ES2911690T3 - Regulación del metabolismo de la glucosa mediante anticuerpos anti-CGRP - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo antipéptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso para mejorar o reducir los síntomas, tratar, prevenir o controlar la hiperglucemia en un sujeto que lo necesite, en el que dicho anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprende: (i) una cadena variable ligera (VL) que comprende polipéptidos de la región determinante de complementariedad (CDR)1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:55, 56 y 57, respectivamente; y (ii) una cadena variable pesada (VH) que comprende polipéptidos de CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:58, 59 y 60, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Regulación del metabolismo de la glucosa mediante anticuerpos anti-CGRP

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de anticuerpos contra el péptido relacionado con el gen de la calcitonina humano ("Caltonin Gene Related Peptide”, “CGRP”) y fragmentos del mismo (incluidos los fragmentos Fab) que se unen específicamente a CGRP y estimulan la captación y utilización de glucosa en tejido periférico y/o inhiben la producción de glucosa hepática. Los ejemplos de realizaciones de los métodos en cuestión pueden conservar las células beta pancreáticas funcionales, ralentizando así la progresión hacia la diabetes sintomática. La descripción también se refiere a métodos de detección de enfermedades y trastornos asociados con la resistencia a la insulina (incluidos los trastornos del metabolismo de la glucosa, de carbohidratos y de grasas). También se describen en este documento métodos para prevenir o tratar enfermedades y trastornos asociados con la resistencia a la insulina mediante la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Esta solicitud contiene un listado de secuencias biológicas que se ha enviado en formato ASCII a través de EFS-Web. Dicha copia ASCII, creada el 1 de julio de 2014, se denomina "43257o3013.txt" y tiene un tamaño de 203.678 bytes.

Antecedentes de la invención

El péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) se produce como un neuropéptido multifuncional de 37 aminoácidos de longitud. Existen dos formas de CGRP, una CGRP-alfa y una CGRP-beta en seres humanos y ambas tienen actividades similares. CGRP-alfa y CGRP-beta difieren en tres aminoácidos en seres humanos y se derivan de genes diferentes. La familia de péptidos CGRP también incluye amilina, adrenomedulina y calcitonina, aunque cada una tiene distintos receptores y actividades biológicas. Doods, H., Curr. Op. Inv. Drugs, 2(9):1261 -68 (2001). Dentro de la familia de proteínas CGRP, los restos aminoácidos en los sitios de unión al receptor putativos están conservados, aunque la homología total varía. Por ejemplo, el CGRP humano y la amilina comparten un 46% de identidad de secuencia de aminoácidos total, mientras que la calcitonina humana y el CGRP comparten un 15% de identidad de secuencia de aminoácidos. Wimalawansa, S.J., Endocrine Rev., 17(5):533-585 (1996).

Los efectos biológicos de CGRP están mediados por el receptor de CGRP (CGRP-R), que consta de un componente siete-transmembrana, junto con la proteína de membrana asociada al receptor (“receptor-associated membrane protein”, RAMP). El CGRP-R requiere además la actividad de la proteína componente del receptor (“receptor component protein”, RCP), que es fundamental para un acoplamiento eficiente a la adenilato ciclasa a través de las proteínas G y la producción de AMPc. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261 -68 (2001).

El CGRP se encuentra en todo el sistema nervioso periférico y central e influye en los sistemas cardiovascular, nervioso y endocrino. Cuando se libera CGRP desde tejidos, tales como los nervios trigéminos, puede resultar en una activación secuencial y liberación de neuropéptidos dentro de las meninges, para mediar en la inflamación neurogénica que se caracteriza por vasodilatación, filtración de vasos y degradación de mastocitos. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Se cree que el CGRP desempeña un papel destacado en el desarrollo de las migrañas. Se ha demostrado que se identificaron niveles elevados de CGRP en el plasma de la sangre venosa yugular durante la fase de dolor de cabeza de las migrañas, con exclusión de otros neuropéptidos. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43:176-187 (2005). Además, se ha demostrado que el antagonismo de CGRP es eficaz para el tratamiento de la migraña (Olesen et al., N. Engl. J. Med., 2004, 11 de marzo, 350 (11):1104-10).

Además del tejido nervioso, se han identificado receptores de CGRP en tejido cardiovascular, glándula suprarrenal, glándula pituitaria, riñón, páncreas y hueso. Wimalawansa, S.J., Endocrine Rev., 17(5):533-585 (1996). En estudios in vitro, se descubrió que tanto el CGRP como la amilina inhiben la secreción de insulina utilizando tejido pancreático aislado, contrarrestan la tasa de síntesis de glucógeno estimulada por la insulina de una manera dependiente de la dosis y bloquean los efectos de la insulina en hepatocitos aislados (Gómez-Foix et al., Biochem. J., 276:607-610, 1991). Además, Leighton y Cooper (Nature, 335(6191):632-5, 1988) informan que el CGRP-1 de rata inhibió las tasas basales y estimuladas por insulina de la síntesis de glucógeno en el músculo sóleo de rata disecado in vitro.

La homeostasis de la glucosa se mantiene equilibrando la síntesis de glucógeno con la glucogenólisis por la hormona glucagón, y la utilización y captación de la glucosa hacia los tejidos por la hormona insulina. La presencia de glucosa normalmente estimula la producción de insulina, que actúa para aumentar la tasa de transporte de glucosa hacia el músculo esquelético, los miocitos, el cerebro y los adipocitos. La insulina normalmente también inhibe la degradación de los lípidos en los adipocitos. En los primeros estadios de la prediabetes o diabetes de tipo 2, los tejidos desarrollan resistencia a la insulina, pero las células beta pancreáticas lo compensan secretando niveles crecientes de insulina. Finalmente, a medida que aumenta la resistencia a la insulina del músculo y el hígado, la capacidad de compensación de las células beta del páncreas se agota y se requiere insulina exógena.

La incapacidad para regular estrictamente la homeostasis de la glucosa como resultado de una síntesis de insulina y una utilización de la glucosa alteradas puede tener efectos metabólicos profundos y perjudiciales para la salud. El más común es el desarrollo de niveles persistentemente altos de azúcar en la sangre (hiperglucemia) que conducen a la resistencia a la insulina y al diagnóstico de diabetes de tipo II. En 2011, en EE. UU., 25.600.000 personas de 20 años o más fueron diagnosticadas con diabetes, de las cuales el 95% era diabetes de tipo 2 (Centers for Disease Control and Prevention. National Diabetes Fact Sheet, 2011. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services; 2011). Los costes médicos para una persona diabética son un promedio de dos veces mayores que para una persona no diabética, debido al mayor riesgo de ataque cardíaco, accidente cerebrovascular, complicaciones renales y neuropatía. Imperatore et al., Am. J. Epidemiol., 160(6):531-539 (2004). Sin cambios significativos, los CDC predicen que para 2050, 1 de cada 3 adultos en los EE. UU. podría tener diabetes. Boyle et al., Popul. Health Metr., 8:29 (2010). En todo el mundo, en 2011, el número total de personas diagnosticadas con diabetes se estimó en 366 millones de personas, aumentando a 552 millones para 2030 (International Diabetes Foundation, IDF Diabetes Atlas, 5a ed.).

El papel del CGRP en el metabolismo de la glucosa no está claramente definido en la literatura. Los estudios en hepatocitos aislados han demostrado que el CGRP y la amilina inhiben la tasa de síntesis de glucógeno estimulada por la insulina (Gómez-Foix et al., Biochem. J., 276:607-610, 1991). Beaumont et al., Br. J. Pharmacol., julio, 115 (5):713-5 (1995) descubrieron que los receptores de CGRP no median en los efectos del metabolismo de la glucosa muscular. Tanaka et al., Exp. Clin Endocrinol. Diabetes, 121:280-285 (2013) afirman que, en un modelo de rata, un anticuerpo anti-CGRP produjo una ligera extensión de la secreción de insulina de primera fase con un pequeño cambio en la secreción de insulina; sin embargo, el estudio no indicó si el anticuerpo tenía reactividad cruzada con otros péptidos de la familia de la calcitonina, potencialmente confundiendo los resultados. Finalmente, patentes de los EE. UU. previas pretendieron demostrar que el CGRP es un agonista de la amilina y que la administración del polipéptido CGRP (a diferencia de un antagonista del CGRP) puede tratar la diabetes (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n os 5,641,744 y 5,175,145).

El documento US 5266561 A (publicado el 30 de noviembre de 1993) informa de un "Tratamiento de la diabetes de tipo 2". El documento US 5364841 A (publicado el 25 de noviembre de 1994) informa de un "Tratamiento de la obesidad y la hipertensión esencial y trastornos relacionados". El documento US 2012/294797 A1 (publicado el 22 de noviembre de 2012) informa de "Composiciones anti-CGRP y uso de las mismas". Derosa et al., informan de una "Optimización del tratamiento combinado en el control de la diabetes de tipo 2" (Vascular Health and Risk Management, 2007, vol.

3(5): págs. 665-671). Halimi et al. informan de un "Tratamiento combinado en el control de la diabetes de tipo 2: foco en la vildagliptina y la metformina como un único comprimido" (Vascular Health and Risk Management, 2008, vol. 4(3): págs. 481-492.)

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones. Específicamente, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo antipéptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) humano humana para usar en un método para mejorar o reducir los síntomas de la hiperglucemia, o para tratar, prevenir o controlar la hipoglucemia en un sujeto que lo necesita, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano comprende: (i) una cadena variable ligera (V^l) que comprende polipéptidos de la región determinante de complementariedad (“complementarity determining region”, CDR)1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:55, 56 y 57, respectivamente; y (ii) una cadena variable pesada (V^h) que comprende polipéptidos de CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:58, 59 y 60, respectivamente.

También se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano para usar en un método para aumentar la utilización de glucosa hepática y/o periférica en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el uso administrar una cantidad eficaz de la composición a dicho sujeto.

También se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano para usar en un método para disminuir la resistencia a la insulina en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el uso administrar una cantidad eficaz de la composición a dicho sujeto.

También se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano para usar en un método para tratar, prevenir o controlar la obesidad en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el uso administrar una cantidad eficaz de la composición a dicho sujeto.

También se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano para usar en un método para lograr una normoglucemia sostenida en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el uso administrar una cantidad eficaz de la composición a dicho sujeto.

También se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano para usar en un método para aumentar la proporción de tejido magro a grasa corporal en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición a dicho sujeto.

Los métodos en cuestión pueden ser eficaces para tratar o retrasar la aparición de la diabetes de tipo II y/o la obesidad. Por ejemplo, se puede retrasar la necesidad de administrar insulina exógena. El método puede ser eficaz para prevenir o frenar la pérdida de células beta pancreáticas. Por ejemplo, sin intención de estar limitado por la teoría, se cree que el método puede permitir que las células beta pancreáticas de un ser humano o animal no humano resistente a la insulina descansen, evitando así la pérdida de células beta pancreáticas funcionales.

Dicho sujeto puede haber sido diagnosticado con prediabetes o puede exhibir uno o más factores de riesgo para el desarrollo de diabetes de tipo II.

El sujeto puede ser premenopáusico, perimenopáusico, menopáusico o posmenopáusico.

El sujeto puede presentar uno o más síntomas de prediabetes, tales como un nivel de glucosa en sangre en ayunas de entre 100 mg/dl y 125 mg/dl; un nivel de azúcar en sangre de entre 140 mg/dL y 199 mg/dL dos horas después de ingerir una disolución de glucosa de 75 gramos o una disolución de glucosa de 1,75 gramos de glucosa por kilogramo de peso corporal, hasta una dosis máxima de 75 gramos; y/o hemoglobina glicosilada de entre 5,7% y 6,4%.

El sujeto puede presentar uno o más síntomas de diabetes, tales como un nivel de glucosa en sangre en ayunas superior a 125 mg/dl; un nivel de azúcar en sangre de al menos 200 mg/dl dos horas después de ingerir una disolución de glucosa de 75 gramos o una disolución de glucosa de 1,75 gramos de glucosa por kilogramo de peso corporal, hasta una dosis máxima de 75 gramos; y/o hemoglobina glicosilada de al menos 6,5%.

El sujeto puede presentar uno o más factores de riesgo para el desarrollo de diabetes de tipo II, tales como antecedentes familiares de diabetes de tipo II; uno o más padres o hermanos previamente diagnosticados con diabetes de tipo II; dislipidemia; unos niveles totales de triglicéridos en sangre de al menos 200 mg/dl; un nivel de lipoproteínas de alta densidad en sangre inferior a 35 mg/dl; obesidad; un índice de masa corporal superior a 25 kg/m2; antecedentes de diabetes gestacional; parto previo de un bebé con un peso al nacer superior a 4 kg (9 libras); hipertensión; presión arterial sistólica de al menos 140 mmHg; presión arterial diastólica de al menos 90 mmHg; una medición previa de glucosa en sangre en ayunas de al menos 99 mg/dL; enfermedad vascular; síndrome de ovario poliquístico; o acantosis nigricans.

El sujeto puede haber sido diagnosticado con diabetes de tipo II.

El sujeto puede ser refractario al tratamiento con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: GLP-1, exenatida-1, exendina, análogo de exendina, agonista de exendina, liraglutida, exenatida LAR, un antagonista de DPP-4, un agonista del receptor de GLP-1 y otro agonista de GLP-1; o tal compuesto puede estar contraindicado para la administración al sujeto.

Los usos pueden comprender además administrar a dicho sujeto un agente antidiabético o un agente antiobesidad distinto de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano. Dicho agente antidiabético o agente antiobesidad puede comprender uno o más de amilina, agonista de amilina, sulfonilureas, calcitonina, glucagón, agonistas de PPAR-gamma, agonistas del receptor de GPL-1, inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV, análogos de amilina, biguanidas, agonistas del receptor de dopamina D2, meglitinidas, inhibidor de alfa-glucosidasa, secuestrante de ácidos biliares antidislipidémico, exendina, análogo de exendina, agonista de exendina, péptido inhibidor de gastrina (“gastrin inhibitory peptide”, GIP), péptido de incretina, insulina, inhibidor de SGLT2, un inhibidor de la reabsorción de glucosa, fenofibrato, fibrato, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo antigrelina, un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR)-1 (IIIb), FGFR-1 (IIIc), anticuerpo o fragmento de anticuerpo y/o FGFR-4(IIIc), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CD38 , un anticuerpo anti-MIC-1 o un fragmento de unión a MIC-1, metformina o una combinación de cualquiera de los anteriores.

En un ejemplo de realización, dicho agente antidiabético es metformina.

El método puede ser eficaz para provocar la pérdida de peso.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano administrado puede no aumentar significativamente la secreción de insulina in vivo, por ejemplo, puede no aumentar significativamente la secreción de insulina por encima de los niveles fisiológicos normales in vivo, o puede no aumentar significativamente la secreción de insulina en relación con el nivel de secreción de insulina antes de la administración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano.

Es posible que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano administrado no aumente la incidencia de pancreatitis o la expresión de marcadores o citoquinas asociados con la inflamación pancreática.

Dicha composición puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede administrarse a dicho sujeto a una dosificación entre aproximadamente 0,1 y 100,0 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor.

Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede ser un anticuerpo humano. Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede ser de origen no natural. Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede ser un fragmento de anticuerpo no natural. Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo. Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede ser un anticuerpo quimérico.

El anticuerpo anti-CGRP humano o los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse específicamente a los mismos epítopos lineales o conformacionales y/o pueden competir por unirse a los mismos epítopos lineales o conformacionales o solapantes en un polipéptido CGRP intacto o un fragmento del mismo, tal como un anticuerpo anti-CGRP humano seleccionado del grupo que consiste en: (a) Ab1 que comprende la V^l de SEQ ID NO:2 y la V^h de SEQ ID NO:4; (b) Ab2 que comprende la V^l de SEQ ID NO:12 y la V^h de SEQ ID NO:14; (c) Ab3 que comprende la V^l de SEQ ID n O:22 y la V^h de SEQ ID NO:24; (d) Ab4 que comprende la V^l de SEQ ID n O:32 y la V^h de SEQ ID NO:34; (e) Ab5 que comprende la V^l de SEQ ID n O:42 y la V^h de SEQ ID NO:44; (f) Ab6 que comprende la V^l de SEQ ID n O:52 y la V^h de SEQ ID NO:54; (g) Ab7 que comprende la V^l de SEQ ID n O:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (h) Ab8 que comprende la V^l de SEQ ID NO:52 y la V^h de SEQ ID NO:54; (i) Ab9 que comprende la V^l de SEQ ID NO:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (j) Ab10 que comprende la V^l de SEQ ID n O:72 y la V^h de SEQ ID NO:74; (k) Ab11 que comprende la V^l de SEQ ID No :82 y la V^h de SEQ ID NO:84; (l) Ab12 que comprende la V^l de SEQ ID NO:92 y la V^h de SEQ ID NO:94; (m) Ab13 que comprende la V^l de SEQ ID No :102 y la V^h de SEQ ID NO:104; y (n) Ab14 que comprende la V^l de SEQ ID NO:112 y la V^h de SEQ ID NO:114.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano para su uso según la presente invención comprende: (i) una cadena variable ligera (V^l) que comprende polipéptidos de la región determinante de complementariedad (CDR)1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:55, 56 y 57, respectivamente; y (ii) una cadena variable pesada (V^h) que comprende polipéptidos de CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:58, 59 y 60, respectivamente. El anticuerpo anti-CGRP humano o los fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento pueden comprender al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o las seis CDR contenidas en un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) Ab1 que comprende la V^l de SEQ ID NO:2 y la V^h de SEQ ID NO:4; (b) Ab2 que comprende la V^l de SEQ ID NO:12 y la V^h de SEQ iD NO:14; (c) Ab3 que comprende la V^l de SEQ ID NO:22 y la V^h de SEQ ID NO:24; (d) Ab4 que comprende la V^l de SEQ ID NO:32 y la V^h de SEQ ID NO:34; (e) Ab5 que comprende la V^l de SEQ ID NO:42 y la V^h de SeQ ID NO:44; (f) Ab6 que comprende la V^l de SEQ ID NO:52 y la V^h de SeQ ID NO:54; (g) Ab7 que comprende la V^l de SEQ ID NO:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (h) Ab8 que comprende la V^l de SEQ ID NO:52 y la V^h de SEQ ID NO:54; (i) Ab9 que comprende la V^l de SEQ ID NO:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (j) Ab10 que comprende la V^l de SEQ ID n O:72 y la V^h de SEQ ID NO:74; (k) Ab11 que comprende la V^l de SEQ ID No :82 y la V^h de SEQ ID NO:84; (l) Ab12 que comprende la V^l de SEQ ID NO:92 y la V^h de SEQ ID NO:94; (m) Ab13 que comprende la V^l de SEQ ID NO:102 y la V^h de SEQ ID NO:104; y (n) Ab14 que comprende la V^l de SEQ ID NO:112 y la V^h de SEQ ID NO:114.

El anticuerpo anti-CGRP humano o los fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento pueden tener una secuencia polipeptídica al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% , o al menos 99% idéntica a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) Ab1 que comprende la V^l de SeQ ID NO:2 y la V^h de SEQ ID NO:4; (b) Ab2 que comprende la V^l de SEQ ID NO:12 y la V^h de SEQ iD NO:14; (c) Ab3 que comprende la V^l de SEQ ID NO:22 y la V^h de SEQ ID NO:24; (d) Ab4 que comprende la V^l de SEQ ID NO:32 y la V^h de SEQ ID NO:34; (e) Ab5 que comprende la V^l de SEQ ID n O:42 y la V^h de SeQ ID NO:44; (f) Ab6 que comprende la V^l de SEQ ID NO:52 y la V^h de SEQ ID NO:54; (g) Ab7 que comprende la V^l de SEQ ID NO:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (h) Ab8 que comprende la V^l de SEQ ID NO:52 y la V^h de s Eq ID NO:54; (i) Ab9 que comprende la V^l de SEQ ID NO:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (j) Ab10 que comprende la V^l de SEQ ID NO:72 y la V^h de SEQ ID NO:74; (k) Ab11 que comprende la V^l de SEQ ID NO:82 y la V^h de SEQ ID NO:84; (l) Ab12 que comprende la V^l de SEQ ID NO:92 y la V^h de SEQ ID NO:94; (m) Ab13 que comprende la V^l de SEQ ID NO:102 y la V^h de SeQ ID NO:104; y (n) Ab14 que comprende la V^l de SEQ ID NO:112 y la V^h de SEQ ID NO:114.

El anticuerpo anti-CGRP humano o los fragmentos de anticuerpo descritos en este documento pueden comprender un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (a) Ab1 que comprende la V^l de SEQ ID NO:2 y la V^h de SEQ ID NO:4; (b) Ab2 que comprende la V^l de SEQ ID NO:12 y la V^h de SEQ ID NO:14; (c) Ab3 que comprende la V^l de SEQ ID NO:22 y la V^h de SEQ ID NO:24; (d) Ab4 que comprende la V^l de SEQ ID NO:32 y la V^h de SEQ ID NO:34; (e) Ab5 que comprende la V^l de SEQ ID NO:42 y la V^h de SEQ ID NO:44; (f) Ab6 que comprende la V^l de SEQ ID n O:52 y la V^h de SEQ ID NO:54; (g) Ab7 que comprende la V^l de SEQ ID n O:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (h) Ab8 que comprende la V^l de SEQ ID NO:52 y la V^h de SeQ ID NO:54; (i) Ab9 que comprende la V^l de SEQ ID NO:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (j) Ab10 que comprende la V^l de SEQ ID NO:72 y la V^h de SEQ ID NO:74; (k) Ab11 que comprende la V^l de SeQ ID NO:82 y la V^h de SEQ ID NO:84; (l) Ab12 que comprende la V^l de SEQ ID NO:92 y la V^h de SEQ ID NO:94; (m) Ab13 que comprende la V^l de SEQ iD NO:102 y la V^h de SEQ ID NO:104; y (n) Ab14 que comprende la V^l de s Eq ID n O:112 y la V^h de SEQ ID NO:114.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede comprender un anticuerpo humano, quimérico o humanizado. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano puede comprender un fragmento Fab, F(ab')², scFv, IgNar o MetMab u otro fragmento de anticuerpo monovalente.

La descripción proporciona una composición adecuada para su uso en un método como se describe en el presente documento, por ejemplo, como se indica en los párrafos anteriores, que puede comprender una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CGRP humano y un agente antidiabético o antiobesidad que no sea un anticuerpo anti-CGRP humano o un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo anti-CGRP humano o fragmento de anticuerpo puede ser uno de los descritos en el presente documento, por ejemplo, que puede unirse específicamente al mismo epítopo(s) lineal(es) o conformacional(es), puede competir por unirse al mismo epítopo(s) lineal(es) o conformacional(es) o solapante(s) en un polipéptido CGRP intacto o un fragmento del mismo, puede tener una secuencia polipeptídica al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos 99% idéntica a un anticuerpo anti-CGRP humano, o puede comprenderlo, seleccionado del grupo que consiste en (a) Ab1 que comprende la V^l de SEQ ID NO:2 y la V^h de SEQ ID NO:4; (b) Ab2 que comprende la V^l de SEQ ID NO:12 y la V^h de SEQ ID NO:14; (c) Ab3 que comprende la V^l de SEQ ID NO:22 y la V^h de SEQ ID NO:24; (d) Ab4 que comprende la V^l de SEQ ID NO:32 y la V^h de SEQ ID NO:34; (e) Ab5 que comprende la V^l de SEQ ID NO:42 y la V^h de SEQ ID NO:44; (f) Ab6 que comprende la V^l de SEQ ID n O:52 y la V^h de SEQ ID NO:54; (g) Ab7 que comprende la V^l de SEQ ID NO:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (h) Ab8 que comprende la V^l de SEQ ID n O:52 y la V^h de SEQ ID NO:54; (i) Ab9 que comprende la V^l de SEQ ID n O:62 y la V^h de SEQ ID NO:64; (j) Ab10 que comprende la V^l de SEQ ID n O:72 y la V^h de SEQ ID NO:74; (k) Ab11 que comprende la V^l de SEQ ID NO:82 y la V^h de SEQ ID NO:84; (l) Ab12 que comprende la V^l de SEQ ID NO:92 y la V^h de SEQ ID NO:94; (m) Ab13 que comprende la V^l de SEQ iD NO:102 y la V^h de SEQ ID NO:104; y (n) Ab14 que comprende la V^l de SEQ ID NO:112 y la V^h de SEQ ID NO:114.

Dicho agente antidiabético o antiobesidad comprende uno o más de amilina, agonista de amilina, sulfonilureas, calcitonina, glucagón, agonistas de PPAR-gamma, agonistas del receptor de GPL-1, inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV, análogos de amilina, biguanidas, agonistas del receptor de dopamina D2, meglitinidas, inhibidor de alfaglucosidasa, secuestrante de ácidos biliares antidislipidémico, exendina, análogo de exendina, agonista de exendina, péptido inhibidor de gastrina (GIP), péptido de incretina, insulina, inhibidor de SGLT2, un inhibidor de la reabsorción de glucosa, fenofibrato, fibrato, metformina, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo antigrelina, un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR)-1 (IlIb), FGFR-1 (IlIc), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y/o FGFR-4(IIIc), un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CD38 , un anticuerpo anti-MIC-1 o un fragmento de unión a MIC-1, o una combinación de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, dicho otro agente antidiabético o antiobesidad puede comprender metformina.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Figura 1A-D. Niveles de glucosa en sangre e insulina plasmática antes y después del tratamiento. Los resultados se expresan como la media ± PEE. ## p<0,01 frente al vehículo con ANOVA unidireccional prueba de Dunnett posthoc. A: La glucosa en sangre se midió tras haber ingerido alimento antes de los tratamientos, 18 horas después del tratamiento con vehículo, Ab14 y metformina y 42 horas después del tratamiento con vehículo y Ab14. B: La insulina plasmática se midió tras haber ingerido alimento antes de los tratamientos, 18 horas después del tratamiento con metformina y 42 horas después del tratamiento con vehículo y Ab14. C: HOMA-IR (índice de resistencia a la insulina = glucosa (mM) X insulina (pü/mL)/22,5) se calculó antes del tratamiento, 18 h después del tratamiento con metformina y 42 h después del tratamiento con vehículo y Ab14 D: La glucosa en sangre se midió en ayunas justo antes del pinzamiento (24 h después del tratamiento con metformina y 48 h después del tratamiento con vehículo y Ab14). Leyenda: Barra más a la izquierda en cada grupo, vehículo; barra central en cada grupo, tratamiento con Ab14; barra más a la derecha en cada grupo, tratamiento con metformina.

