ES2915101T3

ES2915101T3 - Anticuerpos que se unen al receptor cannabinoide 1 (CB1) humano

Info

Publication number: ES2915101T3
Application number: ES15719033T
Authority: ES
Inventors: Anke Kretz-Rommel; Lei Shi; Roger Ferrini; Teddy Yang; Fei Xu; Brian Campion
Original assignee: Bird Rock Bio Inc
Current assignee: Bird Rock Bio Inc
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2022-06-20
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: BR112016022381A2; JP2017512838A; MX2016012403A; TWI694086B; US10308712B2; CL2019000799A1; IL248006B2; TW201600527A; JP6598844B2; CN106232626B; WO2015148984A3; WO2015148984A2; US20230348589A1; EP4159761A1; AU2015237275B2; RU2016141919A; EP3122780A2; US20250236669A1; AU2015237275A1; RU2730674C2

Abstract

Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente al receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento comprenden una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de acuerdo con los SEQ ID NO: 352, 353 y 354, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de acuerdo con los SEQ ID NO: 355, 356 y 357, respectivamente en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo son un agonista inverso del receptor CB1.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen al receptor cannabinoide 1 (CB1) humano

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al receptor receptor cannabinoide 1 (CB1) y a métodos para el uso de dichos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno.

Antecedentes

El receptor cannabinoide 1 (CB1) es un miembro de la superfamilia del receptor unido a la proteína G (GPCR). El receptor CB1 se expresa en el sistema nervioso central (SNC), en los pulmones, en el hígado, en el tejido adiposo y en los riñones y se ha relacionado con muchas enfermedades humanas incluyendo la obesidad, la diabetes, la fibrosis, enfermedades hepáticas, la enfermedad cardiovascular, el cáncer, el dolor, la espasticidad por MS y el glaucoma, entre otras. Más específicamente, se ha demostrado que el receptor CB1 exhibe una acción perjudicial, por ejemplo, en el caso de la obesidad, la diabetes, la fibrosis, las enfermedades hepáticas, la enfermedad cardiovascular y el cáncer; y se ha demostrado que desarrolla una acción beneficiosa en el caso del dolor, la espasticidad por MS y el glaucoma, entre otras.

Existe la necesidad en la técnica de nuevos antagonistas y agonistas del receptor CB1 para fines terapéuticos, así como proteínas que se unen selectivos para fines de diagnóstico/formación de imágenes. En particular, sería deseable un compuesto dirigido al receptor CB1 que carezca de la capacidad de penetración en el SNC para reducir los posibles efectos secundarios mediados por el SNC de la modulación del receptor CB1, resaltados por los eventos adversos psiquiátricos asociados al agonista inverso de CB1 rimonabant. Kuang et al desvelan un anticuerpo monoclonal contra el Receptor Canabinoide 1 (Hybridoma; 31:2, 131-136, 2012). El documento WO2012/007847A2 desvela composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo contra el receptor cannabinoide humano. Robert et al desvelan bloqueantes del receptor CB1 periféricamente restringidos (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 23:15, 4751-4760, 2013). Tam et al citan que el agonismo inverso del receptor cannabinoide periférico reduce la obesidad revirtiendo la resistencia a la leptina (Cell Metabolism; 16:2, 167-179, 2012).

Sumario de la invención

La invención se expone en el conjunto adjunto de reivindicaciones. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están abarcados por las reivindicaciones adjuntas no se consideran ser parte de la presente invención.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (u animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

En un aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con la reivindicación 1, que se unen al receptor cannabinoide 1 (también denominado en el presente documento "receptor CB1" o "CB1"). El receptor CB1 es un receptor CB1 humano. En algunas divulgaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce uno o más epítopos extracelulares sobre el receptor CB1. En algunas divulgaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 y los fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento son anticuerpos funcionales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas divulgaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 o los fragmentos de los mismos inhiben o aumentan la actividad de señalización del receptor CB1. En algunas divulgaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 o los fragmentos de los mismos son anticuerpos antagonistas en el sentido de que inhiben la actividad de señalización del receptor CB1. En algunas divulgaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 o los fragmentos de los mismos son anticuerpos agonistas en el sentido de que potencian la actividad de señalización del receptor CB1. En algunas divulgaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 o los fragmentos de los mismos son moduladores de la actividad de señalización del receptor CB1 o son moduladores alostéricos de la actividad de señalización del receptor CB1. En algunas divulgaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 o los fragmentos de los mismos son proteínas que se unen selectivos sin actividad agonista o antagonista. En algunas divulgaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 o los fragmentos de los mismos son proteínas que se unen selectivos sin actividad agonista o antagonista que son útiles para fines de diagnóstico y/o formación de imágenes.

Los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en algunas divulgaciones, son al menos tan potentes como los moduladores del receptor CB1 de molécula pequeña tales como, por ejemplo, AM6545, AM251 o rimonabant. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos tienen una acción de inhibición o activación del receptor CB1 que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces más potente con respecto a las moléculas pequeñas AM6545, AM251 o rimonabant. En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos inhiben la transducción de señales mediada por el agonista del receptor CB1. En algunas realizaciones, la inhibición de la transducción de señales mediada por el agonista del receptor CB1 se mide determinando los niveles de AMPc intracelular y/o la fosforilación de ERK posterior.

Los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen la ventaja de una penetración en el cerebro reducida o inexistente. En algunas realizaciones, la penetración en el cerebro de los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos presenta penetración en el cerebro reducida con respecto a los agonistas o antagonistas del receptor CB1 de molécula pequeña (por ejemplo, AM6545, AM251 o rimonabant). En algunas realizaciones, los anticuerpos de unión al receptor CB1 y los fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento brindan un beneficio terapéutico con efectos secundarios sobre el sistema nervioso central reducidos con respecto a un agonista o antagonista del receptor CB1 de molécula pequeña. Los efectos secundarios del SNC asociados al antagonista del receptor CB1 de molécula pequeña rimonabant incluyen ansiedad, depresión, agitación, trastornos alimenticios, irritabilidad, agresión e insomnio (Moreira, 2009, Rev Bras Psiquiatr., 31(2):145-53).

En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento se generan a partir de líneas celulares de hibridoma. En otras realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento se generan a partir de bibliotecas de expresión en fagos.

