con Ref. A. Media /-EEM, ID = inyecciones intradérmicas de citocinas, M = Mediciones -grosor de la oreja, S = Sacrificio de los animales; ID - inyecciones de citocinas; los anticuerpos probados 26B9, 19D11, Ref.A y la IgG de control se inyectaron el día 0 (IP).
Figura 29: Ensayo de inflamación de la oreja CytoEar IFNA5. Probar el efecto de diferentes anticuerpos bloqueadores del IFNA de la presente invención después de la inflamación inducida por hIFNA5. Para inducir la inflamación, se inyectaron 20 pl de IFNa5 por oreja a una concentración de 25 pg/ml. También se realizó la medición del grosor antes de aplicar la inyección, y con dos mediciones por oreja. A: Cronograma experimental ilustrativo de 10 días. B: Descripción general del tratamiento experimental de los grupos de animales experimentales A a I. Ref. A - anticuerpo de referencia específico del IFNA. Las mediciones del grosor de la oreja de CytoEar se calcularon como el número de veces de cambio con relación a las mediciones del día 0 que las normalizadas para los controles de PBS relevantes, para cada cohorte. C: Descripción general del efecto de todas las mediciones normalizadas. D: Efectos del tratamiento con 26B9 después de las inyecciones de IFNa5. E: Efectos del tratamiento con 19D11 después de las inyecciones de IFNa5. F: Efecto del tratamiento con el anticuerpo anti-IFN-a de referencia Ref. A después de las inyecciones de IFNa5. El tratamiento con los anticuerpos 26B9 y 19D11 de la presente invención conduce a una reducción del grosor de la oreja, resultante de las inyecciones de IFNa5, (reducción significativa para 26B9 en los días 4, 6, 7, 8 y 9: para 19B11 en los días 7-9). Véase la descripción de la Figura 26 para detalles adicionales. Los anticuerpos probados 26B9, 19D11, Ref.Ay la IgG de control se inyectaron el día 0 (IP).
Figura 30: Ensayo de inflamación de la oreja CytoEar IFNw. Prueba del efecto de diferentes anticuerpos bloqueadores del IFNA de la presente invención después de la inflamación inducida por el hlFNw (IFNw). Para inducir la inflamación, se inyectaron 20 pl de IFNw por oreja a una concentración de 6,25 pg/ml, 125 ng/oreja. También se realizó la medición del grosor antes de aplicar la inyección, y con dos mediciones por oreja. A: Cronograma experimental ilustrativo de 10 días. B: Descripción general del tratamiento experimental de los grupos de animales experimentales A a I. Ref. A - anticuerpo de referencia específico del IFNA. Las mediciones del grosor de la oreja de CytoEar se calcularon como el número de veces de cambio con relación a las mediciones del día 0 que las normalizadas para los controles de PBS relevantes, para cada cohorte. C: Descripción general del efecto de todas las mediciones normalizadas. D: Efectos del tratamiento con 26B9 después de inyecciones de IFNw. E: Efectos del tratamiento con 19D11 después de inyecciones de IFNw. F: Efecto del tratamiento con el anticuerpo anti-IFN-a de referencia Ref. A después de inyecciones de IFNw. El tratamiento con el anticuerpo 26B9 de la presente invención conduce a una reducción significativa del grosor de la oreja, resultante de las inyecciones de IFNw en el día experimental 9. El tratamiento con 19D11 o Ref.A conduce a una reducción aparentemente nula o muy ligera del grosor de la oreja (no significativa (ns) en comparación con las inyecciones de la IgG de control en todos los días). Véase la descripción de la Figura 26 para detalles adicionales. Los anticuerpos probados 26B9, 19D11, Ref.A y la IgG de control se inyectaron el día 0 (IP).
Figura 31: Comparación de la actividad neutralizante del IFN en el suero de pacientes con APS1/APECED y con diabetes tipo 1 (T1D) o sin esta(N). A: IFNA1, B: IFNA2a, C: IFNA4, D: IFNA5, E: IFNA6, F: IFNA7, G: IFNA8, H: IFNA10, 1: IFNA14, J: IFNA16, K: IFNA17, L: IFNA21 y M: IFNW
Figura 32: Comparación de la actividad neutralizante del IFN en el suero de pacientes con APS1/APECED y con diabetes tipo 1 (T1D) o sin esta(N). Como en la Figura 31, sin embargo, con escala logarítmica en el eje Y para una mejor visualización de la actividad neutralizante medida en el suero de pacientes con APS1/APECED y con T1D. A: IFNA1, B: IFNA2a, C: IFNA4, D: IFNA5, E: IFNA6, F: IFNA7, G: IFNA8, H: IFNA10, 1: IFNA14, J: IFNA16, K: IFNA17, L: IFNA21 yM: IFNW. Los pacientes con APS1 que no padecen T1D (N) muestran, para todos los anticuerpos, un título más alto en su suero que los pacientes con T1D-APS1. Esta diferencia de títulos puede indicar requisitos terapéuticos diferenciales en ambos grupos de pacientes.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones. En particular, la invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales humanos así como también a fragmentos, derivados y variantes de los mismos que reconocen y, lo que es más importante, son capaces de neutralizar la actividad de diferentes subtipos de IFN-a como se define en las reivindicaciones; véase también la sección de antecedentes, supra, para la descripción de los subtipos de IFNA, que incluyen elIFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17 e IFNA21, en donde los genes del IFNA1 e IFNA13 codifican el mismo subtipo IFNA1/13.
Como se describe en los Ejemplos, los anticuerpos ilustrativos de la presente invención se han aislado mediante un método, objeto de y descrito en, la solicitud internacional del solicitante WO2013/098419 A1, basado en el cribado de sueros de pacientes con una tolerancia central y/o periférica deteriorada o con pérdida de la autotolerancia, tales como los pacientes con APECED/APS1, en busca de autoanticuerpos contra las proteínas IFN-a, así como también mediante el uso de un método nuevo de aislamiento de anticuerpos de los linfocitos B de un sujeto que padece un trastorno autoinmunitario o una enfermedad autoinflamatoria, que es objeto y se describe en la solicitud internacional del solicitante WO2013/098420 A1.
Los experimentos realizados de acuerdo con la presente invención se dirigieron hacia la provisión de moléculas de unión a IFN-a, de especificidades de subtipo de IFN-a selectivas, es decir anticuerpos y fragmentos de unión a IFN-a de los mismos cuya inmunorreactividad ha demostrado ser protectora en pacientes con APECED/APS1 contra la aparición de, por ejemplo, SLE o al menos reducir la manifestación de los síntomas del SLE.
En consecuencia, en un primer aspecto general, la presente descripción proporciona un anticuerpo anti-interferón-alfa (IFN-a) derivado de humanos o un fragmento de unión a IFN-a, un derivado sintético o biotecnológico del mismo que muestra una especificidad de unión y preferentemente una actividad neutralizante hacia todos o sólo un subintervalo o subtipos particulares de IFN-a. En un ejemplo preferido de la presente descripción, el anticuerpo anti-IFN-a o el fragmento de unión a IFN-a
(i) se une a los subtipos IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA10 e IFNA14 del IFN-a humano;
(ii) se une a al menos a uno de los subtipos IFNA1/13 (IFNAIb), IFNA8, IFNA16 y/o IFNA21 de IFN-a humano; y/o
(iii) es capaz de neutralizar una actividad biológica de al menos uno de los subtipos de IFN-a humano. En consecuencia, la presente invención proporciona un grupo de anticuerpos de diferente especificidad de subtipo de IFNa, diferente de, y que proporciona, un perfil de aplicación más amplio que los anticuerpos conocidos en la técnica.
Todos los subtipos de IFNa utilizan el receptor heterodimérico de IFNa/p (IFNAR) y generan una señal en la célula receptora a través de las tirosinas cinasas citoplasmáticas Tyk2 y Jakl que realizan la fosforilación y la activación concomitante de STAT1 y STAT2 (transductores de señales y activadores de la transcripción). Las proteínas STAT se translocan al núcleo y activan la expresión de genes que tienen sitios GAS o ISRE, o ambos, en sus promotores (Borden y otros, Nat. Rev. Drug Discov. 6 (2007), 975-990; Hu y otros, Immunol. Rev. 226 (2008), 41-56; van Boxel-Dezaire y otros, Immunity 25 (2006), 361-372). Este mecanismo de activación se ha usado dentro de la presente invención, así como también para diseñar métodos in vitro de medición de la actividad del IFN, tales como el ensayo de activación de STAT (transductores de señales y activadores de la transcripción) basado en células y el ensayo con gen indicador de ISRE (elemento de respuesta estimulado por interferón) como se describe y usa en la presente descripción (Cignal Reporter Assay, Qiagen), por ejemplo, en el Ejemplo 3 y en las Figuras 5 a 7 para monitorear las capacidades neutralizantes de los anticuerpos de la presente invención. Como se describió en detalle en ese documento, se ha encontrado que los anticuerpos de la presente invención tienen una potente actividad neutralizante hacia varios subtipos de IFNA como se especifica en detalle más abajo.
Por lo tanto, en un ejemplo de la presente descripción, la actividad biológica neutralizada por el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente invención es la señalización por el IFN-a en un ensayo de activación de STAT (transductores de señales y activadores de la transcripción) basado en células, en un ensayo con gen indicador de ISRE (elemento de respuesta estimulado por interferón), y/o en un ensayo de unión celular (véase el Ejemplo 9).
Además, las afinidades de unión de los anticuerpos de la presente invención se han probado mediante ELISA, LIPS y ensayos de unión celular como se describe en la presente descripción, por ejemplo, en los Ejemplos 1, 2, 6 y 9 y se muestra en las Figuras 3, 7 a 13 y 18 a 27. De acuerdo con los resultados de estos experimentos, la presente invención proporciona varios anticuerpos ilustrativos anti-IFN-a que muestran afinidades de unión diferenciales hacia distintos subtipos de IFNA, que ejemplifican las características de unión y neutralización de las moléculas de unión a IFN-a proporcionadas en la presente descripción.
Por ejemplo, el anticuerpo ilustrativo anti-IFN-a 19D11 de la presente invención se une al menos a los subtipos de IFN-a humano IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA21 (véase, por ejemplo, Figuras 13 y 18 a 27) y tiene propiedades de neutralización como se describe en los Ejemplos y en las Figuras 5 a 7. En consecuencia, en un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción, además de a los subtipos de IFN-a definidos en la sección (i), supra, se une al menos a los subtipos de IFN-a humanos IFNA1/13, IFNA8, IFNA16 e IFNA21. Por tanto, en una descripción preferida, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 19D11 como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia los diferentes subtipos de IFN-a.
Los anticuerpos ilustrativos anti-IFN-a 26B9 y 31B4 de la presente invención se unen al menos a los subtipos de IFN-a humano IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14 e IFNA21 (véanse, por ejemplo, las Figuras 13 y 18 a 27) y tienen propiedades de neutralización como se describe en los Ejemplos y en las Figuras 5 a 7. Por lo tanto, en un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción, además de a los subtipos de IFN-a definidos en la sección (i), supra, se une al menos a los subtipos de IFN-a humanos IFNA1/13, IFNA8 e IFNA21. Por tanto, en otra descripción preferida, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 26B9 o 31B4 como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia los diferentes subtipos de IFN-a.
El anticuerpo ilustrativo anti-IFN-a 25C3 de la presente invención se une al menos a los subtipos de IFN-a humano IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA21 (véase, por ejemplo, Figuras 13 y 18 a 19) y tiene propiedades de neutralización como se describe en los Ejemplos y en las Figuras 5 a 7, y muestra en particular una capacidad de neutralización reducida hacia el IFNA6, IFNA8, IFNA10 e IFNA16. Por tanto, en un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción, además de a los subtipos de IFN-a definidos en la sección (i), supra, se une al menos a los subtipos de IFN-a humanos IFNA1/13, IFNA8, IFNA16 e IFNA21, pero muestra solo una neutralización débil del IFNA16. En un ejemplo adicional, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción muestra además solo una neutralización débil del IFNA6, IFNA8 e IFNA10. Por tanto, en otra descripción preferida, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 25C3, como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia los diferentes subtipos de IFN-a.
El anticuerpo ilustrativo anti-IFN-a 5D1 de la presente invención se une al menos a los subtipos de IFN-a humano IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA21 pero no al IFNA1/13 y tiene propiedades de neutralización como se describe en los Ejemplos y en las Figuras 5 a 7. En consecuencia, en un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción, además de a los subtipos de IFN-a definidos en la sección (i), supra, se une al menos a los subtipos de IFN-a humanos IFNA8, IFNA16 e IFNA21 pero no al IFNA1/13. Por tanto, en otra descripción preferida, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 5D1 como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia los diferentes subtipos de IFN-a.
El anticuerpo ilustrativo anti-IFN-a 13B11 de la presente invención se une al menos a los subtipos de IFN-a humano IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA10, IFNA14 e IFNA16 pero no al IFNA8 y tiene propiedades de neutralización como se describe en la Ejemplos y en las Figuras 5 a 7. Por lo tanto, en un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción, además de los subtipos de IFN-a definidos en la sección (i), supra, se une al menos a los subtipos de IFN-a humanos IFNA1/13 e IFNA16 pero no al IFNA8. Por tanto, en una descripción preferida adicional, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 13B11 como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia los diferentes subtipos de IFN-a.
El anticuerpo ilustrativo anti-IFN-a 8H1 de la presente invención se une al menos a los subtipos de IFN-a humano IFNA1, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA10, IFNA16, IFNA17 e IFNA21, mientras muestra una neutralización más débil del IFNA2, IFNA8 e IFNA14 y tiene propiedades de neutralización como se describe en los Ejemplos y en la Figura 7. Por lo tanto, en un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción, se une además de a los subtipos de IFN-a definidos en la sección (i), supra, al menos a los subtipos de IFN-a humanos IFNA1/13, IFNA17 e IFNA21. Portanto, en una descripción aún más preferida, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 8H1 como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia los diferentes subtipos de IFN-a.
El anticuerpo ilustrativo anti-IFN-a 12H5 de la presente invención se une y neutraliza todos los subtipos de IFN-a humano, específicamente, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17 e IFNA21 y tiene propiedades de neutralización como se describe en los Ejemplos y en la Figura 7. Por lo tanto, en un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se une a todos los subtipos de IFN-a humanos. Por tanto, en una descripción aún más preferida, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 12H5 como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia los diferentes subtipos de IFN-a.
En un ejemplo, el anticuerpo anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción reconocen y/o neutralizan al IFNA21, preferentemente con al menos, sustancialmente, la misma preferencia de unión/actividad neutralizante que cualquier otro IFNA reconocido y/o neutralizado por el anticuerpo o fragmento del mismo.
Además, después de los resultados preliminares obtenidos en los experimentos realizados dentro del alcance de la presente invención, ya se indicó que los ejemplos de anticuerpos proporcionados por la presente invención se unen, además de al menos a un subtipo de IFNA, a otro interferón de tipo I, es decir, IFN-omega (también se indica como IFNW o como IFN-w en la presente descripción) como se muestra, de manera ilustrativa, para los anticuerpos 26B9 y 31B4 en la Figura 18, los experimentos adicionales confirmaron las sorprendentes propiedades neutralizantes de algunos de los anticuerpos en cuestión hacia el IFNW, es decir, para los anticuerpos 26B9 y 31B4 en la Figura 5 y para el anticuerpo 26B9, en comparación con el anticuerpo 19D11 en la Figura 24, para el anticuerpo 26B9 en las Figuras 25-26, para el anticuerpo 3 lB4 en la Figura 25, para el anticuerpo 8H1 en las Figura 7 y 20 y para el anticuerpo 50E11 en la Figura 22. En consecuencia, en la presente descripción también se describen anticuerpos anti-IFN-a y fragmentos de unión a IFN-a de los mismos que, además de al menos a un subtipo de IFNA, se unen al menos a otro interferón de tipo I, en donde el otro interferón de tipo I es, preferentemente, el IFN-w humano ( IFNW). Las moléculas de unión a IFN correspondientes también pueden denotarse como molécula de unión a IFNA/IFNW o anticuerpo anti-IFNA/IFNW. Preferentemente, el anticuerpo anti-IFN-a o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción, además de al menos a un subtipo de IFN-a, es capaz de neutralizar una actividad biológica del IFN-w humano (IFNW). Dicho anticuerpo tiene un valor particular para uso en la prevención, tratamiento o diagnóstico de pacientes que tienen un título más alto de IFNW y/o para pacientes que muestran tanto un título aumentado de un subtipo de IFNA como de IFNW. Por tanto, en una descripción aún más preferida, el anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico del mismo tiene las características inmunitarias y/o propiedades biológicas del anticuerpo 26B9, 31B4, 8H1 o 50E11 como se ilustra en los Ejemplos y Figuras adjuntos, en particular con respecto a su actividad neutralizante hacia el IFN-w.
Las moléculas de unión al IFNA/IFNW de la presente descripción son particularmente útiles en la prevención, terapia y/o diagnóstico de enfermedades asociadas con un aumento en la expresión o el nivel de actividad del IFNW en un sujeto, en particular en caso de que la expresión o el nivel de actividad del IFNA también aumente. Por ejemplo, el IFNW se encuentra en el suero de pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE) y enfermedad renal, además de niveles elevados de los subtipos de IFNA; ver, por ejemplo, MC Dall'Era y otros, Ann. Rheum. Dis. 64 (2005), 1692­ 1697 y Han y otros, Genes and Immunity 4 (2003), 177-186. En consecuencia, las moléculas de unión a IFNA/IFNW de la presente descripción que bloquean, en sentido amplio, múltiples IFN de tipo I, pueden ser más ventajosas como agentes terapéuticos potenciales que un anticuerpo específico solo para el IFNA. Además, se ha informado que los sueros de pacientes con artritis reumatoide además de IFN-p tienen un nivel elevado de IFN-w con relación a los controles normales, pero no de IFN-a; véase Lavoie y otros, J. Immunol. 186 (2011), 186, resumen de congreso 101.37. Por tanto, las moléculas de unión a IFNA/IFNW de la presente descripción también pueden resultar útiles en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios que no implican, o no implican significativamente, al IFNA sino al IFNW.
Por eso, en un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a moléculas de unión al IFNW que son derivados sintéticos o biotecnológicos del anticuerpo anti-IFN-a derivado de humanos 26B9, 31B4, 8H1 o 50E11 que retienen sustancialmente su actividad neutralizante hacia el IFNW, pero perdieron su especificidad de unión a uno o más subtipos de IFN-a o la capacidad de unión al IFN-a por completo. Además, la presente descripción se refiere a cualquier molécula de unión al IFNW, preferentemente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que compita con cualquiera de los anticuerpos anti-IFN-a derivados de humanos 26B9, 31B4, 8H1 o 50E11 para unirse y/o neutralizar al IFNW en cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos, pero, no necesariamente, con respecto a la unión y/o neutralización del IFN-a.
Además, como se muestra en la Figura 18, los anticuerpos anti-IFN-a ilustrativos de la presente descripción presentan una afinidad mucho más débil o nula hacia los interferones de tipo I IFN-£, IFN-p, hacia el IFN-y como un interferón de tipo II y/o hacia el IFN-A (IL-29, IL-28A e IL-28B en la Figura 18) como interferones de tipo III. En consecuencia, en un ejemplo, la presente descripción se refiere a los anticuerpos anti-IFN-a y fragmentos de unión a IFN-a de los mismos que se unen preferentemente a interferones de tipo I sobre los de tipo II y/o tipo III, con mayor preferencia los anticuerpos anti-IFN-a y fragmentos de unión a IFN-a de la presente invención no reconocen sustancialmente los interferones de tipo II y tipo III.
La presente descripción ejemplifica moléculas de unión a IFN-a, es decir anticuerpos y fragmentos de unión a IFN-a de los mismos, que pueden caracterizarse generalmente por comprender en su región variable, es decir, dominio de unión, al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la Vh y/o la Vl de la región variable que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 1 de (Vh) (SEQ ID NO: 2, 10, 18, 22, 30, 38, 76, 84 y 92) y (Vl) (SEQ ID NO: 4, 12, 20, 24, 32, 40, 78, 86 y 94) - véanse las secuencias de CDR ilustrativas subrayadas en la Figura 1 e identificadas en la Tabla 1. Sin embargo, como se discute a continuación, el experto en la técnica es muy consciente del hecho de que, además o alternativamente, pueden usarse CDR, que difieren en su secuencia de aminoácidos de las indicadas en la Figura 1 en uno, dos, tres o incluso más aminoácidos, en particular en el caso de las CDR2 y CDR3.
Con respecto a las preferencias de unión particulares y las capacidades de neutralización hacia subtipos de IFN-a e IFNW específicos, como se muestra en los Ejemplos y Figuras, la caracterización general proporcionada anteriormente puede subdividirse en los siguientes grupos de moléculas de unión de IFN-a, es decir anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos de la presente descripción.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA21, que comprende en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o la Vl representadas en la Figura 1 (Vh) (SEQ ID NO: 18); y la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NO: 20);
(b) una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 19D11.
Como se ilustra en el Ejemplo 5 y se muestra en la Figura 27A/B, se han identificado epítopos en el IFNA2 reconocidos específicamente por el anticuerpo ilustrativo 19D11. En consecuencia, en un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a, derivado sintético o biotecnológico de la presente descripción es capaz de unirse a un epítopo en el IFNA2 que consiste de la secuencia de aminoácidos SAAWDETLLDKFYTELYQ (SEQ ID NO: 99) y/o RITLYLKEKKYSPCAWEV ( SEQ ID NO: 100).
En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, iFnA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14 e IFNA21, que comprende en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o Vl representadas en la Figura 1 (Vh) (SEQ ID n O: 30 o SEQ ID NO: 38); y la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 40);
(b) una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 26B9 o 31B4. Por tanto, en esta descripción, el anticuerpo anti-IFN-a o el fragmento de unión a IFN-a preferentemente también reconoce y neutraliza al IFNW; véase también supra.
Como se ilustra en el Ejemplo 5 y se muestra en la Figura 27C/D, se han identificado epítopos en el IFNA2 e IFNW reconocidos específicamente por el anticuerpo ilustrativo 26B9. En consecuencia, en un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es capaz de unirse a un epítopo del IFNA2 que consiste de la secuencia de aminoácidos YTELYQQLNDLEACVIQG (SEQ ID NO: 101) y/o un epítopo del IFNAW que consiste de la secuencia de aminoácidos TGLHQQLQHLETCLLQVV (SEQ ID NO: 102).
En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en los subtipos IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA21, que comprenden en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o Vl representadas en la Figura 1 (Vh) (SEQ ID n O: 22); y la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NO: 24); (b) una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 25C3.
En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en los subtipos IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA21 pero no al IFNA1/13, que comprende en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o Vl representadas en la Figura 1 (Vh) (SEQ ID n O: 2); y la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NO: 4); (b) una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 5D1.
En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en los subtipos IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA10, IFNA14 e IFNA16, que comprenden en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o Vl representadas en la Figura 1 (Vh) (SEQ ID n O: 10); y la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NO: 12); (b) una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 13B11.
En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en IFNA1, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA10, IFNA16, IFNA17 e IFNA21, que comprende en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable VH y/o VL representadas en la Figura 1 (VH) (Se Q ID NO: 76); y en la Figura 1 (VL) (SEQ ID NO: 78);
(b) una secuencia de aminoácidos de la región VH y/o VL como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 8H1. Por tanto, en esta descripción, el anticuerpo anti-IFN-a o el fragmento de unión a IFN-a preferentemente también reconoce y neutraliza al IFNW; véase también supra.
En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, iFnA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14 e IFNA21, que comprende en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o Vl representadas en la Figura 1 (Vh) (SEQ ID n O: 84); y la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NO: 86); (b) una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 12H5.
En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción es un anticuerpo de origen humano y se une al menos a un subtipo de IFN-a seleccionado del grupo que consiste en IFNA1/13, IFNA2, IFNA4, IFNA5, iFnA6, IFNA8, IFNA10, IFNA14 e IFNA21, que comprende en su región variable:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable VH y/o VL representadas en la Figura 1 (VH) (s Eq ID NO: 92); y la Figura 1 (VL) (SEQ ID NO: 94);
(b) una secuencia de aminoácidos de la región VH y/o VL como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b).
Además, o alternativamente, el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se caracteriza por presentar las características de unión del anticuerpo ilustrativo 50E11. Por tanto, en este ejemplo, el anticuerpo anti-IFN-a o el fragmento de unión a IFN-a preferentemente también reconoce y neutraliza al IFNW al menos hasta cierto grado; véase también supra.
En resumen, en un aspecto, la presente descripción se refiere a anticuerpos monoclonales derivados de humanos y fragmentos de unión a IFN-a, así como también a derivados sintéticos y biotecnológicos de los anticuerpos en cuestión ejemplificados en la presente descripción que comprenden en sus regiones variables:
(a) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o Vl representadas en
(i) la Figura 1 (Vh) (SEQ ID NOs: 2, 10, 18, 22, 30, 38, 76, 84 y 92); y
(ii) la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NOs: 4, 12, 20, 24, 32, 40, 78, 86 y 94); y/o
(b) una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1;
(c) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a); y/o
(d) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (b);
preferentemente en donde el anticuerpo, fragmento de unión a IFN-a o derivado sintético y biotecnológico del mismo retiene al menos una de las características inmunitarias y/o actividades biológicas de cualquiera de los anticuerpos en cuestión descritos en los Ejemplos, por ejemplo, actividad neutralizante hacia diferentes subtipos de IFNAy/o IFNW.
Además, en un aspecto, la presente descripción se refiere a un anticuerpo neutralizante de IFN-a o fragmento de unión de IFN-a del mismo que compite con dicho anticuerpo o fragmento del mismo como se definió anteriormente en la presente descripción para unirse a, y neutralizar, al menos a un subtipo de IFN-a y/o IFNW. Además, en un ejemplo, el anticuerpo de la presente descripción o el fragmento de unión a IFN-a del mismo contiene al menos una CDR3 de la región variable Vh y/o Vl representada en
(i) la Figura 1 (Vh) (SEQ ID NOs: 2, 10, 18, 22, 30, 38, 76, 84 y 92); y
(ii) la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NOs: 4, 12, 20, 24, 32, 40, 78, 86 y 94);
o una CDR3 correspondiente que difiere en su secuencia de aminoácidos por sustitución, deleción y/o adición de 6, 5 o 4, preferentemente no más de 3 y con la máxima preferencia no más de 2 o 1 aminoácidos.
Para proporcionar los anticuerpos particularmente adecuados para aplicaciones terapéuticas, es decir para evitar respuestas inmunitarias a los anticuerpos de la presente invención, como se observa para anticuerpos extraños tales como los anticuerpos de ratón en humanos (respuesta HAMA), la presente descripción se refiere a anticuerpos completamente humanos o derivados de humanos, ya que los anticuerpos de IFN-a ilustrativos, que se describen en los Ejemplos que ilustran la presente invención, se han derivado de un paciente humano.
