ES2914623T3 - Método para convertir una secuencia genómica de una planta monocotiledónea en la que una base de ácido nucleico en la secuencia de ADN diana se convierte de manera específica y el complejo molecular utilizado en el mismo - Google Patents

Método para convertir una secuencia genómica de una planta monocotiledónea en la que una base de ácido nucleico en la secuencia de ADN diana se convierte de manera específica y el complejo molecular utilizado en el mismo Download PDF

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Abstract

Un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario de una célula monocotiledónea, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos que se une de manera específica a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario dado y una desaminasa, con el ADN bicatenario, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otro o más nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en el sitio diana, sin escindir al menos una cadena del ADN bicatenario en el sitio diana, en donde el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica el complejo en la célula monocotiledónea y el cultivo de la célula monocotiledónea para expresar intracelularmente el complejo, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas, un motivo de dedos de zinc, un efector TAL y un motivo PPR, y en donde se añade una señal de localización nuclear a ambos extremos del módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la desaminasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para convertir una secuencia genómica de una planta monocotiledónea en la que una base de ácido nucleico en la secuencia de ADN diana se convierte de manera específica y el complejo molecular utilizado en el mismo
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a un método de modificación de una secuencia genómica, que permite la modificación de una base de ácido nucleico en una región particular del genoma de una monocotiledónea, sin escindir el ADN bicatenario, es decir, sin escisión o escisión de una sola cadena, utilizando un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una desaminasa.
[Antecedentes de la técnica]
Las monocotiledóneas son un grupo de plantas caracterizadas por tener un cotiledón entre las angiospermas y en este se clasifican los tres granos principales de arroz, trigo y maíz. Por lo tanto, la mejora molecular de las monocotiledóneas se ha estudiado ampliamente. Sin embargo, dado que las monocotiledóneas no son hospedadoras de Agrobacterium, el método con Agrobacterium, que es el método de transformación de plantas más general, no se pudo utilizar durante mucho tiempo y se ha utilizado un método de introducción directa. A mediados de la década de 1990, se informó que el arroz se puede transformar de manera eficaz mediante la infección de células activas en la división celular con Agrobacterium. Desde entonces, la mejora molecular de monocotiledóneas mediante transgén ha avanzado mucho.
En los últimos años, la edición genómica está atrayendo la atención como una técnica para modificar el gen y la región genómica diana en varias especies. De manera convencional, como método de edición genómica, se ha propuesto un método que utiliza una nucleasa artificial que comprende una molécula que tiene la capacidad de escindir ADN independiente de la secuencia y una molécula que tiene la capacidad de reconocer una secuencia en combinación (documento no de patente 1).
Por ejemplo, se ha informado acerca de un método para llevar a cabo la recombinación en un locus de un gen diana en el ADN de una célula vegetal o de insecto como hospedador, mediante la utilización de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN, del inglés "zinc finger nuclease") en donde se unen un dominio de unión a ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión de ADN inespecífico (documento de patente 1), un método para escindir o modificar un gen diana en una secuencia de nucleótidos particular o en un sitio adyacente a la misma utilizando TALEN (siglas del inglés, transcription activator-like effector nuclease, nucleasa efectora con actividad similar al activador de la transcripción), en donde están unidos un efector similar a un activador de la transcripción (TAL, del inglés "transcription activatorlike"), que es un módulo de unión al ADN que tiene la bacteria fitopatógena, Xanthomonas, y una ADN endonucleasa (documento de patente 2), un método que utiliza el sistema CRISPR-Cas9 en donde se combinan una secuencia de ADN CRISPR (siglas del inglés clustered regularly interspaced short palindromic repeats, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) que funciona en un sistema inmunitario adquirido que poseen las eubacterias y las arqueobacterias, y la familia de proteínas nucleasas Cas (asociadas a CRISPR) que tienen una función importante junto con CRISPR (documento de patente 3) y métodos similares. Recientemente, por otra parte, Cpf1 se ha informado como una nueva endonucleasa del sistema CRISPR-Cas (documento no de patente 2). Además, también se ha informado de un método para escindir un gen diana en la proximidad de una secuencia particular, mediante la utilización de una nucleasa artificial en donde se unen una proteína PPR constituida para reconocer una secuencia nucleotídica particular mediante una continuación de motivos PPR, cada uno de los cuales consiste en 35 aminoácidos y que reconoce una base de ácido nucleico, y la nucleasa (documento de patente 4).
Estas técnicas de edición genómica básicamente asumen roturas bicatenarias (DSB, del inglés "double-stranded breaks") de ADN mediante nucleasa. Sin embargo, dado que las DSB implican una modificación inesperada del genoma, se producen efectos secundarios tales como fuerte citotoxicidad y translocación cromosómica y similares. De manera adicional, existen problemas de que el número de células viables es extremadamente pequeño y la propia modificación genética es difícil dependiendo del tipo de célula.
En respuesta a los problemas antes mencionados, los presentes inventores han informado que la secuencia genómica se modificó con éxito sin implicar DSB en varios organismos que incluyen levadura y Escherichia coli mediante la conversión de nucleobase en una región que contiene una secuencia de ADN específica, mediante la introducción, en una célula hospedadora, de un complejo en el que una desaminasa que cataliza una reacción de desaminación está unida a una molécula que tiene una capacidad de reconocimiento de secuencias de ADN (documento de patente 5).
Cuando este método se aplica a plantas superiores tales como las monocotiledóneas, para mejorar aún más la eficacia de introducción de mutaciones, es deseable optimizar de manera adicional la constitución del complejo molecular a introducir y las condiciones de cultivo y similares de las células vegetales después de la introducción. En levaduras y procariotas, el modo de mutación es principalmente sustitución de base, como se esperaba del uso de desaminasas, y la frecuencia de mutación por inserción/eliminación es baja. Por lo tanto, también se desea el desarrollo de una técnica mediante la cual se introduzcan de manera eficaz diferentes tipos de mutaciones.
[Listado de documentos]
[Documentos de patente]
Documento de patente 1: JP-B-4968498
Documento de patente 2: Publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2013-513389 Documento de patente 3: Publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2010-519929 Documento de patente 4: JP-A-2013-128413
Documento de patente 5: WO 2015/133554
[Documentos no de patente]
Documento no de patente 1: Kelvin M. Esvelt, Harris H. Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641
Documento no de patente 2: Bernd Zetsche et al. (2015) Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell 163: 759-771
[Sumario de la invención]
[Problemas a resolver con la invención]
Por lo tanto, un primer objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo método de edición genómica para modificar de manera eficaz una base de ácido nucleico de una secuencia particular de un gen del genoma de monocotiledóneas sin DSB, es decir, mediante la no escisión de un ADN bicatenario o escisión de una sola cadena. De manera adicional, un segundo objeto de la presente invención es proporcionar un medio capaz de introducir mutaciones de manera eficaz en una célula monocotiledónea hospedadora de una manera diferente a la sustitución de bases en la edición genómica no acompañada por DSB utilizando desaminasas.
[Medios para resolver los problemas]
Para lograr el primer objetivo antes mencionado, los presentes inventores combinaron primero el vector de direccionamiento pZH_OsU6 gRNA_MMCas9 (Plant Mol Biol (2015) 88:561-572) optimizado para arroz en el sistema CRISPR/Cas9 como nucleasa artificial y una desaminasa (véase la figura 1B). Es decir, se introduce una mutación que inactiva la capacidad de escisión de ambas o una de las cadenas del ADN diana en la secuencia codificante de Cas9 (OsCas9) optimizada para el uso del codón de arroz en el vector de direccionamiento mencionado anteriormente, y la secuencia codificante se fusionó con una secuencia codificante de citidina desaminasa (AtPmCDA) optimizada para el uso de un codón vegetal. Dada la hipótesis de que la eficacia de transferencia de la proteína de fusión Cas9/desaminasa sintetizada en el citoplasma hacia el núcleo puede disminuir debido a que las células vegetales tienen un tamaño celular más grande que la levadura y similares, se añadió una señal de localización nuclear (NLS, del inglés "nuclear localization signal") no solo cadena arriba de Cas9 sino también a ambos extremos de la desaminasa. Como resultado de la introducción del vector mejorado en el callo del arroz, la base objeto en la secuencia de nucleótidos diana podría sustituirse con éxito por otra base. De manera más sorprendente, se aclaró que, cuando se utilizó Cas9 (D10A) en el que se inactiva la capacidad de escisión de una cadena del ADN diana (que tiene actividad de nickasa), la mutación por eliminación ocurre principalmente en la región centrada en la base desaminada mediante la desaminasa.
De manera adicional, los presentes inventores han logrado mejorar aún más la eficacia de la introducción de la mutación mediante el cultivo de callos de arroz con el gen introducido a una temperatura inferior a la temperatura de cultivo normalmente utilizada en la etapa de selección de la cepa con la mutación introducida.
El presente inventor ha realizado estudios adicionales basados en estos hallazgos y ha completado la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención proporciona lo siguiente.
[1] Un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario en una célula monocotiledónea, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos que se une de manera específica a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario dado y una desaminasa, con el ADN bicatenario, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otro o más nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en el sitio diana, sin escindir al menos una cadena del ADN bicatenario en el sitio diana, en donde el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica el complejo en la célula monocotiledónea y el cultivo de la célula monocotiledónea para expresar intracelularmente el complejo, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas, un motivo de dedos de zinc, un efector TAL y un motivo PPR, y en donde se añade una señal de localización nuclear a ambos extremos del módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y de la desaminasa.
[2] El método del punto [1] mencionado anteriormente, en donde la etapa de cultivo se realiza al menos de manera parcial a una temperatura inferior a la temperatura óptima de cultivo de la célula monocotiledónea.
[3] El método de los puntos [1] o [2] mencionados anteriormente, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas.
[4] El método del punto [3] mencionado anteriormente, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos es un sistema CRISPR-Cas en el que se inactiva la capacidad de escisión de una cadena opuesta de la cadena que forma una cadena complementaria con un ARN guía.
[5] El método del punto [4] mencionado anteriormente, en donde se eliminan uno o más nucleótidos del sitio diana.
[6] El método de uno cualquiera de los puntos [1] a [5] mencionados anteriormente, en donde la desaminasa es citidina desaminasa.
[7] El método del punto [6] mencionado anteriormente, en donde la citidina desaminasa es PmCDA1 procedente de Petromyzon marinus o AID humana.
[8] El método de cualquiera de los puntos [1] a [7] mencionados anteriormente, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la desaminasa se optimizan para el uso de un codón de angiosperma o monocotiledónea.
[9] El método de cualquiera de los puntos [1] a [8] mencionados anteriormente, en donde la monocotiledónea es arroz, trigo o maíz y, de manera opcional, en donde la monocotiledónea es arroz.
[Efecto de la invención]
De acuerdo con la técnica de edición genómica de la presente invención, dado que no acompaña la escisión de una doble cadena de ADN, la técnica es superior en seguridad y se hace posible la modificación genética de monocotiledóneas con una eficacia elevada de introducción de mutaciones.
[Breve descripción de los dibujos]
La figura 1 muestra de manera esquemática la estructura del plásmido vector utilizado en los ejemplos. A: vector para la evaluación de Diana-AID. B: vector Diana-AID.
La figura 2 muestra la expresión de EGFP en callos de arroz en los que se introducen dos tipos de vectores para la evaluación de Diana-AID.
La figura 3 muestra los resultados de confirmación de la incorporación de mEGFP y el gen hpt mediante análisis PCR de un doble transformante obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2409.
La figura 4 muestra la expresión de EGFP de un clon transformante doble n.° 6 obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2409.
La figura 5 muestra la expresión de EGFP de un clon transformante doble n.° 3 obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2409.
La figura 6 muestra los resultados del análisis de la secuencia en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana en dos tipos de clones transformantes dobles (A y B) obtenidos mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2409.
La figura 7 muestra los resultados del análisis de la secuencia en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana en un clon transformante doble n.° 39 obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2409.
La figura 8 muestra los resultados del análisis de la secuencia en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana en un clon transformante doble n.° 1 obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2408.