En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento tienen una afinidad por el receptor CB1 humano nativo que es al menos de intervalo nM. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la afinidad por el receptor CB1 es de aproximadamente 1 pM o inferior, o aproximadamente 750 nM o inferior, o aproximadamente 500 nM o inferior, o aproximadamente 250 nM o inferior, o aproximadamente 100 nM o inferior, o aproximadamente 75 nM o inferior, o aproximadamente 50 nM o inferior, o aproximadamente 25 nM o inferior, o aproximadamente 10 nM o inferior, o aproximadamente 1 nM o inferior. En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen una afinidad por el receptor CB1 humano que es de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 0,02 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50 nM.

Los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención pueden derivar de cualquier especie incluyendo, pero no limitado a, ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, primate, llama o ser humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos murinos. En otras realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos quiméricos. En otras realizaciones más, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos humanizados. En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos completamente humanos.

En una realización, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos P1C4 humanizados o quiméricos, según se describen en el presente documento. En una realización, los anticuerpos P1C4 humanizados se seleccionan del grupo que consiste en P1C4-H0, P1C4-H2 y P1C4-H4, según se describe en el presente documento. En una realización, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden modificaciones Fc que dan como resultado una función efectora del anticuerpo reducida, deteriorada o eliminada. En una realización adicional, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se seleccionan del grupo que consiste en P1C4-H0-IgG2-4 híbrido, P1C4-H0-IgG2A330S/P331S, P1C4-H0-IgG4S228P, P1C4-H2-IgG2-4 híbrido, P1C4-H2-IgG2A330S/P331S, P1C4-H2-IgG4S228P, P1C4-H4-IgG2-4 híbrido, P1C4-H4-IgG2A330S/P331S, P1C4-H4-IgG4S228P.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49 y 57. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50 y 58. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51 y 59. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52 y 60. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53 y 61. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54 y 62. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55 y 63. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 y 64.

En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 1; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 3; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 5; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 7.

En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 6; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 8.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 9; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 11; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 13; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 15.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el s Eq ID NO: 10; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 12; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 14; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 16.

En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 17; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 19; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 21; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 23.

En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el s Eq ID NO: 18; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 20; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 22; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 24.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 25; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 27; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 29; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 31.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el s Eq ID NO: 26; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 28; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 30; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 32.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 33; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 35; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 37; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 39.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 34; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 36; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 38; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 40.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 41; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 43; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 45; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 47.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el s Eq ID NO: 42; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 44; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 46; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 48.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 49; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 51; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 53; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 55.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el s Eq ID NO: 50; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 52; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 54; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 56.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 57; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 59; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 61; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 63.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el s Eq ID NO: 58; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo de acuerdo con el SEQ ID NO: 60; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 62; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 64.

La divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que comprende una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 1-351.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada seleccionadas independientemente de las CDR presentes en las regiones variables de cadena pesada de acuerdo con los SEQ ID NO: 2, 10, 18 y 26. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende CDR de cadena ligera seleccionadas independientemente de las CDR presentes en las regiones variables de cadena ligera de acuerdo con los SEQ ID NO: 6, 14, 22 y 30.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado que comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) seleccionadas independientemente de las CDR presentes en las regiones variables de cadena pesada de acuerdo con los SEQ ID NO: 2, 10, 18 y 26. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado que comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR) seleccionadas independientemente de las CDR presentes en las regiones variables de cadena ligera de acuerdo con los SEQ ID NO: 6, 14, 22 y 30.

En una divulgación, la región variable de cadena pesada comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 339-341. En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada que es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 339-341. En una divulgación adicional, la región variable de cadena pesada comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 339-341.

En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 343-351. En una divulgación adicional, la cadena pesada comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 343-351.

En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera que es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 337. En una divulgación adicional, la región variable de cadena pesada comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 337. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 338. En una divulgación adicional, la cadena ligera comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 338.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones, que se une a CB1. En una divulgación adicional, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 337 y una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 339. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 337 y una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 340. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 337 y una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 341. En otra divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena ligera completa de acuerdo con el SEQ ID NO: 338 y una cadena pesada completa de acuerdo con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 343-351.

En una divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 352 (YYWMN). En otra divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de CDR2 de cadena pesada que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 353 (QIYPGDGETKY). En otra divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 354 (SHGNYLPY). En otra divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de CDR1 de cadena ligera que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 355 (SSYLH). En otra divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de CDR2 de cadena ligera que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 356 (STSNLAS). En otra divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una secuencia de CDR3 de cadena ligera que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 357 (HQYHRSPPTF).

En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que comprende secuencias de aminoácidos de acuerdo con los SEQ ID NO: 352, 353 y 354, respectivamente. En otra realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos de acuerdo con los SEQ ID NO: 355, 356 y 357, respectivamente. En una realización adicional, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una CDR1 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada, CDR3 de cadena pesada, CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera y CDR3 de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos de acuerdo con los SEQ ID NO: 352, 353, 354, 355, 356 y 357, respectivamente. En una realización adicional más, el anticuerpo aislado o el fragmento del mismo es quimérico o humanizado.

La persona experta en la materia comprenderá que las CDR de cadena pesada y de cadena ligera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden seleccionarse de forma independiente, o mezclarse y combinarse, para formar un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo que comprenda cualquier CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera; y cualquier CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. La persona experta en la materia comprenderá además que las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden seleccionarse de forma independiente, o mezclarse y combinarse, para formar un anticuerpo o un fragmento de unión que comprenda cualquier cadena pesada y ligera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento.

En una divulgación, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico o un fragmento que contiene CDR de cadena pesada y de cadena ligera seleccionadas de las CDR proporcionadas en el presente documento o variantes conservativas de las CDR proporcionadas en el presente documento. En otra divulgación, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humanizado o un fragmento que contiene CDR de cadena pesada y de cadena ligera seleccionadas de las CDR proporcionadas en el presente documento o variantes conservativas de las CDR proporcionadas en el presente documento. En una divulgación, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada que comprende una secuencia proporcionada en el presente documento o una variante conservativa de la misma. En una divulgación, las variantes conservativas tienen al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de referencia proporcionada en el presente documento. En una divulgación, las variantes conservativas comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos.