Figura 2A-C. Evolución de la tasa de infusión de glucosa durante el procedimiento de pinzamiento (A), media de glucosa en sangre durante el estado estacionario (B) y niveles de insulina plasmática al final del pinzamiento (C). Los resultados se expresan como la media ± PEE. A: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 frente al vehículo con un ANOVA bidireccional con prueba de Bonferroni post-hoc. Leyenda para la figura 2A: línea superior, tratamiento con metformina; línea intermedia, tratamiento con Ab14; línea inferior, tratamiento con vehículo (en el momento de 180 min). Leyenda para la figura 2B-2C: barra más a la izquierda en cada grupo, vehículo; barra central en cada grupo, tratamiento con Ab14; barra más a la derecha en cada grupo, tratamiento con metformina.

Figura 3. Flujo de glucosa medido. Los resultados se expresan como la media ± PEE. # p<0,05 frente al vehículo con un ANOVA unidireccional con la prueba Dunnett post-hoc. Los pinzamientos se realizaron en condiciones de ayuno de 6 horas. Se perfundieron 0,3 U/Kg/h de insulina y 3H-glucosa durante 180 minutos. Se calcularon los promedios de la tasa de infusión de glucosa, el recambio corporal total, la producción de glucosa hepática (HGP), la glucólisis y la síntesis de glucógeno entre 140 y 180 minutos correspondientes al estado estacionario. Leyenda: Barra más a la izquierda en cada grupo, vehículo; barra central en cada grupo, tratamiento con Ab14; barra más a la derecha en cada grupo, tratamiento con metformina.

Figura 4A-C. Utilización específica de glucosa en tejidos in vivo. Los resultados se expresan como la media ± PEE. # p<0,05, ## p<0,01 frente al vehículo con un ANOVA unidireccional con la prueba de Dunnett post-hoc. A: utilización de glucosa en tejido adiposo blanco del epidídimo (EWAT), tejido adiposo blanco inguinal (IWAT) y piel (como control negativo). B: utilización de glucosa en músculo vasto lateral (VL) mixto y músculo extensor largo de los dedos (EDL) glucolítico. C: utilización de glucosa en músculo sóleo oxidativo y vértice cardíaco. Leyenda: Barra más a la izquierda en cada grupo, vehículo; barra central en cada grupo, tratamiento con Ab14; barra más a la derecha en cada grupo, tratamiento con metformina.

Figura 5. Peso corporal promedio a lo largo del tiempo para animales alimentados con una dieta rica en fructosa y rica en grasas o animales de control alimentados con pienso normal. Leyenda: línea superior, dieta rica en grasas y rica en fructosa; línea inferior, pienso control.

Figura 6. Ganancia de peso corporal a lo largo del tiempo para los grupos de animales que se muestran en la figura 5. Línea superior: dieta rica en grasas y rica en fructosa; línea inferior: pienso control. Leyenda: línea superior, dieta rica en grasas y rica en fructosa; línea inferior, pienso control.

Figura 7. Ganancia de peso corporal a lo largo del tiempo para animales alimentados con una dieta rica en grasas después del tratamiento con Ab14 (10, 30 o 100 mg/kg) o metformina, así como animales tratados con vehículo y animales de control alimentados con pienso normal. El tratamiento se administró el día 0. Las líneas en el gráfico en orden de menor a mayor en el día 7 son: pienso normal (NC) más vehículo; dieta rica en grasas (HFD) más metformina; HFD más Ab1430 mg/kg; HFD más Ab14 10 mg/kg; HFD más vehículo; HFD más Ab14 100 mg/kg.

Figura 8A. La ingesta de alimentos para los animales mostrados en la figura 7. Las líneas en el gráfico en orden de menor a mayor en el día 7 son: dieta rica en grasas (HFD) más metformina; HFD más Ab1430 mg/kg; HFD más Ab14 10 mg/kg; HFD más Ab14 100 mg/kg; HFD más vehículo; pienso normal (NC) más vehículo.

Figura 8B. La ingesta acumulada de alimentos para los animales que se muestran en la figura 7. Leyenda: el orden de las barras de izquierda a derecha es: pienso normal (NC) más vehículo; dieta rica en grasas (HFD) más vehículo; HFD más Ab14 10 mg/kg; HFD más Ab1430 mg/kg; HFD más Ab14 100 mg/kg; HFD más metformina.

Figura 9. Glucosa en sangre en ayunas para animales alimentados con una dieta rica en grasas después del tratamiento con Ab14 (10, 30 o 100 mg/kg) o metformina, así como animales tratados con vehículo y animales de control alimentados con pienso normal. El tratamiento se administró el día 0. Leyenda: el orden de las barras de izquierda a derecha es como en la figura 8B.

Figura 10. Insulina plasmática en ayunas para animales alimentados con una dieta rica en grasas después del tratamiento con Ab14 (10, 30 o 100 mg/kg) o metformina, así como animales tratados con vehículo y animales de control alimentados con pienso normal. El tratamiento se administró el día 0. Leyenda: el orden de las barras de izquierda a derecha en cada grupo es como en la figura 8B.

Figura 11. Insulina plasmática (panel superior) y péptido C (paneles inferiores izquierdo y derecho) antes y durante el pinzamiento de glucosa realizado después de 15 días de tratamiento con Ab14 o metformina. Los animales fueron alimentados con una dieta rica en grasas durante 6 semanas antes del tratamiento. Leyenda: el orden de las barras de izquierda a derecha es como en la figura 8B.

Figura 12. HOMA-IR para animales alimentados con una dieta rica en grasas después del tratamiento con Ab14 (10, 30 o 100 mg/kg) o metformina, así como animales tratados con vehículo y animales de control alimentados con pienso normal. El tratamiento se administró el día 0. Leyenda: el orden de las barras de izquierda a derecha es como en la figura 8B.

Figura 13. Tasa de infusión de glucosa para un pinzamiento de glucosa realizada después de 15 días de tratamiento con Ab14 o metformina, así como animales tratados con vehículo y animales de control alimentados con pienso normal. Los animales fueron alimentados con una dieta rica en grasas durante 6 semanas antes del tratamiento. El pinzamiento de glucosa se realizó a dos tasas de infusión de insulina diferentes (5 mU/kg/min, el estado estacionario se alcanza aproximadamente a los 70-100 min, y 15 mU/kg/min, el estado estacionario se alcanza aproximadamente a los 170­ 210 min). Leyenda: marcadores circulares, pienso normal; marcadores cuadrados medianos, dieta rica en grasas (HFD) más vehículo; triángulos que apuntan hacia arriba, HFD más Ab14 10 mg/kg; triángulos que apuntan hacia abajo, HFD más Ab1430 mg/kg; rombos, HFD más Ab14 100 mg/kg; cuadrados grandes, HFD más metformina. Las barras de error que se muestran son la media más o menos PEE.

Figura 14. Tasa media de infusión de glucosa durante el estado estacionario para los experimentos de pinzamiento de glucosa que se muestran en la figura 13. Las tasas de infusión de glucosa se muestran para las tasas de infusión de insulina baja y alta (5 mU/kg/min, el estado estacionario se alcanza aproximadamente a los 70-100 min, y 15 mU/kg/min, el estado estacionario se alcanza aproximadamente a los 170-210 min). El orden de las barras en cada grupo es como en la figura 8B.

Figura 15. Los flujos medios de glucosa durante los experimentos de pinzamiento de glucosa que se muestran en la figura 13. Los resultados se muestran para la tasa de infusión de insulina más baja (5 mU/kg/min), el estado estacionario se alcanza a aproximadamente 70-100 minutos. Leyenda: el orden de las barras de izquierda a derecha en cada grupo es: dieta rica en grasas (HFD) más vehículo; HFD más Ab14 10 mg/kg; HFD más Ab1430 mg/kg; HFD más Ab14 100 mg/kg; HFD más metformina.

Figura 16. Los flujos medios de glucosa durante los experimentos de pinzamiento de glucosa que se muestran en la figura 13. Los resultados se muestran para la tasa de infusión de insulina más alta (15 mU/kg/min), el estado estacionario se alcanza a aproximadamente 170-210 minutos. Leyenda: el orden de las barras en cada grupo es como en la figura 15.

Figura 17. Perfiles toxicocinéticos medios de un anticuerpo anti-CGRP (específicamente, Ab6) después de una inyección en bolo i.v. en ratas macho Sprague-Dawley. La concentración plasmática a lo largo del tiempo se muestra durante 168 horas (7 días), apoyando la dosificación semanal como se realiza en los ejemplos a continuación. Leyenda: marcadores cuadrados, Ab14 10 mg/kg/semana; marcadores triangulares que apuntan hacia arriba, Ab14 30 mg/kg/semana; marcadores de rombos, Ab14 100 mg/kg/semana.

Figura 18A-D. HOMA-IR tras 6 horas de ayuno (A), glucosa en sangre (B), insulina plasmática (C) y peso corporal (D) en ratas ZDF de 8 semanas. Los resultados se expresan como media ± PEE. #p<0,05; ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). El orden de las barras (de izquierda a derecha) en las figuras 18A-D es: (1) ratas magras ZDF tratadas con vehículo 1 y vehículo 2; (2) ratas ZDF tratadas con vehículo 1 y vehículo 2; (3) ratas ZDF tratadas con Ab14 20 mg/kg/semana y vehículo 2; (4) ratas ZDF tratadas con Ab14 60 mg/kg/semana y vehículo 2; (5) ratas ZDF tratadas con vehículo 1 y metformina ("met") 200 mg/kg/día; (6) ratas ZDF tratadas con vehículo 1 y pioglitazona 10 mg/kg/día; (7) ratas z Df tratadas con Ab1420 mg/kg/semana y metformina 200 mg/kg/día; y (8) ratas ZDF tratadas con Ab1460 mg/kg/semana y metformina 200 mg/kg/día.

Figura 19A-B. Seguimiento del peso corporal (A) y del aumento de peso corporal (B). Los resultados se expresan como media ± PEE. $ p<0,05 (figura 19A: ratas tratadas con pioglitazona el día 8; ratas tratadas con Ab1460 mg/kg/semana metformina el día 28; figura 19B: ratas tratadas con Ab14 60 mg/kg/semana metformina los días 22 y 25); $$ p<0,01 (figura 19B: ratas tratadas con 60 mg/kg/semana de Ab14 metformina el día 28); $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (figura 19A: ratas tratadas con pioglitazona en todos los momentos entre los días 11-28; ratas magras ZDF tratadas con vehículo en todos los momentos de tiempo) (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 20A-B. Seguimiento de ingesta de alimentos (A) y consumo de alimentos acumulado (B). Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en la figura 20B es igual que en las figuras 18A-D. $ p<0,05 (figura 20A: ratas tratadas con pioglitazona en los días 20 y 22); $$ p<0,01 (figura 20A: ratas tratadas con pioglitazona en el día 15); $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (figura 20a: ratas magras ZDF tratadas con vehículo en todos los momentos) (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc). ## p<0,01 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney).

Figura 21A-D. Glucosa en sangre (A), insulina plasmática (B), HOMA-IR (C) y péptido C (D) en condiciones de ayuno de 6 horas (día 0) o durante la noche (días 12, 19, 26). Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en las figuras 21A-D es igual que en las figuras 18A-D. #p<0,05; ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 frente al vehículo ZDF (Kruskal-Wallis prueba de Dunn post-hoc). +p<0,01; frente al grupo de metformina y grupo de AB14 20 mg/kg metformina (ANOVA de 1 vía prueba de Newman-Keuls post-hoc). $p<0,05; $$ p<0,01 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 22. Niveles de fructosamina. Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en la figura 22 es igual que en las figuras 18A-D. ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). ** p<0,01 frente al vehículo ZDF (Kruskal-Wallis prueba de Dunn post-hoc). $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (a No VA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 23. Niveles de HbA1c. Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en la figura 23 es igual que en las figuras 18A-D. ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). *** p<0,001 frente al vehículo ZDF (Kruskal-Wallis prueba de Dunn post-hoc). p<0,05; frente al grupo AB1460 mg/kg (ANOVA de 1 vía prueba de Newman-Keuls post-hoc). $p<0,05; $$ p<0,01; $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 24A-B. Niveles plasmáticos de triglicéridos (A) y ácidos grasos libres (B) en condiciones de ayuno de 6 horas (día 0) o durante la noche (días 12, 19 y 26). Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en las figuras 24A-D es igual que en las figuras 18A-D. ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 frente al vehículo ZDF (Kruskal-Wallis prueba de Dunn post-hoc). p<0,05; +p<0,01; ++ p<0,001 frente al grupo con metformina o grupo con Ab1460 mg/kg metformina (ANOVA de 1 vía prueba de Newman-Keuls post-hoc). $p<0,05; $$ p<0,01; $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 25A-C. Niveles plasmáticos de colesterol total (A), colesterol HDL (B) y colesterol no HDL (C). Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en las figuras 25A-C es igual que en las figuras 18A-D. #p<0,05; ##p<0,01; ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 1 vía prueba de Dunnett post-hoc). p<0,05; + p<0,01 frente al grupo de metformina o grupos de Ab14 metformina (ANOVA de 1 vía prueba de Newman-Keuls post-hoc). $$ p<0,01 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 26A-C. Niveles plasmáticos de colesterol total (A), colesterol HDL (B) y colesterol no HDL (C) en relación con el día 0. Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en las figuras 26A-C es igual que en las figuras 18A-D. #p<0,05; ##p<0,01; ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (prueba de la t no apareada). * p<0,05; ** p<0,01 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 1 vía prueba de Dunnett post-hoc). p<0,05; vs grupo de metformina (ANOVA de 1 vía prueba de Newman-Keuls post-hoc). $p<0,05; $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 27A-C. Prueba de tolerancia oral a la glucosa el día 26 en condiciones de ayuno nocturno (A), área bajo la curva (“area under the curve”, AUC) calculada a partir de la glucosa en sangre medida en T0 (B) y calculada a partir del valor relativo frente a T0 (C). Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en las figuras 27B-C es igual que en las figuras 18A-D. $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc) (figura 27A: se muestran todos los momentos para ratas magras ZDF tratadas con vehículo y ratas tratadas con pioglitazona). ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). *** p<0,001 frente al vehículo ZDF (Kruskal-Wallis prueba de Dunn post-hoc).

Figura 28A-B. Niveles plasmáticos de insulina (A) y péptido C (B) durante la prueba de tolerancia oral a la glucosa el día 26. Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en las figuras 28A-B es igual que en las figuras 18A-D. ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). * p<0,05 frente al vehículo ZDF (Kruskal-Wallis prueba de Dunn post-hoc). $$ p<0,01; $$$ p<0,001 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 29A-B. Expresión relativa a partir de T-60 de los niveles de insulina plasmática (A) y péptido C (B) durante la prueba de tolerancia oral a la glucosa el día 26. Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras en cada grupo en las figuras 29A-B es igual que en las figuras 18A-D. #p<0,05; ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). * p<0,05 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 1 vía prueba de Dunnett post-hoc). p<0,05; vs grupo de metformina (ANOVA de 1 vía prueba de Newman-Keuls post-hoc). $p<0,05; $$ p<0,01 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc).

Figura 30A-C. Contenido pancreático: proinsulina (A), insulina (B) y proporción de proinsulina/insulina (C). Los resultados se expresan como media ± PEE. El orden de las barras (de izquierda a derecha) en las figuras 30A-C es: ratas magras ZDF tratadas con vehículo 1 y vehículo 2; ratas ZDF tratadas con vehículo 1 y vehículo 2; ratas ZDF tratadas con Ab14 60 mg/kg/semana y vehículo 2; ratas ZDF tratadas con vehículo 1 y metformina 200 mg/kg/día; y ratas ZDF tratadas con Ab1460 mg/kg/semana y metformina 200 mg/kg/día. #p<0,05; ### p<0,001 frente al vehículo ZDF (Mann Whitney). * p<0,05 frente al vehículo ZDF (ANOVA de 1 vía prueba de Newman-Keuls post-hoc).

Figura 31. Análisis inmunohistoquímico del páncreas: cuantificación del marcaje de insulina. El orden de las barras (de izquierda a derecha) en la figura 31 es: ratas magras ZDF tratadas con vehículo 1 y vehículo 2; ratas ZDF tratadas con vehículo 1 y vehículo 2; ratas ZDF tratadas con Ab14 60 mg/kg/semana y vehículo 2; ratas ZDF tratadas con vehículo 1 y metformina 200 mg/kg/día; y ratas ZDF tratadas con Ab1460 mg/kg/semana y metformina 200 mg/kg/día.

Descripción detallada

La presente invención está definida por las reivindicaciones.

Los presentes inventores descubrieron que los anticuerpos anti-CGRP producían una utilización de glucosa significativamente mayor en el músculo periférico en comparación con la metformina, sin ningún aumento aparente en la tasa de utilización de glucosa en el tejido adiposo blanco. Además, los anticuerpos anti-CGRP descritos en este documento aumentaron la utilización de glucosa en el corazón, mientras que la metformina produjo una disminución en la tasa de utilización de glucosa en el corazón. Además, los anticuerpos anti-CGRP descritos en este documento inhibieron la producción de glucosa hepática, de manera similar al efecto obtenido con la administración de metformina.

El anticuerpo anti-CGRP, Ab14, que es un potente antagonista funcional, se evaluó en modelos animales preclínicos de metabolismo de glucosa normal y alterado para determinar sus efectos sobre la sensibilidad a la insulina y el control glucémico en ratas normales (ejemplo 1), en ratas obesas inducidas por una dieta hiperinsulinémica pero normoglucémica (DIO) que habían sido alimentadas con una dieta rica en grasas/rica en fructosa durante seis semanas para inducir el síndrome metabólico (ejemplo 2), y en ratas grasas diabéticas Zucker (ZDF) que estaban progresando desde un estado prediabético (hiperinsulinémico, normoglucémico) a un estado diabético sintomático (hipoinsulinémico, hiperglucémico) (ejemplo 3).

En el ejemplo 1, se realizó un estudio de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico con Ab14 para determinar sus efectos sobre la sensibilidad a la insulina corporal, así como en la sensibilidad a la insulina específica de tejido en ratas normales que son normoglucémicas, normoinsulinémicas y tienen sensibilidades normales a la insulina específicas de tejido y corporal. Ab14 se administró por vía intravenosa como una sola administración de 100 mg/kg a ratas normales 48 horas antes de un procedimiento de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico. Los resultados de la evaluación de los niveles de glucosa e insulina en plasma medidos justo antes del procedimiento de pinzamiento indicaron que Ab14 redujo los niveles de insulina en plasma en relación con los controles tratados con vehículo sin alterar los niveles de glucosa en plasma. Las reducciones resultantes en HOMA-IR indicaron mejoras en la sensibilidad a la insulina corporal.

El procedimiento de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico confirmó esta mejora en la sensibilidad a la insulina corporal por el antagonismo de CGRP, en el que, en estado estacionario, tanto la tasa de infusión de glucosa como la tasa de renovación (utilización) de glucosa corporal fueron elevadas en relación con los controles tratados con vehículo. El aumento de la tasa de infusión de glucosa y el recambio de glucosa corporal con una infusión constante de insulina fue indicativo de una mayor sensibilidad a la insulina corporal.

En coherencia con el aumento en la tasa de infusión de glucosa y el recambio de glucosa corporal, Ab14 aumentó la utilización de glucosa hepática para la glucólisis y la síntesis de glucógeno en relación con los controles tratados con vehículo y se redujo la producción de glucosa hepática. Estas observaciones son indicativas de una mayor sensibilidad a la insulina hepática por el antagonismo de CGRP que da como resultado una mayor utilización hepática del mayor suministro de glucosa internalizada tanto para la generación de energía como para el almacenamiento, mientras que al mismo tiempo inhibe la producción de glucosa hepática de novo.

El antagonismo de CGRP también aumentó la utilización de glucosa en el músculo esquelético glucolítico y oxidativo (vasto lateral, indicativo de glucolítico más oxidativo mixto; extensor largo de los dedos, indicativo de glucolítico, y sóleo, indicativo de oxidativo). Los mayores aumentos en la utilización de glucosa se produjeron en el vasto lateral metabólico mixto. Estas observaciones son indicativas de una mayor sensibilidad a la insulina del músculo esquelético causada por el antagonismo de CGRP. El antagonismo de CGRP también aumentó la utilización de glucosa cardíaca. Por contraste, las tasas de utilización de glucosa en los depósitos de grasa visceral o subcutánea no se vieron afectadas, lo que sugiere que el antagonismo de CGRP no aumentó sustancialmente la sensibilidad a la insulina en el tejido adiposo blanco.

Tal como se mencionó anteriormente, los animales utilizados en este estudio eran ratas normoglucémicas con sensibilidades normales a la insulina corporal y específicas de tejido, lo que hace que las mejoras en la sensibilidad a la insulina en estos animales sean más difíciles de demostrar. Por lo tanto, aunque las mejoras en algunos de los criterios de valoración individuales evaluados en este estudio no alcanzaron significancia estadística, la observación de que tendieron en la misma dirección que los que sí lo hicieron sugiere que una mayor potencia del estudio permitiría que otros parámetros medidos alcanzaran significancia estadística. Además, dado que en general hay un alto grado de traslación de los resultados de los estudios de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico realizados en animales de experimentación a estudios de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico realizados en el entorno clínico, estas observaciones sugieren el potencial del antagonismo de CGRP para mejorar la sensibilidad a la insulina específica de tejido y corporal en seres humanos.

En el ejemplo 2, los efectos del antagonismo de CGRP mediante la administración crónica de Ab14 sobre la sensibilidad a la insulina hepática y periférica en animales resistentes a la insulina se evaluaron en ratas que se convirtieron en hiperinsulinémicas y resistentes a la insulina, pero no hiperglucémicas, mediante una alimentación prolongada con una dieta rica en grasas/rica en fructosa. Se alimentó a las ratas con una dieta que contenía 69% de grasa y 14% de fructosa durante siete semanas antes del inicio de la administración del compuesto para inducir el síndrome metabólico. Al final del período de tratamiento de dieta de siete semanas, las ratas continuaron recibiendo la dieta rica en grasas/rica en fructosa y, además, recibieron Ab14 por vía intravenosa en dosis de 0 mg/kg (vehículo), 10 mg/kg, 30 mg/kg o 100 mg/kg una vez a la semana durante 2 semanas.

En comparación con el grupo de control tratado con vehículo y alimentado con una dieta rica en grasas, el antagonismo de CGRP no tuvo efecto sobre el consumo de alimentos o el peso corporal, lo que indica que los efectos del antagonismo de CGRP sobre los parámetros adicionales evaluados a continuación no fueron el resultado de la restricción calórica o la pérdida de peso.

Al final del período de tratamiento, todas las dosis de Ab14 redujeron el HOMA-IR en relación con los controles tratados con vehículo, lo que indica mejoras en la sensibilidad a la insulina corporal. Esta reducción en HOMA-IR se debió principalmente a una reducción en los niveles de insulina en plasma, que se produjo en todas las dosis de Ab14. La reducción de la insulina plasmática fue el resultado de una menor producción de insulina en lugar de una mayor degradación de la insulina, ya que el péptido C plasmático, un subproducto de la síntesis de insulina pancreática, se redujo en paralelo a la reducción de la insulina plasmática. Los niveles de glucosa en plasma solo se redujeron ligeramente con las dos dosis más bajas de Ab14, pero se redujeron sustancialmente en relación con los controles tratados con vehículo con la dosis de 100 mg/kg de Ab14.

Inmediatamente después del último día de tratamiento, se realizó un procedimiento de pinzamiento hiperinsulinémicoeuglucémico de dos etapas usando primero una infusión de una cantidad fisiológica de insulina y segundo una concentración de insulina suprafisiológica. Las tres dosis de Ab14 aumentaron la tasa de infusión de glucosa en estado estacionario en relación con los controles tratados con vehículo después de concentraciones de infusión de insulina tanto fisiológicas como suprafisiológicas. Esto es coherente con una mejora en la sensibilidad a la insulina corporal. Las tres dosis de Ab14 también aumentaron las tasas de recambio (utilización) de glucosa corporal, aumentaron la utilización de glucosa hepática para la glucólisis y la síntesis de glucógeno e inhibieron la producción de glucosa hepática en relación con los controles tratados con vehículo después de la infusión de concentraciones fisiológicas de insulina, lo que concuerda con las mejoras en la sensibilidad a la insulina corporal y hepática. La producción de glucosa hepática también se evitó por completo después de la infusión de concentraciones de insulina suprafisiológicas.

Las similitudes entre los efectos agudos del antagonismo de CGRP en ratas normales (ejemplo 1) y sus efectos crónicos en ratas normoglucémicas, hiperinsulinémicas, resistentes a la insulina (ejemplo 2) indican la capacidad del antagonismo de CGRP para funcionar crónicamente para tratar la resistencia a la insulina establecida. Además, como se mencionó anteriormente, dado que en general hay un alto grado de traslación de los resultados de los estudios de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico realizados en animales de experimentación a estudios de pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico realizados en el entorno clínico, estas observaciones sugieren el potencial del antagonismo de CGRP para mejorar la sensibilidad a la insulina corporal y específica de tejido en seres humanos resistentes a la insulina con prediabetes o síndrome metabólico. Finalmente, la capacidad del antagonismo de CGRP para reducir los niveles de glucosa en plasma en estos animales normoglucémicos, aunque solo a la dosis más alta evaluada, sugiere el potencial del antagonismo de CGRP para reducir también los niveles de glucosa en plasma en pacientes hiperglucémicos.

En el ejemplo 3, se evaluaron los efectos de la administración crónica de Ab14 sobre el control de la glucosa en ratas ZDF que progresaban desde un estado prediabético (hiperinsulinémico, normoglucémico) a un estado diabético sintomático (hipoinsulinémico, hiperglucémico). Estos animales desarrollan prediabetes, caracterizada por hiperinsulinemia marcada para compensar el desarrollo de resistencia a la insulina, pero con poca o ninguna hiperglucemia, a las siete semanas de edad. Esto progresa rápidamente a diabetes sintomática, caracterizada por hipoinsulinemia, como resultado de la insuficiencia de las células beta pancreáticas, e hiperglucemia marcada a las 10-12 semanas de edad.

A las 8 semanas de edad, las ratas ZDF se seleccionaron según su HOMA-IR y se trataron con Ab14 a 20 o 60 mg/kg una vez a la semana durante 28 días. Además de evaluar las acciones del antagonista de CGRP Ab14 sobre el control glucémico en este modelo animal, también se evaluaron los efectos del antagonismo de CGRP en combinación con el fármaco comercializado metformina (200 mg/kg/día). La metformina sola produjo una prevención parcial del aumento de la glucosa en sangre en ayunas, una prevención parcial de la reducción de los niveles de insulina y péptido C en plasma, una prevención completa de la reducción de los niveles de proinsulina pancreática, una prevención parcial de la reducción de los niveles de insulina pancreática , y una reducción en la vacuolización, hiperplasia y fibrosis de los islotes pancreáticos que fueron de magnitudes similares a las descritas anteriormente para la dosis alta de Ab14. Sin embargo, la combinación de Ab14 y metformina produjo una prevención sustancialmente mayor del aumento de la glucosa en sangre en ayunas, la reducción de los niveles plasmáticos de insulina y péptido C, la reducción de los niveles de proinsulina e insulina pancreática y la reducción de la fibrosis de los islotes pancreáticos que cualquiera de los compuestos por sí solos. Esto sugiere que los efectos de la metformina pueden verse potenciados por un antagonista de CGRP como Ab14.

