ES2912075T3 - Formulación de líquido amniótico para el tratamiento de trastornos pulmonares - Google Patents

Abstract

Un líquido amniótico descelularizado estéril (D-HAF) para su uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno o lesión pulmonar, en el que el método comprende administrar al pulmón de un sujeto el D- HAF estéril en forma de aerosol o con un nebulizador, que genera gotitas de aerosol con un tamaño de entre aproximadamente 1,5 mm y aproximadamente 5 mm, inclusive, en una unidad de dosificación de entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 10,0 ml y en una cantidad eficaz para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas del trastorno o lesión pulmonar, en el que el D-HAF carece de células amnióticas, materia particulada de membrana amniótica y partículas de corion.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación de líquido amniótico para el tratamiento de trastornos pulmonares

Campo de la invención

La invención se refiere al tratamiento o la prevención de síntomas de enfermedades pulmonares, particularmente mediante la administración de una disolución de líquido amniótico formulada al pulmón, por ejemplo, usando un nebulizador.

Antecedentes de la invención

La buena salud pulmonar contribuye significativamente a la calidad de vida de una persona y a su capacidad para realizar actividades diarias comunes tales como caminar, hacer ejercicio y dormir, y para llevar a cabo funciones simples en su entorno rutinario.

En las últimas décadas, la prevalencia del asma casi se ha duplicado, y hoy en día el asma afecta al 8-10 % de la población mundial (Centers for Disease Control and Prevention, Vital Signs, mayo de 2011). El asma es un trastorno inflamatorio crónico de las vías respiratorias y se caracteriza por hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) a estímulos no específicos y remodelación de las vías respiratorias, que está asociada con alteraciones en las estructuras y funciones de los componentes principales de las vías respiratorias, incluyendo fibroblastos y miofibroblastos (Bergeron C et al., Can Respir J. 17(4): e85-e93 (2010)). El asma se clasifica ampliamente en asma bronquial y asma cardíaca, pero en general “asma” se refiere simplemente a asma bronquial.

Otra enfermedad pulmonar representativa es la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La EPOC se distingue del asma por la obstrucción acompañante de las vías respiratorias, y la EPOC fue la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos en 2011. A más de 11 millones de personas se les ha diagnosticado EPOC, pero se estima que 24 millones pueden tener la enfermedad sin siquiera conocerlo (Hoyert DL et al., Natl Vital Stat Rep.

61(6):1-65 (2012)).

La EPOC provoca una discapacidad grave a largo plazo, y puede ser una causa de muerte temprana. La EPOC se caracteriza por una limitación irreversible del flujo de aire debido a la obstrucción en las vías respiratorias conductoras pequeñas y a la destrucción enfisematosa de la superficie de intercambio de gases del pulmón. El humo de tabaco es el principal factor de riesgo de la EPOC desarrollando hasta el 10-20 % de los fumadores esta enfermedad (Fletcher C et al., Br Med J. 1:1645-8 (1977)). La EPOC se ejemplifica por bronquitis obstructiva crónica, bronquiolitis crónica y enfisema. Las teorías actuales referentes la patogenia de la EPOC incluyen un desequilibrio entre actividad proteasa y antiproteasa, y apoptosis inducida de células de la pared alveolar. La desregulación de las vías respiratorias implicadas en el estrés oxidativo, la angiogénesis y la inflamación crónica, y los procesos de remodelación y reparación tisular aberrantes conducen a la destrucción de la matriz extracelular (ECM) en el pulmón (Woode D et al., Cancers, 7(1): 329-341 (2015)) Sin embargo, la etiología del inicio y la progresión de la EPOC sigue estando poco entendida.

Las opciones de tratamiento del asma y las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas son muy limitadas, y han dependido principalmente del uso de agentes antiinflamatorios o broncodilatadores. En este momento no existe cura para la EPOc , y la tasa de mortalidad asociada con la EPOC continúa aumentando en todo el mundo.

Existe la necesidad de un tratamiento eficaz para pacientes con asma, EPOC y otros trastornos pulmonares obstructivos o restrictivos.

Las guerras recientes han creado una clase completa de individuos con una variedad de lesiones pulmonares, incluyendo daño por inhalación, quemaduras y como subproducto de traumatismos. Por ejemplo, el personal militar desplegado en Irak y Afganistán desde 2004 hasta la actualidad, sirvió en un entorno de condiciones ambientales únicas. Entre estas se encuentran exposiciones a basura quemada en “pozos de combustión” al aire libre encendidos con combustible para aviones JP-8. Dependiendo de la basura quemada (botellas de agua, bandejas de STYROFOAM™, residuos médicos, municiones sin explotar y ordenadores), pueden liberarse toxinas tales como dioxinas y n-hexano y benceno. La contaminación del aire con materia particulada culmina a partir de estos incendios y humos. Las exposiciones ambientales adicionales incluyen tormentas de arena que difieren en dirección y relación con la lluvia. Estas guerras vieron el primer uso de artefactos explosivos improvisados (bombas de fosfato en los bordes de las carreteras), así como artefactos explosivos improvisados en vehículos (coches bomba), que no solo aerosolizan potencialmente metales, sino que también crean ondas de choque que inducen lesiones pulmonares por medio de sobrepresión por explosiones. Al Qaeda también usa proyectiles de mortero convencionales tanto en Irak como en Afganistán. Los aeroalérgenos de exteriores de las palmeras datileras son prevalentes en el sur de Irak junto a los ríos Tigris y Éufrates, mientras que el aeroalérgeno de interiores de Aspergillus predomina durante la temporada de lluvias. La enfermedad pulmonar de alta altitud también puede agravar el problema, particularmente en Kandahar, Afganistán. Clínicamente, los soldados pueden presentar asma de nueva aparición u obstrucción fija de las vías respiratorias. Algunos tienen bronquiolitis constrictiva y remodelación vascular en biopsia de pulmón abierta, a pesar de tener espirometría y radiografías y tomografías computarizadas del tórax normales. Se ha encontrado que otros tienen titanio y otros metales en el pulmón (poco común en la naturaleza). Todavía otros tienen sarcoidosis fulminante comprobada por biopsia.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar formulaciones para el tratamiento y la prevención de una variedad de trastornos pulmonares.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar un líquido amniótico descelularizado estéril (D-HAF) para su uso en un método para la administración eficaz de la formulación al pulmón.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones.

Se han desarrollado formulaciones de líquido amniótico humano estéril y métodos de uso de las mismas. Las formulaciones están desprovistas de células amnióticas, elementos de membrana micronizada y partículas de corion. Las formulaciones no se tratan térmicamente ni se tratan con óxido de etidio. Las formulaciones son adecuadas para administración tópica al pulmón, para el tratamiento y/o la prevención de trastornos pulmonares incluyendo trastornos pulmonares obstructivos crónicos (EPOC), asma, enfisema, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar intersticial, enfisema por alfa-1 antitripsina, así como para el tratamiento y/o la prevención de lesiones pulmonares agudas resultantes de la exposición a irritantes químicos, asfixiantes, quemaduras y humos, agentes de guerra química y de control de disturbios, metales tóxicos y/o lesiones por explosión.

Las formulaciones de líquido amniótico se administran por vía tópica a la superficie del pulmón para aliviar o prevenir al menos un síntoma de un trastorno/lesión pulmonar. En particular, las formulaciones de líquido amniótico son eficaces para mejorar la resistencia al ejercicio, aumentar la saturación de oxígeno en sangre basal y/o reducir la inflamación en los pulmones.

Se describen métodos que incluyen administrar líquido amniótico humano descelularizado estéril formulado específicamente a los pulmones, preferiblemente como aerosol o gotitas nebulizadas o pulverización. Los métodos para la administración eficaz de formulaciones de líquido amniótico para dirigirse a las regiones distales del pulmón usan aparatos tales como nebulizadores. Normalmente, se administran formulaciones de líquidos amnióticos usando nebulizadores que permiten la generación de gotitas de aerosol con un tamaño de entre aproximadamente 1,5 |im y aproximadamente 5 |im, por ejemplo, desde aproximadamente 2,5 |im hasta aproximadamente 3,5 |im, inclusive. Algunos nebulizadores a modo de ejemplo incluyen nebulizadores de chorro de alta eficiencia, nebulizadores ultrasónicos de alta eficiencia o nebulizadores de malla vibratoria de alta eficiencia. Estos dispositivos permiten la administración eficiente de la formulación de líquido amniótico a las regiones distales del pulmón.

También se proporcionan unidades de dosificación de formulaciones de líquido amniótico para el tratamiento de trastornos pulmonares o lesiones pulmonares. Generalmente, las formulaciones de líquidos amnióticos están en una unidad de dosificación de desde aproximadamente 0,1 ml hasta aproximadamente 10,0 ml, inclusive. En algunas realizaciones, el D-HAF se diluye con agua, solución salina o tampón estéril en un volumen de aproximadamente 0. 1 ml a aproximadamente 10,0 ml, inclusive.

También se describen métodos para tratar trastornos pulmonares o lesiones pulmonares usando la formulación en combinación con uno o más agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico. En algunas realizaciones, el uno o más agentes son broncodilatadores, corticosteroides, metilxantinas, inhibidores de fosfodiesterasa-4, agentes antiangiogénicos, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes antiinflamatorios, factores de crecimiento, agentes inmunosupresores, agentes antialérgicos, o combinaciones de los mismos.

También se proporciona un kit que contiene una o más unidades estériles individuales de D-HAF en forma fluida o sólida, e instrucciones sobre cómo ha de usarse la dosis en un nebulizador o aerosol para el tratamiento de trastornos pulmonares o lesiones pulmonares. El kit también puede incluir una dosis unitaria de agua, solución salina o tampón estéril para dilución. El kit se usa generalmente por profesionales para pacientes con un trastorno pulmonar que incluye trastornos pulmonares obstructivos crónicos (EPOC), asma, enfisema, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar intersticial, enfisema por alfa-1 antitripsina, o combinaciones de los mismos. El kit también puede usarse para pacientes con lesiones pulmonares agudas resultantes de la exposición a irritantes químicos, asfixiantes, quemaduras y humos, agentes de control de disturbios y guerra química, metales tóxicos y/o lesiones por explosión.

Descripción detallada de la invención

1. Definiciones

El término “agente activo” se refiere a una sustancia fisiológica o farmacológicamente activa que actúa local y/o sistémicamente en el cuerpo. Un agente activo es una sustancia que se administra a un individuo para el tratamiento (por ejemplo, agente terapéutico), la prevención (por ejemplo, agente profiláctico) o el diagnóstico (por ejemplo, agente de diagnóstico) de una enfermedad o trastorno. Los agentes activos también pueden incluir materiales que alivian síntomas tales como la dificultad para respirar.

La frase “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad del agente terapéutico que produce algún efecto deseado a una razón de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que está tratándose, los constructos dirigidos particulares que se administran, el tamaño del sujeto o la gravedad de la enfermedad o afección. Un experto habitual en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un compuesto particular sin necesitar experimentación excesiva. Un agente profiláctico se refiere a un agente que puede prevenir un trastorno, enfermedad o afección.

El término “reparación de tejidos” se refiere a la restauración de la arquitectura y función tisulares después de una lesión en el contexto de la curación del tejido dañado. Abarca la regeneración celular. La regeneración se refiere a un tipo de curación en el que un nuevo crecimiento restaura partes del tejido dañado a un estado mejorado, o a su estado normal. La regeneración tisular puede iniciarse por estimulantes en las formulaciones, y/o por células madre introducidas en los tejidos dañados.

El término “tratar” se refiere a prevenir o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección. El tratamiento de la enfermedad o afección incluye mejorar al menos un síntoma de la enfermedad o afección particular, incluso si la fisiopatología subyacente no se ve afectada, tal como tratar el dolor de un sujeto mediante la administración de un agente analgésico a pesar de que tal agente no trate la causa del dolor.

Los términos “potenciar”, “aumentar”, “estimular”, “promover”, “disminuir”, “ inhibir” o “reducir” se usan en relación con un control. Se conocen controles en la técnica. Por ejemplo, una respuesta de aumento en un sujeto o célula tratada con un compuesto se compara con una respuesta en un sujeto o célula que no se trata con el compuesto.

El término “factores de crecimiento” se refiere a un grupo de proteínas u hormonas que estimulan el crecimiento celular. Los factores de crecimiento desempeñan un papel importante en la promoción de la diferenciación celular y la división celular, y se producen en una amplia variedad de organismos.

El término “biocompatible” o “biológicamente compatible” se refiere en general a materiales que son, junto con cualquier metabolito o producto de degradación de los mismos, generalmente no tóxicos para el receptor, y que no provocan ningún efecto adverso significativo al receptor. En términos generales, materiales biocompatibles son materiales que no provocan una respuesta inflamatoria o inmunitaria significativa cuando se administran a un paciente.

El término “biodegradable”, como se usa en el presente documento, significa que los materiales se degradan o se descomponen en sus subunidades componentes, o digestión, por ejemplo, mediante un proceso bioquímico, del material para dar lugar a subunidades más pequeñas (por ejemplo, no poliméricas).

El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a compuestos, portadores, excipientes, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una razón de beneficio/riesgo razonable.

El término “peso molecular” se refiere en general a la longitud de cadena promedio relativa del polímero o proteína a granel, a menos que se especifique lo contrario. En la práctica, el peso molecular puede estimarse o caracterizarse usando diversos métodos que incluyen cromatografía de permeación en gel (GPC) o viscosimetría capilar. Los pesos moleculares por GPC se notifican como peso molecular promedio en peso (Mw) en oposición al peso molecular promedio en número (Mn). La viscosimetría capilar proporciona estimaciones del peso molecular como viscosidad inherente determinada a partir de una disolución de polímero diluido usando un conjunto particular de condiciones de concentración, temperatura y disolvente.

II. Composiciones

Se proporcionan formulaciones de líquido amniótico humano purificado. Normalmente, las formulaciones incluyen líquido amniótico humano descelularizado estéril (D-HAF), o bien en forma fluida o bien en forma sólida, por ejemplo, polvo liofilizado, solo o en combinación con excipientes apropiados. Pueden incluirse otros agentes activos. D-HAF contiene más de 300 tipos diferentes de factores de crecimiento humanos, algunos en cantidades menores que las encontradas en el líquido amniótico natural. D-HAF carece de células amnióticas y elementos de membrana micronizada o partículas de corion. El D-HAF se prepara normalmente a través de una serie de etapas de filtración por membrana para eliminar células amnióticas y elementos de membrana micronizada o partículas de corion. Las formulaciones de líquido amniótico contienen citocinas alogénicas y factores de crecimiento para la estimulación de células madre autólogas para la regeneración. Se describen en detalle métodos de preparación de líquido amniótico descelularizado estéril en la patente estadounidense n.° 9.579.350. El D-HAF se esteriliza por filtración, no irradiación, óxido de etileno ni calor.

A. Líquido amniótico

El líquido amniótico (“AF”) contiene nutrientes y factores de crecimiento que facilitan el crecimiento fetal, proporciona amortiguación mecánica y efectores antimicrobianos que protegen al feto, y permite la evaluación de la madurez y enfermedad fetales. El AF contiene normalmente mezclas de factores de crecimiento, citocinas proinflamatorias y citocinas antiinflamatorias, así como una variedad de macromoléculas que incluyen hidratos de carbono, proteínas y péptidos, lípidos, lactato, piruvato, electrolitos, enzimas y hormonas.

En algunas realizaciones, la formulación no se trata térmicamente, ni se trata químicamente ni se fracciona en relación con el líquido sin procesar directamente recogido de la fuente. En algunas realizaciones, la formulación retiene más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 % o preferiblemente más del 90% de los factores amnióticos biológicamente activos presentes en el líquido sin procesar. En algunas realizaciones, las formulaciones no se diluyen con ninguna disolución adicional. En otras realizaciones, las formulaciones no se concentran en relación con el líquido sin procesar. En algunas realizaciones, las formulaciones se diluyen justo antes de añadirse al nebulizador para su uso.

1. Factores de crecimiento, citocinas y otras moléculas

Los factores de crecimiento y sus receptores controlan una amplia gama de funciones biológicas, regulando la proliferación, supervivencia, migración y diferenciación celulares. Los factores de crecimiento que se encuentran en el AF desempeñan un papel crítico en el crecimiento y desarrollo fetales.

Una lista no limitativa de factores de crecimiento que se han identificado en el AF incluye tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I), factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-a ), factor de necrosis tumoral A (TNF-a), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF7), metalopeptidasa de la matriz (MMP-9), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), metaloproteinasa-7 de la matriz (MMP-7), metaloproteinasa-7 de la matriz (MMP-13), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a ), factor de crecimiento transformante beta (TGF-P), factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF-4), factor de crecimiento endotelial vascular derivado de la glándula endocrina (EG-VEGF), interleucina 8 (IL-8), factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21), angiopoyetina-2 (ANG2), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF-19), inhibidor 2 de metalopeptidasa TIMP (TIMP-2), angiopoyetina-1 (ANG-1), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFp1), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), angiotensinógeno, factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA (PDGF-AA) y factor de células madre (SCF).

El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es una pequeña hormona polipeptídica con propiedades mitogénicas in vivo e in vitro. El EGF provoca respuestas biológicas uniéndose a un receptor de la superficie celular que es una glicoproteína transmembrana que contiene una proteína tirosina quinasa citoplasmática. Las respuestas de EGF están mediadas por la unión al ligando y la activación de esta proteína quinasa intrínseca. El receptor puede fosforilarse por otras proteínas quinasas, y esto puede regular la función del receptor. La estimulación de la actividad de la tirosina quinasa receptora por la unión al ligando debe regular la actividad de una(s) molécula(s) aún no definida(s) responsable(s) de transmitir una señal mitogénica al núcleo (Todderud G, et al., Biofactors. 1989, 2(1):11-5).