En este contexto, a diferencia de los anticuerpos humanizados y de los anticuerpos similares a los de humanos, véase también la discusión infra, los anticuerpos derivados de humanos de la presente descripción se caracterizan por comprender CDR que han sido detectadas por el cuerpo humano y, por lo tanto, carecen sustancialmente del riesgo de ser inmunogénicas. Por lo tanto, el anticuerpo de la presente descripción aún puede denotarse como derivado de humanos si al menos una, preferentemente dos y, con la máxima preferencia, las tres CDR de una o ambas cadenas variables ligera y pesada del anticuerpo se derivan de los anticuerpos humanos ilustrados en la presente descripción.
Los anticuerpos derivados de humanos de la presente descripción también pueden llamarse "autoanticuerpos humanos" para enfatizar que esos anticuerpos se expresaron inicialmente por un sujeto humano y no son construcciones seleccionadas in vitro generadas, por ejemplo, por medio de bibliotecas de presentación en fagos que expresan inmunoglobulinas humanas o anticuerpos xenogénicos generados en un animal transgénico que expresan parte del repertorio de inmunoglobulinas humanas, que hasta ahora representaba el método más común para tratar de proporcionar anticuerpos similares a los de humanos. Por otra parte, el anticuerpo de origen humano de la presente descripción puede denotarse como sintético, recombinante y/o biotecnológico para distinguirlo de los anticuerpos de suero humano per se, que pueden purificarse a través de la proteína A o por columna de afinidad.
Sin embargo, la presente invención usa y prevé estudios adicionales de los anticuerpos de la presente invención en modelos animales, por ejemplo, en ratones transgénicos que expresan IFN-a humano. Para evitar efectos inmunogénicos en los animales experimentales análogos a la respuesta HAMA en humanos, en un aspecto, el anticuerpo de la presente descripción puede ser un anticuerpo humanizado, xenogénico o quimérico humano-murino, preferentemente un anticuerpo quimérico roedor-humano o rodentizado, y lo que más se prefiere es un anticuerpo quimérico murino-humano o murinizado.
Como se describe más abajo en la presente descripción con más detalle, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención puede ser o derivar de cualquier tipo, clase o subclase de una molécula de inmunoglobulina. Sin embargo, en un ejemplo preferido, se proporciona el anticuerpo de la presente descripción, que es del isotipo IgG, con la máxima preferencia de la subclase IgG1.
Para proporcionar dichos anticuerpos humanizados, quiméricos y en particular completamente humanos, fragmentos y/o fragmentos Fab nativos de los mismos, el anticuerpo de la presente descripción comprende además, preferentemente, una región constante Ch y/o Cl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos Ch y Cl establecidas en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 6, 8, 14, 16, 26, 28, 34, 36, 42, 44, 72, 74, 80, 82, 88, 90, 96 y 98) o una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 % de identidad, preferentemente un 70 % de identidad, con mayor preferencia un 80 % de identidad, aún con mayor preferencia un 90 % de identidad, y se prefiere particularmente al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99 %, de identidad con las secuencias de referencia mencionadas.
Además, o alternativamente, la región marco del anticuerpo de la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la Figura 1 (Vh) (SEQ ID NO: 2, 10, 18, 22, 30, 38, 76, 84 y 92); y Figura 1 (Vl) (SEQ ID NO: 4, 12, 20, 24, 32, 40, 78 y 86) o una secuencia de aminoácidos con al menos 60 % de identidad, preferentemente 70 % de identidad, con mayor preferencia 80 % de identidad, aún con mayor preferencia 90 % de identidad, y se prefiere particularmente al menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, de identidad con las secuencias de referencia mencionadas.
Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos de la presente invención se han aislado de pacientes con APECED/APS1. En este contexto, los experimentos descritos en la solicitud internacional en tramitación del solicitante WO2013/098419 sorprendentemente reveló que los pacientes con APECED/APS1 muestran un autoinmunosoma, es decir un perfil de autoanticuerpos que comprende también un amplio espectro de moléculas de unión específicas para diferentes subtipos de IFNa. La APS1 es una enfermedad autoinmunitaria rara causada por mutaciones en el gen del regulador autoinmunitario (AIRE). La proteína AIRE gobierna la expresión en el epitelio tímico medular de muchos autoantígenos periféricos (por ejemplo, la insulina) que son presentados por el MHC para tolerar los timocitos en desarrollo. En las APS1, las mutaciones del gen AIRE causan una selección negativa aberrante, lo que permite que los linfocitos T autorreactivos escapen a la periferia. En consecuencia, los pacientes muestran un espectro extremadamente variable de características clínicas en la APS1, pero por lo general con varios trastornos autoinmunitarios de los tejidos endocrinos. La tríada definitoria de la APS1 comprende candidosis mucocutánea crónica, hipoparatiroidismo e insuficiencia suprarrenal (Perheentupa, Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 31 (2002), 295-320). Otras afecciones clínicas que se observan en los pacientes de APECED incluyen enfermedades autoinmunitarias de la tiroides, diabetes mellitus, insuficiencia gonadal, vitiligo, alopecia, hepatitis crónica, gastritis crónica y anemia perniciosa y diferentes formas de otros síntomas gastrointestinales. Para detalles adicionales con respecto a los pacientes con APECED/APS1 y el cribado de su autoinmunosoma, véase la descripción de la solicitud internacional WO2013/098419 y los Ejemplos descritos en ese documento, en particular la sección de Materiales y Métodos en las páginas 112-117; El Ejemplo 1 en las páginas 117-118 y el Ejemplo 7 en la página 128 y las siguientes Tablas 1 a 14; y el Ejemplo 17 en las páginas 168-171.
Como se describe en detalle anteriormente y se indica en el Ejemplo 1, en un ejemplo preferido, el anticuerpo de la presente descripción se obtiene a partir de una muestra de un sujeto humano afectado por el síndrome de poliendocrinopatía autoinmunitaria con candidosis y distrofia ectodérmica (APECED/APS1) o a partir de un paciente afectado con una enfermedad autoinmunitaria similar a la descrita en la solicitud internacional WO2013/098419 y los Ejemplos de ese documento, en particular la sección de Materiales y Métodos en las páginas 112-117; el Ejemplo 1 en las páginas 117-118; en el Ejemplo 10 en las páginas 156-161, específicamente en la sección “Pacientes y controles” en la página 156 de ese documento; y el Ejemplo 17 en las páginas 168-171.
En este contexto, se observa que los anticuerpos anti-IFN-a en cuestión de la presente invención se han clonado mediante un método nuevo y patentado de aislamiento de anticuerpos humanos, que se describe en la solicitud internacional en tramitación del solicitante WO2013/098420.
Brevemente, la muestra para aislar el anticuerpo de interés comprende o consiste en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y suero para la detección de posibles reactividades de los anticuerpos. La muestra derivada del sujeto puede usarse directamente para, por ejemplo, probar la serorreactividad contra uno o más de los antígenos deseados o puede procesarse, además, por ejemplo, enriquecida en linfocitos B. En particular, se prefiere que la muestra comprenda o se derive de linfocitos B que producen el anticuerpo de interés, con la máxima preferencia linfocitos B de memoria. Las linfocitos B de memoria se cultivan en condiciones que permiten solo un tiempo de vida definido de los linfocitos B, típicamente no más de 1 a 2 semanas hasta que se seleccionan las células de los cultivos de linfocitos B que son reactivas contra el antígeno deseado, seguido subsecuentemente por una RT-PCR de células separadas individuales para obtener el repertorio de genes de inmunoglobulinas; véase la descripción detallada en los ejemplos 1 y 2 en las páginas 118 a 120 de los documentos WO2013/098419 y en particular los Ejemplos 1 a 4 en las páginas 27 a 31 del documento WO2013/098420. Naturalmente, la presente descripción se extiende al linfocito B de memoria humano inmortalizado y el linfocito B, respectivamente, que produce el anticuerpo que tiene las características distintas y únicas como se definió en la presente descripción anteriormente y más abajo.
Por tanto, además de usar un grupo de pacientes seleccionados, los anticuerpos anti-IFN-a se han proporcionado mediante el empleo de un método particular desarrollado específicamente y adaptado para aislar anticuerpos monoclonales humanos a partir de linfocitos B de pacientes con una enfermedad autoinmunitaria como los pacientes con APECED/APS1.
En un ejemplo, el anticuerpo o la molécula de unión a IFN-a de la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos de la región Vh y/o Vl como se representa en la Figura 1 o codificada por los ácidos nucleicos correspondientes como se indica en la Tabla 1. Además, en otro ejemplo, la presente descripción se refiere a un anticuerpo anti-IFN-a o molécula de unión a IFN-a, que compite con un anticuerpo de la presente descripción, como se definió anteriormente en la presente descripción, para la unión específica al menos a un subtipo de IFN-a humano y/ IFN-w humano.
En particular, se proporcionan anticuerpos anti-IFN-a que demuestran las características de unión inmunitarias y/o propiedades biológicas como se describe para los anticuerpos ilustrados en los Ejemplos y en las Figuras. Cuando está presente, el término "características de unión inmunológica" u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo.
Como se demuestra en los Ejemplos, los anticuerpos de la presente descripción se caracterizan particularmente por su alta actividad neutralizante frente a la mayoría de los subtipos de IFNa , así como también en el caso de los anticuerpos 26B9, 31B4 y 8H1 contra el IFNw en el intervalo subnanomolar. Preferentemente, los anticuerpos monoclonales derivados de humanos y los fragmentos de unión a IFN-a, así como también los derivados sintéticos y biotecnológicos de los mismos, presentan los valores de CI50 determinados en un ensayo con gen indicador ISRE (elemento de respuesta estimulado por interferón) de los anticuerpos en cuestión ejemplificados en la presente descripción para al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o casi todos los subtipos de IFNA y opcionalmente para el IFNW, o sus valores CI50 no difieren en más del 50 %, preferentemente menos del 40 %, con mayor preferencia menos del 30 %, aún con mayor preferencia menos del 20 % y se prefiere particularmente menos del 10 % de los valores de CI50 determinados para los anticuerpos en cuestión ilustrados en los Ejemplos y las Figuras para cualquiera de los subtipos de IFNA y opcionalmente para el IFNW. En un ejemplo preferido, el anticuerpo o molécula de unión a IFN similar de la presente descripción tiene un valor CI50 de < 10 ng para al menos 5, preferentemente 6, con mayor preferencia 7, aún con mayor preferencia 8 o, ventajosamente, 9 o 10 subtipos de IFN-a humano y/o IFN-w humano.
En un ejemplo adicional, el anticuerpo de la presente descripción es un fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención puede elegirse del grupo que consiste de un fragmento Fv de cadena única (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab), un fragmento F(ab')2 y un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAB).
Una ventaja adicional de los anticuerpos de la presente invención es que, debido al hecho de que la respuesta inmunitaria humoral se ha desencadenado contra el antígeno nativo en su entorno fisiológico y celular, típicamente se producen y pueden aislarse autoanticuerpos que reconocen un epítopo conformacional del antígeno debido a su presentación en contexto, por ejemplo, con otros componentes celulares, presentación en la superficie de una membrana celular y/o unión a un receptor. Por el contrario, los métodos convencionales para generar anticuerpos monoclonales, tales como monoclonales de ratón, versiones humanizadas de los mismos o anticuerpos obtenidos a partir de la presentación en fagos, típicamente emplean un fragmento antigénico de la proteína diana para inmunizar a un mamífero no humano y la detección, respectivamente, sobre la que, por lo general, se obtienen los anticuerpos que reconocen epítopos lineales o epítopos conformacionales limitados a una estructura bidimensional del inmunógeno en lugar de la presencia de la proteína nativa en su contexto fisiológico y celular. En consecuencia, es prudente esperar que los autoanticuerpos de la presente invención sean únicos en términos de su especificidad de epítopo. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a anticuerpos y moléculas de unión similares que presentan sustancialmente la misma especificidad de unión que los autoanticuerpos aislados de acuerdo con el método de la presente descripción. Dichos anticuerpos pueden probarse fácilmente, por ejemplo, mediante un ELISA competitivo o, más apropiadamente, en un ensayo de neutralización basado en células mediante el uso de un autoanticuerpo y un derivado monoclonal, respectivamente, del mismo de la presente descripción como un anticuerpo de referencia, y las pruebas inmunológicas descritas en los Ejemplos o las conocidas por el experto en la técnica.
Como se ilustra además en los Ejemplos y en las Figuras, por ejemplo, en la Figura 19, los anticuerpos de la presente descripción se aíslan preferentemente a partir de donantes humanos y, por tanto, se unen a los subtipos de IFNA humanos. Por lo tanto, en un ejemplo, el anticuerpo anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción reconocen solo el antígeno humano o al menos preferentemente sobre el antígeno correspondiente de otras especies, tales como los ratones. En otro ejemplo, el anticuerpo anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción se unen al menos a un subtipo de IFNA de otra especie, preferentemente en donde la otra especie son los ratones. Las características de unión tales como la especificidad y la afinidad de los anticuerpos de la presente invención se han probado en varios ensayos experimentales como se describe y muestra en la presente descripción, por ejemplo, en los Ejemplos 2, 5 y 6 y en las Figuras 2-3 y 8-13, y 18 al 27.
Como se ha demostrado además para los anticuerpos de la presente invención, estos son capaces de neutralizar la actividad biológica de su proteína diana; véanse, por ejemplo, los resultados del ensayo de fosforilación de STAT1 y el ensayo con gen indicador del elemento de respuesta específico de interferón descrito en el Ejemplo 3 y en las Figuras 5 a 7. En este contexto, el término "neutralizante" significa que el anticuerpo de la presente descripción es capaz de intervenir con la actividad biológica de su proteína diana en un ensayo bioquímico o basado en células, como puede evaluarse al realizar el ensayo respectivo en presencia del anticuerpo en cuestión de la presente descripción, en donde la actividad biológica de la proteína diana se reduce concomitantemente con el aumento del nivel del anticuerpo de la presente descripción sometido al ensayo, en comparación con la actividad biológica de la proteína sin la presencia del anticuerpo de la presente descripción y en presencia de un compuesto, por ejemplo, un anticuerpo de control que se sabe que no afecta la actividad biológica de la proteína diana. Dicho ensayo bioquímico e in vitro también puede realizarse mediante el uso de un anticuerpo de referencia conocido por ser capaz de neutralizar la actividad biológica de la proteína diana, tal como se ha demostrado para los anticuerpos anti-IFN-a de la presente invención, y al someter al anticuerpo candidato a la muestra de prueba, en donde puede observarse un efecto neutralizante aditivo resultante de la actividad combinada del anticuerpo de referencia y el anticuerpo candidato, o se observa una competencia entre el anticuerpo candidato y el anticuerpo de referencia que puede determinarse al marcar cualquiera de los anticuerpos. Por tanto, en un ejemplo preferido de la presente descripción, el anticuerpo obtenido mediante el método de la presente descripción es capaz de neutralizar la actividad biológica de su antígeno, por ejemplo, al menos un subtipo de IFN-a humano.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, por ejemplo, los péptidos, polipéptidos o proteínas de fusión de la presente descripción pueden proporcionarse como se indicó anteriormente, mediante la expresión en una célula huésped o en un sistema de traducción libre de células in vitro, por ejemplo. Para expresar el péptido, polipéptido o proteína de fusión en una célula huésped, la molécula de ácido nucleico que codifica dicho péptido, polipéptido o proteína de fusión puede insertarse en un vector de expresión apropiado es decir un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Los métodos que se conocen bien por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control de la transcripción y la traducción apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)), y Ausubel y otros, Protocols in Molecular Biology (1989); véanse también las secciones "Polinucleótidos" y "Expresiones" más abajo y la bibliografía citada en la sección de Ejemplos para detalles adicionales a este respecto.
Una célula huésped adecuada para la expresión del producto puede ser cualquier célula procariota o eucariota; por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli o B. subtilis, células de insectos (baculovirus), células de levadura, células vegetales o células animales. Sin embargo, para un procesamiento eficiente, se prefieren las células de mamífero. Las líneas celulares de mamífero típicas, útiles para este fin, incluyen células CHO, células HEK 293, células COS y células NSO.
Los anticuerpos aislados de la presente invención pueden, por supuesto, no aplicarse como tales a un paciente, pero por lo general deben formularse farmacéuticamente para garantizar, por ejemplo, su estabilidad, aceptabilidad y biodisponibilidad en el paciente. Por lo tanto, en un ejemplo, se proporciona el método de la presente descripción, que comprende además la etapa de mezclar el anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables se describirán en detalle más abajo.
Como una medida para obtener una fuente estable y permanente de moléculas de unión de la presente invención, en particular para su uso farmacéutico, los genes heterólogos que codifican estas moléculas de unión pueden aislarse mediante clonación directa, amplificación por PCR o síntesis artificial, e introducirse y expresarse en células huésped u organismos adecuados. Por lo tanto, también es un objeto de la presente descripción proporcionar un método para preparar una célula recombinante útil para la producción de un anticuerpo anti-IFN-a humano recombinante o un fragmento de unión a IFN-a del mismo que comprende las etapas de:
(a) preparar una célula B mediante un método como se describió anteriormente;
(b) secuenciar un ácido nucleico y/u obtener del linfocito B un ácido nucleico que codifica;
(i) al menos una de las secuencias de aminoácidos de las Ch y Cl establecidas en la Tabla 1 (SEQ ID NOs: 6, 8, 14, 16, 26, 28, 34, 36, 42, 44, 72, 74, 80, 82, 88, 92, 96 y 98) o una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 % de identidad;
(ii) al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de las secuencias de aminoácidos de la región variable Vh y/o Vl representadas en
Figura 1 (Vh) (SEQ ID NOs: 2, 10, 18, 22, 30, 38, 76, 84 y 92); y
la Figura 1 (Vl) (SEQ ID NOs: 4, 12, 20, 24, 32, 40, 78, 86 y 94);
(iii) una secuencia de aminoácidos de la región VH y/o VL como se representa en la Figura 1;
(iv) al menos una CDR que consiste de una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (a);
(v) una región variable de la cadena pesada y/o ligera que comprende una secuencia de aminoácidos resultante de una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de (ii); y/o
(c) insertar el ácido nucleico en un huésped de expresión para permitir la expresión del anticuerpo de interés en ese huésped.
Las células huésped que se describen en la presente descripción también pueden usarse en el método anterior y como se describe en detalle en la sección "Huésped" de esta descripción. A este respecto, en una descripción se proporciona el método anterior, donde el huésped de expresión es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal.
Además, en una descripción se proporciona un método para preparar una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la expresión y actividad del IFN-a y/o el IFN-ui, y el método comprende:
(a) cultivar células huésped como se define anteriormente;
(b) purificar el anticuerpo, el fragmento de unión a IFN-a del mismo, el derivado biotecnológico o la(s) cadena(s) de inmunoglobulina del mismo de la presente descripción, desde el cultivo hasta el grado farmacéutico; y (c) mezclar el anticuerpo, fragmento de unión a IFN-a del mismo o derivado biotecnológico del mismo de la presente descripción con un portador farmacéuticamente aceptable.
Con respecto a los métodos descritos anteriormente para la producción del anticuerpo de interés respectivo, en un ejemplo, la presente descripción proporciona un método, en donde el ácido nucleico se manipula entre las etapas anteriores (b) y (c) para introducir sitios de restricción, para cambiar el uso de codones, y/o para añadir u optimizar secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción.
Como se demuestra en los Ejemplos 2 y 3 adjuntos y se resume en la Tabla 4, las moléculas de unión, es decir, los anticuerpos, se han identificado y clonado y presentan una afinidad de unión aparente particularmente alta (CE50/DE50) y/o una actividad neutralizante in vitro particularmente alta, con concentraciones inhibidoras bajas (CI50) para al menos un subtipo de IFN-a humano. A este respecto, en un ejemplo, el anticuerpo anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a del mismo de la presente descripción tienen una alta afinidad por su molécula diana respectiva, por ejemplo, los subtipos de IFN-a humano como se define anteriormente en la presente descripción, que muestran una CE50 a concentraciones por debajo de 100 ng/ml, preferentemente por debajo de 20 ng/ml y con mayor preferencia por debajo de 10 ng/ml. Alternativamente o además, en una descripción, el anticuerpo anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a del mismo tienen una alta capacidad neutralizante para al menos un subtipo de IFN-a humano, y muestran una CI50 a concentraciones por debajo de 500, 400, 300 o 100 ng/ ml, preferentemente por debajo de 20 ng/ml, con mayor preferencia por debajo de 10 ng/ml y lo que más se prefiere es por debajo de 5 ng/ml. Para más detalles con respecto a la afinidad de unión de los anticuerpos de la presente descripción, véase, por ejemplo, la sección "Características de unión" más abajo.
La presente descripción también se refiere a polinucleótidos que codifican al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la descripción. Preferentemente, dicha región variable comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la Vh y/o Vl de la región variable como se establece en la Figura 1.
En el caso de una secuencia derivada, dicha secuencia muestra al menos un 60 % de identidad, con mayor preferencia (en el siguiente orden) al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, y con la máxima preferencia un 95 %, al menos 96-99 %, o incluso 100 % de identidad con una secuencia del grupo que consiste de las secuencias referidas anteriormente e identificadas en el Listado de Secuencias. El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias, tiene en cuenta el número de interrupciones, y la longitud de cada interrupción, que necesitan introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo mediante el uso de un algoritmo matemático, que es bien conocido por los expertos en la técnica. Las identidades referidas en la presente descripción se determinarán mediante el uso de los programas BLAST como se refiere además en la presente descripción infra.
Como se mencionó anteriormente, en un ejemplo preferido, la presente descripción se refiere a anticuerpos sustancial y totalmente humanos, preferentemente IgG que incluyen al menos la cadena pesada constante I (Ch1) y la correspondiente cadena ligera de la región constante, es decir y-1, Y-2, Y-3 o y-4 en combinación con lambda o kappa. En una descripción particularmente preferida, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las regiones constantes aisladas para los anticuerpos en cuestión ilustrados en los Ejemplos se usan como se representa en la Tabla 1 más abajo y en las SEQ ID NO: 5, 7, 13, 15, 25, 27, 33, 35, 41, 43, 71, 73, 79, 81, 87, 89, 95 y 97 con respecto a las secuencias de nucleótidos y/o las SEQ ID NO: 6, 8, 14, 16, 26, 28, 34, 36, 42, 44, 72, 74, 80, 82, 88, 90, 96 y 98 con respecto a las secuencias de aminoácidos o secuencias de aminoácidos con al menos 60 % de identidad con las referidas antes.
De acuerdo con lo anterior, la presente descripción también se refiere a un polinucleótido, en particular un polinucleótido recombinante que codifica al menos la región variable de una cadena de inmunoglobulina del anticuerpo anti-IFN-a o fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción. Típicamente, dicha región variable codificada por el polinucleótido comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la Vh y/o Vl de la región variable de dicho anticuerpo. Las regiones variables y constantes de los anticuerpos se describen con más detalle en la sección "Estructura de la IgG" más abajo. En un ejemplo preferido de la presente descripción, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un ácido nucleico que tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica la región vH o vL de un anticuerpo de la presente descripción como se representa en la Tabla 1 más abajo. A este respecto, el experto en la técnica apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar el dominio variable de cualquiera de las cadenas de inmunoglobulina o solo de una de ellas. En una descripción preferida, el polinucleótido codifica el anticuerpo anti-IFN-a o el fragmento de unión a IFN-a como se definió anteriormente en la presente descripción.
Tabla 1: Secuencias de nucleótidos de las regiones variable y constante (regiones VH, VL, CH, CL) de los anticuerpos IgG1, kappa, específicos de IFN-a 5D1, 13B11, 19D11,25C3, 26B9, 3lB4, 8H1 y 12H5 de la presente invención y del anticuerpo ilustrativo 50E11. Los nucleótidos o aminoácidos subrayados y en negrita indican las regiones codificantes de las CDR en la secuencia de la cadena variable. Los nucleótidos o aminoácidos subrayados y en cursiva indican secuencias que no se han secuenciado, pero se obtuvieron de la base de datos. En las cadenas constantes, dichas regiones se alinean con, y se ajustan de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Véase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) gestionado por el Centro MRC para la Ingeniería de Proteínas (Cambridge, Reino Unido).
Figure imgf000021_0001
(continuación)
Figure imgf000022_0001
continuación
Figure imgf000023_0001
continuación
Figure imgf000024_0001
(continuación)
Figure imgf000025_0001
(continuación)
Figure imgf000026_0001
(continuación)
Figure imgf000027_0001
nin i n
Figure imgf000028_0001
continuación
Figure imgf000029_0001
(continuación)
Figure imgf000030_0001
(continuación)
Figure imgf000031_0001
continuación
Figure imgf000032_0001
(continuación)
Figure imgf000033_0001
El experto en la técnica apreciará fácilmente que el dominio variable del anticuerpo que tiene el dominio variable descrito anteriormente puede usarse para la construcción de otros polipéptidos o anticuerpos de especificidad y función biológica deseadas. Por tanto, la presente descripción también abarca polipéptidos y anticuerpos que comprenden al menos una CDR del dominio variable descrito anteriormente y que ventajosamente tienen propiedades de unión sustancialmente iguales o similares a las del anticuerpo descrito en los ejemplos adjuntos. El experto en la materia apreciará fácilmente que mediante el uso de los dominios variables o CDR descritos en la presente descripción, los anticuerpos pueden construirse de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en las solicitudes de patentes europeas EP 0451 216 A1 y EP 0549 581 A1. Además, el experto en la técnica conoce que la afinidad de unión puede potenciarse al hacer sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR o dentro de los bucles hipervariables (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) que se solapan parcialmente con las CDR como lo define Kabat. Por tanto, la presente descripción también se refiere a los anticuerpos en donde una o más de las CDR mencionadas comprenden una o más, preferentemente no más de dos, sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, el anticuerpo de la descripción comprende en una o ambas de sus cadenas de inmunoglobulina, dos o las tres CDR de las regiones variables, como se establece para las regiones Vh en las SEQ ID NO: 2, 10, 18, 22, 30, 38, 76, 84 y 92, para las regiones Vl y las SEQ ID NO: 4, 12, 20, 24, 32, 40, 78, 86 y 94 o como se indica en la Figura 1.
El polinucleótido de la invención que codifica el anticuerpo descrito anteriormente puede ser, por ejemplo, un ADN, ADNc, ARN o ADN o ARN producidos sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérica producida de forma recombinante que comprende cualquiera de esos polinucleótidos solos o en combinación. En una descripción, el polinucleótido es un ADNc que codifica la región variable y al menos parte del dominio constante. En una descripción preferida, se proporciona un vector que comprende el polinucleótido anterior, opcionalmente en combinación con dicho polinucleótido que codifica la región variable de la otra cadena de inmunoglobulina de dicho anticuerpo. Dichos vectores pueden comprender genes adicionales, tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y en condiciones adecuadas.
Preferentemente, el polinucleótido de la invención se unidos operablemente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión en las células eucariotas, preferentemente en células de mamífero, se conocen bien por los expertos en la técnica. Estos por lo general comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripción, así como también de la traducción, y/o regiones promotoras heterólogas o asociadas naturalmente.
A este respecto, el experto en la técnica apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar los dominios variables de ambas cadenas de inmunoglobulina o solo de una de ellas.
Igualmente, dichos polinucleótidos pueden estar bajo el control del mismo promotor o pueden controlarse por separado para la expresión. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, los promotores Pl, lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levaduras o el promotor de CMV, SV40, RSV, el potenciador de CMV, el potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y de otros animales.