Además, la combinación de Ab14 y metformina produjo una reducción sustancial de los niveles de HbA1 c (un marcador de la glucación de la hemoglobina) y, en menor medida, una reducción de los niveles de fructosamina (un marcador de la glucación de la albúmina plasmática) en relación con los controles tratados con vehículo después de 28 días de tratamiento Esto es coherente con la mayor reducción de los niveles de glucosa en plasma producida por la combinación de Ab14 más metformina que con cualquiera de los agentes por sí solos. Estos resultados sugieren que la combinación de un antagonista de CGRP y metformina puede afectar favorablemente las complicaciones diabéticas mediadas por hiperglucemia.

De manera similar, la combinación de la dosis alta de Ab14 con metformina mostró una mejora en la excursión de glucosa y el AUC de glucosa en relación con los animales tratados con vehículo después de la administración del bolo de glucosa durante una prueba de tolerancia oral a la glucosa (“oral glucose tolerance test”, oGTT) realizada el día 26 del estudio. Además, debido a que, para el día 26 del estudio, la destrucción de las células beta en estos animales había progresado más allá del punto de su capacidad para aumentar la secreción de insulina en respuesta a una exposición a la glucosa, se espera que podría haberse observado una mejora aún más sustancial en la excursión de glucosa y el AUC de la glucosa con la combinación de Ab14 más metformina si la oGTT se hubiera realizado dos semanas antes o en otro momento antes de la destrucción completa de las células beta.

La rata ZDF utilizada en el ejemplo 3 es un modelo muy grave de progresión de la diabetes que avanza rápidamente desde un estado prediabético resistente a la insulina hasta una diabetes sintomática con una destrucción completa de las células beta en un transcurso de solo unas pocas semanas. Esto limita la oportunidad de evaluar las modulaciones de la progresión de la enfermedad, lo que hace que las mejoras relacionadas con los compuestos en la progresión de la enfermedad y la protección de las células beta sean difíciles de demostrar en estos animales. Por lo tanto, cualquier demostración de un retraso modesto en la progresión de la enfermedad por parte del antagonista de CGRP Ab14, como se describió anteriormente, sugiere el potencial de afectar también la progresión de la enfermedad en la clínica. Además, la capacidad de mejorar la eficacia general del tratamiento a través de la combinación del antagonismo de CGRP con metformina también respalda la mejora de la eficacia de la terapia combinada en la clínica.

Los resultados de los ejemplos presentados en esta solicitud indican que el antagonismo de CGRP tiene la capacidad de mejorar la sensibilidad a la insulina corporal, la sensibilidad a la insulina hepática y la sensibilidad a la insulina del músculo esquelético. Estas mejoras se pueden observar de forma aguda o crónica en animales normales que son normoinsulinémicos y normoglucémicos y tienen una sensibilidad normal a la insulina, así como en animales resistentes a la insulina que son hiperinsulinémicos, pero aún no hiperglucémicos. Estos resultados indican que el antagonismo de CGRP debería disminuir la resistencia a la insulina que se presenta en pacientes con síndrome metabólico, prediabetes u otras afecciones prediabéticas y además que el antagonismo de CGRP puede ser capaz de frenar la progresión de estas enfermedades a una diabetes sintomática.

Además, la capacidad del antagonista de CGRP Ab14 para reducir la hiperinsulinemia presente en animales resistentes a la insulina al reducir la secreción pancreática de insulina sugiere que Ab14 puede tener un efecto de conservación de células beta pancreáticas al permitir que el páncreas de un animal resistente a la insulina descanse. Esto puede retrasar aún más la progresión del síndrome metabólico, la prediabetes y otras afecciones prediabéticas a una diabetes sintomática en la clínica.

Además, la capacidad de Ab14 para reducir los niveles de glucosa en plasma en ratas hiperinsulinémicas pero normoglucémicas resistentes a la insulina y para frenar la progresión de la prediabetes a una diabetes sintomática en ratas ZDF y para mantener una reducción de los niveles de glucosa en plasma en animales con diabetes sintomática que tienen poco a ninguna capacidad residual para aumentar la producción de insulina indica que el antagonismo de CGRP puede tener la capacidad de afectar a la progresión de la enfermedad no solo en los estados prediabéticos descritos anteriormente sino también en la diabetes sintomática.

Por lo tanto, tomados en conjunto, los resultados de estos estudios indican claramente que un antagonista de CGRP como Ab14 puede afectar favorablemente a la resistencia a la insulina y al control anómalo de la glucosa en un entorno clínico tanto en pacientes con afecciones prediabéticas como en pacientes con diabetes sintomática o en desarrollo.

Finalmente, la capacidad del antagonista de CGRP Ab14 para mejorar las acciones de la metformina en la rata ZDF sugiere que una terapia combinada de Ab14-metformina tiene el potencial de tener una eficacia clínica superior en relación con Ab14 o metformina por sí solos para el tratamiento de pacientes con afecciones prediabéticas, pacientes con diabetes en desarrollo y pacientes con diabetes sintomática.

Definiciones

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos, las líneas celulares, las especies o géneros animales y los reactivos particulares descritos, ya que pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Tal como se usan en el presente documento, las formas en singular "un/una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Todos las expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención, a menos que se indique claramente lo contrario.

Péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP): Tal como se usa en el presente documento, CGRP abarca no solo las siguientes secuencias de aminoácidos de CGRP-alfa de Homo sapiens y CGRP-beta de Homo sapiens disponibles de American Peptides (Sunnyvale CA) y Bachem (Torrance, CA):

CGRP-alfa: ACDTTCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH² (SEQ ID NO:281), en la que la fenilalanina N-terminal está amidada. Excepto cuando se indique lo contrario, en general, las referencias a "CGRP" generalmente se refieren a CGRP-alfa. CGRP-alfa se denomina indistintamente como aCGRP o a-CGRP.

CGRP-beta: ACNTTCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH² (SEQ ID NO:282), en la que la fenilalanina N-terminal está amidada; pero también cualquier forma unida a la membrana de estas secuencias de aminoácidos de CGRP, así como mutantes (muteínas), variantes de corte y empalme, isoformas, ortólogos, homólogos y variantes de esta secuencia. CGRP-beta se denomina indistintamente pCGRP o p-CGRP.

Normoglucemia: En la presente descripción, los términos normoglucemia o euglucemia se refieren al estado de tener una concentración normal de glucosa en sangre. Una concentración de glucosa en sangre normal a modo de ejemplo en seres humanos está entre 70 mg/dl y 99 mg/dl en adultos en ayunas, y entre 70 mg/dl y 140 mg/dl en adultos posprandiales. La normoglucemia sostenida se refiere al mantenimiento de la normoglucemia durante un período extenso de tiempo, por ejemplo, al menos un día, al menos dos días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos un mes o más.

Apareamiento de especies de levadura competentes: En la presente memoria descriptiva, esta expresión abarca ampliamente cualquier levadura diploide o tetraploide que pueda desarrollarse en cultivo. Tales especies de levadura pueden existir en forma haploide, diploide u otra forma poliploide. Las células de una ploidía dada, en condiciones apropiadas, pueden proliferar durante un número indefinido de generaciones en esa forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede dar como resultado cepas tetraploides a través de un posterior apareamiento o fusión de cepas diploides. La presente memoria descriptiva contempla el uso de levaduras haploides, así como células de levadura diploides u otras células de levadura poliploides producidas, por ejemplo, por apareamiento o fusión de esferoplastos.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, la levadura competente para el apareamiento es un miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; y Zygosaccharomyces. Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la memoria descriptiva incluyen Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasidium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidiella.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, la levadura competente para el apareamiento es un miembro del género Pichia. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, la levadura competente para el apareamiento del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica, y Hansenula polymorpha (Pichia angusta). En un ejemplo de la memoria descriptiva, la levadura competente para el apareamiento del género Pichia es la especie Pichia pastoris.

Célula de levadura haploide: Una célula que tiene una sola copia de cada gen de su complemento genómico (cromosómico) normal.

Célula de levadura poliploide: Una célula que tiene más de una copia de su complemento genómico (cromosómico) normal.

Célula de levadura diploide: Célula que tiene dos copias (alelos) de prácticamente todos los genes de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.

Célula de levadura tetraploide: Célula que tiene cuatro copias (alelos) de prácticamente todos los genes de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Los tetraploides pueden portar dos, tres, cuatro o más módulos de expresión diferentes. Estos tetraploides pueden obtenerse en S. cerevisiae por apareamiento selectivo de diploides homocigóticos heterotálicos a/a y alfa/alfa y en Pichia por apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos. Por ejemplo, un haploide [met his] se puede aparear con un haploide [ade his] para obtener un diploide [his]; y un haploide [met arg] puede aparearse con un haploide [ade arg] para obtener un diploide [arg]; luego el diploide [his] x diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide. Los expertos en la técnica entenderán que la referencia a los beneficios y usos de las células diploides también puede aplicarse a las células tetraploides.

Apareamiento de levaduras: El proceso por el cual dos células de levadura haploides se fusionan naturalmente para formar una célula de levadura diploide.

Mitosis: El proceso por el cual una célula de levadura diploide experimenta una división reductora para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede entonces germinar y formar una línea celular de crecimiento vegetativo haploide.

Marcador seleccionable: Un marcador seleccionable es un gen o fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) a una célula que recibe ese gen, por ejemplo, a través de un acontecimiento de transformación. El marcador seleccionable permite que la célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo en condiciones en las que las células que no reciben ese gen marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionables generalmente se dividen en varios tipos, incluidos los genes marcadores seleccionables positivos, tales como un gen que confiere a una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, o temperatura, cuando se cruzan dos mutantes sensibles a la temperatura ("ts") o se transforma un mutante ts; genes marcadores seleccionables negativos, tales como un gen biosintético que confiere a una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico que necesitan todas las células que no tienen ese gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que confiere a una célula la incapacidad de crecer por células que no tienen el gen de tipo salvaje; y similares. Los marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a los siguientes: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; y similares.

Vector de expresión: Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteína extraña dentro de la célula huésped diana. Convenientemente, la manipulación de secuencias y la producción de ADN para la transformación se realiza primero en un huésped bacteriano, por ejemplo, E. coli, y normalmente los vectores incluirán secuencias para facilitar tales manipulaciones, incluido un origen de replicación bacteriano y un marcador de selección bacteriano apropiado. Los marcadores de selección codifican las proteínas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de las células huésped transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes cruciales que no están disponibles en medios complejos. Se describen ejemplos de vectores y métodos para la transformación de levaduras, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D. y Stearns, T. (2000), "Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course", Plainview, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Los vectores de expresión para usar en los métodos de la memoria descriptiva incluirán además secuencias específicas de levadura, incluido un marcador auxotrófico o de fármaco seleccionable para identificar cepas de levadura transformadas. Puede usarse además un marcador de fármaco para amplificar el número de copias del vector en una célula huésped de levadura.

La secuencia de codificación del polipéptido de interés está unida operativamente a secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales que proporcionan la expresión del polipéptido en células de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir, entre otros, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También pueden incluirse secuencias para la secreción del polipéptido, por ejemplo, una secuencia señal, y similares. Un origen de replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión a menudo se integran en el genoma de la levadura. En un ejemplo de la memoria descriptiva, el polipéptido de interés se une operativamente, o se fusiona, a secuencias que proporcionan una secreción optimizada del polipéptido a partir de células diploides de levadura.

Los ácidos nucleicos están "unidos operativamente" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia señal está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un conductor de la secreción, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra mediante acoplamiento en sitios de restricción convenientes o, como alternativa, mediante un método de PCR/recombinación que es conocido para los expertos en la técnica (Gateway® Tecnología; Invitrogen, Carlsbad California). Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y traducción de secuencias de ácidos nucleicos particulares a las que están unidos operativamente. Dichos promotores se dividen en varias clases: promotores inducibles, constitutivos y reprimibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor). Los promotores inducibles pueden iniciar mayores niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.

El fragmento del promotor de levadura también puede actuar como sitio para la recombinación homóloga y la integración del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de la levadura; como alternativa, se usa un marcador seleccionable como sitio para la recombinación homóloga. La transformación de Pichia se describe en Cregg et a l, Mol. Cell. Biol., 5:3376-3385, 1985.

Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el AOX1 y el promotor (Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 9:1316-1323, (1989)); promotor ICL1 (Menéndez et al., Yeast, 20(13):1097-108, (2003)); promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et a l, Gene, 186(1):37-44 (1997)); y promotor FLD1 (Shen et al., Gene, 216 (1): 93-102 (1998)). El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores AOX y FLD1 son inducibles.

Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk y promotores quiméricos derivados de los mismos. Además, pueden usarse promotores que no sean levaduras en la memoria descriptiva, tales como promotores de mamíferos, insectos, plantas, reptiles, anfibios, virus y aves. Más típicamente, el promotor comprenderá un promotor de mamífero (potencialmente endógeno a los genes expresados) o comprenderá un promotor viral o de levadura que proporciona una transcripción eficaz en sistemas de levadura.

Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de ruptura específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte de la secuencia codificante del polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una secuencia que es reconocida y procesada a través de una de las vías convencionales disponibles dentro de la célula huésped. La señal pre-pro del factor alfa de S. cerevisiae ha demostrado ser eficaz en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias señal de levadura incluyen la secuencia señal del factor de apareamiento alfa, la secuencia señal de invertasa y las secuencias señal derivadas de otros polipéptidos de levadura secretados. Además, estas secuencias de péptidos señal pueden diseñarse para proporcionar una secreción mejorada en sistemas de expresión de levaduras diploides. Otras señales de secreción de interés también incluyen secuencias señal de mamíferos, que pueden ser heterólogas a la proteína que se secreta, o pueden ser una secuencia nativa para la proteína que se secreta. Las secuencias señal incluyen secuencias de prepéptido y, en algunos casos, pueden incluir secuencias de propéptido. Muchas de estas secuencias señal se conocen en la técnica, incluidas las secuencias señal que se encuentran en las cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias señal de albúmina sérica humana, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana y similares. Por ejemplo, ver Hashimoto et al., Protein Eng., 11 (2), 75 (1998); y Kobayashi et a l, Therapeutic Apheresis, 2(4), 257 (1998).

La transcripción se puede aumentar insertando una secuencia activadora de la transcripción en el vector. Estos activadores son elementos de ADN que actúan en cis, generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de la transcripción son relativamente independientes de la orientación y la posición, y se han encontrado en 5' y 3' de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificante. El potenciador se puede cortar y empalmar en el vector de expresión en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante, pero preferiblemente está ubicado en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión usados en células huésped eucarióticas también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles desde 3' hasta el codón de terminación de la traducción, en regiones no traducidas de ADN o ADNc eucariótico o viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de acoplamiento o métodos de PCR/recombinación convencionales. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se cortan, se adaptan y se vuelven a acoplar en la forma deseada para generar los plásmidos necesarios o mediante métodos de recombinación. Para que el análisis confirme las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de acoplamiento se utilizan para transformar las células huésped, y los transformantes correctos se seleccionan por su resistencia a antibióticos (por ejemplo, ampicilina o zeocina), según corresponda. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes , se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian.

Como alternativa a la restricción y acoplamiento de fragmentos, pueden usarse métodos de recombinación basados en sitios att y enzimas de recombinación para insertar secuencias de ADN en un vector. Tales métodos se describen, por ejemplo, por Landy, Ann. Rev. Biochem., 58:913-949 (1989); y son conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos utilizan la recombinación de ADN intermolecular mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificadas por lambda y E. coli. La recombinación se produce entre sitios de unión (aff) específicos en las moléculas de ADN que interactúan. Para obtener una descripción de los sitios att, véase Weisberg y Landy (1983), "Site-specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda ¡!\ Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, Nueva York, Cold Spring Harbor Press), págs. 211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se intercambian, de modo que después de la recombinación, los sitios att son secuencias híbridas compuestas por secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación puede producirse entre ADN de cualquier topología.

Los sitios att pueden introducirse en una secuencia de interés acoplando la secuencia de interés en un vector apropiado; generando un producto de PCR que contenga sitios B att mediante el uso de cebadores específicos; generando una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contiene sitios att; y similares.

Plegamiento, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, en la que las interacciones entre los restos aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Si bien las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, normalmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intramoleculares y/o intermoleculares formados por dos restos cisteína. Para proteínas y polipéptidos naturales o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento adecuado suele ser la disposición que da como resultado una actividad biológica óptima, y puede controlarse convenientemente mediante ensayos de actividad, por ejemplo, unión de ligandos, actividad enzimática, etc.

En algunos casos, por ejemplo, cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en la actividad biológica serán menos significativos. El plegamiento apropiado de tales moléculas puede determinarse basándose en las propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios en modelos y similares.

El huésped de expresión puede modificarse aún más mediante la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que mejoran el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, concretamente, foldasas, chaperoninas, etc. Tales secuencias pueden expresarse de manera constitutiva o inducible en la célula huésped de levadura, usando vectores, marcadores, etc., como se conoce en la técnica. Preferiblemente, las secuencias, incluidos los elementos reguladores de la transcripción suficientes para el patrón de expresión deseado, se integran de forma estable en el genoma de la levadura a través de una metodología dirigida.

Por ejemplo, el PDI eucariótico no solo es un catalizador eficaz de la oxidación de las cisteínas de proteínas y la isomerización de enlaces disulfuro, sino que también muestra actividad de chaperona. La coexpresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples enlaces disulfuro. También es de interés la expresión de BIP (proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina); ciclofilina; y similares. En un ejemplo de la memoria descriptiva, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, por ejemplo, una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de las mismas.

Las expresiones "proteína deseada” o "anticuerpo deseado” se usan indistintamente y se refieren generalmente a un anticuerpo original específico para una diana, es decir, CGRP o un anticuerpo quimérico o humanizado o una porción de unión del mismo derivada de este como se describe en este documento. El término "anticuerpo" pretende incluir cualquier estructura molecular que contenga una cadena polipeptídica con una forma específica que se adapte y reconozca un epítopo, en la que una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo, seres humanos, roedores, conejos, vacas, ovejas, cerdos, perros, otros mamíferos, pollos, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente para producir anticuerpos útiles como material de partida según la memoria descriptiva son los conejos. Se han descrito numerosas secuencias codificantes de anticuerpos; y otras pueden generarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos de mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios (tal como scFv), cuerpos de camélidos, nanocuerpos, IgNAR (anticuerpos monocatenarios derivados de tiburones), inmunofármacos modulares pequeños (SMIP) , y fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, F(ab^')2 y similares. Véase, Streltsov V.A., et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci., 14 de noviembre (11): 2901-9 (2005), Epub, 30 de septiembre de 2005; Greenberg A.S., et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature, 9 de marzo, 374 (6518):168-73 (1995)); Nuttall S.D., etal., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol. Immunol., agosto,38(4):313-26 (2001); Hamers-Casterman C., et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 3 de junio de 1993, 363 (6428):446-8; Gill D.S., et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr. Opin. Biotechnol., 17 de diciembre (6): 653-8 (2006), Epub, 19 de octubre de 2006.

Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno mediante ingeniería genética. En esta técnica, al igual que con otros métodos, las células productoras de anticuerpos se sensibilizan al antígeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de las células productoras de anticuerpos se usa como molde para producir ADNc mediante la amplificación por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, cada uno de los cuales contiene un gen de la cadena pesada y un gen de la cadena ligera que conserva la especificidad del antígeno inicial, mediante la inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Se construye una biblioteca combinatoria combinando la biblioteca de genes de cadena pesada con la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones, que coexpresan una cadena pesada y una ligera (similares al fragmento Fab o al fragmento de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo). Los vectores que portan estos genes se cotransfectan en una célula huésped. Cuando se induce la síntesis de genes de anticuerpos en el huésped transfectado, las proteínas de cadena ligera y pesada se autoensamblan para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante selección con el antígeno o el inmunógeno.

Las secuencias codificantes de anticuerpos de interés incluyen aquellas codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticos en secuencia a los ácidos nucleicos descritos y variantes de los mismos. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos ("aa"). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, tales como para alterar un sitio de glicosilación o para minimizar el plegamiento incorrecto mediante la sustitución o eliminación de uno o más restos cisteína que no son necesarios para la función. Las variantes se pueden diseñar para conservar o mejorar la actividad biológica de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional, restos aminoácidos catalíticos, etc.). Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos descritos en el presente documento, en particular fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para la mutagénesis in vitro de genes clonados. También se incluyen en la presente memoria descriptiva los polipéptidos que han sido modificados usando técnicas biológicas moleculares habituales para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agente terapéutico.

Los anticuerpos quiméricos pueden fabricarse por medios recombinantes combinando las regiones variables de cadena ligera y pesada (V^l y V^h), obtenidas de células productoras de anticuerpos de una especie, con las regiones de cadena ligera y pesada constantes de otra. Normalmente, los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedor o conejo y regiones constantes humanas, para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de dichos anticuerpos quiméricos es bien conocida en la técnica y se puede lograr por medios convencionales (tal como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.624.659). Se contempla además que las regiones constantes humanas de los anticuerpos quiméricos de la memoria descriptiva puedan seleccionarse de las regiones constantes de IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Los anticuerpos humanizados están diseñados para contener incluso más dominios de inmunoglobulina similares a los humanos e incorporar solo las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado de animal. Esto se logra mediante el examen de la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal para ajustarlas a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque facialmente complejo, el proceso es sencillo en la práctica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.187.287.

Además de las inmunoglobulinas completas (o sus homólogas recombinantes), pueden sintetizarse fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epítopo (por ejemplo, Fab, F(ab')², u otros fragmentos). Los "fragmentos" o inmunoglobulinas mínimas pueden diseñarse utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para usar en la presente memoria descriptiva se pueden producir sintetizando una región variable de cadena ligera fusionada y una región de cadena pesada variable. Las combinaciones de anticuerpos también son de interés, por ejemplo, diacuerpos, que comprenden dos especificidades Fv distintas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los SMIP (inmunofármacos de molécula pequeña), cuerpos de camélidos, nanocuerpos e IgNAR se incluyen dentro de los fragmentos de inmunoglobulina.

Las inmunoglobulinas y sus fragmentos pueden modificarse postraduccionalmente, por ejemplo, para agregar restos efectores, tales como conectores químicos, restos detectables, tales como tintes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, restos quimioluminiscentes y similares, o restos de unión específicas, tales como estreptavidina, avidina o biotina, y similares, y pueden utilizarse en los métodos y composiciones de la presente memoria descriptiva. Se proporcionan ejemplos de moléculas efectoras adicionales a continuación.

Una secuencia polinucleotídica "corresponde" a una secuencia polipeptídica si la traducción de la secuencia polinucleotídica según el código genético produce la secuencia polipeptídica (es decir, la secuencia polinucleotídica "codifica" la secuencia polipeptídica), y una secuencia polinucleotídica "corresponde" a otra secuencia polinucleotídica si las dos secuencias codifican la misma secuencia polipeptídica.

Una región o dominio "heterólogo" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen normalmente estará flanqueado por ADN que no flanquea al ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo originario. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el que la secuencia codificante genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes de los del gen nativo). Las variaciones alélicas o los acontecimientos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define en este documento.

Una "secuencia codificante" es una secuencia en marco de codones que, en vista del código genético, corresponden o codifican una secuencia de proteína o péptido. Dos secuencias codificantes se corresponden entre sí si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia codificante en asociación con secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción normalmente estarán ubicadas en 3' con respecto a la secuencia codificante. Una "secuencia de promotor" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Las secuencias de promotor normalmente contienen sitios adicionales para la unión de moléculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripción) que afectan a la transcripción de la secuencia codificante. Una secuencia codificante está "bajo el control" de la secuencia de promotor o "ligada operativamente" al promotor cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia de promotor en una célula y transcribe la secuencia codificante en ARNm, que a su vez se traduce en la proteína codificada por la secuencia de codificación.

Los vectores se utilizan para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN o una proteína, en un organismo o célula huésped. Los vectores típicos incluyen virus recombinantes (para polinucleótidos) y liposomas (para polipéptidos). Un "vector de ADN" es un replicón, tal como un plásmido, un fago o un cósmido, al que se puede unir otro segmento de polinucleótido para provocar la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptidos por una célula huésped apropiada. Esto generalmente significa un promotor para unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción del ARNm, así como sitios de unión a ribosomas y señales de inicio para dirigir la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos. La incorporación de una secuencia polinucleotídica en un vector de expresión en el sitio adecuado y en el marco de lectura correcto, seguido de la transformación de una célula huésped apropiada por el vector, permite la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia polinucleotídica.

La "amplificación" de las secuencias polinucleotídicas es la producción in vitro de múltiples copias de una secuencia particular de ácido nucleico. La secuencia amplificada suele estar en forma de ADN. En un artículo de Van Brunt (Bio/Technol., 8(4):291-294 (1990)) se describen una diversidad de técnicas para realizar dicha amplificación. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácidos nucleicos, y el uso de la PCR en este documento debe considerarse como un ejemplo de otras técnicas de amplificación adecuadas.

La estructura general de los anticuerpos en los vertebrados ahora se comprende bien (Edelman, G. M., Ann. N. Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Los anticuerpos constan de dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23,000 Daltons (la "cadena ligera"), y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular de 53.000-70.000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en la que las cadenas ligeras agrupan a las cadenas pesadas comenzando en la boca de la configuración en "Y". La porción de "ramificación" de la configuración en "Y" se denomina región Fab; la porción de vástago de la configuración en "Y" se denomina región Fc. La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo N-terminal en la parte superior de la configuración "Y" hasta el extremo C-terminal en la parte inferior de cada cadena. El extremo N-terminal posee la región variable que tiene especificidad por el antígeno que la suscitó, y tiene una longitud de aproximadamente 100 aminoácidos, existiendo ligeras variaciones entre la cadena ligera y la pesada y de un anticuerpo a otro.