La figura 9 muestra los resultados del análisis de la secuencia en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana en un clon transformante doble n.° 2 obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2408.
La figura 10 muestra los resultados del análisis de la secuencia en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana en un clon transformante doble n.° 4 obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2408.
La figura 11 muestra los resultados del análisis de la secuencia en la proximidad de la secuencia de nucleótidos diana en el subclon n.° 1D (señal negativa de GFP) de un clon transformante doble n.° 1 obtenido mediante la introducción de pRIT3-mEGFP y 2408.
La figura 12 muestra los resultados de la evaluación de la concentración eficaz de imazamox en relación con el callo de arroz. El panel superior es una fotografía el día de la inoculación del callo de arroz en un medio con imazamox añadido y el panel inferior es una fotografía después de 28 días de cultivo.
La figura 13 muestra dibujos esquemáticos de los vectores de expresión de ALS de tipo silvestre y ALS A96V de tipo de mutación utilizados para una prueba para conferir resistencia a imazamox.
La figura 14 muestra la secuencia diana de la modificación A96V de ALS de arroz mediante Diana-AID.
La figura 15 muestra la modificación del gen de ALS de arroz mediante Diana-AID.
La figura 16 es una fotografía del cuerpo vegetal T0 rediferenciado del callo con la modificación A96V de ALS de arroz mediante Diana-AID.
La figura 17 muestra que el cuerpo vegetal T0 rediferenciado a partir del callo con la modificación A96V de ALS de arroz mediante Diana-AID conserva la misma modificación genética ALS que el callo original.
La figura 18 muestra la modificación simultánea de múltiples genes mediante Diana-AID.
[Descripción de las realizaciones]
La presente invención proporciona un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario mediante la conversión de la secuencia de nucleótidos diana y de los nucleótidos en las proximidades de la misma en el ADN bicatenario en otros nucleótidos, sin escindir el ADN bicatenario que se va a modificar en una célula monocotiledónea (en lo sucesivo en el presente documento también se denominará "el método de la presente invención"). El método contiene de manera característica una etapa de poner contacto un complejo en donde un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos que se une de manera específica a la secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos (es decir, una desaminasa) con el ADN bicatenario en la célula monocotiledónea hospedadora para convertir, etc., el sitio diana, es decir, la secuencia de nucleótidos diana y los nucleótidos en las proximidades de la misma, en otros nucleótidos.
Si bien la monocotiledónea utilizable para el método de la presente invención no está particularmente limitada, esta es, por ejemplo, cereales tales como el arroz, el trigo, el maíz, la cebada, el centeno y similares o una planta de jardín tal como el lirio o similares, más preferentemente el arroz, el trigo o el maíz, en particular preferiblemente el arroz.
En la presente invención, la "modificación" de un ADN bicatenario significa que, en una cadena de ADN, un nucleótido (por ejemplo, dC) se convierte en otro nucleótido (por ejemplo, dT, dA o dG), o se elimina, o se inserta un nucleótido o una secuencia de nucleótidos entre determinados nucleótidos en una cadena de ADN. Aunque el ADN bicatenario que se va a modificar no está particularmente limitado siempre que sea un ADN bicatenario presente en la célula hospedadora, este es, preferentemente, un ADN genómico, en particular, ADN genómico nuclear. La expresión "sitio diana" de un ADN bicatenario significa la "secuencia de nucleótidos diana" total o parcial, que reconoce específicamente un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y que se une a la secuencia de nucleótidos diana o a las proximidades de la misma (una o ambas cadena arriba en dirección 5' y cadena abajo en dirección 3'). De manera adicional, la "secuencia de nucleótidos diana" significa una secuencia a la que se une un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos en un ADN bicatenario.
En la presente invención, el "módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos" significa una molécula o complejo de moléculas que tiene la capacidad de reconocer y unirse de manera específica a una secuencia de nucleótidos particular (es decir, secuencia de nucleótidos diana) en una cadena de ADN y se selecciona del grupo que consiste en un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas, un motivo de dedos de zinc, un efector TAL y un motivo PPR. La unión del módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos a una secuencia de nucleótidos diana permite que una desaminasa unida al módulo actúe de manera específica en un sitio diana de un ADN bicatenario.
En la presente divulgación, la expresión "enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos" significa una enzima capaz de convertir un nucleótido diana en otro nucleótido catalizando una reacción para convertir un sustituyente en un anillo de purina o pirimidina en una base de ADN en otro grupo o átomo, sin escindir la cadena de ADN. En la presente invención, la "enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos" es una desaminasa.
En la presente invención, el "complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos" significa un complejo molecular que comprende un complejo que comprende el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos mencionado anteriormente y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos conectados, y que tiene actividad de la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y está dotado de una capacidad particular de reconocimiento de secuencias de nucleótidos. El "complejo" aquí abarca no solo uno constituido por múltiples moléculas, sino también uno que tiene un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos en una sola molécula, tal como una proteína de fusión.
La enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos a utilizar para el método de la presente invención es una desaminasa. Los ejemplos de la misma incluyen la desaminasa que pertenece a la superfamilia de ácidos nucleicos/nucleótidos desaminasas, que cataliza una reacción de desaminación que convierte un grupo amino en un grupo carbonilo. Como ejemplos preferentes de la misma se incluyen citidina desaminasa capaz de convertir citosina o 5-metilcitosina en uracilo o timina, respectivamente, adenosina desaminasa capaz de convertir adenina en hipoxantina, guanosina desaminasa capaz de convertir guanina en xantina y similares. Como citidina desaminasa, se prefiere más la citidina desaminasa inducida por activación (en lo sucesivo en el presente documento también denominada AID, del inglés "activation-induced cytidine deaminase"), que es una enzima que introduce una mutación en un gen de inmunoglobulina en el sistema inmunitario adquirido de vertebrados o similares.
Si bien el origen de la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos no está particularmente limitado, por ejemplo, cuando es citidina desaminasa, se pueden utilizar PmCDA1 (del inglés "Petromyzon marinus cytosine deaminase 1, citosina desaminasa 1 de Petromyzon marinus) procedente de Petromyzon marinus, o AID (citidina desaminasa inducida por activación; AICDA, del inglés "Activation-induced cytidine deaminase") procedente de vertebrados (por ejemplo, mamíferos tales como el ser humano, cerdo, bovino, perro, chimpancé y similares, pájaros tales como gallinas y similares, anfibios tales como Xenopus y similares, peces tales como el pez cebra, ayu, bagre de canal y similares).
Una secuencia de nucleótidos diana en un ADN bicatenario para ser reconocida por el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos en el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención no está particularmente limitada siempre que el módulo se una de manera específica a ella, y puede ser cualquier secuencia en el ADN bicatenario. La longitud de la secuencia de nucleótidos diana solo necesita ser suficiente para la unión específica del módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, no es menos de 12 nucleótidos, preferentemente no menos de 15 nucleótidos, más preferentemente no menos 18 nucleótidos, de acuerdo con el tamaño del genoma de las monocotiledóneas. Si bien el límite superior de la longitud no está particularmente limitado, es preferentemente no más de 25 nucleótidos, más preferentemente no más de 22 nucleótidos.
El módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos en el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos utilizado en la presente invención se selecciona de un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas está inactiva (CRISPR-mutante Cas), un motivo de dedos de zinc, un efector TAL y un motivo PPR se puede utilizar.
Un motivo de dedos de zinc está constituido por el enlace de 3 a 6 unidades de dedo de zinc de tipo Cys2His2 diferentes (1 dedo reconoce aproximadamente 3 bases), y puede reconocer una secuencia de nucleótidos diana de 9 a 18 bases. Se puede producir un motivo de dedos de zinc mediante un método conocido tal como el método de ensamblaje modular (Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141), método OPEN (Mol Cell (2008) 31: 294-301), método CoDA (Nat Methods (2011) 8: 67-69), método de un híbrido de Escherichia coli (Nat Biotechnol (2008) 26:695-701) y similares. El documento de patente 1 mencionado anteriormente puede referirse a los detalles de la producción del motivo de dedos de zinc.
Un efector TAL tiene una estructura de repetición de módulo con aproximadamente 34 aminoácidos como una unidad y los restos de aminoácidos 12 y 13 (llamados RVD) de un módulo determinan la estabilidad de unión y la especificidad de la base. Dado que cada módulo es altamente independiente, el efector TAL específico para una secuencia de nucleótidos diana se puede producir simplemente conectando el módulo. Para el efector TAL, se ha establecido un método de producción que utiliza un recurso abierto (método REAL (Curr Protoc Mol Biol (2012) Capítulo 12: Unidad 12.15;); el método FLASH (Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465 y el método Golden Gate (Nucleic Acids Res (2011) 39: e82), etc.), y se puede diseñar un efector TAL para una secuencia de nucleótidos diana de forma comparativamente conveniente. Se puede hacer referencia al documento de patente 2 antes mencionado en cuanto a los detalles de la producción del efector TAL.
El motivo PPR está constituido de tal manera que una secuencia de nucleótidos particular se reconoce por una continuación de motivos PPR, cada uno de los cuales consiste en 35 aminoácidos y reconoce una base de ácido nucleico, y reconoce una base diana solo por 1, 4 y ii(-2) aminoácidos de cada motivo. La constitución del motivo no tiene dependencia y está libre de interferencia de motivos en ambos lados. Por lo tanto, como el efector TAL, una proteína PPR específica para la secuencia de nucleótidos diana se puede producir simplemente conectando motivos PPR. Se puede hacer referencia al documento de patente 4 antes mencionado para los detalles de la producción del motivo PPR.
Como se divulga en el presente documento, cuando un fragmento de enzima de restricción, factor de transcripción, ARN polimerasa y similares se utiliza, dado que los dominios de unión a ADN de estas proteínas son bien conocidos, se puede diseñar y construir fácilmente un fragmento que contiene el dominio y sin de una capacidad de escisión de la doble cadena de ADN.
Cualquiera de los módulos de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos mencionados anteriormente se puede proporcionar como una proteína de fusión con la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos mencionada anteriormente, o un dominio de unión a proteínas tal como el dominio SH3, dominio PDZ, dominio GK, dominio GB y similares y una pareja de unión del mismo puede fusionarse con un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, respectivamente, y se proporciona como un complejo proteico a través de una interacción del dominio y una pareja de unión del mismo. Como alternativa, un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos pueden fusionarse cada uno con inteína, y pueden unirse mediante ligadura después de la síntesis de proteínas.
El complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente divulgación que contiene un complejo (que incluye proteína de fusión) en donde un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos están unidos puede ponerse en contacto con un ADN bicatenario. Un ácido nucleico que codifica el complejo se introduce en una célula monocotiledónea que tiene el ADN bicatenario diana (por ejemplo, ADN genómico nuclear).
Por lo tanto, el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se preparan como un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión del mismo, o en una forma capaz de formar un complejo en una célula hospedadora después de la traducción a una proteína utilizando un dominio de unión, inteína y similares, o como un ácido nucleico que codifica cada uno de ellos. En el presente documento, el ácido nucleico puede ser ADN o ARN, preferentemente ADN. Cuando es un ADN, es preferentemente un ADN bicatenario y se proporciona en forma de un vector de expresión dispuesto bajo la regulación de un promotor funcional en una célula hospedadora.
Dado que el complejo de la presente divulgación en donde un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos están unidos no acompaña roturas de ADN bicatenario (DSB), es posible la edición genómica con baja toxicidad, y el método de modificación genética de la presente invención se puede aplicar a una amplia gama monocotiledóneas en general.
Un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, tal como un motivo de dedo de zinc, un efector TAL y un motivo PPR, se puede obtener mediante cualquier método mencionado anteriormente para cada módulo. Un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de una enzima de restricción, factor de transcripción, ARN polimerasa y similares se puede clonar mediante, por ejemplo, la síntesis de un cebador de oligoADN que cubre una región que codifica una parte deseada de la proteína (parte que contiene el dominio de unión a ADN) en función de la información de la secuencia de ADNc del mismo, y la amplificación mediante el método RT-PCR utilizando, como molde, el ARN total o una fracción de ARNm preparada a partir de las células productoras de proteínas.
