ES2912103T3 - Una nueva tagatosa-6-fosfato fosfatasa termostable y un método para producir tagatosa mediante el uso de la misma - Google Patents

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Abstract

Uso de tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, para producir tagatosa.

Description

DESCRIPCIÓN
Una nueva tagatosa-6-fosfato fosfatasa termostable y un método para producir tagatosa mediante el uso de la misma
Campo técnico
La presente descripción se refiere a tagatosa-6-fosfato fosfatasa y un método para producir tagatosa mediante el uso de la misma.
Antecedentes de la técnica
Un método para producir D-tagatosa a partir de D-galactosa mediante el uso de L-arabinosa isomerasa y un método para producir tagatosa a partir de D-fructosa mediante el uso de L-ribulosa-5-fosfato-4-epimerasa se han informado como métodos para producir tagatosa mediante el uso de una reacción convencional de conversión de una sola enzima. Sin embargo, en tal reacción de conversión de una sola enzima, hay un cierto nivel de equilibrio de reacción entre un sustrato y un producto (producto/sustrato = aproximadamente 20 % a 50 %). Por lo tanto, en el caso de producir tagatosa de alta pureza mediante el uso de la reacción de conversión de una sola enzima, se requiere un proceso de purificación adicional para aislar y eliminar una alta concentración de un sustrato resultante de la reacción.
Por otro lado, para el método para producir D-tagatosa mediante el uso de una reacción de conversión de múltiples enzimas, ya se ha informado un método de preparación que comprende producir D-fructosa-6-fosfato a partir de adenosina trifosfato (ATP) y fructosa mediante el uso de hexoquinasa (EC 2.7.1.1), convertir la D-fructosa-6-fosfato en D-tagatosa-6-fosfato mediante el uso de D-fructosa-1,6-bisfosfato-adolasa (EC 4.1.2.13) que tiene la actividad de fructosa-6-fosfato-4-epimerasa, y producir D-tagatosa a partir de D-tagatosa-6-fosfato mediante el uso de una fitasa como una fosfatasa (Patentes coreanas núms. 10-1627921 y 10-1620904). Sin embargo, la reacción con múltiples enzimas requiere ATP costoso como donante de fosfato, y está limitada en la aplicación del proceso debido a las bajas estabilidades fisicoquímicas (calor, pH, etc.) de los nucleótidos de adenina AMP, ADP y ATP. Además, las fitasas inducen reacciones irreversibles debido a su variedad de sustratos y, por lo tanto, tienen un límite para aumentar el rendimiento de producción de tagatosa.
Descripción
Problema Técnico
Los presentes inventores han hecho grandes esfuerzos para desarrollar un método para producir tagatosa con alto rendimiento mediante el uso de materias primas económicas. Como resultado, cuando la tagatosa-6-fosfato se produce mediante la conversión de sacarosa, almidón o maltodextrina, que son materias primas económicas, en glucosa o glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato, se encontró que la tagatosa puede producirse con conversiones enzimáticas en un único recipiente en las que pueden usarse simultáneamente una pluralidad de enzimas involucradas en la ruta de producción de tagatosa, al llevar a cabo la desfosforilación de tagatosa-6-fosfato como una ruta de reacción irreversible mediante el uso de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción; y que la tasa de conversión a tagatosa puede incrementarse notablemente, lo que completa de esta manera la presente descripción.
Solución Técnica
Un objeto de la presente invención se refiere al uso de tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, para producir tagatosa.
Otro objeto de la invención se refiere al uso de una composición que comprende tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, para producir tagatosa.
En una modalidad adicional, la invención se refiere al uso de una composición, en donde la composición comprende además:
(a) (I) almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos;
(ii) fosfato;
(iii) fructosa-6-fosfato-4-epimerasa;
(iv) glucosa-6-fosfato isomerasa;
(v) fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y
(vi) a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o
(b) un microorganismo que expresa cualquiera de las enzimas o un cultivo del microorganismo.
En aún una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para producir tagatosa, que comprende: convertir tagatosa-6-fosfato en tagatosa mediante la reacción de tagatosa-6-fosfato con tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo.