La región variable está unida en cada cadena a una región constante que se extiende por la longitud restante de la cadena y que, dentro de una clase particular de anticuerpo, no varía con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antígeno que la suscitó). Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de la molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondientes a las regiones constantes de cadena pesada y, M, a, 5 y £ (gamma, mu, alfa, delta o épsilon)). La clase o región constante determina la función efectora posterior del anticuerpo, incluida la activación del complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a ed., págs. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976))), y otras respuestas celulares (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, págs. 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et a l, Immunology, 48:187 (1983)); mientras que la región variable determina el antígeno con el que reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como k (kappa) o A (lambda). Cada clase de cadena pesada se puede preparar con cadena ligera kappa o lambda. Las cadenas ligera y pesada están unidas entre sí de forma covalente, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas o por células B.

La expresión "región variable" o "VR" se refiere a los dominios dentro de cada par de cadenas ligera y pesada en un anticuerpo que están directamente implicados en la unión del anticuerpo al antígeno. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (V^h), seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V^l) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada.

Las expresiones "región determinante de complementariedad", "región hipervariable" o "CDR" se refieren a una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) hipervariables que se encuentran en las regiones variables de cadenas ligeras o pesadas de un anticuerpo (véase, Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables definidas por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196 901-917 (1987)). Las CDR de cada cadena se mantienen muy próximas entre sí mediante las regiones marco y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos seleccionados que se han descrito como las regiones determinantes de la selectividad (SDR) que representan los residuos de contacto críticos utilizados por la CDR en la interacción anticuerpoantígeno (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).

Las expresiones "región de marco" o "FR" se refieren a una o más de las regiones de marco dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo (véase, Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen aquellas regiones de secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo.

Anticuerpos anti-CGRP y fragmentos de unión de los mismos que tienen actividad de unión para CGRP

Los ejemplos de los presentes métodos comprenden administrar anticuerpos anti-CGRP y fragmentos de los mismos a un sujeto. Se describen ejemplos de anticuerpos anti-CGRP y sus fragmentos en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2012/0294797, y se describen otros ejemplos de anticuerpos anti-CGRP en los párrafos que siguen.

Anticuerpo Ab1

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTST LASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEV VVKR (SEQ ID NO: 1).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTST LASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEV YVKRTYAAPSYFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN S QES VTEQD SKD S T Y SLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACE VTHQ GLS SP VTKSFNRGE

C (SEQ ID NO: 2).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDN TYY AS WAKGRFTISRAS S TT VDLKMTSLTTEDT ATYF C ARGDIW GPGTLVT V S S

(SEQ ID NO: 3).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q SLEES GGRLVTPGTPLTLT CT V S GLDLS S YYMQ WVRQ APGKGLEWIGVIGINDN

TYY AS WAKGRFTISRAS STTVDLKMTSLTTEDTATYF CARGDIWGPGTLVTV S S AS TKGPS VFPLAPS SKS TS GGT AALGCL YKD YFPEP VT V S WN S GALTS GVHTFP A VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP

EVHN AKTKPREEQ Y AS T Y R W S VLTVLHQD WLN GKE YKCKV SNKALP APIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 4).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; y SEQ ID NO:7 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID nO:1 o SEQ ID NO:2. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; y SEQ ID NO:7 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; y SeQ ID NO:7) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3.

En un ejemplo particularmente preferido de la memoria descriptiva, el anticuerpo quimérico anti-CGRP es Ab1, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo preferido de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab1, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:3 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab1. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab1 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab2

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFYFGGGTKVE IKR (SEQ ID NO: 11).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVE IKRT V AAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKV Q WKVDNALQ S GN S Q ES VTEQD SKD S T Y SLS S TLTLSK AD YEKHKVY ACE VTHQ GLS SP VTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 12).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GLDLS S YYMQ WVRQ APGKGLEWV GVIGI NDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAYYFCARGDIWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 13).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GLDLS S YYMQ WVRQ APGKGLEWV GVIGI NDNTYY AS WAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAVYF CARGDIWGQGTL VTVSS ASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WN SGALTSGV HTFPAVLQS SGL YSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; y SEQ ID NO:17 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; y SEQ ID NO:20 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:14.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; y SEQ ID NO:17 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; y SEQ ID NO:20 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; y SeQ ID NO:17) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humanizado es Ab2, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:14, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab2, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:11 y/o SEQ ID NO:13 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab2. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab2 o sus fragmentos Fab, pueden producirse a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tales como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab3

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

q v l t q s p s s l s a s v g d r v t i n c q a s q s v y d n n y l a w y q q k p g k y p k q l i y s t s t LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFYFGGGTKVE IKR (SEQ ID NO: 21).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVE IKRT Y AAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKV Q WKVDNALQ S GN S Q ES VTEQD SKD S T Y SLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACE VTHQ GLS SP YTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 22).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GLDLS S YYMQ WVRQ APGKGLEWV GVIGI

NDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAYYFCARGDIWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO: 23).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GLDLS S YYMQ WVRQ APGKGLEWV GVIGI

NDNTYY AS WAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAVYF CARGDIWGQGTL

VTVSS ASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVS WN SGALTSGV

HTFPAVLQS SGL YSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVD ARVEPKSCDK

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW

YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP

APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; y SEQ ID NO:27 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; y SEQ ID NO:30 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:24, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:24.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; y SEQ ID NO:27 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; y SEQ ID NO:30 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:24.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; y SeQ ID NO:27) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; y SEQ ID NO:30) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP quimérico es Ab3, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:24, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab3, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:21 y/o SEQ ID NO:23 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en este documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab3. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab3 o sus fragmentos Fab, pueden producirse a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab4

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDAST LASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTE VYVKR (SEQ ID NO: 31).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDAST LASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTE V W K R T V AAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS W CLLNNF YPREAK V Q WKVDNALQ S G NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 32).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGA TYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO:33).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q SLEES GGRLVTPGTPLTLTCS V S GIDLS GYYMNWVRQ APGKGLEWIGVTGIN GA TYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSA S TKGP S VFPL APS SKS TS GGT A ALGCLVKD YFPEP VT V S WN S GALTS GYHTFP AY LQS SGLYSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYYVDYSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQ YASTYRVV S VLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAYEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 34).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; y SEQ ID NO:37 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:40 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:34, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:32. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:33 o SEQ ID NO:34.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; y SEQ ID NO:37 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:40 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:34.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; y SeQ ID NO:37) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:40) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humanizado es Ab4, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:32 y SEQ ID NO:34, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab4, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:31 y/o SEQ ID NO:33 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab4. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab4 o sus fragmentos Fab, pueden producirse a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab5

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDAST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFWGGGTKV EIKR (SEQ ID NO: 41).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación: QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDAST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTTSSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKV EIKRT V AAPS W IFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPREAKV Q WKVDNALQ S GN S QES VTEQD SKD S T Y SLS S TLTLSK AD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 42).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GIDLS GYYMNWVRQ APGKGLEWV GVIGI NGATYY AS WAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAYYF CARGDIWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 43).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GIDLS GYYMNWVRQ APGKGLEWV GVIGI NGATYY AS WAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAVYF CARGDIWGQGTL VTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGLYSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK

YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKGSKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; y SEQ ID NO:47 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:50 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:43 o SEQ ID NO:44.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; y SEQ ID NO:47 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:50 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; y SeQ ID NO:47) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:50) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP quimérico es Ab5, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:44, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab5, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:41 y/o SEQ ID NO:43 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab5. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab5 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamífero, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab6

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDAST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKV EIKR (SEQ ID NO: 51).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDAST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKV EIKRT V AAPS VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPREAKV Q WKVDNALQ S GN S QES VTEQD SKD S TYSLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 52).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GIDLS GYYMNWVRQ APGKGLEWV GVIGI NGATYY AS WAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAVYF CARGDIWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 53).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GIDLS GYYMNWVRQ APGKGLEWV GVTGI NGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAYYFCARGDIWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGL YSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVD ARVEPKSCDK

YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTYLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:52. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SeQ ID NO:57) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humanizado es Ab6, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:54, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab6, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:51 y/o SEQ ID NO:53 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en este documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab6. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab6 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab7

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTST LASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEV W K R (SEQ ID NO: 61).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTASPYSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTST LASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEV WKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN S QES VTEQD SKD S T YSLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACE VTHQ GLS SP VTKSFNRGE

C (SEQ ID NO: 62).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGWGIN GRTYYASWAKGRFTISRTSSTTYDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTV SS (SEQ ID NO: 63).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGWGIN GRTYYASWAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTV S S AS TKGP S VFPL APS SKS TS GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S WN S GALTS GVHTF PAVLQS S GLY SLS S VYTVPS S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWYDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQ Y AS T Y R W S VLTVLHQD WLN GKE YKCKV SNKALP APIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNYFSCSYMHEALHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 64).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:66; y SEQ ID NO:67 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:69; y SEQ ID NO:70 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:61 o SEQ ID NO:62. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:66; y SEQ ID NO:67 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:69; y SEQ ID NO:70 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:66; y SeQ ID NO:67) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:69; y SEQ ID NO:70) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP quimérico es Ab7, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:64, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab7, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:61 y/o SEQ ID NO:63 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab7. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab7 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamífero, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab8

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

q v l t q s p s s l s a s v g d r v t i n c q a s q s v y n y n y l a w y q q k p g k v p k q l i y s t s t LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKV EIKR (SEQ ID NO: 71).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVUNCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKV EIKRT V AAPS VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPREAK Y Q WKVDNALQ S GN S QES VTEQD SKD S TYSLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 72).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AV S GIDLSNHYMQWVRQ APGKGLEWV G W GI

NGRTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAYYFCARGDIWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO: 73).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AV S GIDLSNHYMQWVRQ APGKGLEWV G W GI

NGRTYYAS WAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAVYF CARGDIWGQGTL

VTV S S ASTKGPS VFPLAPS SKS TS GGTAALGCLVKD YFPEPVTVS WN SGALTSGV

HTFP AVLQS SGL YSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW

YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP

APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:75; SEQ ID NO:76; y SEQ ID NO:77 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:79; y SEQ ID NO:80 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:71 o SEQ ID NO:72. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:73 o SEQ ID NO:74.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:75; SEQ ID NO:76; y SEQ ID NO:77 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:79; y SEQ ID NO:80 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:75; SEQ ID NO:76; y SeQ ID NO:77) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:79; y SEQ ID NO:80) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humanizado es Ab8, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:72 y SEQ ID NO:74, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab8, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:71 y/o SEQ ID NO:73 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab8. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab8 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamífero, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de sí. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab9

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTST LASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFWGGGTEV W K R (SEQ ID NO: 81).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTST LASGVSSRFRGSGSGTQFTLUSDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEV YVKRTYAAPSYFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN S QES VTEQD SKD S T YSLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACE VTHQGLS SP VTKSFNRGE

C (SEQ ID NO: 82).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q SLEES GGRLVTPGTPLTLT CT VS GIGLS S YYMQ WVRQ SPGRGLEWIGVIGSDGK TYY ATWAKGRFTISKTS STTVDLRMASLTTEDTAT YFCTRGDIWGPGTLVTV S S

(SEQ ID NO: 83).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q SLEES GGRLVTPGTPLTLT CT V S GIGLS S YYMQ WVRQ SPGRGLEWIGVIGSDGK TYY ATWAKGRFTISKTS STTVDLRMASLTTEDTATYFCTRGDIWGPGTLVTV S S A S TKGP S VFPL APS SKS TS GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S WN S GALTS GVHTFP AV LQS SGLYSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE YHNAKTKPREEQ YASTYRVV S VLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 84).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:85; SEQ ID NO:86; y SEQ ID NO:87 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; y SEQ ID NO:90 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:81 o SEQ ID NO:82. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:83 o SEQ ID NO:84.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:85; SEQ ID NO:86; y SEQ ID NO:87 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; y SEQ ID NO:90 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:85; SEQ ID NO:86; y SeQ ID NO:87) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; y SEQ ID NO:90) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP quimérico es Ab9, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:82 y SEQ ID NO:84, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab9, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:81 y/o SEQ ID NO:83 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab9. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab9 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab10

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKV EIKR (SEQ ID NO: 91).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q VLTQ SPSSLSASY GDRVUN CQ AS QNVYNNN YLAWY Q QKPGKVPKQLIY S TS T LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKV EIKRT V AAPS VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPREAKV Q WKVDNALQ S GN S QES VTEQD SKD S TY SLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 92).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGS DGKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 93).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGS DGKTYY ATWAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAVYF CTRGDIWGQGTL VTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGLYSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; y SEQ ID NO:97 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; y SEQ ID NO:100 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:91 o SEQ ID NO:92. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:93 o SEQ ID NO:94.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; y SEQ ID NO:97 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; y SEQ ID NO:100 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; y SeQ ID NO:97) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; y SEQ ID NO:100) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humanizado es Ab10, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:92 y SEQ ID NO:94, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab10, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:91 y/o SEQ ID NO:93 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab10 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas de hongos, insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab11

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTL ASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEV W K R (SEQ ID NO: 101).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q VLTQT ASP V SP AV GS T YTIN CRAS Q S VYYNNYL A WYQQKPGQPPKQLIY S TS TL ASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEV WKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN S QES VTEQD SKD S T Y SLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACE VTHQGLS SP VTKSFNRGE

C (SEQ ID NO: 102).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q SLEES GGRLVTPGGSLTLTCT V S GID VTNYYMQ WVRQ APGKGLEWIGVIGVN G KRYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVS

S (SEQ ID NO: 103).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q SLEES GGRLVTPGGSLTLT CT V S GID VTNYYMQ WVRQ APGKGLEWIGVTGVN G KRYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLYTYS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC

VEVHNAKTKPREEQ Y AS T YRV V S VLTVLHQD WLN GKE YKCK V SNKALP APIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 104).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; y SEQ ID NO:107 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:102 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; y SEQ ID NO:110 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:104, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:101 o SEQ ID NO:102. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:103 o SEQ ID NO:104.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; y SEQ ID NO:107 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:102.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; y SEQ ID NO:110 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:104.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:103; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; y SEQ ID NO:107) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; y SEQ ID NO:110) de la región variable de cadena pesada de SeQ ID NO:103.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP quimérico es Ab11, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:102 y SEQ ID NO:104, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab11, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:103. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:101 y/o SEQ ID NO:103 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab11. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab11 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab12

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKV EIKR (SEQ ID NO: 111).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QYLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKYPKQLIYSTST LASGYPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFYFGGGTKV EIKRT V AAPS VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPREAKV Q WKVDNALQ S GN S QES VTEQD SKD S TYSLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 112).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GID VTN YYMQ WVRQ APGKGLEWV GVIGV NGKRY Y AS WAKGRFTISRDN SKTTVYLQMN SLRAEDTAVYF CARGDIWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 113).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EV QLVES GGGL V QPGGSLRLS C AV S GID VTN YYMQ WVRQ APGKGLEWV GVIGV NGKRYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTL VTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGL YSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQ Y A ST Y R W S YLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 114).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:115; SEQ ID NO:116; y SEQ ID NO:117 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; y SEQ ID NO:120 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:114, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:111 o SEQ ID NO:112. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:113 o SEQ ID NO:114.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:115; SEQ ID NO:116; y SEQ ID NO:117 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; y SEQ ID NO:120 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:114.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:113; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:115; SEQ ID NO:116; y SEQ ID NO:117) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; y SEQ ID NO:120) de la región variable de cadena pesada de SeQ ID NO:113.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humanizado es Ab12, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab12, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:113. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:111 y/o SEQ ID NO:113 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab12. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab12 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab13

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASK LASGVPSRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEV W K R (SEQ ID NO: 121).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

AIVMTQTPSSKSVPVGDTYTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASK LASGVPSRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEV WKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN S QES VTEQD SKD S T YSLS S TLTLSK AD YEKHKVY ACE VTHQ GLS SP VTKSFNRGE

C (SEQ ID NO: 122).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q S VEES GGGLV QPEGSLTLT CT AS GFDF S SNAMWWVRQ APGKGLEWIGIIYN GD

GS TY Y AS WVN GRF SISKTS S TT VTLQLN SLTV ADTATYY C ARDLDLW GPGTL VT

VSS (SEQ ID NO: 123).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q S VEES GGGLVQPEGSLTLTCT AS GFDF S SNAMWWVRQ APGKGLEWIGCIYNG

DGSTYYASWVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLV

TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLYKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWY

VDGVE VHNAKTKPREEQ Y AS T YRV V S VLTVLHQD WLN GKE YKCKV SNKALP A

PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNYFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 124).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:125; SEQ ID NO:126; y SEQ ID NO:127 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:128; SEQ ID NO:129; y SEQ ID NO:130 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:124, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:121 o SEQ ID NO:122. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:123 o SEQ ID NO:124.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:125; SEQ ID NO:126; y SEQ ID NO:127 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:128; SEQ ID NO:129; y SEQ ID NO:130 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:124.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:123; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:125; SEQ ID NO:126; y SEQ ID NO:127) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:128; SEQ ID NO:129; y SEQ ID NO:130) de la región variable de cadena pesada de SeQ ID NO:123.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP quimérico es Ab13, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:122 y SEQ ID NO:124, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab13, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:123. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:121 y/o SEQ ID NO:123 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab13. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab13 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

Anticuerpo Ab14

En un ejemplo, la memoria descriptiva incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTST LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKV EIKR (SEQ ID NO: 131).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia indicada a continuación:

Q VLTQ SPSSLSASY GDRVUN CQ AS QNVYNNN YLAWY Q QKPGKVPKQLIY S TS T LASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKV EIKRT V A APS VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPREAKY Q WKVDN ALQ S GN S QES VTEQD SKD S TYSLS S TLTLSKAD YEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 132).

La memoria descriptiva incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGS DGKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAYYFCTRGDIWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 133).

La memoria descriptiva también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión a CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia indicada a continuación:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGS DGKTYYATWAKGRFT1SRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAYYFCTRGDIWGQGTL

VTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQS SGL YSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVD ARVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQ Y A ST Y R W S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 134).

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:136; y SEQ ID NO:137 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:139; y SEQ ID NO:140 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:134, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos de la memoria descriptiva o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y ligera, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:131 o SEQ ID NO:132. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos de la memoria descriptiva comprenden, o como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:133 o SEQ ID NO:134.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:136; y SEQ ID NO:137 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:139; y SEQ ID NO:140 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:134.

La memoria descriptiva también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a CGRP comprenden, o como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:133; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:136; y SEQ ID NO:137) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:139 y SEQ ID NO:140) de la región variable de cadena pesada de SeQ ID NO:133.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humanizado es Ab14, que comprende, o como alternativa, consiste en SEQ ID NO:132 y SEQ ID NO:134, y tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en este documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab14, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:133. Este ejemplo de la memoria descriptiva contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:NO:131 y/o SEQ ID NO:133 en dicho Fab, al mismo tiempo que conserva la especificidad de unión para CGRP.

En un ejemplo de la memoria descriptiva descrita en el presente documento (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab14. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP, tales como Ab14 o sus fragmentos Fab, se pueden producir a través de la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.

En otro ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden estar presentes en una o más de las siguientes formas no limitantes: Fab, Fab', F(ab')², Fv y formas de anticuerpos Fv monocatenarios. En un ejemplo preferido, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento comprenden además la secuencia de la cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia indicada a continuación:

V AAPS VFIFPPSDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDNALQ S G NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 283).

En otro ejemplo preferido, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento comprenden además la secuencia polipeptídica de cadena pesada constante gamma-1 que comprende la secuencia indicada a continuación: AS TKGPS VFPL APS SKS TS GGT A ALGCLVKD YFPEP VT V S WN S GALTS G

VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD

KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVD GVEVHNAKTKPREEQ Y AS T Y R W S VETVLHQD WLN GKE YKCK V SNK AL

P APIEKTISKAKGQPREPQ V YTLPPSREEMTKN Q Y SLT CL YKGF YP SDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT

QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 284).

En otro ejemplo, la memoria descriptiva contempla un anticuerpo anti-CGRP aislado que comprende una secuencia polipeptídica de V^h seleccionada de: SEQ ID NO:3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o una variante de la misma; y que además comprende una secuencia polipeptídica de V^l seleccionada de: SEQ ID NO:1, 11,21,31,41,51,61,71,81,91, 101, 111, 121 o 131, o una variante de la misma, en la que uno o más de los restos del marco (restos FR) en dicho polipéptido de V^h o V^l se ha sustituido por otro resto aminoácido dando como resultado un anticuerpo anti-CGRP que se une específicamente a CGRP. La memoria descriptiva contempla formas humanizadas y quiméricas de estos anticuerpos. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir un Fc derivado de regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos o polipéptidos de V^h o V^l se originan o se seleccionan de una o más poblaciones de células B de conejo antes del inicio del proceso de humanización al que se hace referencia en el presente documento.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP y sus fragmentos no tienen especificidad de unión por CGRP-R. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP y sus fragmentos inhiben la asociación de CGRP con CGRP-R. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP y sus fragmentos inhiben la asociación de CGRP con CGRP-R y/o proteínas adicionales y/o multímeros de las mismas y/o antagonizan los efectos biológicos de las mismas.

Tal como se indicó anteriormente, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden modificarse postraduccionalmente para agregar restos efectores, tales como conectores químicos, marcadores detectables, tales como, por ejemplo, tintes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos y restos quimioluminiscentes, o restos funcionales, tales como, por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radiactivos.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos también pueden modificarse químicamente para proporcionar ventajas adicionales, tales como mayor solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación (semivida in vivo) del polipéptido, o menor inmunogenicidad (véase la patente de EE. UU. n.° 4.179.337). Los restos químicos para la derivatización se pueden seleccionar de polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico) y similares. Los anticuerpos y sus fragmentos pueden modificarse en posiciones aleatorias dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.

El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que, en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular indicado) para facilitar la manipulación y la fabricación. Se pueden usar otros tamaños, según el perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hubiere, sobre la actividad biológica, la facilidad de manipulación, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol contra una proteína o análogo terapéutico). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000 o 100.000 kDa. Se describen polietilenglicoles ramificados, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides, 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem., 10:638-646 (1999).

Hay una serie de métodos de unión disponibles para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (que informa sobre la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir covalentemente a través de restos aminoácidos por medio de un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los que se puede unir una molécula de polietilenglicol activada. Los restos aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos lisina y los restos aminoácidos N-terminales; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos ácido aspártico, restos ácido glutámico y el resto aminoácido C-terminal. Los grupos sulfhidrilo también se pueden usar como grupo reactivo para unir las moléculas de polietilenglicol. Se prefiere para fines terapéuticos la unión a un grupo amino, tal como la unión al extremo N-terminal o al grupo lisina.

Tal como se sugirió anteriormente, el polietilenglicol se puede unir a las proteínas a través de un enlace con cualquiera de varios restos aminoácidos. Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir a polipéptidos a través de enlaces covalentes con restos lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína. Se pueden emplear una o más químicas de reacción para unir el polietilenglicol a restos aminoácidos específicos (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína) o a más de un tipo de resto aminoácido (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y combinaciones de los mismos).

Como alternativa, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden tener semividas aumentadas in vivo a través de la fusión con albúmina (incluyendo, entre otros, albúmina de suero humana recombinante o fragmentos o variantes de la misma (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5,876,969, otorgada el 2 de marzo, 1999, patente EP 0 413622, y patente de EE. Uu . n.° 5,766,883, otorgada el 16 de junio, 1998)) u otras proteínas de la sangre circulantes, tales como la transferrina o la ferritina. En un ejemplo preferido, los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente memoria descriptiva (incluidos fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de albúmina de suero humana (es decir, los aminoácidos 1 -585 de la albúmina de suero humana como se muestra en las figuras 1 y 2 de la patente EP 0322094). Los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de la memoria descriptiva también están incluidos en la memoria descriptiva.

Con respecto a los restos detectables, otros ejemplos de enzimas incluyen, pero no se limitan a peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y luciferasa. Otros ejemplos de materiales fluorescentes incluyen, pero no se limitan a rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Otros ejemplos de restos quimioluminiscentes incluyen, pero no se limitan a luminol. Otros ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen, pero no se limitan a luciferina y aecuorina. Otros ejemplos de materiales radiactivos incluyen, entre otros, yodo 125 (125I), carbono 14 (14C), azufre 35 (35S), tritio (3H) y fósforo 32 (32P).

Con respecto a los restos funcionales, los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, entre otros, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo dacarbazina; agentes alquilantes, tales como mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1 -metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiaminoplatino (II) (DDP), cisplatino, carboplatino (Paraplatin); las antraciclinas incluyen daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorubicina (Adriamycin), detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, caliqueamicina, mitramicina y antramicina (AMC); y agentes antimitóticos, tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (Taxol), ricina, exotoxina de pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenipósido, colchicina, dihidroxiantracindiona, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferones y mezclas de estos agentes citotóxicos.

Otros agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, caliqueamicina, doxorubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina y bleomicina. Las enzimas tóxicas de plantas y bacterias, tales como la ricina, la toxina de la difteria y la toxina de Pseudomonas, pueden conjugarse con los anticuerpos humanizados o quiméricos, o fragmentos de unión de los mismos, para generar reactivos de destrucción específicos del tipo celular (Youle et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA, 77: 5483 (1980); Gilliland et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA, 77: 4539 (1980); Krolick et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA, 77: 5419 (1980)).

Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas como se describe por Goldenberg en la patente de EE. UU. n.° 6,653,104. Los ejemplos de la memoria descriptiva también se refieren a radioinmunoconjugados en los que un radionúclido que emite partículas alfa o beta se acopla de manera estable al anticuerpo, o a fragmentos de unión del mismo, con o sin el uso de un agente formador de complejos. Dichos radionúclidos incluyen emisores beta, tales como el fósforo-32 (32P), escandio-47 (47Sc), cobre-67 (67Cu), galio-67 (67Ga), itrio-88 (88Y), itrio-90 (90Y), yodo-125 (125I), yodo-131 (131l), samario-153 (153Sm), lutecio-177 (177Lu), renio-186 (186Re) o renio-188 (188Re) y emisores alfa, tales como como astato-211 (211At), plomo-212 (212Pb), bismuto-212 (212Bi) o bismuto-213 (213Bi) o actinio-225 (225Ac).

Se conocen métodos en la técnica para conjugar un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo a un resto detectable y similares, como por ejemplo los métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981)); y Nygren, J., Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)).

Los ejemplos descritos en el presente documento incluyen además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, diacuerpos, SMIP, cuerpos de camélidos, nanocuerpos, IgNAR, polipéptidos, regiones variables y CDR indicados en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservadoras (es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares). Por ejemplo, una sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, por ejemplo, un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Lo que se pretende con una sustitución de aminoácido conservativa es bien conocido en la técnica.