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), también conocido como factor de permeabilidad vascular (VPF), se describió originalmente como un mitógeno específico de células endoteliales. El VEGF se produce por muchos tipos de células, incluyendo células tumorales, macrófagos, plaquetas, queratinocitos y células mesangiales renales. Las actividades de VEGF no se limitan al sistema vascular; el VEGF desempeña un papel en funciones fisiológicas normales, tales como la formación de hueso, hematopoyesis, cicatrización de heridas y desarrollo (Duffy AM et al., en: Madame Curie Bioscience Database [Internet]. Austin (TX): Landes Bioscience (2000)).

TGF -a tiene una estructura similar al EGF y se une al mismo receptor. Las células amnióticas del cordón umbilical expresan EGF, TGF-a y el receptor funcional de EGF/TGF-a , lo que sugiere la posibilidad de un papel regulador del amnios en el crecimiento y desarrollo fetales. También se ha demostrado que EGF y TGF-a estimulan la producción de componentes tensioactivos. Se cree que TGFp1 induce diferenciación terminal de células epiteliales intestinales y acelera la velocidad de curación de heridas intestinales estimulando la migración celular. TGFp1 también puede estimular la producción de IgA. VEGF-A es una proteína señal que estimula la vasculogénesis y angiogénesis (Hoeben Am, et al., Pharmacol Rev 2004, 56:549-580).

El factor de crecimiento transformante beta (TGF-P) es un péptido multifuncional que controla la proliferación, diferenciación y otras funciones en muchos tipos de células. Muchas células sintetizan TGF-beta y esencialmente todas ellas tienen receptores específicos para este péptido. TGF-beta regula las acciones de muchos otros factores de crecimiento peptídicos y determina una dirección positiva o negativa de sus efectos (Sporn MB, et al., Science 1986, 233(4763) 532-534).

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el ligando para la tirosina quinasa receptora codificada por el protooncogén c-Met, es una proteína de múltiples dominios estructuralmente relacionada con la proenzima plasminógeno y con papeles principales en el desarrollo, la regeneración tisular y el cáncer. Un estudio reciente mostró su potencial de inmunomodulación de células madre de líquido amniótico (Maraldi T, et al. Stem Cells Transl Med, 4(6):539-47 (2015)).

Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) que señalizan a través de receptores de FGF (FGFR) regulan un amplio espectro de funciones biológicas, incluyendo proliferación, supervivencia, migración y diferenciación celulares. Las rutas de la señal de FGF son la ruta de RAS/MAP quinasa, la ruta de PI3 quinasa/AKT y la ruta de PLCy, entre las cuales se sabe que la ruta de RAS/MAP quinasa es predominante. Varios estudios han implicado recientemente las funciones biológicas in vitro de los FGF en la regeneración tisular. Muchas aplicaciones actuales del FGF están en la regeneración de tejidos, incluyendo piel, vaso sanguíneo, músculo, tejido adiposo, tendón/ligamento, cartílago, hueso, diente y tejidos nerviosos (Yun YR, et al., J Tissue Eng 2010: 1(1)).

Las metaloproteinasas de la matriz (MMP), también denominadas matrixinas, funcionan en el entorno extracelular de las células y degradan tanto proteínas de la matriz como las que no son de la matriz. Desempeñan papeles centrales en la morfogénesis, cicatrización de heridas, reparación y remodelación tisulares en respuesta a una lesión, por ejemplo después de infarto de miocardio, y en la progresión de enfermedades tales como ateroma, artritis, cáncer y úlceras tisulares crónicas. Son proteínas de múltiples dominios y sus actividades están reguladas por inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP) (Nagasa H, et al., Cardiovascular Research, European Society of Cardiology, 562-573 (2006)).

El líquido amniótico también contiene muchas citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias. Las citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias desempeñan importantes papeles inmunorreguladores. La inflamación se caracteriza por la interacción entre citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias. Las citocinas se clasifican comúnmente en una u otra categoría: interleucina-1 (IL-1), factor de necrosis tumoral (TNF), interferón gamma (IFN-gamma), IL-12, IL-18 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos están bien caracterizados como citocinas proinflamatorias, mientras que IL4, IL-10, IL-13, IFN-alfa y factor de crecimiento transformante beta se reconocen como citocinas antiinflamatorias.

Las citocinas proinflamatorias a modo de ejemplo incluyen eotaxina-2 (CCL24), interleucina 6 (IL-6), quimiocina pulmonar y regulada por activación PARC o ligando 18 de quimiocina (motivo C-C) (CCL18), GRO total que consistía en tres subunidades GROa/CXCL1, GROp/CXCL2 y GROy/CXCL3, expresión de la quimiocina CXC activadora de neutrófilos (ENA-78/CXCL-5), ligando 21 de quimiocina (motivo C-C) (CCL21 o 6Ccina), proteína inflamatoria de macrófagos 3 alfa (MIP-3a o CCL20), monocina inducida por gamma (MIG o CXCL-9), MIP-1a , ligando 5 de quimiocina (motivo C-C) (CCL-5), también conocido como RANTES (regulado en la activación, expresado y secretado por células T normales), interleucina-1 alfa (IL-1a), proteína inflamatoria de macrófagos-1p (MIP-1D o CCL4), factor de necrosis tumoral (TNFa) y proteína quimiotáctica de monocitos 2 (MCP-2 o CCL8).

Las citocinas antiinflamatorias a modo de ejemplo incluyen los factores antiinflamatorios que incluyen interleucina 8 (IL-8), interleucina 13 (IL-13), interleucina 27 (IL-27), proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), factor de crecimiento endotelial vascular D (VEGF-D), antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1Ra), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFp1), interleucina 5 (IL-5) e interleucina 21 (IL-21).

2. Fuentes de formulaciones de líquido amniótico

Las formulaciones de líquido amniótico estéril se preparan a partir de líquido amniótico humano obtenido de una mujer embarazada. Se obtiene AF humano de pacientes que se someten a amniocentesis, pacientes que se someten a parto por cesárea y pacientes que experimentan parto normal usando un receptáculo especialmente diseñado para recoger el líquido después de la rotura de las membranas.

Las formulaciones de líquido amniótico humano descelularizado (D-HAF) pueden almacenarse durante largos períodos de tiempo, permitiendo una amplia gama de métodos de aplicación, incluyendo distribución y almacenamiento como aerosoles, disoluciones, polvos, etc. El D-HAF estéril puede refrigerarse a de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 10 °C para almacenamiento a largo plazo. En una realización, el DHAF estéril se refrigera a 4 °C durante hasta 12 meses y más. Preferiblemente, el almacenamiento a largo plazo no reduce la cantidad de proteínas o factores solubles totales presentes en el D-HAF. Para algunas realizaciones, las proteínas solubles totales retenidas después del almacenamiento a largo plazo en condiciones refrigeradas son de aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % del D-HAF fresco.

Pueden suministrarse formulaciones de D-HAF que contienen factores amnióticos como una disolución transparente de una parte en un recipiente adecuado para almacenamiento a 4 °C, o para almacenamiento a -20 °C, o a -80 °C. Por ejemplo, formulaciones líquidas en alícuotas precargadas pueden ser adecuadas para almacenamiento a 1-5 °C, o para almacenamiento a -20 °C, o a -80 °C. La formulación líquida puede ser adecuada para aplicación tópica en un nebulizador o un inhalador. En otras realizaciones, el líquido puede suministrarse como un kit que puede almacenarse a 4 °C, a -20 °C o a -80 °C hasta que sea necesario.

En algunas realizaciones, las formulaciones de D-HAF usan una filtración final a través de 0,2 |im para obtener el mejor nivel de garantía de esterilidad y producir un líquido amniótico estéril sin ninguna irradiación. En algunas realizaciones, las formulaciones de D-HAF tienen un nivel de garantía de esterilidad de 10-6 sin irradiación. En otras realizaciones, el liofilizado derivado del líquido amniótico a través de la liofilización puede irradiarse mediante irradiación de haz de electrones o irradiación de rayos gamma para agregar otra garantía para la esterilidad final del polvo.

En algunas realizaciones, las formulaciones de D-HAF son líquido amniótico sintetizado o reconstituido para que incluya todos los factores amnióticos conocidos para las mismas propiedades terapéuticas y/o profilácticas en el tratamiento de trastornos pulmonares.

En realizaciones preferidas, el líquido amniótico se administra a la misma especie de la que se recoge, por ejemplo, ser humano u otros animales, por ejemplo, gatos, perros, caballos, ovejas, cerdos y ganado, etc. Por ejemplo, pueden tratarse caballos con formulaciones de líquido amniótico para aliviar o prevenir trastornos o lesiones pulmonares usando formulaciones preparadas a partir de líquido amniótico equino. El líquido amniótico se recoge y se procesa como se describió anteriormente usando un proceso estéril de descelularización del líquido mediante una serie de centrifugación y filtración. Es posible administrar el producto de líquido amniótico a una especie diferente de la que se recoge.

B. Agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico adicionales

Además del componente de líquido amniótico, la formulación puede contener uno o más agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o profilácticos adicionales. En el caso de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades pulmonares, la formulación puede contener uno o más agentes terapéuticos para tratar, prevenir o diagnosticar una enfermedad o trastorno del pulmón. La cantidad de agente terapéutico que va a combinarse con el producto de líquido amniótico depende generalmente de la gravedad de los síntomas de los trastornos pulmonares que van a tratarse. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente dosificaciones específicas. Véase Ansel, Howard C. et al. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6a ed.) Williams y Wilkins, Malvern, PA (1995). Alternativamente, la formulación amniótica puede usarse en combinación con el suministro de células, por ejemplo, el suministro de células madre, células pluripotentes, células somáticas o combinaciones de las mismas.

En algunas realizaciones, la composición puede contener uno o más compuestos adicionales para aliviar síntomas tales como inflamación o dificultad para respirar. Agentes terapéuticos (incluyendo profármacos), profilácticos o de diagnóstico representativos pueden ser péptidos, proteínas, hidratos de carbono, nucleótidos u oligonucleótidos, moléculas pequeñas, o combinaciones de los mismos. Los oligonucleótidos representativos incluyen ARNip, microARN, ADN y ARN. Pueden usarse oligonucleótidos como terapia génica que complementa la eficacia de las formulaciones de líquido amniótico.

Ejemplos no limitativos incluyen broncodilatadores, corticosteroides u otros agentes antiinflamatorios o inmunosupresores, metilxantina, inhibidores de fosfodiesterasa-4, agentes antimicrobianos, analgésicos, anestésicos tópicos o locales, un agente antiangiogénico, antihistamínicos, antiinfecciosos (antivirales, antibiótico y antifúngicos), cofactores enzimáticos, nutrientes esenciales y factores de crecimiento. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica contiene uno o más anestésicos locales. Los anestésicos locales representativos incluyen tetracaína, lidocaína, ametocaína, proparacaína, lignocaína y bupivacaína. En algunos casos, uno o más agentes adicionales, tales como una enzima hialuronidasa, también se añaden a la formulación para acelerar y mejorar la dispersión del anestésico local.

Los agentes activos pueden ser un agente activo de molécula pequeña o una biomolécula tal como una enzima u otra proteína, polipéptido, lípido, lipoproteína o ácido nucleico. Los agentes activos de molécula pequeña adecuados incluyen compuestos orgánicos y organometálicos. En algunos casos, el agente activo de molécula pequeña tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2000 g/mol, más preferiblemente menos de aproximadamente 1500 g/mol, lo más preferiblemente menos de aproximadamente 1200 g/mol. El agente activo de molécula pequeña puede ser un compuesto hidrófilo, hidrófobo o anfífilo.

En algunos casos, uno o más agentes activos adicionales están encapsulados en, dispersados en o asociados de otro modo con la formulación, en forma seca, partículada o líquida. En ciertas realizaciones, uno o más agentes activos adicionales también pueden disolverse o suspenderse en el portador farmacéuticamente aceptable.

Pueden estar presentes agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico de molécula pequeña en su forma neutra, o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, puede ser deseable preparar una formulación que contiene una sal de un agente activo debido a una o más de las propiedades físicas ventajosas de la sal, tales como estabilidad mejorada o un perfil de solubilidad o disolución deseable.

Generalmente, pueden prepararse sales farmacéuticamente aceptables por reacción de las formas de ácido o base libres de un agente activo con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de un agente activo derivadas de ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos, sales de metales alcalinos y sales de metales alcalinotérreos, así como sales formadas por reacción del fármaco con un ligando orgánico adecuado (por ejemplo, sales de amonio cuaternario). Se encuentran listas de sales adecuadas, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, pág. 704.

En algunos casos, el agente adicional es un agente de diagnóstico. Los agentes de diagnóstico a modo de ejemplo incluyen moléculas paramagnéticas, compuestos fluorescentes, moléculas magnéticas y radionúclidos, agentes de obtención de imágenes por rayos X y medios de contraste. Estos también pueden ser ligandos o anticuerpos que están marcados con los anteriores o se unen a ligandos o anticuerpos marcados que son detectables por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, la formulación de líquido amniótico se usa en combinación con terapia de oxígeno.

1. Broncodilatadores

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con uno o más broncodilatadores. Los broncodilatadores son un tipo de medicación que ayuda a abrir las vías respiratorias para facilitar la respiración.

Broncodilatadores de acción corta en una situación de emergencia o según sea necesario para un alivio rápido. Algunos broncodilatadores de acción corta a modo de ejemplo incluyen anticolinérgicos tales como ipratropio (por ejemplo ATROVENT®, en COMBIVENT®, en DUONEB®), agonistas de beta2 tales como albuterol (por ejemplo VOSPIRE ER®, en COMBIVENT®, en DUONEB®) y levalbuterol (por ejemplo XOPENEX®).

Se usan broncodilatadores de acción prolongada para tratar la EPOC a lo largo de un período prolongado de tiempo. Se toman habitualmente una o dos veces al día durante un largo período de tiempo, y vienen como formulaciones para inhaladores o nebulizadores. Algunos broncodilatadores de acción prolongada a modo de ejemplo incluyen anticolinérgicos tales como aclidinio (por ejemplo TUDORZA®), tiotropio (por ejemplo SPIRIVA®) o umeclidinio (por ejemplo INCRUSE ELLIPTA®), agonistas de beta2 tales como arformoterol (por ejemplo BROVANA®), formoterol (por ejemplo FORADIL®, PERFOROMIST®), indacaterol (por ejemplo Ar CAPt A®), salmeterol (por ejemplo SEREVENT®) y olodaterol (por ejemplo STRIVERDI RESPIMAT®).

2. Corticosteroides

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con uno o más corticosteroides. Los corticosteroides ayudan a reducir la inflamación en el cuerpo, facilitando el flujo de aire a los pulmones. Hay varios corticosteroides. Algunos se prescriben con broncodilatadores porque estos dos medicamentos pueden funcionar conjuntamente haciendo que la respiración sea más eficaz. Fluticasona (por ejemplo, FLOVENT®), budesonida (por ejemplo PULMICORT®) y prednisolona son las que los médicos comúnmente prescriben para la EPOC.

3. Metilxantinas

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con una o más metilxantinas. Algunas personas tienen una dificultad grave con la EPOC y los tratamientos regulares o de primera línea por sí solos no parecen ayudar. En estos casos, puede usarse teofilina (por ejemplo, THEO-24®, t He OLAIR®, ELIXOPHYLLINE®, QUIBRON-T®, UNIPHYL® y ELIXOPHYLLIN®), que funciona como antiinflamatorio y relaja los músculos de las vías respiratorias, tomándose junto con un broncodilatador. La teofilina viene como una píldora o un líquido que va a tomarse diariamente, y/o combinado con otros medicamentos.

4. Inhibidores de fosfodiesterasa-4

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con uno o más inhibidores de fosfodiesterasa-4. Este medicamento ayuda a aliviar la inflamación, lo que puede mejorar el flujo de aire a los pulmones. Roflumilast (por ejemplo DALIRESP®) es un inhibidor de fosfodiesterasa-4 y viene como una píldora que puede tomarse una vez al día. Habitualmente se prescribe junto con un broncodilatador de acción prolongada.

5. Agentes antimicrobianos

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con uno o más agentes antimicrobianos. Un agente antimicrobiano es una sustancia que mata o inhibe el crecimiento de microbios tales como bacterias, hongos, virus o parásitos. Los agentes antimicrobianos incluyen agentes antivirales, agentes antibacterianos, agentes antiparasitarios y agentes antifúngicos. Los agentes antivirales representativos incluyen ganciclovir y aciclovir. Los agentes antibióticos representativos incluyen aminoglucósidos tales como estreptomicina, amikacina, gentamicina y tobramicina, ansamicinas tales como geldanamicina y herbimicina, carbacefemas, carbapenemas, cefalosporinas, glicopéptidos tales como vancomicina, teicoplanina y telavancina, lincosamidas, lipopéptidos tales como daptomicina, macrólidos tales como azitromicina, claritromicina, diritromicina y eritromicina, monobactamas, nitrofuranos, penicilinas, polipéptidos tales como bacitracina, colistina y polimixina B, quinolonas, sulfonamidas y tetraciclinas.

Otros agentes antimicrobianos a modo de ejemplo incluyen yodo, compuestos de plata, moxifloxacino, ciprofloxacino, levofloxacino, cefazolina, tigeciclina, gentamicina, ceftazidima, ofloxacino, gatifloxacino, anfotericina, voriconazol, natamicina.