Además de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, como el sitio SV40-poli(A) o el sitio tk-poli(A), aguas abajo del polinucleótido. Además, en dependencia del sistema de expresión usado, las secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo en el medio pueden añadirse a la secuencia codificante del polinucleótido de la invención y se conocen bien en la técnica. La(s) secuencia(s) líder(es) se ensambla(n) en la fase apropiada con las secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una porción de la misma, al espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación C-terminal o N-terminal que otorga las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados, como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) o pSPORT1 (GIBCO BRL).
Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas de promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos y, según se desee, la recolección y purificación de las cadenas ligeras, cadenas pesadas y dímeros de cadenas ligeras/pesadas de las inmunoglobulinas o anticuerpos intactos, fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina; véase, Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).
Además, la presente descripción se refiere a vectores, particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos usados convencionalmente en ingeniería genética que comprenden un polinucleótido que codifica el antígeno o preferentemente un dominio variable de una cadena de inmunoglobulina de un anticuerpo de la invención; opcionalmente en combinación con un polinucleótido de la invención que codifica el dominio variable de la otra cadena de inmunoglobulina del anticuerpo de la invención. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de direccionamiento o transferencia de genes.
Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino pueden usarse para suministrar los polinucleótidos o el vector de la invención en la población celular diana. Los métodos que se conocen bien por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores virales recombinantes; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores de la invención pueden reconstituirse en liposomas para su suministro a las células diana. Los vectores que contienen los polinucleótidos de la invención (por ejemplo, el(los) dominio(s) variable(s) de las secuencias que codifican las cadenas de inmunoglobulinas y las secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a una célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían en dependencia del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación pueden usarse para la transformación de otros huéspedes celulares; véase Sambrook, supra.
Con respecto a lo anterior, la presente invención se refiere además a una célula huésped que comprende dicho polinucleótido o vector. Dicha célula huésped puede ser una célula procariota o eucariota. El polinucleótido o vector de la invención que está presente en la célula huésped puede integrarse en el genoma de la célula huésped o puede mantenerse fuera del cromosoma. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota, tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal o humana; las células huésped adecuadas y los métodos para la producción de los anticuerpos de la presente invención se describen con más detalle en la sección "Células huésped" más abajo.
Mediante el uso de las células huésped mencionadas anteriormente, es posible producir y preparar un anticuerpo de la presente invención para, por ejemplo, un uso farmacéutico o como una diana para la intervención terapéutica. Por lo tanto, en un ejemplo, también es un objeto de la presente descripción proporcionar un método para preparar un anticuerpo anti-IFN-a o un fragmento de unión a IFN-a del mismo, y dicho método comprende
(a) cultivar la célula como se define anteriormente en la presente descripción; y
(b) aislar dicho anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a del mismo a partir del cultivo.
En consecuencia, la presente descripción se refiere a un anticuerpo recombinante o fragmento de unión a IFN-a del mismo, cadena(s) de inmunoglobulina del mismo codificada por el polinucleótido de la presente invención u obtenible mediante el método mencionado anteriormente para preparar un anticuerpo anti-IFN-a o cadena(s) de inmunoglobulina del mismo. En la técnica se conocen los medios y métodos para la producción recombinante de anticuerpos y miméticos de los mismos, así como también los métodos de cribado de moléculas de unión competidoras, que pueden o no ser anticuerpos. Sin embargo, como se describe en la presente descripción, en particular con respecto a las aplicaciones terapéuticas en humanos, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo recombinante humano en el sentido de que la aplicación de dicho anticuerpo está sustancialmente libre de una respuesta inmunitaria dirigida contra dicho anticuerpo, lo que se observa de cualquier otra manera para los anticuerpos quiméricos e incluso humanizados.
Las moléculas de unión, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden usarse directamente como agentes terapéuticos. Sin embargo, en una modalidad, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno que proporciona la presente invención está marcado de forma detectable o unido a un fármaco, preferentemente en donde el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo, un péptido y un metal pesado. Los anticuerpos marcados o los fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden usarse para detectar dianas específicas in vivo o in vitro, que incluyen los ensayos in vitro similares a los de "inmunoquímica/inmunomarcaje". In vivo, pueden usarse de manera similar a las técnicas de imágenes de medicina nuclear para detectar tejidos, células u otro material que exprese el antígeno de interés. Los marcadores, su uso en diagnósticos y su acoplamiento a las moléculas de unión de la presente invención se describen con más detalle en la sección "marcadores y diagnósticos" más abajo.
Los anticuerpos de la presente descripción se aíslan de animales o humanos afectados por un trastorno autoinmunitario. Por otra parte, los anticuerpos específicos de IFN-a identificados en la presente invención pueden implicarse en el deterioro grave del sistema inmunitario del individuo afectado, lo que se asocia, por ejemplo, con síntomas observados en pacientes con APECED. Por lo tanto, es un aspecto adicional de la presente descripción extinguir o al menos aliviar las reacciones patológicas de sujetos que padecen trastornos autoinmunitarios, al proporcionar los medios y medidas para minimizar el número de autoanticuerpos y/o sus efectos en un paciente humano enfermo o en un animal. Por tanto, en un ejemplo, la presente descripción también se refiere a un péptido o a un compuesto basado péptidos que comprende un epítopo reconocido específicamente por un autoanticuerpo de la presente invención. Puede obtenerse un efecto similar al de la aplicación de antígenos competitivos, al secuestrar y evitar, de esta manera, la unión de los autoanticuerpos a sus respectivas dianas mediante anticuerpos antiidiotípicos, como se describe en detalle más abajo. Por lo tanto, en un ejemplo, la presente descripción también proporciona un anticuerpo antiidiotípico de un autoanticuerpo de la presente descripción.
Como ya se indicó anteriormente, la presente descripción también se refiere al anticuerpo antiidiotípico o el péptido o compuesto basado en péptidos de la presente descripción para su uso en el tratamiento de un trastorno como se define anteriormente, es decir un trastorno asociado con una génesis alterada o desregulada de la autotolerancia. Estos anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos de la presente descripción pueden usarse como inmunógenos para generar un panel de antiidiotipos monoclonales. Para conocer los métodos adecuados para la generación de anticuerpos antiidiotípicos, véase a Raychadhuri y otros, J. Immunol. 137 (1986), 1743 y para los linfocitos T véase Ertl y otros, J. Exp. Med. 159 (1985), 1776. Los anticuerpos antiidiotípicos se caracterizarán con respecto a la expresión de idiotipos de imagen interna e imagen no interna mediante el uso de ensayos estándar practicados de forma rutinaria en la técnica como se describe en detalle por Raychaudhuri y otros, J. Immunol. 137 (1986), 1743. Si un anticuerpo antiidiotípico imita estructuralmente al antígeno del anticuerpo al que se une o al que lo une, se llama "imagen interna" del antígeno.
Los métodos para proporcionar moléculas que imitan un idiotipo de un autoanticuerpo asociado a una enfermedad autoinmunitaria (autoanticuerpos) se describen en la técnica; véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO03/099868, el contenido de cuya descripción se incorpora como referencia en la presente descripción. Por ejemplo, dicho método puede comprender las siguientes etapas: (a) proporcionar autoanticuerpos de acuerdo con el método de la presente descripción; (b) unir los autoanticuerpos a una fase sólida para formar una matriz de afinidad; (c) poner en contacto el plasma combinado o los linfocitos B que comprenden inmunoglobulinas con la matriz de afinidad seguido de la eliminación de los componentes del plasma no unidos; (d) eluir las inmunoglobulinas unidas, que son anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) de autoanticuerpos, de la matriz; (e) proporcionar una biblioteca molecular que comprenda una pluralidad de miembros de moléculas; y (e) poner en contacto el anti-Id con la biblioteca molecular y aislar las moléculas unidas que están unidas por el anti-Id, las moléculas unidas son moléculas que imitan un idiotipo de autoanticuerpos. Un método para aislar autoanticuerpos idiotípicos se describe en la solicitud internacional WO2010/136196, el contenido de cuya descripción se incorpora en la presente descripción como referencia, que describe preparados de inmunoglobulina que contienen anticuerpos (Ac) reactivos a IgG policlonales naturales aislados de suero humano normal (SHN), para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y trastornos del sistema inmunitario. Los Ac reactivos a IgG neutralizan potentemente los autoanticuerpos patógenos o asociados a enfermedades presentes en el suero de pacientes que padecen enfermedades autoinmunitarias, al unirse a sus determinantes antigénicos ubicados dentro o cerca de (por ejemplo, solapado con) los sitios de combinación del antígeno.
La presente descripción también se refiere a composiciones que comprenden uno cualquiera de los anticuerpos anti-IFN-a y/o fragmentos de unión a IFN-a antes mencionados, el polinucleótido, el vector, la célula, el péptido o compuesto basado en péptidos de la presente descripción y/ o un cóctel de anticuerpos o fragmentos de unión a IFN-a de los mismos que, en combinación, presentan las características de un anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a del mismo de la presente invención. Además, o alternativamente, en un ejemplo, la composición o el kit de la presente descripción comprende el anticuerpo antiidiotípico de la presente descripción. En una descripción la composición es una composición farmacéutica y comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables, las vías de administración y el régimen de dosificación pueden tomarse de la bibliografía correspondiente conocida por el experto en la técnica y se describen también con más detalle en las secciones "Portadores farmacéuticos" y "Régimen de dosificación" más abajo.
Además de los ensayos in vitro bioquímicos y basados en células, la utilidad terapéutica de los anticuerpos de la presente invención puede validarse en modelos animales apropiados tales como para AR, psoriasis, SLE o T1DM; véanse los Ejemplos más abajo, por ejemplo, el Ejemplo 4.
En una descripción, la composición farmacéutica comprende además un agente adicional útil para tratar una inflamación o un trastorno autoinmunitario, preferentemente en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), corticosteroides, antihistamínicos y combinaciones de los mismos. Además, o alternativamente, en una descripción adicional, la composición farmacéutica comprende además un agente adicional útil para tratar una enfermedad relacionada con la inflamación, seleccionada del grupo que consiste en fármacos inmunosupresores y antiinflamatorios o "antirreumáticos".
En otra descripción, la composición es una composición de diagnóstico o un kit y comprende además reactivos usados convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos o reacciones inmunológicas.
Además, la presente descripción se refiere a uno cualquiera de los anticuerpos anti-IFN-a antes mencionados y un fragmento de unión a IFN-a de los mismos, o la composición como se define anteriormente en la presente descripción para su uso en un método de:
(a) tratar o evitar la progresión de una enfermedad o afección mediada por mecanismos inmunitarios o autoinmunitaria.
(b) mejora de los síntomas asociados con una enfermedad o afección mediada por mecanismos inmunitarios o autoinmunitaria; y/o
(c) diagnosticar o cribar a un sujeto para detectar la presencia o determinar el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad o afección mediada por mecanismos inmunitarios o autoinmunitaria; en donde la enfermedad o afección asociada con la expresión de IFN-a y/o IFN-w en un paciente
A este respecto, pueden usarse varias vías de aplicación. En un ejemplo de la presente descripción, se proporciona el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno antes mencionado, el anticuerpo antiidiotípico o péptido o compuesto basado en péptidos y/o un cóctel de anticuerpos que, en combinación, presentan las características de un anticuerpo de la presente descripción, que se diseña para administrarse por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, parenteral o en forma de aerosol.
Como se indicó anteriormente, debido a su especificidad de unión, las moléculas de la presente descripción, tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden usarse preferentemente en el método de tratamiento definido anteriormente, en la mejora, diagnóstico y/o cribado de un trastorno o afección mediada por mecanismos inmunitarios o autoinmunitaria. Por ejemplo, se ha detectado con frecuencia actividad elevada de IFN-a en el suero de pacientes con SLE (Ronnblom y otros, Sem. Immun. 23 (2011), 113-121). Un patrón de expresión específico de los genes dependientes de interferón (denominado "firma de interferón") se presenta además en los leucocitos de pacientes con diversos trastornos autoinmunitarios como el síndrome de Sjogren, dermatomiositis, esclerosis múltiple (EM), psoriasis, diabetes mellitus tipo 1 o dependiente de insulina (T1DM o IDDM) y una fracción de pacientes con AR (véase, por ejemplo, Higgs y otros, Eur Musc Rev (2012), 22-28). Además, el desarrollo de artritis inflamatoria, EM y T1DM se ha observado repetidamente durante la terapia con IFN-a, lo que indica que el IFN-a al menos promueve esas enfermedades (Crow MK., Arthritis Res Ther. (2010), Supl 1:S5). Datos adicionales sugieren una implicación del IFN-a en la miositis, la esclerodermia sistémica, la psoriasis crónica Higgs y otros, Eur Musc Rev (2012), 22-28; Bissonnette y otros, J Am Acad Dermatol (2009), 427-436; Greenberg SA, Arth Res Ther (2010): S4;) y tiroiditis autoinmunitaria (Prummel y Laurberg, Thyroid (2003), 547-551). Por lo tanto, en una descripción se proporciona el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a del mismo o la composición como se define anteriormente en la presente descripción para su uso en el método antes mencionado, en donde dicha enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus eritematoso cutáneo (CLE), lupus eritematoso discoide (LED), diabetes mellitus tipo 1 (T1DM), síndrome de Sjogren, dermatomiositis, psoriasis, tiroiditis autoinmunitaria, artritis reumatoide, espondiloartritis, esclerodermia y diferentes formas de cáncer que incluyen la leucemia, tales como el cáncer de mama y cáncer de ovario y leucemia linfoblástica infantil (LLA; Einav y otros, Oncogen 24 (2005), 6367-6375). Los resultados preliminares sugirieron una diferencia en la actividad neutralizante de los anticuerpos obtenidos a partir de pacientes con APS1 que padecen, o no padecen, además T1DM (Fig. 4). Sin embargo, un análisis más detallado de los sueros de pacientes reveló que la actividad neutralizante de los anticuerpos anti-IFNA individuales en ambos tipos de pacientes puede ser sustancialmente la misma, mientras que los títulos de anticuerpos y el nivel total de actividad neutralizante del IFN difieren significativamente, con un título muy bajo en pacientes con T1DM; véanse las figuras. 31 and 32. En consecuencia, en un ejemplo, la presente descripción también se refiere a las moléculas de unión a IFN-a e IFN-a/w descritas en la presente descripción, así como también a otras moléculas de unión a IFN-a para su uso en el tratamiento de la T1DM en un paciente a partir del cual se determinó que la muestra de sueros presenta una actividad neutralizante más baja contra las citocinas de al menos un subtipo de IFN-a en comparación con una muestra de control, es decir, sueros de un sujeto sano o de un paciente con TD1M que no presenta los síntomas de la enfermedad.
Debido a la multitud de moléculas adecuadas en el tratamiento de, por ejemplo, trastornos asociados con la inflamación que se presentan en la presente descripción, la presente descripción también se refiere a métodos de tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico del curso y resultado probables de tales trastornos, preferentemente en donde la enfermedad mediada por mecanismos inmunitarios o la enfermedad o afección autoinmunitaria se asocia con la expresión de IFN-a y/o IFN-w al uso de las moléculas de la presente invención. En una descripción, se proporciona un método para tratar dicho trastorno, cuyo método comprende administrar a un sujeto que necesite del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno antes mencionado, el cóctel de anticuerpos que, en combinación, presenta las características de un anticuerpo de la presente descripción, el anticuerpo antiidiotípico o el péptido o compuesto basado en péptidos.
Además, en un ejemplo, la presente descripción se refiere a un método para tratar una enfermedad o afección mediada por mecanismos inmunitarios o autoinmunitaria, asociada con la expresión de IFN-a y/o IFN-u>, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de unión a ligando que comprende:
(i) al menos una CDR de los anticuerpos anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a de la presente invención; o (ii) al menos un anticuerpo antiidiotípico y/o un péptido o un compuesto basado en péptidos, como se definió anteriormente en la presente descripción.
Los métodos de tratamiento basados en el uso de un solo anticuerpo monoclonal específico para un epítopo de un antígeno particular, que está relacionado con o una enfermedad, o la causa, pueden tener varios inconvenientes. Por ejemplo, las dificultades y probablemente la ineficacia del tratamiento pueden provenir de la multiplicidad de los mecanismos patogénicos que causan un trastorno específico que requiere dirigir el tratamiento hacia varios antígenos simultáneamente. Además, debe tenerse en cuenta la diversidad inherente de la población de pacientes con respecto a, por ejemplo, al polimorfismo, la heterogeneidad de la glicosilación o la ligera desnaturalización de un antígeno dado, ya sea en el mismo o en diferentes pacientes, lo que puede conducir a una disminución de la eficiencia de unión del anticuerpo monoclonal usado al menos. Algunas de estos inconvenientes pueden evitarse, por ejemplo, mediante cribados previos al tratamiento para determinar si el antígeno es inmunológicamente relevante para los pacientes a los que se pretende tratar y si hay algunos cambios de epítopo en los pacientes particulares. Sin embargo, dichos cribados a menudo se omiten debido a la urgencia del tratamiento o a las restricciones de costos. Por lo tanto, en la presente descripción también se describen métodos basados en la aplicación de más de un tipo de molécula de unión a la vez a un paciente, es decir a la aplicación de un cóctel de moléculas de unión. Estas moléculas de unión pueden unirse específicamente a un subtipo de IFNA en diferentes epítopos y/o de un epítopo de IFN-w, cada una de las moléculas de unión aplicadas puede unirse específicamente a otro subtipo de IFNa o se usan varias moléculas de unión que se unen a varios epítopos de más de un subtipo de IFNA y/o IFN-w . En caso de que las moléculas de unión de la presente invención se dirijan (se unan específicamente) hacia un subtipo de IFNA como antígeno, su especificidad de unión se dirige hacia distintos epítopos de dicho antígeno. El uso de tales cócteles se prevé en particular para el tratamiento de pacientes que padecen trastornos autoinmunitarios como la APS1, quienes debido a la presencia de autoanticuerpos contra alrededor de 3000 antígenos endógenos, a menudo no son susceptibles a la monoterapia con un anticuerpo particular. En dichos casos, se espera que la terapia combinada con dos o más anticuerpos monoclonales y/o péptidos y compuestos basados en péptidos de la presente invención, con la misma o diferente especificidad antigénica, logre al menos algún alivio de los síntomas.
Por lo tanto, en una descripción se proporciona un método adicional para tratar un trastorno que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un cóctel que consiste esencialmente de al menos dos, tres, cuatro, cinco y más componentes seleccionados de los grupos que consisten en:
- un anticuerpo anti-IFN-a y un fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción que se une específicamente a los subtipos de IFNA y/o de IFN-w como se definió anteriormente en la presente descripción; y/o
- un anticuerpo antiidiotípico de la presente descripción, y/o de un péptido o compuesto basado en péptidos de la presente descripción, cuyo péptido o compuesto basado en péptidos comprende un epítopo reconocido específicamente por los anticuerpos anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a de la presente descripción.
La presente solicitud también describe métodos de diagnóstico y pronóstico dirigidos a diagnosticar afecciones y trastornos mediados por mecanismos inmunitarios o autoinmunitarios asociados con la expresión de uno o más subtipos de IFN-a y/o IFN-w y/o pronóstico del desarrollo de la enfermedad, es decir su progresión, respuesta al tratamiento o recuperación. Por lo tanto, en la presente descripción también se describe un método para diagnosticar una enfermedad o afección mediada por la inmunidad o autoinmunitaria en un sujeto, asociada con la expresión de IFN-a que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un anticuerpo anti-IFN-a y un fragmento de unión de IFN-a. de la presente descripción, y detectar la presencia de IFN-a y/o IFN-u>. Además, en un ejemplo, la presente descripción se relaciona con un método para detectar o determinar el IFN-a y/o IFN-w en una muestra biológica aislada que comprende mezclar la muestra con un anticuerpo anti-IFN-a de la presente descripción, lo que permite que el anticuerpo forme un complejo con cualquier subtipo de IFN-a y/o IFN-w presente en la mezcla, y detectar el complejo presente en la mezcla.
Como ya se mencionó anteriormente, en un ejemplo, la presente descripción se refiere a un kit para el diagnóstico de una enfermedad o afección mediada por mecanismos inmunitarios o autoinmunitaria asociada con la expresión de IFN-a y/o IFN-w, dicho kit comprende el anticuerpo anti-IFN-a y el fragmento de unión a IFN-a antes mencionado, el anticuerpo antiidiotípico o el péptido o compuesto basado en péptidos, el polinucleótido, el vector o la célula, opcionalmente con los reactivos y/o instrucciones de uso. Puede haber un aviso asociado con los kits de la presente descripción, es decir, dentro de un contenedor que comprende el kit, en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de los productos farmacéuticos o biológicos, este aviso refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para la administración humana. Además, o alternativamente, el kit comprende reactivos y/o instrucciones para su uso en ensayos de diagnóstico apropiados. Las composiciones, es decir los kits de la presente descripción son, por supuesto, adecuados particularmente para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de un trastorno que va acompañado de la expresión de IFN-a, en particular aplicable para el tratamiento de enfermedades como se mencionó anteriormente. En una descripción particularmente preferida, el trastorno está asociado con la expresión de uno o más subtipos de IFN-a y/o IFN-u>.
En otro ejemplo, la presente descripción se refiere a una composición de diagnóstico que comprende una cualquiera de las moléculas de unión, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, péptidos o compuestos basados en péptidos, polinucleótidos, vectores o células de la descripción descritos anteriormente y, opcionalmente, los medios adecuados para la detección, tales como reactivos usados convencionalmente en métodos de diagnóstico basados en ácidos nucleicos o reacciones inmunológicas. Los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, adecuados para usar en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unidos a un portador en fase sólida. Los ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar el anticuerpo de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Ejemplos de dichos inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA), el sándwich (ensayo inmunométrico), la citometría de flujo y el ensayo de inmunotransferencia. Los antígenos y anticuerpos de la descripción pueden unirse a muchos portadores diferentes y usarse para aislar células específicamente unidas a los mismos. Los ejemplos de portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble para los fines de la invención. Hay muchos marcadores y métodos de marcaje diferentes conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes; véase también las descripciones discutidas anteriormente en la presente descripción.
En este contexto, la presente descripción también se refiere a los medios diseñados específicamente para este fin. Por ejemplo, puede usarse una micromatriz de proteínas o anticuerpos, que por ejemplo se carga con los antígenos derivados de uno o más subtipos de IFN-a y que contiene el antígeno asociado a la enfermedad para detectar los autoanticuerpos que pueden estar presentes en los pacientes que padecen de una enfermedad autoinmunitaria, en particular la SLE o la APECED/APS1, o con anticuerpos o moléculas de unión a antígeno equivalentes de la presente descripción que reconocen específicamente uno cualquiera de esos antígenos asociados con la inflamación. El diseño de inmunoensayos de micromatrices se resume en Kusnezow y otros, Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. En consecuencia, la presente descripción también se refiere a micromatrices cargadas con moléculas de unión, en particular un anticuerpo anti-IFN-a y un fragmento de unión a IFN-a de la presente invención o antígenos identificados de acuerdo con la presente descripción.
Definiciones y modalidades
A menos que se indique de cualquier otra manera, un término y una modalidad como se usa en la presente descripción recibe la definición proporcionada y usada en la solicitud internacional WO2013/098419 y la solicitud internacional WO2013/098420. De manera complementaria, un término como se usa en la presente descripción recibe la definición que se proporciona en Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revisado en el 2000 y reimpreso en el 2003, ISBN 0198506732.
Cabe señalar que el término "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, se entiende que "un anticuerpo" representa uno o más anticuerpos. Como tal, los términos “una”, “uno o más”, y “al menos uno” pueden usarse indistintamente en la presente descripción.
El término "neutralizante" y "anticuerpo neutralizante", respectivamente, se usa comúnmente en la técnica en el sentido de que un anticuerpo reduce o suprime al menos alguna actividad biológica de un antígeno o de un microorganismo vivo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IFN-a específico de subtipo de la presente invención es un anticuerpo neutralizante si, en cantidades adecuadas, suprime o reduce la actividad del subtipo(s) de IFN-a respectivo(s), por ejemplo, en un ensayo como se describió en los Ejemplos. La neutralización se define comúnmente por las concentraciones inhibidoras del 50 % (CI50) y puede evaluarse estadísticamente en base al área bajo las curvas de titulación de la neutralización (AUC). Los valores de CI50 de los anticuerpos anti-IFN-a ilustrativos de la presente invención se describen y muestran en la presente descripción, por ejemplo, en las Figuras 8-10 y en la Tabla 4.
Tolerancia central y periférica
La tolerancia central y periférica se describe con más detalle en el capítulo respectivo de la solicitud internacional WO2013/098419 en las páginas 62-63.
Péptidos y polipéptidos:
Se entiende que el término "péptido" incluye los términos "polipéptido" y "proteína" (que, en ocasiones, pueden usarse indistintamente en la presente descripción) y cualquier secuencia de aminoácidos, como las de la región variable de las cadenas pesada y ligera, así como también constante región de la presente invención dentro de su significado. De manera similar, también se contemplan fragmentos de proteínas y polipéptidos y pueden denominarse en la presente descripción como "péptidos". Sin embargo, el término "péptido" denota preferentemente un polímero de aminoácidos que incluye al menos 5 aminoácidos contiguos, preferentemente al menos 10 aminoácidos contiguos, con mayor preferencia al menos 15 aminoácidos contiguos, aún con mayor preferencia al menos 20 aminoácidos contiguos, y se prefieren particularmente al menos 25 aminoácidos contiguos. Además, el péptido de acuerdo con la presente descripción típicamente no tiene más de 100 aminoácidos contiguos, preferentemente menos de 80 aminoácidos contiguos y con mayor preferencia menos de 50 aminoácidos contiguos.
Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" en singular así como también "polipéptidos" en plural, tales como los anticuerpos de la presente descripción, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los "péptidos", "dipéptidos", "tripéptidos", "oligopéptidos", "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido" puede usarse en lugar de, o indistintamente con cualquiera de estos términos.
El término "polipéptido" también pretende hacer referencia a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, que incluyen, sin limitación, la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica o modificación mediante aminoácidos que no son naturales. Un polipéptido puede derivarse de una fuente biológica natural o producirse mediante tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier manera, que incluye la síntesis química.
Un polipéptido de la descripción puede tener un tamaño de alrededor de 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. No obstante, el término "polipéptido" denota preferentemente un polímero de aminoácidos que incluye al menos 100 aminoácidos.
Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no necesariamente tienen dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan no plegados. Como se usa en la presente descripción, el término glicoproteína se refiere a una proteína acoplada al menos a una fracción de carbohidrato que se une a la proteína a través de una cadena lateral que contiene oxígeno o que contiene nitrógeno de un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de serina o un residuo de asparagina.
Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede retirarse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para los fines de la descripción, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada.
"Péptidos, polipéptidos o proteínas recombinantes" se refiere a péptidos, polipéptidos o proteínas producidos mediante técnicas de ADN recombinante, es decir producido a partir de células, microbianas o de mamíferos, transformadas por una construcción de expresión de ADN recombinante exógeno que codifica la proteína de fusión que incluye el péptido deseado. Las proteínas o los péptidos expresados en la mayoría de los cultivos bacterianos típicamente no tendrán glicano. Las proteínas o polipéptidos expresados en levaduras pueden tener un patrón de glicosilación diferente al expresado en células de mamíferos.