En algunas divulgaciones, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a CB1 y presenta una reducción de la función efectora. En una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a CB1 y comprende una o más modificaciones de la región Fc. En una realización adicional, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a CB1 y comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una o más mutaciones en la región Fc. En una realización adicional, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una mutación en la posición 228 y/o 330 y/o 331. En otra realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una mutación en la posición 228 de la región Fc, en donde la región Fc es del isotipo IgG4. En una realización adicional, la mutación es S228P. En otra realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una mutación en la posición 330 y/o en la posición 33 l. En una realización adicional, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una mutación en la posición 330 y/o 331, en donde la región Fc es del isotipo IgG2. En una realización adicional, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo tiene las siguientes mutaciones en la región Fc: A330S y P331S. En otra realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región Fc que es una región Fc híbrida. Por ejemplo, en una realización, la región Fc es una región Fc de IgG2/IgG4 híbrida, en donde las regiones CH1 y bisagra derivan de IgG2 y las regiones CH2 y CH3 derivan de IgG4.

Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico o humanizado o fragmento que contiene CDR de cadena pesada y ligera seleccionado de las CDR proporcionadas en el presente documento, o variantes conservativas de las CDR proporcionadas en el presente documento, en donde el anticuerpo aislado o fragmento del mismo comprende una región Fc que comprende modificaciones que alteran las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, en una divulgación, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende CDR de cadena ligera y pesada de acuerdo con los SEQ ID NO: 352-357, o variantes conservativas de las mismas, y además comprende una región Fc híbrida de IgG2-IgG4, una región Fc de IgG2 que comprende mutaciones de aminoácidos en las posiciones 330 y 331 (por ejemplo, A330S y P331S) o una región Fc de IgG4 que comprende una mutación de aminoácidos en la posición 228 (por ejemplo, S228P).

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CB1, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 70 nM o menos, aproximadamente 60 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 30 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 15 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 8 nM o menos, aproximadamente 6 nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos, aproximadamente 4 nM o menos, aproximadamente 3 nM o menos, aproximadamente 2 nM o menos o aproximadamente 1 nM o menos. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que se une a CB1, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 en el intervalo de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 75 nM, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 4 nM a aproximadamente 10 nM o tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB2 que es aproximadamente 50 nM, o aproximadamente 40 nM, o aproximadamente 30 nM, o aproximadamente 20 nM, o aproximadamente 10 nM, o aproximadamente 5 nM, o aproximadamente 4 nM, o aproximadamente 3 nM, o aproximadamente 2 nM o aproximadamente 1 nM.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 11 veces, al menos 12 veces, al menos 13 veces, al menos 14 veces o al menos 15 veces más potente que la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia del anticuerpo o fragmento o rimonabant se mide mediante inhibición de la transducción de señales mediada por el antagonista del receptor CB1 en un ensayo AMPc. En una realización adicional, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo es humanizado.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CB1, en donde el anticuerpo o el fragmento presenta mayor afinidad de unión y/o mayor potencia que un anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento y el anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente comprende las mismas CDR de cadena pesada y ligera. Por ejemplo, en una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de acuerdo con los SEQ ID NO: 352, 353, 354, 355, 356 y 357, respectivamente, en donde el anticuerpo humanizado presenta mayor afinidad de unión por el receptor CB1 y/o mayor potencia con respecto a la inhibición del agonista del receptor CB1. En una realización, los anticuerpos humanizados y fragmentos proporcionados en el presente documento presentan al menos el 50 % más, al menos el 100 % más, al menos 2 veces más, al menos 3 veces más, al menos 4 veces más, al menos 5 veces más o al menos 10 veces más potencia con respecto al anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente. En una realización adicional, la potencia se mide a través de la inhibición de la producción de CB1- AMPc.

La potencia de los anticuerpos del receptor CB1 proporcionados en el presente documento puede medirse a través de cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una realización, la potencia de los anticuerpos y de los fragmentos proporcionados en el presente documento se mide a través de los niveles de AMPc intracelular o de la fosforilación de ERK. Por ejemplo, la potencia puede medirse mediante el nivel de inhibición de la producción de AMPc en un ensayo funcional de AMPc (Cisbio) o la inhibición de la fosforilación de ERK inducida por WIN55.212 en una transferencia Western.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de competir con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo desvelado en el presente documento para unirse al receptor CB1. La presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de unirse específicamente a esencialmente el mismo epítopo en el receptor CB1 que los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno desvelados en el presente documento. Dichos anticuerpos pueden identificarse usando ensayos de unión de competición de rutina. En determinadas divulgaciones, la competición se mide mediante ELISA, citometría de flujo o ensayo de resonancia de plasmón superficial (SPR).

En algunas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de los mismos se conjugan con uno o más agentes seleccionados del grupo que incluye un agente terapéutico adicional, un agente citotóxico, una molécula de inmunoadhesión y un agente de formación de imágenes. En algunas realizaciones, el agente de formación de imágenes se selecciona del grupo que consiste en un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético y biotina.

En un aspecto, se proporcionan métodos para modular la actividad de señalización del receptor CB1 que comprenden poner en contacto una célula que expresa al receptor CB1 con el anticuerpo o fragmento del mismo desvelado en el presente documento. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados dan como resultado la inhibición de la actividad de la señalización del receptor CB1. En algunas divulgaciones, los métodos proporcionados dan como resultado una actividad aumentada de la señalización del receptor CB1. En algunas divulgaciones, la modulación de la actividad de señalización del receptor CB1 es indirecta, tal como a través de un modulador alostérico. En algunas divulgaciones, la modulación de la actividad de señalización del receptor CB1 se sesga para la señalización mediada por Galpha i/o frente a la señalización mediada por arrestina beta.

Se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o trastorno que responde al antagonismo o agonismo del receptor CB1 en un sujeto que lo necesita. En algunas divulgaciones, los métodos comprenden la administración al sujeto de un anticuerpo anti-receptor CB1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo según se desvela en el presente documento. En una divulgación, el sujeto es un mamífero. En una divulgación adicional, el sujeto es un ser humano. En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es obesidad, diabetes, dislipidemia, enfermedades metabólicas, fibrosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad hepática, cirrosis biliar primaria, enfermedad renal, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, osteoporosis, ateroesclerosis, enfermedad cardiovascular, cáncer, una enfermedad inflamatoria, dolor, espasticidad por MS y enfermedades oculares, incluyendo glaucoma. En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es, por ejemplo, obesidad, diabetes, fibrosis, enfermedad hepática, enfermedad cardiovascular o cáncer y el método proporcionado da como resultado la inhibición de la actividad del receptor CB1. En algunas divulgaciones, la enfermedad o trastorno es, por ejemplo, dolor o glaucoma, y el método proporcionado da como resultado la activación o el aumento de la actividad del receptor CB1.

