ES2913337T3 - Uso de un reactivo para la lisis de eritrocitos, así como procedimientos y kits relacionados con el mismo - Google Patents

Abstract

Uso de un reactivo para la lisis de eritrocitos, siendo el reactivo una solución acuosa que comprende o que consiste en HEPES (ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperacinetanosulfónico), NH4+/NH3, un agente quelante, y opcionalmente CO32-/HCO3- en el que la concentración final durante la lisis de eritrocitos está en el intervalo de - desde 2,5 mmol/l a 12 mmol/l de HEPES, - desde 60 mmol/l a 120 mmol/l de NH4+/NH3, - desde 0,04 mmol/l a 0,8 mmol/l de agente quelante, y - desde 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de CO32-/HCO3-, si está presente, en el que el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en EGTA (ácido etilenglicol-tetraacético), BAPTA (ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético) DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), EDTA (tetraacetato de etilendiamina) y NTA (N,N-bis(carboximetil)glicina).

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de un reactivo para la Iísís de eritrocitos, así como procedimientos y kits relacionados con el mismo

La presente divulgación se refiere al uso de un reactivo para la lisis de eritrocitos y un procedimiento de lisado de eritrocitos.

Los procedimientos de diagnóstico y análisis normalmente tienen como objetivo ser mínimamente invasivos, técnicamente sólidos y universalmente aplicables. El análisis de sangre se ha usado como herramienta de diagnóstico y análisis durante muchos años, ya que la sangre es obtenible sin dificultad y el análisis de sus componentes normalmente es relativamente fácil y automatizable.

La sangre está compuesta de varios tipos diferentes de células y otros compuestos, incluyendo diversas sales y determinadas proteínas. En vertebrados, la sangre está compuesta esencialmente de glóbulos sanguíneos suspendidos en plasma sanguíneo. El plasma, que constituye un 55 % del fluido sanguíneo, contiene proteínas disipadas, glucosa, iones minerales, hormonas, dióxido de carbono (siendo el plasma el medio principal para el transporte de productos de excreción) y Ios propios glóbulos sanguíneos. Los glóbulos sanguíneos son principalmente glóbulos rojos (también llamados RBC o eritrocitos), glóbulos blancos (también llamados WBC o leucocitos) y plaquetas (trombocitos). Las células más abundantes en sangre de vertebrados son Ios glóbulos rojos. Los seres humanos tienen aproximadamente de 4 a 6 millones de eritrocitos por microlitro de sangre, mientras que existen aproximadamente 4000-11.000 glóbulos blancos y aproximadamente 150.000-400.000 plaquetas en cada microlitro de sangre humana. Los eritrocitos son responsables principalmente del transporte de gases respiratorios. Los leucocitos son células del sistema inmunitario y se encuentran en todo el cuerpo, incluyendo la sangre y el sistema linfático. Los trombocitos circulan en la sangre de mamíferos y están implicados en la hemostasia, dando lugar a la formación de coágulos sanguíneos.

Para analizar componentes, en particular componentes celulares, de la sangre distintos de eritrocitos, es deseable retirar Ios eritrocitos, lo que no es fácil debido a su alto número. Para esto, se ha usado la hemólisis, es decir, la lisis o rotura de eritrocitos.

Se han desarrollado muchos procedimientos y protocolos para la lisis de eritrocitos, de Ios que algunos se detallan a continuación:

El cloruro de amonio se describió como una sal penetrante que permite la lisis de eritrocitos en sangre completa. El tampón de lisis de cloruro de amonio clásico contiene NH4C1 150 mM, KHCO3 1 mM y EDTA 0,1 mM. Los eritrocitos se pueden agotar cuantitativamente usando este tampón, pero también se pierde alrededor de un 30 % o más de leucocitos (véanse, por ejemplo, Meryman H. Red Cell Structure and Function 1969; 352-367, Sass M. Am J Physiol. 1979;236(5):C238-43, claus R. et al. Folia Hematol. 1985; 5: 683-688, Terstappen et al. J Immun Methods. 1989: 103-112).

El documento US 7.678.583 B2 divulga un procedimiento para lisar eritrocitos cuantitativamente usando un tampón con Ios componentes centrales clorhidrato de pirrolidina o piperidina, hidrogenocarbonato de potasio y anhidrasa carbónica. Se describe que esta composición de tampón de lisis da como resultado una tasa de descubrimiento de leucocitos mayor con un agotamiento de eritrocitos cuantitativo en comparación con el procedimiento de lisis con cloruro de amonio.

El documento US 5.840.515 describe un procedimiento para aislar y diferenciar leucocitos en una muestra de sangre por lisis de eritrocitos con una solución con una osmolalidad y pH que se han ajustado para mantener la integridad de Ios leucocitos y que contiene saponina e inhibición de la lisis diluyendo la muestra con una solución que tiene una composición sustancialmente composición similar pero que no contiene saponina. El reactivo está compuesto de 0,1 a 2 g/l de saponina y tiene una osmolalidad entre 200 y 400 miliosmoles y un pH de entre 6 y 8.

El documento DE 102008032501 A l se refiere a un reactivo de lisis general que se puede usar para el análisis de ácido nucleico y que contiene un tensioactivo no iónico y un polímero que actúa como agente espesante. Para analizar Ios ácidos nucleicos en leucocitos, Ios eritrocitos se agotan usando la siguiente composición de tampón de lisis: sacarosa 320 mM, Tris/Cl 50 mM pH 7,5, MgCh 5 mM, Tritón X-100 al 1 %.

El documento US 5.155.044 divulga un sistema de reactivó lítico para el tratamiento químico selectivo de sangre completa que comprende una solución acuosa ácida que consiste esencialmente en un diluyente, un reactivó lítico seleccionado del grupo que consiste en ácido fórmico, ácido acético y sus respectivas mezclas; siendo suficiente la concentración relativa del reactivó lítico en dicha solución acuosa ácida para efectuar el reparto de una muestra de sangre completa en una fracción de glóbulos rojos lisada y una fracción de leucocitos esencialmente intacta en un estado tal que permite el análisis diferencial de al menos cinco subpoblaciones de dichos leucocitos; y una cantidad de saponina eficaz para clarificación en el intervalo de aproximadamente un 0,05 a aproximadamente un 0,2 por ciento.