En otro ejemplo, la memoria descriptiva contempla secuencias polipeptídicas que tienen al menos un 90% o más de homología de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias polipeptídicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Más preferiblemente, la memoria descriptiva contempla secuencias polipeptídicas que tienen al menos un 95% o más de homología de secuencia, incluso más preferiblemente al menos un 98% o más de homología de secuencia, y aún más preferiblemente al menos un 99% o más de homología de secuencia con uno cualquiera o más de las secuencias polipeptídicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Los métodos para determinar la homología entre secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En otro ejemplo, la memoria descriptiva contempla además que los homólogos polipeptídicos mencionados anteriormente de los fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestos en el presente documento tienen además actividad anti-CGRP. En el presente documento se exponen ejemplos no limitantes de actividad anti-CGRP.

En otro ejemplo, la memoria descriptiva contempla además la generación y el uso de anticuerpos antiidiotípicos que se unen a cualquiera de las secuencias anteriores. En un ejemplo ilustrativo, tal anticuerpo antiidiotípico podría administrarse a un sujeto que ha recibido un anticuerpo anti-CGRP para modular, reducir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti-CGRP. Dichos anticuerpos antiidiotípicos también podrían ser útiles para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la presencia de anticuerpos anti-CGRP. Otro ejemplo de uso de dichos anticuerpos antiidiotípicos es para la detección de los anticuerpos anti-CGRP de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, para controlar los niveles de los anticuerpos anti-CGRP presentes en la sangre u otros fluidos corporales de un sujeto.

La presente memoria descriptiva también contempla anticuerpos anti-CGRP que comprenden cualquiera de las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas descritas en este documento sustituidas por cualquiera de las otras secuencias polinucleotídicas descritas en este documento. Por ejemplo, sin limitarse a ello, la presente memoria descriptiva contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualquiera de las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable descritas en el presente documento, y contempla además anticuerpos resultantes de la sustitución de cualquiera de las secuencias CDR descritas en el presente documento por cualquiera de las otras secuencias de CDR descritas en este documento.

Otros ejemplos de la memoria descriptiva

En otro ejemplo, la memoria descriptiva contempla uno o más anticuerpos anti-CGRP humano o fragmentos de anticuerpos de los mismos que se unen específicamente al/a los mismo(s) epítopo(s) lineal(es) o conformacional(es) y/o compiten por unirse al/a los mismo(s) epítopo(s) lineal(es) o conformacional(es) en un polipéptido CGRP humano intacto o fragmento del mismo, tal como un anticuerpo anti-CGRP humano seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14. Dichos uno o más anticuerpos anti-CGRP humano o fragmentos de anticuerpos de los mismos pueden ser de origen no natural, tales como anticuerpos humanizados o quiméricos, fragmentos de anticuerpos de origen no natural, anticuerpos que incorporan un marcador, etc. En un ejemplo preferido, el anticuerpo anti-CGRP humano o fragmento del mismo se une específicamente al/a los mismo(s) epítopo(s) lineal(es) o conformacionale(s) y/o compite por unirse al/a los mismo(s) epítopo(s) lineal(es) o conformacional(es) en un polipéptido CGRP humano intacto o un fragmento del mismo, tal como Ab3, Ab6, Ab13 o Ab14.

Un ejemplo preferido de la memoria descriptiva se refiere a anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluidos los fragmentos Fab) que tienen especificidad de unión por CGRP e inhiben las actividades biológicas mediadas por la unión de CGRP al receptor de CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP quiméricos o humanizados se seleccionan de Ab3, Ab6, Ab13 o Ab14.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humano es un anticuerpo que se une específicamente a los mismos epítopos lineales o conformacionales en un polipéptido CGRP intacto o fragmento del mismo que se une(n) específicamente a Ab3, Ab6, Ab13 o Ab14, tal como se determina por cartografiado epitópico usando fragmentos peptídicos lineales solapantes que abarcan la longitud completa del polipéptido CGRP humano nativo.

La memoria descriptiva también se dirige a un anticuerpo anti-CGRP que se une con el mismo epítopo de CGRP y/o compite con un anticuerpo anti-CGRP por unirse a CGRP, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en este documento, que incluye, entre otros, un anticuerpo anti-CGRP seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14.

En otro ejemplo, la memoria descriptiva también se dirige a un anticuerpo anti-CGRP aislado o fragmento de anticuerpo que comprende una o más de las CDR contenidas en las secuencias polipeptídicas de V^h seleccionadas de: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o una variante de las mismas y/o una o más de las CDR contenidas en las secuencias polipeptídicas de V^l seleccionadas de: 1, 11,21,31,41,51 ,61 , 71, 81,91, 101, 111, 121 o 131, o una variante de las mismas.

La memoria descriptiva contempla además que uno o más anticuerpos anti-CGRP humano analizados anteriormente están aglicosilados o, si están glicosilados, contienen solo restos manosa; contienen una región Fc que se ha modificado para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación; son humanos, humanizados, monocatenarios o quiméricos; y son un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo anti-CGRP humano de conejo (originario).

La memoria descriptiva contempla además uno o más anticuerpos anti-CGRP humano en los que las regiones de marco (FR) en la región variable ligera y las regiones variables pesadas de dicho anticuerpo, respectivamente, son FR humanas que no están modificadas o que han sido modificadas mediante la sustitución de uno o más restos de FR humanos en la región variable de cadena ligera o pesada por variables restos de FR correspondientes del anticuerpo originario de conejo, y en los que dichas FR humanas se han derivado de secuencias variables de anticuerpos de cadena ligera y pesada humanas que se han seleccionado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de línea germinal humana basándose en su alto nivel de homología con las correspondientes regiones variables de cadena pesada o ligera de conejo en relación con otras secuencias de anticuerpos de línea germinal humana contenidas en la biblioteca.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, el anticuerpo anti-CGRP humano o fragmento se une específicamente a células humanas que expresan CGRP y/o a moléculas de CGRP solubles circulantes in vivo, incluyendo CGRP expresado sobre células humanas o por células humanas en un paciente con una enfermedad asociada con células que expresan CGRP.

La memoria descriptiva contempla además anticuerpos anti-CGRP humano o fragmentos unidos directa o indirectamente a un marcador detectable o agente terapéutico.

La memoria descriptiva también contempla una o más secuencias de ácido nucleico que dan como resultado la expresión de un anticuerpo anti-CGRP humano o fragmento de anticuerpo como se indicó anteriormente, incluidos aquellos que comprenden, o como alternativa, consisten en codones preferidos de levadura o humanos. La memoria descriptiva también contempla vectores (incluyendo plásmidos o vectores virales recombinantes) que comprenden dicha(s) secuencia(s) de ácido nucleico. La memoria descriptiva también contempla células huésped o células huésped recombinantes que expresan al menos uno de los anticuerpos expuestos anteriormente, incluidas células de mamífero, levadura, bacteria e insecto. En un ejemplo preferido, la célula huésped es una célula de levadura. En otro ejemplo preferido, la célula de levadura es una célula de levadura diploide. En un ejemplo ejemplificado, la célula de levadura es una levadura Pichia.

La memoria descriptiva también contempla un método de tratamiento que comprende administrar a un paciente con una enfermedad o afección asociada con células que expresan CGRP una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-CGRP humano o fragmento descrito en este documento. La memoria descriptiva también contempla que el método de tratamiento puede implicar la administración de dos o más anticuerpos anti-CGRP o fragmentos de los mismos y que se describen en el presente documento. Si se administra más de un anticuerpo al paciente, los múltiples anticuerpos se pueden administrar de forma simultánea o concurrente, o se pueden escalonar en su administración.

La actividad anti-CGRP de los anticuerpos anti-CGRP de la presente memoria descriptiva, y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión a CGRP, también puede describirse por su fuerza de unión o su afinidad por CGRP. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP de la presente memoria descriptiva y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión a CGRP se unen a CGRP con una constante de disociación (K^d) menor o igual a 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-1° M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, o 10-13 M. Preferiblemente, los anticuerpos anti-CGRP y sus fragmentos se unen a CGRP con una constante de disociación menor o igual a 10-11 M, 5x10-12 M, o 10-12 M. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP de la presente memoria descriptiva, y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión a CGRP, se unen a un epítopo de CGRP lineal o conformacional.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, la actividad anti-CGRP de los anticuerpos anti-CGRP de la presente memoria descriptiva y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión a CGRP se unen a CGRP con una constante de disociación inferior o igual a 10-4 S-1, 5x10-5 S-1, 10-5 S-1, 5x10-6 S-1, 10-6 S-1, 5x10-7 S-1, o 10-7S-1.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, la actividad anti-CGRP de los anticuerpos anti-CGRP de la presente memoria descriptiva, y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión a CGRP, muestran actividad anti-CGRP al prevenir, mejorar o reducir los síntomas o, como alternativa, tratar, enfermedades y trastornos asociados con CGRP. En el presente documento se exponen ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos asociados con CGRP.

Polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos anti-CGRP

En ejemplos ilustrativos, los anticuerpos anti-CGRP pueden estar codificados por secuencias polinucleotídicas indicadas en la lista de secuencias biológicas contenida en este documento, u otros polinucleótidos codificantes que pueden identificar fácilmente los expertos en la técnica. Los ejemplos de los mismos incluyen el polinucleótido de SEQ ID NO:141 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:1), el polinucleótido de SEQ ID NO:142 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2), el polinucleótido de SEQ ID NO:143 (que codifica el polipéptido de s Eq ID NO:3), el polinucleótido de SEQ ID NO:144 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:4), el polinucleótido de SEQ ID NO:151 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:11), el polinucleótido de SEQ ID NO:152 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:12), el polinucleótido de SEQ ID nO:153 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:13), el polinucleótido de SEQ ID NO:154 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:14), el polinucleótido de SEQ ID NO:161 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:21), el polinucleótido de SEQ ID NO:162 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:22), el polinucleótido de SEQ ID NO:163 (que codifica el polipéptido de SEQ iD NO:23), el polinucleótido de SEQ ID NO:164 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:24), el polinucleótido de SEQ ID NO:171 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:31), el polinucleótido de SEQ ID NO:172 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:32), el polinucleótido de SEQ ID NO:173 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:33), el polinucleótido de SEQ ID NO:174 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:34), el polinucleótido de SEQ ID NO:181 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:41), el polinucleótido de SEQ ID NO:182 (que codifica el polipéptido de SEQ iD NO:42), el polinucleótido de SEQ ID NO:183 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:43), el polinucleótido de SEQ ID NO:184 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:44), el polinucleótido de SEQ ID nO:191 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:51), el polinucleótido de SEQ ID NO:192 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:52), el polinucleótido de SEQ ID NO:193 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:53), el polinucleótido de SEQ ID NO:194 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:54), el polinucleótido de SEQ ID NO:201 (que codifica el polipéptido de SEQ iD NO:61), el polinucleótido de SEQ ID NO:202 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:62), el polinucleótido de SEQ ID NO:203 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:63), el polinucleótido de SEQ ID nO:204 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:64), el polinucleótido de SEQ ID NO:211 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:71), el polinucleótido de SEQ ID NO:212 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:72), el polinucleótido de SEQ ID NO:213 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:73), el polinucleótido de SEQ ID NO:214 (que codifica el polipéptido de SEQ iD NO:74), el polinucleótido de SEQ ID NO:221 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:81), el polinucleótido de SEQ ID NO:222 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:82), el polinucleótido de SEQ ID nO:223 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:83), el polinucleótido de SEQ ID NO:224 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:84), el polinucleótido de SEQ I D NO:231 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:91), el polinucleótido de SEQ ID NO:232 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:92), el polinucleótido de SEQ ID NO:233 (que codifica el polipéptido de SEQ iD NO:93), el polinucleótido de SEQ ID NO:234 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:94), el polinucleótido de SEQ ID NO:241 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:101), el polinucleótido de SEQ ID nO:242 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:102), el polinucleótido de SEQ ID NO:243 (que codifica el polipéptido de SeQ ID NO:103), el polinucleótido de SEQ ID NO:244 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:104), el polinucleótido de SEQ ID NO:251 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:111), el polinucleótido de SEQ ID NO:252 (que codifica el polipéptido de SEq ID NO:112), el polinucleótido de SEQ ID nO:253 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:113), el polinucleótido de SeQ ID NO:254 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:114), el polinucleótido de SEQ ID NO:261 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:121), el polinucleótido de SEQ ID nO:262 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:122), el polinucleótido de SEQ ID nO:263 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:123), el polinucleótido de SeQ ID NO:264 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:124), el polinucleótido de SEQ ID NO:271 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:131), el polinucleótido de SEQ ID NO:272 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:132), el polinucleótido de SEQ ID nO:273 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:133) o el polinucleótido de SeQ ID NO:274 (que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:134).

Detección y selección de células B

En un ejemplo, la presente memoria descriptiva contempla la preparación y el aislamiento de una población clonal de células B específicas de antígeno que pueden usarse para aislar al menos una célula específica de antígeno CGRP, que puede usarse para producir un anticuerpo monoclonal contra CGRP, que es específico para un antígeno CGRP deseado, o una secuencia de ácido nucleico correspondiente a tal anticuerpo. Los métodos para preparar y aislar dicha población clonal de células B específicas de antígeno se muestran, por ejemplo, en la publicación de patente de EE.UU. n.° US 2007/0269868 de Carvalho-Jensen et al. Los métodos para preparar y aislar dicha población clonal de células B específicas de antígeno también se indican en el presente documento en los ejemplos. Los métodos para “enriquecer” una población celular por tamaño o densidad son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU.

5.627.052. Estas etapas se pueden usar además de enriquecer la población celular por especificidad de antígeno.

Métodos de humanización de anticuerpos

En otro ejemplo, la presente memoria descriptiva contempla métodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. Los métodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que pueden aplicarse a anticuerpos anti-CGRP se indican, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US 2009/0022659 de Olson et al., y en la patente de EE. UU. n.° 7.935.340 de García-Martínez et al.

Ensayos de detección

La memoria descriptiva también incluye ensayos de detección diseñados para ayudar en la identificación de enfermedades y trastornos asociados con CGRP en pacientes que muestran síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CGRP. Por ejemplo, la presente memoria descriptiva incluye ensayos que detectan la insensibilidad a la insulina (resistencia) o la utilización de glucosa en un sujeto. Dicho sujeto puede estar opcionalmente en ayunas o en estado posprandial.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP de la memoria descriptiva, o sus fragmentos de unión a CGRP, se usan para detectar la presencia de CGRP en una muestra biológica obtenida de un paciente que presenta síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CGRP. La presencia de CGRP, o niveles elevados del mismo en comparación con los niveles de CGRP previos a la enfermedad en una muestra biológica comparable, puede ser beneficiosa para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado con CGRP.

Otro ejemplo de la memoria descriptiva proporciona un ensayo de diagnóstico o detección para ayudar en el diagnóstico de enfermedades o trastornos asociados con CGRP en pacientes que presentan síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CGRP identificado en el presente documento, que comprende analizar el nivel de expresión de CGRP en una muestra biológica de dicho paciente. utilizando un anticuerpo anti-CGRP modificado postraduccionalmente o un fragmento de unión del mismo. El anticuerpo anti-CGRP o el fragmento de unión del mismo puede modificarse postraduccionalmente para incluir un resto detectable, tal como se indicó anteriormente en la descripción.

El nivel de CGRP en la muestra biológica se puede determinar utilizando un anticuerpo anti-CGRP modificado o un fragmento de unión del mismo como se establece en el presente documento, y comparando el nivel de CGRP en la muestra biológica con un nivel patrón de CGRP (por ejemplo, el nivel en muestras biológicas normales). El médico experto comprenderá que puede existir cierta variabilidad entre las muestras biológicas normales y lo tendrá en cuenta al evaluar los resultados. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP de la memoria descriptiva se pueden usar para correlacionar los niveles de expresión de CGRP con una etapa particular del metabolismo alterado de la glucosa. Por ejemplo, la correlación de los niveles de CGRP circulante con los niveles de glucosa y/o insulina permitirá establecer el nivel de insensibilidad a la insulina o hiperglucemia. La sensibilidad a la insulina además se puede medir en un sujeto utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Muniyappa et al. (Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 294:E15-E26, 2008). En resumen, la sensibilidad a la insulina se puede medir utilizando una diversidad de métodos, incluido el pinzamiento de glucosa euglucémico hiperinsulinémico, la prueba de supresión de insulina, QUICKI, HOMA, 1 /insulina o el índice de Matusda. Los expertos en la técnica pueden medir el CGRP en numerosos sujetos para establecer intervalos de expresión de CGRP que corresponden a etapas clínicamente definidas de desarrollo diabético o prediabetes.

El ensayo mencionado anteriormente también puede ser útil para controlar una enfermedad o trastorno, en el que el nivel de CGRP obtenido en una muestra biológica de un paciente que se cree que tiene una enfermedad o trastorno asociado con CGRP se compara con el nivel de CGRP en muestras biológicas anteriores del mismo paciente, para determinar si el nivel de CGRP en dicho paciente ha cambiado, por ejemplo, con un régimen de tratamiento. Los expertos en la técnica comprenderán que midiendo el CGRP en el paciente a diferentes intervalos, se puede determinar la progresión del deterioro de la capacidad de un individuo para metabolizar la glucosa.

La memoria descriptiva también se dirige a un método de formación de imágenes in vivo que detecta la presencia de células que expresan CGRP, que comprende administrar una cantidad eficaz desde el punto de vista diagnóstico de una composición de diagnóstico. Dicha detección puede ser útil como parte de un régimen de planificación para el diseño de un protocolo de tratamiento eficaz para la diabetes o para pacientes con riesgo de desarrollar diabetes.

En un ejemplo, los métodos de la memoria descriptiva incluyen una o más composiciones usadas para tratar el metabolismo alterado de la glucosa, tal como la resistencia a la insulina, la secreción alterada de insulina o la hiperglucemia, en combinación con los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento. De particular interés son, por ejemplo, una o más de sulfonilureas, agonistas de PPAR-gamma, agonistas del receptor de GPL-1, inhibidor de dipeptidil peptidasa IV, análogos de amilina, biguanidas, agonistas del receptor de dopamina D2, meglitinidas, inhibidor de alfa-glucosidasa, secuestrante del ácido biliar antidislipidémico, insulina, terapia con citoquinas, terapia génica y terapia con anticuerpos, así como un anticuerpo anti-CGRP o fragmento del mismo. Los ejemplos de biguanidas incluyen: metformina, tal como Glucophage y Glucophage XR (Bristol Myers Squibb/Merck Serono), Fortamet (Watson), Glumetza (Biovail/Depomed/Santarus) y genéricos. Los ejemplos de sulfonilureas incluyen glimepirida, tal como Amaryl (Sanofi) y genéricos; glipizida, tal como Glucotrol y Glucotrol XL (Pfizer) y genéricos; gliburida/glibenclamida, tal como Diabeta (Sanofi), Micronase/Glynase (Pfizer) y genéricos; metformina gliburida, tal como Glucovance (Bristol Myers Squibb), Suguan M (Sanofi-Aventis), GlicoRest, GlucoNorm (Abiogen), Bi-Euglucon (Roche) y genéricos; metformina glipizida, tal como Metaglip (Bristol Myers Squibb) y genéricos. Los ejemplos de agonistas de PPAR-gamma incluyen: rosiglitazona, tal como Avandia (GlaxoSmithKline); pioglitazona, tal como Actos (Takeda) y genéricos; rosiglitazona metformina, tal como Avandamet (GlaxoSmithKline); pioglitazona metformina, tal como Actoplus Met XR (Takeda); pioglitazona glimepirida, tal como Avandaryl/Avaglim (GlaxoSmithKline); pioglitazona glimepirida, tal como Duetact/Tandemact/Sonias (Takeda). Los ejemplos de agonistas del receptor de GLP-1 incluyen: exenatida, tal como Byetta (Bristol Myers Squibb/AstraZeneca); liraglutida, tal como Victoza (Novo Nordisk); exenatida LAR, tal como Bydureon (Bristol Myers Squibb/AstraZeneca). Los ejemplos de inhibidores de la dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV o DPP4) incluyen: sitagliptina, tal como Januvia, Merck; vildagliptina, tal como Galvus (Novartis); saxagliptina, tal como Onglyza (Bristol Myers Squibb/AstraZeneca); alogliptina, tal como Nesina (Takeda/Furiex); linagliptina, tal como Trazenta (Boehringer Ingelheim/Eli Lilly); teneligliptina, tal como Tenelia (Mitsubishi Tanabe/Daiichi Sankyo); sitagliptina metformina, tal como Janumet (Merck) y Janumet XR (Merck); sitagliptina simvastatina, tal como JuviSync (Merck); vildagliptina metformina, tal como Eurcreas (Novartis); saxagliptina metformina, tal como Kombiglyze/Kombiglyze XR (AstraZeneca/Bristol Myers Squibb); alogliptina pioglitazona, tal como como Liovel (Takeda/Furiex); linagliptina metformina, tal como Jentadueto (Boehringer Ingelheim/Eli Lilly). Los ejemplos de meglitinidas incluyen: repaglinida, tal como GlucoNorm/Prandin/NovoNorm (Daiichi Sankyo/Fournier Pharma/Novo Nordisk); nateglinida, tal como Starlix (Novartis), Fastic (Daiichi Sankyo), Starsis (Astellas) y genéricos; mitiglinida, tal como Glufast (Kissei/Takeda). Los ejemplos de inhibidores de alfa-glucosidasa incluyen: acarbosa, tal como Precose/Glucobay (Bayer) y genéricos; miglitol, tal como Glyset (Pfizer), Diastabol (Sanofi), Seibule (Sanwa Kagaku) y genéricos; voglibosa, tal como Basen (Takeda) y genéricos. Los ejemplos de secuestrantes de ácidos biliares incluyen: colesevelam, tal como Cholestagel (Sanofi), Welchol (Daiichi Sankyo). El ejemplo de un agonista del receptor de dopamina D2 incluye bromocriptina, tal como Cycloset (Santarus). El ejemplo de un análogo de amilina incluye pramlintida, tal como Symlin (Bristol Myers Squibb/AstraZeneca). Los ejemplos de insulinas de acción rápida incluyen: insulina lispro, tal como Humalog (Eli Lilly); insulina aspart, tal como NovoLog (Novo Nordisk), NovoRapid (Novo Nordisk), insulina glulisina, tal como Apidra (Sanofi). Los ejemplos de insulinas humanas normales incluyen: Humulin/Umuline Rapide (Eli Lilly), Novolin R (Novo Nordisk), Actrapid (Sanofi). Los ejemplos de insulinas de acción intermedia incluyen: Humulin N (Eli Lilly), Novolin N (Novo Nordisk). Los ejemplos de insulinas de larga duración incluyen: insulina glargina, tal como Lantus (Sanofi) e insulina detemir, tal como Levemir (Novo Nordisk).

La presente memoria descriptiva proporciona además un kit para detectar la unión de un anticuerpo anti-CGRP de la memoria descriptiva a CGRP. En particular, el kit puede usarse para detectar la presencia de un CGRP específicamente reactivo con un anticuerpo anti-CGRP de la memoria descriptiva o un fragmento inmunorreactivo del mismo. El kit también puede incluir un anticuerpo unido a un sustrato, un anticuerpo secundario reactivo con el antígeno y un reactivo para detectar una reacción del anticuerpo secundario con el antígeno. Tal kit puede ser un kit ELISA y puede comprender el sustrato, anticuerpos primarios y secundarios cuando sea apropiado, y cualquier otro reactivo necesario, tales como restos detectables, sustratos enzimáticos y reactivos de color, por ejemplo, como se describe en este documento. El kit de diagnóstico también puede tener la forma de un kit de inmunotransferencia. El kit de diagnóstico también puede tener la forma de un kit quimioluminiscente (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). El kit de diagnóstico también puede ser un kit de detección basado en lantánidos (PerkinElmer, San José, CA).

Un médico experto comprenderá que una muestra biológica incluye, pero no se limita a sueros, plasma, orina, saliva, secreciones mucosas, líquido pleural, líquido sinovial y líquido cefalorraquídeo.

Métodos para mejorar o reducir los síntomas, tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con CGRP

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, son útiles para mejorar o reducir los síntomas, tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con el CGRP. Los anticuerpos anti-CGRP descritos en este documento, o fragmentos de los mismos, así como combinaciones, también se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz a pacientes que necesitan tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP en forma de una composición farmacéutica como se describe con mayor detalle a continuación.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, son útiles para mejorar o reducir los síntomas, tratar o prevenir la tolerancia alterada a la glucosa, la resistencia a la insulina (insensibilidad), la secreción alterada de insulina, la lipotoxicidad, la hiperglucemia, el fallo de las células beta pancreáticas como resultado de diabetes, prediabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 o diabetes gestacional.

En ejemplos ilustrativos, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, pueden administrarse a un individuo con riesgo de desarrollar diabetes, por ejemplo, un individuo diagnosticado con prediabetes. Sin intención de estar limitado por la teoría, se cree que restableciendo la sensibilidad a la insulina, los anticuerpos anti-CGRP del presente documento pueden retrasar o prevenir la progresión a la diabetes.

En ejemplos ilustrativos adicionales, los anticuerpos anti-CGRP descritos en este documento, o fragmentos de los mismos, pueden administrarse a un paciente que no alcanza la normoglucemia con la administración de otro tratamiento, por ejemplo, un tratamiento con metformina, pioglitazona, una sulfonilurea, una glinida, un medicamento oral de tiazolidindiona (TZD), tal como pioglitazona, un agonista del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1), tal como exenatida, un inhibidor de DPP4, tal como sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina, alogliptina, linagliptina o teneligliptina, o una terapia combinada, tal como metformina y pioglitazona, metformina y una sulfonilurea, metformina y una glinida, metformina y un TZD, metformina y pioglitazona, metformina y un agonista de GLP-1, metformina y exenatida, sitagliptina y metformina, sitagliptina y simvastatina, vildagliptina y metformina, saxagliptina y metformina, alogliptina y pioglitazona, o linagliptina y metformina.

En un ejemplo ilustrativo adicional, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, se administran para la prevención o el tratamiento de la obesidad, por ejemplo, a individuos que tienen un índice de masa corporal de al menos 25. Sin pretender estar limitado por la teoría, se cree que los anticuerpos anti-CGRP del presente documento pueden aumentar la utilización de glucosa periférica y/o hepática, aumentando así la tasa metabólica y contribuyendo a la pérdida de peso. Dichos anticuerpos anti-CGRP pueden administrarse en combinación con otro agente antiobesidad, tal como orlistat, rimonabant, sibutramina, un péptido YY (PYY, un péptido de 36 aminoácidos que reduce el apetito), un análogo de PYY, un antagonista de CB-1, rimonabant, una leptina, un análogo de la leptina o una fentermina.