6. Anestésicos locales

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con uno o más anestésicos locales. Un anestésico local es una sustancia que provoca anestesia local reversible y tiene el efecto de pérdida de la sensación de dolor. Los ejemplos no limitativos de anestésicos locales incluyen ambucaína, amolanona, amilocaína, benoxinato, benzocaína, betoxicaína, bifenamina, bupivacaína, butacaína, butambeno, butanilicaína, butetamina, butoxicaína, carticaína, cloroprocaína, cocaetileno, ciclometicaína, dibucaína, dimetisoquina, dimetocaína, diperodón, diciclonina, ecgonidina, ecgonina, cloruro de etilo, etidocaína, beta-eucaína, euprocina, fenalcomina, formocaína, hexilcaína, hidroxitetracaína, p-aminobenzoato de isobutilo, mesilato de leucinocaína, levoxadrol, lidocaína, mepivacaína, meprilcaína, metabutoxicaína, cloruro de metilo, mirtecaína, naepaína, octacaína, ortocaína, oxetazaína, paretoxicaína, fenacaína, fenol, piperocaína, piridocaína, polidocanol, pramoxina, prilocaína, procaína, propanocaína, proparacaína, propipocaína, propoxicaína, psuedococaína, pirrocaína, ropivacaína, alcohol salicílico, tetracaína, tolicaína, trimecaína, zolamina, y cualquier combinación de los mismos.

7. Agentes antiinflamatorios e inmunosupresores

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con uno o más agentes antiinflamatorios. Los agentes antiinflamatorios reducen la inflamación e incluyen fármacos esteroideos y no esteroideos. Los agentes activos esteroideos adecuados incluyen glucocorticoides, progestinas, mineralocorticoides y corticosteroides. Otros agentes antiinflamatorios a modo de ejemplo incluyen acetónido de triamcinolona, acetónido de fluocinolona, prednisolona, dexametasona, loteprendol, fluorometolona, ibuprofeno, aspirina y naproxeno. Los fármacos inmunomoduladores a modo de ejemplo incluyen ciclosporina, tacrolimus y rapamicina. Los ejemplos de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) incluyen ácido mefenámico, aspirina, diflunisal, salsalato, ibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, ketoprofeno, dexketoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, loxoprofeno, indometacina, sulindaco, etodolaco, ketorolaco, diclofenaco, nabumetona, piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lomoxicam, isoxicam, ácido meclofenámico, ácido flufenámico, ácido tolfenámico, electoxib, rofecoxib, valdecoxib, parecoxib, lumiracoxib, etoricoxib, firocoxib, sulfonanilidas, nimesulida, ácido níflumico y licofelona.

En algunas realizaciones, los agentes antiinflamatorios son citocinas antiinflamatorias. Citocinas a modo de ejemplo son IL-10, TGF-p e IL-35. Citocinas antiinflamatorias en el contexto de implante de biomaterial, injertos de piel e injertos capilares son citocinas que inducen un entorno inmunitario antiinflamatorio o suprimen el entorno inmunitario inflamatorio. La activación de células T reguladoras, Treg, está implicada en la prevención del rechazo, la inducción y el mantenimiento de la tolerancia periférica del aloinjerto. Las células Th17 son un subconjunto de células T auxiliares que se caracteriza por la producción de IL-17. Se ha sugerido que las células Th17 desempeñan un papel en el rechazo de aloinjertos. En algunas realizaciones, las citocinas que van a añadirse a las formulaciones de líquido amniótico son aquellas que inducen la activación de Treg (por ejemplo IL-25) y suprimen la activación de Th17 (por ejemplo IL-10) para minimizar el rechazo.

8. Células

En algunas realizaciones, la formulación de líquido amniótico incluye al menos un tipo de célula eucariota. Los tipos de células eucariotas a modo de ejemplo incluyen células madre, células inmunitarias tales como linfocitos T, linfocitos B, células citolíticas naturales y células dendríticas, o combinaciones de las mismas.

Se han identificado células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC) como una posible estrategia para el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (Gu W et al., Sci Rep. 5:8733 (2015); Weiss DJ et al., Chest. 143(6): 1590-8 (2013); D'Agostino B et al., Expert Opin Biol Ther. 10(5):681-7 (2010)). En algunas realizaciones, las células madre son células madre mesenquimales. Las características funcionales de las células madre mesenquimales que pueden beneficiar la cicatrización de heridas incluyen su capacidad para migrar al sitio de lesión o inflamación, participar en la regeneración de tejidos dañados, estimular la proliferación y diferenciación de células progenitoras residentes, promover la recuperación de células lesionadas a través de la secreción de factores de crecimiento y la remodelación de la matriz, y ejercer efectos inmunomoduladores y antiinflamatorios únicos.

En ciertas realizaciones, las células madre mesenquimales protegen el tejido pulmonar a través de la supresión de citocinas proinflamatorias, y a través del desencadenamiento de la activación de la producción de factores de crecimiento reparadores.

9. Factores de crecimiento y citocinas

En algunas realizaciones, se usan formulaciones de líquido amniótico en combinación con uno o más factores de crecimiento y/o citocinas. Estos son proteínas capaces de estimular el crecimiento celular, la proliferación y/o la diferenciación celular. Los ejemplos no limitativos de factores de crecimiento incluyen factor de crecimiento transformante beta (TGF-P), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF), factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO), miostatina (GDF8), factor de diferenciación del crecimiento-9 (GDF9), factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF o FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF-2), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

10. Anticuerpos

En algunas realizaciones, la formulación puede incluir anticuerpos, por ejemplo, daclizumab, bevacizumab (Avastin®), ranibizumab (Lucentis®), basiliximab, ranibizumab y pegaptanib sódico o péptidos como SN50, y antagonistas de NF.

11. Cofactores, vitaminas y nutrientes

En algunas realizaciones, la formulación de líquido amniótico comprende además uno o más cofactores enzimáticos, y/o uno o más nutrientes esenciales. Los cofactores a modo de ejemplo incluyen vitamina C, biotina, vitamina E y vitamina K. Los nutrientes esenciales a modo de ejemplo son aminoácidos, ácidos grasos, etc.

12. Antiproliferativos

En algunas realizaciones, la formulación de líquido amniótico comprende además fármacos antiproliferativos tales como paclitaxel y derivados. Los fármacos antiproliferativos representativos incluyen, pero no se limitan a, las siguientes moléculas pequeñas amsacrina, bleomicina, busulfán, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, crisantaspasa, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, epipodofilotoxinas, epirubicina, etopósido, fosfato de etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxicarbamida, idarubicina, ifosfamida, innotecán, leucovorina, doxorubicina liposomal, daunorubicina liposomal, lomustina, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, pentostatina, procarbazina, raltitrexed, satraplatino, estreptozocina, tenipósido, tegafur-uracilo, temozolomida, tenipósido, tiotepa, tioguanina, topotecán, treosulfán, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, taxol y derivados del mismo, y anticuerpos tales como trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuximab y rituximab (RITUXAN® o MABTHERA®), bevacizumab (AVASTIN®), y combinaciones de los mismos. Los agentes proapoptóticos representativos incluyen, pero no se limitan a, fludarabinataurosporina, cicloheximida, actinomicina D, lactosilceramida, 15d-PGJ(2)5 y combinaciones de los mismos.

C. Formulaciones de dosificación

Normalmente, las formulaciones de líquido amniótico se envasan en unidades de dosificación estériles que pueden almacenarse y distribuirse para su uso por médicos especialistas. Las formulaciones liofilizadas o de líquido pueden estar en forma de ampolla envasada estéril lista para su uso con un nebulizador.

Las dosificaciones de líquido para su uso son líquido amniótico que está desprovisto de células y materia particulada, preparado por medio de una serie de etapas de centrifugación y filtración que no desnaturalizan los compuestos bioactivos. Las concentraciones de proteínas, lípidos o cualquier otra molécula presente en el líquido amniótico humano descelularizado son similares a la del líquido no procesado. Normalmente, el líquido amniótico descelularizado retiene más del 80 % de las proteínas amnióticas en comparación con el líquido amniótico sin procesar. En algunas realizaciones, las composiciones de D-HAF retienen la mayoría de los factores amnióticos después del almacenamiento a corto o largo plazo en condiciones de temperatura controlada, o bien como un líquido o bien como polvo liofilizado, por ejemplo, al menos el 50 % del contenido de proteína total en comparación con el del D-HAF fresco, preferiblemente más del 80 %.

Las dosificaciones de líquido para su uso con un nebulizador serán de desde aproximadamente 0,1 ml hasta aproximadamente 10,0 ml. En algunas realizaciones, la dosificación para su uso con un nebulizador es de aproximadamente 0,1 ml, aproximadamente 0,2 ml, aproximadamente 0,5 ml, aproximadamente 1,0 ml, aproximadamente 2,0 ml, aproximadamente 3,0 ml, aproximadamente 5,0 ml y aproximadamente 10,0 ml. Generalmente, los volúmenes usados en el presente documento se refieren a líquido amniótico humano descelularizado estéril recién procesado, es decir, presentación 1x sin ninguna dilución o concentración. En algunas realizaciones, los volúmenes para su uso con un nebulizador deben ajustarse/aumentarse para que coincidan con la cantidad de principios activos en las formaciones de líquido amniótico, en particular si las formulaciones se almacenaron durante un largo período de tiempo donde los principios activos (factores amnióticos) se han deteriorado con el tiempo. En algunos casos en los que se usan formulaciones de líquido amniótico liofilizadas, estos volúmenes se refieren al volumen de líquido cuando el polvo liofilizado se reconstituye con el volumen inicial de agua estéril, es decir, presentación 1x.

En la realización actualmente preferida, se administran tratamientos una vez a la semana mediante nebulizador, pero podrían administrarse más o menos frecuentemente, y usando otros dispositivos tales como un inhalador o pulverización intranasal.

La formulación de líquido amniótico estéril puede administrarse en forma procesada, forma concentrada o diluida con agua, solución salina o tampón estéril, preferiblemente en forma de aerosol. Puede incluir un agente terapéutico, profiláctico o de diagnóstico adicional, o bien mezclado con las formulaciones, o bien en recipientes separados que van a usarse conjuntamente con, posteriormente a o en alternancia con el tratamiento con la formulación de líquido amniótico de la divulgación. La eficacia se determina mediante evaluaciones médicas, autoevaluaciones del paciente, estudios de obtención de imágenes y evaluaciones de calidad de vida.

Los excipientes representativos incluyen disolventes, diluyentes, agentes modificadores del pH, conservantes, antioxidantes, agentes de suspensión, agentes humectantes, modificadores de la viscosidad, agentes de tonicidad, agentes estabilizantes, y combinaciones de los mismos. Se seleccionan preferiblemente excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados de materiales que generalmente se reconocen como seguros (GRAS), y pueden administrarse a un individuo sin provocar efectos secundarios biológicos indeseables ni interacciones no deseadas. Puede formularse D-HAF para su almacenamiento como un líquido o sólido (es decir, polvo). En realizaciones preferidas, se formula DHAF para su almacenamiento como un líquido (es decir, por encima de las temperaturas de congelación).

1. Disoluciones, emulsiones y suspensiones

Se conocen y están disponibles numerosas formulaciones. Las disoluciones pueden ser el líquido amniótico filtrado estéril, concentrado o diluido con agua, solución salina tamponada o un equivalente. Las emulsiones son generalmente dispersiones de gotitas oleosas en una fase acuosa. No debería haber evidencias de rotura o coalescencia. Las suspensiones contienen partículas sólidas dispersas en un portador líquido; deben ser homogéneas cuando se agitan suavemente y permanecer suficientemente dispersas para permitir que se retire la dosis correcta del recipiente. Puede producirse sedimentación, pero esto debe dispersarse fácilmente cuando se agita el recipiente, y debe controlarse el tamaño de las partículas dispersadas. El principio activo y cualquier otro material suspendido deben reducirse hasta un tamaño de partícula lo suficientemente pequeño como para aerosolizarse y para evitar la irritación y el daño al revestimiento de los pulmones. Pueden contener aditivos adecuados, tales como agentes antimicrobianos, antioxidantes y agentes estabilizantes.

Cuando la disolución se dispensa en un recipiente de múltiples dosis que va a usarse durante un período de tiempo mayor de 24 horas, debe añadirse un conservante para garantizar la seguridad microbiológica durante el período de uso.

Las formulaciones deben prepararse dependiendo del uso previsto del D-HAF, y la información sobre el paciente que va a tratarse. Esto puede determinarlo un experto en la técnica.

Por ejemplo, para aplicaciones pulmonares, el pH de las formulaciones debe ser idealmente equivalente al de los revestimientos del pulmón, que puede variar dependiendo de la ubicación precisa y la gravedad de la enfermedad. Sin embargo, la decisión de añadir un agente tamponante debe basarse en consideraciones de estabilidad. El pH seleccionado debe ser el óptimo tanto para la estabilidad del principio farmacéutico activo como para la tolerancia fisiológica. Si se usa un sistema de tampón, no debe provocar precipitación ni deterioro de los principios activos. También debe tenerse en cuenta la influencia sobre la nebulización.

Aunque disoluciones con un pH fisiológico son ideales, las superficies del pulmón toleran un intervalo mayor, desde 3,5 hasta 10,0. Pueden añadirse tampones o agentes de ajuste del pH o portadores para ajustar y estabilizar el pH a un nivel deseado. Las formulaciones de D-HAF se tamponan al pH de la máxima estabilidad del/de los principio(s) activo(s) que contienen. Los tampones se incluyen para minimizar cualquier cambio en el pH durante la vida útil del fármaco; esto puede ser el resultado de dióxido de carbono absorbido del aire o de iones hidroxilo de un recipiente de vidrio. Los cambios en el pH pueden afectar a la solubilidad y estabilidad del/de los principio(s) activo(s). En consecuencia, es importante minimizar las fluctuaciones en el pH. Los expertos en la técnica conocen bien tampones adecuados y algunos ejemplos de tampones útiles son tampones acetato, borato, carbonato, citrato y fosfato. El sistema de tampón debe ser suficiente para mantener el pH durante toda la vida útil esperada del producto, pero con una baja capacidad de tampón de modo que, cuando la formulación se nebulice y se deposite sobre los revestimientos de los pulmones, el sistema de tampón llevará rápidamente el pH de la disolución de nuevo al de los revestimientos del pulmón. Se usan bajas concentraciones de sales de tampón para preparar tampones de baja capacidad de tampón.

La preparación de formulaciones acuosas de D-HAF requiere una cuidadosa consideración de la necesidad de isotonicidad, una cierta capacidad tamponante, el pH deseado, la adición de agentes antimicrobianos y/o antioxidantes, el uso de agentes de aumento de la viscosidad y la elección del envase apropiado. Las formulaciones se consideran isotónicas cuando la tonicidad es igual a la de una disolución al 0,9 % de cloruro de sodio. Los revestimientos de los pulmones generalmente pueden tolerar disoluciones equivalentes al 0,5-7,0 % de cloruro de sodio.

Las disoluciones, suspensiones o emulsiones para administración pulmonar también pueden contener uno o más agentes de tonicidad para ajustar el intervalo isotónico de la formulación. En la técnica se conocen bien agentes de tonicidad adecuados y algunos ejemplos incluyen glicerina, manitol, sorbitol, cloruro de sodio y otros electrolitos. Disoluciones que son isotónicas, es decir, una cantidad equivalente al 0,9 % de NaCl, son ideales para la comodidad y deben usarse cuando sea posible. Hay momentos en que son necesarias disoluciones hipertónicas terapéuticamente, o cuando la adición de un agente auxiliar requerido por motivos de estabilidad reemplaza la necesidad de isotonicidad. Una disolución hipotónica requerirá la adición de una sustancia (agente de ajuste de la tonicidad) para alcanzar el intervalo de tonicidad apropiado.

En algunos casos, la formulación se distribuye o se envasa en forma líquida. Alternativamente, las formulaciones para administración pueden envasarse como un sólido, obtenido, por ejemplo, mediante liofilización de una formulación líquida adecuada. El sólido puede reconstituirse con un portador o diluyente apropiado antes de la administración.

Las disoluciones, suspensiones o emulsiones para administración pulmonar también pueden contener uno o más conservantes para prevenir la contaminación bacteriana. En la técnica se conocen conservantes adecuados, e incluyen polihexametilenbiguanidina (PHMB), cloruro de benzalconio (BAK), complejos de oxicloro estabilizados (conocidos de otra forma como PURITE®), acetato fenilmercúrico, clorobutanol, ácido sórbico, clorhexidina, alcohol bencílico, parabenos, timerosal, y mezclas de los mismos.

Las disoluciones, suspensiones o emulsiones para administración pulmonar también pueden contener uno o más excipientes conocidos en la técnica, tales como agentes dispersantes, agentes humectantes y agentes de suspensión.

En las realizaciones preferidas, las formulaciones de D-HAF para administración pulmonar no contienen ningún aditivo y se envasan en forma estéril.

Pueden suministrarse formulaciones de D-HAF que contienen factores amnióticos como una disolución transparente de una parte en un recipiente adecuado para almacenamiento a 4 °C, o para almacenamiento a -20 °C, o a -80 °C. Por ejemplo, formulaciones líquidas en alícuotas precargadas pueden ser adecuadas para almacenamiento a 1-5 °C, o para almacenamiento a -20 °C, o a -80 °C. La formulación líquida puede ser adecuada para aplicación tópica a las superficies de los pulmones. En otras realizaciones, el líquido puede suministrarse como un kit que puede almacenarse a 4 °C, a -20 °C, o a -80 °C hasta que sea necesario.