El documento EP 0795751 A2 enseña que Ios leucocitos se pueden separar de forma rápida y selectiva de Ios eritrocitos sometiendo una muestra de sangre completa a una serie de etapas incluyendo lisar Ios eritrocitos y lavar Ios leucocitos restantes con una solución que contiene cloruro de amonio y un ácido carboxílico o un carboxilato de metal.

El documento US 2006/172300 A l un procedimiento para identificar la presencia de proteína/fragmento específico de BBB en células endoteliales de capilares cerebrales, que comprende, entre otros, tratar células endoteliales digeridas enzimáticamente de capilares cerebrales con un tampón de lisis que destruye esencialmente eritrocitos presentes y células apoptóticas y mantiene al menos un 70 % de las células endoteliales de capilares cerebrales en forma vital. El tampón hipotónico usado debe tener una fuerza iónica de 0,1-0,2 M, contener aniones y cationes monovalentes y bivalentes, respectivamente, y un tampón en un intervalo de pH de 7,0-8,0.

Todos estos protocolos de lisis de eritrocitos descritos y también variaciones de protocolos más allá de Ios citados anteriormente (lisis hipotónica, lisis dependiente de detergente, lisis basada en amonio, lisis basada en ácido acético) se han sometido a prueba y tienen la desventaja de que al menos un 20-30 % de Ios leucocitos se pierden durante el procedimiento de lisis de eritrocitos (véase el ejemplo 7). Por lo tanto, estos procedimientos no son apropiados para un procedimiento de agotamiento de eritrocitos cuantitativo combinado con una tasa de recuperación de leucocitos alta, por ejemplo, de al menos un 90 %.

En consecuencia, un objetivo de la presente divulgación fue proporcionar medios y procedimientos para el agotamiento de eritrocitos cuantitativo combinado con una tasa de recuperación de leucocitos viable alta. Preferentemente, Ios medios y procedimientos no deberían influir en la morfología de leucocitos. Adicionalmente, se deben evitar las reacciones que tienen una influencia negativa sobre la viabilidad celular o sobre experimentos posteriores a lisis de eritrocitos (por ejemplo, PCR o FACS o reacciones enzimáticas).

Sorprendentemente, el objetivo se resolvió por un nuevo reactivo que se va a usar en la lisis de eritrocitos, siendo el reactivo una solución acuosa que comprende o que consiste en HEPES (ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperacinetanosulfónico), NH4+/NH3, un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en EGTA (ácido etilenglicol-tetraacético), BAPTA (ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético) DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), EDTA (tetraacetato de etilendiamina) y NTA (N,N-bis(carboximetil)glicina) y opcionalmente C032"/C03", en el que la concentración final durante la lisis de eritrocitos está en el intervalo de

- desde 2,5 mmol/l a 12 mmol/l de HEPES,

- desde 60 mmol/l a 120 mmol/l de NH4-/NH3,

- desde 0,04 mmol/l a 0,8 mmol/l de agente quelante, y

- desde 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de C032-/C03-, si está presente.

El tampón de lisis recientemente desarrollado se basa en cloruro de amonio como principal componente de lisis. Pero en comparación con Ios tampones de cloruro de amonio establecidos, la concentración de cloruro de amonio es menor en el tampón desarrollado y se añaden otros componentes de tampón, tales como HEPES, un agente quelante y KHCO3, a la mezcla de reactivo. Esta composición de tampón permite el agotamiento de eritrocitos cuantitativo con una tasa de recuperación de leucocitos alta, preferentemente de al menos un 90 % (véase el ejemplo 4) en contraste con Ios procedimientos establecidos, en Ios que la tasa de recuperación de leucocitos fue considerablemente menor (véanse Ios ejemplos 1 y 2). Adicionalmente, Ios componentes sospechosos de tener efectos adversos sobre la viabilidad celular o Ios experimentos posteriores a lisis de eritrocitos no están presentes.

En comparación con Ios protocolos de lisis de cloruro de amonio en general usados, Ios medios y procedimientos desarrollados permiten mantener un valor de pH fisiológicamente estable de entre 6,8 y 7,4 durante el procedimiento de lisis (véase el ejemplo 6). Cuando se usan Ios procedimientos de tampón de lisis de cloruro de amonio comunes, se mide un valor de pH de alrededor de 8,0. En dichas condiciones, también mueren glóbulos sanguíneos no eritrocíticos debido al valor de pH no fisiológico.

Sin embargo, el aislamiento de leucocitos a partir de sangre completa por un procedimiento de agotamiento de eritrocitos es una etapa importante para estudiar múltiples fenómenos de glóbulos sanguíneos y relacionados con sangre fisiológicos y fisiopatológicos, por ejemplo, evaluaciones inmunológicas, tales como determinación del estado inflamatorio e inmunitario; enfoques oncológicos, tales como investigación de diferentes tipos de leucemia o detección de células tumorales circulantes en sangre; enfoques cardiovasculares, tales como investigación de células endoteliales circulantes en sangre; enfoques de seguridad no clínicos; o enfoques de citometría de flujo, tales como Ios basados en todas las aplicaciones fisiológicas y fisiopatológicas para estudiar células nucleadas en sangre (leucocitos y otros).

En consecuencia, en un primer aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un reactivo para la lisis de eritrocitos, siendo el reactivo una solución acuosa que comprende o que consiste en HEPES (ácido (4-(2 hidrox¡et¡l)-1-p¡perac¡netanosulfónico), NH4+/NH3 y un agente quelante opcionalmente CÜ32'/CÜ3', en el que la concentración final durante la lisis de eritrocitos está en el intervalo de

- desde 2,5 mmol/l a 12 mmol/l de HEPES,

- desde 60 mmol/l a 120 mmol/l de NH4+/NH3, y

- desde 0,04 mmol/l a 0,8 mmol/l de agente quelante,

en el que el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en EGTA (ácido etilenglicol-tetraacético), BAPTA (ácido 1,2-bis(o-aminofenox¡)etano-N,N,N',N-tetraacét¡co), DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), EDTA (tetraacetato de etilendiamina) y NTA (N,N-bis(carboximet¡l)gl¡c¡na).

El reactivo puede comprender además de 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de CÜ32'/CÜ3'.

Como se detalla anteriormente, el reactivo se puede usar para la lisis de eritrocitos. De acuerdo con la presente divulgación, el reactivo es una solución acuosa, es decir, una solución a base de agua. El reactivo comprende o consiste en los componentes enumerados anteriormente en solución acuosa, lo que quiere decir que la solución acuosa consiste en estos componentes solo (que consisten en) o engloba también al menos otro componente (que comprende).