Administración

En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se administran a un sujeto a una concentración de entre aproximadamente 0,1 y 100,0 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se administran a un sujeto a una concentración de aproximadamente 0,4 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se administran a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada veintiséis semanas o menos, tal como una vez cada dieciséis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, una vez cada cuatro semanas o menos, una vez cada dos semanas o menos, una vez cada semana o menos, o una vez al día o menos.

Los fragmentos Fab pueden administrarse cada dos semanas o menos, cada semana o menos, una vez al día o menos, varias veces al día y/o cada pocas horas. En un ejemplo de la memoria descriptiva, un paciente recibe fragmentos Fab de 0,1 mg/kg a 40 mg/kg por día administrados en dosis divididas de 1 a 6 veces al día, o en una forma de liberación sostenida, eficaz para obtener los resultados deseados.

Debe entenderse que la concentración del anticuerpo o Fab administrado a un paciente dado puede ser mayor o menor que los ejemplos de concentraciones de administración expuestos anteriormente en los dos párrafos anteriores.

Los expertos en la técnica pueden determinar una dosificación y una frecuencia de administración eficaces a través de la experimentación habitual, por ejemplo guiada por la descripción del presente documento y las indicaciones en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S. y Parker, K. L. (2006), Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Nueva York, McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C. y Mycek, M. J. (2006), Pharmacology, Lippincott's Illustrated Reviews, Filadelfia, Lippincott Williams & Wilkins; y Golan, D. E. (2008), Principles of Pharmacology: The Pathophysiologic Basics of Drug Therapy, Filadelfia, Pensilvania, [etc.], Lippincott Williams & Wilkins.

En otro ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se administran a un sujeto en una formulación farmacéutica.

Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para la administración a un mamífero. Tales composiciones pueden formularse específicamente para su administración a través de una o más de una serie de vías, incluidas, entre otras, la vía bucal, epicutánea, epidural, por inhalación, intraarterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal a través un enema o supositorio, subcutánea, subdérmica, sublingual, transdérmica y transmucosa. Además, la administración puede realizarse mediante inyección, polvo, líquido, gel, gotas u otros medios de administración.

En un ejemplo de la memoria descriptiva, los anticuerpos anti-CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, pueden administrarse opcionalmente en combinación con uno o más agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgésicos, antihistamínicos, antipiréticos, antiinflamatorios, antibióticos, antivirales y anticitoquinas. Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas y moduladores de TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), hepcidina, incluidos anticuerpos reactivos frente a cualquiera de los anteriores y anticuerpos reactivos frente a cualquiera de sus receptores. Los agentes activos también incluyen, entre otros, ácidos 2-arilpropiónicos, aceclofenaco, acemetacina, ácido acetilsalicílico (aspirina), alclofenaco, alminoprofeno, amoxiprina, ampirona, ácidos arilalcanoicos, azapropazona, benorilato, benoxaprofeno, bromfenaco, carprofeno, celecoxib, salicilato de magnesio colina, clofezona, inhibidores de la COX-2, dexibuprofeno, dexketoprofeno, diclofenaco, diflunisal, droxicam, etenzamida, etodolaco, etoricoxib, faislamina, ácidos fenámicos, fenbufeno, fenoprofeno, ácido flufenámico, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ibuproxam, indometacina, indoprofeno, kebuzona, ketoprofeno, ketorolac, lornoxicam, loxoprofeno, lumiracoxib, salicilato de magnesio, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, meloxicam, metamizol, salicilato de metilo, mofebutazona, nabumetona, naproxeno, ácidos N-arilantranílicos, factor de crecimiento nervioso (NGF), oxametacina, oxaprozina, oxicamas, oxifenbutazona, parecoxib, fenazona, fenilbutazona, fenilbutazona, piroxicam, pirprofeno, profenos, proglumetacina, derivados de pirazolidina, rofecoxib, salicilato de salicilo, salicilamida, salicilatos, sustancia P, sulfinpirazona, sulindaco, suprofeno, tenoxicam, ácido tiaprofénico, ácido tolfenámico, tolmetina y valdecoxib.

Un antihistamínico puede ser cualquier compuesto que se oponga a la acción de la histamina o a su liberación desde las células (por ejemplo, mastocitos). Los antihistamínicos incluyen, entre otros, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos de cetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabastina, loratidina, metescopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometazina, pirilamina, terfenadina y tranilast.

Los antibióticos incluyen, entre otros, amikacina, aminoglucósidos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, arsfenamina, azitromicina, azlocilina, aztreonam, bacitracina, carbacefem, carbapenémicos, carbenicilina, cefaclor, cefadroxilo, cefalexina, cefalotina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefoxitina, cefpodoxima, cefprozil, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cefalosporinas, cloranfenicol, cilastatina, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, cloxacilina, colistina, cotrimoxazol, dalfopristina, demeclociclina, dicloxacilina, diritromicina, doripenem, doxiciclina, enoxacina, ertapenem, eritromicina, etambutol, flucloxacilina, fosfomicina, furazolidona, ácido fusídico, gatifloxacina, geldanamicina, gentamicina, glicopéptidos, herbimicina, imipenem, isoniazida, kanamicina, levofloxacina, lincomicina, linezolida, lomefloxacina, loracarbef, macrólidos, mafenida, meropenem, meticilina, metronidazol, mezlocilina, minociclina, monobactámicos, moxifloxacina, mupirocina, nafcilina, neomicina, netilmicina, nitrofurantoína, norfloxacina, ofloxacina, oxacilina, oxitetraciclina, paromomicina, penicilina, penicilinas, piperacilina, platensimicina, polimixina B, polipéptidos, prontosil, pirazinamida, quinolonas, quinupristina, rifampicina, rifampina, roxitromicina, espectinomicina, estreptomicina, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanilimida, sulfasalazina, sulfisoxazol, sulfonamidas, teicoplanina, telitromicina, tetraciclina, tetraciclinas, ticarcilina, tinidazol, tobramicina, trimetoprima, trimetoprima-sulfametoxazol, troleandomicina, trovafloxacina y vancomicina.

Los agentes activos también incluyen aldosterona, beclometasona, betametasona, corticosteroides, cortisol, acetato de cortisona, acetato de desoxicorticosterona, dexametasona, acetato de fludrocortisona, glucocorticoides, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, esteroides y triamcinolona. También se contempla cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.

Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un vehículo, normalmente un líquido, en donde se formula un agente terapéutico activo. En un ejemplo de la memoria descriptiva, el agente terapéutico activo es un anticuerpo humanizado descrito en este documento, o uno o más fragmentos del mismo. El excipiente generalmente no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica y características de liberación. Se pueden encontrar ejemplos de formulaciones, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Grennaro, A., ed., 1995.

Tal como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" o un "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción que sean fisiológicamente compatibles. En un ejemplo, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la memoria descriptiva. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos suplementarios.

Las composiciones farmacéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La memoria descriptiva contempla que la composición farmacéutica se presente en forma liofilizada. La composición se puede formular como disolución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La memoria descriptiva contempla además la inclusión de un estabilizante en la composición farmacéutica. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos.

En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. Al incluir un agente tal como sales de monoestearato y gelatina, se puede prolongar la absorción de las composiciones inyectables. Además, el polipéptido alcalino se puede formular en una formulación de liberación prolongada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos los implantes y los sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, poli(ácido láctico) y copolímeros polilácticopoliglicólico (PLG). Los expertos en la técnica conocen muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones.

Para cada uno de los ejemplos citados, los compuestos pueden administrarse mediante una diversidad de formas de dosificación. Se contempla cualquier forma de dosificación biológicamente aceptable conocida por los expertos en la técnica y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de tales formas de dosificación incluyen, sin limitación, polvos reconstituibles, elixires, líquidos, disoluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, sellos, inhalantes, inhalantes en aerosol, parches, inhalantes de partículas, implantes, implantes depot, inyectables (incluyendo subcutáneos, intramusculares, intravenosos e intradérmicos), infusiones y combinaciones de los mismos.

La descripción anterior de diversos ejemplos ilustrados de la memoria descriptiva no pretende ser exhaustiva ni limitar la memoria descriptiva a la forma precisa descrita. Aunque los ejemplos específicos y los ejemplos para la memoria descriptiva se describen en el presente documento con fines ilustrativos, son posibles diversas modificaciones equivalentes dentro del alcance de la memoria descriptiva, como reconocerán los expertos en la técnica pertinente. Las indicaciones proporcionadas en este documento de la memoria descriptiva se pueden aplicar a otros fines distintos de los ejemplos descritos anteriormente.

Se pueden realizar estos y otros cambios en la memoria descriptiva a la luz de la descripción detallada anterior. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos utilizados no deben interpretarse como una limitación de la memoria descriptiva a los ejemplos específicos descritos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones. En consecuencia, la memoria descriptiva no está limitada por la descripción, sino que el alcance de la memoria descriptiva debe determinarse completamente por las siguientes reivindicaciones.

La memoria descriptiva se puede practicar de maneras distintas a las descritas concretamente en la descripción y los ejemplos anteriores. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la memoria descriptiva a la luz de las indicaciones anteriores y, por lo tanto, están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ciertas indicaciones relacionadas con métodos para obtener una población clonal de células B específicas de antígeno se divulgaron en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 60/801.412, presentada el 19 de mayo, 2006.

Se describen ciertas indicaciones relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados de conejo y las modificaciones de secuencia preferidas para mantener la afinidad de unión al antígeno en la solicitud internacional n.° PCT/US2008/064421, correspondiente a la publicación internacional n.° WO/2008/144757, titulada "Nuevos métodos de humanización de anticuerpos de conejo y anticuerpos de conejo humanizados", presentada el 21 de mayo, 2008.

Ciertas indicaciones relacionadas con la producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos utilizando levaduras competentes para el apareamiento y los métodos correspondientes se describen en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 11/429.053, presentada el 8 de mayo, 2006 (publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° US2006/0270045).

Ciertos polinucleótidos y polipéptidos de anticuerpos contra CGRP se describen en la lista de secuencias que acompaña a esta solicitud de patente.

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de cómo fabricar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que se considera la invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados; y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Ejemplo de referencia

Se trataron ratas normales con Ab14 100 mg/kg (vía intravenosa, administración única 48 h antes del procedimiento de pinzamiento) y los efectos se compararon con metformina 500 mg/kg (vía oral, 2 administraciones 24 h y 4 h antes del procedimiento de pinzamiento). El anticuerpo usado en este ejemplo consistía en cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas de SEQ ID No :132 y 134.

La glucosa en sangre se midió en condiciones de alimentación antes del tratamiento, 18 horas después del tratamiento con metformina y Ab14 y 42 horas después del tratamiento con Ab14. Los 2 compuestos no afectaron a la glucosa en sangre en estas condiciones. La glucosa en sangre se midió en ayunas, justo antes del pinzamiento y solo la metformina tuvo un efecto de disminución significativo (17%). La insulina plasmática, medida en condiciones de alimentación antes del tratamiento y 18 h después del tratamiento con metformina y 42 h después del tratamiento con Ab14, disminuyó ligeramente por los 2 compuestos, así como el índice de resistencia a la insulina HOMA-IR (no significativo).

Se obtuvieron muestras de plasma de animales tratados con Ab14 justo antes del procedimiento de pinzamiento, 48 horas después del tratamiento, y se determinó la concentración de Ab14. Los resultados de este análisis confirmaron unas exposiciones sistémicas que oscilaron entre 642 y 797 pg/ml de Ab14 en ratas que se sometieron al procedimiento de pinzamiento.

Para evaluar el efecto sobre la sensibilidad a la insulina corporal, se realizó un procedimiento de pinzamiento utilizando 0,3 U/kg/h de insulina y 3H-glucosa. Las ratas se mantuvieron en ayunas durante 6 horas antes de los 180 minutos de perfusión. El estado estacionario se alcanzó después de 140 minutos de infusión y se calcularon las medias de la tasa de infusión de glucosa (“glucose infusion rate”, GIR), el recambio de glucosa corporal (“glucose turn over”, GTO), la producción de glucosa hepática (“hepatic glucose production”, HGP), la glucólisis y la síntesis de glucógeno a partir de 140 min hasta 180 min. Se administró un bolo de 14-C-2-desoxiglucosa 1 hora antes del final del pinzamiento para medir la utilización de glucosa específica del tejido. Como era de esperar, la metformina aumentó significativamente la GIR (27%) y el GTO (30%), al aumentar la glucólisis y la síntesis de glucógeno. La metformina aumentó la utilización de glucosa en el músculo vasto lateral mixto (VL, 49%, p<0,05), en el músculo extensor largo de los dedos glucolítico (EDL, 19%, NS) y disminuyó la utilización de glucosa en el corazón (-39%, p<0,01), probablemente debido a la estimulación de la oxidación de ácidos grasos miocárdicos. El Ab14 tendió a aumentar GIR y GTO (NS) y tuvo un efecto más fuerte que la metformina sobre la utilización de glucosa en VL (70%, p<0,01), en EDL (26%, NS) y en el músculo sóleo oxidativo (27%, NS). También tendió a aumentar la utilización de glucosa en el corazón (21%, NS). Al igual que la metformina, Ab14 no afectó la tasa de utilización de glucosa en los tejidos adiposos blancos (profundos y subcutáneos).

En conclusión, Ab14 mostró una buena tendencia a mejorar la utilización de glucosa corporal en ratas normales después del tratamiento agudo con un efecto significativo sobre la tasa de utilización de glucosa en los músculos (VL).

Métodos

Se alojaron ratas macho Sprague Dawley en jaulas de alojamiento (1500 cm2 x 21 cm) durante toda la fase experimental. Las camas de las jaulas de los animales se cambiaron una vez por semana. Se alojaron en grupos de 3-4 animales durante el período de aclimatación y luego en un alojamiento individual después de la cirugía hasta el procedimiento de pinzamiento. Se utilizó un ciclo de luz invertido de 12 horas (a las 8:00 am luces apagadas), 22 ± 2 °C y 55 ± 10% de humedad relativa. Se proporcionó dieta convencional (RM1 (E) 801492, SDS) y agua del grifo ad libitum.

Después de un período de aclimatación de 2 semanas, las ratas se anestesiaron (isoflurano) y se les colocó un catéter en la vena femoral. A esto le siguió un período de recuperación de 5-6 días antes del procedimiento de pinzamiento.

La glucosa en sangre (GS) se midió entre las 7:30 y las 8:00 (justo antes del apagado de la luz) am desde la punta de la cola con un glucómetro y se realizó una extracción de sangre (en EDTA) justo después para medir la insulina plasmática. La siguiente tabla describe las condiciones:

Las muestras de plasma se mantuvieron a -80 °C hasta la medición de la insulina (usando el método ELISA).

Se obtuvo una muestra de sangre (aproximadamente 200 pL) justo antes del procedimiento de pinzamiento para cada animal del grupo 2, se procesó para obtener el plasma (aproximadamente 60 pL) y se mantuvo a -80 °C para la determinación posterior de las concentraciones de Ab14 utilizando una plataforma ELISA Meso Scale Discovery (MSD).

El vehículo y Ab14 se administraron por vía i.v. 48h antes de la T0 del procedimiento de pinzamiento (a las 02:00 p.m dos días antes del pinzamiento).

La metformina se administró por vía oral 24 h y 4 h antes de la T0 del procedimiento de pinzamiento (a las 02:00 p.m del día anterior al pinzamiento y a las 10:00 am del día del pinzamiento).

Las ratas se mantuvieron en ayunas 6 horas antes del inicio del pinzamiento (a aproximadamente 8 h, justo después de la extracción de sangre).

El pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico se realizó mediante 3H-glucosa como trazador e infusión de insulina 0,3U/kg/h de 02:00 pm (T0) a 5:00 pm (T+3h). Se infundió una disolución de glucosa en paralelo y la tasa de infusión se ajustó para alcanzar el estado estacionario (aproximadamente 100 /-10 mg/dL). La glucosa en sangre se midió desde la punta de la cola usando glucómetros cada 10 minutos. Se recolectó sangre (10 pL) de la punta de la cola durante la última hora (estado estacionario) y se evaluaron los siguientes parámetros: tasa de infusión de glucosa; tasa de utilización de glucosa corporal; tasa de producción de glucosa hepática; glucógeno corporal total y tasas glucolíticas.

Para determinar la tasa de utilización de glucosa tisular individual, se realizó una inyección en bolo de 100 pCi por rata de desoxi-D-glucosa 2-14C (14C-2-DOG) a través de la vena femoral 60 min antes del final de la infusión de D-[3-3H]-glucosa. Se determinó la desaparición de 14C-2-DOG del plasma y la concentración de glucosa en gotas de 10 pl de sangre extraídas de la punta de la vena de la cola a los 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección. Al final del experimento, se diseccionaron los músculos vasto lateral (VL), extensor largo de los dedos (EDL) y sóleo, tejido adiposo blanco inguinal y del epidídimo, vértice del corazón y piel (como control negativo), se congelaron rápidamente y se mantuvieron a -80 °C. Se disolvió un trozo de cada tejido en NaOH 1 M y luego se neutralizó con HCl 1 M. La D-2-14C desoxiglucosa 6-fosfato se precipitó diferencialmente mediante el uso de una disolución de hidróxido de zinc (0,3 M) o una disolución de ácido perclórico (al 6%). Se midió el contenido de radiactividad de ambos para evaluar la captación de glucosa expresada como ng/mg/min.

El nivel de insulina en plasma se midió al final del pinzamiento.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Los histogramas se analizaron usando un ANOVA de una vía con una prueba de Dunnett post-hoc y las curvas se analizaron usando un ANOVA de dos vías con una prueba de Bonferroni post-hoc. Una diferencia se consideró significativa cuando el valor de p fue <0,05. NS: no significativo.

Resultados y análisis

Medición de glucosa e insulina en sangre. En condiciones de alimentación, el nivel de glucosa en sangre no se vio afectado 42 h después del tratamiento con 100 mg/kg de Ab 14 y 18 h después del tratamiento con 500 mg/kg de metformina en comparación con el grupo del vehículo (figura 1A). Al mismo tiempo, Ab14 y metformina redujeron el nivel de insulina en plasma en un 11% y un 18% respectivamente (no significativo, figura 1B). Luego, el índice de resistencia a la insulina HOMA-IR disminuyó de manera similar en comparación con el grupo del vehículo (figura 1C). Por otro lado, en condiciones de ayuno de 6 horas, la metformina disminuyó significativamente la glucosa en sangre en un 17% 30 horas después del tratamiento (figura 1D).

Flujos de glucosa corporal. Se realizaron pinzamientos euglucémicos hiperinsulinémicos en condiciones de ayuno de 6 horas, 48 h después de la administración única de Ab14 100 mg/kg y 4 h después de la última administración de metformina 500 mg/kg.

La metformina aumentó significativamente la evolución de GIR a partir de los 60 minutos del inicio de la infusión en comparación con el grupo del vehículo. El Ab14 mostró una tendencia a aumentar la evolución de GIR principalmente después de 130 minutos de infusión (figura 2A).

La meseta de la tasa de infusión de glucosa se alcanzó a partir de los 140 min en todos los grupos. El nivel de glucosa en sangre fue similar en todos los grupos durante este estado estacionario (figura 2B). El nivel de insulina en plasma al final del pinzamiento también fue similar en todos los grupos (figura 2C). El nivel de insulina plasmática alcanzado al final del pinzamiento fue casi el mismo que el medido en condiciones de alimentación, es decir, la dosis de insulina utilizada para obtener hiperinsulinemia fue fisiológica.

A continuación, se calcularon los flujos de glucosa desde los 140 minutos hasta los 180 minutos de infusión (figura 3). Ab14 y metformina aumentaron la tasa de infusión de glucosa en un 18% (NS) y un 27% (p<0,05), respectivamente, así como el recambio de glucosa en un 18% (NS) y un 30% (p<0,05), respectivamente. La producción de glucosa hepática fue totalmente inhibida por esta dosis suprafisiológica de insulina en los 3 grupos. Ab14 no afectó la tasa de glucólisis mientras que la metformina la aumentó en un 43% (NS). Ab14 aumentó la tasa de síntesis de glucógeno en un 23% de manera similar a la metformina (NS).

También se determinaron las tasas de utilización de glucosa en tejidos individuales usando una inyección en bolo de 100 pCi por rata de desoxi-D-glucosa 2-14C (14C-2-DOG) a través de la vena femoral introducida 60 min antes del final de la infusión de D-[3-3H]-glucosa. Se midió el contenido de radiactividad de ambos para evaluar la captación de glucosa expresada como ng/mg/min. Como se muestra en la figura 4A-C, la metformina aumentó la utilización de glucosa en el músculo vasto lateral mixto (VL, 49% p<0,05), en el músculo extensor largo de los dedos glucolítico (EDL, 19% NS) y disminuyó la utilización de glucosa en el corazón (-39%, p<0,01), que es un efecto conocido de la metformina que se cree que se debe a la estimulación de la oxidación de ácidos grasos miocárdicos. Ab14 tendió a aumentar la tasa de infusión de glucosa y el recambio de glucosa corporal (NS) y tuvo un efecto más fuerte que la metformina sobre la utilización de glucosa en el VL (70%, p<0,01), en EDL (26%, NS) y en el músculo sóleo oxidativo (27%, NS). También tendió a aumentar la utilización de glucosa en el corazón (21%, NS). Al igual que la metformina, Ab14 no afectó a la tasa de utilización de glucosa en los tejidos adiposos blancos (profundos y subcutáneos).

Análisis de la concentración plasmática de Ab14. Las concentraciones plasmáticas de Ab14 para los animales del grupo 2 que se sometieron al procedimiento de pinzamiento oscilaron entre 642 y 797 pg/mL y soportaron hasta 48 horas de exposición sistémica.

Conclusión. El tratamiento agudo con Ab14 disminuyó ligeramente la insulina plasmática y tendió a aumentar la utilización de glucosa corporal al aumentar la síntesis de glucógeno y la utilización de glucosa muscular.

Ejemplo 2 - Ejemplo de referencia

Este ejemplo evalúa la capacidad de Ab14 para mejorar la sensibilidad a la insulina en un modelo de resistencia a la insulina en ratas. En este modelo, las ratas fueron alimentadas con una dieta rica en grasas (69%) y rica en fructosa (HFD) (14%) durante 6 semanas para inducir la intolerancia a la glucosa, con un aumento significativo del nivel de insulina en plasma y un ligero aumento de la glucemia en comparación con los animales control alimentados con pienso normal. El anticuerpo usado en este ejemplo constaba de cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas de SEQ ID NO:132 y 134.

Las ratas alimentadas con HFD de seis semanas se trataron durante 2 semanas con Ab14 y se realizó un pinzamiento euglucémico hiperinsulinémico de 2 etapas para evaluar la sensibilidad a la insulina. Se utilizó una dosis fisiológica de insulina durante la primera etapa y una dosis farmacológica de insulina durante la segunda etapa para evaluar los efectos de la sensibilidad a la insulina periférica y hepática, respectivamente, en estas dos condiciones.

Resumen

Después de 6 semanas de HFD, las ratas se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento según su intolerancia a la glucosa (cálculo del AUC durante una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT)) y su HOMA-IR (índice de resistencia a la insulina). Se trataron ratas HFD durante 15 días (i.v., dos administraciones con una semana de diferencia) con Ab14 a 10, 30 y 100 mg/kg/semana, o diariamente con metformina 200 mg/kg/día en el agua de bebida.

El peso corporal y el consumo de alimentos se midieron 3 veces por semana hasta los 10 días de tratamiento. El HOMA-IR se midió los días 10 y 15. Se realizó un pinzamiento de 2 etapas (5 mU/kg/min y luego 15 mU/kg/min de insulina) el día 15 o 16. El recambio de glucosa (GTO) se evaluó usando una infusión de trazador de 3H-glucosa durante el procedimiento de pinzamiento.

Al final del estudio, en comparación con las ratas de control alimentadas con pienso normal, se observó que las ratas HFD exhibieron aumentos significativos en el peso corporal, la glucosa en sangre en ayunas, la insulina plasmática y el péptido C, así como una disminución significativa en la tasa de infusión de glucosa (GIR) durante el pinzamiento euglucémico hiperinsulinémico de 2 etapas.

En comparación con el grupo de control de HFD más vehículo, el tratamiento con Ab14 no tuvo efectos sobre el peso corporal o el consumo de alimentos, mientras que en el grupo de metformina disminuyó significativamente en ambos parámetros.

El Ab14 a 100 mg/kg disminuyó significativamente HOMA-IR en un 38% después de 15 días de tratamiento (al disminuir la glucosa en sangre en ayunas y la insulina plasmática). La metformina tuvo un efecto de disminución no significativo (ns) en HOMA-IR en el día 15. El péptido C también disminuyó significativamente con el tratamiento con Ab14 (en un 30% con 10 mg/kg y en un 29% con 100 mg/kg).

Se observó un aumento de GIR (ns) en los grupos tratados con Ab14 en comparación con el grupo de control de vehículo HFD durante la primera etapa del pinzamiento, mientras que la metformina tuvo un efecto de aumento sobre GIR que fue comparativamente menor en magnitud. El Ab14 a 30 o 100 mg/kg y el tratamiento con metformina aumentaron significativamente la GIR durante la segunda etapa del pinzamiento (en un 36, 28 y 27% respectivamente).

El Ab14 a 30 mg/kg tendió a aumentar el GTO en comparación con el grupo de control de vehículo HFD durante la primera etapa (en un 17%, ns) del procedimiento de pinzamiento. El Ab14 a 30 mg/kg tuvo un ligero efecto de aumento (ns) sobre la glucólisis y la síntesis de glucógeno durante ambas etapas del pinzamiento.

La producción de glucosa hepática (HGP, por sus siglas en inglés) disminuyó leve pero no significativamente con el tratamiento con Ab14 o metformina durante la primera etapa de pinzamiento (entre 11-20%). Durante la segunda etapa, Ab14 disminuyó significativamente la HGP a 10 mg/kg (en un 78%) en comparación con el grupo de control de vehículo HFD, y Ab14 inhibió completamente la HGP a 30 o 100 mg/kg y metformina.

En conclusión, se observó una mejora en la resistencia a la insulina (principalmente hepática) después de la administración intravenosa de Ab14 en el modelo de rata HFD.

Métodos

Se alojaron 82 ratas Sprague Dawley (8 semanas de edad al comienzo del estudio, con un peso promedio de aproximadamente 250 gramos) en jaulas de alojamiento (904 cm2 x 23 cm) durante toda la fase experimental. Las camas de las jaulas de los animales se cambiaron 3 veces por semana. Se alojaron en grupos de 2-3 animales durante el período de aclimatación, HFD y tratamiento. Luego, las ratas se alojaron individualmente después de la cirugía hasta el procedimiento de pinzamiento. Las ratas se alojaron con un ciclo de luz invertido de 12 horas (a las 08:00 am se apagaron las luces), con temperatura mantenida a 22 ± 2 °C y 55 ± 10% de humedad relativa. Se proporcionaron al menos 5 días de período de aclimatación antes del comienzo de la alimentación HFD. Durante la fase de aclimatación, se proporcionó una dieta convencional (RM1 (E) 801492, SDS) y agua del grifo ad libitum.