En un aspecto más específico, el método comprende además convertir fructosa-6-fosfato en tagatosa-6-fosfato mediante reacción de la fructosa-6-fosfato con fructosa-6-fosfato-4-epimerasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la tagatosa-6-fosfato en tagatosa.
En un aspecto aún más específico, el método comprende además convertir glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa-6-fosfato con glucosa-6-fosfato isomerasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la fructosa-6-fosfato en tagatosa-6-fosfato.
En un aspecto aún más específico, el método comprende además convertir glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa-1-fosfato con fosfoglucomutasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato.
En un aspecto aún más específico, el método comprende además convertir la glucosa en glucosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa con glucoquinasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo y fosfato, antes de convertir la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato.
En un aspecto aún más específico, el método comprende además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa-1-fosfato mediante reacción del almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos con fosfato y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa o sacarosa fosforilasa; un microorganismo que expresa las mismas; o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato.
En un aspecto aún más específico, el método comprende además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa mediante reacción del almidón, maltodextrina, sacarosa o combinación de estos con a-amilasa, pululanasa, glucoamilasa, sacarasa o isoamilasa; un microorganismo que expresa las mismas; o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa en glucosa-6-fosfato.
De acuerdo con un aspecto específico, la reacción del método antes descrito se lleva a cabo a un pH de 5,0 a 8,0, una temperatura de 60 °C a 90 °C, y/o durante 1 minuto a 24 horas.
De acuerdo con un aspecto específico, la reacción del método descrito anteriormente se lleva a cabo en presencia de un ion o sal de un metal seleccionado del grupo que consiste en Mg, Mn y Zn.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir tagatosa, que comprende hacer reaccionar almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de los mismos y fosfato con (a) una tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.°: 1; fructosa-6-fosfato-4-epimerasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa cualquiera de las enzimas o un cultivo del microorganismo.
Efectos Ventajosos
Dado que la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción es termoestable, puede usarse para producir tagatosa industrialmente, la producción de tagatosa en una alta concentración es posible mediante la explotación de una vía de reacción irreversible, y la tagatosa puede producirse con un conversión enzimática en un único recipiente mediante el uso de sacarosa, almidón o maltodextrina, que son materias primas económicas, como materia prima. Por lo tanto, dado que el proceso para producir tagatosa de alta pureza puede simplificarse, el método de producción es ventajoso porque es simple y económico.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra esquemáticamente la vía de reacción capaz de producir tagatosa a partir de almidón (por ejemplo, maltodextrina), sacarosa o glucosa, y presenta las enzimas implicadas en ella.
La Figura 2 muestra los resultados del análisis del peso molecular de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa (E: T6PP) de la presente descripción por electroforesis de proteínas (SDS-PAGE). "M" representa un marcador de tamaño de proteína y "CE" representa un sobrenadante después de la interrupción del transformante. La Figura 3 es un gráfico que muestra la actividad de conversión de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción de tagatosa-6-fosfato en tagatosa.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la actividad de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción de acuerdo con la solución tampón y el intervalo de pH.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la actividad de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción de acuerdo con la temperatura.
La Figura 6 es un gráfico que muestra la actividad de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción tras la adición de un ion metálico.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la especificidad de sustrato de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción para la tagatosa-6-fosfato.
Mejor modo
A continuación, la presente descripción se describirá en detalle. Mientras tanto, cada una de las explicaciones y modalidades ilustrativas descritas en la presente descripción pueden aplicarse a otras explicaciones y modalidades ilustrativas. Es decir, todas las combinaciones de varios factores descritos en la presente descripción pertenecen al alcance de la presente descripción. Además, el alcance de la presente descripción no debería estar limitado por la descripción específica proporcionada a continuación.
Para lograr el objeto de la presente descripción, un aspecto de la presente descripción se relaciona con el uso de tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, para producir tagatosa.
La tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción puede comprender un polipéptido que tiene una homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 %. Por ejemplo, es evidente que una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene deleción, modificación, sustitución o adición de algunas secuencias cae dentro del alcance de la presente descripción siempre que tenga la homología y muestre la eficacia correspondiente a la de la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Adicionalmente, siempre que una proteína tenga una eficacia correspondiente a la de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción, que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, no excluye una mutación que puede ocurrir por una adición de secuencia sin sentido en dirección 5' o en dirección 3' de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una mutación natural o una mutación silente. Además, una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 pertenece además al alcance de la presente descripción.
Además, la tagatosa-6-fosfato fosfatasa puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de SED ID NO: 2, o la tagatosa-6-fosfato fosfatasa puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una homología con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 %, pero no se limita a ello. Basado en la redundancia de codones, es evidente que las proteínas que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o polinucleótidos que pueden traducirse en proteínas que tienen una homología con las proteínas anteriores, pueden incluirse además en el alcance de la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un grado de coincidencia con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos dada, y la homología puede expresarse como un porcentaje. En la presente descripción, una secuencia con homología que tiene una actividad idéntica o similar a una secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos dada se expresa como "% de homología". La secuencia con homología puede determinarse, por ejemplo, mediante software estándar, específicamente, BLAST 2.0, que calcula los parámetros tales como puntuación, identidad, similitud, etc., o mediante comparación de las secuencias en un experimento de hibridación de Southern en condiciones rigurosas definidas, y definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia en la técnica y puede determinarse mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, J. Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; F.M. Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Como se usa en la presente descripción, el término "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones diseñadas para permitir la hibridación específica entre polinucleótidos. Por ejemplo, estas condiciones se describen específicamente en la literatura (por ejemplo, J. Sambrook y otros, supra).
En la presente descripción, las condiciones rigurosas pueden ajustarse para determinar la homología. Para confirmar la homología entre polinucleótidos, pueden usarse condiciones de hibridación de baja rigurosidad, correspondientes a un valor de Tm de 55 °C. Por ejemplo, pueden usarse condiciones de SSC 5X, SDS al 0,1 %, leche al 0,25 % y sin formamida; o formamida al 30 %, SSC 5X y SDS al 0,5 %. Las condiciones de hibridación de rigurosidad suave corresponden a valores altos de Tm; por ejemplo, puede usar formamida al 40% y SSC 5X o 6X. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad corresponden a los valores más altos de Tm; por ejemplo, puede usarse formamida al 50% y SSC 5X o 6X, pero las condiciones de hibridación no se limitan a los ejemplos anteriores.
La hibridación requiere que dos ácidos nucleicos tengan secuencias complementarias, aunque los apareamientos erróneos entre bases son posibles en dependencia de la rigurosidad de la hibridación. El término "complementario" se usa para describir la relación entre las bases de nucleótidos que pueden hibridar entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por tanto, la presente descripción también puede incluir secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares así como fragmentos de ácido nucleico aislados complementarios a la secuencia completa.
Específicamente, el polinucleótido que tiene homología puede detectarse mediante el uso de condiciones de hibridación que incluyen una etapa de hibridación a un valor de Tm de 55 °C y el uso de las condiciones descritas anteriormente. Además, el valor de Tm puede ser, pero no se limita a, 60 °C, 63 °C, o 65 °C. Los expertos en la técnica pueden ajustar apropiadamente el valor de Tm de acuerdo con su propósito.
La rigurosidad apropiada para la hibridación de los polinucleótidos depende de la longitud y el grado de complementariedad de los polinucleótidos, y las variables se conocen bien en la técnica. A medida que aumenta la similitud u homología entre los dos nucleótidos, aumenta el valor de Tm para los híbridos de los polinucleótidos que tienen tal secuencia. La estabilidad relativa para la hibridación de los polinucleótidos (correspondiente a un valor de Tm superior) disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. La fórmula de cálculo de los valores de Tm para híbridos, cuya longitud es superior a 100 nucleótidos, está publicada en la técnica (Sambrook y otros, supra, 9.50-9.51). Para la hibridación con polinucleótidos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición del apareamiento erróneo puede ser más importante, y la longitud de los oligonucleótidos puede determinar la especificidad de estos (Sambrook y otros, supra, 11.7-11.8).