En un modo de realización específico como se presenta en el presente documento, el reactivo no comprende uno o más o todos de los siguientes agentes: piperidina o sal de la misma, pirrolidina o sal de la misma, anhidrasa carbónica, saponina, un tensioactivo y un polímero que actúa como agente espesante.

Durante la lisis, la concentración final de los componentes enumerados anteriormente es como se define anteriormente. Para su uso en lisis, se puede usar un reactivo preparado que se mezcla con una fuente que comprende eritrocitos. En este caso, la dilución del reactivo se debe tener en cuenta cuando se prepara el reactivo preparado. Si, por ejemplo, se usa sangre o un producto sanguíneo como fuente, se puede añadir el reactivo al mismo (o viceversa), diluyendo por tanto el reactivo. Las diluciones típicas pueden ser de 1:10 a 10:1 (fuente:reactivo), requiriendo por tanto antes de la dilución un reactivo madre de 1,1 veces a 11 veces, respectivamente. Reactivo madre de X veces quiere decir que las concentraciones en los componentes del reactivo antes de la dilución se incrementan en un factor X en relación con las concentraciones finales durante la lisis como se indica en el presente documento.

La lisis de glóbulos rojos normalmente se logra por un mecanismo hallado en la alteración del equilibrio osmótico. Los eritrocitos normalmente tienen forma de discos bicóncavos. En entorno hipotónico, se puede observar la esferización de las células y el posterior incremento de volumen. Cuando la tensión de membrana excede un valor crítico, la membrana se rompe, lisando por tanto los eritrocitos. En consecuencia, la lisis en el presente contexto se refiere a la descomposición de una célula por mecanismos osmóticos que comprometen su integridad.

Un componente del reactivo es HEPES (ácido (4-(2-hidrox¡et¡l)-1-p¡perac¡netanosulfónico), que es un agente tamponador químico orgánico dipolar. HEPES se usa ampliamente en biología, bioquímica, tal como en cultivo celular, en gran parte porque es mejor para mantener el pH fisiológico a pesar de los cambios en la concentración de dióxido de carbono en comparación con otros tampones. La disociación del agua disminuye con la caída de la temperatura, pero las constantes de disociación (pK) de muchos otros tampones no cambian mucho con la temperatura. He PES es como el agua en que su disociación disminuye a medida que disminuye la temperatura. Esto hace que HEPES sea un agente tamponador más eficaz para mantener la estructura y función enzimática a bajas temperaturas. Un tampón es más eficaz cuando el pH es igual al pKa de ese tampón, y lo más eficaz cuando está en el intervalo de una unidad de pH por encima y por debajo de ese valor. HEPES se usa comúnmente para mantener los niveles de pH en medios celulares. En comparación con el sistema tampón de bicarbonato de sodio inorgánico, HEPES es más adecuado para tamponar en el intervalo de pH fisiológico de 7,2-7,6. HEPES es un tampón "bueno", que contiene grupos ionizables tanto positivos como negativos, donde los grupos de amina secundaria y terciaria proporcionan la carga positiva y las cargas negativas se ofrecen por los grupos de ácido sulfónico y carboxílico. Normalmente, se añade HEPES a los medios en concentraciones de 15 mM a 25 mM, sin embargo, en la presente divulgación, la concentración de HEPES es menor.

Otro componente del reactivo es un tampón de amoníaco (NH3)/amonio (NH4+). La concentración final de amoníaco amonio está en el intervalo anterior de desde 60 mmol/l a 120 mmol/l. Normalmente, el tampón se prepara a partir de cloruro de amonio y amoníaco, en el que la proporción de ambos componentes varía dependiendo del pH previsto. El pKa del sistema tampón es de 9,25.

Adicionalmente, el reactivo comprende un agente quelante. Un agente quelante es un agente complejante de iones, lo que reduce sus concentraciones. Normalmente, los iones son iones metálicos, tales como Ca, Mg, Fe, Zn y Cu, pero también se pueden complejar iones no metálicos, tales como P. Al formar complejos solubles en agua estables con iones (metálicos) multivalentes, los agentes quelantes evitan interacciones no deseadas bloqueando la reactividad normal de Ios Iones (metálicos). En la presente Invención, el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en EGTA (ácido etilenglicol-tetraacético), BAPTA (ácido 1,2-bis(o-ammofenoxI)etano-N,N,N',N-tetraacético) DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), EDTA (tetraacetato de etilendiamina) y NTA (N,N-bis(carboximetil)glicina), en el que el reactivo que comprende EDTA como agente quelante representa un modo de realización en particular ventajoso. EDTA es un ejemplo de un agente quelante muy común que tiene átomos de nitrógeno y grupos carboxílicos de cadena corta y se usa como anticoagulante.

Opcionalmente, otro componente del reactivo es un tampón de carbonato (CO32') / hidrogenocarbonato (HCO3'). La concentración final de carbonato hidrogenocarbonato está en el intervalo anterior de desde 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l, si está presente. Normalmente, el tampón se prepara disolviendo sales de carbonato e hidrogenocarbonato, tales como sales de potasio o sodio, en agua, en el que la proporción de carbonato/hidrogenocarbonato varía dependiendo del pH. El pKa de bicarbonato es 6,1, Io que proporciona la mejor capacidad tamponadora a un pH de 5,1-7,1.

En otro modo de realización específico, uno o más componentes como se define anteriormente están presentes en una concentración final durante la IIsIs en el intervalo de

- desde 3 mmol/l a 11 mmol/l de HEPES, preferentemente de 3 mmol/l a 10 mmol/l de HEPES, más preferentemente de 3,5 mmol/l a 4,5 mmol/l de He PES,

- desde 70 mmol/l a 100 mmol/l de NH4+/NH3, preferentemente de 75 mmol/l a 85 mmol/l de NH4+/NH3,

- desde 0,05 mmol/l a 0,5 mmol/l de agente quelante, preferentemente de 0,06 mmol/l a 0,2 mmol/l de agente quelante, más preferentemente de 0,07 mmol/l a 0,1 mmol/l de agente quelante, y/o

- desde 0,3 mmol/l a 0,6 mmol/l de C032'/C03', preferentemente de 0,3 mmol/l a 0,5 mmol/l de C032'/C03', más preferentemente de 0,35 mmol/l a 0,45 mmol/l de C032'/C03', si está presente.