Se proporciona un método para detectar el receptor CB1 en una célula, tejido o sujeto, comprendiendo el método poner en contacto una célula con un anticuerpo de unión al receptor CB1 o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionado en el presente documento. En una divulgación, la célula está presente en un sujeto. En otra divulgación, la célula está presente en un sujeto humano. En otra divulgación, el nivel de expresión del receptor CB1 en las células se correlaciona con una patología. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para usar anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen específicamente al receptor CB1 como herramientas para el diagnóstico y/o el pronóstico de las enfermedades humanas. La presente divulgación proporciona métodos para la formación de imágenes del receptor CB1 que comprenden el uso de los anticuerpos del receptor CB1 y los fragmentos desvelados en el presente documento. En una divulgación, el método para detectar al receptor CB1 se logra con un anticuerpo del receptor CB1 o fragmento del mismo desvelado en el presente documento que se une selectivamente al receptor CB1. En una divulgación adicional, el anticuerpo del receptor CB1 selectivo o el fragmento del mismo no exhibe actividad agonista o antagonista. En una divulgación adicional, el anticuerpo del receptor CB1 selectivo o el fragmento del mismo no se internaliza. La presente divulgación proporciona métodos de diagnóstico y formación de imágenes que comprenden el uso de un anticuerpo del receptor CB1 o de un fragmento que está conjugado con un agente de formación de imágenes tal como, por ejemplo, un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético o biotina.

En una realización, la invención proporciona una célula hospedadora que expresa un anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la invención. En otra divulgación, se proporciona un método para fabricar un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a un receptor CB1, comprendiendo el método la inmunización de mamíferos con receptor CB1 purificado o un fragmento antigénico del mismo, complejos CB1/lípido, iCAPS del receptor CB1 y/o ADN del receptor CB1. En una divulgación adicional, los mamíferos inmunizados son ratones. En otra divulgación, los mamíferos se inmunizan una, dos, tres, cuatro, cinco o más veces con CB1 purificado o un fragmento antigénico del mismo, complejo de CB1/lípido, iCAPS del receptor CB1 y/o ADN del receptor CB1 antes de recoger las células de los mamíferos inmunizados. En una divulgación adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente al receptor CB1 se genera a partir de una línea celular de hibridoma que comprende células derivadas de los mamíferos inmunizados. En otra divulgación, el anticuerpo o el fragmento del mismo que se une específicamente al receptor CB1 se genera a partir de una biblioteca de expresión en fagos. En una divulgación adicional, la biblioteca de expresión en fagos deriva de células aisladas de los mamíferos inmunizados. En una divulgación adicional, la biblioteca de expresión en fagos deriva de secuencias de inmunoglobulina humanas sin tratamiento previo.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A es un conjunto de histogramas que muestra la unión de mAb P2A12 Bril (columna izquierda), PA2LR3-P2D3 (columna central) o PA2R3-P1A7 (columna derecha) a 300 nM (fila superior) o 30 nM (fila inferior) con la línea celular de CB1 humano nativo Trex-CHO (expresa el receptor CB1 nativo; líneas grises oscuras), Trex-CHO CB1 T210A/compañero de fusión (CB1 sobreexpresado; líneas grises medias) o la línea celular Trex-CHO parental (sin expresión del receptor CB1; líneas grises claras). La figura 1B es un conjunto de histogramas que muestra la unión de PA2R3-P1F1 (columna izquierda), PA2LR3-P2E5 (columna central) o PA2LR3-P3B10 (columna derecha) a 300 nM (fila superior) o 30 nM (fila inferior) con la línea celular de CB1 nativo Trex-CHO (expresa el receptor CB1 humano nativo; líneas grises oscuras), Trex-CHO CB1 T210A/compañero de fusión (CB1 sobreexpresado; líneas grises medias) o la línea celular parental Trex-CHO (sin expresión del receptor CB1; líneas grises claras). La figura 1C es un conjunto de histogramas que muestra la unión de PA2LR3-P3B8 (columna izquierda) o PA2LR3-P1H4 (columna derecha) a 300 nM (fila superior) o 30 nM (fila inferior) con la línea celular de CB1 humano nativo Trex-CHO (expresa el receptor CB1 nativo; líneas grises oscuras), Trex-CHO CB1 T210A/compañero de fusión (CB1 sobreexpresado; líneas grises medias) o la línea celular parental Trex-CHO (sin expresión del receptor CB1; líneas grises claras). La figura 1D es un conjunto de histogramas que muestra la unión de PA2LR3-P4B1 (columna izquierda), PA2LR3-P4B5 (columna central) o PA2LR3-P4C6 (columna derecha) a 300 nM (fila superior) o 30 nM (fila inferior) con la línea celular de CB1 humano nativo Trex-CHO (expresa el receptor CB1 nativo; líneas grises oscuras), Trex-CHO CB1 T210A/compañero de fusión (CB1 sobreexpresado; líneas grises medias) o la línea celular parental Trex-CHO (sin expresión del receptor CB1; líneas grises claras). La figura 1E es un conjunto de histogramas que muestra la unión de PA2LR3-P4G10 (columna izquierda) o PA2LR3-P6D7 (columna derecha) a 300 nM (fila superior) o 30 nM (fila inferior) con la línea celular de CB1 humano nativo Trex-CHO (expresa el receptor CB1 nativo; líneas grises oscuras), Trex-CHO CB1 T210A/compañero de fusión (CB1 sobreexpresado; líneas grises medias) o la línea celular parental Trex-CHO (sin expresión del receptor CB1; líneas grises claras). La figura 1F es un conjunto de histogramas que muestra la unión de PA2LR3-P1G6 (columna izquierda), PA2LR3-P1H4 (columna central) o PA2LR3-P2B8 (columna derecha) con la línea celular parental Trex-CHO (sin expresión del receptor CB1; fila superior), línea celular Trex-CHO CB1 T210A/compañero de fusión (CB1 sobreexpresado; file central) o línea celular Trex-CHO A156 (expresa el receptor CB1 humano nativo; fila inferior).