Específicamente, los polinucleótidos pueden detectarse mediante el uso de las siguientes condiciones de hibridación: 1) una etapa de hibridación con una concentración de sal inferior a 500 mM y una temperatura de al menos 37 °C; y una etapa de lavado a por lo menos 63 °C con 2X SSPE; 2) una etapa de hibridación con una concentración de sal inferior a 200 mM y una temperatura de al menos 37 °C; o 3) ambas etapas de hibridación y lavado a 63°C con 2X SSPE.
La longitud del ácido nucleico de hibridación puede ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente 10 nucleótidos, 15 nucleótidos, 20 nucleótidos o al menos 30 nucleótidos. Además, los expertos en la técnica pueden ajustar la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado según sea necesario en dependencia de factores tales como la longitud de la sonda.
La tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción puede ser una enzima derivada de Thermotoga sp., y específicamente puede ser una enzima derivada de Thermotoga neapolitana, pero no se limita a ella.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un transformante que comprende el ácido nucleico que codifica la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción para su uso en la producción de tagatosa.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a un proceso para introducir un vector en una célula huésped que incluye un ácido nucleico que codifica una proteína diana, lo que permite, de esta manera, la expresión de la proteína codificada por el ácido nucleico en la célula huésped. Para el ácido nucleico transformado, no importa si el ácido nucleico transformado se inserta en el cromosoma de una célula huésped y se ubica allí, o si se ubica fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped, y se incluyen ambos casos. Adicionalmente, el ácido nucleico incluye ADN y ARN, que codifican la proteína diana. El ácido nucleico puede insertarse en cualquier forma siempre que pueda introducirse en una célula huésped y expresarse en ella. Por ejemplo, el ácido nucleico puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es una construcción génica que incluye todos los elementos esenciales necesarios para la autoexpresión. El casete de expresión puede incluir convencionalmente un promotor unido operativamente al ácido nucleico, una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma, y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión capaz de autorreplicarse. Adicionalmente, el ácido nucleico puede introducirse en una célula huésped tal como está y unirse operativamente a una secuencia esencial para su expresión en la célula huésped, pero el ácido nucleico no se limita a esto.
Adicionalmente, como se usa en la presente descripción el término "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia promotora, que inicia y media la transcripción del ácido nucleico que codifica la proteína diana de la presente descripción, y la secuencia génica anterior.
El método de la presente descripción para la transformación del vector incluye cualquier método para introducir un ácido nucleico en una célula y puede llevarse a cabo mediante selección de una técnica estándar adecuada que se conoce en la técnica de acuerdo con la célula huésped. Ejemplos del método pueden incluir electroporación, precipitación con fosfato de calcio (CaPO4), precipitación con cloruro de calcio (CaCh), microinyección, una técnica de polietilenglicol (PEG), una técnica de DEAE-dextrano, una técnica de liposomas catiónicos, una técnica de acetato de litio-DMSO, etc., pero no se limitan a esto.
Como célula huésped, es preferible usar un huésped que tenga una alta eficacia para introducir ADN y una alta eficacia para expresar el a Dn introducido. Por ejemplo, puede ser E. coli, pero no se limita a esta.
Aún otro aspecto más de la presente descripción proporciona el uso de una composición para producir tagatosa, que comprende la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción, un microorganismo que expresa la tagatosa-6-fosfato fosfatasa o un cultivo del microorganismo que expresa la tagatosa-6-fosfato fosfatasa.
La composición para producir tagatosa puede comprender además una enzima involucrada en la vía de producción de tagatosa (ver Figura 1) de la presente descripción, un microorganismo que exprese la enzima involucrada en la vía de producción de tagatosa de la presente descripción, o un cultivo del microorganismo que expresa la enzima implicada en la vía de producción de tagatosa de la presente descripción. Sin embargo, esto es simplemente un ejemplo; es decir, una enzima que debe estar contenida en la composición de la presente descripción para producir tagatosa y un sustrato usado para la producción de tagatosa no están limitados, siempre que la tagatosa pueda producirse mediante el uso de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción.