D. Kits

En algunas realizaciones, las composiciones se proporcionan en un kit. Normalmente, la composición de D-HAF estará en una sola unidad de dosis, por ejemplo, en una ampolla lista para su uso con nebulizadores. La composición de D-HAF está en una sola unidad de dosis de entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 10,0 ml. En algunas realizaciones, la composición de D-HAF está en una sola unidad de dosis de aproximadamente 0,1 ml aproximadamente 0,2 ml, aproximadamente 0,3 ml, aproximadamente 0,4 ml, aproximadamente 0,5 ml aproximadamente 1,0 ml, aproximadamente 2,0 ml, aproximadamente 3,0 ml, aproximadamente 4,0 ml aproximadamente 5,0 ml, aproximadamente 6,0 ml, aproximadamente 7,0 ml, aproximadamente 8,0 ml aproximadamente 9,0 ml o aproximadamente 10,0 ml.

En algunas realizaciones, el kit incluye un primer componente que contiene líquido para rehidratar los componentes secos en un segundo componente. Por ejemplo, el primer componente es agua, o solución salina; y el segundo componente es la formulación de D-HAF liofilizada.

En realizaciones preferidas, el kit incluye instrucciones para instruir a los pacientes o profesionales sobre cómo debe usarse la dosis junto con un nebulizador, tal como la forma de abrirlo y transferir su contenido al nebulizador, cómo hacer funcionar el nebulizador y durante cuánto tiempo debe continuarse la nebulización para completar la administración de la dosis.

111. Métodos de fabricación

Se proporcionan métodos de preparación de las formulaciones de líquido amniótico humano descelularizado (D-HAF) estéril. DHAF contiene más de 300 tipos de factores de crecimiento humanos. D-HAF carece de células madre amnióticas y elementos de membrana micronizada o partículas de corion. El líquido purificado se esteriliza sin el uso de irradiación terminal severa, haz de electrones u óxido de etileno (EO). En la realización preferida, el proceso consiste en separar las células del AF usando centrifugación y utilizando una serie de dispositivos de filtración para eliminar todas las células restantes y la carga biológica. Cada lote se somete a prueba para determinar la carga biológica y se certifica la esterilidad al contener <1 organismos nocivos. Estas etapas son generalmente aplicables para purificar líquido amniótico de otros animales mamíferos, por ejemplo, perros, gatos, caballos, ovejas, cerdos y búfalos.

A. Preparación

En algunas realizaciones, la formulación se prepara a partir de líquido amniótico humano estéril obtenido de una mujer embarazada. La formulación está libre de materia particulada de la membrana amniótica, es decir, se eliminan células, partículas grandes y otros productos disolvibles, preferiblemente por centrifugación a alta velocidad para obtener líquido amniótico clarificado. El líquido amniótico clarificado se filtra entonces a través de filtros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 10 |im para obtener un filtrado micrométrico, seguido de filtración del filtrado micrométrico a través de filtros con un tamaño de poro de aproximadamente 1,0 |im para obtener un segundo filtrado, seguido de filtración del filtrado a través de filtros submicrométricos con un tamaño de poro de 0,45 |im o/y 0,2 |im para obtener el líquido amniótico filtrado de manera estéril.

Los expertos en la técnica están familiarizados con métodos para obtener muestras de AF de manera segura y humana, y de la necesidad de mantener la esterilidad del AF durante tales procedimientos. Las fuentes adecuadas, por ejemplo de AF humano, incluyen AF que se obtiene de pacientes que se someten a amniocentesis, pacientes que se someten a un parto por cesárea y pacientes que experimentan parto normal usando un receptáculo especialmente diseñado para recoger el líquido después de la rotura de las membranas.

En una realización, el procedimiento de recogida se realiza en un entorno de quirófano estéril durante una cesárea de elección. Normalmente, la mujer se somete a un método quirúrgico previo a la cesárea, y la etapa de obtener el líquido amniótico humano estéril incluye las etapas de encender un dispositivo de ultrasonidos para proporcionar orientación para el proceso de obtener líquido humano de la mujer, insertar una aguja de punta roma en el saco amniótico de la mujer, unir la aguja de punta roma a una llave de paso de tres vías, conectar una jeringa Luer lock a la llave de paso de tres vías, conectar un primer extremo de una longitud de tubo estéril con la llave de paso de tres vías y recoger de manera estéril el líquido amniótico a través de la aguja de punta roma y el tubo estéril en un recipiente de recogida.

En esta realización, el recipiente de recogida estéril incluye una bomba con un dispositivo de succión. El dispositivo de succión es un dispositivo de baja succión o un dispositivo de baja succión baja cargado por resorte. El dispositivo de succión está conectado de manera fluida a un globo interno. Esta realización incluye además bombear manualmente el globo interno en el recipiente de recolección estéril usando el dispositivo de baja succión para permitir una succión de bajo nivel y la recogida del líquido amniótico.

En una realización, el AF recogido se almacena y se envía a 2-8 °C. Los envíos se hacen durante la noche en cajas enfriadoras aisladas con paquetes de hielo.

En una realización, el procesamiento se realiza en condiciones estériles, en una campana de flujo laminar de clase 100 en una sala limpia. Se separa la mayor cantidad de AF posible de cualquier residuo sólido. El AF se transfiere a recipientes de 500 - 2.000 ml estériles (el tamaño depende del volumen inicial). El procesamiento se realiza a menos de 25 °C durante el proceso.

En algunas realizaciones, la etapa de eliminar células, partículas grandes y otros sólidos del líquido amniótico humano incluye una primera etapa de centrifugación o filtración en profundidad del líquido amniótico humano. En algunas realizaciones, el líquido amniótico humano se centrifuga a de aproximadamente 5.000 rpm a aproximadamente 10.000 rpm durante de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 minutos. Se usan bombas peristálticas para transferir el AF a botellas de centrífuga limpias y estériles de 250 ml sin llenar en exceso las botellas. El peso de cada botella no debe variar más de 2,0 gramos cuando se colocan en el rotor. Usar los manguitos de rotor estériles sobre las botellas para mantenerlos limpios. Centrifugar las botellas a 10.000 rpm durante 60 minutos en la centrífuga refrigerada Sorvall. Decantar o bombear delicadamente el sobrenadante a un recipiente estéril y guardar el material de sedimento. Se usa una segunda centrifugación opcional cuando el AF no está libre de residuos después de la centrifugación inicial. En una realización, el sobrenadante de AF de la primera centrifugación se transfiere a tubos de centrífuga estériles de 50 ml que se centrifugan a 5.000 rpm durante 60 minutos. El sobrenadante de AF se decanta en un recipiente estéril y se guarda cualquier volumen de sedimento significativo.

En algunas realizaciones, el sobrenadante de AF se somete posteriormente a una serie de etapas de filtración. En una realización, se usan filtros de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 10 |im para la primera filtración (prefiltración) y son filtros de éster de celulosa, filtros de fibra de vidrio, filtros de cápsulas de nailon o filtros de cartuchos de nailon. En algunas realizaciones, se usan múltiples prefiltros, dependiendo de la claridad de la disolución filtrada. Los filtros con el tamaño de poro de 1,0 |im (filtración 1,0u) son filtros de cápsula o filtros de cartucho. Los filtros con el tamaño de poro de 1,0 |im son filtros de membrana de poliéter sulfona, poli(fluoruro de vinilideno) o acetato de celulosa. La filtración final se lleva a cabo usando filtros con un tamaño de poro de 0,45 |im o 0,2 |im que son normalmente filtros de cápsula o filtros de cartucho. Algunos filtros a modo de ejemplo con el tamaño de poro de 0,45 |im o 0,2 |im son filtros de membrana de poliéter sulfona, filtros de membrana de poli(fluoruro de vinilideno) o acetato de celulosa.

En algunas realizaciones, el líquido amniótico humano filtrado de manera estéril contiene factores de crecimiento que incluyen hormona del crecimiento humana, factor de crecimiento transformante beta 1, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante beta 3 y factor de diferenciación del crecimiento 11 o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el líquido amniótico estéril incluye además la etapa de llenado y envasado. Por ejemplo, D-HAF estéril se llena en jeringas listas para la aplicación. Cada dosis debe pesar 0,90 -1,10 gramos. Si es necesario, recalibrar la configuración de la bomba. Se inicia la operación de llenado usando los nidos de 100 jeringas de 1 ml Schott TopPac. Se purga el aire 3X del sistema de taponamiento Impro. Taponar cada nido inmediatamente después del llenado usando el sistema de taponamiento a vacío Impro conectado a 0,2 |im de aire filtrado. Realizar asépticamente al menos (3) recuentos de partículas y controles de medios abiertos en el transcurso de la ejecución.

Las jeringas llenas pueden taparse con un émbolo estéril. Colocar la jeringa en una bolsa preetiquetada Mylar de Mangar con el vástago del émbolo hacia el lado de cheurón de la bolsa. Sellar la bolsa con un termosellador ajustado a 270 °F, 2,4 segundos de permanencia, temperatura de enfriamiento de 170 °F. Inspeccionar visualmente los sellos después del sellado. Obsérvese que la jeringa intacta constituye la barrera estéril primaria del producto de AF. En otra realización, el líquido AF se llena en viales estériles de 2 ml con tapones y tapas de engarce de 13 mm como barrera.

En algunas realizaciones, el líquido amniótico estéril incluye además la etapa de liofilizar el líquido amniótico estéril para obtener un liofilizado del mismo. El método incluye además irradiar el liofilizado por irradiación de haz de electrones o irradiación de rayos gamma para reforzar la esterilidad.

En algunas realizaciones, el líquido amniótico de la filtración final se transfiere asépticamente a jeringas o viales, y se mantiene en un congelador profundo a de aproximadamente -80 °C a aproximadamente -20 °C para almacenamiento a largo plazo. El líquido amniótico estéril se seca en el vial mediante liofilización en un entorno estéril incorporado. El liofilizado derivado del líquido amniótico se reconstituye con agua estéril antes de la inyección o administración tópica. El liofilizado puede almacenarse a de 4 °C a aproximadamente 25 °C (temperatura ambiente).

En algunas realizaciones, el liofilizado derivado del líquido amniótico a través de liofilización puede irradiarse mediante irradiación de haz de electrones o irradiación de rayos gamma para agregar otra garantía para la esterilidad final del polvo. La irradiación de un liofilizado es mucho menos desnaturalizante para proteínas y péptidos que irradiar disoluciones acuosas, debido a que la ausencia de agua reduce considerablemente la producción de aniones superóxido reactivos y su difusión durante la irradiación. Tales aniones superóxido son la principal causa de la división de enlaces peptídicos y la modificación química de aminoácidos de proteínas y péptidos. Después de la liofilización, el líquido amniótico se reconstituye añadiendo el volumen inicial de agua. Después de una homogeneización suave, el polvo se disuelve rápidamente en aproximadamente un minuto.

El líquido amniótico reconstituido es transparente y puede usarse para la cicatrización de heridas, aplicaciones cosméticas, ortopédicas, oftalmológicas o pulmonares en particular para pacientes con asma y EPOC.

En algunas realizaciones, las herramientas para obtener líquido amniótico humano filtrado de manera estéril de una mujer incluyen una llave de paso de tres vías, una aguja de punta roma estéril unida asépticamente a la llave de paso de tres vías, una jeringa Luer lock conectada asépticamente a la llave de paso de tres vías, un tubo estéril conectado asépticamente a la llave de paso de tres vías, un recipiente de recogida o un recipiente de recogida que incluye una bomba con dispositivo de succión conectado con el tubo estéril, un conjunto de filtros que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 10 |im, un conjunto de filtros de cápsula o cartucho que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 1 |im, un conjunto de filtros de cápsula o cartucho que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 0,45 |im o 0,2 |im, un conjunto de jeringas o viales estériles para almacenar el líquido amniótico filtrado estéril e instrucciones de funcionamiento sobre el uso del kit para obtener líquido amniótico humano filtrado de manera estéril. Los filtros que tienen el tamaño de poro de aproximadamente 5 |im a aproximadamente 10 |im y los filtros de cápsula o cartucho están hechos de éster de celulosa, fibra de vidrio o nailon.

El recipiente de recogida estéril puede incluir una bomba con un dispositivo de succión. En un aspecto de esta realización, el dispositivo de succión puede ser un dispositivo de baja succión o un dispositivo de baja succión cargado por resorte. En otro aspecto, el dispositivo de succión puede estar conectado de manera fluida a un globo interno. Además de este aspecto, el método incluye bombear manualmente el globo interno en el recipiente de recogida estéril usando el dispositivo de baja succión para permitir una succión de bajo nivel y la recogida del líquido amniótico. En otro aspecto más, el recipiente de recogida estéril puede incluir una entrada. Además de este aspecto particular, el método incluye conectar un segundo extremo del tubo a la entrada del recipiente de recogida estéril. El recipiente de recogida estéril puede incluir un orificio de ventilación que tiene una tapa.

En algunas realizaciones, utilizar el sitio de incisión inmediatamente antes de realizar la cesárea y con guía de ultrasonidos para proteger al feto y a la madre proporciona un entorno de riesgo mínimo o nulo para la recogida. La recogida se logra por medio de una succión de bajo nivel establecida dentro de un recipiente de recogida y/o por medio de la gravedad. Normalmente, se usa filtración por centrifugación a alta velocidad con filtros de 5 a 10 |im (filtro de baja unión a proteínas) para completar la eliminación de células y partículas grandes. Entonces se realizaría filtración submicrométrica con filtros de 1 |im y 0,45 |im o/y 0,2 |im (filtro de baja unión a proteínas), dos en una conexión en serie, para eliminar los contaminantes macroscópicos. En esta condición, los factores de crecimiento solubles pasarán a través de este filtro para lograr una condición semiestéril, recuentos de carga biológica muy bajos. Si está bajo una condición de operación aséptica estricta, se logra un nivel de garantía de esterilidad de 10-3 Puede lograrse un nivel de garantía de esterilidad de 10-6 mediante filtración submicrométrica con un filtro de 0,22 |im (filtro de baja unión a proteínas) en el extremo y envasado estéril para lograr un producto estéril. Se monitorizaría el filtrado después de cada etapa de filtración para determinar qué componentes se eliminaron y luego determinar qué proceso usar para lograr el producto deseable.

Pueden usarse filtros de membrana que incluyen o están hechos de polietersulfona hidrófila (PES) para filtrar disoluciones de proteínas. Discos de filtro para pequeños volúmenes y diferentes tamaños de cartuchos para volúmenes más grandes tales como 1 litro y más. No deben usarse membranas hidrófobas como PTFE que están diseñadas para líquidos desprovistos de proteínas. Se comienza con centrifugación a de 5000 a 8000 rpm durante al menos 30 minutos. A continuación, el sobrenadante se filtra con un prefiltro para eliminar precipitados y agregados proteicos residuales en suspensión (puede usarse AP20). Si se usa directamente un filtro de 0,6/0,2 |im, después de la prefiltración, pueden experimentarse tasas de filtración lentas y el flujo puede detenerse demasiado rápido. Puede ser deseable realizar etapas de filtración intermedias usando membranas de 1,2 |im y 0,8 |im. En una realización, es necesaria una filtración final a través de 0,2 |im para obtener el mejor nivel de garantía de esterilidad y producir un líquido amniótico estéril para inyecciones.

B. Almacenamiento

El filtrado final puede almacenarse en condiciones congeladas de aproximadamente -20 °C a aproximadamente -80 °C para el almacenamiento a largo plazo. Además, el líquido amniótico filtrado de manera estéril puede distribuirse en viales equipados con tapones de caucho especiales para liofilización estéril.

La liofilización se lleva a cabo en un entorno estéril. Los tapones de caucho en los viales se empujan entonces automáticamente hacia abajo en el liofilizador para cerrarlos definitivamente. Luego se sella una tapa de aluminio sobre cada vial para proteger su contenido estéril. En un estado liofilizado de este tipo, el líquido amniótico puede almacenarse a 4 °C o temperatura ambiente durante al menos un año sin disminución de su actividad biológica. Para su uso médico, el líquido amniótico estéril puede reconstituirse añadiendo el volumen inicial de agua estéril al polvo con el fin de restaurar un líquido fisiológico transparente y homogéneo.

El proceso de descelularización y purificación protege los factores de crecimiento y otros componentes biológicos del líquido amniótico de la degradación química y enzimática. Las moléculas contenidas dentro del líquido se estabilizan contra la degradación, evitando la necesidad de modificación química o física para mantener la actividad biológica de las moléculas a lo largo de períodos de tiempo prolongados. Por lo tanto, el D-HAF preparado según los métodos puede almacenarse durante largos períodos de tiempo, permitiendo una amplia gama de métodos de aplicación, incluyendo distribución y almacenamiento como aerosoles, disoluciones, polvos, etc.

En algunas realizaciones, el D-HAF estéril se refrigera a de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 10 °C para almacenamiento a largo plazo. En una realización adicional, el D-HAF estéril se refrigera a 4 °C durante hasta 12 meses y más. Por ejemplo, los líquidos purificados según los métodos descritos retienen las propiedades biológicas de las moléculas componentes a lo largo de periodos prolongados de almacenamiento, idealmente sin la necesidad de congelación/descongelación.

Preferiblemente, el almacenamiento a largo plazo no reduce la cantidad de proteínas o factores solubles totales presentes en el D-HAF. Para algunas realizaciones, las proteínas solubles totales retenidas después del almacenamiento a largo plazo en condiciones refrigeradas son de aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % del D-HAF fresco.

Las cantidades de proteína que permanecen solubles en el D-HAF después de un período de almacenamiento se evalúan mediante métodos comunes de cuantificación de proteínas tales como el ensayo de ácido bicinconínico (BCA), ensayo de Bradford, ensayo de Lowry y absorción ultravioleta (a 280 nm). Para cuantificar proteínas individuales, métodos de alto rendimiento tales como matrices de cribado de alta densidad (RayBiotech, Norcross GA).