Las figuras 2A-D muestran la selectividad de dos de los anticuerpos del receptor CB1, PA13R3-P1C4 y 36E12B6C2, para unirse a las células que expresan CB1. La figura 2A (que muestran la unión de PA13R3-P1C4) y la figura 2B (que muestra la unión de 36E12B6C2) muestran que ambos anticuerpos unidos a A156 (expresa el receptor CB1 humano nativo) y, en un grado incluso superior, A56 (sobreexpresa al receptor CB1 modificado por la mutación T210A y el reemplazo de ICL3 por el compañero de fusión) pero no presentó unión con células CHO que no expresan al receptor CB1, línea celular de expresión de CB2 o línea celular de expresión de 5HT2b. La expresión de CB2 (figura 2C) y 5HT2b (figura 2D) se confirmó en las líneas celulares con expresión de CB2 y expresión de 5HT2b, respectivamente.

Las figuras 3A y 3B muestran los resultados de un ensayo de competición para determinar si 36E12B6C2 y P1C4 se unen a epítopos similares. Se incubaron células CB1 humano nativo Trex CHO A156 con IgG competidores (PA13R3-P1C4 IgG o Fab y 36E12B6C2) seguido de diferentes concentraciones de IgG de tinción (300 nM o 75 nM de P1C4, figura 3A; 80 nM o 25 nM de 36E12B6C2, figura 3B).

Las figuras 4A-G muestran los resultados del ensayo antagonista funcional AMPc. Los anticuerpos 36E12B2H8 (figura 4A) y PA13R3-P1C4 (figura 4B) presentaron actividad antagonista que fue equipotente (36E12B2H8) o más potente (PA13R3-P1C4) con respecto a los inhibidores del receptor CB1 de molécula pequeña de control positivo AM251 (figura 4C), SR141716A (rimonabant) (figura 4D) y AM6545 (figura 4E). Se usaron P2A12 y el isotipo IgG de hibridoma como controles negativos (figuras 4F y 4G).

La figura 5A es un conjunto de transferencias Western que muestra ERK fosforilada (pERK) y ERK total en células del receptor CB1 humano nativo Trex-CHO después de la expresión del receptor CB1 y el tratamiento con IgG de control, AM6545 de molécula pequeña de control positivo o mAb PA13R3-P1C4 o PA13R3-P1E4 derivado de fagos, seguido de un tratamiento con 100 nm de agonista del receptor CB1 WIN55.212. Las transferencias Western que se muestran son a partir de 10 minutos después de la activación WIN55.212 (paneles izquierdos) o 15 minutos después de la activación WIN55.212 (paneles derechos). La figura 5B es un conjunto de transferencias Western que muestra pERK y ERK total en células del receptor CB1 humano nativo Trex-CHO después de la expresión del receptor CB1 y el tratamiento con IgG1 de control, IgG2 de control, WIN55.212, AM6545 o mAb 36E12B2E5, 36E12B6C2 o 36E12B2F2 derivado de hibridoma, seguido de la activación de WIN55.212.

La figura 6A muestra los resultados del ensayo funcional AMPc realizado en ausencia de CP55940 para evaluar la posible actividad agonista de PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6B12 y PA2LR3-P6G6, con respecto a los controles ilustrados en la figura 6B: CP55940 (control positivo), P2A12 (control negativo) o PA2R3-P1A7 (control negativo). La figura 6C muestra los resultados del ensayo funcional AMPc realizado en presencia de CP55940 para evaluar la posible actividad moduladora alostérica de PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6B12 y PA2LR3-P6G6, con respecto a los controles ilustrados en la figura 6D: CP55940 solo (control positivo), P2A12 (control negativo) o PA2R3-P1A7 (control negativo).

La figura 7 muestra los resultados de un ensayo AMPc realizado para evaluar la actividad agonista inversa o antagonista neutra de PA13R3-P1C4 y 36E12b6c 2. AM6545 y SR141716A se usaron como controles positivos para el antagonista neutro y el agonista inverso, respectivamente.

La figura 8A muestra un ensayo de unión ELISA iCAPS que evalúa a 36E12B6C2 Fab (panel superior izquierdo) o IgG (panel superior derecho) o P1F7 Fab (panel inferior izquierdo) o Fab (panel inferior derecho) para rBril-0918, iCAPS vacío, iCAPS que no expresa al receptor CB1 (h13h iCAPS) o iCAPS que expresa al receptor CB1 humano (A138 iCAPS y A139 iCAPS). La figura 8B muestra un ensayo de unión ELISA iCAPS que evalúa a PA13R3-P1C4 Fab (panel superior izquierdo) o IgG (panel superior derecho) o P1F7 Fab (panel inferior izquierdo) o Fab (panel inferior derecho) para rBril-0918, ÍCa Ps vacío, iCAPS que no expresa al receptor CB1 (h13h iCAPS) o iCAPS que expresa al receptor CB1 humano (A138 iCAPS y A139 iCAPS).

Las figuras 9A y 9B muestran la internalización del receptor CB1 después de diversos tratamientos. La figura 9A muestra que los anticuerpos CB1 no bloquean la internalización del receptor inducida por WIN55.212. La fila superior de histogramas en la figura 9A muestra la expresión superficial de CB1 después del tratamiento con WIN55.212 o control, o el pretratamiento con el antagonista AM6545 neutro específico de CB1 seguido de WIN55.212. Las filas central e inferior de histogramas en la figura 9A muestran la expresión superficial de CB1 después del pretratamiento con los anticuerpos CB1 PA2LR3-P3A8, PA2LR3-P3F8, PA2LR3-P5B11, PA2LR3-P5E7, PA2LR3-P6B12, PA2LR3-P6G7, PA3R3-P4D5, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P4B5, PA2LR3-P4C6 y PA2LR3-P4G10 o P2A12 de control negativo seguido del tratamiento con WIN55.212. La figura 9B muestra que los anticuerpos CB1 solos no inducen la internalización del receptor CB1. La fila superior de histogramas en la figura 9B muestra la expresión superficial de CB1 después del tratamiento con WIN55.212 o control, o el pretratamiento con el antagonista AM6545 neutro específico de CB1 seguido de WIN55.212. Las filas central e inferior de histogramas en la figura 9B muestran la expresión superficial de CB1 después del tratamiento con los anticuerpos CB1 PA2LR3-P3A8, PA2LR3-P3F8, PA2LR3-P5B11, PA2LR3-P5E7, PA2LR3-P6B12, PA2LR3-P6G7, PA3R3-P4D5, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P4B5, PA2LR3-P4C6 y PA2LR3-P4G10 o P2A12 de control negativo.