La composición de la presente descripción para producir tagatosa puede comprender además: (a) (i) almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos, glucosa, glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato, o tagatosa-6-fosfato; (ii) fosfato; (iii) fructosa-6-fosfato-4-epimerasa; (iv) glucosa-6-fosfato isomerasa; (v) fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y/o (vi) a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa o sacarosa fosforilasa, o a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa cualquiera de las enzimas o un cultivo del microorganismo, pero no se limita a esto.
La fosforilasa de almidón/maltodextrina (EC 2.4.1.1) y la a-glucanofosforilasa de la presente descripción pueden incluir cualquier proteína siempre que sean proteínas que estén sujetas a la transferencia de fosforilo desde el fosfato a la glucosa, de esta manera tiene la actividad de producir glucosa-1-fosfato a partir de almidón o maltodextrina. La sacarosa fosforilasa (EC 2.4.1.7) de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que esté sujeta a la transferencia de fosforilo desde el fosfato a la glucosa, de esta manera tiene la actividad de producir glucosa-1-fosfato a partir de sacarosa. La a-amilasa (EC 3.2.1.1), la pululanasa (EC 3.2.1.41), la glucoamilasa (EC 3.2.1.3) y la isoamilasa de la presente descripción, que son enzimas para la sacarificación del almidón, pueden incluir cualquier proteína siempre que sean proteínas que tengan la actividad de convertir almidón o maltodextrina en glucosa. La sacarasa (EC 3.2.1.26) de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga la actividad de convertir sacarosa en glucosa. La fosfoglucomutasa (EC 5.4.2.2) de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga la actividad de convertir glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato. La glucoquinasa puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína capaz de transferir fosfato a glucosa, de manera que tiene la actividad de conversión a glucosa-6-fosfato. Específicamente, la glucoquinasa puede ser una glucoquinasa dependiente de polifosfato, y más específicamente puede ser una glucoquinasa dependiente de polifosfato derivada de Deinococcus geothermalis que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, o puede ser una glucoquinasa dependiente de polifosfato derivada de Anaerolinea thermophila que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8. La glucosa-6-fosfato isomerasa de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga la actividad de convertir glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. La fructosa-6-fosfato-4-epimerasa de la presente descripción puede incluir cualquier proteína siempre que sea una proteína que tenga la actividad de convertir fructosa-6-fosfato en tagatosa-6-fosfato.
La composición de la presente descripción para producir tagatosa puede comprender además un ion o una sal de un metal seleccionado del grupo que consiste en Mg, Mn y Zn. Específicamente, la sal metálica de la presente descripción puede ser una sal de un metal seleccionado del grupo que consiste en MgCh, MgSO4, MnCh, MnSO4, ZnCl2, y ZnSO4.
Aún otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para producir tagatosa, que comprende convertir tagatosa-6-fosfato en tagatosa mediante reacción de la tagatosa-6-fosfato con la tagatosa-6-fosfato fosfatasa de la presente descripción, un microorganismo que expresa la tagatosa-6-fosfato fosfatasa, o un cultivo del microorganismo que expresa la tagatosa-6-fosfato fosfatasa.
El método de producción de la presente descripción puede comprender además convertir fructosa-6-fosfato en tagatosa-6-fosfato mediante reacción de la fructosa-6-fosfato con fructosa-6-fosfato-4-epimerasa, un microorganismo que expresa la fructosa-6-fosfato-4-epimerasa, o un cultivo del microorganismo que expresa la fructosa-6-fosfato-4-epimerasa, antes de convertir la tagatosa-6-fosfato en tagatosa.
Además, el método de producción puede comprender además convertir glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa-6-fosfato con glucosa-6-fosfato isomerasa, un microorganismo que expresa la glucosa-6-fosfato isomerasa o un cultivo del microorganismo que expresa la glucosa-6-fosfato isomerasa, antes de convertir la fructosa-6-fosfato de la presente descripción en tagatosa-6-fosfato.
Además, el método de producción puede comprender además convertir glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa-1-fosfato con fosfoglucomutasa, un microorganismo que expresa la fosfoglucomutasa, o un cultivo del microorganismo que expresa la fosfoglucomutasa, antes de convertir la glucosa-6-fosfato de la presente descripción a fructosa-6-fosfato.