El almacenamiento no reduce, impide ni altera de otro modo la actividad biológica de uno cualquiera o más de los factores amnióticos del DHAF. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la actividad biológica de uno o más factores amnióticos se retiene a lo largo de todo el almacenamiento durante períodos de tiempo prolongados. La actividad de uno cualquiera o más de los factores de crecimiento amnióticos del producto almacenado puede evaluarse como un % en comparación con la del producto fresco (sin procesar), o en comparación con el D-HAF antes del almacenamiento. Por lo tanto, en algunas realizaciones, se observan pocos o ningún cambio estadísticamente significativo en la actividad biológica de los factores amnióticos cuando se usa D-HAF almacenado a 4 °C durante hasta un día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, hasta una semana, hasta 2 semanas, hasta 3 semanas, hasta 4 semanas, hasta un mes, hasta 2 meses, hasta 3 meses, hasta 4 meses, hasta 5 meses, hasta 6 meses o más de 6 meses. En otras realizaciones, la actividad de una cualquiera de las proteínas en el líquido amniótico se reduce en un 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, o menos del 5 % en relación con el líquido amniótico sin procesar antes del proceso de descelularización.

En algunas realizaciones, uno o más de los factores de crecimiento se reducen después del almacenamiento. Por ejemplo, tales factores de crecimiento incluyen FGF7, MMP-9, GCSF, MMP-7, MMP-13, TGF-p, FGF-4, EG-VEGF e iL-8. En otras realizaciones, uno o más de los factores de crecimiento se reducen después de la congelación/descongelación. Por ejemplo, tales factores de crecimiento incluyen FGF-21, ANG2, GDNF, FGF-19, TIMP-2, ANG-1, TGFp1 y M-CSF. En una realización preferida, uno o más de los factores de crecimiento están aumentados en comparación con el D-HAF fresco, presumiblemente debido a la estabilidad mejorada en estas condiciones de almacenamiento. Algunos factores de crecimiento a modo de ejemplo incluyen VEGF-a , TNF-a y HGF. En una realización adicional, cambios variables en los factores de crecimiento tales como angiotensinógeno, PDGF-AA, TGF-a , EGF y SCF.

En algunas realizaciones, los marcadores inflamatorios disminuyen después de la refrigeración a 2-8 °C durante una, dos, tres o cuatro semanas. Por ejemplo, la cantidad de una o más de las proteínas inflamatorias presentes en la muestra refrigerada se reduce en aproximadamente un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 % u 80 % en comparación con el producto fresco (sin procesar). Algunos marcadores inflamatorios a modo de ejemplo incluyen eotaxina-2, IL-6, CCL18, GRO total, CXCL5, 6Ccina y MIP-3a .

En algunas realizaciones, las proteínas inflamatorias disminuyen después de la congelación. Por ejemplo, la cantidad de una o más de las proteínas inflamatorias presentes en la muestra almacenada en condición congelada a de aproximadamente -20 °C a aproximadamente -80 °C se reduce en aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 80 % o 90 % en comparación con el producto fresco (sin procesar). Algunos marcadores inflamatorios a modo de ejemplo incluyen IL-1a , CXCL9, MIP-1a y CCL5.

En otras realizaciones, los marcadores inflamatorios aumentan después de almacenarse a largo plazo en condiciones refrigeradas o congeladas. Algunos marcadores inflamatorios a modo de ejemplo incluyen TNF-a , MIP-1 p y MCP-2.

En una realización preferida, las moléculas antiinflamatorias no disminuyen significativamente después de almacenarse refrigeradas o congeladas durante uno o más días, semanas o meses. En otra realización, una o más de las moléculas antiinflamatorias disminuyen en D-HAF después de un período de refrigeración. Algunas moléculas antiinflamatorias a modo de ejemplo incluyen IL-8, IL-13, IL-27, CTLA-4 e IL-21. En otra realización, una o más de las moléculas antiinflamatorias disminuyen en el D-HAF almacenado en condiciones congeladas. Algunas moléculas antiinflamatorias a modo de ejemplo incluyen IL-1Ra y TGFp1. En algunas realizaciones, la cantidad de una o más de las proteínas antiinflamatorias presentes en la muestra después de la refrigeración a 2-8 °C, o después de almacenarse en condición congelada a de aproximadamente -20 °C a aproximadamente -80 °C, retiene más del 95 %, aproximadamente un 95 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 % o 40 % en comparación con el producto fresco (sin procesar).

IV. Métodos de uso

Las formulaciones de líquido amniótico pueden administrarse solas o en cualquier portador farmacéutico apropiado, tal como un líquido, por ejemplo, agua, y solución salina, o un polvo, para su administración al sistema respiratorio. Las formulaciones pueden administrarse mediante cualquier método y/o dispositivo que se use actualmente para la administración pulmonar. Por ejemplo, pueden usarse nebulizadores, aerosoles e inhaladores.

Pueden seleccionarse una dosificación, formulaciones y sistemas de administración de aerosol para una aplicación terapéutica particular, como se describe, por ejemplo, en Gonda, I. “Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract”, en Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990), y en Moren, “Aerosol dosage forms and formulations”, en Aerosols in Medicine. Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, et al., Eds., Esevier, Ámsterdam, 1985.

A. Métodos de tratamiento

Las formulaciones de líquido amniótico se proporcionan como un medicamento para mejorar la tolerancia al ejercicio, mejorar el tiempo de resistencia, reducir la intensidad de la molestia respiratoria y/o aumentar la capacidad de ejercicio en pacientes con cualquier trastorno pulmonar. En algunas realizaciones, la formulación es eficaz para estimular la regeneración tisular y la reparación tisular.

En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico, generalmente con un portador farmacéutico, son para uso como medicamento para un tratamiento para mejorar la tolerancia al ejercicio y/o el tiempo de resistencia en pacientes con trastornos pulmonares. En consecuencia, en un aspecto, las formulaciones de líquido amniótico se proporcionan como un medicamento para mejorar la tolerancia al ejercicio en un paciente con EPOC o asma que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de formulaciones de D-HAF. En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico se proporcionan como un medicamento para reducir la intensidad de la molestia respiratoria en un paciente con EPOC o asma mientras hace ejercicio que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de formulaciones de D-HAF.

En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico, generalmente con un portador farmacéutico, son para uso como medicamento para un tratamiento para mejorar las funciones pulmonares. Por ejemplo, la mejora en las funciones pulmonares puede medirse mediante pruebas de espirometría que proporcionan puntuaciones tales como capacidad vital (VC), capacidad vital forzada (FVC), volumen espiratorio forzado (FEV) a intervalos cronometrados de 0,5, 1,0 (FEV1), 2,0 y 3,0 segundos, flujo espiratorio forzado 25-75 % (FEF 25-75) y ventilación voluntaria máxima (MVV), y/o PEF (flujo espiratorio máximo). Generalmente, la mejora en las funciones pulmonares se observa en el plazo de días, semanas o meses después del tratamiento inicial, y FEV1 y/o PEF mejoran en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 % o más del 300 %.

En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico dan como resultado un aumento en la duración del ejercicio. Por ejemplo, si un paciente podía realizar ejercicios durante un máximo de 5 minutos antes del tratamiento con D-HAF, el tratamiento con las formulaciones puede ayudar a prolongar ese intervalo hasta aproximadamente 6 min, 7 min, 8 min o más de 8 min. Generalmente, la mejora en la tolerancia al ejercicio se observa en el plazo de días, semanas o meses después del tratamiento inicial, y la duración del ejercicio se prolonga hasta el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de 500 %.

Las formulaciones de líquido amniótico se proporcionan como un medicamento para mejorar la saturación de oxígeno en sangre basal, y/o reducir la inflamación local en el pulmón de pacientes con cualquier trastorno pulmonar.

En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico dan como resultado un aumento en la saturación de oxígeno en sangre basal en un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más del 50 % en ausencia de cualquier terapia con oxígeno externo.

En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico dan como resultado una reducción de la inflamación en los pulmones. Estos pueden medirse mediante marcadores de inflamación sistémicos tales como medir los niveles plasmáticos de proteína C reactiva (CRP), receptor del factor de necrosis tumoral soluble (sTNFR)-1, osteoprotegrina, péptido 2 activador de neutrófilos, CXCL16 y proteína quimioatrayente de monocitos-4. Alternativamente, se mide mediante una exploración pulmonar de ventilación/perfusión (una exploración pulmonar V/Q).

1. Trastornos y enfermedades que van a tratarse

Las formulaciones pueden usarse para diversos trastornos pulmonares, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos pulmonares obstructivos y trastornos pulmonares restrictivos. En algunas realizaciones, las formulaciones son eficaces en la mejora de la resistencia al ejercicio, el aumento de la saturación de oxígeno en sangre basal y/o la reducción de la inflamación en los pulmones de pacientes con cualquier trastorno pulmonar obstructivo y trastorno pulmonar restrictivo. En algunas realizaciones, las formulaciones son eficaces para ayudar a los pacientes a ser menos dependientes del uso de otro tratamiento suplementario tal como broncodilatadores y/o terapia con oxígeno. En algunas realizaciones, las formulaciones son eficaces en la prevención o el retraso de la aparición de uno o más síntomas en el pulmón de un sujeto que tiene pulmones sanos pero corre el riesgo de desarrollar enfermedad pulmonar, por ejemplo, debido a riesgos ocupacionales y/o ambientales, enfermedades autoinmunitarias y/o predisposición genética.

Las formulaciones son particularmente adecuadas para el tratamiento de la EPOC y el asma, incluyendo, pero sin limitarse a, bronquitis, bronquitis crónica, enfisema y cardiopatía pulmonar asociada (cardiopatía secundaria a enfermedad de los pulmones y el sistema respiratorio) con hipertensión pulmonar, hipertrofia ventricular derecha e insuficiencia cardíaca derecha, asma bronquial, asma alérgica y asma intrínseca, por ejemplo, asma tardía e hiperreactividad de las vías respiratorias.

Otros ejemplos no limitativos incluyen bronquiectasia, enfermedad pulmonar intersticial y enfisema por alfa-1 antitripsina.

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una enfermedad rápidamente progresiva que se produce en pacientes críticos. La principal complicación en el SDRA es que se escapa líquido a los pulmones haciendo que la respiración sea difícil o imposible. El SDRA puede diagnosticarse inicialmente como neumonía o edema pulmonar (fluido en los pulmones por enfermedad cardíaca). Los pacientes con SDRA tienen dificultad para respirar, a menudo grave. También tienen tos y muchos tienen fiebre. Aquellos con SDRA también tienen frecuencias cardíacas rápidas y respiración rápida. Ocasionalmente, experimentan dolor torácico, especialmente durante la inhalación. Algunos pacientes que tienen niveles de oxígeno muy bajos pueden tener coloración azulada de uñas y labios por los niveles de oxígeno gravemente disminuidos en la sangre. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

El síndrome de la unidad de cuidados intensivos (UCI), o psicosis de la UCI, se produce en pacientes que se vuelven psicóticos en unidades de cuidados intensivos, con causas subyacentes tales como ansiedad, privación de sueño, privación sensorial y sobrecarga, inmovilización, un entorno desconocido y dolor . Por lo tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas pulmonares asociados con el síndrome de la unidad de cuidados intensivos (UCI).

El síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), síndrome séptico, síndrome séptico grave, choque séptico, y síndrome de disfunción multiorgánica (SDMO) son factores de riesgo comunes para el desarrollo de lesiones pulmonares agudas en pacientes. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas en el pulmón asociados con el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), síndrome séptico, síndrome séptico grave, choque séptico o síndrome de disfunción multiorgánica (SDMO).

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad hereditaria que hace que se forme mucosidad espesa en los pulmones, páncreas y otros órganos. En los pulmones, esta mucosidad bloquea las vías respiratorias, provocando daño pulmonar y dificultando la respiración. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas en el pulmón asociados con fibrosis quística.

La neumonía es una infección pulmonar común provocada por bacterias, un virus, hongos o productos químicos. Es comúnmente una complicación de una infección respiratoria, especialmente la gripe, pero hay más de 30 causas diferentes de la enfermedad. Adultos mayores, niños y personas con enfermedad crónica, incluyendo EPOC y asma, corren un alto riesgo de neumonía. Los síntomas de la neumonía pueden variar de leves a graves, dependiendo del tipo de neumonía que se tenga, la edad y la salud. Los síntomas más comunes de neumonía son tos (con algunas neumonías puede toserse mucosidad verdosa o amarilla, o incluso mucosidad sanguinolenta), fiebre, que puede ser leve o alta, escalofríos, dificultad para respirar, que puede producirse solo cuando se suben escaleras. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas en el pulmón asociados con neumonía.

La sarcoidosis es una enfermedad que hace que el sistema inmunitario reaccione en exceso, lo que puede conducir a problemas de salud. Puede provocar daño pulmonar, erupciones cutáneas y enfermedad ocular y puede afectar a otros órganos del cuerpo. Muchos pacientes con sarcoidosis experimentan problemas pulmonares, que pueden incluir tos seca persistente, dificultad para respirar, sibilancias y/o dolor torácico. En algunas realizaciones, las formulaciones y los métodos de uso de las mismas son adecuados para gestionar síntomas asociados a la sarcoidosis en pacientes.

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es un trastorno pulmonar crónico caracterizado por engrosamiento, rigidez y cicatrización (fibrosis) del tejido dentro de los pulmones. Los individuos afectados desarrollan dificultad para respirar y enfermedad pulmonar progresiva. En última instancia, la FPI da como resultado complicaciones potencialmente mortales tales como insuficiencia respiratoria. En algunas realizaciones, las formulaciones y los métodos de uso de las mismas son adecuados para gestionar la fibrosis pulmonar idiopática en pacientes. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con la fibrosis pulmonar idiopática. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para reducir o prevenir la cicatrización pulmonar en pacientes con FPI.

i. Lesión por inhalación aguda

Las formulaciones son adecuadas para el tratamiento de lesiones por inhalación agudas. Sustancias inhaladas pueden provocar lesiones en el epitelio pulmonar a diversos niveles de las vías respiratorias, conduciendo a desde síntomas simples hasta enfermedad grave. Se ha notificado que irritantes químicos, asfixiantes, metales tóxicos, productos de incendios y combustión, y muchas otras sustancias, provocan lesiones por inhalación agudas (Gorguner M et al., J Med. 42(1): 28-35(2010)). Algunos casos de lesión por inhalación aguda pueden implicar más de una sustancia o mecanismo. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una lesión por inhalación aguda.

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para personas que corren un mayor riesgo de exposición a agentes tóxicos como medida profiláctica. Algunos individuos de alto riesgo a modo de ejemplo son agricultores que trabajan cerca de silos, bomberos, mineros de carbón después del disparo de explosivos, soldadores que trabajan con sopletes de acetileno en espacios confinados, personal militar, trabajadores de pistas de hockey y trabajadores químicos que pueden estar expuestos a humos de subproductos en la fabricación de colorantes y lacas constituyen algunas de las ocupaciones de riesgo. Por ejemplo, las formulaciones son adecuadas para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas de la neumoconiosis de los trabajadores del carbón.

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para granjeros que corren el riesgo de exponerse a polvo, materiales particulados, por ejemplo, de la cosecha de heno, cultivos, pesticidas, herbicidas, defoliantes y fungicidas tales como óxido de metilo. Otros posibles agentes tóxicos incluyen gas de maduración de frutas tal como etileno, dióxido de carbono que inhibe el crecimiento de microorganismos, nitrógeno como carga inerte y mezclas de gases para preservar la apariencia fresca de las frutas, verduras y carnes, por ejemplo, 1-metilciclopropeno.

Algunos agentes químicos adicionales que pueden provocar lesiones pulmonares incluyen defoliante, ecocida, agente de hostigamiento, herbicida, pesticida, agente nervioso y agentes antipersonales. Por ejemplo, el agente naranja usado durante la guerra de Vietnam es una combinación de dos herbicidas conocidos como 2,4-D y 2,4,5-T. Otros dos herbicidas, picloram y ácido cacodílico, también se usaron, pero en cantidades mucho más pequeñas. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar y/o aliviar uno o más síntomas en sujetos con lesiones pulmonares a largo plazo debido a la exposición a agentes tales como el agente naranja.

La inhalación de varios gases, neblinas, aerosoles, humos o polvos puede provocar lesión pulmonar irritante, asfixia u otros efectos sistémicos. El uso de productos químicos industriales con posible toxicidad ha aumentado. Derrames accidentales, explosiones e incendios pueden dar como resultado exposiciones complejas a tales sustancias. Según el National Exposure Survey (NOES 1981-1983), se estima que más de un millón de trabajadores en los EE. UU. corren el riesgo de exposición a irritantes respiratorios anualmente; sin embargo, los datos de los centros de toxicología sugieren que se producen lesiones por inhalación con más frecuencia en el entorno doméstico que en el lugar de trabajo. El número de personas afectadas varía dependiendo del entorno y puede ser tan alto como decenas de millones en caso de que la contaminación del aire alcance niveles peligrosos, por ejemplo, debido al agotamiento del ozono.