También se incluyen como polipéptidos de la presente descripción los fragmentos, derivados, análogos y variantes de los polipéptidos precedentes y cualquier combinación de los mismos. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" incluyen péptidos y polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos del péptido natural. El término "suficientemente similar" significa una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes con relación a una segunda secuencia de aminoácidos, de manera que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, en la presente descripción se definen como suficientemente similares, las secuencias de aminoácidos que comprenden un dominio estructural común que es al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos alrededor del 91 %, al alrededor del 92 %, al menos alrededor del 93 %, al menos alrededor del 94 %, al menos alrededor del 95 %, al alrededor del 96 %, al menos alrededor del 97 %, al menos alrededor del 98 %, al menos alrededor del 99 %, o al menos alrededor del 100 % idénticas. Preferentemente, las variantes serán suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de los péptidos preferidos de la presente descripción, en particular a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, o a un péptido sintético o compuesto basado en péptidos que comprende epítopos reconocidos por los anticuerpos de la presente descripción o fragmentos, variantes, derivados o análogos de cualquiera de ellos. Dichas variantes generalmente retienen la actividad funcional de los péptidos de la presente descripción, es decir están unidos por los anticuerpos de la presente descripción. Las variantes incluyen péptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos del péptido nativo y de tipo salvaje, respectivamente, por medio de una o más deleciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos. Estas pueden ser variantes naturales, así como también diseñadas artificialmente.
Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a anticuerpos o polipéptidos de anticuerpos de la presente descripción incluyen cualquiera de los polipéptidos que retienen al menos algunas de las propiedades de unión al antígeno de la correspondiente molécula de unión, anticuerpo o polipéptido nativo. Los fragmentos de polipéptidos de la presente descripción incluyen fragmentos proteolíticos, así como también fragmentos de deleción, además de fragmentos de anticuerpos específicos discutidos en otra parte de la presente descripción.
Las variantes de anticuerpos y polipéptidos de anticuerpos de la presente descripción incluyen fragmentos como se describe anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden o no ser naturales. Las variantes que no son naturales
se pueden producir mediante el uso de técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Los derivados de las moléculas de unión de la presente descripción, por ejemplo, anticuerpos y polipéptidos de anticuerpos de la presente descripción, son polipéptidos que se han alterado para exhibir características adicionales que no se encuentran en el polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden denominarse "análogos de polipéptidos" en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, un "derivado" de una molécula de unión o fragmento de la misma, un anticuerpo o un polipéptido de anticuerpo se refiere a un polipéptido en cuestión que tiene uno o más residuos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional. Se incluyen también como "derivados" los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales, de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina; y la ornitina puede sustituirse por la lisina.
Anticuerpos antiidiotípicos:
El término "anticuerpos antiidiotípicos" cuando se refiere a anticuerpos u otras moléculas de unión incluye moléculas que se unen a la secuencia peptídica antigénica única ubicada en la región variable de un anticuerpo, cerca o en el sitio de unión a antígeno, e inhibe así una respuesta inmunitaria que de cualquier otra manera causaría el autoanticuerpo dado. De manera análoga, puede usarse un péptido sintético o un compuesto basado en péptidos que comprende un epítopo reconocido específicamente por un anticuerpo de la presente descripción.
Los anticuerpos antiidiotípicos pueden obtenerse de forma similar a otros anticuerpos. El anticuerpo antiidiotípico particular se detecta mediante cualquier tipo de entrecruzamiento, ya sea mediante aglutinación (en ensayos turbidimétricos o nefelométricos), precipitación (inmunodifusión radial) o inmunoensayos en sándwich tales como los ELISA. La solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20020142356 proporciona un método para obtener poblaciones de anticuerpos monoclonales antiidiotípicos dirigidos a un anticuerpo que es específico para un antígeno diana de alta concentración y alto peso molecular, en donde dichas poblaciones de anticuerpos antiidiotípicos tienen una amplia variedad de afinidades de unión para el anticuerpo seleccionado específico para dicho antígeno diana, y en donde pueden seleccionarse un subconjunto de dichas poblaciones de anticuerpos antiidiotípicos que tienen la afinidad requerida para una aplicación particular.
La solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20020142356 describe un inmunoensayo competitivo de un antígeno mediante el uso de un anticuerpo como recubrimiento y un anticuerpo antiidiotípico para la detección o viceversa. Otras referencias que describen el uso de un anticuerpo antiidiotípico como antígeno sustituto incluyen Losman y otros, Cancer Research, 55 (1995) (23 suppl. S):S5978-S5982; Becker y otros, J. of Immunol. Métodos 192 (1996), 73-85; Baral y otros, International J. of Cancer, 92 (2001), 88-95; y Kohen y otros, Food and Agriculture Immunology, 12 (2000), 193-201. El uso de anticuerpos antiidiotípico en el tratamiento de enfermedades o contra parásitos es conocido en la técnica; véase, por ejemplo, en Sacks y otros, J. Exper. Medicine, 155 (1982), 1108-1119.
Determinación de la similitud y/o identidad de las moléculas:
La "similitud" entre dos péptidos se determina mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos de un péptido con la secuencia de un segundo péptido. Un aminoácido de un péptido es similar al aminoácido correspondiente de un segundo péptido si es idéntico o una sustitución de aminoácido conservativa. Las sustituciones conservativas incluyen las descritas en Dayhoff, M.O., ed., The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), y en Argos, EMBO J. 8 (1989), 779-785. Por ejemplo, los aminoácidos que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios o sustituciones conservativas: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; y-Asp, Glu.
La determinación del porcentaje de identidad o similitud entre dos secuencias se lleva a cabo preferentemente mediante el uso del algoritmo matemático de Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas BLASTn y BLASTp de Altschul, y otros, (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 available at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge).
La determinación del porcentaje de identidad o similitud se realiza con los parámetros estándar de los programas BLASTn y BLASTp.
Las búsquedas BLAST de polinucleótidos se realizan con el programa BLASTn.
Para los parámetros generales, la casilla "Max Target Sequences" puede establecerse en 100, la casilla "Short queries" puede marcarse, la casilla "Expect Threshold" puede establecerse en 10 y la casilla "Word Size" puede establecerse en 28. Para los parámetros de puntuación, las "Match/mismatch Scores" pueden establecerse en 1, -2 y la casilla "Gap Costs" puede establecerse en lineal. Para los parámetros Filtros y Enmascaramiento, la casilla "Low complexity regions" puede dejarse sin marcar, la casilla "Species-specific repeats" puede dejarse sin marcar, la casilla "Mask for lookup table only" puede marcarse y la casilla "Mask lower case letters" puede dejarse sin marcar.
Las búsquedas BLAST de proteínas se realizan con el programa BLASTp. Para los parámetros generales, la casilla "Max Target Sequences" puede establecerse en 100, la casilla "Short queries" puede marcarse, la casilla "Expect Threshold" puede establecerse en 10 y la casilla "Word Size" puede establecerse "3". Para los parámetros de puntuación, la casilla "Matrix" puede establecerse en "BLOSUM62", la casilla "Gap Costs" puede establecerse en "Existence: 11 Extension: 1", la casilla "Compositional adjustments" puede establecerse en "Conditional compositional score matrix adjustment". Para los parámetros Filtros y Enmascaramiento, la casilla "Low complexity regions" puede dejarse sin marcar, la casilla "Maskfor lookup table only" puede dejarse sin marcar y la casilla "Mask lower case letters" puede dejarse sin marcar.
Polinucleótidos:
El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico en singular, así como también ácidos nucleicos en plural, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislado, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace que no es convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" se refiere a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por polinucleótido o ácido nucleico "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha retirado de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un anticuerpo contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente descripción. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados, de acuerdo con la presente descripción, incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, el polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, un sitio de unión a ribosoma o un terminador de la transcripción.
Como se usa en la presente descripción, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico la cual consiste en codones que se traducen a aminoácidos. Aunque un "codón de parada" (TAG, TGA o TAA) no se traduce a un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia que flanquea a dicha región, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosoma, terminadores de la transcripción, intrones, y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes de la presente descripción pueden presentarse en una única construcción de polinucleótidos, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones de polinucleótidos separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una región codificante única, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la descripción puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no, a un ácido nucleico que codifica una molécula de unión, un anticuerpo o fragmento, variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal de secreción o un dominio funcional heterólogo.
En determinados ejemplos, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o traducción asociados operablemente con una o más regiones codificantes. Una asociación operable es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que coloca la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptidos y un promotor asociado a esta) están "asociados operablemente" o "unidos operablemente" si la inducción de la función del promotor resulta en la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico o interfiere con la capacidad de transcribir el molde de ADN. Por tanto, una región promotora estaría asociada operablemente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operablemente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de la célula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se describen en la presente descripción.
Los expertos en la técnica conocen una variedad de regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción que funcionan en células de vertebrados, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A), virus del simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (como el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados como la actina, la proteína de choque térmico, la hormona de crecimiento bovina y la p-globina de conejo, así como también otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como también promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).
De manera similar, los expertos en la técnica conocen una variedad de elementos de control de la traducción. Estos incluyen, pero no se limitan a, sitios de unión a ribosoma, codones de iniciación y terminación de la traducción y elementos derivados de picornavirus (particularmente un sitio interno de entrada al ribosoma, o IRES, también denominado secuencia CITE).
En otros ejemplos, un polinucleótido de la presente descripción es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm), ARN de horquilla pequeña (ARNhp), ARN de interferencia pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN.
Las regiones codificantes de los polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente descripción pueden asociarse con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos señal o de secreción, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente descripción. De acuerdo con la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por células de mamíferos tienen un péptido señal o una secuencia líder de secreción que se escinde de la proteína madura una vez que se inicia la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrados generalmente tienen un péptido señal fusionado con el extremo N-terminal del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinados ejemplos, el péptido señal nativo, por ejemplo, se usa un péptido señal de la cadena pesada o de la cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que retiene la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que se asocia operablemente con él. Alternativamente, puede usarse un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede sustituirse con la secuencia líder del activador del plasminógeno tisular humano (TPA) o la p-glucuronidasa de ratón. Sin embargo, también es posible la producción intracelular de los polipéptidos, en particular de las inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas de la presente descripción.
Expresión:
El término "expresión", como se usa en la presente descripción, se refiere a un proceso mediante el cual un gen produce un bioquímico, por ejemplo, un a Rn o un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula que incluye, sin limitación, la inactivación del gen, así como también la expresión transitoria y la expresión estable. Incluye, sin limitación, la transcripción del gen en ARN mensajero (ARNm), a Rn de transferencia (ARNt), ARN de horquilla pequeña (ARNhp), ARN de interferencia pequeño (ARNip) o cualquier otro producto de ARN, y la traducción de dicho ARNm en un(os) polipéptido(s). Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y de cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Como se usa en la presente descripción, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen o un polipéptido que se traduce a partir de una transcrito. Los productos génicos descritos en la presente descripción incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glicosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades proteicas, escisión proteolítica y similares.
Una variedad de sistemas de vector de expresión/huésped pueden utilizarse para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión recombinante de tipo bacteriófago, plásmido o cósmido de ADN; levaduras transformadas con vectores de expresión en levaduras; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión virales (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión virales (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión en bacterias (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales.
Para expresar el péptido, polipéptido o proteína de fusión (en lo sucesivo, denominado "producto") en una célula huésped, puede usarse un procedimiento como el siguiente. Un fragmento de restricción que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho producto puede clonarse en un plásmido recombinante apropiado que contiene un origen de replicación que funciona en la célula huésped y un marcador de selección apropiado. El plásmido puede incluir un promotor para la expresión inducible del producto (por ejemplo, pTrc (Amann y otros, Gene 69 (1988), 301315) y pETl ID (Studier y otros, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990), 60 89). El plásmido recombinante puede introducirse en la célula huésped mediante, por ejemplo, electroporación, y las células que contienen el plásmido recombinante pueden identificarse mediante la selección del marcador en el plásmido. La expresión del producto puede inducirse y detectarse en la célula huésped mediante el uso de un ensayo específico para el producto.
En algunos ejemplos, el ADN que codifica el producto/péptido puede optimizarse para la expresión en la célula huésped. Por ejemplo, el ADN puede incluir codones para uno o más aminoácidos que son predominantes en la célula huésped con relación a otros codones para el mismo aminoácido.
Alternativamente, la expresión del producto puede realizarse mediante síntesis in vitro de la proteína en extractos libres de células que también son particularmente adecuados para la incorporación de aminoácidos modificados o artificiales, para estudios funcionales; véase también infra. El uso de sistemas de traducción in vitro puede tener ventajas sobre la expresión de genes in vivo cuando el producto sobreexpresado es tóxico para la célula huésped, cuando el producto es insoluble o forma cuerpos de inclusión, o cuando la proteína sufre una rápida degradación proteolítica por proteasas intracelulares. Los sistemas de traducción libres de células más usados consisten en extractos de reticulocitos de conejo, germen de trigo y Escherichia coli. Todos se preparan como extractos crudos que contienen todos los componentes macromoleculares (ribosomas 70S u 80S, ARNt, aminoacil ARNt sintetasas, factores de iniciación, elongación y terminación, etc.) necesarios para la traducción del ARN exógeno. Para asegurar una traducción eficiente, cada extracto debe complementarse con aminoácidos, fuentes de energía (ATP, GTP), sistemas regeneradores de energía (creatina fosfato y creatina fosfocinasa para los sistemas eucariotas, y fosfoenol piruvato y piruvato cinasa para el lisado de E. coli) y otros cofactores conocidos en la técnica (Mg2+, K+, etc). Los sistemas de transcripción/traducción apropiados están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Promega Corporation, Roche Diagnostics y Ambion, es decir Applied Biosystems (Anderson, C. y otros, Meth. Enzymol. 101 (1983), 635-644; Arduengo, M. y otros (2007), The Role of Cell-Free Rabbit Reticulocyte Expression Systems in Functional Proteomics in, Kudlicki, Katzen y Bennett eds., Cell-Free Expression Vol. 2007. Austin, Tx: Landes Bioscience, pp. 1-18; Chen y Zubay, Meth. Enzymol. 101 (1983), 674-90; Ezure y otros, Biotechnol. Prog. 22 (2006), 1570-1577).
Células huésped:
Con respecto a la presente descripción, la célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota, tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal o humana. Las células fúngicas preferidas son, por ejemplo, las del género Saccharomyces, en particular las de la especie S. cerevisiae. El término "procariota" pretende incluir todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con moléculas de ADN o a Rn para la expresión de un anticuerpo de la descripción o las correspondientes cadenas de inmunoglobulina. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gramnegativas y grampositivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término "eucariota" pretende incluir levaduras, plantas superiores, insectos y preferentemente células de mamíferos, con la máxima preferencia células HEK 293, NSO, CSO y CHO. En dependencia del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los anticuerpos o las cadenas de inmunoglobulina codificadas por el polinucleótido de la presente descripción pueden glicosilarse o no glicosilarse. Los anticuerpos de la descripción o las correspondientes cadenas de inmunoglobulina también pueden incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial. Un polinucleótido de la descripción puede usarse para transformar o transfectar el huésped mediante el uso de cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Además, los métodos para preparar genes fusionados, unidos operablemente, y expresarlos en, por ejemplo, células de mamíferos y bacterias son bien conocidos en la técnica (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Laboratorio de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Las construcciones genéticas y los métodos descritos en ese documento pueden utilizarse para la expresión del anticuerpo de la descripción o las correspondientes cadenas de inmunoglobulina en huéspedes eucariotas o procariotas. En general, los vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficiente del polinucleótido insertado se usan en relación con el huésped. El vector de expresión contiene típicamente un origen de replicación, un promotor y un terminador, así como también genes específicos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica de las células transformadas. Las células fuente adecuadas para las secuencias de ADN y las células huésped para la expresión y secreción de inmunoglobulinas pueden obtenerse de varias fuentes, como la Colección Americana de Cultivos Tipo ("Catálogo de líneas celulares e hibridomas", quinta edición (1985) Rockville, Maryland, Estados Unidos.). Además, los animales transgénicos, preferentemente mamíferos, que comprenden células de la invención pueden usarse para la producción a gran escala del anticuerpo de la invención.
Los huéspedes transformados pueden crecer en fermentadores y cultivarse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente descripción pueden purificarse de acuerdo con los procedimientos estándar de la técnica, que incluyen la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, "Purificación de proteínas", Springer Verlag, NY (1982). El anticuerpo o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondiente(s) de la descripción pueden aislarse luego del medio de cultivo, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de, por ejemplo, anticuerpos o cadenas de inmunoglobulina expresados de forma recombinante de la descripción pueden realizarse por cualquier medio convencional, tales como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra la región constante del anticuerpo de la descripción. Será aparente para los expertos en la técnica que los anticuerpos de la descripción pueden acoplarse además a otras fracciones para, por ejemplo, aplicaciones de direccionamiento e imagen de fármacos. Dicho acoplamiento puede realizarse químicamente después de la expresión del anticuerpo o antígeno en el sitio de unión o el producto de acoplamiento puede manipularse en el anticuerpo o antígeno de la descripción a nivel de ADN. A continuación, los ADN se expresan en un sistema huésped adecuado y las proteínas expresadas se recolectan y se renaturalizan, si es necesario.
Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos alrededor de 90 a 95 % de homogeneidad, y las de 98 a 99 % o más de homogeneidad son las de máxima preferencia para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, los anticuerpos pueden usarse luego terapéuticamente (que incluye de forma extracorpórea) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo.
La presente descripción también implica un método para producir células capaces de expresar un anticuerpo de la descripción o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondiente(s) que comprende células manipuladas genéticamente con el polinucleótido o con el vector de la descripción. Las células que pueden obtenerse mediante el método de la descripción pueden usarse, por ejemplo, para probar la interacción del anticuerpo de la descripción con su antígeno.
Ensayos ELISA:
Los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) para varios antígenos incluyen los basados en colorimetría, quimioluminiscencia y fluorometría. Los ELISA se han aplicado con éxito en la determinación de bajas cantidades de fármacos y otros componentes antigénicos en muestras de plasma y orina, no implican etapas de extracción y son fáciles de llevar a cabo. Los ELISA para la detección de anticuerpos contra antígenos proteicos a menudo usan la unión directa de péptidos sintéticos cortos a la superficie de plástico de una placa de microtitulación. Los péptidos son, en general, muy puros debido a su naturaleza sintética y métodos de purificación eficientes, mediante el uso de cromatografía líquida de alta resolución. Un inconveniente de los péptidos cortos es que, por lo general, representan epítopos lineales, pero no epítopos conformacionales o discontinuos. Para presentar epítopos conformacionales, se usan péptidos largos o la proteína nativa completa. La unión directa de los antígenos proteicos al soporte de poliestireno hidrofóbico de la placa puede dar como resultado la desnaturalización parcial o total de la proteína unida y la pérdida de epítopos conformacionales. El recubrimiento de la placa con un anticuerpo, que media la inmovilización (ELISA de captura) de los antígenos, puede evitar este efecto.
Sin embargo, con frecuencia, las proteínas recombinantes sobreexpresadas son insolubles y requieren purificación en condiciones desnaturalizantes y de la renaturalización, cuando se van a analizar anticuerpos contra epítopos conformacionales. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20030044870 para un ELISA genérico que usa proteínas de fusión recombinantes como proteínas de recubrimiento.
Moléculas de unión:
Una "molécula de unión", como se usa en el contexto de la presente descripción, se refiere principalmente a anticuerpos y fragmentos de los mismos, pero también puede referirse a otras moléculas que no son anticuerpos que se unen a las "moléculas de interés" de la presente descripción, en donde las moléculas de interés son proteínas de la clase de glicoproteínas conocidas como citocinas, en particular interferones seleccionados del grupo de diferentes subtipos de IFN-a. Las moléculas de interés de la presente descripción se definen con detalles adicionales dentro de la descripción de los ejemplos particulares de la presente descripción que se mencionan anteriormente y más abajo. Las moléculas de unión de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, hormonas, receptores, ligandos, moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), chaperonas tales como las proteínas de choque térmico (HSP), así como también moléculas de adhesión célula-célula, tales como los miembros de las superfamilias de la cadherina, intergrina, lectina tipo C y e inmunoglobulinas (Ig). Por tanto, solo en aras de la claridad y sin restringir el alcance de la presente descripción, la mayoría de los siguientes ejemplos se discuten con respecto a anticuerpos y moléculas similares a anticuerpos que representan las moléculas de unión preferidas para el desarrollo de agentes terapéuticos y de diagnóstico.
Anticuerpos:
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en la presente descripción. Un anticuerpo o inmunoglobulina es una molécula de unión a una molécula de interés de la presente invención, como se define antes en la presente descripción y más abajo, que comprende al menos el dominio variable de una cadena pesada y comprende normalmente al menos los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de las inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados se entienden relativamente bien; véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da edición 1988). Los términos "se une" y "reconoce" se usan indistintamente con respecto a la afinidad de unión de las moléculas de unión de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos.
Cualquier anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contiene la estructura suficiente para unirse específicamente a la molécula de interés, como se define anteriormente en la presente descripción y más abajo, se denota en la presente descripción indistintamente como una "molécula de unión", "fragmento de unión" o "fragmento inmunoespecífico"
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos inmunoespecíficos, variantes o derivados de los mismos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, murinizados o quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos de unión a epítopos, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2 , Fd, Fv, Fv de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio Vl o VH, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab y anticuerpos antiidiotípico (anti-Id) (que incluyen por ejemplo, anticuerpos anti-Id contra los anticuerpos descritos en la presente descripción). Las moléculas scFv se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5,892,019. A este respecto, el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo también puede ser un anticuerpo de dominio (dAb), también conocido como anticuerpos de dominio único (sdAB) o nanobodies™ (Ablynx, Gent, Bélgica), véase, por ejemplo, De Haard y otros, J. Bacteriol. 187 (2005), 4531­ 4541; Holt y otros, Trends Biotechnol. 21 (2003), 484-490. Como se discutirá con más detalle más abajo, el término "inmunoglobulina" comprende varias clases amplias de polipéptidos pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la técnica apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) por ejemplo, IgG1, IgG3, IgG4, IgA1, etc. se encuentran bien caracterizadas y se conoce que confieren especialización funcional. Las moléculas de inmunoglobulina o anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, clases IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), o subclases (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc.) de molécula de inmunoglobulina. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son discernibles fácilmente para el experto en la técnica en vista de la descripción inmediata y, en consecuencia, están dentro del alcance de la presente invención. Aunque todas las clases de inmunoglobulina están claramente dentro del alcance de la presente invención, la siguiente discusión se dirigirá generalmente a la clase IgG de las moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a la IgG, una molécula de inmunoglobulina estándar comprende dos polipéptidos de cadena ligera idénticos de peso molecular aproximadamente de 23000 Daltons, y dos polipéptidos de cadena pesada idénticos de peso molecular de 53000-70000. Las cuatro cadenas se unen típicamente por enlaces disulfuro en una configuración de "Y" en donde las cadenas ligeras sujetan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.
Como es evidente a partir de la clasificación de los anticuerpos ilustrativos anti-IFNa de la presente invención enumerados en la Tabla 1 anteriormente, los anticuerpos ilustrativos de la presente invención son de la clase IgG1, lo que implica posiblemente respuestas de linfocitos T reguladores y/o de epitelios en su iniciación en estos estados de deficiencia del gen AIRE. Estos hallazgos se confirman mediante la clasificación de los autoanticuerpos correspondientes que se encuentran en los ratones con deficiencia de AIRE descritos por Karner y otros, en Clin. Exp. Immunol. (2012); doi: 10.1111/cei.12024. En consecuencia, en un ejemplo preferido de la presente descripción, los anticuerpos de la presente invención son del tipo IgG, incluso se prefieren más los IgG1.
Estructura de la IgG:
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre sí, y las porciones de la "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes, cuando las inmunoglobulinas se generan mediante hibridomas, linfocitos B o células huésped manipuladas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un extremo N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el extremo C-terminal en la parte inferior de cada cadena.
Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se usan funcionalmente. Con respecto a esto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera (Vl) y pesada (Vh) determinan el reconocimiento y la especificidad a antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CHI, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión a antígeno o del extremo amino del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable y la porción C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden el extremo carboxilo de la cadena pesada y ligera, respectivamente.
Como se indicó anteriormente, la región variable permite que el anticuerpo reconozca selectivamente y se una específicamente a los epítopos en los antígenos. Es decir, el dominio Vl y el dominio Vh, o subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura cuaternaria del anticuerpo forma el sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno se define por tres CDR en cada una de las cadenas Vh y Vl. Cualquier anticuerpo o fragmento de inmunoglobulina que contiene la estructura suficiente para unirse específicamente a una molécula de interés de la presente invención se denota en la presente descripción indistintamente como un "fragmento de unión" o un "fragmento inmunoespecífico".
En los anticuerpos naturales, un anticuerpo comprende seis regiones hipervariables, a veces llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" presentes en cada dominio de unión a antígeno, que son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que se posicionan específicamente para formar el dominio de unión a antígeno ya que el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Las "CDR" están flanqueadas por cuatro regiones "marco" o "FR" relativamente conservadas que muestran menos variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de hoja p y las CDR forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Por lo tanto, las regiones marco actúan para formar un soporte que proporciona el posicionamiento de las CDR en la orientación correcta mediante interacciones intercatenarias no covalentes. El dominio de unión a antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo conocido. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente los aminoácidos que comprenden las CDR y las regiones marco, respectivamente, para cualquier región variable de cadena pesada o ligera dada, dado que se han definido con precisión; véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., y otros, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917.
En el caso donde haya dos o más definiciones de un término que se usa y/o acepta dentro la técnica, la definición del término como se usa en la presente descripción pretende incluir todos esos significados a menos que se establezca explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región en particular ha sido descrita por Kabat y otros, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917, donde las definiciones incluyen solapamiento o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variante del mismo, se pretende que esté dentro del alcance del término como se define y usa en la presente descripción. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR definidas porcada una de las referencias citadas anteriormente, se establecen más abajo en la Tabla 2 como una comparación. Los números exactos de residuos que abarcan una CDR particular variarán en dependencia de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar rutinariamente cuáles residuos comprende una región hipervariable particular o CDR del subtipo de anticuerpo IgG humano dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.
Figure imgf000047_0001
Kabat y otros también definieron un sistema de numeración para las secuencias del dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia del dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Como se usa en la presente descripción, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat y otros, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Amenos que se especifique de cualquier otra manera, las referencias a la numeración de las posiciones específicas de los residuos de aminoácidos en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado del mismo de la presente invención son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, el cual, sin embargo, es teórico y puede que no se aplique de la misma manera a cada anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, en dependencia de la posición de la primera CDR, las siguientes CDR podrían desplazarse en cualquier dirección.
En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención no es IgM o un derivado del mismo con una estructura pentavalente. Particularmente, en aplicaciones específicas de la presente descripción, especialmente en el uso terapéutico, las IgM son menos útiles que las IgG y otros anticuerpos bivalentes o las moléculas de unión correspondientes, dado que las IgM, debido a su estructura pentavalente y la falta de maduración de la afinidad, a menudo muestran reactividades cruzadas inespecíficas y muy baja afinidad.