Además, el método de producción puede comprender además convertir glucosa en glucosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa con glucoquinasa, un microorganismo que expresa la glucoquinasa o un cultivo del microorganismo que expresa la glucoquinasa y fosfato, antes de convertir la glucosa-6- fosfato de la presente descripción a fructosa-6-fosfato.
Además, el método de producción puede comprender además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa-1-fosfato mediante reacción del almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos con fosfato y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, o sacarosa fosforilasa; un microorganismo que expresa la a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa o sacarosa fosforilasa; o un cultivo del microorganismo que expresa la a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa o sacarosa fosforilasa, antes de convertir la glucosa-1-fosfato de la presente descripción en glucosa-6-fosfato.
Además, el método de producción puede comprender además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de los mismos en glucosa mediante reacción del almidón, maltodextrina, sacarosa o combinación de estos con a-amilasa, pululanasa, glucoamilasa, sacarasa o isoamilasa; un microorganismo que expresa a-amilasa, pululanasa, glucoamilasa, sacarasa o isoamilasa; o un cultivo del microorganismo que expresa la a-amilasa, la pululanasa, la glucoamilasa, la sacarasa o la isoamilasa, antes de convertir la glucosa de la presente descripción en glucosa-6-fosfato.
El método de producción puede comprender además convertir la glucosa en almidón, maltodextrina o sacarosa mediante reacción de la glucosa con 4-a-glucanotransferasa, un microorganismo que expresa la 4-aglucanotransferasa o un cultivo del microorganismo que expresa la 4-a-glucanotransferasa.
En el método de producción, la "reacción" puede llevarse a cabo a un pH de 5,0 a 8,0, una temperatura de 60 °C a 90 °C y/o durante 1 minuto a 24 horas. Específicamente, la reacción de la presente descripción puede llevarse a cabo a un pH de 6,0 a 8,0, un pH de 6,5 a 8,0 o un pH de 6,5 a 7,5. Además, la reacción de la presente descripción puede llevarse a cabo a una temperatura de 60 °C a 90 °C, de 70 °C a 90 °C o de 75 °C a 85 °C. Además, la reacción de la presente descripción puede llevarse a cabo durante 1 minuto a 12 horas, 1 minuto a 6 horas, 1 minuto a 3 horas, 1 minuto a 1 hora, 5 minutos a 24 horas, 5 minutos a 12 horas, 5 minutos a 6 horas, 5 minutos a 3 horas, 5 minutos a 1 hora, 10 minutos a 24 horas, 10 minutos a 12 horas, 10 minutos a 6 horas, 10 minutos a 3 horas o 10 minutos a 1 hora.
Además, la reacción de la presente descripción puede llevarse a cabo en presencia de un ion o una sal de un metal seleccionado del grupo que consiste en Mg, Mn y Zn. Específicamente, la sal metálica de la presente descripción puede ser una sal de un metal seleccionado del grupo que consiste en MgCh, MgSO4, MnCh, MnSO4, ZnCh, y ZnSO4.
Aún otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para producir tagatosa, que comprende hacer reaccionar almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de los mismos y fosfato con (a) tagatosa-6-fosfato fosfatasa; fructosa-6-fosfato-4-epimerasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y aglucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa cualquiera de las enzimas o un cultivo del microorganismo.
Modo para la Invención
A continuación, la presente descripción se describirá en detalle con modalidades ilustrativas acompañantes. Sin embargo, las modalidades ilustrativas que se describen en la presente descripción son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente descripción.
Ejemplo 1: Preparación del vector de expresión recombinante que contiene el gen de la tagatosa-6-fosfato fosfatasa y el microorganismo transformado
Para descubrir una nueva D-tagatosa-6-fosfato fosfatasa termoestable, se aisló un gen de Thermotoga neapolitana, un microorganismo termófilo, y después se produjeron un vector de expresión recombinante y un microorganismo transformado.