La figura 10 muestra los resultados del ensayo del antagonista funcional AMPc para los anticuerpos P1C4 quiméricos contra los humanizados. El anticuerpo humanizado P1C4-H0 presentó actividad antagonista similar al anticuerpo P1C4 quimérico. Los anticuerpos humanizados P1C4-H4 y PIC4-H2 presentaron actividad antagonista más potente con respecto al anticuerpo P1C4 quimérico o al inhibidor del receptor CB1 de molécula pequeña de control positivo rimonabant.

Las figuras 11A y 11B muestran la afinidad de unión, reactividad cruzada y especificidad de los anticuerpos P1 C4 humanizados según lo medido por citometría de flujo. Los anticuerpos P1C4 humanizados P1C4-H2 y PIC4-H4 presentaron afinidad de unión superior por las células CB1 humano nativo (figura 11A, panel superior) y por las células CB1 sobreexpresado (figura 11A, panel inferior) con respecto al anticuerpo quimérico P1C4. Ninguno de los anticuerpos quiméricos o humanizados se unión al CB1 de ratón de expresión de células de ratón, células parentales TRex-CHO o células TRex-CHO que expresan CB2 humano (figura 11B).

La figura 12 muestra la afinidad del anticuerpo P4B5 no marcado contra el anticuerpo P4B5 marcado con Vivotag 680 XL por CB1 en las células.

Las figuras 13A y 13B muestran la detección del anticuerpo P4B5 marcado en el corazón, los pulmones, el hígado, los riñones, el estómago, los intestinos y la vejiga en los momentos 0 h, 1 h, 5 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 144 h (13A.1); y la detección del anticuerpo P4B5 marcado en el cerebro en los momentos 0 h, 1 h, 5 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 144 h (13A.2). La figura 13B muestra la detección del anticuerpo marcado en el cerebro incluyendo tanto el tejido como la sangre (panel izquierdo) frente a la detección del anticuerpo marcado en el cerebro con la señal de sangre sustraída (es decir, solo el tejido cerebral; panel derecho).

Las figuras 14A y 14B muestran los perfiles SEC y los análisis SDS-PAGE para las variantes humanizadas de PA13R3-P1C4 expresadas en las células 293 y CHO-K1. La figura 14A muestra el perfil SEC (arriba) y los análisis SDS-PAGE (abajo) para uno de los lotes de 293 FreeStyle. La figura 14B muestra el perfil SEC (arriba) y los análisis SDS-PAGE (abajo) para uno de los lotes de CHO-K1.

Las figuras 15A y 15B muestran los ensayos funcionales AMPc para las variantes humanizadas PA13R3-P1C4 en comparación con PA13R3-P1C4 quimérico parental y P2A12 mAb, un anticuerpo de control negativo mAb no dirigido a GPCR de isotipo IgG1.

Las figuras 16A y 16B muestran una comparación de la actividad de las variantes humanizadas P1C4-h2-IgG2 y P1C4-h2-IgG4 con rimonabant, AM6545 y el anticuerpo de control negativo P2A12-IgG1 en 1,5 pM de células TRex-CHO CB1 estimuladas por forskolina (figura 16A), así como 5 pM de células TRex-CHO CB1 estimuladas por forskolina (figura 16B).

Las figuras 17A y 17B muestran el efecto del aumento de las concentraciones de P1C4-h2-IgG4 sobre CP55.940 (figura 17A) y WIN55.212 (figura 17C). También se muestran gráficas de Schild para cada tratamiento (figuras 17B y 17D).

Las figuras 18A y 18B muestran los ensayos de activación de ERK de transferencia Western que miden la capacidad de las variantes humanizadas de PA13R3-P1C4 de bloquear la activación de ERK mediada por WIN55.212.

La figura 19A muestra un estudio de internalización del receptor CB1 basado en citometría de flujo en diversas condiciones de inducción, sin inhibidor (panel A) o con rimonabant (panel B) o las variantes humanizadas de PA13R3-P1C4 (paneles C-G). La figura 19B muestra el mismo ensayo de internalización del receptor CB1 que investiga el efecto del P1C4-h2 clonado en los diferentes marcos Fc humanos IgG2 y IgG4.

Las figuras 20A-D muestran los datos de citometría de flujo que miden la unión de las variantes del anticuerpo PA13R3-P1C4 humanizado con las células TRex-CHO transfectadas de forma estable con CB1 humano inducible por tetraciclina. Las figuras 20E-M muestran la selectividad de unión y la reactividad cruzada de las variantes de PA13R3-P1C4 humanizadas por CB1 humano contra CB2 humano y CB1 de ratón.

La figura 21 muestra los datos de citometría de flujo que miden la unión de los anticuerpos (indicada en la parte superior) con las células que expresan diversas construcciones de CB1 (indicado en la izquierda).

Las figuras 22A-D muestran la citotoxicidad mediada por anticuerpos y la citotoxicidad dependiente del complemento de las variantes P1C4 humanizadas P1C4-h2-IgG2 y P1C4-h2-IgG4 en células Daudi. Las figuras 22A-C muestran el efecto de las variantes P14C en los ensayos de toxicidad mediados por anticuerpos. La figura 22D muestra el efecto de las variantes P14C en los ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento. Las figuras 23A y 23B muestran los análisis de transferencia Western que evalúan el reconocimiento de la proteína CB1 desnaturalizada por los anticuerpos primarios de P1C4 indicados o los anticuerpos de control y los anticuerpos secundarios anti-humanos (figura 23A) o anti-ratón (figura 23B). La IgG humana purificada con secundaria humana (figura 23A, carril 1) y primaria de ratón con secundaria anti-conejo (figura 23B, carril 11) se presentan como controles negativos.

La figura 24 muestra los resultados de los experimentos de unión de citometría de flujo (figura 24A) y la inhibición de la producción de AMPc (figura 24B), por fragmentos de anticuerpos Fab P1C4 quiméricos y humanizados incubados con células que expresan al receptor CB1.

La figura 25 muestra tinción específica de CB1 positiva en macrófagos, hepatocitos y miofibroblastos hepáticos en muestras de NASH temprana (panel izquierdo), NASH fibrosis (panel central) y fibrosis tardía (panel derecho). La figura 26 muestra que no se observó tinción con los anticuerpos irrelevantes controlados por isotipo en células derivadas de células normales (panel central) o de fibrosis NASH (panel derecho).

La figura 27 no muestra tinción específica de CB1 en tejidos normales.