En un ejemplo preferido particularmente, el anticuerpo de la presente descripción no es un anticuerpo policlonal, es decir consiste sustancialmente en una especie de anticuerpo particular en lugar de ser una mezcla obtenida de una muestra de inmunoglobulina plasmática.
Fragmentos de anticuerpos, animalización:
Los fragmentos de anticuerpos, que incluyen los anticuerpos de cadena única, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una porción de las siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la descripción fragmentos de unión a una molécula de interés de la presente invención, dichos fragmentos comprenden cualquier combinación de región(es) variable(s) con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos o fragmentos inmunoespecíficos de los mismos de la presente descripción, equivalentes a los anticuerpos monoclonales aislados de acuerdo con el método de la presente invención, en particular a los anticuerpos monoclonales humanos, pueden ser de cualquier origen animal, que incluye pájaros y mamíferos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos, murinos, de burro, de conejo, de cabra, de cobayo, de camello, de llama, de caballo o de pollo. En otro ejemplo, la región variable puede tener un origen de condrictios (por ejemplo, de tiburones).
En un ejemplo particularmente preferido de la presente descripción, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos naturales o fragmentos de unión, derivados y variantes de los mismos clonados a partir de sujetos humanos, que se unen específicamente a los subtipos de IFNa específicos de la presente invención, como se define en detalle anteriormente y más abajo, por ejemplo, en la Tabla 1, las Figuras, en particular las Figuras 1 a 4 y en los Ejemplos, por ejemplo, en los Ejemplos 2 y 6.
Opcionalmente, la región marco del anticuerpo humano se alinea y se ajusta de acuerdo con las secuencias de la región variable de la línea germinal humana pertinentes en la base de datos; véase, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) gestionado por el Centro MRC para la Ingeniería de Proteínas (Cambridge, Reino Unido). Por ejemplo, los aminoácidos considerados potencialmente desviados de la secuencia verdadera de la línea germinal podrían deberse a las secuencias del cebador de la PCR incorporadas durante el proceso de clonación. En comparación con los anticuerpos similares a los de humanos, generados artificialmente, tal como los fragmentos de anticuerpos de cadena única (scFv) de una biblioteca de anticuerpos presentados en fagos o ratones xenogénicos, el anticuerpo monoclonal humano de la presente descripción se caracteriza por (i) obtenerse a partir de la respuesta inmunitaria humana en lugar de la de sustitutos animales, es decir el anticuerpo se ha generado en respuesta a subtipos de IFNa en su conformación relevante en el cuerpo humano, (ii) haber protegido al individuo o minimizado al menos significativamente la presencia de síntomas de la enfermedad, por ejemplo, SLE, y (iii) dado que el anticuerpo es de origen humano, los riesgos de reactividad cruzada contra antígenos propios se minimizan. Por tanto, de acuerdo con la presente invención, los términos "anticuerpo monoclonal humano", "autoanticuerpo monoclonal humano", "anticuerpo humano" y similares, se usan para denotar una molécula de unión a IFN-a, de una especificidad de subtipo de IFN-a particular que es de origen humano, es decir que se ha aislado de una célula humana tal como un linfocito B o hibridoma del mismo o cuyo ADNc se ha clonado directamente a partir del ARNm de una célula humana, por ejemplo un linfocito B de memoria humano. Un anticuerpo humano aún se considera como "humano" incluso si se hacen sustituciones de aminoácidos en el anticuerpo, por ejemplo, para mejorar las características de unión.
Los anticuerpos derivados de las bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describió infra y, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5.939.598 de Kucherlapati y otros, se denotan como anticuerpos similares a los de humanos para distinguirlos de los anticuerpos verdaderamente humanos de la presente invención.
Por ejemplo, el apareamiento de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos similares a los de humanos, tales como anticuerpos sintéticos y semisintéticos, típicamente aislados de una biblioteca de presentación en fagos, no reflejan necesariamente el apareamiento original como ocurrió en el linfocito B humano original. En consecuencia, los fragmentos Fab y scFv obtenidos de bibliotecas de expresión recombinante como se usan comúnmente en la técnica anterior pueden considerarse artificiales con todos los posibles efectos asociados sobre la inmunogenicidad y la estabilidad.
Por el contrario, la presente invención proporciona anticuerpos de afinidad madurada, aislados a partir de sujetos humanos seleccionados, que se caracterizan por su utilidad terapéutica.
Anticuerpos injertados (equivalentes)
La descripción también se refiere a anticuerpos injertados (denominados indistintamente como equivalentes) que contienen CDR derivadas a partir de los anticuerpos de la presente invención, tales como anticuerpos anti-IFN-a, respectivamente. Dichas CDR injertadas incluyen anticuerpos animalizados, en los que se han injertado CDR de los anticuerpos de la presente invención o en los que se injerta una CDR que contiene una o más sustituciones de aminoácidos. Las CDR pueden injertarse directamente en un marco humano o en un marco de anticuerpo de origen animal como se indicó anteriormente. Si se desea, también pueden incorporarse cambios de marco mediante la generación de bibliotecas de marco. La optimización de las CDR y/o secuencias marco puede realizarse independientemente y combinada secuencialmente o puede realizarse simultáneamente, como se describe con más detalle más abajo.
Para generar anticuerpos injertados, las CDR donantes de los anticuerpos de la presente invención se injertan en un marco de región variable aceptor de anticuerpo. Los métodos para injertar anticuerpos y generar variantes de CDR para optimizar la actividad se han descrito previamente (véase, por ejemplo, las solicitudes de patentes internacionales WO 98/33919; WO 00/78815; WO 01/27160). El procedimiento puede realizarse para lograr el injerto de las CDR donantes y la readquisición de la afinidad en un proceso simultáneo. Los métodos pueden usarse de manera similar, solos o en combinación con injertos de CDR, para modificar u optimizar la afinidad de unión de una región variable. Los métodos para conferir afinidad de unión a la CDR donante en una región variable aceptora son aplicables a ambas regiones variables de cadena pesada y ligera y, como tales, pueden usarse para injertar y optimizar simultáneamente la afinidad de unión de la región variable de un anticuerpo.
Las CDR donantes pueden alterarse para que contengan una pluralidad de cambios de residuos de aminoácidos diferentes en todas las posiciones o posiciones seleccionadas dentro de las CDR donantes. Por ejemplo, la incorporación aleatoria o sesgada de los veinte residuos de aminoácidos naturales, o de subconjuntos preseleccionados, puede introducirse en las CDR donantes para producir una población diversa de especies de CDR. La inclusión de especies variantes de CDR en la población diversa de regiones variables permite la generación de especies variantes que muestran una afinidad de unión optimizada para un antígeno predeterminado. Puede hacerse una variedad de posibles cambios en las posiciones de las CDR de donantes. Algunos o todos los posibles cambios que pueden seleccionarse para el cambio, pueden introducirse en la población de CDR donantes injertadas. Puede seleccionarse una única posición en una CDR para introducir los cambios o pueden combinarse una variedad de posiciones que tienen aminoácidos alterados y cribarlos por su actividad.
Un enfoque es cambiar todas las posiciones de los aminoácidos a lo largo de una CDR mediante el reemplazo de cada posición con, por ejemplo, los veinte aminoácidos naturales. El reemplazo de cada posición puede ocurrir en el contexto de otras posiciones de aminoácidos de la CDR donante de modo que una porción significativa de la CDR mantenga la secuencia de la CDR donante auténtica y, por lo tanto, la afinidad de unión de la CDR donante. Por ejemplo, un marco de región variable aceptor, ya sea un marco nativo o alterado, puede injertarse con una población de CDR que contienen reemplazos de una única posición en cada posición dentro de las CDR. De manera similar, un marco de región variable aceptor puede ser diana de un injerto con una población de CDR que contienen más de una posición cambiada para incorporar los veinte residuos de aminoácidos, o un subconjunto de aminoácidos. Una o más posiciones de aminoácidos dentro de una CDR, o dentro de un grupo de CDR a injertar, pueden alterarse e injertarse en un marco de región variable aceptor para generar una población de anticuerpos injertados. Se entiende que una CDR que tiene una o más posiciones alteradas puede combinarse con una o más CDR que tienen una o más posiciones alteradas, si se desea.
Una población de especies variantes de CDR que tienen una o más posiciones alteradas puede combinarse con cualquiera o con todas las CDR que constituyen el bolsillo de unión de una región variable. Por lo tanto, un marco de región variable aceptor puede ser diana de la incorporación simultánea de poblaciones de variantes de CDR donantes en una, dos o las tres ubicaciones de CDR receptoras en una cadena pesada o ligera. La elección de qué CDR o el número de CDR a las que se dirigirán los cambios de posición de aminoácidos dependerá, por ejemplo, de si se desea un injerto de CDR completo en un aceptor o si el método se realiza para optimizar la afinidad de unión.
Otro enfoque para seleccionar los aminoácidos de la CDR donante que se cambiarán para conferir afinidad de unión de la CDR donante en un marco de región variable aceptor de anticuerpo, es seleccionar posiciones de CDR conocidas o fácilmente identificables que son altamente variables. Por ejemplo, la región variable CDR3 es generalmente muy variable. Por lo tanto, pueden dirigirse a esta región, selectivamente, cambios de posición de aminoácidos durante los procedimientos de injerto para garantizar la readquisición o el aumento de la afinidad de unión, ya sean solos o junto con cambios relevantes en el marco variable aceptor.
Anticuerpos murinizados:
Un ejemplo de anticuerpos generados por injerto, como se describe anteriormente, son los anticuerpos murinizados. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo murinizado" o "inmunoglobulina murinizada" se refiere a un anticuerpo que comprende una o más CDR de un anticuerpo humano de la presente invención; y una región marco humana que contiene sustituciones y/o deleciones y/o inserciones de aminoácidos que se basan en una secuencia de anticuerpo de ratón. La inmunoglobulina humana que proporciona las CDR se llama la "parental" o "aceptora" y el anticuerpo de ratón que proporciona los cambios en el marco se llama "donante". Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, por lo general son sustancialmente idénticas a las regiones constantes del anticuerpo de ratón, es decir, al menos alrededor de 85-90 %, preferentemente alrededor de 95 % o más idénticas. Por eso, en algunos ejemplos, una inmunoglobulina humana de cadena pesada o ligera murinizada de longitud completa contiene una región constante de ratón, las CDR humanas y un marco sustancialmente humano que tiene varias sustituciones de aminoácidos "murinizantes". Típicamente, un "anticuerpo murinizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera variable murinizada y/o una cadena pesada variable murinizada. Por ejemplo, un anticuerpo murinizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico, por ejemplo, debido a que toda la región variable de un anticuerpo quimérico no es de ratón. Un anticuerpo modificado que ha sido "murinizado" por el proceso de "murinización" se une al mismo antígeno que el anticuerpo parental que proporciona las CDR y por lo general es menos inmunogénico en ratones, en comparación con el anticuerpo parental.
Fragmentos de anticuerpos:
Como se usa en la presente descripción, el término "porción de cadena pesada" incluye las secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Un polipéptido que comprende una porción de cadena pesada comprende al menos uno de: un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región de la bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3 o una variante o fragmento de la misma. Por ejemplo, un polipéptido de unión para su uso en la invención puede comprender una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH2; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1 y un dominio CH3; una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, y un dominio CH3, o una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH1, al menos una porción de un dominio bisagra, un dominio CH2, y un dominio CH3. En otro ejemplo, un polipéptido de la descripción comprende una cadena polipeptídica que comprende un dominio CH3. Además, un polipéptido de unión para su uso en la invención puede carecer de al menos una porción de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2). Como se estableció anteriormente, un experto en la técnica entenderá que estos dominios (por ejemplo, las porciones de la cadena pesada) pueden modificarse de manera que varíen en la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina natural.
En determinados anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente descripción, las porciones de cadena pesada de una cadena polipeptídica de un multímero son idénticas a las de una segunda cadena polipeptídica del multímero. Alternativamente, los monómeros que contienen porciones de la cadena pesada no son idénticos. Por ejemplo, cada monómero puede comprender un sitio de unión a la diana diferente, lo que forma, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o diacuerpo.
En otra descripción, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos descritos en la presente descripción se componen de una cadena polipeptídica única tal como scFv y deben expresarse intracelularmente (intracuerpos) para potenciales aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo.
Las porciones de cadena pesada de un polipéptido de unión para su uso en los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en la presente descripción pueden derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una porción de cadena pesada de un polipéptido puede comprender un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una porción de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.
Por tanto, como también se ejemplifica en los Ejemplos, en un ejemplo la región constante del anticuerpo de la presente descripción o parte de la misma, en particular el dominio CH2 y/o CH3, pero opcionalmente también el dominio CH1 es heterólogo a la región variable del anticuerpo monoclonal humano nativo aislado de acuerdo con el método de la presente descripción. En este contexto, la(s) región(es) constante(s) heteróloga(s) es(son) preferentemente de origen humano en el caso de aplicaciones terapéuticas del anticuerpo de la presente descripción, pero también podría ser, por ejemplo, de origen de roedores en el caso de estudios con animales; véanse también los Ejemplos.
Como se usa en la presente descripción, el término "porción de cadena ligera" incluye las secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. Preferentemente, la porción de cadena ligera comprende al menos un dominio Vl o Cl.
Como se indicó anteriormente, las estructuras de las subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas se conocen bien. Como se usa en la presente descripción, el término "dominio Vh" incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y el término "dominio CH1" incluye el primer dominio (el más amino terminal) de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio Vh y es amino terminal a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de inmunoglobulina.
Como se usa en la presente descripción, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde alrededor del residuo 244 al residuo 360 de un anticuerpo mediante el uso de esquemas de numeración convencionales (residuos 244 a 360, sistema de numeración de Kabat; y residuos 231-340, sistema de numeración EU; ver Kabat EA y otros op. cit). El dominio CH2 es único en el sentido de que no se aparea estrechamente con otro dominio. En su lugar, dos cadenas de carbohidratos ramificados unidas a asparagina se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. También está bien documentado que el dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el C-terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 residuos.
Como se usa en la presente descripción, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión a antígeno N-terminal se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: dominios bisagra superior, medio e inferior; véase Roux y otros, J. Immunol. 161 (1998), 4083.
Como se usa en la presente descripción, el término "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un segundo grupo tiol. En la mayoría de las moléculas de IgG naturales, las regiones CH1 y CL se unen por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas se unen por dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 mediante el uso del sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU).
Como se usa en la presente descripción, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes más, por cualquier medio que incluye la conjugación química o medios recombinantes. Una "fusión en marco" se refiere a la unión de dos o más marcos abiertos de lectura de polinucleótidos (ORF) para formar un ORF continuo más largo, de manera que mantiene el marco de lectura de traducción correcto de los ORF originales. Por lo tanto, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (cuyos segmentos normalmente no están unidos en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se hace así continuo a lo largo de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar separados física o espacialmente, por ejemplo, por una secuencia conectora en marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden fusionarse, en marco, pero estar separados por un polinucleótido que codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones c Dr adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" estén cotraducidas como parte de un polipéptido continuo. En consecuencia, en una descripción, el polinucleótido es un ADNc que codifica la región variable y al menos parte del dominio constante. En un ejemplo, el polinucleótido es un ADNc que codifica la región variable y el dominio constante de un anticuerpo de la presente descripción como se define en la presente descripción.
Epítopos:
Se cree que el tamaño mínimo de un epítopo peptídico o polipeptídico para un anticuerpo es de alrededor de cuatro a cinco aminoácidos. Los epítopos peptídicos o polipeptídicos contienen preferentemente al menos siete, con mayor preferencia al menos nueve y con la máxima preferencia entre al menos alrededor de 15 a alrededor de 30 aminoácidos. Dado que una CDR puede reconocer un péptido o polipéptido antigénico en su forma terciaria, los aminoácidos que comprenden un epítopo no necesitan estar contiguos, y en algunos casos, incluso pueden no estar en la misma cadena peptídica. En la presente descripción, un epítopo peptídico o polipeptídico reconocido por los anticuerpos de la presente invención contiene una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, con mayor preferencia al menos 8, al menos 9, al menos 10 , al menos 15, al menos 20, al menos 25, entre alrededor de 15 a alrededor de 30 o entre alrededor de 30 a alrededor de 50 aminoácidos contiguos o no contiguos de una molécula de interés de la presente invención, es decir al menos un subtipo de IFNA, o las secuencias homólogas de los otros subtipos de IFNA, en caso de que el anticuerpo reconozca más de un subtipo. Para el mapeo de epítopos de IFNA2 para los anticuerpos ilustrativos 19D11 y 26B9 y del epítopo de IFNW para el anticuerpo ilustrativo 26B9 de la presente descripción, véase la Figura 27.
Características de unión:
Por"unir" o "reconocer", usado indistintamente en la presente descripción, se entiende generalmente que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que se une a un epítopo predeterminado a través de su dominio de unión a antígeno, y que la unión implica alguna complementariedad entre el dominio de unión a antígeno y el epítopo. De acuerdo con esta definición, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que se podría unir a un epítopo aleatorio, no relacionado. El término "especificidad" se usa en la presente descripción para calificar la afinidad relativa por la que un determinado anticuerpo se une a un determinado epítopo. Por ejemplo, puede considerarse que el anticuerpo "A" tiene una especificidad superior por un epítopo dado que el anticuerpo "B," o se puede decir que el anticuerpo "A" se une al epítopo "C" con una especificidad superior que la que tiene para el epítopo "D" relacionado. Los epítopos no relacionados por lo general son parte de un antígeno inespecífico (por ejemplo, BSA, caseína o cualquier otro polipéptido especificado), que puede usarse para la estimación de la especificidad de unión de una molécula de unión dada. A este respecto, el término "unión específica" se refiere a la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado con una Kd que es al menos dos veces menor que su Kd para unirse a un antígeno no específico. El término unión "altamente específica", tal como se usa en la presente descripción, significa que la K d relativa del anticuerpo para el epítopo diana específico es al menos 10 veces menor que la Kd para unir ese anticuerpo a otros ligandos.
Cuando está presente, el término "características de unión inmunológica" u otras características de unión de un anticuerpo con un antígeno, en todas sus formas gramaticales, se refiere a la especificidad, afinidad, reactividad cruzada y otras características de unión de un anticuerpo.
Por "unir preferentemente," se entiende que la molécula de unión, por ejemplo, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo más fácilmente de lo que se podría unir a un epítopo relacionado, similar, homólogo o análogo. Por tanto, un anticuerpo que "se une preferentemente" a un epítopo dado podría unirse más probablemente a ese epítopo que a un epítopo relacionado, aunque dicho anticuerpo pueda reaccionar de forma cruzada con el epítopo relacionado. Con respecto a antígenos particulares, tales como subtipos de IFNA específicos, el término "se une preferentemente" significa que la molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se une específicamente a un subtipo de IFNA más fácilmente de lo que se uniría a un subtipo de IFNA relacionado, similar, homólogo o análogo.
Por medio de un ejemplo no limitante, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo puede considerarse que se une a un primer epítopo preferentemente si se une a dicho primer epítopo con una constante de disociación (Kd) que es menor que la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer antígeno si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer epítopo si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la Kd del anticuerpo para el segundo epítopo.
En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se une a un primer epítopo preferentemente si se une al primer epítopo con una velocidad de disociación (k(off)) que es menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer epítopo si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos un orden de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo. En otro ejemplo no limitante, puede considerarse que un anticuerpo se une preferentemente a un primer epítopo si se une al primer epítopo con una afinidad que es al menos dos órdenes de magnitud menor que la k(off) del anticuerpo para el segundo epítopo.
Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en la presente descripción, puede decirse que se une a una molécula de interés de la presente descripción o a un fragmento o variante de la misma con una velocidad de disociación (k(off)) menor o igual a 5 x 10-2 seg-1, 10-2 seg-1, 5 x 10-3 seg-1 o 10-3 seg-1. Con mayor preferencia, puede decirse que un anticuerpo de la descripción se une a una molécula de interés o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de disociación (k(off)) menor o igual a 5 x 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 x 10-5 seg-1, o 10-5 seg-15 x 10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 x 10-7 seg-1 o 10-7 seg-1.
Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, variante o derivado descrito en la presente descripción, puede decirse que se une a una molécula de interés de la presente descripción o a un fragmento o variante de la misma con una velocidad de asociación (k(on)) mayor o igual a 103 M-1 seg-1, 5 x 103M-1 seg-1, 104 M-1 seg-1 o 5 * 104 M-1 seg-1. Con mayor preferencia, puede decirse que un anticuerpo de la descripción se une a una molécula de interés o un fragmento o variante de la misma con una velocidad de asociación (k(on)) mayor o igual a 105 M-1 seg-1, 5 * 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, o 5 * 106 M-1 seg-1 o 107 M-1 seg-1.
Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se dice que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de referencia a un epítopo dado si se une preferentemente a ese epítopo hasta el grado que se bloquea, en cierta medida, la unión del anticuerpo de referencia al epítopo. La inhibición competitiva puede ser determinada por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA competitivos. Se puede decir que un anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia a un epítopo dado en al menos 90 %, al menos 80 %, al menos 70 %, al menos 60 % o al menos 50 %.
Como se usa en la presente descripción, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de unión de un epítopo individual con la CDR de una molécula de unión, por ejemplo, una molécula de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Harlow y otros, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da edición. (1988) en las páginas 27-28. Como se usa en la presente descripción, el término "avidez" se refiere a la estabilidad general del complejo entre una población de inmunoglobulinas y un antígeno, es decir, la fuerza de combinación funcional de una mezcla de inmunoglobulina con el antígeno; véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez se relaciona tanto con la afinidad de las moléculas de inmunoglobulinas individuales en la población con epítopos específicos, como también con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, tal como un polímero, sería una de gran avidez. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antígeno puede determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman y Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos que se describen en esos documentos. Las técnicas generales para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno incluyen ELISA, RIA y resonancia de plasmones de superficie. La afinidad que se mide de una interacción particular antígeno anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes, por ejemplo, concentración de sales, pH. Por tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, Kd, CI50 , se llevan a cabo preferentemente, con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.
Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Como se usa en la presente descripción, el término "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de la relación entre las dos sustancias antigénicas diferentes. Por tanto, un anticuerpo es reactivo cruzado si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo de reacción cruzada generalmente contiene muchos de las mismas características estructurales complementarias que el epítopo inductor y, en algunos casos, puede encajar mejor que el original.
Por ejemplo, determinados anticuerpos tienen algún grado de reactividad cruzada, ya que se unen a epítopos relacionados, pero no idénticos, por ejemplo, epítopos con al menos 95 %, al menos 90 %, al menos 85 %, al menos 80 %, al menos 75 %, al menos 70 %, al menos 65 %, al menos 60 %, al menos 55 % y al menos 50 % de identidad (como se calcula mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción) a un epítopo de referencia. Puede decirse que un anticuerpo tiene poca o ninguna reactividad cruzada si no se une a epítopos con menos del 95 %, menos del 90 %, menos del 85 %, menos del 80 %, menos del 75 %, menos del 70 %, menos del 65 %, menos del 60 %, menos del 55 % y menos del 50 % de identidad (como se calcula mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción) a un epítopo de referencia. Un anticuerpo puede considerarse "altamente específico" para un determinado epítopo, si no se une a ningún otro análogo, ortólogo u homólogo de ese epítopo.
Las moléculas de unión, por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos de la invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a la molécula de interés de la presente invención. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menor de 5 * 10-2 M, 10-2 M, 5 * 10-3M, 10-3M, 5 * 10-4 M, 10-4 M, 5 * 10-5 M, 10-5 M, 5 * 10-6 M, 10­ 6 M, 5 * 10-7 M, 10-7 M, 5 * 10-g M, 10-8 M 5 * 10-9 M, 10-9 M, 5 * 10-10 M, 10-10 M, 5 * 10-11 M, 10-11 M, 5 * 10-12 M, 10­ 12 M, 5 * 10-13 M, 10-13 M, 5 * 10-14 M, 10-14 M, 5 * 10-15 M, o 10-15 M. Típicamente, el anticuerpo se une con una constante de disociación (Kd) de 10-7 M o menos, a su antígeno predeterminado. Preferentemente, el anticuerpo se une a su antígeno afín con una constante de disociación (Kd) de 10-9 M o menos y con mayor preferencia con una constante de disociación (Kd) de 10-11 M o menos.
Modificaciones de anticuerpos:
Una inmunoglobulina o su ADNc codificante puede modificarse adicionalmente. Por tanto, el método descrito en la presente descripción comprende una cualquiera de la(s) etapa(s) de producir un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena única, fragmento Fab, anticuerpo biespecífico, anticuerpo de fusión, anticuerpo marcado o un análogo de cualquiera de esos. Los métodos correspondientes se conocen por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, (1988). Cuando los derivados de dichos anticuerpos se obtienen mediante la técnica de presentación en fagos, la resonancia de plasmones de superficie como se emplea en el sistema BIAcore, puede usarse para aumentar la eficiencia de los anticuerpos presentados en fagos que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO89/09622. Los métodos para la producción de anticuerpos humanizados se describen en, por ejemplo, la solicitud europea EP-A1 0239 400 y la solicitud internacional WO90/07861. Las fuentes de anticuerpos adicionales a utilizar de acuerdo con la presente descripción se llaman anticuerpos xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos tales como anticuerpos humanos en ratones se describen en, por ejemplo, las solicitudes internacionales WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 y WO 96/33735. Como se discutió anteriormente, el anticuerpo de la descripción puede existir en una variedad de formas además de anticuerpos completos; que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2 , así como también en cadenas únicas; véase por ejemplo la solicitud internacional WO88/09344.
Los anticuerpos de la presente invención o su(s) cadena(s) de inmunoglobulina correspondiente(s) puede(n) modificarse adicionalmente mediante el uso de técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de deleción(es), inserción(es), sustitución(es), adición(es), y/o recombinación(ones) y/o cualquier otra(s) modificación(es) de aminoácidos conocida en la técnica, ya sea sola o en combinación. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para introducir dichas modificaciones en la secuencia de ADN subyacente en la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, NY (1994). Las modificaciones del anticuerpo de la descripción incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, que incluyen modificaciones de la cadena lateral, modificaciones del esqueleto y modificaciones en los extremos N-terminal y C-terminal, que incluyen acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de fracciones de carbohidratos o lípidos, cofactores y similares. Igualmente, la presente descripción abarca la producción de proteínas quiméricas que comprenden el anticuerpo descrito o algún fragmento del mismo en el extremo amino fusionado a una molécula heteróloga tal como un marcador o un fármaco. Las moléculas de unión a antígeno generadas de esta manera pueden usarse para la localización de fármacos en células que expresan las estructuras superficiales apropiadas de la célula y el tejido enfermos, respectivamente. Este direccionamiento y unión a las células podría ser útil para el suministro de agentes activos terapéuticamente o para el diagnóstico y terapia génica/introducción de genes. Las moléculas/partículas con un anticuerpo de la descripción se unirían específicamente a las células/tejidos que expresan el antígeno particular de interés y, por lo tanto, podrían tener un uso diagnóstico y terapéutico.