Un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos también se puede clonar de manera similar mediante la síntesis de un cebador de oligoADN en función de la información de la secuencia de ADNc del mismo, y la amplificación mediante el método RT-PCR utilizando, como molde, el ARN total o una fracción de ARNm preparada a partir de las células productoras de enzimas. Por ejemplo, se puede clonar un ADN que codifica PmCDAI de Petromyzon marinus mediante el diseño de cebadores adecuados de la CDS cadena arriba y cadena abajo basándose en la secuencia de ADNc (n.° de registro EF094822) registrada en la base de datos del NCBI, y mediante la clonación del ARNm procedente de Petromyzon marinus mediante el método de RT-PCR. Un ADN que codifica la AID humana se puede clonar mediante el diseño de cebadores adecuados para la CDS cadena arriba y cadena abajo basándose en la secuencia de ADNc (n.° de registro AB040431) registrada en la base de datos del NCBI y mediante la clonación a partir de, por ejemplo, ARNm procedente de nódulo linfático humano mediante el método de RT-PCR. De la misma manera que la comentada anteriormente, basándose en información de secuencias de ADNc conocidas, también se puede clonar un homólogo de AID procedente de otro vertebrado (por ejemplo, de porcino (n.° de registro CU582981), bovino (n.° de registro NM_110138682), perro (n.° de registro NM_001003380), chimpancé (n.° de registro NM_001071809), pollo (n.° de registro NM_001243222), Xenopus (n.° de registro NM_00l095712), pez cebra (n.° de registro AAI62573), ayu (n.° de registro AB619797) y bagre de canal (n.° de registro NM_001200l85), etc.).
El ADN clonado puede directamente, o después de la digestión con una enzima de restricción cuando se desee, o después de la adición de un enlazador adecuado y/o una señal de localización nuclear (cada orgánulo transfiere la señal cuando el ADN bicatenario diana es ADN de mitocondria o de cloroplasto), unirse con un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos para preparar un ADN que codifica una proteína de fusión. En una realización preferible, una secuencia de ADN que codifica una señal de transferencia de orgánulos tal como una señal de localización nuclear y similares se añade deseablemente a ambos extremos de un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos. Dado que las células monocotiledóneas son más grandes en comparación con las células de levadura, la distancia entre el citoplasma donde se sintetiza la proteína y el núcleo aumenta. Por lo tanto, para transportar de manera eficaz una molécula de proteína con un gran peso molecular, tal como un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos al núcleo, preferentemente se añade una señal de localización nuclear tanto al módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos como a la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos. Cuando el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se expresan como una proteína de fusión, se puede añadir una señal de localización nuclear a ambos extremos de la proteína de fusión, y entre el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos. La señal de localización nuclear no está particularmente limitada siempre que funcione en monocotiledóneas. Por ejemplo, se puede mencionar la señal de localización nuclear procedente de SV40 (PKKKRKV; SEQ ID NO: 6).
Como alternativa, un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos pueden fusionarse cada uno con un ADN que codifica un dominio de unión o una pareja de unión del mismo, o ambos ADN pueden fusionarse con un ADN que codifica una inteína de separación, por lo que el módulo de conversión de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se traducen en una célula hospedadora para formar un complejo. En estos casos, cuando se desee, puede unirse un enlazador y/o una señal de localización nuclear a una posición adecuada de uno o de ambos ADN.
Se puede obtener un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos mediante la síntesis química de la cadena de ADN o mediante la puesta en contacto de cadenas cortas de oligoADN parcialmente superpuestas sintetizadas mediante la utilización del método de PCR y el método de ensamblaje de Gibson para construir un ADN que codifica la longitud completa del mismo. La ventaja de construir un ADN de longitud completa mediante síntesis química o mediante una combinación del método de p Cr o el método de ensamblaje de Gibson, es que el codón que se utilice puede diseñarse en la CDS de longitud completa según el hospedador en el que se introduzca el ADN. En la expresión de un ADN heterólogo, se espera que el nivel de expresión de la proteína aumente al convertir su secuencia de ADN en un codón que se usa con mucha frecuencia en el organismo hospedador. Como los datos de frecuencia de uso de codones en el hospedador que se van a utilizar, por ejemplo, se puede utilizar la base de datos de frecuencia de uso del código genético (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) divulgada en la página de inicio del Instituto de Investigación de ADN de Kazusa, o se puede hacer referencia a los documentos que muestran la frecuencia de uso de codones en cada hospedador. En referencia a los datos obtenidos y a la secuencia de ADN que se va a introducir, los codones que muestran una frecuencia de uso baja en el hospedador de entre los usados para la secuencia de ADN, pueden convertirse en un codón que codifique el mismo aminoácido y que muestre una frecuencia de uso alta. Por ejemplo, cuando la célula hospedadora es una célula de arroz, se puede utilizar una secuencia codificante de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y/o de una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos optimizada para el uso de codones en monocotiledóneas tales como el arroz y similares, o plantas angiospermas en general tales como Arabidopsis thaliana y similares. Por ejemplo, como un ADN de PmCDA1 que utiliza un codón adecuado para la expresión en angiospermas, se puede mencionar un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada por la SEQ ID NO: 1.
Se puede producir un vector de expresión que contiene un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y/o una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante la unión del ADN cadena abajo de un promotor funcional en células monocotiledóneas en un vector de expresión que contiene el promotor.
Un vector replicable en una célula monocotiledónea no está particularmente limitado siempre que tenga un origen de replicación (por ejemplo, ori del plásmido Ti, plásmido Ri, etc.) que funcione en una célula monocotiledónea. Preferentemente también contiene un origen de replicación de Escherichia coli (por ejemplo, ColE1 ori, etc.). Cuando se utiliza un método con Agrobacterium como método de transferencia de genes, es necesario que contenga además un fragmento de ADN-T (que incluye las secuencias límite RB y LB) del que se ha eliminado un gen patógeno del plásmido Ti o del plásmido Ri. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero sin limitación, pBI101 procedente de pBIN193, pBI121 (Clontech) y un vector mejorado que lo utiliza como cadena principal (por ejemplo, pRI909, pRI910, pRI101, pRI201 (Takara Bio Inc.), etc.).
Como promotor, se puede utilizar cualquier promotor capaz de funcionar en una célula monocotiledónea. En un método convencional que utiliza DSB, dado que la tasa de supervivencia de la célula hospedadora a veces disminuye notablemente debido a la toxicidad, es deseable aumentar el número de células al comienzo de la inducción mediante el uso de un promotor inductivo (por ejemplo, promotor del gen PR1a inducido por lesión, tratamiento con ácido salicílico, promotor del gen rd29A inducido por secado, baja temperatura, tratamiento con ácido abscísico, promotor del gen GST-27 inducido por tratamiento con diclormid, etc.). Sin embargo, dado que también se puede lograr una proliferación celular suficiente expresando el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención, también se puede utilizar sin limitación un promotor constitutivo. Como promotor constitutivo, se pueden mencionar el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor CaMV19S, el promotor de la nopalina sintetasa (NOS), el promotor de la ubiquitina procedente de perejil (Pcubi4-2) y similares. También se pueden utilizar estos promotores o fragmentos de los mismos unidos en tándem (por ejemplo, 2 * 35S).
El vector de expresión puede contener, cuando se desee, un finalizador (por ejemplo, finalizador NOS, finalizador de Pisum sativum rbcS3A, finalizador de la proteína de choque térmico (HSP) 17.3, etc.), un potenciador de la traducción (por ejemplo, región no traducida en 5' de la alcoholdeshidrogenasa procedente del arroz (Os ADH-5'UTR), secuencia Ó procedente del virus del mosaico del tabaco (TMV) o CaMV, etc.), una región reguladora en 3' (por ejemplo, gen de actina procedente del arroz (Act1)3'UTR, etc.), una señal añadida de poliA, un marcador de selección del gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, gen de resistencia G418 (nPtll), una gen de resistencia a higromicina (hpt), etc.) y similares.
Se puede preparar un ARN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y/o una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, la transcripción a ARNm en un sistema de transcripción in vitro conocido de por sí mediante el uso de un vector que codifica un ADN que codifica el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y/o una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos mencionados anteriormente como molde.
Un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se puede expresar intracelularmente mediante la introducción de un vector de expresión que contiene un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y/o una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos en una célula monocotiledónea hospedadora y mediante el cultivo de la célula hospedadora.
Como la célula monocotiledónea para ser una hospedadora, se utilizan células cultivadas en suspensión, callo, protoplasto, segmento de hoja, segmento de raíz, semilla (embrión inmaduro, etc.) y similares preparados a partir de cereales tales como el arroz, el trigo, el maíz, la cebada, el centeno y similares, plantas de jardín con flores tales como el lirio y similares, y similares.
La célula monocotiledónea puede ser haploide (monoploide) o poliploide (por ejemplo, diploide, triploide, tetraploide y similar). En los métodos convencionales de introducción de mutaciones, la mutación es, en principio, introducida en un solo cromosoma homólogo para producir un tipo de heterogén. Por lo tanto, el fenotipo deseado no se expresa a menos que se produzca una mutación dominante, y la homocigosis requiere inconvenientemente esfuerzo y tiempo. En cambio, de acuerdo con la presente invención, dado que la mutación puede introducirse en cualquier alelo del cromosoma homólogo en el genoma, el fenotipo deseado se puede expresar en una sola generación incluso en el caso de mutación recesiva, y se pueden resolver los problemas de los métodos convencionales.
Un vector de expresión se puede introducir en un tejido adecuado (por ejemplo, callo, raíz, hoja, semilla, punto vegetativo, etc.) mediante un método conocido (por ejemplo, el método con Agrobacterium, el método de PEG, el método de electroporación, el método del cañón de partículas, etc.) de acuerdo con el tipo de monocotiledónea. Por ejemplo, en el caso del arroz, en general se utilizan el método con Agrobacterium, el método de introducción directa de bigotes y similares, pero el método no se limita a ellos. Por ejemplo, en el caso del método con Agrobacterium, se induce un callo a partir de una semilla de arroz de acuerdo con un método convencional, se incorpora un casete de expresión de un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y/o una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos en un fragmento de ADN-T de un vector de expresión de Agrobacterium, se introduce el vector de expresión en Agrobacterium, se infecta el callo con Agrobacterium y la bacteria se elimina 3 días después. Por otro lado, en el caso del método de introducción directa de bigotes, un vector de expresión se mezcla con poliornitina para dar un complejo, el complejo se añade junto con bigotes hechos de titanato de potasio al callo de arroz, se mezcla y se sonica.
En el caso del trigo y el maíz, por ejemplo, se puede introducir un vector de expresión utilizando un embrión inmaduro recogido de una semilla inmadura como material vegetal y utilizando de manera similar un método con Agrobacterium.
Cuando se utiliza el método PEG o el método de electroporación, se prepara un protoplasto a partir de una célula o tejido apropiado de acuerdo con un método convencional, y se introduce en él un vector de expresión. En el caso de un método de pistola de partículas, se puede introducir un vector de expresión adsorbido en micropartículas de oro en el callo, en el embrión inmaduro, en el punto de crecimiento y similares existentes en el ápice del brote o yema axilar con una pistola de partículas.
En el método de pistola de partículas y el método con Agrobacterium, el transgén es a menudo quimérico. Por lo tanto, se necesita utilizar para la transformación una célula de muestra en la que el ácido nucleico mencionado anteriormente se introduce en las células de la estirpe germinal a frecuencia elevada. Por ejemplo, se pueden mencionar el embrión la sección de hipocótilo, el callo embriogénico, el punto vegetativo aislado y similares.
Una célula monocotiledónea introducida con un vector se puede cultivar de acuerdo con un método conocido en función de su tipo. Como medio para utilizarse para el cultivo, es preferible un medio sólido (por ejemplo, medio de agar, medio de agarosa, medio de goma gellan, etc.). El medio contiene, preferentemente, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sustancias inorgánicas y similares, que son necesarias para el crecimiento del transformante. Por ejemplo, medio N6, medio MS, medio LS, medio B5 y similares se utilizan como medio basal. El medio puede contener sustancias de crecimiento vegetal (por ejemplo, auxinas, citocininas, etc.) y similares según sea adecuado. El pH del medio varía, preferentemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. La temperatura de cultivo se puede seleccionar de manera adecuada entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 35 °C de acuerdo con el tipo de célula monocotiledónea. Por ejemplo, el callo del arroz se puede cultivar en general de 28 a 33 °C, preferentemente de 30 a 33 °C.