En un modo de realización particular, Ios componentes como se define anteriormente están presentes en una concentración final durante la IIsIs en el intervalo de desde 3 mmol/l a 10 mmol/l de HEPES, de desde 70 mmol/l a 100 mmol/l de NH4+/NH3, de desde 0,05 mmol/l a 0,5 mmol/l de agente quelante y de desde 0,3 mmol/l a 0,6 mmol/l de C032-/C03-.

Aún en otro modo de realización particular, Ios componentes como se define anteriormente de forma ventajosa están presentes en una concentración final durante la IIsIs en el Intervalo de desde 3 mmol/l a 10 mmol/l de HEPES, de desde 75 mmol/l a 85 mmol/l de NH4+/NH3, de desde 0,06 mmol/l a 0,2 mmol/l de agente quelante y de desde 0,3 mmol/l a 0,5 mmol/l de C032'/C03', en particular en el que el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Aún en otro modo de realización particular y con ventaja particular, Ios componentes como se define anteriormente están presentes en una concentración final durante la lisis en el Intervalo de desde 3,5 mmol/l a 4,5 mmol/l de HEPES, de desde 75 mmol/l a 85 mmol/l de NH4+/NH3, de desde 0,07 mmol/l a 0,1 mmol/l de agente quelante y de desde 0,35 mmol/l a 0,45 mmol/l de C032'/C03', en particular en el que el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Aún en otro modo de realización específico, el pH del reactivo está en el Intervalo de desde 6,4 a 7,7, en un modo de realización particular de forma ventajosa el pH del reactivo está en el Intervalo de desde 6,7 a 7,4, aún en otro modo de realización particular y con ventaja particular el pH del reactivo está en el Intervalo de desde 6,8 a 7,3. En química, el pH es una medida de la actividad del Ion hidrógeno (solvatado). El agua pura tiene un pH muy cercano a 7 a 25 °C. Las soluciones con un pH menor que 7 se dice que son ácidas y las soluciones con un pH mayor que 7 son básicas o alcalinas. El pH de la sangre normalmente es ligeramente básico con un valor en el Intervalo de desde pH 7,35 a pH 7,45. En otro modo de realización específico, el pH se mantiene en el Intervalo de desde 6,4 a 7,7, en particular de 6,7 a 7,4, más específicamente de 6,8 a 7,3 durante la IIsIs de eritrocitos, lo que es ventajoso para mantener la viabilidad de las células no eritrocíticas.

En consecuencia, Ios componentes como se define anteriormente están presentes en una concentración final durante la IIsIs en el Intervalo de desde 3 mmol/l a 10 mmol/l de HEPES, de desde 70 mmol/l a 100 mmol/l de NH4+/NH3, de desde 0,05 mmol/l a 0,5 mmol/l de agente quelante y de desde 0,3 mmol/l a 0,6 mmol/l de CO32' /CO3' y el pH del reactivo está en el Intervalo de 6,4 a 7,7, preferentemente de 6,7 a 7,4, más preferentemente de 6,8 a 7,3.

Todavía más específicamente, Ios componentes como se define anteriormente están presentes de forma ventajosa en una concentración final durante la IIsIs en el Intervalo de desde 3 mmol/l a 10 mmol/l de HEPES, de desde 75 mmol/l a 85 mmol/l de NH4+/NH3, de desde 0,06 mmol/l a 0,2 mmol/l de agente quelante y de desde 0,3 mmol/l a 0,5 mmol/l de C032'/C03' y el pH del reactivo está en el Intervalo de 6,4 a 7,7, en particular de 6,7 a 7,4, más específicamente de 6,8 a 7,3, en particular en el que el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

En un modo de realización altamente específico y con ventaja particular, Ios componentes como se define anteriormente están presentes en una concentración final durante la lisis en el intervalo de desde 3,5 mmol/l a 4,5 mmol/l de HEPES, de desde 75 mmol/l a 85 mmol/l de NH4+/NH3, de desde 0,07 mmol/l a 0,1 mmol/l de agente quelante y de desde 0,35 mmol/l a 0,45 mmol/l de C032-/C03- y el pH del reactivo está en el intervalo de 6,4 a 7,7, en particular de 6,7 a 7,4, más específicamente de 6,8 a 7,3, en particular en el que el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

Aún en otro modo de realización específico, el reactivo se usa en el aislamiento de células distintas de eritrocitos (también denominadas células no eritrocíticas) de una muestra que comprende eritrocitos, en particular de una muestra de sangre o un producto sanguíneo.

Para proporcionar una muestra de sangre, se debe extraer sangre de un sujeto. En particular para mamíferos, esto se puede realizar convenientemente extrayendo sangre venosa del sujeto. Se puede obtener sangre venosa por venopunción del mamífero, en el que normalmente solo una pequeña muestra, por ejemplo, una muestra de 3 ml a 10 ml, de sangre es adecuada para el uso en la presente divulgación. La sangre se obtiene más comúnmente de la vena mediana del codo, en la parte anterior del antebrazo (el lado dentro del pliegue del codo). Esta vena se encuentra cerca de la superficie de la piel y no tiene una gran inervación. La mayor parte de la extracción de sangre de sangre en Ios países industrializados se realiza con un sistema de tubo de vacío que consiste en una cubeta plástica, una aguja hipodérmica y un tubo de vacío. Sin embargo, también se puede obtener sangre por cualquier otro procedimiento conocido para el experto en la técnica.

Después del aislamiento de la sangre, la sangre se puede procesar, por ejemplo, añadiendo un anticoagulante. Después de haberse obtenido y opcionalmente procesado además, la sangre se puede usar de inmediato para análisis o almacenarse como es conocido para el experto en la técnica. El rasgo característico "producto sanguíneo" en la presente divulgación se refiere a un producto derivado de la sangre, en el que la sangre se ha procesado para obtener el producto sanguíneo. Los ejemplos incluyen sangre con aditivos (tales como heparina), concentrados de glóbulos rojos, concentrados de eritrocitos, concentrados de trombocitos, concentrados de granulocitos, preparaciones de células madre sanguíneas, etc.