Muestras:
Como se usa en la presente descripción, el término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a cualquier material biológico obtenido de un sujeto o paciente. En un aspecto, una muestra puede comprender sangre, líquido cefalorraquídeo ("CSF") u orina. En otros aspectos, una muestra puede comprender sangre completa, plasma, células mononucleares enriquecidas a partir de sangre periférica (PBMC) tales como linfocitos (es decir linfocitos T, células NK o linfocitos B), monocitos, macrófagos, células dendríticas y basófilos; y células cultivadas (por ejemplo, linfocitos B de un sujeto). Una muestra también puede incluir una biopsia o muestra de tejido que incluye tejido tumoral. En aún otros aspectos, una muestra puede comprender células completas y/o un lisado de células. En una descripción, una muestra comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las muestras pueden recolectarse por métodos conocidos en la técnica.
Identificación de anticuerpos anti-IFN-a, aislamiento de los linfocitos B correspondientes y expresión recombinante de anticuerpos anti-IFN-a:
La identificación de linfocitos B específicos para los anticuerpos anti-IFN-a de la presente invención, como se enumeran en la Tabla 1, y como se muestra ilustrativamente para varios subtipos de lFN-a, y la clonación molecular de anticuerpos que presentan especificidad de interés, así como también su expresión recombinante y la caracterización funcional, puede realizarse generalmente como se describió en las solicitudes internacionales WO2013/098419 y WO2013/098420; véanse las secciones de Ejemplos en esos documentos, en particular los Ejemplos 1 y 2 en las páginas 118 a 120 del documento WO2013/098419 y los Ejemplos 1 a 4 en las páginas 27 a 31 del documento WO2013/098420.
Brevemente, en un ejemplo de la presente descripción, se cultivaron cultivos de linfocitos B únicos u oligoclonales y el sobrenadante del cultivo, que contiene anticuerpos producidos por dichos linfocitos B, se cribaron en busca de la presencia y afinidad de anticuerpos específicos para uno o más de los subtipos de IFN-a, como se describió en los Ejemplos. En otra descripción, los sueros de los pacientes se cribaron primero para detectar la presencia de autoanticuerpos contra los subtipos de IFN-a y luego se seleccionaron aquellos con un título alto para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica; véase el Ejemplo 2 en las páginas 118-120 del documento WO2013/098419. El proceso de cribado comprende el cribado de la unión a fragmentos, péptidos o derivados de los subtipos de IFN-a. Subsecuentemente, se aislaron el anticuerpo para el que se detectó la unión o la célula productora de dicho anticuerpo; véase el Ejemplo 3 en la página 120 del documento WO2013/098419. Por tanto, puede realizarse un cribado preliminar en un panel de donantes candidatos, mediante el uso de muestras que contienen células secretoras de anticuerpos (tales como sangre periférica total o suero). En particular, las células mononucleares pueden aislarse de tejidos sanguíneos o linfáticos mediante el uso de técnicas de separación estándar para aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC), tales como la centrifugación en gradiente. Después y/o antes de esta etapa de separación, las muestras de suero (o plasma), sobrenadantes de cultivo celular o células (obtenidas de diferentes pacientes, de diferentes tejidos y/o en diferentes momentos) pueden cribarse previamente mediante el uso de tecnologías estándar para detectar la presencia de anticuerpos y células secretoras de anticuerpos (por ejemplo ELISA, BIACORE, inmunotransferencia, FACS, SERPA, matrices de antígenos, neutralización de infecciones virales en un sistema de cultivo celular o ensayos ELISPOT). La literatura proporciona varios ejemplos de estas tecnologías que muestran, por ejemplo, el uso de ELISPOT para caracterizar la respuesta inmunitaria en donantes vacunados (Crotty y otros, Immunol Meth. 286 (2004), 111-122), el uso de micromatrices de antígenos como herramientas de diagnóstico para pacientes recién infectados (Mezzasoma y otros, Clin Chem. 48 (2002), 121-130, y otras tecnologías para medir las respuestas inmunitarias específicas de antígeno (Kern y otros, Trends Immunol. 26 (2005), 477-484).
Después de la identificación de los anticuerpos anti-IFN-a candidatos y los linfocitos B que los secretan, respectivamente, se obtiene la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo de interés, que comprende las etapas de preparar una célula B y obtener/secuenciar el ácido nucleico de la célula B que codifica el anticuerpo de interés e insertar además el ácido nucleico en, o usar el ácido nucleico para preparar, un huésped de expresión que pueda expresar el anticuerpo de interés, cultivar o subcultivar el huésped de expresión en condiciones en las que se exprese el anticuerpo de interés y, opcionalmente, purificar el anticuerpo de interés. No hace falta decir que el ácido nucleico puede manipularse en el medio para introducir sitios de restricción, cambiar el uso de codones y/o añadir u optimizar secuencias reguladoras de la transcripción y/o traducción. Estas técnicas son de última generación y puede realizarlas un experto en la técnica sin una carga indebida. Por ejemplo, la región constante de la cadena pesada puede cambiarse por la de un isotipo diferente o eliminarse por completo. Las regiones variables pueden unirse para codificar regiones Fv de cadena única. Pueden unirse múltiples regiones Fv para conferir capacidad de unión a más de una diana o pueden emplearse combinaciones quiméricas de cadena pesada y ligera. Una vez que el material genético está disponible, el diseño de análogos como se describió anteriormente, que retienen su capacidad de unirse a la diana deseada es sencillo. Los métodos para la clonación de regiones variables de anticuerpos y la generación de anticuerpos recombinantes se conocen por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en Gilliland y otros, Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke y otros, Leukemia 11 (1997), 1787-1792. Sin embargo, en un ejemplo preferido de la presente descripción, se obtienen linfocitos B y se expresa el anticuerpo correspondiente mediante los métodos descritos en la solicitud internacionalWO2013/098420, en particular en el Ejemplo 3, en las páginas 28-30 de ese documento.
Enfermedades y trastornos:
A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente en la presente descripción. El término "trastorno autoinmunitario", como se usa en la presente descripción, es una enfermedad o trastorno que surge y se dirige contra los propios tejidos u órganos de un individuo o una segregación simultánea o manifestación de los mismos, o la afección resultante de los mismos. Las enfermedades autoinmunitarias son causadas principalmente por la desregulación de las respuestas inmunitarias adaptativas y se forman autoanticuerpos o linfocitos T autorreactivos contra estructuras propias. Casi todas las enfermedades autoinmunitarias también tienen un componente inflamatorio. Las enfermedades autoinflamatorias son principalmente inflamatorias y algunas enfermedades autoinflamatorias clásicas son causadas por defectos genéticos en las vías inflamatorias innatas. En las enfermedades autoinflamatorias, no se encuentran linfocitos T autorreactivos ni autoanticuerpos. En muchos de estos trastornos autoinmunitarios y autoinflamatorios, pueden existir varios marcadores clínicos y de laboratorio, que incluyen, pero no se limitan a, hipergammaglobulinemia, altos niveles de autoanticuerpos, depósitos de complejos antígeno-anticuerpo en los tejidos, beneficio de los tratamientos con corticosteroides o inmunosupresores y agregados de células linfoides en los tejidos afectados. Sin limitarse a una teoría sobre el trastorno autoinmunitario mediado por linfocitos B, se cree que los linfocitos B demuestran un efecto patogénico en las enfermedades autoinmunitarias humanas a través de una multitud de vías mecánicas, que incluyen la producción de autoanticuerpos, la formación de inmunocomplejos, la activación de linfocitos T y células dendríticas, síntesis de citocinas, liberación directa de quimiocinas y provisión de un nido para la neolinfogénesis ectópica. Cada una de estas vías puede participar en diferentes grados en la patología de las enfermedades autoinmunitarias.
Como se usa en la presente descripción, un "trastorno autoinmunitario" puede ser una enfermedad específica de un órgano (es decir, la respuesta inmunitaria se dirige específicamente contra un sistema de órganos, tales como el sistema endocrino, el sistema hematopoyético, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinal y hepático, el sistema renal, la tiroides, los oídos, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistémica que puede afectar a múltiples sistemas de órganos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide, polimiositis, síndrome de poliendocrinopatía autoinmunitaria tipo 1 (APS1)/poliendocrinopatía autoinmunitaria con candidosis y distrofia ectodérmica (APECED ) etc. Dichas enfermedades preferidas incluyen trastornos reumatológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tal como el SLE y nefritis lúpica, polimiositis/dermatomiositis y artritis psoriásica), trastornos dermatológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, psoriasis, enfermedades del grupo de los pénfigos, enfermedades del penfigoide ampolloso y lupus eritematoso cutáneo), y trastornos endocrinos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la diabetes tales como la diabetes mellitus tipo 1 o dependiente de insulina (T1DM o IDDM), enfermedad tiroidea autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis)) y enfermedades que afectan a la generación de autoinmunidad tales como el síndrome de poliendocrinopatía autoinmunitaria tipo 1 (APS1)/poliendocrinopatía autoinmunitaria con candidosis y distrofia ectodérmica (APECED), miastenia gravis (MG/Timoma).
Las enfermedades preferidas incluyen, por ejemplo, SLE, AR, T1DM, EM, síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, tiroiditis y glomerulonefritis y APS1. Aún más preferidos son la AR, SLE y EM, y la más preferida es la SLE.
Marcadores y diagnósticos:
Los agentes marcadores pueden acoplarse directa o indirectamente a los anticuerpos o antígenos de la invención. Un ejemplo de acoplamiento indirecto es mediante el uso de una fracción espaciadora. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden comprender un dominio adicional, y dicho dominio se une mediante enlaces covalentes o no covalentes. El enlace puede basarse en la fusión genética de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica y descritos anteriormente o puede realizarse, por ejemplo, mediante entrecruzamiento químico como se describió, por ejemplo, en la solicitud internacional WO94/04686. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo de la invención puede unirse preferentemente mediante un conector flexible, ventajosamente un conector polipeptídico, en donde dicho conector polipeptídico comprende una pluralidad de aminoácidos hidrofílicos unidos por enlaces peptídicos de una longitud suficiente para atravesar la distancia entre el extremo C-terminal de dicho dominio adicional y el extremo N-terminal del anticuerpo de la invención o viceversa. El agente activo terapéutica o diagnósticamente puede acoplarse al anticuerpo de la invención o a un fragmento de unión a antígeno del mismo por varios medios. Esto incluye, por ejemplo, proteínas de fusión de cadena única que comprenden las regiones variables del anticuerpo de la invención acopladas mediante métodos covalentes, tales como enlaces peptídicos, al agente activo terapéutica o diagnósticamente. Ejemplos adicionales incluyen moléculas que comprenden al menos un fragmento de unión a antígeno acoplado a moléculas adicionales de forma covalente o no covalente, que incluyen las de la siguiente lista ilustrativa no limitante. Traunecker, Int. J. CancerSurp. SuDP 7 (1992), 51-52, describen el reactivo biespecífico janusina en donde la región Fv dirigida a CD3 se acopla a la CD4 soluble o a otros ligandos como OVCA e IL-7.
De manera similar, las regiones variables del anticuerpo de la invención pueden construirse en moléculas Fv y acoplarse a ligandos alternativos como los ilustrados en el artículo citado. Higgins, J. Infect. Disease 166 (1992), 198­ 202, describió un anticuerpo heteroconjugado compuesto por OKT3 entrecruzado con un anticuerpo dirigido a una secuencia específica en la región V3 de GP120. Dichos anticuerpos heteroconjugados también pueden construirse mediante el uso de al menos las regiones variables contenidas en el anticuerpo de los métodos de la invención. Ejemplos adicionales de anticuerpos específicos incluyen los descritos por Fanger, CancerTreat. Res. 68 (1993), 181­ 194 y por Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124. Los conjugados que son inmunotoxinas que incluyen anticuerpos convencionales se han descrito ampliamente en la técnica. Las toxinas pueden acoplarse a los anticuerpos mediante técnicas de acoplamiento convencionales o pueden producirse inmunotoxinas que contienen porciones de toxina proteica como proteínas de fusión. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse de una manera correspondiente para obtener dichas inmunotoxinas. Ilustrativos de dichas inmunotoxinas son los descritos por Byers, Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 y por Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
La proteína de fusión descrita anteriormente puede comprender además un conector escindible o un sitio de escisión para proteinasas. Estas fracciones espaciadoras, a su vez, pueden ser insolubles o solubles (Dienery otros, Science 231 (1986), 148) y puede seleccionarse para permitir la liberación del fármaco desde el antígeno en el sitio diana. Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden acoplarse a los anticuerpos y antígenos de la presente invención para la inmunoterapia son quimiocinas, moléculas asociadas a la migración celular, fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas. Los fármacos con los que se pueden conjugar los anticuerpos y antígenos de la presente invención dependen del contexto de la enfermedad en el que se pretenden usar las moléculas conjugadas. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para dianas útiles en el tratamiento de enfermedades tumorales se pueden conjugar con compuestos que se denominan clásicamente fármacos antineoplásicos tales como mitomicina C, daunorrubicina y vinblastina. En el uso de anticuerpos o antígenos conjugados con radiosótopos de la invención para, por ejemplo, la inmunoterapia tumoral, determinados isótopos pueden ser más preferibles que otros en dependencia de tales factores como la distribución de leucocitos, así como también la estabilidad y la emisión. En dependencia de la respuesta autoinmunitaria, algunos emisores pueden ser preferibles a otros. En general, en la inmunoterapia se prefieren los radioisótopos emisores de partículas a y p. Se prefieren los emisores a de alta energía y corto alcance, como 212Bi. Ejemplos de radioisótopos que pueden unirse a los anticuerpos o antígenos de la invención con fines terapéuticos son 125I, 1311, 90y , 67Cu, 212Bi, 212En, 211Pb, 47Sc, 109Pd y 188Re. Otros agentes terapéuticos que pueden acoplarse al anticuerpo o antígeno de la invención, así como también protocolos terapéuticos ex vivo e in vivo, se conocen, o pueden determinarse fácilmente, por los expertos en la técnica. Ejemplos no limitantes de radionucleidos adecuados para el marcaje son 198Au, 212Bi, 11C, 14C, 57Co, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 197Hg, 166Ho, 111In, 113m In, 123I, 125I, 127I, 131I, •min, i 77Lu, 15O, 13N, 32P, 33P, 203Pb, 186Re, 188Re, 105Rh, 97Ru, 35S, 153Sm y 99mTc. Otras moléculas adecuadas para el marcaje son un tinte fluorescente o luminiscente, una partícula magnética, un metal y una molécula que puede detectarse a través de una etapa enzimática o de unión secundaria, tales como una enzima o una etiqueta peptídica. Las sondas fluorescentes comerciales adecuadas para su uso como marcadores en la presente invención se enumeran en el Manual de Sondas fluorescentes y productos de investigación, 8a edición. Las partículas magnéticas adecuadas para su uso en ensayos basados en partículas magnéticas (MPA) pueden seleccionarse entre materiales paramagnéticos, diamagnéticos, ferromagnéticos, ferromagnéticos y superparamagnéticos.
Los métodos generales en bioquímica molecular y celular útiles para fines de diagnóstico pueden encontrarse en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3era Edición. (Sambrook y otros, Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4ta edición. (Ausubel y otros eds., John Wiley & Sons 1999); Métodos de proteínas (Bollag y otros, John Wiley & Sons 1996). Los reactivos, los medios de detección y los kits para fines de diagnóstico están disponibles de proveedores comerciales tales como Pharmacia Diagnostics, Amersham, BioRad, Stratagene, Invitrogen y Sigma-Aldrich, así como también de las fuentes proporcionadas en cualquiera de las referencias citadas en la presente descripción, en particular la literatura de patentes.
Tratamiento y fármacos:
Como se usa en la presente descripción, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren al tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, tal como el desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria y/o autoinflamatoria. Los resultados clínicos deseados o beneficiosos incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, diminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estable (es decir, no empeora), retraso o disminución de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (parcial o total), detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que tienen ya una afección o trastorno, así como también los que tienden a padecer la afección o trastorno o aquellos en los que se debe prevenir la manifestación de la afección o trastorno.
Si no se indica de cualquier otra manera, los términos "fármaco", "medicina" o "medicamento" se usan indistintamente en la presente descripción e incluyen, pero no se limitan a, todos (A) los artículos, medicinas y preparados para uso interno o externo, y cualquier sustancia o mezcla de sustancias que se pretenda usar para el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades del hombre o de otros animales; y (B) los artículos, medicinas y preparados (que no sean alimentos) que pretenden afectar la estructura o cualquier función del cuerpo del hombre o de otros animales; y (C) los artículos que se pretenden usar como componente de cualquier artículo especificado en las cláusulas (A) y (B). El término "fármaco", "medicina" o "medicamento" incluirá la fórmula completa del preparado que se pretende usar en el hombre o en otros animales que contiene uno o más "agentes", "compuestos", "sustancias" o "composiciones (productos químicos)" como y en algún otro contexto también otros excipientes farmacéuticamente inactivos como rellenos, desintegrantes, lubricantes, deslizantes, aglutinantes o que garanticen un fácil transporte, desintegración, desagregación, disolución y disponibilidad biológica del "fármaco", "medicina" o "medicamento" en una ubicación diana prevista dentro del cuerpo del hombre o de otros animales, por ejemplo, en la piel, en el estómago o en el intestino. Los términos "agente", "compuesto" o "sustancia" se usan indistintamente en la presente descripción e incluirán, en un contexto más particular, pero sin limitarse a todos los agentes farmacológicamente activos, es decir, agentes que inducen un efecto biológico o farmacológico deseado o se investigan o prueban para determinar la capacidad de inducir dicho posible efecto farmacológico mediante los métodos de la presente invención.
Ejemplos de "fármacos antirreumáticos" y fármacos inmunosupresores incluyen cloroquina, hidroxicloroquina, miocrisina, auranofm, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab (más metotrexato oral y subcutáneo), adalimumab, etc., azatioprina, D-penicilamina, sales de oro (oral), sales de oro (intramuscular), minociclina, ciclosporina que incluye la ciclosporina A y ciclosporina tópica, tacrolimus, micofenolato de mofetilo, ciclofosfamida, proteína estafilocócica A (Goodyear y Silverman, J. Exp. Med., 197 (2003), 125-39), y se incluyen las sales y derivados de los mismos, etc.
Los ejemplos de "fármacos antiinflamatorios no esteroideos" o "NSAID" incluyen aspirina, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno e ibuprofeno de liberación retardada, fenoprofeno, piroxicam, flurbiprofeno, naproxeno, ketoprofeno, naproxeno, tenoxicam, benorilato, diclofenaco, naproxeno, nabumetona, indometacina, ketoprofeno, ácido mefenámico, diclofenaco, fenbufeno, azapropazona, acemetacina, ácido tiaprofénico, indometacina, sulindac, tolmetin, fenilbutazona, diclofenaco y diclofenaco de liberación retardada, inhibidores de la ciclooxigenasa (COX)-2 como GR 253035, MK966, celecoxib (CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il), bencenosulfonamida y valdecoxib (BEXTRA®), y meloxicam (MOBIC®), e incluyen las sales y derivados de los mismos, etc. Preferentemente, son aspirina, naproxeno, ibuprofeno, indometacina o tolmetina. Dichos NSAID se usan opcionalmente con un analgésico como codenina, tramadol y/o dihidrocodinina o un narcótico como la morfina.
Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para quien se desea el diagnóstico, pronóstico, prevención o terapia.
Portadores farmacéuticos:
Los portadores farmacéuticamente aceptables y las vías de administración pueden tomarse de la bibliografía correspondiente conocida por el experto en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica; véase por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) por la Universidad de Ciencias de Filadelfia, Is Bn 0-683-306472, Vaccine Protocols. Segunda edición por Robinson y otros, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, Estados Unidos, 2003; Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. Segunda edición por Taylor y Francis. (2006), ISBN: 0-8493-1630-8. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos portadores pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse por diferentes vías. Los ejemplos incluyen administrar una composición que contiene un portador farmacéuticamente aceptable por vía oral, intranasal, rectal, tópica, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, subdérmica, transdérmica, intratecal e intracraneal. Las formulaciones en aerosol tales como las formulaciones nasales incluyen soluciones acuosas u otras soluciones purificadas del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Dichas formulaciones se ajustan preferentemente a un pH y un estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral, tales como moléculas de anticuerpos de dominio único (por ejemplo, "nanobodies™"), etc. también se prevé en la presente invención. Dichas formulaciones orales pueden ser en forma de tableta, cápsula, polvo, líquido o semisólido. Una tableta puede comprender un portador sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Las formulaciones para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio con un portador adecuado; véase también O'Hagan y otros, Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735. Puede encontrarse más orientación sobre las formulaciones que son adecuadas para varios tipos de administración en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) y las actualizaciones correspondientes. Para una breve revisión de los métodos de suministro de fármacos, véase Langer, Science 249 (1990), 1527-1533.
Régimen de dosificación:
El régimen de dosificación será determinado por el médico de cabecera y los factores clínicos. Como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para cada paciente dependen de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto en particular que se administrará, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y de otros fármacos que se administren simultáneamente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 |jg (o de ácido nucleico para la expresión o para la inhibición de la expresión en este intervalo); sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ilustrativo, especialmente teniendo en cuenta los factores antes mencionados. Generalmente, el régimen como una administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el intervalo de 1 jg a 10 mg unidades por día. Si el régimen es una infusión continua, también debe estar en el intervalo de 1 jg a 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. El progreso puede monitorearse mediante la evaluación periódica. Los preparados para la administración parenteral incluyen emulsiones, suspensiones o soluciones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen una solución salina y medios tamponados. Los portadores parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer y aceites no volátiles. Los portadores intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales tales como agentes antitumorales y fármacos citotóxicos, en dependencia del uso pretendido de la composición farmacéutica.
Además, puede ser deseable la administración conjunta o secuencial de otros agentes. Una dosis o cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del ingrediente activo suficiente para mejorar los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 % de la población) y DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de la dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, DL50/DE50.
Preferentemente, el agente terapéutico en la composición está presente en una cantidad suficiente para prevenir la inflamación o la supresión de la respuesta inmunitaria.
Puede consultarse la bibliografía adicional respecto a cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos a emplear de acuerdo con la presente invención, a partir de las bibliotecas y bases de datos públicas, mediante el uso por ejemplo de dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline", que está gestionada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica y/o la Biblioteca Nacional de Medicina de los Institutos Nacionales de Salud. El experto en la técnica conoce otras bases de datos y direcciones web, tales como las del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI), que forma parte del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL), y también se pueden obtener mediante el uso de motores de búsqueda en Internet. Una visión general de la información de patentes en biotecnología y una búsqueda de fuentes relevantes de información de patentes útiles para la investigación retrospectiva y para el conocimiento actual Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
La descripción anterior generalmente describe la presente invención. Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta descripción. Las citas bibliográficas completas se pueden encontrar al final de la descripción que precede inmediatamente a las reivindicaciones. Puede obtenerse un entendimiento más completo mediante la referencia a los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en la presente descripción solo con fines ilustrativos y que no pretenden limitar el alcance de la invención.
EJEMPLOS
Los ejemplos siguientes 1 a 9 y las figuras correspondientes 1 a 32 ilustran además la invención, pero no debe interpretarse que limitan el alcance de la invención de ningún modo. Pueden encontrarse descripciones detalladas de los métodos convencionales, tales como los empleados en la presente descripción, en la literatura citada; véase también 'The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Decimoséptima edición editada por Beers and Berkow (Merck & Co., Inc., 2003).
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de cualquier otra manera, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Los métodos de genética molecular e ingeniería genética se describen generalmente en las ediciones actuales de Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook y otros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames y Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames y Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney y Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller y Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3ra edición (Ausubel y otros, eds.); y Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller y Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Volúmenes 154 and 155 (Wu y otros, eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (Weir y Blackwell, eds., 1986). Los reactivos, los vectores de clonación y los kits para la manipulación genética referidos en esta descripción están disponibles en proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech. Las técnicas generales en cultivo celular y recolección de medios se describen en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu y otros, Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); and Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch y otros, Bioprocess Technol. 19 (1990), 251.
Materiales y métodos
La selección de pacientes, el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con APECED/APS1, el cultivo de linfocitos B de memoria y el aislamiento de anticuerpos se llevaron a cabo como se describe en las solicitudes internacionales WO2013/098419 y WO2013/098420 con la diferencia de que la especificidad de los anticuerpos aislados y analizados se dirigió hacia los subtipos de IFNA como se define anteriormente y más abajo en la presente descripción, en lugar de IL-17 e IL-22, que se usaron específicamente en las solicitudes PCT mencionadas; véanse las secciones de Ejemplos en ese documento, en particular los Ejemplos 1 y 2 en las páginas 117 a 120 y el Ejemplo 17 en las páginas 168-171 del documento WO2013/098419 y Ejemplos 1 a 4 en las páginas 27 a 31 del documento WO2013/098420.
La clonación molecular de anticuerpos humanos de la presente invención y la subsecuente producción y purificación de anticuerpos se realizaron como se describe en la solicitud internacional. WO2013/098419, véase la sección de Ejemplos de la solicitud y en particular los Ejemplos 1 a 3 en las páginas 117-120 de ese documento. El análisis de mutación del gen AIRE se realizó como se describió en la solicitud internacional WO2013/098419; véanse los Ejemplos en ese documento, en particular la sección "Análisis de mutación del gen AIRE" en Materiales y Métodos de los Ejemplos, en las páginas 115-116, con las etapas particulares realizadas como se describe en el documento WO99/15559. En este sentido, el genotipado de las respectivas mutaciones en el gen AIRE (APECED) se realiza como se describió en la solicitud internacional WO99/15559 en el Ejemplo 2 en las páginas 12 a 13; una confirmación de las mutaciones en los exones 2 y 6 del gen AIRE como se describió en el ejemplo 3 de la solicitud internacional WO99/15559 en la página 13, línea 5 que se enlaza con la página 14, línea 13. En particular, para el análisis de mutaciones se purifican muestras de ADN a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con APECED y de sospechosos portadores de APECED y de controles sanos normales (de acuerdo con Sambrook y otros 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSH Press) y se someten a PCR mediante el uso de cebadores específicos para todos los exones identificados.
Ejemplo 1: Detección de anticuerpos específicos de citocinas en el suero de pacientes
La presencia general de varias citocinas y anticuerpos específicos de la enfermedad en los sueros de los pacientes que padecen de la afección genética APECED (poliendocrinopatía autoinmunitaria con candidosis y displasia epidérmica, también llamada poliendocrinopatía autoinmunitaria de tipo 1 (APS1)) se ha determinado mediante análisis ProtoArray como se describe en el Ejemplo 7 en la página 128 y se indica en las Tablas 1 y 2 en las páginas 128-130 de la solicitud internacional del solicitante WO2013/098419. En conjunto, se usaron en los ensayos sueros de 23 pacientes, presentados por códigos desde APS1-1 a APS1-23. Se obtuvieron ocho sueros de control de personal de laboratorio sano, de la misma edad que los pacientes y codificados como C1-C8. Véase la Figura 4 que indica la presencia de anticuerpos específicos de subtipo de IFNA y específicos de ADNdc en los 23 pacientes examinados. Además de las serorreactividades que se muestran en la Figura 4, los pacientes APS1-9 y APS1-2 han mostrado serorreactividad hacia IFNA1/13, IFNA5, IFNA6, IFNA10, IFNA14, IFNA16 e IFNA21.