Como se menciona anteriormente, un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, es decir, un complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos, puede expresarse intracelularmente.
Se puede seleccionar un transformante que exprese de manera estable el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos introducidos mediante el cultivo de células monocotiledóneas en un medio complementado con un fármaco correspondiente al gen marcador de selección (por ejemplo, gen de resistencia a fármacos tal como nptll, hpt y similares) contenido en el vector de expresión introducido y la selección de una colonia resistente al fármaco. Si bien el período de cultivo selectivo no está particularmente limitado, una colonia resistente a fármacos en general aparece en alrededor de las 3 a 6 semanas.
Cuando se puede visualizar la introducción de la mutación diana, por ejemplo, cuando la mutación introduce resistencia a fármacos en la célula monocotiledónea o cambia la capacidad de producción de pigmento, también es posible seleccionar directamente una cepa introducida con la mutación utilizando como índice el cambio en el rasgo debido a la introducción de la mutación diana, sin realizar el cribado primario con el marcador de selección.
El transformante se puede subcultivar mediante un método conocido de por sí que es adecuado para el cultivo. Por ejemplo, se puede utilizar el mismo método que se utilizó para el cultivo selectivo del transformante mencionado anteriormente. Mediante el cultivo del transformante a una temperatura inferior a la temperatura general (por ejemplo, 20 a 26 °C, preferentemente aproximadamente 25 °C, para callos de arroz), se puede aumentar la eficacia de la introducción de mutaciones. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, como una interpretación, ya que la PmCDAI, que es una de las enzimas convertidoras de bases de ácidos nucleicos preferidas de la presente invención, procede de Petromyzon marinus, que es un poiquilotermo, la temperatura óptima de actividad de la PmCDAI puede ser inferior a aproximadamente 37 °C, la temperatura óptima de las enzimas generales y, por lo tanto, se considera que la actividad enzimática aumenta con el cultivo a baja temperatura. En una realización preferida de la presente invención, por lo tanto, PmCDA1 se utiliza como una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y la célula monocotiledónea introducida con un complejo de módulo de reconocimiento de secuencias codificantes de ácido nucleico/PmCDA1 se cultiva a baja temperatura.
La eficacia de la introducción de mutaciones también se puede aumentar mediante el cultivo del transformante en condiciones de densidad más elevada de lo normal (por ejemplo, en el caso del callo de arroz, condiciones en las que las células están estresadas por una densidad que provoca que los callos entren en contacto entre sí para limitar el contacto con el medio).
Se puede confirmar si la mutación se ha introducido con éxito en el ADN bicatenario diana del transformante mediante el examen del fenotipo cuando se puede visualizar el cambio de fenotipo mediante la introducción de la mutación. Sin embargo, la confirmación final se realiza preferentemente mediante la amplificación de una región de ADN diana que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante PCR del genoma y la determinación de la secuencia de bases del fragmento amplificado. Incluso un solo clon transformante puede tener una forma de introducción de mutación diferente dependiendo de la célula. Por ejemplo, cuando se utiliza callo como material vegetal, por ejemplo, se repite la operación de suspender el callo transformado en un medio líquido, de volver a sembrar el mismo en un medio sólido y conformar la forma de introducción de la mutación del subclon formado, con lo que se puede obtener un clon que tiene una forma de introducción de mutación uniforme.
Los clones transformantes en los que se confirmó la introducción de la mutación se pueden rediferenciar en plantas mediante un método de rediferenciación conocido de por sí. Cuando una mutación se introduce en heterocigosis, una planta R1 obtenida por autopolinización del cuerpo vegetal obtenido se autopoliniza aún más para dar una planta R2, con lo que se puede obtener un cuerpo vegetal en el que se introduce una mutación en homocigosis.
Cuando un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se expresa mediante un vector de expresión introducido en la célula, el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos reconoce de manera específica y se une a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario (por ejemplo, ADN genómico) de interés y, debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos unida al módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, la conversión de bases se produce en la cadena de sentido o la cadena antisentido del sitio diana o en la proximidad del mismo y se produce un emparejamiento incorrecto en el ADN bicatenario (por ejemplo, cuando la citidina desaminasa tal como PmCDA1, AID y similares se utilizan como una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, la citosina en la cadena de sentido o en la cadena de antisentido en el sitio diana se convierte en uracilo para producir un emparejamiento incorrecto U:G o G:U). Cuando el emparejamiento incorrecto no se repara correctamente y cuando se repara de tal manera que una base de la cadena opuesta forma un par con una base de la cadena convertida (T-A o A-T en el ejemplo mencionado anteriormente) o cuando adicionalmente se sustituye otro nucleótido (por ejemplo, U ^A , G) o cuando se eliminan o insertan de una a varias docenas de bases durante la reparación, se introducen varias mutaciones.
En cuanto al motivo de los dedos de zinc, la producción de muchos motivos de dedos de zinc realmente funcionales no es fácil, ya que la eficacia de producción de un dedo de zinc que se une de manera específica a una secuencia de nucleótidos diana no es elevada y la selección de un dedo de zinc que tiene una especificidad de unión elevada es complicada. Aunque el efector TAL y el motivo de PPR tienen un grado de libertad elevado en el reconocimiento de la secuencia de ácido nucleico diana en comparación con el motivo de dedos de zinc, sigue existiendo un problema en la eficacia ya que es necesario diseñar y construir una proteína grande cada vez de acuerdo con la secuencia de nucleótidos diana.
En cambio, dado que el sistema CRISPR-Cas reconoce la secuencia de ADN bicatenario diana mediante un ARN guía complementario a la secuencia de nucleótidos diana, cualquier secuencia puede ser dirigida simplemente mediante la síntesis de un oligoADN capaz de formar de manera específica un híbrido con la secuencia de nucleótidos diana.
Por lo tanto, en una realización más preferida de la presente invención, un sistema CRISPR-Cas en donde al menos una capacidad de escisión de ADN de la proteína efectora Cas está inactivada (CRISPR-mutante Cas) se utiliza como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos.
El módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención que utiliza CRISPR-Cas mutante se proporciona como un complejo de CRISPR-ARN (ARNcr) que contiene una secuencia complementaria a una secuencia de nucleótidos diana y, si fuera necesario, un ARN transactivante (ARNtracr) necesario para reclutar una proteína efectora Cas mutante (proporcionada opcionalmente como ARN quimera con ARNcr cuando es necesario ARNtracr), y una proteína efectora Cas mutante. Una molécula de ARN que consiste en ARNcr solo o ARN quimérico de ARNcr y ARNtracr, que constituye un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos en combinación con una proteína efectora Cas mutante, se denomina en general como "ARN guía".
La proteína efectora Cas que se utilizará en la presente invención no está particularmente limitada siempre que forme un complejo con el ARN guía y reconozca y se una a la secuencia de nucleótidos diana en el gen diana y un motivo adyacente protoespaciador (PAM, del inglés "protospacer adjacent motif') adyacente al mismo. Se prefiere Cas9 o Cpf1. Los ejemplos de la Cas9 incluyen, pero sin limitación, Cas9 procedente de Streptococcus pyogenes (SpCas9; secuencia de PAM NGG (N es A, G, T o C, en lo sucesivo en el presente documento el mismo), Cas9 procedente de Streptococcus thermophiles (StCas9; secuencia de PAM NNAGAAW), Cas9 procedente de Neisseria meningitides (MmCas9; secuencia de PAM NNNNGATT) y similares. Se prefiere SpCas9 con menos restricción por parte del PAM (sustancialmente 2 bases, en teoría puede dirigirse a casi cualquier parte del genoma). Los ejemplos de la Cpf1 incluyen, pero sin limitación, Cpf1 procedente de Francisella novicida (FnCpfl; secuencia de pAm NTT), Cpf1 procedente de Acidaminococcus sp. (AsCpfl; secuencia de PAM NTTT), Cpf1 procedente de la bacteria Lachnospiraceae (LbCpfl; secuencia de PAM NTTT) y similares. Como proteína efectora Cas mutante (a veces abreviada como Cas mutante) para utilizar en la presente invención, se puede utilizar cualquiera de las proteínas efectoras Cas en donde se inactiva la capacidad de escisión de ambas cadenas del ADN bicatenario, o una que tiene actividad de nickasa en donde solo se inactiva la capacidad de escisión de una cadena. Por ejemplo, en el caso de SpCas9, se puede utilizar un mutante D10A en donde el resto Asp 10 se convierte en un resto Ala y que carece de la capacidad de escisión de una cadena opuesta a la cadena que forma una cadena complementaria con un ARN guía (por lo tanto, que tiene actividad de nickasa con una cadena que forma una cadena complementaria al ARN guía) o un mutante H840A en donde el resto His 840 se convierte en un resto Ala y que carece de la capacidad de escisión de la cadena que forma una cadena complementaria al ARN guía (por lo tanto, que tiene actividad de nickasa con una cadena opuesta a una cadena que forma una cadena complementaria al ARN guía) o un mutante doble del mismo (dCas9), y se puede utilizar otro mutante Cas de manera similar. En el caso de FnCpfl, se puede utilizar una variante que carece de la capacidad de escisión de ambas cadenas, en la que el resto Asp 917 se convierte en el resto Ala (D917A) o el resto Glu 1006 se convierte en el resto Ala (E1006A). Se pueden utilizar otros Cas mutantes de manera similar siempre que carezcan de la capacidad de escisión de al menos una cadena de un ADN bicatenario.
Se proporciona una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos como un complejo con Cas mutante mediante un método similar al esquema de acoplamiento con el dedo de zinc mencionado anteriormente. Como alternativa, una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y Cas mutante también se pueden unir mediante la utilización de aptámeros de ARN MS2F6, PP7 y similares y un armazón de ARN mediante la unión de proteínas al mismo. La secuencia de direccionamiento en el ARN guía forma una cadena complementaria con la secuencia de nucleótidos diana, y la Cas mutante se recluta por otra región en el ARN guía (es decir, una secuencia distinta de la secuencia de direccionamiento en ARNcr o ARNtracr posterior a ARNcr) y reconoce PAM. Uno o ambos ADN no se pueden escindir y, debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos unida al Cas mutante, la conversión de bases se produce en el sitio diana (adecuadamente ajustado dentro de varios cientos de bases, incluida la secuencia de nucleótidos diana completa o parcial) y se produce un emparejamiento incorrecto en el ADN bicatenario. Cuando el emparejamiento incorrecto no se repara correctamente y cuando se repara de manera que una base de la cadena opuesta forma un par con una base de la cadena convertida o cuando adicionalmente otro nucleótido se convierte o cuando se eliminan o insertan de una a varias docenas de bases durante la reparación, se introducen varias mutaciones.
Incluso cuando se utiliza CRISPR-Cas mutante como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, se introducen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, en forma de un ácido nucleico (preferiblemente ADN) que lo codifica, en una célula monocotiledónea que tiene un ADN bicatenario de interés, similar a cuando se utilizan dedos de cinc y similares como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos.
Un ADN que codifica la proteína efectora Cas (por ejemplo, Cas9, Cpf1) se puede clonar mediante un método similar al método mencionado anteriormente para un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, de una célula que produce la enzima. Se puede obtener una Cas mutante mediante la introducción de una mutación para convertir un resto de aminoácido de la parte importante para la actividad de escisión del ADN (por ejemplo, resto Asp 10 y resto His 840 para SpCas9, resto Asp 917, resto GLU 1006 y similares para FnCpfl, aunque no limitado a ellos) en otro aminoácido, en un ADN que codifica Cas clonado, mediante un método de inducción de mutación específica del sitio conocido de por sí.
Como alternativa, un ADN que codifica la Cas mutante también se puede construir como un ADN que muestra el uso de codones adecuado para la expresión en una célula monocotiledónea hospedadora que se va a utilizar, mediante un método similar a los mencionados anteriormente para un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, y mediante una combinación de síntesis química o método de PCR o método de ensamblaje Gibson. Por ejemplo, como ADN de SpCas9 que utiliza un codón adecuado para la expresión en arroz, se puede mencionar un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3.