Específicamente, en base a secuencias génicas de Thermotoga neapolitana registradas en Genbank, se seleccionó t6pp, que es un gen que se espera que codifique tagatosa-6-fosfato fosfatasa. Posteriormente, en base a la información de su secuencia de aminoácidos (s Eq ID NO: 1) y secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2), se diseñaron y sintetizaron un cebador directo (SEQ ID NO: 3) y un cebador inverso (SEQ ID NO: 4). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo con los cebadores sintetizados mediante el uso de ADN cromosómico (ADN genómico) de Thermotoga neapolitana como molde. Específicamente, se llevó a cabo la PCR por un total de 25 ciclos en las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos y polimerización a 68 °C por 2 segundos. Los resultantes se insertaron en pET21a (Novagen Inc.), que es un vector plasmídico para la expresión en E. coli, mediante el uso de las enzimas de restricción Ndel y Xhol, y después se construyó un vector de expresión recombinante y se denominó pET21a-CJ_tn_t6pp. El pET21a-CJ_tn_t6pp se transformó en la cepa BL21(DE3) de E. coli mediante un método de transformación convencional (Sambrook y otros, 1989) para preparar un microorganismo transformado en un vector recombinante que incluye la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y esto se designó como E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp.
La cepa E. coli BL21(DE3)/CJ_tn_t6pp se depositó en el Centro de Cultivos Coreanos de Microorganismos (KCCM), que es una autoridad depositaria internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 23 de junio de 2016 y se le asignó el número de acceso KCCM11850P.
Ejemplo 2: Preparación de enzima recombinante
Para preparar una tagatosa fosfatasa recombinante (en lo sucesivo, T6PP), se inoculó E. coli BL21 (DE3)/CJ_tn_t6pp en un tubo de cultivo que contenía 5 mL de medio líquido LB y después se inició un cultivo de inóculo en una incubadora con agitación a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 2,0. La solución de cultivo de inóculo se inoculó en un matraz de cultivo que contenía el medio líquido LB y se llevó a cabo el cultivo principal. Cuando la absorbancia a 600 nm alcanzó 2,0, se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión/producción de T6PP. El cultivo de inóculo y el cultivo principal se llevaron a cabo a una velocidad de agitación de 200 rpm a una temperatura de 37 °C. Una vez finalizado el cultivo principal, la solución de cultivo se centrifugó a 4 °C a 8000* g durante 20 minutos y después se recuperaron las células. Las células recuperadas se lavaron dos veces con un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), se suspendieron en el mismo tampón y después las células se rompieron mediante el uso de un disruptor celular ultrasónico. Los restos celulares se centrifugaron a 4 °C a 13000* g durante 20 minutos y después solo se obtuvo el sobrenadante. La T6PP se purificó del sobrenadante mediante el uso de cromatografía de afinidad con etiquetas de His.
El peso molecular se confirmó mediante análisis SDS-PAGE y, como resultado, se encontró que el peso molecular de la T6PP purificada era de aproximadamente 29 kDa (indicado como "E" en la Figura 2a).
Ejemplo 3: Confirmación de actividad de conversión de T6PP en tagatosa
Para analizar la actividad de conversión de T6PP de tagatosa-6-fosfato en tagatosa, se suspendió tagatosa-6-fosfato (50 mM) en un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y se añadieron T6PP purificada (0,1 unidades/mL) y MgCh (10 mM). Posteriormente, los resultantes se hicieron reaccionar a 70 °C durante 10 minutos, y después los resultantes de la reacción se analizaron con HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo mediante el uso de una columna HPX-87H (Bio-Rad, Inc.) mientras fluía ácido sulfúrico 5 mM en la fase móvil a un régimen de flujo de 0,6 mL/min a 60 °C. Se detectaron tagatosa y tagatosa-6-fosfato mediante un detector de índice de refracción.
Como resultado, se encontró que se producía tagatosa a partir del producto de reacción de T6PP (Figura 3).
Ejemplo 4: Confirmación de actividad de T6PP de acuerdo con el pH, temperatura y adición de ion metálico 4-1. Confirmación de actividad de acuerdo con el pH
Para investigar la influencia del pH en la T6PP, la T6PP purificada (0,1 unidades/mL) se añadió a tagatosa-6-fosfato (50 mM) suspendida en un tampón 50 mM con varios pH (pH de 4,0 a 7,0, citrato de sodio; pH 4,0 a 7,0, acetato de sodio; pH 6,0 a 8,0, fosfato de potasio: pH 7,0 a 9,0, Tris-HCl), y después se hizo reaccionar a 70 °C durante 10 minutos. Posteriormente, la tagatosa se analizó cuantitativamente por HPLC en las mismas condiciones analíticas que en el Ejemplo 3.