Los anticuerpos anti-ADNdc son altamente específicos para el SLE y se usan en el diagnóstico de la enfermedad. Sorprendentemente, ningún paciente con APS1 tiene lupus a pesar de la frecuente presencia de anticuerpos anti-ADNdc. Sin embargo, los pacientes con APS1 muestran una serorreactividad pronunciada contra varios subtipos de interferón-a que son dianas farmacológicas clínicamente relevantes implicadas en muchos mecanismos moleculares relacionados con el lupus, lo que implica la posible idoneidad de estos anticuerpos en el tratamiento del SLE.
ELISA - IFN-a
Se recubrieron microplacas de 96 pocillos (Costar, Estados Unidos) con IFNA1, IFNA2 (ImmunoTools), IFNA4 (SinoBiological), IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA21 (todas de PBL) e IFNA14 (ATGen) o IFNA8 (Novus Biologicals) humanos. Las placas se lavaron con PBS-T y se bloquearon 1 h a temperatura ambiente con PBS que contenía 2 % de BSA (Sigma, Buchs, Suiza). Los sueros de los pacientes, el medio acondicionado de linfocitos B o los preparados de anticuerpos recombinantes se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. La unión de la IgG humana al antígeno de interés se determinó mediante el uso de un anticuerpo específico anti-Fc-gamma humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, Europe Ltd., Cambridgeshire, Reino Unido), seguido de la medición de la actividad de HRP mediante el uso de una solución de sustrato TMB (TMB, Sigma, Buchs, Suiza). La unión a la fusión Fc humana del IFNA2, IFNA4, IFNA14 (SinoBiological) de ratón se detectó con un anticuerpo específico anti-F(ab')2 conjugado con peroxidasa de rábano picante (véase la Fig. 19A).
Ejemplo 2: Determinación de la CE50 mediante ELISA de los anticuerpos de la presente invención
La unión CE50 de los ACMh de la presente invención a IFNA2 (ImmunoTools), IFNA4 (SinoBiological), IFNA14 (ATGen) se determinó mediante ELISA (véase también la Tabla 3 a continuación para detalles con respecto a las proteínas recombinantes usadas). Se incubaron diluciones en serie de los ACM (desde 1000 ng/ml hasta 0,0169 ng/ml) durante 2 horas con placas recubiertas de antígeno (recubrimiento durante toda la noche a 1 pg/ml en PBS, seguido de lavado y bloqueo con BSA al 2 % en PBS).). Las placas se lavaron subsecuentemente y se detectó la unión de los ACM con un anticuerpo secundario conjugado con HRP antihumano. Las concentraciones del ACM que resultaron en la mitad de la unión máxima a los antígenos respectivos (CE50, ng/ml) se calculó mediante el uso del software Prism 4 GraphPad en curvas de respuesta a dosis sigmoideas (pendiente variable, 4 parámetros) obtenidas al graficar el logaritmo de la concentración contra las mediciones de DO 450 nm; véase la Figura 3 y la Tabla 4 más abajo.
Figure imgf000060_0001
Tabla 4: Resumen de los valores de CI50 de neutralización de los anticuerpos anti-IFN-a ilustrativos 19D11, 26B9, 8H1, 12H5 de la presente invención y del anticuerpo ilustrativo 50E11 tal como se obtiene en el ensayo indicador dual de luciferasa ISRE.
Figure imgf000060_0002
Los ensayos previos de CE50 de unión frente a CI50 de neutralización realizados de acuerdo con la presente invención, de los anticuerpos anti-IFN-a ilustrativos, mediante el uso de proteínas IFNA obtenidas de proveedores comerciales como se indica en la Tabla 3 y proteínas IFNA gIFNA2/-4 y -14 generadas de acuerdo con la presente invención, dieron resultados similares.
Además, la unión de los ACM 19D11, 25C3, 26B9, 5D1 y 13B11 ilustrativos de la presente invención al IFNA1 (ImmunoTools) se comparó con la unión de estos anticuerpos al IFNA2 (ImmunoTools) mediante ELISA. En este experimento, los ACM examinados (300 ng/ml) se incubaron durante 2 horas con placas recubiertas de antígeno (recubrimiento durante toda la noche a 1 pg/ml en PBS, seguido de lavado y bloqueo con BSA al 2 % en PBS). Las placas se lavaron subsecuentemente y se detectó la unión de los ACM con un anticuerpo secundario conjugado con HRP antihumano. Los ACM ilustrativos 19D11, 25C3, 26B9 y 13B11 han mostrado una afinidad de unión comparable a IFNA1 e IFNA2 (véase la Figura 11A). Sin embargo, el ACM anti-IFN-a 5D1 ilustrativo se une al IFNA2 y no reacciona de forma cruzada con el IFNA1 (véase la Figura 11A). En un experimento adicional, se comparó mediante LIPS la unión de los ACM ilustrativos 19D11, 25C3, 26B9, 5D1 y 13B11 de la presente invención al IFNA8, con respecto a la unión de estos anticuerpos a IFNA14 (ambas proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia). En la presente descripción, el ACM 13B11 ilustrativo no mostró reactividad cruzada con el IFNA8. Los otros anticuerpos ilustrativos 19D11, 25C3, 26B9 y 5D1 han mostrado una unión más fuerte del INFA8 que del IFNA14 (véase la Figura 11B). En un experimento adicional, se determinó y comparó la unión de los ACM ilustrativos 5D1, 13B11 19D11, 25C3, 26B9 y 31B4 de la presente invención a IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNA21 (todos de PBL) e IFNA14 (ATGen). El anticuerpo anti-IFNA-a ilustrativo 13B1 no reaccionó de forma cruzada con el IFNA8 e IFNA21 y el anticuerpo 19D11 reaccionó de forma cruzada con una menor afinidad con el IFNA21 que con los otros subtipos de IFNA (véase la Figura 11C).
Ejemplo 3: Ensayos de neutralización
Los ensayos de neutralización se llevan a cabo en líneas celulares que responden a la citocina estudiada, es decir que tienen el receptor necesario. La unión del ligando al receptor activa una vía de señalización correspondiente, la translocación de los factores de transcripción al núcleo y regula positivamente la transcripción, la traducción y, si corresponde, la secreción del producto del gen respondedor. La concentración de citocinas usada se selecciona desde el comienzo de la parte lineal de la curva dosis-respuesta para maximizar la sensibilidad del ensayo. Para probar la capacidad neutralizante de los anticuerpos, la concentración óptima de la citocina diana se incuba previamente con diluciones en serie de suero, sobrenadante o muestras de anticuerpos purificados. Los resultados se expresan como título o concentración de anticuerpos que muestran el valor medio entre los controles positivo y negativo.
Ensayo Phospho-STATI
Se sembraron 30000 células HEK 293T o HEK 293T MSR en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-L-lisina (BD Biocoat, Bedford, MA, Estados Unidos) o en placas regulares de 96 pocillos tratadas para el cultivo de tejidos (Núm. catálogo 3598, Corning Inc., Corning, NY, Estados Unidos), respectivamente. Al día siguiente, los rhIFNA o sobrenadantes de células HEK 293T que expresan transitoriamente proteínas de fusión IFN-luciferasa Gaussia (g1 IFN) se mezclaron con AcM anti-IFNA o IgG de control (5 |jg/ml) y se incubaron previamente durante una hora a 37 °C. Después de la incubación previa, las mezclas se usaron para estimular las células HEK 293T o HEK 293T MSR durante 10 min a 37 °C. Después de la estimulación, las células se lisaron con tampón de lisis CelLytic™ M complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (Núm. catálogo C2978, P5726, P0044, P8340, SIGMA-ALDRICH, St. Louis, MO, Estados Unidos) y los lisados recolectados se aclararon a 13 000 RPM, a 4 °C en una centrífuga de mesa. Los lisados se sometieron a una SDS-PAGE reductora y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con un tampón que contenía gelatina bovina al 0,25 %, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, Triton X-100 al 0,05 % durante una hora a temperatura ambiente, seguido de incubación con anticuerpos monoclonales de conejo contra la proteína STAT1 fosforilada (Tyr701, diluido 1:1000 en tampón de bloqueo, núm. catálogo 9167, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, Estados Unidos) a 4 °C durante toda a noche. Al día siguiente, las transferencias se lavaron tres veces con tampón de bloqueo seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante contra IgG de conejo (diluidos 1:20 000 en tampón de bloqueo, núm. catálogo 111-035-144, Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pensilvania, Estados Unidos). Después de tres etapas de lavado adicionales, se añadió un sustrato de ECL (núm. catálogo 34087, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Estados Unidos) y las bandas reactivas se visualizaron mediante autorradiografía. Los anticuerpos unidos se eliminaron mediante incubación en Tampón de lavado de inmunotransferencia Restore (núm. catálogo 21059, Thermo Fisher Scientific) y se usó un suero anti-STAT1 policlonal de conejo para visualizar los niveles totales de STAT1 (diluido 1:1000 en tampón de bloqueo, núm. catálogo 9172, Cell Signaling Technology).
A continuación, se analizan los resultados de dos ensayos Phospho-STAT1 realizados con anticuerpos específicos anti-IFN-a ilustrativos 5D1, 19D11, 25C3, 26B9, 31B4 y 13B11. Como puede verse en las Figura 5B y 5C, la adición de anticuerpos específicos anti-IFN-a ilustrativos 19D11, 25C3, 26B9, 31B4 y 13B11 impide la fosforilación de STAT1 dependiente de IFNA2, IFNA4 e IFNA14, lo que indica la capacidad neutralizante de IFN-a de los anticuerpos de la presente invención. Además, los anticuerpos específicos anti-IFN-a ilustrativos 19D11, 26B9 y 31B4 también impiden la fosforilación de STAT1 dependiente de IFNA1, g1 IFNA5 e IFNA6, con la capacidad de neutralización del anticuerpo 26B9 ligeramente reducida contra IFNA5. El anticuerpo 25C3 mostró una capacidad de neutralización ligeramente más débil con respecto a la actividad del IFNA6 e IFNA14 en comparación con su capacidad de neutralización hacia el IFNA2 e IFNA4. La adición del anticuerpo específico anti-IFN-a 5D1 ilustrativo de la presente invención mostró la actividad neutralizante de este anticuerpo contra IFNA2 e IFNA4, en donde pudo observarse una neutralización nula o muy débil con respecto a la fosforilación de STAT1 dependiente de IFNA14 (Figura 5C, panel derecho) y una neutralización ligeramente más débil de IFNA6.
Después de la estimulación con IFNA1b o IFNA16, los anticuerpos ilustrativos 19D11,25C3, 26B9, 31B4 y 13B11 han mostrado capacidad de neutralización hacia la actividad del IFNA1b (IFNA1/13), en donde no pudo observarse neutralización con respecto al anticuerpo 5D1 (Figura 5B). Con respecto al IFNA16, solo los anticuerpos 19D11, 5D1 y 13B11 han mostrado capacidad de neutralización, en donde los anticuerpos ilustrativos 25C3, 26B9 y 31B4 indicaron al menos una reducción severa o incluso una falta de capacidad de neutralización hacia IFNA16 (Figura 5C). El anticuerpo ilustrativo 13B11 neutralizó potentemente al IFNA1, IFNA2, IFNA4 y g1 IFNA5, mientras que pudo observarse una neutralización muy débil con respecto a la fosforilación de STAT1 dependiente de IFNA6. La concentración de rhIFNA usada fue: 10 ng/ml (IFNA1b), 2 ng/ml (IFNA2, IFNA4, IFNA6, IFNA16). El sobrenadante g1 IFNA5 se usó en su dilución CE80.
Mientras que todos los anticuerpos ilustrativos, excepto 13B11, neutralizaron al IFNA21 en este ensayo funcional (Figura 5D), los anticuerpos ilustrativos 25C3 y 13B11 no neutralizaron al IFNA6 (Figura 5B). La concentración de los Ac M fue de 5 pg/ml, y la del rhIFNA (PBL) a 2 ng/ml.
Todos los anticuerpos neutralizaban al IFNA5 (g1IFNA5) (Figura 5B). Los anticuerpos 25C3 y 13B11 no neutralizaron al IFNA8 (g1IFNA8). Ninguno de los anticuerpos anti-IFN-a ilustrativos de la presente invención neutralizó al IFN-y (IFN-gamma/IFNG) (Figura 5D). Aparte de la descripción experimental general anterior, aquí las células HEK293T se dejaron sin tratar (-) o se estimularon con sobrenadantes de células HEK 293T que expresan transitoriamente proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia humanas (+) en ausencia de anticuerpos o en presencia de 5 pg/ml de ACM humanos ilustrativos derivados de humanos o una IgG de control humana (hulgG) como se indica en la Figura 5D.
En una segunda ronda experimental, se probaron subtipos adicionales de IFNA. Los resultados de estas dos rondas experimentales se han combinado en la Figura 5. Después de la estimulación con IFNA7, g1 IFNA8, IFNA10, IFNA14 o IFNA16, el anticuerpo ilustrativo 19D11 ha mostrado capacidad de neutralización hacia todos los IFN probados, en donde los anticuerpos ilustrativos 26B9 y 31B4 no pudieron neutralizar al IFNA16 (Figura 5C). El anticuerpo ilustrativo 25C3 neutralizó completamente al IFNA7, pero mostró una neutralización más débil del g1 lFNA8, IFNA10, IFNA14 e IFNA16. El anticuerpo ilustrativo 5D1 neutralizó al IFNA7, g1 IFNA8, IFNA10 e IFNA16, pero no neutralizó al IFNA14. El anticuerpo ilustrativo 13B11 mostró neutralización del IFNA7, IFNA10, IFNA14 e IFNA16, pero no neutralización del g1 IFNA8. La concentración de rhIFNA usada fue de 2 ng/ml (IFNA7, IFNA10, IFNA14, IFNAl6). El sobrenadante del g1 IFNA8 se usó en su dilución CE80.
Todos los anticuerpos ilustrativos neutralizaron al IFNA17 en este ensayo funcional (Figura 5D). Todos los anticuerpos ilustrativos, excepto 13B11, neutralizaron al IFNA21. Solo dos anticuerpos ilustrativos, 26B9 y 31B4, neutralizaron al IFNW en este ensayo funcional, mientras que ninguno de los anticuerpos ilustrativos neutralizó al IFNB o al g1 IFNG. La concentración del rhIFNA fue de 2 ng/ml, el sobrenadante del g1 iFNG se usó en su dilución CE80.
Ensayo indicador ISRE-Luciferasa
Se sembraron 20 000 células HEK 293T o 10 000 HEK 293T MSR en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-L-lisina (BD Biocoat) (en placas de 96 pocillos de media área blancas (núm. catálogo 3688, Corning Inc.) - los valores entre paréntesis indican las diferencias en la segunda opción experimental con células HEK 293 T MSR), y se transfectaron inversamente con 100 ng (50 ng) de construcciones previamente mezcladas del indicador ISRE-luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla (núm. catálogo CCS-008L, Qiagen, Hilden, Alemania) (véase el esquema de las construcciones en la Figura 6A) mediante el uso de Fugene HD de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI, Estados Unidos). La construcción que expresa la luciferasa de Renilla sirvió como control de normalización interno. Las células se incubaron durante toda la noche en Medio de suero reducido Opti-MEM® I complementado con 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, suero bovino fetal al 10 % (0,5 %) (Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) a 37 °C, CO2 al 5 % en una atmósfera húmeda. Después de la incubación durante toda la noche, las células se estimularon durante 24 horas con medio que contenía mezclas de rhIFNA, con o sin AcM anti-IFNA, o IgG de control que se habían incubado previamente durante una hora a 37 °C. Después de 24 horas de estimulación, se realizaron ensayos de indicador dual de luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega).
Como puede verse en la Figura 7, la adición de anticuerpos específicos anti-IFN-a ilustrativos 19D11, 25C3, 26B9, 31B4 (Figura 7A y B) y 13B11 (Figura 7C y D) impide la activación del indicador ISRE-Luciferasa dependiente de IFNA2, IFNA4 e IFNA14, lo que indica la capacidad neutralizante de IFN-a de los anticuerpos de la presente invención. La adición del anticuerpo ilustrativo específico anti-IFN-a 5D1 de la presente invención mostró actividad neutralizante de este anticuerpo contra el IFNA2 e IFNA4, en donde pudo observarse una neutralización nula o muy débil con respecto a la activación de ISRE-Luciferasa dependiente del IFNA14 (Figura 7C y D). Como ya se vio en el ensayo Phospho-STAT1, el anticuerpo 25C3 mostró una capacidad de neutralización ligeramente más débil con respecto a la actividad del IFNA14 en comparación con su capacidad neutralizante con respecto al IFNA2 e IFNA4. De manera similar, el anticuerpo ilustrativo específico anti-IFN-a 13B11 ha mostrado una capacidad de neutralización ligeramente más débil hacia el IFNA14 (Figura 7C y D). El anticuerpo ilustrativo 8H1 neutraliza al IFNW, junto con el IFNA1, A4, A5, A6, A7, A10, A16, A17 y A21, mientras que muestra una neutralización más débil del IFNa 2, A8 y A14 (Figura 7E). El anticuerpo ilustrativo 12H5 inhibe fuertemente la inducción del indicador ISRE-Luciferasa por todos los interferones alfa, específicamente, el IFNA1, A2, A4, A5, A6, A7, A8, A10, A14, A16, A17 y A21, mientras que prácticamente no afecta la inducción del indicador mediada por el IFNW. Ni el anticuerpo ilustrativo 8H1 ni el 12H5 interfieren con la inducción del indicador mediada por el IFNB (Figura 7E).
Como se muestra en la Figura 8, el anticuerpo ilustrativo 26B9 neutraliza potentemente al rhIFNAl, A2, A4, A5, A6, A8, A10, A14, A17, A21 y rhIFNW, mientras que neutraliza débilmente al rhIFNA16. La concentración del rhIFN fue de 10 ng/ml (IFNA1), 1,3 ng/ml (IFNA16) y 2 ng/ml (todos los demás rhIFN). En la Tabla 4 se muestra un resumen de los valores de CI50 determinados en el ensayo indicador de ISRE-Luciferasa.
Como puede verse en la Figura 9, el anticuerpo ilustrativo 19D11 neutraliza todas las moléculas de rhIFNA, específicamente, IFNA1, A2, A4, A5, A6, A7, A8, A10, A14, A16, A17 y A21. La concentración del rhIFN fue de 10 ng/ml (IFNA1), 1,3 ng/ml (IFNA16) y 2 ng/ml (todos los demás rhIFN). En la Tabla 4 se muestra un resumen de los valores de CI50 determinados en el ensayo indicador de ISRE-Luciferasa.
Ensayo de unión celular quimioluminiscente
Se sembraron 30 000 células HEK 293T MSR en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos de media área blancas (núm. catálogo 3688, Corning Inc.). Al día siguiente, los sobrenadantes de células HEK 293T que expresan transitoriamente proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia humanas se mezclaron con AcM anti-IFN, IgG de control o concentraciones en exceso de IFNA2 recombinante sin marcar y se incubaron previamente durante una hora a 37 °C. Después de la incubación previa, las mezclas se usaron para estimular las células HEK 293T MSR durante 40 minutos a 37 °C. Tras la unión, las células se lavaron tres veces con PBS y se desarrolló el ensayo de luciferasa de Gaussia mediante el uso del kit Gaussia Flash Assay de acuerdo con las instrucciones del fabricante (núm. catálogo 16159, Thermo Fisher Scientific).
Como se muestra en la Figura 10C, el anticuerpo ilustrativo 19D11 neutraliza eficientemente la unión del g1 IFNA2, A4, A5, A6, A7, A8, A10, A14, A16, A17 y A21 a células HEK 293T MSR que expresan endógenamente receptores de IFN. Por el contrario, el anticuerpo ilustrativo 19D11 prácticamente no interfiere con la unión del g1 IFNB y g1 IFNW. La unión de todos los IFN g1 mostrados en la presente descripción aparentemente no se ve afectada por un anticuerpo humano de control (huIgG). Concentración de anticuerpo: 5 pg/ml.
Como puede verse en la Figura 10D, la unión del g1 IFNA16 a células HEK 293T MSR se neutraliza más eficientemente mediante el anticuerpo ilustrativo 19D11 en comparación con el anticuerpo ilustrativo 26B9. Sin embargo, el anticuerpo ilustrativo 26B9 neutraliza fuertemente la unión del g1 IFNW a las células HEK 293T MSR, mientras que el anticuerpo ilustrativo 19D11 no muestra una capacidad de neutralización aparente hacia este ligando. La unión del g1 IFNA16 y g1 IFNW no se ve afectada por un anticuerpo humano de control (huIgG). Concentración de anticuerpo: 10 pg/ml.
Ejemplo 4: Validación de los anticuerpos en cuestión
Los anticuerpos proporcionados por la presente invención se prueban en relación con su actividad neutralizante frente al IFN-a humano en modelos animales de enfermedad. Al realizar dichos experimentos, debe garantizarse que los subtipos de IFN-a humano induzcan fenotipos enfermos en ratones y que no ocurra una reacción cruzada entre los anticuerpos de IFN-a probados de la presente invención y los homólogos de IFN-a murino. Dado que no se disponía de un sistema modelo adecuado para el IFN-alfa en la técnica anterior, el presente Ejemplo describe y proporciona dicho sistema para probar anticuerpos neutralizantes de IFN-alfa que no reaccionan de forma cruzada con los IFN de ratón. En primer lugar, se probó in vivo el efecto de diferentes subtipos de IFN-a en cuanto a la inducción de la inflamación de la oreja. En particular, se ha probado la actividad proinflamatoria de los subtipos humanos IFNA2a, IFNA2b, IFNA4 e IFNA14. El IFNA2a difiere del IFNA2b por el aminoácido 23 (Lys en el IFNA2a y Arg en el IFNA2b)
Ensayo de inflamación de la oreja
Se indujo el fenotipo de inflamación de la oreja en ratones C57BL/6J (de tipo salvaje; de Charles River) de 8 semanas de edad mediante inyección intradérmica de IFNA2a, IFNA2b, IFNA4 e IFNA14 humanos en 20 pl de PBS, o control de PBS en cada oreja, administrada en días alternos el día 0, Día 2 y Día 4 (20 pl/oreja, 500 ng/oreja, 1 pg total/ratón/día) mediante el uso de una aguja de calibre 30. Los ratones se sacrificaron el día 6; véase la Tabla 5 más abajo y la Figura 14A para ver el cronograma experimental.
Tabla 5: Asignación de grupos de animales a las diferentes citocinas probadas. n - número de animales en el grupo, ng/20pl - cantidad de citocina inyectada por oreja.
Figure imgf000063_0001
Para probar el efecto proinflamatorio de los subtipos de IFNA inyectados, se tomaron medidas del grosor de la oreja de los animales con un micrómetro digital Mitutoyo durante la administración de citocinas en 2 mediciones por oreja antes de la inyección de citocinas en el día 0 y en días alternos en el día 1, día 3, Día 5 (indicado por la letra M en la Figura 14A) y, alternativamente o, además, en el Día 6 después del sacrificio del animal.
Además, se monitoreó el peso corporal durante el tratamiento, para observar posibles cambios de peso debido a la inducción de la inflamación o a su respectiva reducción debido al tratamiento aplicado. Además, después del sacrificio de los animales se realizan tinciones histológicas con H&E de las orejas ((hematoxilina y eosina; véase Harris, HF, J. Appl. Microscopy III (1900), 777-781 y Mallory, FB: Pathological technique. Filadelfia, Saunders, 1938).
Los cuatro subtipos de IFNA humanos probados pudieron inducir significativamente la hinchazón de las orejas después de la inyección de citocinas; véanse las Figuras 14-16 y los resultados del experimento resumidos en la tabla de la Figura 17. Todas las orejas eran notablemente más gruesas que las orejas tratadas con PBS, esto fue significativo en todos los grupos después de la segunda inyección intradérmica, desde el Día 3 hasta el final del experimento. El IFNA14 fue el más potente, especialmente en el día 5 de este experimento. El IFNA2a y el IFNA4 indujeron niveles similares de engrosamiento de la oreja. El IFNA2b fue el más similar a la hinchazón inducida por el IFNA4 y el IFNA14. El IFNA2b indujo la hinchazón más que la isoforma IFNA2a en este experimento; véanse las Figuras 14-16 y el resumen de los resultados experimentales en la tabla de la Figura 17.
Los resultados de este experimento muestran la aplicabilidad del ensayo de inflamación de la oreja para las pruebas de aplicabilidad terapéutica de los anticuerpos de la presente invención. Dado que los anticuerpos ilustrativos anti-IFN-a 19D11, 26B9, 31B4, 5D1 y 13B11 de la presente invención no mostraron ninguna reacción cruzada aparente con al menos los subtipos 2, 4 y 14 de IFN-a murino (véase la Figura 19A), se probaron en el ensayo indicado anteriormente con respecto a sus propiedades de neutralización hacia el IFN-a humano usado para la inducción de la inflamación. La afinidad de unión aparente del anticuerpo anti-IFN-a ilustrativo 25C3 hacia el INFA2 murino y la afinidad de los anticuerpos anti-IFN-a ilustrativos 5D1 y 19D11 hacia el IFNA1 murino se tienen en cuenta al diseñar los experimentos de neutralización de CytoEar in vivo descritos en la presente descripción.
Dichas pruebas de tratamiento se realizan con los anticuerpos ilustrativos anti-IFN-a de la presente invención mediante la inyección de los anticuerpos en diferentes momentos durante el cronograma experimental preparado anteriormente (véase también la Figura 14a ) para probar la inducción de inflamación por el IFN-a humano. Por ejemplo, para probar el efecto preventivo y/o terapéutico, uno o más de los anticuerpos ilustrativos de la presente invención se inyectan junto con, o por separado de, el subtipo o subtipos de IFNA en el día 0 del experimento. Además, o alternativamente, uno o más de los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de unión a IFN-a de los mismos, se inyectan en días alternos con el subtipo o subtipos de IFNA. Por ejemplo, si el subtipo o subtipos de IFNA se inyectan como se indicó anteriormente en los Días 0, 2 y 4 (flechas cortas en la Figura 14a ), los anticuerpos se inyectan en los Días alternos 1, 3 y/o 5 (flechas largas en la Figura 14A).
El potencial de neutralización de los anticuerpos de la presente invención o de los fragmentos de unión a IFN-a de los mismos para reducir el fenotipo de inflamación de la oreja inducido y/o para prevenir dicha inducción, se examina mediante la comparación de la hinchazón de la oreja (grosor) observada en animales que reciben el tratamiento con el anticuerpo anti-IFN-a y los grupos de control que reciben PBS o IgG humanas de una especificidad de unión dirigida hacia otras moléculas distintas de los subtipos de IFNA humanos (sin especificidad de unión relacionada con el IFN-a).
Además, o alternativamente, se monitoreó el peso corporal durante el tratamiento, para observar posibles cambios de peso debido a la inducción de la inflamación o su respectiva reducción debido al tratamiento aplicado. Además, después del sacrificio de los animales se realizan tinciones histológicas con H&E de las orejas (hematoxilina y eosina; véase supra). Este ensayo se usa preferentemente como modelo sustituto de la psoriasis.