La manipulación de productos químicos, el trabajo en áreas ventiladas inadecuadamente o la entrada en áreas de exposición con equipos de protección inadecuados o ausentes son generalmente los motivos de las lesiones ocupacionales (White SR et al., Emergency medicine: a comprehensive study guide. 6a ed. Nueva York: The Mc Graw Hill Companies, Inc., 2004). En el entorno general, pueden producirse exposiciones aleatorias, tales como mezclar productos químicos domésticos por error, por ejemplo, mezcla de lejía y ácido clorhídrico, o una fuga de gas en el hogar, por ejemplo, monóxido de carbono, o humo que contiene productos químicos irritantes, por ejemplo, productos de pirólisis hechos de materiales sintéticos cuando se usan durante un incendio doméstico. Se usan productos químicos en la fabricación de espuma de poliuretano, molduras, aislamiento, caucho sintético y materiales de embalaje y pueden inducir lesiones de células pulmonares cuando se inhalan. Toxinas químicas y agentes de guerra química, tales como tabún, sarín, somán, ciclosarín, gas nervioso VX, mostaza de azufre, agente naranja, cloro, fosgeno y difosgeno, pueden provocar una enfermedad pulmonar potencialmente mortal (Kales SN et al., N Engl J Med. 19; 350(8):800-8(2004); Newman LS et al., N Engl J Med. 26; 333(17): 1128-34 (1995)).

Lesión química

Irritantes químicos en áreas ocupacionales y ambientales son generalmente la causa de toxicidad aguda por inhalación. Los irritantes químicos a modo de ejemplo incluyen cloro, cloruro de hidrógeno, amoniaco, fluoruro de hidrógeno (HF) y ácido fluorhídrico, dióxido de azufre (SO²), óxidos de nitrógeno, fosgeno, sulfuro de hidrógeno (H2S). En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una lesión por inhalación aguda provocada por irritantes químicos.

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una lesión por inhalación aguda provocada por uno o más asfixiantes. A diferencia de los irritantes químicos, el asfixiante tiene un mecanismo diferente. Sin embargo, algunos asfixiantes tales como el sulfuro de hidrógeno también pueden tener un efecto de irritación química. Basándose en sus efectos, los asfixiantes pueden dividirse en dos grupos: asfixiantes simples que actúan desplazando el oxígeno del aire inspirado, dando como resultado una fracción reducida de oxígeno inspirado y posterior hipoxemia, y asfixiantes químicos, tales como monóxido de carbono y cianuro de hidrógeno, que actúan interfiriendo con el suministro o la utilización de oxígeno. Sin embargo, cualquier gas en alta concentración puede actuar como un asfixiante. Aunque, por ejemplo, metano, etano, argón y el helio son más inocuos a bajas concentraciones, a altos niveles de exposición pueden desplazar el oxígeno o bloquear la reacción de la citocromo oxidasa o hemoglobina, alterando la respiración celular y el transporte de oxígeno.

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una lesión pulmonar provocada por agentes de control de disturbios y/o guerra química. Los agentes de control de disturbios y guerra química del pasado, especialmente durante la Primera y la Segunda Guerra Mundial, eran gases tales como agente naranja, gas mostaza, fosgeno y cloropicrina. Hoy en día, el arsenal de guerra química incluye toxinas sistémicas derivadas de plaguicidas de organofosfato. Además de ser neurotoxinas altamente letales, también tienen importantes efectos respiratorios, tales como bronquiorrea y broncoespasmo, que se producen por medio de la estimulación de receptores muscarínicos. Los agentes de control de disturbios (agentes de control de multitudes, gases lacrimógenos) tienen como objetivo incapacitar a las personas por medio de la irritación inmediata de la membrana mucosa. Cloroacetofenona y ortoclorobenzamalonitrilo son los agentes más comunes en todo el mundo. Se ha notificado que tienen efectos sobre la membrana mucosa, además de provocar lesiones respiratorias inferiores. Contrariamente a los gases lacrimógenos, el cloruro de zinc, que es el componente principal de las bombas de humo, es un potente irritante de las vías respiratorias inferiores y puede provocar edema pulmonar severo. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir el edema pulmonar.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones se usan inmediatamente después de la exposición a cualquier agente potencialmente tóxico para prevenir la aparición de cualquier lesión pulmonar, y/o aliviar la aparición inmediata de afecciones pulmonares mientras se previene uno o más síntomas secundarios. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir cualquier cicatrización de tejido pulmonar. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar a veteranos que se expusieron a gas tóxico tal como agente naranja, gas mostaza durante las guerras en la gestión de su salud pulmonar.

Quemaduras y lesiones por humo

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una lesión por inhalación aguda provocada por quemaduras y/o inhalación de humo. La exposición al calor, materia particulada y gases tóxicos se consideran la exposición al humo. Fuegos en espacios cerrados y condiciones que provocan pérdida de conocimiento a menudo son el motivo de las lesiones por inhalación. Entre el 20 % y el 30 % de las víctimas de quemaduras padecen complicaciones pulmonares, con una tasa de incidencia que se correlaciona con la gravedad de la quemadura y un historial de estar en un espacio cerrado. El daño traqueobronquial y las complicaciones pulmonares, que son comunes y una causa importante de morbimortalidad, pueden ir acompañados de infección, choque y las consecuencias de la terapia, incluyendo sobrehidratación. Las mejoras en el tratamiento del choque por quemaduras y el síndrome séptico han convertido a la lesión por inhalación en la principal causa de mortalidad en los pacientes con quemaduras (Hartzell GE, Toxicology. 115(1-3):7-23 (1996)).

La “inhalación de humo” es un término genérico que se refiere a una posible exposición a una amplia variedad de sustancias debido a la compleja química de la descomposición por calor y la pirólisis. Tanto los bomberos (tanto urbanos como forestales) como las víctimas no ocupacionales pueden estar expuestos a un número sustancial de irritantes. Las lesiones térmicas normalmente se limitan a las vías respiratorias superiores; sin embargo, las que están por debajo de las cuerdas vocales se producen solo con la inhalación de vapor. Todas las vías respiratorias pueden verse afectadas por la inhalación de humo de incendios. El humo contiene materia particulada que se forma a partir de la combustión incompleta de un material orgánico, habitualmente con un tamaño de menos de 0,5 |im. Por lo tanto, las partículas pequeñas pueden alcanzar fácilmente los bronquiolos terminales y allí pueden iniciar una reacción inflamatoria, que conduce a broncoespasmo (Ainslie G, Respir Med. 87(3): 169-74(1993)).

Metales tóxicos

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una lesión pulmonar provocada por metales tóxicos. El cadmio y el mercurio son los metales más comunes que provocan lesiones por inhalación. La soldadura, soldadura fuerte o corte de metal con llama con poca ventilación son las condiciones típicas para la exposición al cadmio normalmente, mientras que procesos de recuperación de metales con calor implican posibles riesgos de exposición al mercurio. Metales o sus compuestos tales como antimonio, manganeso, berilio, vanadio y tributilestaño rara vez provocan lesiones por inhalación a través de la inhalación de humos o vapores de ciertos metales, puede desarrollarse neumonitis aguda. La neumonitis por metales pesados se ha explicado por la inhibición de funciones enzimáticas y otras funciones celulares críticas. En tales casos, puede considerarse tratamiento de quelación (Nemery B, Eur Respir J. 3(2):202-19 (1990)).

Fiebres por inhalación

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar sujetos con fiebres por inhalación antes de cualquier lesión pulmonar confirmada para usos preventivos. La fiebre por inhalación incluye fiebre por humos de metales, fiebre de humos de polímeros y síndrome tóxico por polvo orgánico, todos los cuales comparten hallazgos clínicos y pronóstico similares. La exposición al humo de zinc y, a veces, al humo de cobre y magnesio provoca fiebre por humo de metales. La exposición a fluoropolímeros calentados y altas cantidades de endotoxina conduce a fiebre por humo de polímeros y síndrome tóxico por polvo orgánico, respectivamente, que se caracterizan por escalofríos, fiebre, malestar general y mialgia con inicio de 4 a 8 horas después de la inhalación intensa de humos o polvo. Las molestias respiratorias comunes incluyen tos o disnea leve.

Lesión por explosión

La lesión pulmonar es frecuentemente un componente del politraumatismo sostenido por personal militar que sobrevive a una explosión en el campo de batalla. Las lesiones por explosiones surgen de varias maneras. En orden temporal, estas incluyen daño tisular por la onda de choque de la explosión (lesión por explosión primaria), material propulsado a la víctima (secundaria), la víctima propulsada contra otros objetos (terciaria), calor, productos químicos y toxinas suministradas por el dispositivo (cuaternaria) y finalmente la respuesta inflamatoria sistémica provocada en el huésped (quinaria). La lesión pulmonar por explosión (LPE) letal puede mantenerse en ausencia de cualquier otro signo externo de traumatismo, torácica o de otro tipo. El diagnóstico clínico de la lesión pulmonar por explosión se basa en el contexto, los síntomas clínicos y la radiología. Los síntomas pueden incluir dificultad respiratoria, inquietud y, en algunos casos, hemoptisis, en asociación con cianosis e hipoxemia. En algunos pacientes, los síntomas pueden retrasarse significativamente. Los hallazgos típicos descritos hasta la fecha incluyen opacidades focales unilaterales o bilaterales, pérdida difusa unilateral o bilateral de translucidez pulmonar que, si es unilateral, puede estar asociada con una expansión costal reducida, y evidencia radiológica de barotrauma. Este último puede incluir neumotórax, neumomediastino, neumopericardio, enfisema quirúrgico, enfisema intersticial y hemotórax secundario a laceraciones del parénquima pulmonar.

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una afección pulmonar asociada con una lesión por explosión. En algunas realizaciones, las formulaciones se administran a cualquier persona con lesiones pulmonares relacionadas con explosiones, o cualquier persona que se sospecha que ha estado expuesta a una lesión por explosión, dentro de la “hora dorada” después del impacto. En algunas realizaciones, las formulaciones se administran a cualquier persona que sea susceptible a lesiones pulmonares relacionadas con explosiones para prevenir la aparición de cualquier síntoma, o para prevenir una o más complicaciones secundarias asociadas con el pulmón. En algunas realizaciones, las formulaciones se administran en combinación con una o más intervenciones adicionales tales como oxígeno suplementario.

Exposiciones complejas

En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con una lesión pulmonar provocada por la exposición a uno o más compuestos tóxicos. Los individuos que padecen lesiones por inhalación están expuestos frecuentemente a mezclas complejas de compuestos tóxicos, no solo un único agente. Aunque están mal caracterizadas, tales mezclas pueden contener mezclas de productos de combustión, productos de pirólisis, metales, partículas y gas. Se ha demostrado que tales mezclas tienen el potencial de producir una gama de lesiones pulmonares intersticiales difusas y de las vías respiratorias.

Las personas que se exponen accidentalmente a gases tóxicos generalmente se recuperan por completo. Sin embargo, algunas veces pueden desarrollarse complicaciones graves agudas potencialmente mortales o crónicas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones se usan para prevenir uno o más síntomas de complicaciones pulmonares secundarias/crónicas en pacientes que han tenido lesiones por inhalación agudas. En algunas realizaciones, las formulaciones se usan para tratar, aliviar uno o más síntomas de pacientes que han tenido lesiones por inhalación aguda y desarrollaron complicaciones pulmonares crónicas. Algunas complicaciones pulmonares crónicas a modo de ejemplo incluyen síndrome de enfermedad reactiva de las vías respiratorias (SERVR), bronquiolitis obliterante (BO, también conocida como bronquiolitis constrictiva), neumonía criptogénica organizada (NCO) y bronquiectasia.

2. Tratamiento de afecciones pulmonares en animales

La formulación puede administrarse a sujetos mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a, seres humanos, primates tales como monos y simios, caninos tales como perros, felinos tales como gatos, bovinos tales como vacas, equinos tales como caballos, porcinos tales como cerdos y roedores tales como ratones y ratas.

Se describen las composiciones y los métodos para gestionar o tratar una enfermedad pulmonar en equinos, preferiblemente caballos. En algunas realizaciones, los caballos que necesitan tratamiento son caballos de carreras. Las manifestaciones fenotípicas comunes de enfermedades de las vías respiratorias en caballos incluyen tos, descarga nasal, aumento del esfuerzo respiratorio y mal rendimiento o intolerancia al ejercicio. En una realización preferida, la formulación se administra a caballos de carreras en lugar de Lasix, para prevenir hemorragias durante un ejercicio extremo, tal como carreras.

En diversas enfermedades de las vías respiratorias, pueden observarse fiebre, depresión, disminución del apetito y pérdida de peso (Couetil et al., 2007 y Kutasi et al., 2011). En algunas realizaciones, las enfermedades pulmonares que necesitan tratamiento son enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias, o enfermedad reactiva de las vías respiratorias (espasmos). En algunas realizaciones, la enfermedad pulmonar que necesita tratamiento es obstrucción recurrente de las vías respiratorias (ORVR), o conocida formalmente como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En algunas realizaciones, las formulaciones se administran usando inhaladores equinos para una administración mejorada.

Se observa hemorragia pulmonar inducida por ejercicio (HPIE) en la mayoría de los caballos de carreras y en muchos otros caballos usados en deportes equinos (por ejemplo, polo, carreras de barriles, eventos de 3 días) que requieren ejercicio extenuante durante cortos períodos de tiempo. Se observa epistaxis en una pequeña proporción (~5 %) de los caballos con HPIE. Se identifica sangre en el árbol traqueobronquial en el 45 %-75 % de los caballos de carreras mediante examen endoscópico, y se detecta hemorragia mediante examen citológico del lavado broncoalveolar en >90 % de los caballos de carreras. La HPIE es común en caballos que realizan ejercicio intenso, pero también se ha notificado en atletas humanos, camellos de carreras y galgos de carreras. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones son adecuadas para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con la hemorragia pulmonar inducida por ejercicio (HPIE) en mamíferos, especialmente en caballos de carreras. En algunas realizaciones, las formulaciones son adecuadas para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con la epistaxis.

Otras enfermedades respiratorias que son adecuadas para el tratamiento usando las formulaciones incluyen infecciones respiratorias virales tales como infección por herpesvirus equino, gripe equina, arteritis viral equina e infección por el virus Hendra; infecciones respiratorias bacterianas secundarias tales como las provocadas por Streptococcus equi zooepidemicus, Actinobacillus equuli, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Pasteurella spp, Pseudomonas aeruginosa o S equi equi. La enfermedad bacteriana secundaria puede dar como resultado infecciones bacterianas de la mucosa (rinitis y traqueítis) o puede producir enfermedades invasivas más graves, tales como neumonía y pleuroneumonía. En algunas realizaciones, las formulaciones son adecuadas para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas asociados con rinitis, traqueítis, neumonía o pleuroneumonia.

También se dan a conocer las composiciones y los métodos para gestionar o tratar una enfermedad pulmonar en perros y gatos. Las enfermedades pulmonares en perros/gatos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades pulmonares obstructivas y alérgicas tales como asma, bronquitis o asma bronquial. En algunas realizaciones, la enfermedad pulmonar que necesita tratamiento es la EPOC. En sus estadios tempranos en perros y gatos, el principal síntoma de la EPOC es tos crónica, o tos que persiste durante más de un mes. La tos suele ser “seca” o áspera, y son comunes arcadas después de la tos. A medida que la enfermedad progresa, los perros/gatos pueden tener dificultades para respirar y, a menudo, tienen una tolerancia al ejercicio disminuida (se cansan fácilmente) o incluso pueden desmayarse con un esfuerzo excesivo. La respiración puede volverse ruidosa, y el animal puede emitir sibilancias al exhalar. En estadios posteriores, las encías pueden desarrollar un matiz azulado como resultado de la falta de oxígeno. Los perros/gatos con EPOC rara vez tienen fiebre y habitualmente su apetito sigue siendo normal. En algunas realizaciones, las formulaciones se administran usando inhaladores diseñados específicamente para los animales para lograr una administración mejorada.

También se dan a conocer las composiciones y los métodos para tratar, aliviar o prevenir una lesión pulmonar en animales que han estado expuestos a sustancias tóxicas, o que tiene lesiones por inhalación agudas. Irritantes químicos, asfixiantes, metales tóxicos, productos de incendios y combustión o muchos otros agentes comentados anteriormente también pueden provocar lesiones por inhalación aguda en animales.

B. Métodos de administración

Las composiciones proporcionadas se usan para tratar, prevenir o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o enfermedad broncoconstrictiva en un sujeto. Generalmente, no se restringe a ningún modo específico de administración siempre que las composiciones se depositen en los sitios deseados de tratamiento. En realizaciones preferidas, los métodos implican administrar al sujeto por medio de una vía pulmonar, orofaríngea, nasofaríngea o hipofaríngea. En una realización, el método incluye la administración por nebulizador a un sujeto de una cantidad eficaz de una composición que contiene DHAF, por lo que la enfermedad o trastorno se trata, o se previene.

1. Nebulizadores

Las formulaciones están diseñadas para la administración por nebulizador. Una disolución nebulizada es una dispersa en aire para formar un aerosol, y un nebulizador genera gotitas de líquido muy finas adecuadas para inhalación en el pulmón. Los nebulizadores normalmente usan aire comprimido, ondas ultrasónicas o una malla vibratoria para crear una neblina de las gotitas y también pueden tener un deflector para eliminar las gotitas más grandes de la neblina por impacto. Están disponibles una variedad de nebulizadores disponibles para este propósito, tales como nebulizadores ultrasónicos, nebulizadores de chorro y nebulizadores accionados por la respiración. En realizaciones preferidas, se acoplan normalmente boquillas o máscaras a un paciente para ayudar a la administración de la disolución nebulizada.

La deposición de medicación inhalada en el pulmón y las vías respiratorias está influida por múltiples factores, incluyendo las características del dispositivo nebulizador, las propiedades de formulación del aerosol, el patrón de respiración del paciente, la geometría de las vías respiratorias y posibles diferencias en la ventilación regional de las vías respiratorias. Las diferencias entre los sistemas nebulizadores pueden tener un impacto de varias veces en la eficiencia de la administración de fármacos al pulmón. Por lo tanto, los nebulizadores se seleccionan para administrar eficientemente la cantidad deseada de formulaciones a las áreas objetivo del pulmón, con efectos adversos relacionados con el fármaco minimizados.