Después de la fase de aclimatación, 10 ratas fueron alimentadas con pienso normal (NC) mientras que 72 ratas fueron alimentadas con HFD (RD1, SAFE) durante todo el experimento.

La composición de la dieta rica en grasas fue la siguiente (Kcal%): proteínas: 17,3%; carbohidratos (fructosa): 14%; grasas (manteca de cerdo): 68,7%; colesterol 1,65%, ácido cólico 0,65%.

Después de 6 semanas de alimentación con HFD, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 6 horas y se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa. Las ratas que presentaban el AUC más bajo (~17%) se excluyeron del estudio. Las ratas restantes se asignaron aleatoriamente a los diferentes grupos según su AUC (índice de tolerancia a la glucosa) y HOMA-IR (índice de resistencia a la insulina).

El Ab14 (10, 30, 100 mg/kg) y el vehículo se administraron semanalmente por vía i.v. (a través de la vena caudal, bajo anestesia con isoflurano), por la mañana, el día 1 y el día 8 de tratamiento.

Se administró metformina (200 mg/kg/día) en el agua potable durante aproximadamente 2 semanas hasta el procedimiento de pinzamiento. Las ratas tratadas con metformina se trataron con vehículo el día 1 y el día 8 (a través de la vena caudal).

Los grupos de prueba fueron los siguientes:

Grupo 1: NC vehículo i.v. (n=10)

Grupo 2: HFD vehículo i.v. (n=10)

Grupo 3: HFD Ab14 10 mg/kg i.v. (n=10)

Grupo 4: HFD Ab1430 mg/kg i.v. (n=10)

Grupo 5: HFD Ab14 100 mg/kg i.v. (n=10)

Grupo 6: HFD metformina 200 mg/kg en agua de bebida vehículo i.v. (n=10)

Durante la última semana de alimentación con HFD, antes de la selección, se midió el consumo de agua 3 veces por semana para evaluar la dilución de metformina en agua del grifo.

Después de 6 semanas de pienso normal y HFD, las 82 ratas se mantuvieron en ayunas desde las 08:00 am hasta las 02:00 pm (6 horas). Se administró un bolo de glucosa (2,5 g/kg) a las 02:00 pm (t0). Se midió la glucosa en sangre (usando un glucómetro, en una gota de sangre recogida de la punta de la cola) en t-30, 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 min. Se recogió sangre de la cola de la punta (40 gl en EDTA) en t-30 para medir la insulina plasmática (método ELISA). Se calculó el área bajo la curva (AUC). Las 12 ratas alimentadas con HFD que presentaban el AUC más alto se consideraron menos intolerantes a la glucosa y se excluyeron del estudio. Las 60 ratas restantes se asignaron al azar a los 6 grupos, según el AUC, el HOMA-IR y el peso corporal homogéneos.

El peso corporal se midió una vez por semana durante las primeras seis semanas de HFD. El peso corporal se midió 3 veces por semana durante los primeros 10 días de tratamiento. El consumo de alimentos se midió durante 48 horas o 72 horas, justo antes del tratamiento y 3 veces por semana durante el tratamiento hasta el procedimiento quirúrgico (día 11). Antes del comienzo del tratamiento (el día de la OGTT) y el día 10 del tratamiento, todas las ratas estuvieron en ayunas desde las 8:00 am hasta las 01:30 pm, se recogió sangre de la cola de la punta (40 gl en EDTA). Se midieron la glucosa en sangre (utilizando glucómetros) y la insulina plasmática (método ELISA).

El día 11, las ratas fueron anestesiadas (isoflurano) y se implantó un catéter en la vena femoral. Se siguió un período de recuperación durante 4 días antes del procedimiento de pinzamiento.

La mañana del pinzamiento, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 6 horas (de 8:00 am a 02:00 pm). Se recolectó una muestra de sangre (aproximadamente 160 gL, en EDTA) de la punta de la cola, justo antes del procedimiento de pinzamiento (~01:00 pm) de cada rata en los grupos 3, 4, 5 y 6, se procesó a plasma (~60 gL) y se mantuvo a -80 °C hasta la evaluación de las concentraciones de Ab14. Aunque no se analizó la concentración de anticuerpos en los grupos de control y de metformina, se recolectó (y desechó) una cantidad similar de sangre de las ratas de los grupos 1,2 y 7. En el día 15 o 16, se realizó el pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico de 2 etapas utilizando 3H-glucosa como trazador (excepto en el grupo de pienso normal), e infusión de insulina 5 mU/kg/min de 02:00 pm (T0) a 04:00 pm (T+2h), seguida de una infusión de insulina 15 mU/kg/min de 4:00 pm a 05:30 pm (t+3,5h). Se infundió una disolución de glucosa en paralelo y la tasa de infusión se ajustó para alcanzar el estado estacionario (100 /-10 mg/dL). La glucosa en sangre se midió desde la punta de la cola utilizando glucómetros cada 10 minutos. Se recogió sangre (10 gL) regularmente de la punta de la cola durante los estados estacionarios de cada etapa.

Se evaluaron los siguientes parámetros: tasa de infusión de glucosa (en todos los grupos); tasa de utilización de glucosa corporal (excepto en el grupo de pienso normal); tasa de producción de glucosa hepática (excepto en el grupo de pienso normal); índices de glucógeno corporal y glucolíticos (excepto en el grupo de pienso normal).

Además, excepto en el grupo de pienso normal, 1 hora antes del final del experimento de pinzamiento, se realizó una inyección en bolo de 14C-2DOG y se recolectaron muestras de los siguientes tejidos al final del pinzamiento y se conservaron para una evaluación adicional:

músculo vasto lateral (VL); músculo extensor largo de los dedos (EDL); vértice cardíaco; músculo sóleo; tejido adiposo blanco del epidídimo; tejido adiposo blanco inguinal; piel (control negativo).

Los niveles de insulina y péptido C en plasma se midieron justo antes de que comenzara la infusión (~T-30 min.), al final del estado estacionario de la etapa 1 (T2h) y etapa 2 (T3,5h). Para eso, la recolección de sangre se realizó de la punta de la cola (aproximadamente 100 pL, en EDTA).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software de GraphPad Prism. Las curvas se analizaron utilizando ANOVA de dos vías con una prueba de Bonferroni post-hoc. Los histogramas se analizaron usando una prueba de la t para comparar el grupo de control de HFD más vehículo y el grupo de control de pienso normal más vehículo. Los histogramas se analizaron utilizando un ANOVA unidireccional con una prueba de Dunnett post-hoc para comparar los grupos de Ab14 y metformina frente al grupo de control de HFD más vehículo. Una diferencia se consideró significativa cuando el valor de p fue <0,05. NS: no significativo.

Resultados

Modelo animal y selección. Se alimentaron ratas de 8 semanas de edad con una dieta rica en grasas enriquecida con fructosa (HFD, 69% de grasas y 16% de fructosa) durante 7 semanas antes del inicio del tratamiento. El peso corporal fue de 522 ± 5 g en el grupo HFD frente a 448 ± 13 g en el grupo de control alimentado con pienso normal. Luego se produjo un aumento del 16% en el peso corporal (p<0,001 con una prueba de la t en el día 42 bajo HFD (figura 5). Después de 7 semanas, el peso corporal aumentó en 187 ± 3 g en la población HFD frente a 158 ± 9 g en el grupo de control alimentado con pienso normal (p<0,001 con una prueba de la t el día 42, figura 6).

Durante la semana 7 de HFD, se realizó una prueba de tolerancia oral a la glucosa para evaluar la intolerancia a la glucosa en la población de HFD. El nivel de glucosa en sangre se mantuvo más alto hasta 150 min después de la administración de glucosa en la población HFD (no se muestra). El AUC calculado en relación con el T0 fue significativamente mayor (9%) en ratas HFD en comparación con las ratas control alimentadas con comida (no se muestra).

El HOMA-IR (índice de resistencia a la insulina) se calculó en el t-30 de la OGTT. Las ratas que presentaron el AUC más alto y el HOMA-IR más alto se asignaron aleatoriamente a los 6 grupos. El AUC fue mayor (~9%, no se muestra) en los grupos de HFD en comparación con el grupo de control con alimentación con pienso, así como e1HOMA-IR (34%, no se muestra) y el peso corporal (aproximadamente 17%, p<0,001, figura 7).

Seguimiento del peso corporal y la ingesta de alimentos. Se siguió el peso corporal durante 10 días de tratamiento. El tratamiento con Ab14 no tuvo efectos sobre el peso corporal. El peso corporal de las ratas control alimentadas con pienso permaneció significativamente más bajo que el de las ratas con vehículo HFD (figura 7). El Ab14 (30 mg/kg) disminuyó ligeramente (ns) y la metformina 200 mg/kg disminuyó significativamente la ganancia de peso corporal desde el segundo día de tratamiento en adelante.

El consumo de alimentos fue menor en el grupo de vehículo HFD que en el grupo de control alimentado con pienso como se esperaba. El tratamiento con Ab14 no tuvo efecto sobre la ingesta de alimentos de seguimiento (figura 8A) o sobre la ingesta de alimentos acumulada (figura 8B no mostrada). La metformina redujo significativamente el consumo acumulado de alimentos en un 25%. El ayuno de los animales antes de los procedimientos quirúrgicos alteró las mediciones de consumo de alimentos entre los días 9 y 10.

Parámetros bioquímicos. La glucosa en sangre en ayunas aumentó en el grupo del vehículo HFD en comparación con el grupo de control alimentado con pienso en un 5% (ns), 11% (ns) y 20% (p<0,001) en los días 0, 10 y 15 respectivamente. El tratamiento con Ab14 o metformina no tuvo efecto el día 10. El tratamiento con Ab14 a 100 mg/kg tuvo un efecto de disminución significativo sobre la glucosa en sangre en ayunas el día 15 en comparación con el grupo de vehículo HFD (figura 9).

La insulina plasmática en ayunas aumentó en un 33% (ns), 49% (ns) y 67% (p<0,01) en el grupo de vehículo HFD en comparación con el grupo de control alimentado con pienso en los días 0, 10 y 15 respectivamente. El tratamiento con Ab14 no tuvo efecto el día 10, mientras que la metformina disminuyó la insulina plasmática en un 37% (ns). El tratamiento con Ab14 a 10, 30 o 100 mg/kg disminuyó la insulina plasmática en un 26, 16 o 18% (ns), respectivamente, después de 15 días de tratamiento, y la metformina disminuyó la insulina plasmática en un 11% (ns, figura 10).

Como se esperaba, el perfil del nivel de péptido C en plasma el día 15 fue similar al nivel de insulina en plasma, pero los efectos fueron más marcados y menos variables. El péptido C aumentó significativamente en un 67% en el grupo de vehículo HFD en comparación con el grupo de control alimentado con pienso. El tratamiento con Ab14 a 10, 30 o 100 mg/kg disminuyó el nivel de péptido C en un 30% (p<0,05), 23% (ns) y 29% (p<0,05), respectivamente, y la metformina disminuyó el péptido C en 13% (ns) (figura 11, panel inferior izquierdo).

El HOMA-IR, un índice de resistencia a la insulina, aumentó en el grupo de vehículo HFD en comparación con el grupo de control alimentado con pienso en un 36% en el día 0 (ns), en un 42% en el día 10 (ns) y en un 98% en el día 15 (p<0,01). En comparación con el vehículo HFD, Ab14 no tuvo ningún efecto después de 10 días de tratamiento, mientras que la metformina tuvo un efecto de disminución (ns) en un 36%. Después de 15 días de tratamiento, Ab14 a 10, 30 o 100 mg/kg disminuyó el HOMA-IR en un 33% (ns), 17% (ns) y 38% (p<0,05), respectivamente, y la metformina tendió a disminuir el HOMA-IR en un 18% (ns, figura 12).

Pinzamiento hiperinsulinémico. La figura 13 muestra la tasa de infusión de glucosa (GIR) a lo largo del tiempo durante el pinzamiento hiperinsulinémico de 2 etapas. Durante la primera etapa (5 mU/kg/min de insulina), la producción de glucosa hepática (HGP) se inhibió de forma incompleta y las tasas de infusión de glucosa (GIR) fueron más bajas que durante la segunda etapa (15 mU/kg/min de insulina) cuando la producción de glucosa hepática fue inhibida.

El GIR para el grupo de control alimentado con pienso fue más alto que el grupo de vehículo HFD durante ambas etapas del pinzamiento y confirmó que las ratas HFD tenían un fenotipo resistente a la insulina después de 8-9 semanas de dieta. La metformina no tuvo ningún efecto sobre el GIR durante la primera etapa de pinzamiento, mientras que la meseta del GIR fue ligeramente mayor (ns) en los grupos tratados con Ab14. En todos los grupos tratados se observaron mesetas de GIR más altas que el grupo de vehículo HFD durante la segunda etapa de pinzamiento, con diferencias significativas observadas para metformina y Ab14 a 30 o 100 mg/kg (figura 13). La significancia estadística se evaluó usando un ANOVA de dos vías con una prueba de Bonferroni post-hoc frente a HFD. Durante la primera etapa de pinzamiento, el GIR fue significativamente diferente solo para el control de pienso normal, las ratas tratadas con vehículo a los 50 y 60 minutos (p<0,01 y p<0,05 respectivamente). Durante la segunda etapa de pinzamiento, el GIR fue significativamente diferente para las ratas HFD tratadas con 30 mg/kg de Ab14 a los 160-210 minutos (p<0,05 a los 160 minutos y p<0,01 a los 170-210 minutos), para las ratas HFD tratadas con 100 mg/kg de Ab14 a los 170­ 210 minutos (p<0,01 a los 190 minutos y p<0,05 a los 170-180 y 200-210 minutos), y para las ratas HFD tratados con metformina a los 170-210 minutos (p<0,01 a los 180 y 190 minutos, y p<0,05 a los 170 y 200-210 minutos).

Se calcularon las medias de GIR para cada meseta (figura 14). El GIR disminuyó significativamente en el grupo de vehículo HFD en comparación con el grupo de control alimentado con pienso en un 32% (p <0,05) y un 17% (p <0,01) durante la primera y la segunda etapa, respectivamente. El Ab14 a 10, 30 o 100 mg/kg aumentó el GIR (ns) durante la primera etapa (en un 26, 37 y 29% respectivamente), y la metformina también tuvo un efecto de aumento (ns) en un 11%. Durante la segunda etapa, todos los tratamientos aumentaron la GIR en comparación con el grupo del vehículo HFD: Ab1410, 30 o 100 mg/kg en un 19% (ns), 36% (p<0,01) y 28% (p<0,05). respectivamente, y metformina en un 27% (p<0,05).

Los promedios de glucosa en sangre durante las dos etapas del pinzamiento correspondieron a un estado euglucémico como se esperaba. Aunque hubo una diferencia significativa entre el grupo de control alimentado con pienso y el grupo de vehículo HFD durante la primera etapa de pinzamiento, la glucemia permaneció en un intervalo normal y el estado biológico fue el mismo en ambos grupos (figura 14).

La insulina plasmática se midió durante el procedimiento de pinzamiento. Como era de esperar, el nivel de insulina fue similar entre todos los grupos al final de las dos etapas de pinzamiento. Durante la primera etapa de pinzamiento, la concentración de insulina fue de aproximadamente 140 pU/mL y estuvo en un nivel fisiológico esperado durante las condiciones de alimentación. La concentración de insulina después de la segunda etapa de pinzamiento fue de aproximadamente 490 pU/mL, que era un nivel farmacológico (figura 11, panel superior).

El péptido C también se midió durante el procedimiento de pinzamiento (figura 11, panel inferior derecho). Durante las condiciones euglucémicas, la secreción de insulina por parte de las células beta fue inhibido y, por lo tanto, los niveles de péptido C en plasma eran bajos y no interpretables.

Se infundió 3H-glucosa con insulina durante el procedimiento de pinzamiento en todos los grupos HFD (no en el grupo de control alimentado con pienso). A continuación, se calcularon los flujos de glucosa corporal. Durante la primera etapa de pinzamiento, el recambio de glucosa (GTO) fue similar en todos los grupos, excepto que el Ab14 a 30 mg/kg tendió a aumentar el GTO en comparación con el grupo del vehículo HFD (17%, ns). La glucólisis y la síntesis de glucógeno tendieron a aumentar, 15 y 16%, respectivamente (ns, figura 15), después del tratamiento con Ab14 a 30 mg/kg.

Durante la segunda etapa de pinzamiento, el GTO, la glucólisis y la síntesis de glucógeno fueron similares en todos los grupos tratados, observándose un ligero aumento de la síntesis de glucógeno en el grupo tratado con 30 mg/kg de Ab14 en comparación con el grupo con vehículo HFD (en un 10%, ns). El Ab14 a 30 mg/kg (p<0,05) y 100 mg/kg (ns) inhibió completamente la HGP, al igual que la metformina (ns), y el tratamiento con Ab14 a 10 mg/kg disminuyó la HGP en un 78% (ns, figura 16).

Conclusión. El tratamiento con Ab14 disminuyó el HOMA-IR al disminuir la glucosa en sangre en ayunas, así como los niveles de insulina en plasma en el modelo de rata HFD. Además, Ab14 mejoró notablemente la sensibilidad a la insulina del hígado, mientras que no se observó claramente un efecto sobre la sensibilidad a la insulina periférica corporal. Como era de esperar, el tratamiento con metformina también mejoró la sensibilidad a la insulina del hígado.

Ejemplo 3 - Ejemplo de referencia

Este ejemplo evalúa el efecto de Ab14 sobre el metabolismo de la glucosa y sobre el control glucémico en un modelo de rata con diabetes, la rata Zucker diabética grasa (ZDF). Los efectos de la administración crónica de Ab14 sobre el control de la glucosa se evaluaron en ratas ZDF que progresaban desde un estado prediabético (hiperinsulinémico, normoglucémico) a un estado diabético sintomático (hipoinsulinémico, hiperglucémico). Estos animales desarrollan prediabetes, caracterizada por una hiperinsulinemia marcada para compensar el desarrollo de resistencia a la insulina, pero con poca o ninguna hiperglucemia, a las siete semanas de edad. Esto progresa rápidamente a diabetes sintomática, caracterizada por hipoinsulinemia, como resultado del fallo de las células beta pancreáticas, e hiperglucemia marcada a las 10-12 semanas de edad. El anticuerpo usado en este ejemplo constaba de cadenas polipeptídicas ligeras y pesadas de SEQ ID NO:132 y 134.

Métodos

Se alojaron 81 ratas ZDF fa/fa (Charles River Laboratories, Francia) y 10 ratas magras ZDF ?/+ (controles) en jaulas ventiladas y enriquecidas en grupos de 1-2 animales en un ciclo de luz normal de 12 horas (a las 08:00 pm luces apagadas), 22 ± 2 °C y 50 ± 10% de humedad relativa. Las ratas tenían 7 semanas de edad en el momento de la recepción y se aclimataron durante una semana antes del comienzo del estudio. Las ratas fueron alimentadas con la dieta convencional para ratas ZDF (Purina 5008, Charles River) y se les proporcionó agua del grifo ad libitum. Todos los animales fueron controlados al menos una vez al día para detectar cualquier signo de mala salud, reacciones adversas al tratamiento o morbilidad durante todo el estudio.

Las ratas macho ZDF fa/fa de ocho semanas de edad eran hiperinsulinémicas y levemente diabéticas. Debido a la variabilidad de los niveles de glucosa e insulina en sangre en este estado, las ratas ZDF se seleccionaron según su HOMA-IR.

Para los grupos tratados con AB14, el anticuerpo se administró una vez por semana a través de la vena caudal (i.v., 5 ml/kg) los días 1,8, 15 y 22 en dos dosis diferentes de 20 mg/kg/semana (grupos 3 y 7) o 60 mg/kg/semana (grupos 4 y 8). Todos los demás grupos se trataron una vez por semana con el vehículo 1 (i.v., 5 ml/kg). Los tratamientos intravenosos se realizaron por la mañana los días 1, 8, 15 y 22 bajo anestesia con isoflurano. El volumen de administración se adaptó individualmente según el peso corporal más reciente.

La metformina (Met) y la pioglitazona (PIO) se administraron una vez al día durante 28 días, por vía oral (p.o., 5 ml/kg) entre las 8:00 h y las 10:00 h, excepto que el día de la OGTT o después de los tratamientos intravenosos, algunos tratamientos orales se completaron después de las 10:00 h. Los grupos 5, 7 y 8 recibieron tratamiento con metformina 200 mg/kg/día y el grupo 6 con pioglitazona 10 mg/kg/día. Todos los demás grupos se trataron diariamente con el vehículo 2 (p.o., 5 ml/kg) durante 28 días. Se utilizó el peso corporal más reciente para calcular el volumen medio de administración en cada grupo.

Los grupos de prueba se resumen en la siguiente tabla. Met: metformina.

Después de un período de aclimatación de 1 semana, se pesaron todas las ratas y se mantuvieron en ayunas durante 6 horas (desde ~8:00 am hasta ~2:00 pm). A las ~02:00 pm, se recogió sangre (~ 150 pL, EDTA) de la punta de la cola. Se midieron la glucosa en sangre (glucómetro) y la insulina plasmática (ELISA), y se calculó e1HOMA-IR (índice de resistencia a la insulina). Las 11 ratas ZDF fa/fa que presentaban valores extremos de HOMA-IR se excluyeron del estudio, pero se mantuvieron alojadas durante 28 días para la recolección de plasma al final del estudio. Luego, las 70 ratas restantes se asignaron aleatoriamente a 7 grupos de tratamiento según su HOMA-IR y su peso corporal. Todas las ratas magras se mantuvieron en el grupo 1 y se trataron solo con vehículo.

El peso corporal se midió dos veces por semana durante las 4 semanas de tratamiento.

El consumo de alimentos se midió justo antes del procedimiento de selección y luego dos veces por semana durante 24 h durante las primeras tres semanas de tratamiento. El consumo de alimentos se midió una vez por semana durante la semana de OGTT (semana 4).

Se realizó un ayuno (6 horas el día 0 desde 8:00 am hasta 02:00 pm, y durante la noche los días 12, 19 y 26 desde ~6:00 pm hasta ~8:00 am) antes de cada extracción de sangre. La sangre se recolectó a las ~2:00 pm, desde la punta de la cola, el día 0 (antes de la selección, 150 pL, EDTA potasio) y a las ~8:00 am antes de la dosificación en los días 12 (110 pL, EDTA potasio), 19 (150 pL, EdTA potasio) y 26, (110 pL, EDTA potasio).

La glucosa en sangre en ayunas (glucómetros) se midió los días 0, 12, 19 y 26. La insulina plasmática en ayunas, el péptido-C (método ELISA), los ácidos grasos libres, los triglicéridos, el colesterol total (método colorimétrico) y el colesterol HDL (precipitación con fosfotungstato, método colorimétrico) se midieron el día 0 y antes de la dosificación los días 12, 19 y 26. El colesterol no HDL se calculó como colesterol total - colestero1HDL. La fructosamina se midió los días 0, 19 y 28. La HbA1c (DCA 2000) se midió los días 0 y 28.

La prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) se realizó de la siguiente manera. El día 25, las ratas estuvieron en ayunas a las ~6:00 pm y se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral al día siguiente (el día 26). A las ~8:00 am (T-60) se realizó una extracción de sangre (110 pL, EDTA) para las mediciones de los parámetros bioquímicos. Una hora después (~9:00 am), se administró un bolo oral de glucosa (1,5 g/kg) (T0). La glucosa en sangre se midió (glucómetro o método colorimétrico en caso de glucemia alta) en T-60, T0, T15, T30, T60, T90, T120 y T180 minutos. El área bajo la curva (AUC) se calculó en función de los valores de glucosa en sangre medidos en T0. Se midieron la insulina plasmática y el péptido C (método ELISA) en T-60, T15 (~40 pL de sangre, EDTA) y T30 minutos (~40 pL de sangre, EDTA).

Después de 2 horas de restricción alimentaria (de 8:00 am a 10:00 am), 80 ratas del estudio fueron anestesiadas el día 28 con isoflurano. Se recogió sangre (aproximadamente 3000 pL de la vena abdominal, en K2-EDTA) para la determinación de las concentraciones plasmáticas de AB14. El plasma (3 partes alícuotas de ~200 pL) se mantuvo a -80 °C hasta la prueba. A continuación, se extirpó el tejido del páncreas. Las ratas se sacrificaron mediante incisión de la vena abdominal y la aorta.

Cada páncreas se dividió en 2 partes (corte longitudinal). Una pieza fue fijada en disolución de formol al 10% para el procesamiento histopatológico. El otro trozo de páncreas se congeló instantáneamente y se mantuvo a -80 °C para la determinación de los niveles de insulina y proinsulina.

Las 11 ratas ZDF fa/fa excluidas del estudio se sacrificaron después de 28 días de alojamiento. Fueron anestesiadas con isoflurano. Se recogió sangre de la vena abdominal (volumen máximo en EDTA potasio). Las muestras de plasma (2 partes alícuotas de 1 ml cada una) se congelaron para realizar más pruebas. Las ratas se sacrificaron mediante incisión de la vena abdominal y la aorta.

Cada muestra de páncreas se homogeneizó en un tampón ácido y se midió el contenido de insulina y proinsulina mediante kits ELISA en los siguientes grupos:

Grupo 1: ratas magras vehículos (n=10)

Grupo 2: ratas ZDF vehículos (n=10)

Grupo 4: ratas ZDF AB1460 mg/kg/semana (n=10)

Grupo 5: ratas ZDF metformina 200 mg/kg/día (n=10)

Grupo 8: ratas ZDF AB1460 mg/kg/semana metformina 200 mg/kg/día (n=10)

Cada muestra de páncreas se fijó en formol al 4% durante un máximo de 24-48 horas; el volumen de formol fue de 5 a 10 veces mayor que el volumen de la muestra para asegurar una fijación adecuada. Después de 48 h, las muestras se colocaron en etanol al 70%. A continuación, las muestras se incluyeron en parafina para el proceso histológico en los siguientes grupos:

Grupo 1: ratas magras vehículos (n=10)

Grupo 2: ratas ZDF vehículos (n=10)

Grupo 4: ratas ZDF AB1460 mg/kg/semana (n=10)

Grupo 5: ratas ZDF metformina 200 mg/kg/día (n=10)

Grupo 8: ratas ZDF AB1460 mg/kg/semana metformina 200 mg/kg/día (n=10)

Después de delinear los islotes de Langerhans, se cuantificó la superficie y la intensidad del marcaje de insulina mediante análisis de imágenes de las áreas marcadas (marrón) y no marcadas (azul).