En un modo de realización particular, la sangre se aísla como sigue: Se extrae sangre de un sujeto y se recoge en un recipiente previsto para la extracción de sangre. Esos recipientes están disponibles comercialmente y se pueden usar en el procedimiento como se presenta en el presente documento. Normalmente, comprenden un anticoagulante tal como EDTA. Un recipiente ejemplar es un tubo al vacío con EDTA habitual (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Para estabilizar las membranas celulares de Ios WBC, se pueden añadir agentes adecuados conocidos para el experto en la técnica. Además, puede estar presente una solución tampón adaptada para la estabilización en condiciones neutras. Las muestras de sangre se pueden invertir suavemente. Después de esto, la muestra se puede usar o almacenar de inmediato hasta que se use.

Las fuentes alternativas para mezclas de células incluyendo glóbulos rojos incluyen muestras de biopsia, médula ósea, orina, heces o líquidos corporales con glóbulos rojos como "contaminante".

En un modo de realización específico, Ios eritrocitos o la muestra que contiene eritrocitos se obtienen de un mamífero, en particular de un animal doméstico mamífero, tal como gato, perro, conejo o cobaya, o de un animal de granja, tal como vaca, caballo, cabra, oveja, cerdo o camello. En un modo de realización muy específico, Ios eritrocitos o la muestra que contiene eritrocitos se obtienen de un ser humano.

Como se detalla anteriormente, el reactivo se puede usar en la detección, concentración o aislamiento de células distintas de eritrocitos a partir de una muestra que comprende eritrocitos. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada, pero una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre, por ejemplo, una muestra de sangre procesada o un producto sanguíneo, es un modo de realización específico que se puede usar con ventaja particular. El reactivo se puede usar para detectar, concentrar o aislar células distintas de eritrocitos a partir de una mezcla de células que comprenden eritrocitos. El reactivo se usa para la lisis de eritrocitos, incrementando por tanto el porcentaje de otras células en la muestra. En consecuencia, las células distintas de eritrocitos se concentran por la lisis. Se pueden combinar otras etapas de detección, concentración o aislamiento de células de interés con la lisis, incluyendo centrifugación tal como centrifugación diferencial o centrifugación por gradiente, mareaje de células de interés y posterior detección o separación de las mismas, separación celular, por ejemplo, por fAc S, etcétera. Los procedimientos adecuados para detección, concentración o aislamiento de células de interés son bien conocidos para el experto en la técnica.

Evidentemente, el tipo de células de interés depende de la fuente elegida (sangre, etc., véase anteriormente) y la aplicación o campo técnico previsto. En general, la célula de interés puede ser cualquier célula presente en la fuente o muestra elegida. En un modo de realización específico, las células distintas de eritrocitos son leucocitos, linfoeitos B, linfoeitos T, eosinófilos, células endoteliales circulantes o células cancerosas tales como células tumorales circulantes, en particular células tumorales circulantes o mieroémbolos tumorales circulantes, que son de particular relevancia para propósitos de diagnóstico.

La presente divulgación es en particular útil para la detección o aislamiento de células raras, en particular en la que en la población la proporción de células raras con respecto a células totales es como máximo de un 5 %, preferentemente como máximo de un 1 %, en especial como máximo de un 0,1 %, tal como como máximo de un 0,01 %. El procedimiento es en particular útil con células raras, ya que el procedimiento incrementa el porcentaje de estas células considerablemente, lo que facilita su detección o aislamiento. Las células raras pueden ser en particular células tumorales circulantes (CTC) y microémbolos tumorales circulantes (CTM) en la sangre de un paciente. El desafío técnico en este campo consiste en encontrar células tumorales 'raras' (unas pocas CTC mezcladas con los aproximadamente 10 millones de leucocitos y 5 mil millones de eritrocitos en 1 ml de sangre) y poder distinguirlas de otras células, en particular células no tumorales epiteliales y leucocitos. Sin embargo, estas células se pueden detectar mucho antes de que el propio tumor sea detectable por medios estándar (y por lo tanto una primera herramienta de diagnóstico), lo que evidentemente es muy ventajoso en el tratamiento de las enfermedades cancerosas.

Evidentemente, la presente divulgación es de particular interés para el aislamiento o detección de células indicativas de un estado particular, tal como una enfermedad. En consecuencia, las células que se van a detectar o aislar pueden ser, por ejemplo, células cardiovasculares o células vasculares o células vasculares liberadas por un proceso inflamatorio, células madre (por ejemplo, células madre cancerosas), células indicativas de una enfermedad residual mínima, células cancerosas (por ejemplo, células de leucemia) o células bacterianas, por ejemplo, indicativas de una infección. En este contexto, el procedimiento se puede usar para genotipado, diagnóstico, pronóstico, seguimiento del tratamiento, etc.

Las células cancerosas se caracterizan por marcadores particulares. Los ejemplos que se pueden mencionar son: en especial oncogenes y genes supresores de tumores tales como p53, genes de la familia ras erb-B2, c-myc, mdm2, c-fos, DPC4, Fa P, nm23, RET, WT1, y similares, LOH, por ejemplo con respecto a p53, DCC, APC, Rb y similares y también BRCA1 y BRCA2 en tumores hereditarios, inestabilidad de microsatélites de MSH2, MLH1, WT1 y similares; también ARN tumorales tales como CEA, citoqueratinas, por ejemplo, CK20, BCL-2, MUC1, en particular variantes de empalme específicas de tumor de los mismos, MAGE3, Muc18, tirosinasa, PSA, PSM, BA46, Mage-1 y similares, o también ARN morfogénicos tales como maspina, hCG, GIP, motilina, hTG, SCCA-1, AR, ER, PR, diversas hormonas y similares; además, en especial ARN y proteínas que afectan el perfil metastatizante, es decir, la expresión de moléculas involucradas en angiogénesis, motilidad, adhesión y degradación de matriz tales como bFGF, bFGF-R, VEGF, VEGF-R, tales como VEGF-R1 o VEGF -R2, E-cadherina, integrinas, selectinas, MMP, TIMP, SF, SF-R y similares, el perfil de ciclo celular o perfil de proliferación, tal como ciclinas (por ejemplo, proporción de expresión de ciclinas D, E y B), Ki67, p120, p21, PCNA y similares, o el perfil de apoptosis, tal como FAS (L+R), TNF (L+R), perforina, granzima B, BAX, bcl-2, caspasa 3 y similares. En consecuencia, los eritrocitos se pueden retirar de una muestra para incrementar la concentración de otras células y permitir la detección de los marcadores anteriores.