Un ADN que codifica una Cas mutante y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos pueden unirse para permitir la expresión como una proteína de fusión, o diseñarse para expresarse por separado utilizando un dominio de unión, inteína y similares, y formar un complejo en una célula hospedadora a través de la interacción proteína-proteína y la unión de proteínas. En cualquier caso, de manera deseable se añade un ADN que codifica la Cas mutante y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, a los dos extremos del mismo, con una secuencia (por ejemplo, secuencia codificante NLS procedente de SV40; SEQ ID NO: 5) que codifica una señal de localización nuclear (NLS) capaz de funcionar en una célula monocotiledónea. Cuando Cas mutante y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se expresan como proteínas de fusión, comúnmente pueden tener una secuencia NLS como NLS para añadir al extremo C de una de las proteínas y al extremo N de la otra proteína. Cuando se aplica la técnica CRISPR-Cas a una célula eucariota, la adición de una NLS es un medio convencional para mejorar la eficacia de la translocación nuclear de la proteína efectora Cas. De acuerdo con la presente invención, para expresar Cas mutante como un complejo con una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, el peso molecular se hace grande. Cuando se utiliza como hospedador una célula monocotiledónea que tiene un tamaño grande en comparación con la célula de levadura descrita anteriormente por el presente inventor, la eficacia de la translocación nuclear del complejo puede disminuir. Para mejorar la eficacia de la translocación nuclear del complejo, los presentes inventores concibieron la adición de NLS a ambos extremos de la proteína efectora Cas mutante y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, con lo que se obtuvo con éxito una elevada eficacia de introducción de mutaciones incluso en una célula monocotiledónea mediante la utilización de la técnica de edición genómica de la presente invención.
El ADN obtenido que codifica una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se puede insertar cadena abajo de un promotor de un vector de expresión similar al mencionado anteriormente, por ejemplo, promotor CaMV35S, promotor CaMV19S, promotor NOS, promotor Pcubi4-2, promotor 2 * 35S y similares. Como se menciona anteriormente, el vector de expresión puede contener, cuando se desee, un marcador de selección de un finalizador (por ejemplo, finalizador NOS, finalizador de Pisum sativum rbcS3A, finalizador de la proteína de choque térmico (HSP) 17.3, etc.), un potenciador de la traducción (por ejemplo, región no traducida en 5' a partir de la alcoholdeshidrogenasa procedente del arroz (Os ADH-5'UTR), secuencias O procedentes de CaMV y virus del mosaico del tabaco (TMV), etc.), región reguladora en 3' (por ejemplo, arroz procedente del gen de actina (Act1) 3'UTR, etc.), una señal de adición de poliA, gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, gen de resistencia G418 (nPtll), una gen de resistencia a higromicina (hpt), etc.) y similares. En una realización preferible, para mejorar la eficacia de la traducción en una célula monocotiledónea, se puede insertar Os ADH-5'UTR entre un promotor y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y/o Cas mutante.
Por otro lado, se puede obtener un ADN que codifica un ARN guía mediante el diseño de una secuencia codificante de una secuencia de ARNcr (por ejemplo, cuando se recluta FnCpfl como proteína efectora Cas, se puede utilizar el ARNcr que contiene AAUUUCUACUGUUGUAGAU (SEQ ID NO: 7; las secuencias subrayadas forman pares de bases para tomar una estructura de bucle de tallo) en el lado 5' de la secuencia de direccionamiento) que comprende una secuencia de nucleótidos (también llamada "secuencia de direccionamiento") complementaria a la "cadena diana" de la secuencia de nucleótidos diana, o una secuencia de oligo ADN en la que una secuencia codificante de ARNcr y, si fuera necesario, una secuencia codificante de ARNtracr conocida (por ejemplo, como secuencia codificante de ARNtracr cuando Cas9 se recluta como proteína efectora Cas, gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggc accgagtcggtggtgctttt; SEQ ID NO: 8) se unen y se sintetizan químicamente mediante un sintetizador de ADN/ARN.
Como se utiliza en el presente documento, la "cadena diana" significa una cadena que se hibrida con el ARNcr de la secuencia de nucleótidos diana, y una cadena opuesta que se vuelve monocatenaria mediante hibridación entre la cadena diana y el ARNcr se denominará "cadena no diana". En general se supone que la reacción de conversión de base de ácido nucleico ocurre a menudo en cadenas no diana que se han vuelto monocatenarias. Por lo tanto, cuando la secuencia de nucleótidos diana está representada por una cadena (por ejemplo, cuando se indica la secuencia PAM, cuando se muestra la relación posicional entre la secuencia de nucleótidos diana y PAM, etc.), está representada por la secuencia de la cadena no diana.
Si bien la longitud de la secuencia de direccionamiento no está particularmente limitada siempre que pueda unirse de manera específica a una secuencia de nucleótidos diana, esta es, por ejemplo, de 15 a 30 nucleótidos, preferentemente de 18 a 25 nucleótidos. La selección de la secuencia de nucleótidos diana está limitada por la presencia de PAM adyacentes en el lado 3' (en el caso de Cas9) o en el lado 5' (en el caso de Cpf1) de la secuencia. De acuerdo con el hallazgo en levadura y similares, en el sistema de la presente invención en el que se combinan CRISPR-Cas9 mutante y citidina desaminasa, hay regularidad en que la C ubicada dentro de los 7 nucleótidos en la dirección 3' desde el extremo 5' de la misma se sustituye fácilmente, independientemente de la longitud de la secuencia de nucleótidos diana. Por lo tanto, es posible cambiar el sitio de la base, en el que se puede introducir la mutación, mediante la determinación de manera adecuada de la longitud de la secuencia de nucleótidos diana (secuencia de direccionamiento como una cadena complementaria de la misma). Como resultado, es posible cancelar al menos de manera parcial la restricción por PAM (n Gg en SpCas9), lo que aumenta aún más el grado de libertad de introducción de mutaciones.
Cuando Cas9 se utiliza como proteína efectora Cas, una secuencia de direccionamiento se puede diseñar mediante, por ejemplo, una lista de secuencias de 20 mer adyacentes a PAM (por ejemplo, NGG en el caso de SpCas9) en el lado 3' de las secuencias CDS del gen diana mediante el uso de un sitio web de diseño de ARN guía publicado (herramienta de diseño CRISPR, CRISPR directo, etc.), y la selección de una secuencia que provoque un cambio de aminoácido en la proteína codificada por el gen diana cuando C en 7 nucleótidos en la dirección 3' desde el extremo 5' de la misma se convierte en T. Además, cuando la longitud de la secuencia de direccionamiento cambia dentro del intervalo de, por ejemplo, 18 a 25 nucleótidos, se selecciona de manera similar una secuencia que contiene C que provoca el cambio de aminoácido mediante la conversión de bases dentro de 7 nucleótidos en la dirección 3' desde el extremo 5' de la misma. De estos candidatos, una secuencia candidata con un pequeño número de sitios fuera de la diana en el genoma de la monocotiledónea diana se puede utilizar como secuencia de direccionamiento. Cuando el programa informático de diseño de ARN guía que se utilizará no tiene la función de buscar el sitio fuera de la diana del genoma monocotiledóneo, el sitio fuera de la diana se puede buscar mediante, por ejemplo, la aplicación de una búsqueda Blast al genoma de la monocotiledónea para que sea el hospedador de 8 a 12 nucleótidos (secuencia semilla con capacidad elevada de discriminación de la secuencia de nucleótidos diana) en el lado 3' de la secuencia candidata.
Mientras un ADN que codifica el ARN guía también se puede insertar en un vector de expresión similar al mencionado anteriormente, de acuerdo con el hospedador. Como promotor, se utilizan preferentemente el promotor del sistema pol III (por ejemplo, promotor SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U3, U6, H1, etc.) y un finalizador (por ejemplo, secuencia poli T (secuencia T6, etc.)). Por ejemplo, cuando la célula hospedadora es una célula de arroz, se puede utilizar el promotor U6 o U3 procedente del arroz, más preferiblemente el promotor U6. Cuando se utiliza el promotor del sistema pol III, una secuencia de nucleótidos con 4 o más T consecutivas no debe seleccionarse como secuencia de direccionamiento.
El ADN que codifica el ARN guía (ARNcr o quimera de ARNcr y ARNtracr) se puede obtener mediante el diseño de una secuencia de oligoADN que une una secuencia complementaria a la cadena diana de la secuencia de nucleótidos diana y una secuencia conocida de ARNtracr (cuando se recluta Cas9) o una secuencia de repetición directa de ARNcr (cuando se recluta Cpf1) y mediante la síntesis química utilizando un sintetizador de ADN/a Rn .
Un ADN que codifica Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos y un ADN que codifica el ARN guía (ARNcr o quimera de ARNcr y ARNtracr) se pueden introducir en una célula mediante un método similar al anterior, de acuerdo con la célula monocotiledónea hospedadora. La selección de transformantes que expresan de manera estable Cas mutante y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos, y el cultivo de mantenimiento de los transformantes seleccionados también se pueden realizar de la misma manera que se ha descrito anteriormente.
Dado que la nucleasa artificial convencional acompaña a roturas de ADN bicatenario (DSB), la inhibición del crecimiento y la muerte celular, supuestamente causadas por una escisión desordenada del cromosoma (escisión colateral), se producen mediante el direccionamiento de una secuencia en el genoma. En la presente invención, la mutación no se introduce mediante escisión del ADN, sino por una reacción de conversión del sustituyente en la base del ADN (en particular, la reacción de desaminación) y, por lo tanto, se puede realizar una reducción drástica de toxicidad.
La modificación del ADN bicatenario en la presente invención no evita que se produzca la escisión del ADN bicatenario en un sitio distinto del sitio diana (de manera adecuada ajustado dentro de varios cientos de bases que incluyen la secuencia de nucleótidos diana total o parcial). Sin embargo, una de las mayores ventajas de la presente invención es evitar la toxicidad por escisión colateral. En una realización preferida, por lo tanto, en la presente invención, la modificación del ADN bicatenario no acompaña a la escisión de la cadena de ADN no solo en un sitio diana de un ADN bicatenario dado, sino en un sitio distinto de la misma.
Como se muestra en los ejemplos mencionados a continuación, la tendencia de la forma de introducción de la mutación difiere de manera notable entre cuando Cas9 tiene una actividad de nickasa capaz de escindir solo una de las cadenas del ADN bicatenario y se utiliza como un mutante Cas, y cuando el mutante Cas9 incapaz de escindir ambas cadenas se utiliza como un mutante Cas. Cuando un mutante D10A que carece de la capacidad de escisión de la cadena opuesta (cadena no diana) de la cadena que forma una cadena complementaria con el ARN guía (por lo que tiene actividad de nickasa contra la cadena diana) se utiliza como mutante Cas, es más probable que se introduzca una mutación por eliminación de aproximadamente 1 a 20 nucleótidos que una sustitución de base. La eliminación a menudo ocurre en la región centrada en el sitio de sustitución de bases (dentro de 7 nucleótidos en la dirección 3' desde el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos diana) que el sitio de escisión por Cas (de 2 a 3 nucleótidos cadena arriba de PAM). Al mismo tiempo que la eliminación, puede ocurrir la inserción de uno a varios nucleótidos. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, en la reparación por escisión del nucleótido que ha sufrido una sustitución de base en una cadena no diana, se considera que la reacción de elongación se realiza con la cadena opuesta (cadena diana) como plantilla mientras se eliminan las bases circundantes en monocotiledóneas. En ese momento, cuando la cadena diana contiene una muesca, se supone que el mecanismo de reparación por escisión también funciona en la cadena diana, dando como resultado un estado en el que el nucleótido se cae en ambas cadenas y se produce una unión forzada sin realizar una reacción de elongación normal, como resultado de lo cual, es probable que ocurra una mutación por eliminación.