En una segunda ronda experimental, el ensayo indicado anteriormente se ha usado con algunas modificaciones para probar las propiedades de neutralización de los anticuerpos ilustrativos 26B9 y 19D11 de la presente invención hacia la inflamación inducida en las orejas de ratones mediante inyecciones del IFNA14 (Figura 28), IFNA5 (Figura 29) e IFNW (Figura 30) humano. Como puede verse en los esquemas de tiempo mostrados en las Figuras 28A, 29A y 30A, el cronograma experimental se ha prolongado aquí a 10 días, con los anticuerpos probados y los controles inyectados en el día experimental 0 (IP), inyecciones intradérmicas de citocinas en los días 1, 3, 6 y 8 y un sacrificio de los animales de prueba en día 10. Las asignaciones de grupos de animales a las diferentes citocinas probadas y las concentraciones y cantidades respectivas de las citocinas, los anticuerpos probados respectivos se indican en las tablas en los paneles B de las figuras respectivas. Ambos anticuerpos, 26B9 y 19D11, han mostrado un potencial preventivo y/o terapéutico pronunciado debido a una reducción significativa del grosor de la oreja en varios días experimentales después de la inflamación de la oreja inducida por el IFNA14 (Figuras 28 D y E) y el IFNA5 (Figuras 29 D y E), en comparación con los controles de IgG. El tratamiento con el anticuerpo específico de IFN-a de referencia (Ref. A en las Figuras 28, 29, en particular las Figuras 28F y 29F) también condujo a una reducción significativa de la hinchazón de la oreja después del tratamiento con IFNA14 en varios días experimentales, sin embargo con una reducción ligeramente más baja en el día 10 en comparación con los anticuerpos 26B9 y 19D11 de la presente invención (compárense las curvas F para el 26B9 en la Figura 28D y G para el 19D11 en la Figura 28E con la curva H para el Ref.A en la Figura 28F y con la curva E en cada Figura para la IgG de control). Además, el anticuerpo ilustrativo 26B9 ha mostrado una reducción significativa de la hinchazón de la oreja inducida por el IFNW en el día experimental 9 (Figura 30D), en donde las inyecciones del anticuerpo 19D11 y Ref.A no mostraron ninguna reducción significativa de la hinchazón de la oreja en comparación con el tratamiento con la IgG inespecífica. En consecuencia, los anticuerpos proporcionados con la presente invención tienen un alto potencial para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con actividad potenciada del FN Ay/o IFNW.
Ensayo CytoAnkle:
En este ensayo, las cohortes de ratones (c57/b16, 7-8 semanas) se inyectan intraarticularmente (IA) con 62,5-1000 ng de citocina, por ejemplo, al menos un subtipo de IFNA como el IFNA2a, IFNA2b, IFNA4 o IFNA14 o mezclas de varios subtipos de IFNA en 10 ul de PBS (o control de PBS) en los tobillos cada 48-72 horas. Las mediciones del grosor axial del tobillo se toman con un micrómetro digital Mitutoyo. Los animales se pesan cada día y se administra el subtipo o subtipos respectivos de IFNA mientras los ratones se anestesian con isofluorano. El marco de tiempo experimental está diseñado como se indicó anteriormente para el ensayo de inflamación de la oreja, con inyecciones del anticuerpo o anticuerpos anti-IFN-a de la presente invención, con respecto a los grupos de control que reciben PBS o IgG humana sin especificidad de unión relacionada con el IFN-a, como se indicó anteriormente. La reducción de la hinchazón del tobillo se usa como lectura del efecto terapéutico de los anticuerpos de la presente invención. Este ensayo se usa preferentemente como modelo sustituto para la artritis, por ejemplo, la artritis reumatoide.
Ejemplo 5: Mapeo de epítopos de los anticuerpos de IFN-a ilustrativos
Como primera etapa del mapeo, se examinó la unión diferencial de los ACM anti-IFN-a de la presente invención a distintos sitios de unión a antígeno para determinar el número de sitios de unión diferentes.
Para este fin, los ACM se expresaron con Fc humano (ACMh) o de ratón (ACMhm) y se llevaron a cabo experimentos de competencia cruzada mediante el recubrimiento de las placas con antígeno y la detección de la unión del ACMhm en presencia de un gran exceso de ACM humanos. La detección de ACMhm unidos al ligando se realizó mediante un anticuerpo secundario conjugado con HRP dirigido contra la porción Fc del anticuerpo primario.
Como puede verse en la Figura 2Ay la Tabla 6A más abajo, los anticuerpos anti-IFN-a ilustrativos 19D11,26B9, 31B4 y 13B11 de la presente invención compiten entre sí por la unión de IFNA2 pero no con los anticuerpos 5D1 y 25C3, lo que indica que 5D1 y 25C3 se unen a otros sitios del IFNA2 distintos de los sitios de unión de 19D11, 26B9, 31B4 y 13B11. El mismo patrón de competencia puede observarse para el IFNA4 y el IFNA14 con la diferencia, sin embargo, de que 13B1 no compite por la unión del IFNA4 y solo compite débilmente por la unión del IFNA14 con 19D11, 26B9, 31B4, lo que indica que el epítopo al que se unen los anticuerpos puede no ser conservado en estos subtipos de IFN-a y en particular, es divergente en el IFNA4. Los resultados del primer enfoque también indican una competencia débil entre sí de los anticuerpos anti-IFN-a 5D1 y 25C3 de la presente invención por la unión del IFNA2 y el IFNA4, lo que indica un posible solapamiento de epítopos parcial de estos anticuerpos; véanse las Figuras 2A, 2B y las Tablas 5a , 5B. Además, puede observarse un patrón de competencia divergente en el IFNA14, donde el ACMh 25C3 muestra una fuerte competencia con el ACMhm 5D1, pero solo puede observarse una competencia débil en la situación inversa (ACMh 5D1 contra ACMhm 25C3), lo que indica una posible preferencia del anticuerpo 25C3 hacia un epítopo específico del IFNA14; véase la Figura 2C y la Tabla 6C más abajo.
Tabla 6: Resultados de los experimentos de competencia cruzada de los anticuerpos ilustrativos de la presente invención. Se añadieron ACM humanos (ACMh) en gran exceso a placas recubiertas con los antígenos respectivos antes de la adición de ACM con Fc de ratón ACMhm .
Figure imgf000065_0001
(continuación)
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000066_0002
(Fig. 27C) y al péptido 23 (TGLHQQLQHLETCLLQVV SEQ ID NO: 102) del IFNAW (Figura 27D).
Ejemplo 6: Determinación de la unión de los ACM a los subtipos de IFNA mediante el ensayo LIPS.
Además del ensayo ELISA, la unión de los ACM a los diferentes subtipos de IFNA se determinó mediante el ensayo LIPS. Las proteínas de fusión IFNA5-, IFNA6- e IFNA8-Gaussia se produjeron mediante la clonación del IFNA5, IFNA6 e IFNA8, cada uno fusionado con luciferasa Gaussia en el extremo N-terminal, y se expresaron individualmente mediante transfección transitoria de células HEK293 (cosecha del sobrenadante después de 2 días) como se describió en el Ejemplo 10 en la página 158 y el Ejemplo 15 en las páginas 165-167 en la solicitud internacional del solicitante WO2013/098419, mediante el uso de los cebadores indicados en la Tabla 8 más abajo. Los ACM (4 |jg/ml) se diluyeron en tampón A (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl25 mM, Triton X-100 al 1 %) y se incubaron durante 1 hora con una cantidad igual de perlas de agarosa de proteína A (Exalpha) en pocillos de placas de filtro MultiScreen HTS (Millipore) en un agitador rotatorio. Se añadieron dos volúmenes de proteína de fusión IFNA5- o IFNA6- o IFNA8-Gaussia (1 millón de LU) y las placas se incubaron durante 1 hora. Las placas se lavaron 5 veces con Tampón A y 2 veces adicionales con PBS antes de la adición del sustrato (Kit Gaussia Luciferase Flash Assay, Pierce). La luminiscencia (CPS) se leyó mediante el uso de EnSprire (Perkin Elmer) (véanse las Figuras 11B, 12A-C y 13). Se ha usado como control negativo un anticuerpo humano que se une a un antígeno ACM humano no relacionado.
Como puede verse en los resultados mostrados en las Figuras 11 y 12, el ACM 13B11 ilustrativo se une al: IFNA2, 4, 5, 6, 10 y 14 pero no, o de manera más débil al IFNA1/13, y no al IFNA8. Además, los resultados proporcionados en los experimentos descritos en la presente descripción, por ejemplo, en los Ejemplos 2 y 3 muestran que el ACM 13B11 ilustrativo neutraliza al: IFNA2, 4, 5, 14 pero no al IFNA6, 8 e IFNA21. Todos los resultados con respecto a las propiedades de unión y neutralización de los anticuerpos ilustrativos de la presente invención proporcionados por los experimentos descritos en los Ejemplos 2, 3 y 6 se resumen en la Tabla 7 más abajo.
Tabla 7: Unión (B) y neutralización (N) de diferentes subtipos de IFN por los anticuerpos ilustrativos de la presente invención obtenidos en el ELISA, LIPS o ensayos de neutralización descritos en la presente descripción. El anticuerpo anti-IFN-a humano ilustrativo de la presente invención 19D11 neutraliza todos los subtipos de IFNA y no al IFNW. El anticuerpo ilustrativo 26B9 neutraliza al IFNW y todos los subtipos de IFNA excepto al IFNA16. /++/+++ = unión, neutralización respectiva; - = falta de unión/neutralización. nd = no determinado; B = unión, determinada mediante ELISA con proteínas recombinantes comerciales o mediante LIPS con proteínas de fusión IFN-luciferasa Gaussia de producción propia; N= neutralización, determinada mediante el ensayo indicador de ISRE-Luciferasa o mediante el ensayo Phospho-STAT1.
Figure imgf000067_0001
Los experimentos previos sobre la unión y neutralización de diferentes subtipos de IFNA por los anticuerpos ilustrativos de la presente invención en el ELISA, LIPS y los ensayos de neutralización dieron resultados similares.
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Clonación de subtipos de IFN humano en fusión con luciferasa Gaussia
Las secuencias codificantes del IFNA1, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21, IFNW, IFNB, IFNG, IFNE e IFNK sin péptidos señal se clonaron en el vector de fusión pPK-CMV-F4 modificado (PromoCell GmbH, Heidelberg; Alemania) corriente abajo de la luciferasa de Gaussia secretada naturalmente (Gluc) que fue reemplazada en el plásmido en lugar de la luciferasa de luciérnaga.
Ejemplo 7: Análisis de la CI50 de los AcM de IFNA ilustrativos derivados de seres humanos mediante el ensayo de neutralización del indicador de ISRE-luciferasa.
Las Células HEK 293T MSR (núm. catálogo R79507, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) que expresan transitoriamente las construcciones del indicador de ISRE-luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla (núm. catálogo CCS-008L, Quiagen, Hilden, Alemania) se estimularon con 2 ng/ml del rhIFNA2, rhIFNA4, rhIFNA14 o con sobrenadantes de células HEK 293T que expresan transitoriamente proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia humana (IFNA5, IFNA8), en presencia del AcM 26B9 de IFNA derivado de humanos (Figura 8A-E), 25C3 (Figura 9A-E) o 19D11 (Figura 10A-E) como se indica. Después de 24 horas de estimulación, se realizaron ensayos de indicador dual de luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI, Estados Unidos).
En una ronda experimental de confirmación, se estimularon células HEK 293T MSR que expresaban transitoriamente las construcciones del indicador de ISRE-luciferasa de luciérnaga y de luciferasa de Renilla como se describió anteriormente, con 10 ng/ml de rhIFNA1, 2 ng/ml de rhIFNA2, rhIFNA4, rhIFNA5, rhIFNA6, rhIFNA8, rhIFNA10, rhIFNA14, rhIFNA17, rhIFNA21, 1,3 ng/ml de rhIFNA16, en presencia del AcM 26B9 de IFNA derivado de humanos (Figura 8F-R) o 19D11 (Figura 10F-Q) como se indica. Después de 24 horas de estimulación, se realizaron ensayos de indicador dual de luciferasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI, Estados Unidos). La misma configuración experimental se ha usado además para realizar el análisis de la CI50 de los AcM derivados de humanos 8H1 (Figura 20), 12H5 (Figura 21) y 50E11 (Figura 22). Los resultados de los ensayos se resumen en la Tabla 4 anteriormente.
Ejemplo 8: Mediciones de afinidad de los anticuerpos mediante el uso de la tecnología de resonancia de plasmones de superficie (SPR)
Para la determinación de la afinidad de los anticuerpos de la presente invención, las mediciones de SPR se realizan mediante el uso de un instrumento ProteOn™ XPR36, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIO-RAD; Hercules CA, Estados Unidos) mediante el uso de las moléculas de interés de la presente invención en un montaje experimental análogo al que se describió en el Ejemplo 14 de la solicitud internacional WO2013/098419 en las páginas 163-165. Alternativamente o además, se realiza un análisis similar mediante el uso de instrumentos Biacore SPR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados de las mediciones de SPR realizadas en los anticuerpos ilustrativos 19D11 y 26B9 de la presente invención se muestran en la Figura 26, se observó una cinética de unión 1:1 para los anticuerpos hacia el IFNA2b, IFNA4, IFNA14 y con respecto al anticuerpo 26B9 también frente al IFNW. Las afinidades hacia el IFNA4 y el IFNA14 humano están en el intervalo subpicomolar y para el IFNA2b en el intervalo subnanomolar. El 26B9 también se une al IFNW humano con una afinidad subpicomolar.
Ejemplo 9: Ensayos de unión celular quimioluminiscente
Interferones-luciferasa Gaussia
Se sembraron 30000 células HEK 293T MSR en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de media área blancas (núm. catálogo 3688, Corning Inc.). Al día siguiente, los sobrenadantes de células HEK 293T que expresan transitoriamente proteínas de fusión de IFN-luciferasa Gaussia humanas se mezclaron con AcM anti-IFN, IgG de control o concentraciones en exceso de IFNA2 recombinante sin marcar y se incubaron previamente durante una hora a 37 °C. Después de la incubación previa, las mezclas se usaron para estimular las células HEK 293T MSR durante 40 minutos a 37 °C. Tras la unión, las células se lavaron tres veces con PBS y se desarrolló el ensayo de luciferasa de Gaussia mediante el uso del kit Gaussia Flash Assay de acuerdo con las instrucciones del fabricante (núm. catálogo 16159, Thermo Fisher Scientific).
Unión a anticuerpos transmembrana
Se sembraron 30000 células HEK 293T MSR en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos de media área blancas (núm. catálogo 3688, Corning Inc.). Durante la siembra, las células se transfectaron con 100 ng de ADNc que codifica una versión transmembrana del AcM anti-IFN 26B9 (26B9-TM) mediante el uso de Fugene HD (núm. catálogo E2311, Promega, Madison, WI, Estados Unidos). La expresión del anticuerpo de superficie (26B9-TM) se analizó 48 horas después de la transfección en un ELISA basado en células (Figura 24A). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se usaron sobrenadantes de células HEK 293T que expresaban transitoriamente proteínas de fusión IFNW-luciferasa Gaussia humanas (g1 IFNW) para estimular las células HEK 293T MSR transfectadas previamente

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    Un anticuerpo humano anti-interferón-alfa (IFN-a) o un fragmento de unión a IFN-a del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a
    se une a los subtipos de IFN-a humano IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA10 e IFNA14;
    y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a comprender en su región variable las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 y VL-CDR1, VL-CDR2 y VL-CDR3 seleccionadas a partir de:
    a) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 2
    VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 2
    VH-CDR3: posiciones 99-111 de la SEQ ID NO: 2
    VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 4
    VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 4
    VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 4;
    b) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 10
    VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 10
    VH-CDR3: posiciones 99-112 de la SEQ ID NO: 10
    VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 12
    VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 12
    VL-CDR3: posiciones 89-95 de la SEQ ID NO: 12;
    c) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 18
    VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 18
    VH-CDR3: posiciones 99-115 de la SEQ ID NO: 18,
    VL-CDR1: posiciones 24-35 de la SEQ ID NO: 20
    VL-CDR2: posiciones 51-57 de la SEQ ID NO: 20
    VL-CDR3: posiciones 90-100 de la SEQ ID NO: 20;
    d) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 22
    VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 22
    VH-CDR3: posiciones 99-111 de la SEQ ID NO: 22
    VL-CDR 1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 24
    VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEO ID NO: 24
    VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 24;
    e) VH-CDR1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 30
    VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 30
    VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 30
    VL-CDR 1: posiciones 24-40 de la SEQ ID NO: 32
    VL-CDR2: posiciones 56-62 de la SEQ ID NO: 32
    VL-CDR3: posiciones 95-103 de la SEQ ID NO: 32;
    f) VH-CDR 1: posiciones 31-37 de la SEQ ID NO: 38
    VH-CDR2: posiciones 52-67 de la SEQ ID NO: 38
    VH-CDR3: posiciones 100-113 de la SEQ ID NO: 38
    VL-CDR1: posiciones 24-40 de la SEQ ID NO: 40
    VL-CDR2: posiciones 56-62 de la SEQ ID NO: 40
    VL-CDR3: posiciones 95-103 de la SEQ ID NO: 40;
    g) VH-CDR 1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 76
    VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 76
    VH-CDR3: posiciones 99-113 de la SEQ ID NO: 76
    VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEQ ID NO: 78
    VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 78
    VL-CDR3: posiciones 89-97 de la SEQ ID NO: 78; y
    h) VH-CDR1: posiciones 31-35 de la SEQ ID NO: 84
    VH-CDR2: posiciones 50-66 de la SEQ ID NO: 84
    VH-CDR3: posiciones 99-112 de la SEQ ID NO: 84,
    VL-CDR1: posiciones 24-34 de la SEO ID NO: 86
    VL-CDR2: posiciones 50-56 de la SEQ ID NO: 86
    VL-CDR3: posiciones 89-98 de la SEO ID NO: 86.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de la reivindicación 1, que comprende en su región variable una secuencia de aminoácidos de las Vh y Vl seleccionadas del grupo que consiste en:
    Figure imgf000145_0001
    y
  3. 3. El anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que es IgG1 y/o que comprende una región constante Ch y/o Cl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las Ch y Cl establecidas en las SEQ ID NOs.: 6, 8, 14, 16, 26, 28, 34, 36, 42, 44, 72, 74, 80, 82, 88 y 90.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fv de cadena única (scFv), un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab) y un fragmento F(ab')2.
  5. 5. Un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a IFN-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, preferentemente en donde el polinucleótido es un ADNc que codifica la región variable y al menos parte del dominio constante.
  6. 6. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5.
  7. 7. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de la reivindicación 5 o un vector de la reivindicación 6.
  8. 8. El anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se marca de forma detectable o se une a un fármaco, preferentemente en donde el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo, un péptido y un metal pesado.
  9. 9. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8, el polinucleótido de la reivindicación 5, el vector de la reivindicación 6 y/o la célula de la reivindicación 7, preferentemente en donde la composición es
    (i) una composición farmacéutica y que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable; o (ii) una composición de diagnóstico.
  10. 10. La composición de la reivindicación 9, en donde la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional útil en el tratamiento de una enfermedad o afección autoinmunitaria, en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en fármacos inmunosupresores, antiinflamatorios y antirreumáticos.
  11. 11. La composición de la reivindicación 10, en donde dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus eritematoso cutáneo (CLE), lupus eritematoso discoide (DLE), diabetes mellitustipo 1 (TIDM), síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, dermatomiositis, esclerosis múltiple (EM), psoriasis, tiroiditis autoinmunitaria, artritis reumatoide (AR), espondiloartritis y esclerodermia, glomerulonefritis y APS1.
  12. 12. El anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8, o la composición de la reivindicación 9 para su uso en un método para tratar o prevenir la progresión de una enfermedad o afección autoinmunitaria.
  13. 13. El anticuerpo o fragmento de unión a IFN-a o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (SLE), lupus eritematoso cutáneo (CLE), lupus eritematoso discoide (DLE), diabetes mellitus tipo 1 (TIDM), síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, dermatomiositis, esclerosis múltiple (EM), psoriasis, tiroiditis autoinmunitaria, artritis reumatoide (AR), espondiloartritis y esclerodermia, glomerulonefritis y APS1.
ES14750320T 2013-07-03 2014-07-03 Anticuerpos humanos anti-IFN-alfa Active ES2911663T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13174995 2013-07-03
PCT/EP2014/064167 WO2015001013A2 (en) 2013-07-03 2014-07-03 Human anti-ifn-alpha antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2911663T3 true ES2911663T3 (es) 2022-05-20

Family

ID=48703313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14750320T Active ES2911663T3 (es) 2013-07-03 2014-07-03 Anticuerpos humanos anti-IFN-alfa

Country Status (10)

Country Link
US (3) US10112995B2 (es)
EP (2) EP3016978B1 (es)
JP (1) JP6742237B2 (es)
KR (1) KR102402973B1 (es)
CN (3) CN112358548B (es)
AU (1) AU2014286131C1 (es)
CA (1) CA2917112C (es)
DK (1) DK3016978T3 (es)
ES (1) ES2911663T3 (es)
WO (1) WO2015001013A2 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112358548B (zh) * 2013-07-03 2024-10-25 因美诺克股份公司 人抗IFN-α抗体、IFN-α结合片段、多核苷酸、组合物、试剂盒及应用和制备方法
TWI713453B (zh) * 2014-06-23 2020-12-21 美商健生生物科技公司 干擾素α及ω抗體拮抗劑
AU2019276776B2 (en) * 2018-06-01 2025-12-11 ILC Therapeutics Limited Compositions and methods relating to the treatment of diseases
US11098093B2 (en) 2019-01-07 2021-08-24 Shattuck Labs, Inc. Heterodimeric proteins for modulating gamma delta T cells
WO2020146393A1 (en) 2019-01-07 2020-07-16 Shattuck Labs. Inc. Heterodimeric proteins for modulating gamma delta t cells
CN112794903B (zh) * 2021-04-14 2021-06-25 广州市雷德生物科技有限公司 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用
WO2025231346A1 (en) * 2024-05-03 2025-11-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Anti-interferon-alpha and anti-interferon-beta antibodies, and methods of use thereof
WO2025247917A1 (en) * 2024-05-28 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale ANTI-IFN-α2 AND ANTI-IFN-ω1 MONOCLONAL ANTIBODIES
WO2025247913A1 (en) * 2024-05-28 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Anti-ifn-omega1 monoclonal antibodies
WO2025247924A1 (en) * 2024-05-28 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale ANTI-IFN-α2 MONOCLONAL ANTIBODIES
WO2025247918A1 (en) * 2024-05-28 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale ANTI-IFN-α2 MONOCLONAL ANTIBODIES

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
WO1989009622A1 (en) 1988-04-15 1989-10-19 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
GB9020282D0 (en) 1990-09-17 1990-10-31 Gorman Scott D Altered antibodies and their preparation
DE69233408T2 (de) 1991-12-02 2005-09-22 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Herstellung von Antikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken.
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
CA2135642C (en) 1992-08-21 1999-12-14 James G. Barsoum Tat-derived transport polypeptides
US6309636B1 (en) * 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US6590079B2 (en) 1997-01-30 2003-07-08 Ixsys, Incorporated Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
FI973762A0 (fi) 1997-09-23 1997-09-23 Krohn Kai Ny gen
US6531580B1 (en) 1999-06-24 2003-03-11 Ixsys, Inc. Anti-αvβ3 recombinant human antibodies and nucleic acids encoding same
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
US6838250B2 (en) 2000-03-31 2005-01-04 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassay for C-reactive protein
US7087726B2 (en) 2001-02-22 2006-08-08 Genentech, Inc. Anti-interferon-α antibodies
US20030044870A1 (en) 2001-07-13 2003-03-06 Peter Sehr Generic capture elisa using recombinant fusion proteins for detecting antibodies in biological samples
US8450067B2 (en) 2002-05-28 2013-05-28 Omrix Biopharmaceuticals Inc. Method for obtaining anti-idiotype antibodies
AU2003285874A1 (en) * 2002-10-16 2004-05-04 Amgen Inc. HUMAN ANTI-IFN-Gamma NEUTRALIZING ANTIBODIES AS SELECTIVE IFN-Gamma PATHWAY INHIBITORS
GB0407315D0 (en) 2003-07-15 2004-05-05 Cambridge Antibody Tech Human antibody molecules
NZ547157A (en) * 2003-12-10 2009-07-31 Medarex Inc Interferon Alpha Antibodies and their uses
MY146381A (en) * 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
WO2006086586A2 (en) 2005-02-10 2006-08-17 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use
US7888481B2 (en) 2005-02-10 2011-02-15 Baylor Research Institute Anti-interferon alpha monoclonal antibodies and methods for use
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2682292A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 Medimmune, Llc Aqueous formulation comprising an anti-human interferon alpha antibody
MX2010012052A (es) * 2008-05-07 2010-12-14 Novo Nordisk As Anticuerpos humanizados contra interferon-alfa humano.
EP2258727A1 (en) 2009-05-27 2010-12-08 Wezen Biopharmaceuticals S.r.l. A Socio Unico Immunoglobulin preparation for the treatment of autoimmune diseases and immune system disorders
CN101580546B (zh) * 2009-06-04 2011-09-14 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗人干扰素α抗体及其应用
WO2013059299A1 (en) * 2011-10-17 2013-04-25 The Uab Research Foundation Antibodies for interferon subtypes and interferon/interferon receptor ternary complex and uses thereof
ES2668104T3 (es) 2011-12-28 2018-05-16 Immunoqure Ag Procedimiento de aislamiento de anticuerpos humanos
CN112358548B (zh) 2013-07-03 2024-10-25 因美诺克股份公司 人抗IFN-α抗体、IFN-α结合片段、多核苷酸、组合物、试剂盒及应用和制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK3016978T3 (en) 2022-05-02
JP6742237B2 (ja) 2020-08-19
KR20160027171A (ko) 2016-03-09
CN112358548B (zh) 2024-10-25
US10941198B2 (en) 2021-03-09
EP4056591A1 (en) 2022-09-14
CN112375145B (zh) 2024-10-25
WO2015001013A2 (en) 2015-01-08
CN112375145A (zh) 2021-02-19
JP2016531090A (ja) 2016-10-06
US20210221883A1 (en) 2021-07-22
AU2014286131C1 (en) 2020-02-13
US10112995B2 (en) 2018-10-30
EP3016978A2 (en) 2016-05-11
CA2917112A1 (en) 2015-01-08
CN105518025B (zh) 2020-12-08
KR102402973B1 (ko) 2022-05-27
US11945861B2 (en) 2024-04-02
HK1219961A1 (en) 2017-04-21
CA2917112C (en) 2022-07-05
CN112358548A (zh) 2021-02-12
AU2014286131B2 (en) 2019-08-29
US20190071499A1 (en) 2019-03-07
WO2015001013A3 (en) 2015-03-12
US20170051055A1 (en) 2017-02-23
CN105518025A (zh) 2016-04-20
EP3016978B1 (en) 2022-01-26
AU2014286131A1 (en) 2016-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11945861B2 (en) Human anti-IFN-α antibodies
US10975144B2 (en) CDNA encoding a monoclonal anti-IL-32 antibody and methods for the production of the antibody
HK1219961B (en) Human anti-ifn-alpha antibodies
US20170189524A1 (en) Human-derived anti-human il-20 antibodies and assay for the identification of anti-cytokine antibodies