En un segundo aspecto, la presente divulgación se refiere a un procedimiento de lisado de eritrocitos, comprendiendo el procedimiento

a) proporcionar una muestra que comprende eritrocitos; e

b) incubar la muestra con el reactivo para la lisis de eritrocitos, siendo el reactivo una solución acuosa que comprende o que consiste en HEPES, NH4+/NH3 y un agente quelante, en el que la concentración final durante la lisis de eritrocitos está en el intervalo de

- desde 2,5 mmol/l a 12 mmol/l de HEPES,

- desde 60 mmol/l a 120 mmol/l de NH4+/NH3, y

- desde 0,04 mmol/l a 0,8 mmol/l de agente quelante,

en el que el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en EGTA (ácido etilenglicol-tetraacético), BAPTA (ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético) DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), EDTA (tetraacetato de etilendiamina) y NTA (N,N-bis(carboximetil)glicina).

El reactivo puede comprender además de 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de C032'/C03'.

El procedimiento puede comprender además después de la etapa b) opcionalmente retirar los residuos de eritrocitos.

Con respecto a los términos usados en el segundo aspecto de la presente divulgación, se hace referencia a los términos, ejemplos y modos de realización específicos usados en el primer aspecto de la presente divulgación, que también son aplicables al segundo aspecto de la presente divulgación.

Como primera etapa del procedimiento como se presenta en el presente documento, se proporciona una muestra que comprende eritrocitos. Los detalles sobre una muestra adecuada se dan anteriormente. La muestra puede estar contenida en un recipiente, en el que el recipiente es un tubo, tal como un tubo de centrífuga o tubo de centrifugación, Jeringuillas, cartucho, cámara, placa de múltiples pocilios, o tubo de ensayo, o combinaciones de los mismos. La muestra se puede pretratar para soportar la lisis de eritrocitos o detección o aislamiento de otras células. El tamaño/volumen de la muestra puede variar y se puede elegir dependiendo del procedimiento que se va a llevar a cabo. Si, por ejemplo, el procedimiento se usa para el aislamiento de células distintas de eritrocitos, el tamaño de muestra dependerá de la frecuencia de estas células.

En una segunda etapa, la muestra se incuba con el reactivo como se define anteriormente, lisando de este modo eritrocitos. Para esto, la muestra se puede añadir al reactivo o el reactivo se puede añadir a la muestra. El resultado del contacto es una solución acuosa. El contacto es durante un tiempo y en condiciones adecuadas para permitir la lisis de los eritrocitos.

Las condiciones adecuadas incluyen temperatura y solución apropiadas para evitar, por ejemplo, la muerte de células distintas de eritrocitos o la desnaturalización de proteínas de interés, en la medida en que estén presentes y se requieran. Las condiciones adecuadas dependerán del diseño particular del procedimiento y la muestra elegida y el experto en la técnica podrá seleccionar las mismas en base a su conocimiento general. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferentemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del diseño de procedimiento, volumen de solución, concentraciones y similares. Normalmente, los procedimientos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque se pueden realizar en un intervalo de temperaturas, tales como de 20 °C a 40 °C o de 22 °C a 37 °C. Durante el contacto, la mezcla de reactivo y muestra se puede agitar o mezclar en vórtex o se puede dejar reposar.

Como etapa tercera y opcional, los residuos de eritrocitos se pueden retirar, es decir, separarse del resto, por ejemplo, células de interés. Típicamente, los residuos celulares se retiran por técnicas que implican diferencias en características físicas de residuos y resto, tales como tiempo de sedimentación y tamaño. Los procedimientos típicos incluyen centrifugación y filtración. Los procedimientos para la retirada de residuos de eritrocitos son bien conocidos en la técnica.

En un modo de realización particular como se presenta en el presente documento, la segunda y/o tercera etapa se puede repetir. En consecuencia, el procedimiento puede comprender una o más (por ejemplo, dos o tres) etapas de lisis (es decir, etapa b)) y/o una o más (por ejemplo, dos o tres) etapas de lavado (es decir, etapa c)). En un modo de realización muy específico, el procedimiento comprende dos veces la etapa b) y una, dos o tres veces la etapa c).

Aún en otro modo de realización específico, la muestra es una muestra de sangre o una muestra que comprende eritrocitos y otras células, en particular glóbulos blancos y/o células tumorales circulantes (véanse también los detalles anteriores).

Aún en otro modo de realización específico, el procedimiento como se presenta en el presente documento comprende además

c) detectar o aislar células distintas de eritrocitos a partir de una muestra que comprende eritrocitos, en particular a partir de una muestra de sangre, como se describe anteriormente.

Para más detalles sobre detección o aislamiento, véase anteriormente.

Preferentemente, las células distintas de eritrocitos son glóbulos blancos o células tumorales circulantes, en particular células tumorales circulantes (véanse también detalles anteriormente).

Preferentemente, la incubación de la etapa b) es como máximo de 30 min, preferentemente como máximo de 20 min, más preferentemente como máximo de 10 min, en especial a temperatura ambiente.

También se divulga, pero no es parte de la invención,

un kit para el aislamiento de glóbulos blancos a partir de una muestra que comprende eritrocitos, que comprende

- un reactivo para la lisis de eritrocitos como se define anteriormente en el contexto de los usos y procedimientos como se divulga en el presente documento; y

- un reactivo para retirar residuos de eritrocitos; y

- opcionalmente, instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los procedimientos como se divulga en el presente documento.

Con respecto a la presente divulgación, se hace referencia a Ios términos, ejemplos y modos de realización específicos usados en el primer y segundo aspecto de la presente divulgación, que también son aplicables al tercer aspecto de la presente divulgación.

El reactivo para retirar residuos de eritrocitos puede ser solución salina tamponada con fosfato (PBS) que comprende un agente quelante, en especial en el intervalo de 0,1 mmol/l a 0,5 mmol/l, preferentemente en el intervalo de 0,2 mmol/l a 0,4 mmol/l, más preferentemente de 0,25 a 0,35 mmol/l, y/o en especial en el que el agente quelante es EDTA.