Por otro lado, cuando se utilizó la Cas9 mutante con ambas cadenas no escindibles, la forma de introducción de la mutación fue principalmente la sustitución de bases como en el caso de la levadura de gemación, Escherichia coli y similares. Sin embargo, el intervalo del sitio de introducción de la mutación es algo más amplio que en el caso de la levadura de gemación y alcanza cadena arriba del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos diana (por ejemplo, 21 nucleótidos cadena arriba de la secuencia PAM). Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, en función de la hipótesis antes mencionada, se asume que, debido a la ausencia de muescas en la cadena diana, una reacción de elongación que utiliza la cadena diana como molde procede normalmente, y la sustitución de bases se convierte en la mutación principal. De manera análoga, se supone que incluso cuando se utiliza el mutante H840A que carece de la capacidad de escisión de la cadena diana (por lo que tiene actividad de nickasa contra la cadena no diana), dado que una reacción de elongación que utiliza la cadena diana opuesta como molde procede normalmente, la forma de introducción de la mutación es principalmente la sustitución de bases.
Por lo tanto, mediante la selección adecuada de la capacidad de escisión de la cadena de ADN del mutante Cas, se puede introducir una sustitución de bases en un nucleótido particular o en una región de nucleótidos en un punto, o se puede introducir una mutación por eliminación dentro de aproximadamente 20 nucleótidos que centran el sitio de sustitución de bases, que puede ser propiedad adoptada de acuerdo con la diana.
Los presentes inventores también confirmaron utilizando levadura de gemación que cuando se producen módulos de reconocimiento de secuencias para las múltiples secuencias de nucleótidos diana adyacentes y se utilizan de manera simultánea, la eficacia de la introducción de mutaciones aumenta de manera radical en comparación con el uso de una sola secuencia de nucleótidos como diana, y también se puede esperar un efecto similar en las células monocotiledóneas. Como efecto de la misma, de manera similar, la inducción de mutaciones se realiza incluso cuando ambas secuencias de nucleótidos diana se superponen parcialmente o cuando ambas están separadas por aproximadamente 600 pb. Puede ocurrir tanto cuando las secuencias de nucleótidos diana están en la misma dirección (la cadena diana es la misma cadena) como cuando son opuestas (las cadenas diana son ambas cadenas de ADN bicatenario).
De manera adicional, se puede realizar la modificación de múltiples regiones de ADN en posiciones completamente diferentes como dianas. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, se pueden utilizar dos o más tipos de módulos de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos que se unen de manera específica a diferentes secuencias de nucleótidos diana (que pueden estar presentes en un gen diana o en dos o más genes diana diferentes). En este caso, cada uno de estos módulos de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos forman un complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos. En este caso, se puede utilizar una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos común. Por ejemplo, cuando el sistema CRISPR-Cas se utiliza como módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, se utiliza un complejo común de una proteína efectora Cas y una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos (que incluye la proteína de fusión), y se producen dos o más ARNcr, o dos o más tipos de ARN quimérico de cada uno de dos o más ARNcr y ARNtracr que forman respectivamente una cadena complementaria con una secuencia de nucleótidos diana diferente y se utilizan como ARN guía (ARNcr o quimera de ARNcr y ARNtracr). Por otro lado, cuando el motivo de dedos de zinc, el efector TAL y similares se utilizan como módulos de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, una enzima convertidora de bases de ácidos nucleicos se puede fusionar con un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos que se une de manera específica a un nucleótido diana diferente.
Para expresar el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente divulgación en una célula monocotiledónea, como se menciona anteriormente, en dicha célula se introduce un vector de expresión que contiene un ADN que codifica el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos. Para una introducción eficaz de la mutación, es deseable mantener una expresión del complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de un nivel determinado o superior durante un periodo no inferior al establecido. Desde este punto de vista, mientras que el vector de expresión ciertamente se incorpora al genoma del hospedador, dado que la expresión sostenida del complejo enzimático de modificación de ácido nucleico aumenta el riesgo de escisión fuera de la diana, preferentemente se elimina de manera rápida después de la introducción exitosa de la mutación. Como un medio para eliminar el ADN incorporado en el genoma del hospedador, se pueden mencionar un método que utiliza un sistema Cre-loxP, un método que utiliza un transposón y similares.
Como alternativa, la edición genómica del hospedador se puede realizar de manera eficaz mientras se evita el riesgo de escisión fuera de la diana mediante la provocación de una reacción de conversión de bases de ácidos nucleicos en una etapa deseada y mediante la expresión transitoria del complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedadora durante un período necesario para fijar la modificación del sitio diana. Aunque el período necesario para una reacción de conversión de bases de ácido nucleico y la fijación de la modificación del sitio diana varía según el tipo de célula hospedadora, las condiciones de cultivo y similares, se considera que son necesarios de unos 2 a 3 días, ya que es necesario realizar al menos varias generaciones de división celular. Los expertos en la materia pueden determinar de manera adecuada un período de inducción de expresión preferible en base a las condiciones de cultivo a utilizar y similares. El período de inducción de expresión del ácido nucleico que codifica el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención, puede ampliarse más allá del "período necesario para fijar la modificación del sitio diana" mencionado anteriormente, siempre que la célula hospedadora esté exenta de efectos secundarios y se pueda mantener la potencia de rediferenciación de la célula hospedadora.
Como medio para expresar transitoriamente el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente divulgación en una fase deseada durante un período deseado, se puede mencionar un método que incluye la producción de una construcción (vector de expresión) que contiene un ácido nucleico (un ADN que codifica un ARN guía y un ADN que codifica una Cas mutante y una enzima de sustitución de base de ácido nucleico en el sistema CRISPR-Cas) que codifica el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos, en una forma capaz de controlar el período de expresión, que introduce la construcción en una célula monocotiledónea. La "forma capaz de controlar el período de expresión" es específicamente, por ejemplo, un ADN que codifica el complejo enzimático modificador de ácidos nucleicos de la presente invención colocado bajo la regulación de una región reguladora inducible. Aunque la "región reguladora inducible" no está particularmente limitada, esta es, por ejemplo, el promotor de inducción antes mencionado (por ejemplo, el promotor del gen PR1a, el promotor del gen rd29A, el promotor del gen GST-27, etc.).
La presente invención se explica a continuación por referencia a los ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.
[Ejemplos]
1. Construcción de vectores
(1) Construcción de vector para evaluación de diana-AID
Se produjeron mediante un método convencional pRIT3-EGFP (que tiene EGFP ORF; SEQ ID NO: 9) y pRIT3-mEGFP (que tiene un codón de finalización inmediatamente después del codón de iniciación de EGFP; SEQ ID NO: 10) que tienen las estructuras que se muestran en la figura 1A.
(2) Construcción del vector Diana-AID
Se produjeron el vector Diana-AID 2408 (que codifica dCas9; SEQ ID NO: 11) y 2409 (que codifica el mutante D10A; SEQ ID NO: 12) que tienen las estructuras que se muestran en la figura 1B mediante la sustitución OS Optel. Cas9 de pZH_OsU6 gRNA_MMCas9 (Plant Mol Biol (2015) 88:561-572) con ADN que codifica el mutante Cas9 que tiene la doble mutación H840A y D10A o la mutación D10A sola, y mediante la fusión cadena abajo del mismo con ADN que codifica PmCDAI optimizado para el uso de codones de Arabidopsis thaliana y que tiene una secuencia que codifica la señal de localización nuclear (NLS) procedente de SV40 añadida a ambos extremos.
2. Introducción de diana-AID y vector de evaluación en Agrobacterium
Los vectores Diana-AID 2408 y 2409 (Figura 1B) y los vectores de evaluación pRIT3-EGFP y pRIT3-mEGFP (Figura 1A) se introdujeron en Agrobacterium (cepa EHA101 de Agrobacterium tumefaciens) mediante electroporación (sistema de electroporación MicroPulser, Bio Rad).
Primero, se produjo una célula competente de Agrobacterium mediante los siguientes procedimientos.
La cepa de Agrobacterium se esparció en medio de agar YEB (Extracto de carne de res 5 g/l, extracto de levadura 1 g/l, peptona Bacto 1 g/l, sacarosa 5 g/l, MgSO42 mM, agar Bacto 12 g (1,2 %)) y se cultivó en un lugar oscuro a 28 °C durante 2 días. La colonia única obtenida se inoculó en medio líquido YEB (5 ml) y se cultivó con agitación en un lugar oscuro a 28 °C durante 12 horas. La suspensión (200 ml) se añadió a 200 ml de medio líquido YEB y se cultivó con agitación en un lugar oscuro a 28 °C y se dejó que proliferara hasta una DO600 = 0,2 a 0,4. A continuación, el hongo se centrifugó (3000 rpm, 4 °C, 10 min) y se recogió, se suspendió en 20 ml de HEPES 10 mM (pH 8,0) y se repitió la centrifugación de 2 a 3 veces. El hongo recogido mediante centrifugación se suspendió en una solución acuosa estéril de glicerol al 10 % (2 ml) para dar una célula competente. A continuación, mediante los procedimientos que se muestran a continuación, cada vector se introdujo en Agrobacterium. Cada vector se disolvió en agua estéril a una concentración de 1 mg/ml, se mezcló con la suspensión de Agrobacterium mencionada anteriormente (50 ml), se transfirió a una cubeta de micropulsador (0,1 cm de separación, BioRad) y se realizó la electroporación (2,2 kV, 5,8 ms). A continuación, a este líquido se le añadieron 800 ml de medio líquido YEB y la mezcla se cultivó en un lugar oscuro a 28 °C durante 2 h, se esparció en medio de agar YEB que contenía 100 mg/l de espectinomicina y se cultivó en un lugar oscuro a 28 °C durante 36 a 48 horas. La colonia bacteriana obtenida se dejó que proliferara en medio líquido YEB (5 ml) que contenía 100 mg/l de espectinomicina, se dispensó a un microtúbulo como una solución de glicerol (concentración final del 35 %) y se conservó a -80 °C.
3. Introducción del vector de evaluación Diana-AID en células cultivadas de arroz
El arroz se transformó básicamente de acuerdo con el método de Terada et al. (Terada, R., Urawa, H., Inagaki, Y., Tsugane, K., y lida, S. (2002) Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat. Biotechnol. 20, 1030­ 1034).
3-1. Preparación de callo de arroz para la transformación
Aproximadamente 100 semillas de arroz (Oryza sativa L. Japonica; Nipponbare) después de retirar la granza se agitaron en etanol al 70 % durante 1 min y se esterilizaron sumergiéndolas en hipoclorito de sodio al 2,5 % durante 20 a 30 min. Después de eso, se enjuagaron con agua estéril inoculada en medio 2N6 (sal mixta para medio N6 (Sigma-Aldrich Co. LLC.) 4,0 g/l, ácido casamino 300 mg/l, mioinocitol 100 mg/l, ácido nicotínico 0,5 mg/l, piridoxina HCl 0,5 mg/l, tiamina HCl 0,5 mg/l, L-prolina 2878 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) 2 mg/l, gelrita 4,0 g/l, pH 5,8), se cultivaron en un lugar oscuro a 31,5 °C durante 3 semanas, con lo que se indujo el agregado de células de desdiferenciación procedente de células del escutelo (callo). Después de esto, cada mes se seleccionó callo con actividad elevada de división celular, se cultivó por pases y el callo después de 4 meses desde el comienzo del cultivo se utilizó para la transformación.
3-2. Preparación de Agrobacterium para la transformación
Cada cultivo bacteriano de Agrobacterium en el que se introdujo un vector para la evaluación de Diana-AID se disolvió en hielo, se esparcieron 300 ml del mismo en medio AB (NH4CI 1 g/l, MgSO4-7H2O 3 g/l, KCl 0,15 g/l, CaCh-2H2O 0,012 g/l, FeSO4-7H2O 0,0025 g/l, K2HPO43 g/l, NaH2PO4H2O 1,15 g/l, sacarosa 5,5 g/l, agarosa 6,0 g/l, pH 7,2) al que se añadió 100 mg/l de espectinomicina y se cultivó en un lugar oscuro a 28 °C durante 3 días. Después de esto, el Agrobacterium proliferado se suspendió en medio líquido AAI (MgSO4-7H2O 5 g/l, CaCh-2H2O 1,5 g/l, NaH2PO4H2O 1.5 g/l, KCl 29,5 g/l, MnSO4-4H2O 10 g/l, ZnO4-7H2O 2 g/l, H3BO3 3 g/l, KI 0,75 g/l, Na2MoO42H2O 0,25 g/l, COCI26 H2O 25 mg/l, CuSO4-5H2O 25 g/l, FeSO4-7H2O 13,9 g/l, Na2 EDTA 18,7 g/l, mioinocitol 100 mg/l, tiamina HCI 0,01 g/l, ácido nicotínico 1 mg/l, piridoxina HCl 1 mg/l) al que se añadió 40 mg/l de acetosiringona (3',5'-dimetoxi-4'-hidroxi-acetofenona) y se cultivó con agitación a 25 °C durante 2 h. La suspensión se diluyó con medio líquido AAI que contenía 40 mg/ml de acetosiringona para preparar una suspensión (120 ml) (DO600 = 0,008).