La figura 28 muestra los datos de expresión que miden el Pro-colágeno A1(I), en células estelares hepáticas primarias tratadas con PBS, anticuerpo de control no funcional y anticuerpos P1C4-h2.

La figura 29 muestra los datos de expresión de RT-PCR que miden los niveles de expresión de TGFp en las células estelares hepáticas primarias tratadas con los anticuerpos, las concentraciones y los controles indicados. La figura 30 muestra los datos de expresión de TIMP1 que miden los niveles de expresión de TGFp en las células estelares hepáticas primarias tratadas con los anticuerpos, las concentraciones y los controles indicados.

La figura 31 muestra los datos de expresión de a-SMA que miden los niveles de expresión de TGFp en las células estelares hepáticas primarias tratadas con los anticuerpos, las concentraciones y los controles indicados.

Descripción detallada

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de las mismas que se unen selectivamente al receptor cannabinoide 1 humano (CB1). Los anticuerpos y los fragmentos de los mismos son anticuerpos funcionales que agonizan o antagonizan al receptor CB1 o que reconocen selectivamente a CB1 sin actividad agonista o antagonista.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a proteínas de unión que tienen al menos un dominio de unión a antígeno e incluye fragmentos de anticuerpos monoclonales y/o variantes de los mismos incluyendo polipéptidos recombinantes, proteínas de fusión e inmunoconjugados. Por lo tanto, las expresiones "anticuerpo", "fragmento de anticuerpo" y "variante de anticuerpo" se usan indistintamente en el presente documento. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, el fragmento Fab, que consiste en los dominios VL, VH, CL y CHI; el fragmento Fc, que consiste en los dominios VH y CHI; el fragmento Fv que consiste en VL y VH; el fragmento dAb que consiste en un dominio VH; las regiones CDR aisladas; F(ab^')2un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos; y las moléculas Fv de cadena simple (scFv). Los anticuerpos de unión al receptor CB1 proporcionados en el presente documento pueden generarse a partir de cualquier especie, incluyendo, pero no limitado a, ratón, rata, conejo, primate, llama y ser humano. Los anticuerpos de unión al receptor CB1 pueden ser anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos.

Como se usa en el presente documento, el término "derivado" cuando se usa para hacer referencia a una molécula o polipéptido relacionado con un anticuerpo de referencia u otra proteína de unión, significa una molécula o polipéptido que es capaz de unirse con especificidad al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia u otra proteína de unión.

El uso de la forma singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. La palabra "un" o "una" significa "al menos un/a" a menos que se indique específicamente lo contrario. El uso de "o" significa "y/o" a menos que se establezca lo contrario. El significado de la frase "al menos uno" es equivalente al significado de la frase "uno o más". Adicionalmente, el uso de la expresión "que incluye" así como también otras formas, tales como "incluye" e "incluyendo", no es limitante. También, términos tales como "elemento" o "componente" comprenden tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una unidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento son específicos para el receptor cannabinoide 1 (CB1). Por "específico para" se entiende que los anticuerpos y los fragmentos de los mismos se unen al receptor CB1 con mayor afinidad (es decir, un valor Kd de afinidad de unión inferior) que cualquier otra diana. Por lo tanto, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos que son selectivos para el receptor CB1 se unen al receptor CB1 con mayor afinidad (es decir, un valor Kd de afinidad de unión inferior) que cualquier otro receptor cannabinoide o cualquier otro GPCR o cualquier otra diana. Los anticuerpos y los fragmentos o variantes de los mismos pueden tener un valor Kd de afinidad de unión para el receptor CB1 en el intervalo de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 500 nM, de aproximadamente 0,02 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 50 nM. Los anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden tener un valor Kd de afinidad de unión para el receptor CB1 de aproximadamente 500 nM, aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 150 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 75 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 25 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 250 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM o aproximadamente 10 pM. Los anticuerpos y los fragmentos de los mismos pueden tener un valor Kd de afinidad de unión para el receptor CB1 de aproximadamente 100 nM o inferior, aproximadamente 75 nM o inferior, aproximadamente 50 nM o inferior, aproximadamente 10 nM o inferior, aproximadamente 1 nM o inferior, aproximadamente 500 pM o inferior o aproximadamente 100 pM o inferior.

Como se usa en el presente documento, el término "agonista" se refiere a un compuesto que mejora la actividad de señalización de otro compuesto o sitio del receptor.

Como se usa en el presente documento, el término "antagonista" se refiere a un compuesto que inhibe, disminuye o previene la actividad de señalización de otro compuesto en un sitio del receptor y, en términos más generales, se refiere a un compuesto que disminuye o previene la activación y/o la actividad de señalización de un receptor.

Un "modulador alostérico" es un compuesto que modula indirectamente los efectos agonistas de otro compuesto. Por ejemplo, un modulador alostérico puede modular indirectamente el efecto agonista de un agonista receptor mediante la inducción de un cambio conformacional dentro de la estructura de la proteína. Los moduladores alostéricos pueden ser moduladores positivos (amplificar el efecto agonista del compuesto agonista) o negativos (disminuir el efecto del compuesto agonista).

Como se usan en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como profiláctico o a las medidas preventivas. Un sujeto que necesita un tratamiento es un sujeto que ya tiene la enfermedad o trastorno, así como aquellos que pueden desarrollar la enfermedad o trastorno y aquellos en quienes el propósito es prevenir, retrasar o disminuir la enfermedad o trastorno. Los métodos de "tratamiento" desvelados en el presente documento emplean la administración a un sujeto de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno desvelado en el presente documento, por ejemplo, un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado a CB1 (por ejemplo, una enfermedad fibrótica) o con predisposición a sufrir dicha enfermedad o trastorno, para prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno o la enfermedad o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de los esperado sin dicho tratamiento. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" denota un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferentemente, un sujeto es un ser humano.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un compuesto o composición necesaria para proporcionar un beneficio terapéutico y/o preventivo al sujeto. Una cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del sujeto y la afección patológica que se está tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la afección patológica, la forma de administración y similares, que un experto en la materia puede determinar fácilmente. Las dosificaciones para la administración pueden variar de, por ejemplo, aproximadamente 1 ng a aproximadamente 10.000 mg, de aproximadamente 1 ug a aproximadamente 5.000 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1.000 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, desvelado en el presente documento. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz también es una cantidad en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial (es decir, efectos secundarios) de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se minimiza o es superado por los efectos beneficiosos.