PBS es una solución tampón usada comúnmente en el campo biológico, bioquímico y médico. Es una solución salina a base de agua que comprende cloruro de sodio, fosfato de sodio y, en algunas formulaciones, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Los grupos fosfato del tampón ayudan a mantener un pH constante. La osmolaridad y las concentraciones de iones de la solución normalmente coinciden con las del cuerpo humano (isotónicas). También se usa PBS con EDTA para separar las células unidas y agrupadas. Se pueden añadir metales divalentes tales como cinc para apoyar la precipitación. Existen muchas preparaciones diferentes de PBS. Algunas formulaciones no contienen potasio, mientras que otras contienen calcio o magnesio. En general, PBS comprende Ios siguientes componentes (mmol/l): NaCI (137), KCl (2,7), Na2HP04 (10), KH2PO4 (2,0). El pH es normalmente de aproximadamente 7,4. Si se usa con células, la solución se puede distribuir en alícuotas y esterilizar en autoclave (20 min, 121 °C, ciclo líquido). La esterilización puede no ser necesaria dependiendo de su uso. La PBS se puede almacenar a temperatura ambiente. Sin embargo, las soluciones madre concentradas pueden precipitar cuando se enfrían y se deben mantener a temperatura ambiente hasta que el precipitado se haya disuelto por completo antes de su uso. En el contexto de la presente divulgación, PBS comprende (mmol/l), por ejemplo, NaCI (138), KCl (2,7), Na2HP04 (8), KH2PO4 (1,5) y tiene un pH de 7,0 a 7,6, preferentemente de 7,2 a 7,4.

La terminología usada en el presente documento es para el propósito de describir solo modos de realización particulares y no pretende limitar el alcance de la presente divulgación. Las palabras "comprender", "contener" y "englobar" se deben interpretar de forma inclusiva en lugar de exclusiva.

A menos que se defina de otro modo, todos Ios términos técnicos y científicos y cualquier acrónimo usado en el presente documento tienen Ios mismos significados que se entienden comúnmente por un experto en la técnica en el campo de la divulgación. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a Ios descritos en el presente documento se puede usar en la práctica como se presenta en el presente documento, Ios procedimientos y materiales específicos se describen en el presente documento.

La divulgación se ilustra además por Ios siguientes ejemplos, aunque se entenderá que Ios ejemplos se incluyen simplemente con propósitos ilustrativos.

Ejemplos

Para someter a prueba Ios diversos reactivos (denominados tampón de lisis) en la lisis de eritrocitos, manteniendo otras células, se usó el siguiente protocolo:

A menos que se indique de otro modo, una parte de la sangre completa se mezcla con partes del tampón de lisis (como se define a continuación), se incuba durante 10 min a temperatura ambiente y se centrifuga durante 15 min a 300 x g. El sobrenadante se desecha y el sedimento celular se resuspende en cuatro partes del tampón de lisis y se centrifuga durante 15 min a 300 x g. El sobrenadante se desecha y el sedimento celular se resuspende en cuatro partes de PBS que contiene EDTA 0,3 mM y se centrifuga durante 15 min a 300 x g. El sobrenadante se desecha y el sedimento celular se resuspende en una cantidad distinta de PBS que contiene EDTA 0,3 mM.

Ejemplo comparativo 1: lisis de eritrocitos con productos convencionales

En una primera prueba, se sometió a prueba la idoneidad de Ios productos convencionales de acuerdo con el protocolo anterior. Se usaron Ios siguientes productos convencionales EasySep® Red Blood Cell Lysis Buffer (StemCell Technologies, n.0 cat. 20110), HetaSep® (StemCell Technologies, n.0 cat. 07806), Stromatolyser NR Lyse (Sysmex, n.o cat. SNR-200, SNR-210A).

Los resultados se muestran en la siguiente tabla 1:

Tabla 1: Efecto de productos convencionales para lisis de eritrocitos sobre la tasa de recuperación de glóbulos blancos (WBC)

Los resultados anteriores muestran que con productos convencionales un alto porcentaje de glóbulos blancos (WBC) se pierde durante la lisis de eritrocitos, a saber, hasta más de un 50 %.

Ejemplo comparativo 2: lisis de eritrocitos en reactivo sin NH4Cl

En una segunda prueba, se sometió a prueba la idoneidad de los reactivos sin NH4CI de acuerdo con el protocolo anterior. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 2:

Tabla 2: Efecto del reactivo sin NH4CI sobre la recuperación de glóbulos blancos (WBC)

Los resultados anteriores muestran que los tampones sin NH4CI no son adecuados para el uso previsto, ya que una parte considerable de glóbulos blancos (WBC) se pierde durante la lisis de eritrocitos.

Ejemplo comparativo 3: lisis de eritrocitos en diferentes reactivos con NH4CI

En una tercera prueba, se sometió a prueba la idoneidad de diferentes reactivos con NH4CI de acuerdo con el protocolo anterior. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 3:

Tabla 3: Efecto de diferentes reactivos con NH4CI sobre la recuperación de glóbulos blancos (WBC)

Los resultados anteriores muestran que los tampones con NH4CI y HEPES son adecuados para el uso previsto, ya que solo un bajo número de glóbulos blancos (WBC) se pierde durante la lisis de eritrocitos. Adicionalmente, EDTA parece incrementar la recuperación de WBC.

Ejemplo 4 (que comprende tanto ejemplos comparativos como un modo de realización que entra dentro del alcance de la presente invención): lisis de eritrocitos en diferentes reactivos con NH4CI y HEPES

En una cuarta prueba, se sometió a prueba la idoneidad de diferentes reactivos con NH4CI y HEPES de acuerdo con el protocolo anterior. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 4:

Tabla 4: Efecto de diferentes reactivos con NH4CI y HEPES sobre la recuperación de glóbulos blancos (WBC)

*tampón RBCL: tampón de Iísís de glóbulos rojos (Roche Applied Science, n,0 cat, 11814389001): NH4CI 150 mM, KHCO^s 1 mM, 0,1 mM

De nuevo, Ios resultados anteriores muestran que Ios tampones con NH4CI y HEPES son adecuados para el uso previsto, ya que solo un bajo número de glóbulos blancos (WBC) se pierde durante la lisis de eritrocitos, Adicionalmente, EDTA y KHCO3 incrementan la recuperación de WBC, En ausencia de estos, HEPES 10 mM es superior a HEPES 5 mM,

Para el tampón de lisis que consiste en NH4CI 80 mM HEPES 5 mM KHC03 0,5 mM EDTA 0,1 mM (usado con 1 parte de sangre 5 partes de tampón de lisis, 2 x lisis (10 min)), se sometieron a prueba 122 muestras, Un 90,77 ± 3,37 % de WBC presentes antes de la lisis (100,00 ± 3,38 %) se recuperaron después de la lisis, Ejemplo 5: lisis de eritrocitos en diferentes reactivos con NH4CI y HEPES