3-3. Introducción de pRIT3-EGFP, pRIT3-mEGFP en callos de arroz (inoculación con Agrobacterium, cultivo conjunto, eliminación bacteriana, selección de callo recombinante de arroz)
Se recogieron los callos de arroz (aproximadamente 5 g) en un vaso de precipitados de vidrio esterilizado, se añadió la suspensión de Agrobacterium (mencionada anteriormente) con cada vector introducido y se inoculó durante 3 a 5 min con agitación. La suspensión se filtró a través de una malla de acero inoxidable (abertura de la junta 1,5 mm) y se eliminó el Agrobacterium sobrante. A continuación, el papel de filtro de esterilización se colocó en medio del cultivo conjunto 2N6 (sal mixta para medio N6 (fabricado por Sigma) 4,0 g/l, ácido casamino 300 mg/l, mioinocitol 100 mg/l, ácido nicotínico 0,5 mg/l, piridoxina HCl 0,5 mg/l, tiamina HCl 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, glucosa 10 g/l, 2,4-D 2 mg/l, gelrita 4,0 g/l, acetosiringona 40 mg/l, pH 5.2), sobre el que se dispusieron los callos a igual distancia con pinzas, y se cultivaron de manera conjunta en un lugar oscuro a 25 °C durante 3 días. Después de esto, para la eliminación bacteriana de Agrobacterium de los callos después del cultivo conjunto, se recogieron los callos en un vaso de precipitados de 500 ml y se lavaron con líquido de eliminación de bacterias 1 (agua estéril que contenía vancomicina 200 mg/l, Tween20 20 ml/l) (300 ml) con agitación durante 30 min. Después de eso, los callos se recogieron en una malla de acero inoxidable, el agua alrededor de los callos se eliminó con una toalla de papel y la operación de eliminación de bacterias se repitió 4 veces utilizando el líquido de eliminación de bacterias 2 (agua estéril que contiene vancomicina 200 mg/l, Tween20 20 ml/l) (300 ml). A continuación, los callos después de la eliminación de bacterias se cultivaron durante 5 días en medio 2N6NU (sal mixta para medio N6 [fabricado por Sigma] 4,0 g/l, ácido casamino 300 mg/l, mioinocitol 100 mg/l, ácido nicotínico 0,5 mg/l, piridoxina HCl 0,5 mg/l, tiamina HCl 0,5 mg/l, L-prolina 2878 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, 2,4-D 2 mg/l, gelrita 4,0 g/l, vancomicina 100 mg/l, meropenem 25 mg/l, pH 5,8). Después de esto, los callos se dispusieron a la misma distancia en medio de selección 2N6SEPa50 (sal mixta para medio N6 [fabricada por Sigma] 4,0 g/l, ácido casamino 300 mg/l, mioinocitol 100 mg/l, ácido nicotínico 0,5 mg/l, piridoxina HCl 0,5 mg/l, tiamina HCl 0,5 mg/l, L-prolina 2878 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, 2,4-D 2 mg/l, agarosa 8,0 g/l, vancomicina 100 mg/l, meropenem 25 mg/l, pH 5,8) que contenía paromomicina (50 mg/l), y se cultivaron en un lugar oscuro a 31.5 °C durante unas 6 semanas. Como resultado, podrían seleccionarse múltiples linajes de callos resistentes a la paromomicina.
3-4. Análisis de callos de arroz en el que se introdujeron pRIT3-EGFP y pRIT3-mEGFP
Se seleccionaron al azar 96 linajes de callos que mostraron resistencia a la paromomicina después de la introducción de pRIT3-EGFP y se utilizaron para el análisis posterior. El ADN del genoma se extrajo de una parte del callo de cada linaje mediante un aparato automático de extracción de ácidos nucleicos (Kurabo Industries PX-80). Como resultado del análisis de PCR utilizando conjuntos de cebadores "Sbfl-p35S-F" (SEQ ID NO: 13) y "EGFP-Notl-R" (SEQ ID NO: 14) (Tabla 1), se detectó un fragmento de ADN de 1238 pb procedente de pRIT3-EGFP y se pudieron confirmar los genes recombinantes. Como resultado de la observación de los mismos utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia, en todos ellos se detectó señal de EGFP (Figura 2). Se realizó un análisis similar para los callos con la introducción de pRIT3-mEGFP y se confirmó un gen recombinante mediante análisis de PCR. Como resultado de la observación de estos utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia, no se detectó ninguna señal de EGFP (Figura 2).
Figure imgf000017_0001
3-5. Introducción simultánea de pRIT3-mEGFP y 2408, o pRIT3-mEGFP y 2409 en callos de arroz (inoculación con Agrobacterium, cultivo conjunto, eliminación de bacterias, selección de callo recombinante de arroz)
La operación básica siguió 3-3. Se mezclaron cantidades iguales de cultivo bacteriano de Agrobacterium que tenía pRIT3-mEGFP y cultivo bacteriano de Agrobacterium que tenía 2408 o 2409 y se inocularon en callos de arroz (aproximadamente 30 g). La operación posterior para curar el cultivo sigue la mencionada anteriormente. Para el cultivo de selección, se utilizó el medio 2N6SEH40Pa50 que contiene higromicina 40 mg/l y paromomicina 50 mg/l. Después de unas 6 semanas de cultivo de selección, los callos que mostraron resistencia a higromicina y paromomicina se pudieron confirmar en múltiples linajes. Cuando se introdujeron pRIT3-mEGFP y 2408, se obtuvieron 14 linajes y cuando se introdujeron pRIT3-mEGFP y 2409, se obtuvieron 56 linajes.
3-6. Análisis de callos de arroz con introducción de pRIT3-mEGFP y 2408, o pRIT3-mEGFP y 2409
El ADN del genoma se extrajo del callo de cada linaje seleccionado y se realizó un análisis de PCR utilizando conjuntos de cebadores "Sbfl-p35S-F" y "EGFP-Notl-R", y "Hmr-F" (SEQ ID NO: 15) y "Hmr 2408 R-1" (SEQ ID NO: 16) (Tabla 1). Como resultado, 269 linajes contenían transformantes dobles que incorporaban pRIT3-mEGFP y 2408, y 264 linajes contenían aquellos que incorporaban pRIT3-mEGFP y 2409 (Tabla 2, figura 3).
Tabla 2
número de linajes de callos
vector 1 vector 2 linaje de selección de transformante doble detección de señal
GFP frecuencia (%) pRIT3-mEGFP
2408 (hpt) 269 10 3,7 (nptll)
pRIT3-mEGFP 2409 (hpt) 264 41 15,5 ______ (nptll)______
A continuación, todos los callos transformantes dobles se observaron con un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Como resultado, la expresión de EGFP se confirmó en dos linajes (n.° 6 y 3) que incorporaban pRIT3-mEGFP y 2409 (Figuras 4 y 5). Para confirmar la modificación de la secuencia del genoma mediante Diana-AID en estos callos, se extrajo ADN del genoma del callo que expresa EGFP en cada linaje, El producto de PCR que utiliza los conjuntos de cebadores "Sbfl-p35S-F" y "EGFP-Notl-R" (Tabla 1) se purificó con el kit I de purificación de ADN MonoFas (GL Sciences Inc.) y se clonó entre los sitios Sbfl y Notl del vector pCR4 Blunt TOPO (ThermoFisher Inc.). La secuencia de bases de 111 clones en total fue decodificada por un secuenciador de ADN. Como resultado, la modificación de la secuencia de bases mediante Diana-AID se confirmó en una parte del mismo (Tabla 3, figuras 6A y B). En la nickasa de tipo 2409, la frecuencia de mutación de eliminación corta (1 a 20 nucleótidos) fue elevada, pero también podría ocurrir la sustitución de bases sola (Figura 7).
Tabla 3
número de clones sustitución de Eliminación sin mutaciónanalizados bases
111 3 (2,7 %) 7 (6,3 %) 101 (91,0 %)
Por otro lado, cuando se utilizó Cas9 (2408) que carece de la capacidad de escisión de ambas cadenas, la forma de introducción de la mutación fue principalmente la sustitución de bases (Figuras 8, 9 y 10), la región donde ocurrió la sustitución de bases fue más ancha que por la levadura de gemación, y se confirmó fuera de la secuencia de nucleótidos diana (21 nucleótidos cadena arriba de la secuencia PAM) (Figura 10). En las células con señal de GFP negativa, la mutación no se introdujo en la secuencia de nucleótidos diana ni en la proximidad de la misma (Figura 11).
4. Modificación del gen endógeno ALS (Acetolactato sintasa) del arroz
En lo anterior, la modificación del gen informador exógeno mediante Diana-AID tuvo éxito. A continuación, se realizó la modificación del gen endógeno del arroz. Como diana, se seleccionó el gen ALS (acetolactato sintasa) y se probó la creación de un gen ALS de tipo mutante (ALS A96V) en el que el aminoácido 96 se cambia de alanina (A) a valina (V) a través de la sustitución de la base diana en la secuencia del gen. A partir de informes anteriores sobre otras plantas, se prevé que el cuerpo vegetal y el callo del arroz que expresan ALS A96V adquieran resistencia a herbicida (Imazamox) a partir de informes anteriores en otras plantas, pero no hay ningún ejemplo precedente. No hay ningún caso que pruebe el efecto de imazamox en el cuerpo vegetal y callos de arroz en condiciones de cultivo aséptico. Por lo tanto, en este ejemplo, como estudio preliminar, la prueba de concentración eficaz de imazamox para semillas y callos de arroz en condiciones de cultivo aséptico (los siguientes 4-1 y 4-2) y la adquisición de resistencia a imazamox por ALS A96V se confirmaron por primera vez (el siguiente 4-3) y se realizó la modificación de ALS A96V mediante Diana-AID (el siguiente 4-4).
4-1. Verificación de la concentración eficaz de imazamox en el cuerpo vegetal de arroz en condiciones de cultivo aséptico
Basado en medio sólido 1/2 MS (mezcla MS (Sigma), sacarosa 15,0 g/l, gelrita (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 4,0 g/l, pH 5,8), se produjeron medios en 9 etapas (0 mg/l, 0,5 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l, 20 mg/l, 30 mg/l) con diferentes concentraciones de imazamox. De manera sucesiva, se eliminaron las semillas de la paja de arroz (Oryza sativa L. Japonica; Nipponbare), las semillas se agitaron en etanol al 70 % durante 1 min y se esterilizaron sumergiéndolas en hipoclorito de sodio al 2,5 % durante 20 a 30 min mientras se permitía la penetración. Las semillas esterilizadas se inocularon a razón de 24 semillas por área de tratamiento, se cultivaron a 25 °C durante 11 horas con luz (8000 lux)/13 horas en oscuridad durante 7 días y se observaron las condiciones de germinación. Como resultado, 23 semillas de 24 germinaron en medio 1/2 MS sin imazamox y mostraron un crecimiento constante. En el medio adicionado con imazamox a una concentración de 0,5 mg/l o más, en todas las semillas se confirmó el oscurecimiento del tallo del embrión y el blanqueamiento del coleoptilo, y se estiró hasta unos 5 mm (Tabla 4).
A partir de lo anterior, se determinó que la concentración eficaz de imazamox en las condiciones de cultivo aséptico para el cuerpo vegetal de arroz fue de 0,5 mg/l.