Una consideración importante al elegir un nebulizador apropiado es su capacidad para generar un tamaño de gotita apropiado del aerosol para el tratamiento pulmonar. Generalmente, se prefieren tamaños de gotita pequeños para una administración más eficiente de las formulaciones para que alcancen el tracto respiratorio inferior. La cantidad de fármaco en gotitas pequeñas (< 5 |im), comúnmente descrita como fracción de gotitas finas, es la porción de un fármaco aerosolizado administrado de la manera más eficiente a las vías respiratorias distales. En algunas realizaciones, un tamaño de gotita de menos de 5,0 |im es adecuado, por ejemplo, entre aproximadamente 1,5 |im y 5,0 |im, preferiblemente un tamaño de gotita de entre aproximadamente 2,5 |im y 3,5 |im o menos.

En algunas realizaciones, la fracción de gotitas con un tamaño de entre aproximadamente 1,5 |im y 5 |im es de al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o más del 90 % de las formulaciones nebulizadas totales. En algunas realizaciones, la fracción de gotitas con un tamaño de entre aproximadamente 2,5 |im y 3,5 |im es de al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o más del 90 % de las formulaciones nebulizadas totales.

En algunas realizaciones, las formulaciones se administran usando un nebulizador de chorro de alta eficiencia, un nebulizador ultrasónico de alta eficiencia o un nebulizador de malla vibratoria de alta eficiencia, permitiendo y/o potenciando el uso de estos dispositivos el uso de las formulaciones de volumen reducido de la invención. Muchos nebulizadores comerciales adecuados para la administración de las formulaciones incluyen, pero no se limitan a NEBUTECH®, UP-DRAFT® II OPTI-NEB, PARI LC® Plus, PAIR LC® Star, SIDESTREAM®. En realizaciones preferidas, las formulaciones se administran mediante un nebulizador de malla vibratoria de alta eficiencia, por ejemplo, VOYAGER™ PRO, o micronebulizador de aire OMRON® (NE-U22V).

En algunas realizaciones, las formulaciones son para administración con un nebulizador de alta eficiencia, en particular uno que puede administrar al menos el 10%, preferiblemente al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, más del 90 % o aproximadamente el 100 %, de las formulaciones de D-HAF a los pulmones del paciente.

2. Inhaladores

En algunas realizaciones, las formulaciones están diseñadas para la administración por inhaladores. Los inhaladores son dispositivos manuales pequeños que administran una descarga de medicamento a las vías respiratorias. Hay tres tipos básicos: inhaladores de dosis medida (MDI), inhaladores de polvo seco (DPI) e inhaladores de niebla suave (SMI).

Los MDI contienen un medicamento líquido que se administra como un aerosol. El medicamento se mantiene en un bote presurizado que tiene una válvula dosificadora. Los pacientes cierran los labios alrededor de la boquilla o colocan la boquilla a de 1 a 2 pulgadas de su boca y respiran lentamente a medida que presionan el inhalador. Un método alternativo que muchos encuentran preferible es usar un espaciador. Un separador es un tubo de plástico hueco usado entre la boquilla y el bote de medicamento. Un espaciador hace que sea más fácil que la dosis completa de medicación llegue hasta los pulmones. En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico se administran mediante inhaladores de dosis medida.

Un DPI es similar, pero libera una descarga de polvo seco en lugar de una niebla líquida. Los DPI no deben usarse con un espaciador. En su lugar, los pacientes cierran la boca firmemente alrededor de la boquilla del inhalador DPI e inhalan rápida y constantemente. En algunas realizaciones, las formulaciones de líquido amniótico se administran mediante inhaladores de polvo seco.

Un SMI es un tipo más nuevo de inhalador que proporciona una cantidad medida previamente de medicamento en una niebla de movimiento lento que ayuda a inhalar el medicamento. Los pacientes ponen sus labios en la boquilla mientras sostienen el dispositivo horizontalmente y teniendo cuidado de no cubrir los orificios de ventilación de aire. Proporciona activamente medicamentos de una manera que no depende de la rapidez con la que se respire el aire del inhalador.

C. Dosificaciones y regímenes de dosificación

La dosificación y los regímenes de dosificación dependen de la gravedad del trastorno pulmonar, y los conocen los expertos en la técnica.

La formulación se adaptará al sujeto individual, la naturaleza de la afección que va a tratarse en el sujeto y, en general, el criterio del médico especialista. En otra realización más, la formulación es cualquier cantidad de entre aproximadamente 0,1 y 10 ml combinados con cualquier cantidad de entre aproximadamente 0,1 y 10 ml de agua, o solución salina estéril.

Para el tratamiento de la EPOC y el asma, incluyendo, pero sin limitarse a, bronquitis crónica, enfisema, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar intersticial y enfisema por alfa-1 antitripsina usando las formulaciones, generalmente se proporciona un nebulizador y una ampolla que contiene no menos de 0,1 ml de la formulación de D-HAF, por ejemplo, cualquier cantidad entre 0,1 ml a 10 ml de D-HAF mezclado con solución salina estéril o agua estéril.

Una ampolla llena contiene una formulación de D-HAF. Generalmente se encuentra en un portador farmacéuticamente aceptable y tamponado para uso en seres humanos a un pH de aproximadamente 3,5 - 10,0. Las formulaciones de los ejemplos se tamponan a aproximadamente pH 6,0 - 7,5. Las formulaciones están libres de conservantes, lo cual es una ventaja ya que algunos conservantes pueden estar asociados con efectos broncoconstrictores, el efecto opuesto al requerido por la formulación. Se usa agua o solución salina para proporcionar el portador.

Pueden añadirse uno o más agentes de ajuste de la tonicidad para proporcionar la fuerza iónica deseada. Los agentes de ajuste de la tonicidad para su uso incluyen aquellos que no muestran o solo muestran actividad farmacológica insignificante después de la administración. Pueden usarse agentes de ajuste de la tonicidad tanto inorgánicos como orgánicos. Las composiciones de la invención también pueden incluir excipientes y/o aditivos. Ejemplos de estos son tensioactivos, estabilizadores, agentes complejantes, antioxidantes o conservantes que prolongan la duración del uso de la formulación farmacéutica terminada, aromatizantes, vitaminas u otros aditivos conocidos en la técnica. Los agentes complejantes incluyen, pero no se limitan a, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o una sal del mismo, tal como la sal de disodio, ácido cítrico, ácido nitrilotriacético y sales del mismo. En una realización, el agente complejante es EDTA. Los conservantes incluyen, pero no se limitan a, aquellos que protegen la disolución de la contaminación con partículas patógenas, incluyendo cloruro de benzalconio o ácido benzoico, o benzoatos tales como benzoato de sodio. Los antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, vitaminas, provitaminas, ácido ascórbico, vitamina E o sales o ésteres de la misma.

En algunas realizaciones, se prefieren las formulaciones de D-HAF liofilizadas. En algunas realizaciones, el D-HAF liofilizado se reconstituye añadiendo el volumen inicial de agua. En otras realizaciones, la formulación se diluye adicionalmente hasta desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el 99 % del D-HAF reconstituido. La formulación refrigerada se diluye fácilmente hasta desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el 99 % del D-HAF original hasta una concentración deseada para aplicaciones.

En otras realizaciones, la formulación final se prepara como una disolución mucho más concentrada dependiendo de la necesidad de aplicación. Por ejemplo, para minimizar la cantidad de tiempo que el paciente necesita estar confinado a un nebulizador, se usa una formulación concentrada para administrar la misma dosificación eficaz en un período más corto. En una realización, el D-HAF liofilizado se reconstituye añadiendo la mitad del volumen inicial de agua para lograr disoluciones del doble de concentración de todos los factores amnióticos. En una realización adicional, el D-HAF liofilizado se reconstituye añadiendo el 10 % del volumen inicial de agua para lograr disoluciones 10 veces más concentradas de los factores amnióticos para la aplicación. En algunas realizaciones, el D-HAF refrigerado puede usarse para reconstituir el D-HAF liofilizado con el fin de obtener una disolución más concentrada.

Las formulaciones de D-HAF pueden administrarse con tanta frecuencia como sea necesario y apropiado. La frecuencia generalmente depende de la gravedad del daño pulmonar, y la capacidad de respuesta de los tejidos diana al tratamiento con formulaciones de D-HAF. Por ejemplo, en el caso de SDRA, donde el inicio de las afecciones pulmonares es rápido, el tratamiento puede administrarse una vez cada 6-8 horas durante las primeras 24 horas para prevenir o retrasar el SDRA. En algunas realizaciones, las formulaciones de D-HAF se administran una vez a la semana. En realizaciones preferidas, las formulaciones de D-HAF se administran en una serie de tres tratamientos con una semana de diferencia. En otras realizaciones, las formulaciones de D-HAF se administran una vez al mes. En algunas realizaciones, la rutina de administración puede cambiar basándose en la evaluación por parte de los profesionales sanitarios del paciente después del tratamiento previo.

Normalmente, las formulaciones de D-HAF se administran a lo largo de un período de entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 30 minutos, preferiblemente entre aproximadamente 7 minutos y aproximadamente 15 minutos. La duración precisa de la administración depende de la configuración del nebulizador, y la gravedad de las afecciones pulmonares.

D. Controles

El efecto de las formulaciones de líquido amniótico sobre los pulmones puede compararse con un control. En la técnica se conocen controles adecuados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un sujeto tratado con las formulaciones de D-HAF se compara con un sujeto de control tratado con placebo que tenía síntomas similares al sujeto experimental antes del tratamiento de las formulaciones de D-HAF. En algunas realizaciones, los pacientes realizarán una autoevaluación en el plazo de días, semanas, meses después del inicio del tratamiento en función de su capacidad para hacer frente diariamente a sus capacidades, por ejemplo, usando el cuestionario clínico de EPOC (CCQ). En algunas realizaciones, los sujetos se evaluarán en intervalos regulares por médicos especialistas basándose en puntuaciones clínicas tales como puntuaciones de FEV1, PEF, y su tolerancia al ejercicio, su reducción en la inflamación en el área afectada y/o su saturación de oxígeno basal.

La presente invención se entenderá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Tratamiento de pacientes con EPOC y asma con disolución de líquido amniótico

El propósito del estudio es determinar el tratamiento terapéutico apropiado de la EPOC usando líquido amniótico nebulizado por medio de un nebulizador de malla vibratoria.

Materiales y métodos

Criterios de selección

Los pacientes deben estar libres de cáncer tal como se determina por tomografía computarizada de tórax (TC). En el caso de diagnóstico de cáncer en los últimos cinco años, debe haber una declaración de estar libre de cáncer por parte del médico especialista. Los pacientes también deben estar libres de enfermedad fibrótica. Los pacientes deben estar libres de consumo de tabaco en el plazo de los 6 meses previos al tratamiento.

Recogida de datos

Se realizaron pruebas de función pulmonar al inicio del estudio (es decir, justo antes del tratamiento con la formulación de líquido amniótico), a 1 mes y a los 6 meses. Se recogieron datos de espirometría antes y después de la broncodilatación, 1 semana y 3 meses. Se recogieron datos de oximetría mientras estaban en reposo con aire ambiental en el momento basal, 30 minutos después del tratamiento, 1 semana, 1 mes, 3 meses y 6 meses. Se recogieron datos de oximetría después de la prueba de marcha de 6 minutos con aire ambiental en el momento basal, 1 semana, 1 mes, 3 meses, 6 meses. Se recogieron resultados de tensión arterial en cada visita. Todos los resultados se documentaron en una hoja de cálculo específica para el paciente.

Dosificación

Se administró PURAGEN®, también conocido como disolución de inhalación PURACEL™, o disolución de inhalación derivada de D-MAPPS™ estéril (señalización paracrina de múltiples proteínas alogénicas descelularizadas, Decellularized Múltiple Allogeneic Proteins Paracrine Signaling), la formulación de líquido amniótico dada a conocer, a una unidad de dosificación de 0,5 ml a menos que se indique lo contrario. Normalmente, se añaden 0,5 ml de PURAGEN® mezclado con 3,0 ml de solución salina normal a un nebulizador de malla vibratoria para administrar a los pacientes. De manera rutinaria, solo se administra un tratamiento una vez en la primera visita seguido de la recogida de datos en los momentos prescritos, incluyendo el momento basal, 1 mes, 2 meses, 3 meses, etc., dependiendo de la disponibilidad de los pacientes. Si no fuera factible una visita física a la clínica, se realizaría una evaluación por teléfono. En casos más graves de EPOC, se administró una dosis más alta de PURAGEN®, por ejemplo 1,0 ml. En algunos casos, se administraron dosis adicionales.

Resultados

A. Tratamiento de EPOC de moderada a grave

A la paciente (C.T.) se le diagnosticó EPOC cuatro años antes del tratamiento. Tenía tos persistente, dificultad para respirar y mal color de la piel.

A la paciente (C.T.) se le administró tratamiento con albuterol, seguido inmediatamente de 0,5 ml de PURAGEN® en la visita inicial. En la visita de seguimiento de 2 semanas, C.T. parecían tener un color de piel mucho mejor. C.T. dijo que, desde su tratamiento inicial, había sido generalmente mucho más activa, tal como llevando a cabo actividades diarias de ir al centro comercial, caminar alrededor del bloque y pasar la aspiradora en su casa sin dificultad para respirar. También mencionó que solo tuvo un ataque de tos desde su tratamiento, lo cual fue notable ya que estuvo tosiendo constantemente durante su primera visita. Ya no necesitaba albuterol después de su primera visita, lo que no había experimentado en los últimos seis meses. Además, C.T. mostró una enorme mejora en sus puntuaciones de CCQ (cuestionario clínico de EPOC) y notificó una mejora global en su bienestar.

C.T. elogió efusivamente PURAGEN® durante toda su visita de seguimiento de 2 semanas. Clínicamente mostró una gran mejora en su tos y su FEV1 fue mejor que su valor basal en 0,12, que se midió sin ninguna broncodilatación. También mostró una mejora de 10 puntos en la puntuación de PEF con respecto a su valor basal. Su oxigenación permaneció igual.

La evaluación de seguimiento de 4 semanas se realizó por teléfono. La paciente notificó seguir teniendo mejoras en su estado respiratorio. Dijo que estaba haciendo más ejercicio al tiempo que todavía no tenía tos. Mencionó que justo antes de la conversación telefónica había pasado la aspiradora en su casa, fregado el suelo de baldosas y quitado el polvo de su casa sin ninguna dificultad para respirar. No había necesitado su broncodilatación desde su visita inicial en la que elogió PURAGEN® como una milagro.

Tabla 1: Resumen para la paciente C.T.

Durante la visita de seguimiento de 3 meses, la paciente notificó un éxito continuo de PURAGEN®. Sin embargo, sí que sentía como si su mejora en su estado respiratorio se hubiera estancado en este punto de tiempo. Se le administró una segunda dosis de 0,5 ml de PURAGEN® al día siguiente.

Tratamiento de EPOC grave

La paciente (J.R.) era una mujer de 73 años de edad a la que se le diagnosticó EPOC nueve años antes del tratamiento. La paciente había padecido EPOC grave. J.R. se había sometido a tratamiento en el Lung Institute sin éxito ni mejora. Hacía ejercicio rutinariamente tres veces por semana; utilizando una cinta de correr durante 8 min, 8 min, 8 min y 6 min. Se le administró una receta de 2 litros por minuto (1 pm) de oxígeno para la deambulación, y durante la noche cuando era necesario. Su FEV1 y PEF no pudieron medirse durante esta visita debido a la gravedad de su afección. Recibió 1,0 ml de PURAGEN® mezclado con 2,0 ml de NaCl por medio de un nebulizador de malla vibratoria.

En la visita de seguimiento de dos semanas, la paciente tenía un color de la piel mejorado. Se determinó que tenía alguna mejora. Específicamente, J.R. podía hacer ejercicio en la cinta de correr a intervalos de 10 minutos en comparación con intervalos de 8 minutos antes del tratamiento. También había reducido la utilización de su oxígeno en casa: lo estaba usando cada mañana durante 15-20 minutos después de despertarse antes del tratamiento, pero no lo había usado desde la primera dosis de PURAGEN®. Notificó que sus fosas nasales habían estado hinchadas crónicamente, pero no se habían hinchado desde su tratamiento. Su puntuación de CCQ, que evaluaba sus capacidades para realizar funciones, se redujo desde 39 en su visita inicial hasta 19, lo que indica una mejora significativa. J.R. notificó una mejora global en su bienestar y le gustaría seguir mejorando con un tratamiento adicional. También reconoció que, debido a la gravedad de su afección, tardaría más en darse cuenta de los beneficios de PURAGEN®. Clínicamente, estaba igual que en su visita inicial. Su oxigenación permaneció igual. Sin embargo, no ha utilizado tanto su oxígeno en casa.

A las cuatro semanas de seguimiento, la paciente notificó una mayor tolerancia al ejercicio donde pudo hacer ejercicio hasta 20 minutos en la cinta de correr a 1,1 mph. Clínicamente, fue posible obtener sus puntuaciones de FEV1 y PEF en este punto de tiempo. También había reducido aún más sus puntuaciones de CCQ. Se administraron adicionalmente dosis adicionales de 0,5 ml de PURAGEN® en la semana 4 y la semana 5.

A los tres meses de seguimiento, la paciente notificó que estaba usando más oxígeno, aunque sus niveles de ejercicio permanecieron iguales. La paciente describió que PURAGEN® no había ayudado e incluso podría estar provocando dolor. Sin embargo, basándose en datos clínicos de tolerancia al ejercicio, su estado había mejorado enormemente.