Las medias de las ratas ZDF con vehículo y las ratas magras se compararon usando una prueba de Student cuando la prueba de Fisher no mostró diferencias significativas en las varianzas. En caso contrario, se utilizó la prueba no paramétrica de Mann Whitney.

Las medias de las ratas ZDF tratadas se compararon con las ratas ZDF con vehículo utilizando una ANOVA de una vía prueba de Dunnett post-hoc. Si la prueba de Bartlett mostró diferencias significativas en las varianzas, se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskall Wallis prueba de Dunn post-hoc.

Las medias de 20 mg/kg de AB14 solo se compararon con 200 mg/kg de metformina sola o en combinación con 20 mg/kg de AB14 mediante una ANOVA de una vía prueba de Newman-Keuls post-hoc.

Las medias de 60 mg/kg de AB14 solo se compararon con 200 mg/kg de metformina sola o en combinación con 60 mg/kg de AB14 mediante una ANOVA de una vía prueba de Newman-Keuls post-hoc.

Las curvas se analizaron usando un ANOVA de 2 vías prueba de Bonferroni post-hoc.

Las ratas se excluyeron del análisis si presentaban valores atípicos en todos o casi todos los parámetros. Esto resultó en la exclusión de cuatro ratas, cada una de un grupo diferente.

Resultados

Como se esperaba en ratas ZDF de 8 semanas de edad, HOMA-IR aumentó fuertemente en comparación con ratas magras (aproximadamente 111 frente a 3,5, figura 18A). Las ratas ZDF eran levemente hiperglucémicas (aproximadamente 180 frente a 113 mg/dl, figura 18B) e hiperinsulinémicas (aproximadamente 250 frente a 12,6 pü/ml, figura 18C). El peso corporal aumentó ligeramente en ratas ZDF (figura 18D).

En comparación con las ratas magras, los pesos corporales de las ratas ZDF permanecieron más altos durante todo el período de tratamiento (figura 19A), mientras que la ganancia de peso corporal fue similar entre las ratas magras y las ZDF (figura 19B).

La pioglitazona aumentó significativamente el peso corporal en comparación con las ratas con vehículo ZDF, a partir de los 8 días de tratamiento, y la ganancia de peso corporal fue 3 veces mayor al final del tratamiento (figura 19A y B). Todos los demás tratamientos farmacológicos no tuvieron un efecto significativo sobre el peso corporal en comparación con las ratas ZDF con vehículo. La combinación de 60 mg/kg de AB14 200 mg/kg de metformina aumentó significativamente la ganancia de peso corporal a partir de los 22 días de tratamiento (figura 19B).

La ingesta de alimentos aumentó aproximadamente 2 veces en las ratas ZDF con vehículo en comparación con las ratas magras (significativo el día 13). Las ratas tratadas con pioglitazona mostraron una tendencia a un mayor consumo de alimentos en comparación con las ratas con vehículo ZDF (significativo los días 15, 20 y 22, figura 20A). La ingesta de alimentos acumulada aumentó en un 94% en el grupo de vehículo ZDF en comparación con el grupo magro (p<0,01), y en un 14% en el grupo de pioglitazona en comparación con el grupo de vehículo ZDF (NS, figura 20B). Otros tratamientos no tuvieron efecto sobre la ingesta de alimentos en comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo.

La glucosa en sangre en ayunas permaneció en un intervalo normal durante los 26 días de tratamiento en ratas magras, después de 6 horas o de una noche de ayuno (figura 21A). Esto se correlacionó con los niveles normales de insulina (figura 21B). En ratas con vehículo ZDF, la glucosa en sangre en ayunas durante la noche alcanzó 362 ± 32 mg/dl el día 12 (alrededor de 10 semanas de edad) y permaneció significativamente más alta que las ratas magras hasta el final del tratamiento (figura 21A). Esto se correlacionó con la disminución de los niveles de insulina en plasma (49,2 ± 6,7, 41,2 ± 4,8 y 36,6 ± 2,7 pü/mL - p<0,001 frente a ratas magras, figura 21B) y con la disminución de los niveles de péptido C en plasma (2813 ± 249, 2472 ± 195, 2156 ± 165 pM - <p<0,001 frente a ratas magras (figura 21D) medidas los días 12, 19 y 26. La evolución del HOMA-IR en ratas ZDF magras y con vehículo reflejó el cambio en la glucosa en sangre y niveles de insulina en plasma (figura 21C).

La pioglitazona redujo significativamente los niveles de glucosa en sangre en ayunas durante la noche hasta un nivel normal a partir de los 12 días de tratamiento (p<0,001, figura 21A). Con ambas dosis, AB14 disminuyó en aproximadamente un 15% la glucosa en sangre después de 12, 19 o 26 días de tratamiento (n.s., figura 21 A). En comparación con AB14, la metformina 200 mg/kg tuvo un efecto similar el día 12, pero este efecto no se observó en los días 19 y 26. En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, la combinación de AB1420 mg/kg metformina redujo ligeramente la glucosa en sangre el día 12 (12%, ns), y no mostró ningún efecto el día 19 y el día 26 (figura 21 A). Por el contrario, la combinación de 60 mg/kg de AB14 con metformina redujo significativamente los niveles de glucosa en sangre el día 12 (38%, p<0,01 frente a ratas ZDF tratadas con vehículo). Aunque no es estadísticamente significativa, la reducción de sangre todavía se observó el día 19 y 26 (22% y 27% respectivamente, figura 21A).

La pioglitazona no pareció tener un efecto protector sobre la secreción de insulina ya que no mostró ningún efecto sobre los niveles de insulina y péptido C en plasma en los días 12, 19 y 26 en comparación con las ratas ZDF con vehículo (figuras 21B y D). Por tanto, la reducción de los niveles de glucosa en sangre estuvo relacionada con el efecto sensibilizador a la insulina de la pioglitazona, que redujo el HOMA-IR en un 67%, 62% y 54%, en los días 12, 19 y 26, respectivamente, en comparación con las ratas ZDF con vehículo (figura 21C).

En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, AB14 20 mg/kg no cambió los niveles de insulina y péptido C en plasma, así como HOMA-IR en los días 12, 19 y 26 (figura 21B-D). Por otra parte, 60 mg/kg de AB14 aumentaron los niveles de insulina en plasma los días 12, 19 y 26 en un 74%, 21% y 19%, respectivamente (ns frente a ratas ZDF con vehículo, figura 21B).

El AB14 60 mg/kg aumentó los niveles de péptido C en plasma el día 12 en un 10% (ns) y no tuvo ningún efecto en los días 19 y 26 (figura 21D).

En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, la metformina aumentó los niveles de insulina en plasma los días 12, 19 y 26 en un 79%, 55% y 48%, respectivamente (ns, figura 21B). La metformina aumentó los niveles de péptido C en plasma los días 12, 19 y 26 en un 23%, 21% y 9% (ratas NS frente a ZDF tratadas con vehículo, figura 21D).

En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, la combinación de AB14 20 mg/kg metformina aumentó los niveles de insulina en plasma en los días 12, 19 y 26 en 2 veces (NS, figura 21B). La combinación de 20 mg/kg de AB14 metformina aumentó los niveles de péptido C en plasma los días 12, 19 y 26 en un 21%, 23% y 25%, respectivamente (NS, figura 21D).

En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, la combinación de AB14 60 mg/kg metformina aumentó significativamente los niveles de insulina plasmática en los días 12, 19 y 26 por un factor de 2,5, 2,3 y 2,7 respectivamente. La combinación de AB14 60 mg/kg metformina aumentó significativamente los niveles de péptido C en plasma desde el día 12 en un 45% (día 12), 48% (día 19) y 52% (día 26) (p<0,05 frente a ratas ZDF tratadas con vehículo, figura 21D).

En este modelo en el que la secreción de insulina se redujo con el tiempo, el aumento de HOMA-IR reflejaba una mejora de la secreción de insulina. Por tanto, se observó un aumento de HOMA-IR en metformina sola o en combinación con los grupos tratados con AB14, en comparación con los grupos con vehículo ZDF, y este aumento se mantuvo los días 12, 19 y 26 (figura 21C).

En comparación con las ratas magras, la fructosamina fue significativamente mayor (66%) en las ratas ZDF de 8 semanas de edad tratadas con vehículo (208 ± 6 frente a 144 ± 2 pM, p<0,001). Los niveles de fructosamina se mantuvieron en un intervalo similar en ratas magras durante el período de tratamiento, pero aumentaron en ratas con vehículo ZDF después de 19 días de tratamiento (253 ± 5 pM, p<0,001) y 28 (234 ± 6 pM, p<0,001) (figura 22). Como era de esperar, la pioglitazona redujo significativamente los niveles de fructosamina desde el día 19 (30% en el día 19 y 25% en el día 28, p<0,001). El AB1420 y 60 mg/kg no tuvo efecto sobre los niveles de fructosamina. En comparación con las ratas tratadas con vehículo, la metformina mostró una tendencia hacia niveles más bajos de fructosamina solo en el día 19 (6%, ns). En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, la combinación de AB14 20 mg/kg metformina mostró una tendencia no significativa hacia niveles más bajos de fructosamina en los días 19 y 28 en un 10% y un 8%, respectivamente. Asimismo, la combinación de AB14 60 mg/kg metformina mostró una tendencia no significativa hacia niveles más bajos de fructosamina (9%) el día 28 (figura 22).

En comparación con las ratas magras, la HbA1c fue mayor en las ratas ZDF de 8 semanas de edad (4,3 ± 0,1% frente a 3,1 ± 0,04%), aunque estos valores se encontraban en un intervalo normal.

En ratas ZDF de 12 semanas de edad, la HbA1c alcanzó un valor patológico de 8,8 ± 0,2% en el día 28 (p<0,001 ZDF frente a ratas magras, figura 23). En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, 20 y 60 mg/kg de AB14 no tuvieron efecto sobre los niveles de HbA1c después de 28 días de tratamiento. Después de 28 días de tratamiento, la pioglitazona y la metformina redujeron significativamente la HbA1c en un 44 y un 15%, respectivamente (figura 23). La combinación de metformina con AB14 20 mg/kg y con 60 mg/kg redujo significativamente la HbA1c en un 11 y un 19%, respectivamente (figura 23).

En comparación con ratas magras, los niveles de triglicéridos en plasma aumentaron fuertemente en ratas ZDF de 8 semanas de edad (aproximadamente 8 mM frente a aproximadamente 0,7 mM, figura 24A).

En comparación con el vehículo, la pioglitazona disminuyó fuertemente los niveles de triglicéridos en plasma a partir del día 12 de tratamiento. El AB14 20 mg/kg disminuyó levemente los niveles de triglicéridos en plasma los días 12 y 19 (en un 15% y 7%, respectivamente, ns) y no tuvo efecto el día 26. El AB14 60 mg/kg disminuyó levemente los niveles de triglicéridos en plasma los días 12, 19 y 26 en 14%, 9% y 12%, respectivamente (ns). La metformina aumentó los niveles de triglicéridos en plasma los días 12, 19 y 26 en un 26%, 40% y 49%, respectivamente (significativo a partir del día 19). La combinación de metformina AB14 20 mg/kg mostró una tendencia hacia triglicéridos en plasma más altos en los días 19 y 26 (en un 13% y un 23%, respectivamente, ns) en comparación con el grupo del vehículo ZDF. La combinación de metformina AB14 60 mg/kg mostró una tendencia hacia niveles más altos de triglicéridos en plasma los días 12, 19 y 26 (en un 9%, 48% y 43% respectivamente, significativo a partir del día 19, figura 24A).

Después de 6 horas de ayuno, los niveles de ácidos grasos libres en plasma fueron más altos en ratas ZDF de 8 semanas de edad que en ratas magras (~0,85 mM frente a ~0,59 mM). Después de un ayuno nocturno (condiciones lipolíticas máximas), los niveles de ácidos grasos libres fueron similares (~1,3 mM) a las 10 y 11 semanas. A las 12 semanas de tratamiento, la capacidad lipolítica de las ratas ZDF disminuyó, como lo muestran los niveles más bajos de ácidos grasos libres, en comparación con las ratas magras (1,05 ± 0,06 frente a 1,38 ± 0,03 mM, figura 24B). En comparación con las ratas con vehículo ZDF, las ratas tratadas con pioglitazona mostraron niveles de ácidos grasos libres en plasma más bajos en un 35% en el día 12 (p<0,001), un 17% en el día 19 (ns) y un 30% en el día 26 (p<0,05). El AB1420 y 60 mg/kg no tuvo efecto. La metformina aumentó los niveles de ácidos grasos libres en un 14%, 25% y 8% en los días 12, 19 y 26, pero no significativamente en comparación con las ratas ZDF del vehículo. El efecto de la metformina sola o en combinación con AB14 20 mg/kg fue similar. Por otro lado, cuando se combinó con AB14 60 mg/kg, la metformina mostró un efecto de aumento solo el día 19 en comparación con el grupo del vehículo ZDF (en un 20%, NS, figura 24B).

En comparación con ratas magras, los niveles de colesterol total y colestero1HDL en plasma fueron más altos en ratas ZDF de 8 semanas de edad y aumentaron gradualmente durante las 4 semanas siguientes (figura 25A-B, figura 26A-B). Los niveles de colesterol no HDL en plasma fueron similares en ratas magras y ZDF a las 8 semanas de edad, pero aumentaron con el tiempo en ratas ZDF frente a ratas magras a partir de las 10 semanas (figura 25C y figura 26C). Como hubo una diferencia significativa en el colesterol total y el colestero1HDL entre los grupos de ZDF en el día 0 (figura 25), los resultados se expresaron en valores relativos desde el día 0 (figura 26). Como se muestra en la figura 26A, la pioglitazona tendía a prevenir el aumento de los niveles de colesterol total en plasma con el tiempo. El AB14 20 mg/kg y la metformina no tuvieron efecto. El AB14 60 mg/kg aumentó el colesterol total en un 8%, 14% y 15% en los días 12, 19 y 26, respectivamente, en comparación con el grupo del vehículo ZDF. Cuando se combinó con metformina, el AB14 20 mg/kg aumentó el colesterol total en un 15% y 10% los días 12 y 26, respectivamente, mientras que el AB14 60 mg/kg aumentó el colesterol total en un 24%, 21% y 13% en los días 12, 19 y 26, respectivamente, en comparación con el grupo ZDF de vehículo. En comparación con el vehículo, la pioglitazona aumentó el colesterol HDL en plasma en un 38%, 17% y 19% en los días 12, 19 y 26, respectivamente. La metformina sola no tuvo efecto. El AB14 20 mg/kg y 60 mg/kg, solo o en combinación con metformina, aumentó los niveles en plasma de colesterol HDL entre un 11 y un 22% después de 12, 19 y 26 días de tratamiento. Los niveles de colesterol no HDL en plasma (figura 26C) fueron similares en todos los grupos de ZDF después de 12 días de tratamiento. En comparación con el vehículo, AB14 20 mg/kg, AB14 60 mg/kg, la metformina, sola o en combinación con AB14, no tuvo efecto sobre los niveles de colesterol no HDL. Solo la pioglitazona redujo significativamente los niveles en plasma de colesterol no HDL en un 49% y un 47% en el día 19 y el día 26, respectivamente.

Se realizó una prueba de tolerancia oral a la glucosa a los 26 días de tratamiento. En comparación con las ratas magras tratadas con vehículo, se esperaba que los niveles de glucosa en sangre fueran más altos en las ratas ZDF tratadas con vehículo antes y después de la carga de glucosa (figura 27A). En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, solo las ratas ZDF tratadas con pioglitazona mostraron niveles de glucosa en sangre significativamente reducidos en todos los momentos. En comparación con el vehículo, la combinación de AB14 60 mg/kg y metformina tendió a reducir los niveles de glucosa en sangre en t-60 minutos (figura 27A), mientras que otros tratamientos farmacológicos no mostraron un efecto significativo. En comparación con las ratas magras, el área bajo la curva (AUC) de la glucosa en sangre aumentó significativamente 3,7 veces en las ratas ZDF tratadas con vehículo. En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, las ratas tratadas con pioglitazona mostraron una reducción significativa del 54% en el AUC de la glucosa en sangre. El AB1420 mg/kg, el AB1460 mg/kg y la metformina sola o en combinación con 20 mg/kg o 60 mg/kg AB14, mostraron una reducción no significativa en el AUC (7%, 11%, 6%, 7% y 17%, respectivamente). La combinación de AB14 60 mg/kg metformina fue ligeramente más eficaz para reducir el AUC en comparación con AB14 o metformina sola (figura 27B).

Los niveles de insulina y péptido C en plasma se midieron a los 15 y 30 minutos después de la carga de glucosa. Los perfiles de concentración frente al tiempo fueron similares tanto para la insulina como para el péptido C. Los niveles de insulina y péptido C fueron similares entre los grupos tratados con vehículo, AB14 20 mg/kg y AB14 60 mg/kg, aumentaron ligeramente en los grupos tratados con metformina y pioglitazona, y aumentaron más de manera dependiente de la dosis en los grupos tratados con AB14 20 mg/kg y AB14 60 mg/kg combinados con metformina (figura 28A-B). La capacidad de secreción de insulina o péptido C en respuesta a la carga de glucosa se evaluó expresando los resultados en valores relativos calculados a partir de T-60 minutos. Como se esperaba, las ratas con vehículo ZDF habían perdido significativamente su capacidad para secretar insulina y péptido C en respuesta a la carga de glucosa en comparación con las ratas magras (figura 29A-B). En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, las ratas tratadas con pioglitazona aumentaron la secreción de insulina en un 20% (p<0,05) y un 5% en el momento T15 y T30, respectivamente. Todos los demás tratamientos no tuvieron efecto sobre la secreción de insulina en el momento T15. La metformina disminuyó la secreción de insulina en el momento T30 en un 26% (p<0,01). AB14 20 mg/kg solo no tuvo efecto en el momento T30 y mostró una tendencia a disminuir la secreción de insulina (en un 14%, ns) en combinación con metformina. El AB14 60 mg/kg solo o combinado con metformina mostró una tendencia a disminuir la secreción de insulina en un 19% y un 18%, respectivamente (figura 29A). En comparación con las ratas magras, la secreción de péptido C en respuesta a la carga de glucosa (figura 29B) se redujo significativamente en las ratas ZDF tratadas con vehículo en aproximadamente 40% en los momentos T15 y T30. En comparación con las ratas ZDF tratadas con vehículo, solo la pioglitazona aumentó significativamente la secreción de péptido C en el momento T15 y T30 en un 21% y un 22%, respectivamente.

Como se esperaba, los niveles de proinsulina pancreática (figura 30A) e insulina (figura 30B) fueron significativamente menores en ratas ZDF de 12 semanas de edad en comparación con ratas magras. El AB1460 mg/kg y la metformina impidieron por completo las reducciones de proinsulina, y 60 mg/kg de AB14 combinados con metformina aumentaron significativamente los niveles de proinsulina (p<0,05 frente al vehículo) (figura 30A). El AB14 60 mg/kg aumentó ligeramente los niveles de insulina pancreática, y metformina o AB14 60 mg/kg combinados con metformina aumentaron significativamente los niveles de insulina (p<0,05 frente al vehículo) (figura 30B). En comparación con las ratas magras, la proporción de proinsulina/insulina aumentó significativamente en las ratas ZDF, mientras que no se observó ningún cambio con los tratamientos farmacológicos (figura 30C).

No se indicaron evidencias de toxicidad en este estudio centrado en cambios microscópicos en el páncreas de ratas magras o ZDF tratadas con vehículo, AB14, metformina o una combinación de AB14/metformina.

Se notó una mayor incidencia y gravedad de islotes grandes/gigantes focales a multifocales, correspondientes a una hiperplasia de islotes, y fibrosis de islotes en ratas ZDF que recibieron control con vehículo (tabla 1 y tabla 2).

Tabla 1. Incidencia de observaciones histopatológicas Todos los grupos de tratamiento fueron ratas ZDF excepto cuando se indique lo contrario. Met.: metformina 200 mg/kg/día.

Tabla 2. Análisis histopatológico: puntuaciones promedio grupales de descubrimientos elementales Todos los grupos de tratamiento fueron ratas ZDF excepto cuando se indique lo contrario. Met.: metformina 200 mg/kg/día.

En comparación con las ratas magras, las ratas ZDF tratadas con vehículo tenían una ligera vacuolización de las células de los islotes y una mayor incidencia y gravedad de la fibrosis de los islotes. Hubo una tendencia constante hacia una disminución de la vacuolización y la gravedad de la fibrosis de los islotes con todos los tratamientos farmacológicos, AB14 60 mg/kg, metformina o metformina combinada con AB14. Estos efectos fueron más pronunciados cuando se combinaron AB14 y metformina.

Como era de esperar, la insulina pancreática medida por inmunohistoquímica mostró una reducción en el marcaje de insulina en ratas ZDF. Como se observa a partir de la medición del contenido de insulina (figura 30B), los tratamientos farmacológicos impidieron ligeramente esta reducción del marcaje de insulina con un mejor efecto cuando se combinaron AB14 y metformina (figura 31).

Análisis

A ratas ZDF de ocho semanas de edad que eran marcadamente resistentes a la insulina y gravemente hiperinsulinémicas, pero solo levemente hiperglucémicas, se les administró Ab14 por vía intravenosa en dosis de 0 mg/kg (vehículo), 20 mg/kg o 60 mg/kg una vez a la semana durante 4 semanas. Durante este período de tiempo, los controles tratados con vehículo progresaron a diabetes sintomática y estaban gravemente hipoinsulinémicos y marcadamente hiperglucémicos para el día 12 del estudio, en consonancia con un fallo completa de las células beta pancreáticas para las 10 semanas de edad. Esto se confirmó al final del estudio mediante la medición directa de los niveles de insulina pancreática y proinsulina, los cuales se redujeron sustancialmente, y mediante la evaluación inmunohistoquímica del marcaje de insulina pancreática, que también se redujo drásticamente. Además, el análisis histológico realizado al final del estudio también demostró una mayor incidencia y gravedad de la vacuolización de los islotes, la hiperplasia de los islotes (islote(s) grande(s)/gigante(s)) y la fibrosis de los islotes en estos animales, en consonancia con la patología diabética de los islotes pancreáticos.

Por el contrario, el aumento de la glucosa en sangre en ayunas en los controles tratados con vehículo en el día 12 del estudio fue prevenido parcialmente por ambas dosis de Ab14, y esta prevención parcial también se observó en los días 19 y 26 del estudio. Además, la dosis alta de Ab14 también evitó parcialmente la reducción de los niveles de insulina y péptido C en plasma observados en los controles tratados con vehículo el día 12 del estudio. Esta prevención parcial también se observó, pero en menor medida, en los días 19 y 26 del estudio, lo que indica un retraso modesto en la progresión de la enfermedad (fallo de las células beta pancreáticas) y sugiere una protección parcial de las células beta pancreáticas por parte del compuesto. En efecto, la dosis alta de Ab14 también evitó por completo la reducción de los niveles de proinsulina pancreática observada en los controles tratados con vehículo cuando se obtuvo tejido pancreático al final del estudio (día 28) y también evitó parcialmente la reducción de los niveles de insulina pancreática cuando se midió ya sea directamente o mediante análisis inmunohistoquímicos. Además, Ab14 disminuyó invariablemente la vacuolización de los islotes, la fibrosis de los islotes y la hiperplasia de los islotes observada en los animales tratados con vehículo en la evaluación histológica al final del estudio, lo que indica además un impacto favorable en la patología diabética de los islotes pancreáticos.

Como se demostró en el ejemplo 2, cuando se comparó con el grupo de control tratado con vehículo, Ab14 no tuvo efecto sobre el consumo de alimentos o el peso corporal, lo que indica que los efectos de Ab14 sobre los parámetros evaluados anteriormente no fueron el resultado de la restricción calórica o la pérdida de peso.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. - Un anticuerpo antipéptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso para mejorar o reducir los síntomas, tratar, prevenir o controlar la hiperglucemia en un sujeto que lo necesite, en el que dicho anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprende: (i) una cadena variable ligera (V^l ) que comprende polipéptidos de la región determinante de complementariedad (CDR)1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:55, 56 y 57, respectivamente; y (ii) una cadena variable pesada (V^h ) que comprende polipéptidos de CDR1, CDR2 y CDR3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:58, 59 y 60, respectivamente.

2. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según la reivindicación 1, en el que el uso es lograr una normoglucemia sostenida en el sujeto.

3. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es para su uso en combinación con un agente antidiabético o agente antiobesidad distinto de un anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que opcionalmente (i) dicho agente antidiabético o agente antiobesidad comprende uno o más de amilina, agonista de amilina, sulfonilureas, calcitonina, glucagón, agonistas de PPAR-gamma, agonistas del receptor de GPL-1, inhibidor de dipeptidil peptidasa IV, análogos de amilina, biguanidas, agonistas del receptor de dopamina D2, meglitinidas, inhibidor de alfa-glucosidasa, secuestrante de ácidos biliares antidislipidémico, exendina, análogo de exendina, agonista de exendina, péptido inhibidor de gastrina (GIP), péptido de incretina, insulina, inhibidor de SGLT2, un inhibidor de la reabsorción de glucosa, fenofibrato, fibrato, un anticuerpo antigrelina o un fragmento de unión al antígeno del mismo, un anticuerpo o un fragmento de unión antígeno del mismo del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR)-1(IIIb), Fg FR-1 (IIIc) y/o FGFR-4(IIIc), un anticuerpo anti-CD38 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, un anticuerpo anti-MIC-1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, metformina o una combinación de cualquiera de los anteriores; o (ii) dicho agente antidiabético es metformina.

4. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, debe administrarse a dicho sujeto a una dosificación de entre aproximadamente 0,1 y 100,0 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor.

6. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano; no aparece de forma natural; es un fragmento de anticuerpo no natural; es un anticuerpo humanizado; o es un anticuerpo quimérico.

7. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo (i) tiene una secuencia polipeptídica al menos el 80%, al menos al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a, o (ii) comprende, un anticuerpo que comprende la VL de SEQ ID NO:52 y la VH de SEQ ID NO:54.

8. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo anti-CGRP humano, o fragmentos de unión al antígeno del mismo, comprende (i) un anticuerpo humano, quimérico o humanizado; (ii) un Fab, F(ab')², scFv, o IgNar u otro fragmento de anticuerpo monovalente.

9. - El anticuerpo anti-CGRP humano para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo anti-CGRP humano comprende una región Fc que se ha modificado para alterar la función efectora, la semivida, la proteólisis y/o la glicosilación.

10. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, está aglicosilado o, si está glicosilado, solo comprende restos manosa.

11. - El anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo anti-CGRP humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, comprende la V^l de SEQ ID n O:52 y la V^h de SEQ ID NO:54.