[Tabla 4]
Evaluación de la concentración eficaz de imazamox en el cuerpo vegetal de arroz
concentración de imazamox añadido a medio 1/2 MS
0 mg/l 0,5 mg/l 1 mg/l 2 mg/l 4 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 20 mg/l 30 mg/l siembra aséptica 24 24 23 24 24 24 24 24 24 germinación (7 días
23 0 0 0 0 0 0 0 0 después)
tasa de
supervivencia (%) 95,8 0 0 0 0 0 0 0 0
4-2. Verificación de la concentración eficaz de imazamox en callo de arroz en condiciones de cultivo aséptico
Basado en medio sólido 2N6 (mencionado anteriormente), se produjeron medios en 4 etapas (0 mg/l, 30 mg/l, 50 mg/l, 70 mg/l) con diferentes concentraciones de imazamox. El callo se indujo a partir de la parte del escutelo de la semilla de arroz (mencionada anteriormente), se inoculó en medio sólido 2N6 adicionado con imazamox, se cultivó a 31,5 °C durante 28 días en oscuridad todo el día y se confirmó el estado de proliferación del callo. Como resultado, el callo se hinchó en cierta medida en un medio adicionado con imazamox 70 mg/l pero se inhibió la proliferación mitótica. En cambio, se observó proliferación mitótica del callo a una concentración de 50 mg/l o inferior (Figura 12).
A partir de lo anterior, se determinó que la concentración eficaz de imazamox para callos de arroz fue de 70 mg/l.
4-3. Resistencia a imazamox impartida al callo de arroz por el gen ALS de tipo mutante (ALS A96V)
Para evaluar la resistencia a imazamox del callo de arroz mediante mutación de tipo ALS A96V, se construyeron pRIT4-ALS TS y pRIT4-ALS A96V (Figura 13). pRIT4 es un vector binario para la transformación del arroz y tiene higromicina fosfotransferasa (hpt) como gen marcador positivo para las plantas. pRIT4-ALS TS se basa en el ADN del genoma extraído del arroz de tipo silvestre (Oryza sativa L. Japonica; Nipponbare) y se obtiene mediante el aislamiento del gen ALS, el promotor y la región de finalización de la transcripción del mismo mediante clonación por PCR e incorporación de los mismos en pRIT4. pRIT4-ALS A96V se obtiene mediante la producción del gen ALS en el que se introduce de manera artificial la mutación A96V mediante el método de introducción de mutación específica del sitio a través de PCR e incorporación del mismo en pRIT4. Estos dos tipos de vectores se introdujeron (mencionado anteriormente) en el linaje EHA101 de Agrobacterium para transformar (mencionado anteriormente) el callo procedente del escutelo de semilla de arroz. Después de esto, el callo se dispuso a igual distancia en medio de selección (2N6SEH50; sal mixta para medio N6 [fabricada por Sigma] 4,0 g/l, ácido casamino 1000 mg/l, mioinocitol 100 mg/l, ácido nicotínico 0,5 mg/l, piridoxina HCl 0,5 mg/l, tiamina HCl 0,5 mg/l, L-prolina 2878 mg/l, sacarosa 30,0 g/l, 2,4-D 2 mg/l, gelrita 4,0 g/l, vancomicina 100 mg/l, meropenem 25 mg/l, pH 5,8) al que se añadió higromicina 40 mg/l y se cultivó a 31,5 °C en un lugar oscuro durante aproximadamente 4 semanas. Como resultado, se obtuvieron 169 linajes de callos en los que se introdujo pRIT4-ALS TS y 263 linajes de callos en los que se introdujo pRIT4-ALS A96V (Tabla 5). En las siguientes etapas, estos callos se cultivaron de manera individual para cada linaje. Cada linaje de callo proliferado en medio 2N6SEH50 se pasó en un medio de selección (2N6SEH40IMZ70) que es 2N6SEH40 al que se le añadió imazamox 70 mg/l y se cultivó a 31,5 °C en un lugar oscuro durante aproximadamente 6 semanas. Como resultado, de los callos con introducción de pRIT4-ALS TS, 6 linajes de callos (3,6 %) mostraron resistencia a imazamox 70 mg/l. Cuando se introdujo pRIT4-ALS A96V, 261 linajes (99,2 %) mostraron resistencia (Tabla 5).
A partir de lo anterior, se pudo confirmar la resistencia a imazamox impartida al callo de arroz por ALS A96V de tipo mutante.
Resistencia a imazamox impartida al callo de arroz mediante el tipo mutante
ALS A96V
Resistencia a IMZ vector Resistencia a Hm
(%)
ALS (TS) pRIT4-ALS TS 169 6 3,6
ALS (A96V) pRIT4-ALS A96V 263 261 99,2
4-4. Modificación de ALS A96V mediante Diana-AID
Los vectores Diana-AID 1476 (dCas-AID) y 1477 (nCas-AID) se diseñaron para modificarse a ALS A96V mediante la sustitución de la base diana (C287T) del gen ALS en el genoma del arroz (Figura 14). 1476, 1477 se introdujeron (mencionado anteriormente) en el linaje EHA101 de Agrobacterium y se utilizaron para la transformación (mencionada anteriormente) en callos (aproximadamente 8 g) procedentes de embriones de semillas de arroz. El callo que se sometió a inoculación con Agrobacterium y a la eliminación bacteriana se cultivó en medio 2N6NU durante 14 días y se dispuso a igual distancia en medio de selección (2N6SEH40) con higromicina 40 mg/l añadida y se cultivó a 31,5 °C en un lugar oscuro durante aproximadamente 3 semanas. A continuación, se pasó en el mismo medio y se cultivó a 25 °C en un lugar oscuro durante aproximadamente 10 semanas para dar 155 linajes de callo con introducción de 1476 y 203 linajes de callo con introducción de 1477. En las siguientes etapas, los linajes se cultivaron de manera individual. Los callos de cada linaje se dividieron en dos, se pasaron en un medio con higromicina (50 mg/l) añadida (2N6SEH50) y un medio con imazamox 70 mg/l añadido (2N6SEH50IMZ70), y la selección se cultivó a 31,5 °C en un lugar oscuro durante aproximadamente 6 semanas. Como resultado del cultivo en 2N6SEH50, proliferaron los callos de todos los linajes. Cuando se cultivaron en 2N6SEH50IMZ70, se encontró proliferación en 3 linajes de callos con introducción de 1476 y 6 linajes de callos con introducción de 1477. Para confirmar la secuencia del gen ALS en estos 9 linajes de callos, se extrajo el ADN del genoma y se añadieron los sitios de reconocimiento de Sbfl y Notl mientras se amplificaban los fragmentos de ADN mediante PCR utilizando los conjuntos de cebadores "ALS cloning-F" (SEQ ID NO: 17) y "ALS cloning-R" (SEQ ID NO: 18). Los productos de PCR obtenidos se purificaron mediante el kit I de purificación de ADN MonoFas (GL Sciences Inc.) y se clonaron entre el sitio Sbfl-Notl del vector de clonación obtenido mediante la modificación de pDONRZeo (Thermo Fisher Scientific Inc.). La secuencia de bases del clon de plásmido obtenido se analizó mediante un secuenciador de ADN (ABI, 3130XL) utilizando el cebador "ALS F-1" (Se Q ID NO: 19). La secuencia del cebador utilizada se muestra en la tabla 1.
Como resultado, de 6 linajes con introducción de 1477 y que mostraban resistencia a imazamox, se introdujo la mutación A96V en el gen ALS de 4 linajes. En 3 linajes, se confirmó la sustitución (C287T) de la base diana que provocaba la mutación A96V (Figura 15b ). En el linaje restante, también se confirmó C285T sin cambios en la secuencia de aminoácidos además de C287T (Figura 15C). Todos ellas son sustitución de bases de C en la secuencia diana del vector 1477 a T. Con respecto a estos linajes, se confirmó el gen ALS, el promotor del mismo y la secuencia genómica de la región de finalización de la transcripción, pero no se confirmaron mutaciones distintas de C285T y C287T. Por lo tanto, la modificación del gen ALS endógeno del arroz mediante Diana-AID y la resistencia a los herbicidas impartida de ese modo se consideraron satisfactorias. En 3 linajes de 4 linajes exitosos en la introducción de la mutación A96V en el gen ALS, el cuerpo vegetal T0 se rediferenció con éxito (Figura 16). El fragmento de ADN del cuerpo vegetal T0 obtenido, que se amplificó mediante PCR con "ALS cloning-F" y "ALS cloning-R", se secuenció directamente utilizando "ALS F-1". Como resultado, se confirmó la misma mutación (C287T o C285T/C287T) que en el callo del que procedía todos los cuerpos vegetales T0 (Figura 17).
5. Modificación simultánea de múltiples genes mediante Diana-AID
El vector Diana-AID 2455 (dCas-AID) se produjo para la modificación simultánea del gen mEGFP en pRIT3-mEGFP y el gen ALS endógeno del arroz, y expresa respectivamente el mismo ARNg que 2408/2409 y 1476/1477. 2455 se introdujo mediante el método mencionado anteriormente en un callo (aproximadamente 17 g) en el que se introdujo pRIT3-mEGFP para dar 124 linajes de linaje transformante doble. Estos se observaron en un microscopio estereoscópico de fluorescencia y se confirmó la expresión de EGFP en 3 linajes. Además, estos 3 linajes de callos se pasaron en medio 2N6SEH40IMZ70 y se cultivaron a 31,5 °C en un lugar oscuro durante aproximadamente 6 semanas. Como resultado, todos mostraron resistencia a imazamox y proliferaron de manera activa. El ADN del genoma se extrajo de 3 linajes de callos, y la región del gen mEGFP y la región del gen ALS se amplificaron mediante PCR con conjuntos de cebadores "Sbfl-p35S-F" y "EGFP-Notl-R", o "ALS Cloning-F" y " Clonación ALS-R". Los productos de PCR obtenidos se purificaron mediante el kit I de purificación de ADN MonoFas (GL Sciences Inc.) y se sometieron a secuenciación directa. Como resultado, la sustitución de la base diana mediante Diana-AID se confirmó tanto en el gen mEGFP como en el gen ALS en un linaje (Figura 18). El codón de finalización (TAG) establecido inmediatamente después del codón de iniciación del gen mEGFP se modificó a TAT correspondiente a tirosina, y el GTG inmediatamente posterior se modificó a ATG correspondiente a metionina (Figura 18A). C287T se confirmó en el gen ALS (Figura 18B).
A partir de lo anterior, se demostró que Diana-AID puede modificar de manera simultánea múltiples secuencias diana en el genoma del arroz.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un método para modificar un sitio diana de un ADN bicatenario de una célula monocotiledónea, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en donde se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos que se une de manera específica a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN bicatenario dado y una desaminasa, con el ADN bicatenario, para convertir uno o más nucleótidos en el sitio diana en otro o más nucleótidos o eliminar uno o más nucleótidos, o insertar uno o más nucleótidos en el sitio diana, sin escindir al menos una cadena del ADN bicatenario en el sitio diana, en donde el ADN bicatenario se pone en contacto con el complejo mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica el complejo en la célula monocotiledónea y el cultivo de la célula monocotiledónea para expresar intracelularmente el complejo,
en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos se selecciona del grupo que consiste en un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas, un motivo de dedos de zinc, un efector TAL y un motivo PPR, y
en donde se añade una señal de localización nuclear a ambos extremos del módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la desaminasa.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa de cultivo se realiza al menos de manera parcial a una temperatura inferior a la temperatura óptima de cultivo de la célula monocotiledónea.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos es un sistema CRISPR-Cas en donde se inactiva al menos una capacidad de escisión de ADN de Cas.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos es un sistema CRISPR-Cas en el que se inactiva la capacidad de escisión de una cadena opuesta de la cadena que forma una cadena complementaria con un ARN guía.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde se eliminan uno o más nucleótidos del sitio diana.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la desaminasa es citidina desaminasa.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la citidina desaminasa es PmCDAI procedente de Petromyzon marinus, o AID humana.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el módulo de reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos y la desaminasa se optimizan para el uso de un codón de angiosperma o monocotiledónea.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la monocotiledónea es arroz, trigo o maíz y, de manera opcional, en donde la monocotiledónea es arroz.
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