En una quinta prueba, se sometió a prueba la idoneidad de un reactivo con NH4CI 80 mM Hepes 10 mM EDTA 0,1 mM de acuerdo con el protocolo anterior, Además de la recuperación de WBC y RBC, la viabilidad de WBC recuperados se midió por la prueba de exclusión Trypanblue, Por lo tanto, Ios WBC se han teñido con Trypanblue (Sigma, n,0 cat. T8154-20ML), (suspensión de WBC de dilución: Trypanblue = 1:2) y las células teñidas (células muertas) se han contado usando la cámara de recuento C-Chip (Biochrom, n.o cat. P DHC-N01). Los resultados se muestran en la siguiente tabla 5:

Tabla 5: Efecto del reactivo sobre la recuperación y viabilidad de glóbulos blancos (WBC) y glóbulos rojos (RBC)

____ ___

Los resultados anteriores muestran que, mientras que el número de RBC disminuye drásticamente, el número y la viabilidad de WBC se mantienen a un nivel muy alto, probando la idoneidad del reactivo para la lisis específica de eritrocitos.

Ejemplo 6: lisis de eritrocitos en diferentes reactivos con NH4CI y HEPES

En una sexta prueba, se sometió a prueba la idoneidad de diferentes reactivos con NH4CI y HEPES de acuerdo con el protocolo anterior. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 6:

Tabla 6: Efecto de la composición de reactivo sobre la recuperación de glóbulos blancos (WBC) y el valor de pH después de la lisis

Se sometieron a prueba diversos tampones con NH4CI de 80 a 120 mmol HEPES de 5 mM a 10 mmol/l EDTA 0,1 mM KHCO3 de 0 a 0,5 mM para determinar su eficacia. Los resultados anteriores muestran que cualquiera de Ios tampones sometidos a prueba fue adecuado para mantener el número de WBC a un nivel muy alto, probando la idoneidad del reactivo para la lisis específica de eritrocitos. Adicionalmente, Ios valores de pH en el sobrenadante después de la 1.a y 2.a lisis estuvieron en el intervalo de desde 6,7 a 7,7, en particular de desde 6,9 a 7,3.

Ejemplo comparativo 7: lisis de eritrocitos en diferentes reactivos con diferentes componentes de lisis En una séptima prueba, se sometió a prueba la eficacia de Ios protocolos de lisis de eritrocitos existentes como se indica. Los resultados se muestran en la siguiente tabla 7:

Tabla 7: Efecto de Ios protocolos de IIsIs de eritrocitos convencionales en la recuperación de glóbulos blancos

* RCLB: tampón de Iísís de glóbulos rojos (Roche Applied Science, n,0 cat, 11814389001): NH4CI 150 mM, KHC03 1 mM, 0,1 mM

Los resultados anteriores muestran que ninguno de Ios tampones sometidos a prueba fue adecuado para mantener el número de WBC a un nivel alto, probando el efecto ventajoso asociado con el reactivo como se presenta en el presente documento.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un reactivo para la Iísís de eritrocitos, siendo el reactivo una solución acuosa que comprende o que consiste en HEPES (ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperacinetanosulfónico), NH4+/NH3, un agente quelante, y opcionalmente C032"/HC03" en el que la concentración final durante la lisis de eritrocitos está en el intervalo de - desde 2,5 mmol/l a 12 mmol/l de HEPES,

- desde 60 mmol/l a 120 mmol/l de NH4+/NH3,

- desde 0,04 mmol/l a 0,8 mmol/l de agente quelante, y

- desde 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de C032"/HC03", si está presente,

en el que el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en EGTA (ácido etilenglicol-tetraacético), BAPTA (ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético) DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), EDTA (tetraacetato de etilendiamina) y NTA (N,N-bis(carboximetil)glicina).

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el reactivo comprende de 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de C032'/HC03'. 3. El uso de la reivindicación 1 o 2, en el que la concentración final durante la lisis está en el intervalo de - desde 3 mmol/l a 11 mmol/l de HEPES,

- desde 70 mmol/l a 100 mmol/l de NH4+/NH3,

- desde 0,05 mmol/l a 0,5 mmol/l de agente quelante, y/o

- desde 0,

3 mmol/l a 0,6 mmol/l de C032'/HC03', si está presente.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el pH del reactivo está en el intervalo de desde 6,4 a 7,7.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que el pH se mantiene en el intervalo de desde 6,4 a 7,7 durante la lisis de eritrocitos.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el reactivo se usa en la detección, concentración o aislamiento de células distintas de eritrocitos a partir de una muestra que comprende eritrocitos.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que la muestra es una muestra de sangre.

8. El uso de la reivindicación 6 o 7, en el que las células distintas de eritrocitos son leucocitos, células endoteliales circulantes o células tumorales circulantes, en particular células tumorales circulantes.

9. Un procedimiento de lisado de eritrocitos, comprendiendo el procedimiento

a) proporcionar una muestra que comprende eritrocitos; e

b) incubar la muestra con el reactivo para la lisis de eritrocitos, siendo el reactivo una solución acuosa que comprende o que consiste en HEPES, NH4+/NH3, un agente quelante, y opcionalmente C032'/HC03', en el que la concentración final durante la lisis de eritrocitos está en el intervalo de

- desde 2,5 mmol/l a 12 mmol/l de HEPES,

- desde 60 mmol/l a 120 mmol/l de NH4+/NH3,

- desde 0,04 mmol/l a 0,8 mmol/l de agente quelante, y

- desde 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de C032'/HC03', si está presente,

en el que el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en EGTA (ácido etilenglicol-tetraacético), BAPTA (ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético) DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético), EDTA (tetraacetato de etilendiamina) y NTA (N,N-bis(carboximetil)glicina).

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el reactivo comprende de 0,15 mmol/l a 0,8 mmol/l de CO32' /HC03-.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 o 10 que comprende además después de la etapa b) retirar Ios residuos de eritrocitos.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la muestra es una muestra de sangre o una muestra que comprende eritrocitos y otras células.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el procedimiento comprende además

c) detectar o aislar células distintas de eritrocitos a partir de una muestra que comprende eritrocitos.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que las células distintas de eritrocitos son glóbulos blancos o células tumorales circulantes.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que la incubación de la etapa b) es como máximo de 30 min.