Como resultado, se confirmó que T6PP mostró la actividad máxima en el tampón Tris-HCl (especialmente a pH 7,0), y que T6PP mostró un 80 % o más de su actividad en un intervalo de pH muy amplio (5,0 a 8,0) en comparación con la actividad máxima (Figura 4).
4-2. Confirmación de actividad de acuerdo con la temperatura
Para analizar la actividad de T6PP de acuerdo con la temperatura, se añadió la T6PP purificada (0,1 unidades/mL) a tagatosa-6-fosfato (50 mM) suspendida en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), y después se hizo reaccionar a 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C y 90 °C durante 10 minutos. Posteriormente, la tagatosa se analizó cuantitativamente por HPLC en las mismas condiciones analíticas que en el Ejemplo 3.
Como resultado, se confirmó que T6PP mostró una alta actividad entre 70 °C y 90 °C y, en particular, exhibió la actividad máxima a 80 °C (Figura 5).
4-3. Confirmación de actividad de acuerdo con la adición de ion metálico

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Uso de tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, para producir tagatosa.
2. Uso de una composición que comprende tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, para producir tagatosa.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la composición comprende además:
(a) (i) almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos; (ii) fosfato; (iii) fructosa-6-fosfato-4-epimerasa; (iv) glucosa-6-fosfato isomerasa; (v) fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y (vi) aglucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o
(b) un microorganismo que expresa cualquiera de las enzimas o un cultivo del microorganismo.
4. Un método para producir tagatosa, que comprende: convertir tagatosa-6-fosfato en tagatosa mediante reacción de tagatosa-6-fosfato con tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el método comprende además convertir fructosa-6-fosfato en tagatosa-6-fosfato mediante reacción de la fructosa-6-fosfato con fructosa-6-fosfato-4-epimerasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la tagatosa-6-fosfato en tagatosa.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el método comprende además convertir glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa-6-fosfato con glucosa-6-fosfato isomerasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo de el microorganismo, antes de convertir la fructosa-6-fosfato en tagatosa-6-fosfato.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el método comprende además convertir glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa-1-fosfato con fosfoglucomutasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el método comprende además convertir la glucosa en glucosa-6-fosfato mediante reacción de la glucosa con glucoquinasa, un microorganismo que expresa la misma, o un cultivo del microorganismo y fosfato, antes de convertir la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el método comprende además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa-1-fosfato mediante reacción del almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos con fosfato y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa o sacarosa fosforilasa; un microorganismo que expresa las mismas; o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa-1-fosfato en glucosa-6-fosfato.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el método comprende además convertir almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos en glucosa mediante reacción del almidón, la maltodextrina, la sacarosa o una combinación de estos con a-amilasa, pululanasa, glucoamilasa, sacarasa o isoamilasa; un microorganismo que expresa las mismas; o un cultivo del microorganismo, antes de convertir la glucosa en glucosa-6-fosfato.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde la reacción se lleva a cabo a un pH de 5,0 a 8,0, una temperatura de 60 °C a 90 °C y/o durante 1 minuto a 24 horas.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde la reacción se lleva a cabo en presencia de un ion o sal de un metal seleccionado del grupo que consiste en Mg, Mn y Zn.
13. Un método para producir tagatosa, que comprende hacer reaccionar almidón, maltodextrina, sacarosa o una combinación de estos y fosfato con (a) una tagatosa-6-fosfato fosfatasa que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; fructosa-6-fosfato-4-epimerasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; fosfoglucomutasa o glucoquinasa; y a-glucanofosforilasa, almidón fosforilasa, maltodextrina fosforilasa, sacarosa fosforilasa, a-amilasa, pululanasa, isoamilasa, glucoamilasa o sacarasa; o (b) un microorganismo que expresa cualquiera de las enzimas o un cultivo del microorganismo.
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