Tabla 2: Resumen para la paciente J.R.

B. Tratamiento de EPOC inducida por asma

La paciente (M.R.) tenían antecedentes de asma con sibilancias frecuentes. Padecía EPOC inducida por asma, y había dependido de prednisona durante mucho tiempo. Está muy limitada en sus capacidades para trabajar, caminar o para realizar cualquier movimiento muscular. También había padecido apnea del sueño obstructiva, y estaba usando presión positiva continua de las vías respiratorias con 2,5 litros por minuto (1 pm) de oxígeno por la noche. Durante el día, se le administraba una prescripción de administración de oxígeno cuando fuera necesario. Usaba broncodilatación con inhalador de dosis medida (MDI) de 3 a 5 veces por semana. M.R. también usaba un nebulizador dos veces al día y usaba sus músculos respiratorios auxiliares con frecuencia.

Una semana después de su tratamiento inicial con PURAGEN®, notificó que solo usó su inhalador de rescate una vez. Había observado un aumento en su tolerancia al ejercicio, así como una disminución en su dosificación de prednisona de acuerdo con las indicaciones del médico. Además, notificó que se había sentido mejor por las mañanas, mientras que antes del tratamiento, el despertar siempre había supuesto un fastidio. En general, también estaba experimentando menos dificultad para respirar. Su CCQ mejoró drásticamente, reduciéndose desde 46 hasta 7. Su PEF y FEV1 permanecieron iguales. Se le administró a M.R. una segunda dosis de 0,5 ml de PURAGEN® durante su visita de 2 semanas.

En la visita de seguimiento de tres semanas, la tolerancia al ejercicio y los marcadores fisiológicos de M.R. mejoraron ambos. Su uso de prednisona se redujo a la mitad del uso antes del tratamiento. No había requerido su infusión para el asma durante 2 meses desde su última infusión. Se le administró una tercera dosis de 0,5 ml de PURAGEn® durante esta visita.

Tabla 3: Resumen para la paciente M.R.

C. Tratamiento de enfermedad pulmonar grave

El paciente (B.B.) era un varón de 71 años con enfermedad pulmonar grave. La tomografía computarizada mostró cicatrización significativa, pero sin proceso de enfermedad fibrótica activa. El resultado indicó una combinación de signos y síntomas de EPOc , y posiblemente de enfermedades reactivas de las vías respiratorias. El paciente era altamente dependiente del oxígeno, usando 3 litros por minuto (lpm) de oxígeno en reposo, 4 litros por minuto (lpm) de oxígeno con deambulación y por la noche. También había usado ventilación de presión positiva no invasiva (NPPV) 10/6 como ayuda para dormir. La prueba de marcha reveló que el esfuerzo mínimo (42 pies) dio como resultado una saturación de O² del 88 %, con una saturación de O² en reposo del 91 %, ambos de los cuales se midieron mientras se administraba O².

Solo cuatro días después del tratamiento inicial, el paciente llamó para notificar que su oxigenación había mejorado. Antes del tratamiento, se había visto impedido para realizar actividades de la vida diaria debido a su dificultar para respirar. Sin embargo, notificó que, después del primer tratamiento, fue capaz de quitarse el oxígeno para cuidar de sí mismo, lo que generalmente daría como resultado que su nivel de oxígeno cayera hasta el 77 %, pero permaneció al 88 %.

En la visita de seguimiento de dos semanas, el paciente continuó mejorando sus capacidades de ADL y experimentó menos desaturación de oxígeno en ausencia de suministro externo de oxígeno. En este momento, el paciente podía permanecer sin suministro de oxígeno durante 10 minutos antes de que el nivel de oxígeno cayera hasta el 80 %.

En la visita de seguimiento de tres semanas, el paciente mejoró aún más sus capacidades de ADL, así como su tolerancia al ejercicio. El paciente también tenía una puntuación de PEF aumentada y una puntuación de CCQ reducida. En el plazo de tres semanas después del tratamiento inicial, la esposa del paciente notificó que B.B. había mejorado mucho su bienestar y que podía participar en muchas más actividades físicas, como ir al centro comercial y jugar con su nieto.

En la visita de seguimiento de cuatro semanas, B.B. notificó una mejor memoria y un tiempo de actividad prolongado hasta aproximadamente 20 min en ausencia de suministro externo de oxígeno. B.B. también era mucho menos dependiente del oxígeno, reduciendo el consumo de oxígeno al 50 % en comparación con los niveles previos al tratamiento.

Siete semanas después de la visita inicial, B.B. notificó que podía estar sin oxígeno durante 40-50 min mientras estaba activo y 4 horas en reposo.

En la visita de seguimiento de nueve semanas, B.B. había mejorado significativamente con respecto a la primera visita. Podía permanecer sin oxígeno durante hasta 4 horas mientras está en reposo, y hasta 1 hora con actividad. Sus ADL mejoraron mucho: B.B. comenzó sin poder realizar ninguna ADL en la primera visita y ahora podía realizar las ADL sin ayuda, SOB ni fatiga. El paciente podía realizar actividades adicionales tales como hacer burbujas con sus nietos, realizar el mantenimiento del jardín y carpintería ligera. Clínicamente, la mejora se observó en las siguientes áreas, 17 % de mejora en FEV1, 33 % de mejora en PEF y una reducción del 92 % en la puntuación de CCQ (la puntuación reducida indica mayores ADL y QOL), donde PEF/FEV se realizaron sin broncodilatación. En cuanto a su requisito de oxígeno, sus niveles de saturación fueron estables en aire ambiental, su dependencia de O² suplementario se redujo en un 25 % y el tiempo de recuperación se acortó a menos de 2 min.

La tomografía computarizada de tórax, con fecha un año después de la tomografía computarizada de tórax inicial, reveló una reducción significativa en la resolución de intervalo de dos cicatrices lineales en el pulmón izquierdo. El diafragma está menos aplanado y los pulmones están menos hiperexpandidos. Hay una apariencia global mejorada del grado de enfisema tanto paraseptal como centrolobulillar.

El paciente mostró una mejora notable en el estado pulmonar después del régimen de disolución de inhalación de D-MAPPS estéril; fisiológicamente, en oxigenación, flujo de aire, tolerancia al ejercicio, y subjetivamente en calidad de vida, niveles de actividad y ADL. A los 6 meses después del tratamiento, el paciente podía estar sin oxígeno durante 10 horas en reposo.

Tabla 4: Resumen para el paciente B.B.

D. Tratamiento de asma persistente grave

El paciente (D.S.) era un varón de 14 años con asma persistente grave con exacerbaciones agudas. Se le diagnosticó asma a la edad de 4. Desde entonces, siempre tenía exacerbaciones ocasionales y requería mantenimiento farmacológico diario. D.S. era un atleta de pista y usaba un inhalador antes de y/o después de eventos de pista. Dado que era un adolescente activo, la puntuación de CCQ y la prueba de ejercicio no fueron muy informativas en la comparación de los efectos previos y posteriores al tratamiento. Por lo tanto, se usaron sus tiempos de carrera y recuperación para determinar los efectos del tratamiento con PURAGEN®. Después de la dosis inicial de PURAGEN® recibida en la primera visita, D.S. solo recibiría dosis adicionales si fuera sintomático.

Además de las puntuaciones clínicas habituales, también se realizó tomografía computarizada (TC) en este paciente. Se demostró una respuesta significativa a la terapia en 15 minutos con apertura de las vías respiratorias superiores antes y después de las tomografías computarizadas de alta resolución. Se obtuvieron imágenes de TC axiales potenciadas contiguas con contracción y sin contraste del tórax desde la entrada torácica a través de las bases pulmonares con retención de la respiración en espiración, antes y después de la terapia. Se generaron imágenes reformateadas multiplanares y se revisaron tanto con ventanas de tejido blando como de pulmón. 140 ml de ULTRAVIST® 370. Volumen de contraste desechado: 0 ml. No se requiere BUN/creatinina.

Los hallazgos de tomografía computarizada fueron los siguientes:

1) Antes de la terapia: había un arqueamiento anterior de la tráquea membranosa posterior consecuente con la espiración; había un artefacto de movimiento respiratorio significativo que probablemente representaba dificultad con la contención de la respiración y/o dificultad respiratoria leve; había hiperexpansión leve; la evaluación de la vasculatura pulmonar estaba limitada por el artefacto de movimiento respiratorio, pero era macroscópicamente normal.

2) Después de la terapia: había un arqueamiento anterior de la tráquea membranosa posterior consecuente con la espiración; había un artefacto de movimiento respiratorio mínimo presente solo en las bases pulmonares; los pulmones se expandieron normalmente; había una vasculatura pulmonar normal.

3) La tiroides parecía normal. Se demostró un timo residual normal mínimo. No había linfadenopatía axilar, mediastinal ni hiliar. Las vías respiratorias eran permeables. No había consolidación focal, derrame pleural ni neumotórax. No había nódulos pulmonares. La silueta cardíaca era normal sin derrame pericárdico. La aorta tenía un tamaño normal. Había una anatomía normal de tres vasos. La arteria pulmonar tenía un tamaño normal.

4) Imágenes limitadas a través de la parte superior del abdomen demostraron un contenido abdominal superior normal. Las ventanas óseas no demostraron lesiones óseas agresivas. No había escoliosis ni asimetría espinal. No había anomalías en los cuerpos vertebrales. Los tejidos blandos subcutáneos parecían normales.

El radiólogo/médico interpretó que los pulmones ligeramente hiperexpandidos con un artefacto de movimiento respiratorio significativo eran consecuentes con la dificultad para contener la respiración y/o la dificultad respiratoria leve en las exploraciones previas a la terapia; y los pulmones expandidos de manera normal con solo un artefacto de movimiento respiratorio mínimo eran consecuentes con una respuesta significativa a la terapia en las exploraciones posteriores a la terapia.

Cuatro días después del tratamiento, D.S. notificó que no había tenido que usar el inhalador de rescate desde la visita inicial. Además, realizó eventos de carrera basal sin la necesidad de broncodilatación antes o después de los eventos. Después del tratamiento, el uso promedio del inhalador por parte del paciente es una vez a la semana sin tratamientos con nebulizador. El paciente también notó menos reacciones alérgicas al polen, alfombras y pelo de gato.

Tabla 5: Resumen para el paciente D.S.

Ejemplo 2: Tratamiento de víctimas de pozos de combustión militares con disolución de líquido amniótico

Materiales y métodos

Tres pacientes masculinos de pozos de combustión, con una edad de 28-34 años, que habían servido al menos una vez en Irak o Afganistán, se incluyeron en el estudio realizado por el Departamento de Defensa. A los tres pacientes se les diagnosticó bronquiolitis constrictiva u otro diagnóstico pulmonar. Tenían síntomas similares después de su exposición a pozos de combustión en Irak/Afganistán. Antes del tratamiento, los pacientes experimentaban dificultad para respirar con un esfuerzo leve, flema (productiva), tos prolongada y excesiva, congestión torácica, sibilancias y dificultad ocasional para conseguir una respiración profunda completa.

Los tres pacientes recibieron 3 tratamientos, con 1 semana de diferencia con la administración de disolución de inhalación de D-MAPPS estéril con un nebulizador.

Resultados

La formulación se sometió a prueba como un posible tratamiento para víctimas de pozos de combustión militares, ya que actualmente no existe tratamiento. Tres veteranos, todos los cuales habían estado estacionados durante largos períodos de tiempo o bien en Irak o bien en Afganistán, eran todos jóvenes y por lo demás sanos, pero tenían pulmones equivalentes a los de hombres de 70 años. Después de la serie de tres tratamientos, todos tenían una resolución completa de los síntomas y volvieron a hacer ejercicio y otras actividades sin sibilancias. En la evaluación después del tratamiento de dos meses, los tres pacientes mostraron una resolución completa de todos los síntomas, y fueron capaces de aumentar sustancialmente su tolerancia al ejercicio.

Ejemplo 3: Tratamiento de pacientes con fibrosis pulmonar con disolución de líquido amniótico

Materiales y métodos

Se incluyó en este estudio un hombre de raza blanca de 76 años con enfisema ampolloso y fibrosis pulmonar. El paciente había tomado OFEV® (nintedanib; ciclo de 60 días), PROAIR®, MDI de albuterol. El paciente tenía una transferencia de gas gravemente deteriorada. Antes del tratamiento, el paciente tenía dificultad para respirar con un esfuerzo leve, dificultad ocasional para conseguir una respiración profunda completa y necesitaba dependencia de oxígeno suplementario.

Al paciente se le administraron 0,5 ml de disolución de inhalación PURACEL™ combinada con 2,5 ml de NaCl por medio de un nebulizador de malla vibratoria, una vez a la semana durante 3 semanas mientras todavía tomaba OFEV®.

Resultados

Se trató a un paciente de 76 años con enfisema y fibrosis pulmonar que tomaba Ofev durante tres meses con resultados mínimos. Después del primer tratamiento, su médico le retiró Ofev y fue disminuyendo su dependencia del oxígeno. Después del tercer tratamiento, el paciente podía estar sin oxígeno durante 8-10 horas al día, mientras mantenía niveles de saturación saludables, y era capaz de disfrutar de una calidad de vida más normal, mostrando su distancia de marcha una mejora del 500 %.

Los resultados se muestran en la tabla 6.

Tabla 6: Resumen para paciente con fibrosis pulmonar.

Después del tratamiento, el paciente mostró una mejora significativa en FEV1, PEF y duración del ejercicio, así como puntuación de CCQ.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención dada a conocer.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un líquido amniótico descelularizado estéril (D-HAF) para su uso en un método de tratamiento o prevención de un trastorno o lesión pulmonar, en el que el método comprende administrar al pulmón de un sujeto el D-HAF estéril en forma de aerosol o con un nebulizador, que genera gotitas de aerosol con un tamaño de entre aproximadamente 1,5 |im y aproximadamente 5 |im, inclusive, en una unidad de dosificación de entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 10,0 ml y en una cantidad eficaz para tratar, aliviar o prevenir uno o más síntomas del trastorno o lesión pulmonar, en el que el D-HAF carece de células amnióticas, materia particulada de membrana amniótica y partículas de corion.
2. 2. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que el D-HAF se diluye con agua, solución salina o tampón estéril.
3. 3. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que el D-HAF se administra al sistema pulmonar o nasal.
4. 4. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que al menos el 30 % de las gotitas de aerosol tienen un tamaño de entre 2,5 micrómetros y 3,5 micrómetros.
5. 5. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que la formulación es isotónica y/o tiene un pH que es equivalente al del revestimiento de los pulmones.
6. 6. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que el D-HAF se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos, agentes profilácticos o de diagnóstico, opcionalmente en el que el D-HAF se administra en combinación con uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en broncodilatadores, corticosteroides, metilxantinas, inhibidores de fosfodiesterasa-4, agentes antiangiogénicos, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes antiinflamatorios, factores de crecimiento, agentes inmunosupresores, agentes antialérgicos, y combinaciones de los mismos.
7. 7. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que el trastorno pulmonar se selecciona del grupo que consiste en trastornos pulmonares obstructivos crónicos (EPOC), asma, enfisema, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar intersticial, enfisema por alfa-1 antitripsina, y combinaciones de los mismos.
8. 8. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que la lesión pulmonar es una lesión por inhalación aguda provocada por la exposición a una condición tóxica seleccionada del grupo que consiste en irritantes químicos, asfixiantes, quemaduras y humos, agentes de control de disturbios y guerra química, metales tóxicos, lesiones por explosión, y combinaciones de los mismos.
9. 9. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que el D-HAF está en una cantidad eficaz para mejorar la resistencia al ejercicio, aumentar la saturación de oxígeno en sangre basal y/o reducir la inflamación en los pulmones.
10. 10. El D-HAF para su uso en un método según la reivindicación 1, en el que el sujeto es:

    (i) un mamífero;

    (ii) un mamífero seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, perros, gatos y caballos; o

    (iii) un mamífero que es un caballo montado en una competición.
11. 11. El D-HAF para su uso en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el D-HAF se administra una vez a la semana durante un período de al menos una semana o al menos tres semanas.
12. 12. Un kit que comprende una ampolla lista para su uso con un nebulizador o aerosol, conteniendo la ampolla una única dosis unitaria estéril de D-HAF de entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 10,0 ml, en el que el D-HAF carece de células amnióticas, materia particulada de membrana amniótica y partículas de corion,

    opcionalmente en donde el kit comprende además instrucciones sobre cómo ha de usarse la dosis en un nebulizador o aerosol para el tratamiento de un trastorno y/o lesión pulmonar; y/o

    opcionalmente en donde el kit comprende además una dosis unitaria de agua, solución salina o tampón estéril para dilución.
13. 13. El kit según la reivindicación 12, en el que la disolución de D-HAF está en un portador farmacéuticamente aceptable.
14. 14. El kit según la reivindicación 12, en el que la dosis es eficaz para tratar a un ser humano con un trastorno pulmonar seleccionado del grupo que consiste en trastornos pulmonares obstructivos crónicos (EPOC), asma, enfisema, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfermedad pulmonar intersticial, enfisema por alfa-1 antitripsina, y combinaciones de los mismos.
15. 15. El kit según la reivindicación 12, en el que la dosis es eficaz para tratar a un ser humano con una lesión por inhalación aguda provocada por la exposición a una condición tóxica seleccionada del grupo que consiste en irritantes químicos, asfixiantes, quemaduras y humos, agentes de control de disturbios y guerra química, metales tóxicos, lesiones por explosión, y combinaciones de los mismos.
16. 16. El kit según la reivindicación 12, en el que la dosis es eficaz para tratar a un caballo.