I. Anticuerpos anti-CB1 modificados

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-receptor CB1 desvelados en el presente documento pueden comprender una o más modificaciones. Las formas modificadas de los anticuerpos anti-receptor CB1 desvelados en el presente documento pueden realizarse mediante el uso de cualquier técnica conocida en la técnica.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-receptor CB1 y fragmentos de los mismos son conjugados que comprenden además un agente seleccionado del grupo que incluye un agente terapéutico adicional, un agente citotóxico, una molécula de inmunoadhesión y un agente de formación de imágenes. En algunas realizaciones, el agente de formación de imágenes se selecciona del grupo que consiste en un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético y biotina. En algunas realizaciones, el agente de formación de imágenes es un radiomarcador seleccionado del grupo que consiste en: 3H, 14C, 35S, 64Cu, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm. En algunas realizaciones, el agente terapéutico o agente citotóxico se selecciona del grupo que incluye un agente inmunosupresor, un agente inmunoestimulador, un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.

En una realización, el anticuerpo anti-receptor CB1 aislado o el fragmento de unión a antígeno desvelado en el presente documento se conjuga con un antagonista de CB1. Los ejemplos no limitantes de antagonistas de CB1 conocidos incluyen rimonabant, taranabant, VD60, CB1 antisentido Isis-414930, JD5037, AM6545 y TM38837. En una realización, el anticuerpo anti-receptor CB1 aislado o el fragmento de unión a antígeno desvelado en el presente documento se conjuga con rimonabant. En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se conjuga con el agente citotóxico es un antagonista del receptor CB1. En otra realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se conjuga con el agente citotóxico es un aglutinante neutro del receptor CB1 que permite que se produzca la internalización del receptor.

En otro aspecto, el anticuerpo anti-receptor CB1 aislado o el fragmento de unión a antígeno desvelado en el presente documento se conjuga con un agente quimioterapéutico. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecán), briostatina; calistatina; CC-1065 (que incluye sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma 1l y calicheamicina omega 1l (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, que incluye dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como también cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediina cromoproteínas relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; agentes antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamnol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxana; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',22"-triclorotrietilamina; tricotecenas (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ libre de Cremophor, formulación de nanopartículas de paclitaxel modificadas genéticamente con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y TAXOTERE® doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; y sales, ácidos o farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en la definición los inhibidores de proteasoma tales como bortezomib (Velcade), inhibidores de BCL-2, antagonistas IAP (por ejemplo, miméticos Smac/xIAP e inhibidores tales cIAP como determinados péptidos, compuestos de piridina tales como (S)-N-{6-benzo[1,3]dioxol-5-il-1-[5-(4-fluoro-benzoil)-piridin-3-ilmetil]-2-oxo-1,2-dihidro-piridin-3-il}-2-metilamino-propionamida, antisentido xIAP), inhibidores de HDAC (HDACI) e inhibidores de quinasa (Sorafenib). En una realización, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno que se conjuga con el agente citotóxico es un agonista del receptor CB1.

En algunas realizaciones, la proteína de unión se conjuga directamente con el agente. En otras realizaciones, la proteína de unión se conjuga con el agente a través de un enlazador. Los enlazadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de aminoácidos y polipéptidos desvelados en el presente documento. Los enlazadores pueden ser escindibles o no escindibles.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos son anticuerpos biespecíficos o bifuncionales. La expresión "anticuerpos biespecíficos" se refiere a moléculas que combinan los sitios de unión a antígeno de dos anticuerpos dentro de una única molécula. Por lo tanto, un anticuerpo biespecífico es capaz de unirse a dos antígenos diferentes simultáneamente. Un anticuerpo biespecífico normalmente es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión o epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes.

En una realización, el anticuerpo biespecífico y/o fragmento del mismo tiene especificidades de unión dirigidas hacia CB1 y un segundo antígeno diana. En determinadas realizaciones, el anticuerpo biespecífico y/o fragmento del mismo tiene especificidades de unión dirigidas hacia CB1 y TGF-p, 2-AG, PDGF-p, IL-6, anandamida (AEA) o LOXL-2.

Los anticuerpos y fragmentos desvelados en el presente documento pueden unirse a uno o más antígenos diana seleccionados del grupo que consiste en anhidrasa carbónica IX, alfa-fetoproteína, a-actinina-4, A3, antígeno específico para el anticuerpo A33, ART-4, B7, Ba 733, BAGE, BrE3-antígeno, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, antígeno-p específico de colon (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM1, CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvlII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, receptor de folato, antígeno de G250, GAGE, gp100, GROB, HLA-DR, HM1.24, gonadotrofina coriónica humana (Hc G) y sus subunidades, HER2/neu, HMGB-1, factor inducible por hipoxia (HIF-1), HSP70-2M, HST-2, la, IGF-1R, IFN-y, IFN-a, IFN-p, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-1), KC4-antígeno, KS-1-antígeno, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, antígeno específico para el anticuerpo PAM-4, factor de crecimiento placental, p53, PLAGL2, fosfatasa del ácido prostático, PSA, PRAME, PSMA, PIGF, IGF, IGF-1R, IL-6, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, survivina, survivina-2B, TAC, TAG-72, tenascina, receptores TRAIL, TNF-a, antígeno Tn, antígenos Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis tumoral, VEGFR, fibronectina ED-B, WT-1, 17-1A-antígeno, factores del complemento C3, C3a, C3b, C5a, C5, un marcador de angiogénesis, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, un marcador de oncogén y un producto de oncogén (véase, por ejemplo, Sensi et al., Clin Cancer Res 2006, 12:5023-32; Parmiani et al., J Immunol 2007, 178:1975-79; Novellino et al. Cancer Immunol Immunother 2005, 54:187-207).

Los métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos son bien conocidos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein et al., Nature 305:537 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, los hibridomas (cuadromas) producen una mezcla posible de diez moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se logra habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991). Otros métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos se proporcionan, por ejemplo, en Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004.

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión, preferentemente, es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, Ch²y Ch³. Puede tener la primera región constante de cadena pesada (Cm) que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransforman en un organismo hospedador adecuado. Para obtener detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986). Se han desarrollado diversos métodos recombinantes para la producción eficiente de anticuerpos biespecíficos, tanto como fragmentos de anticuerpos (Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470; Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3: 83-105; Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66) como en formatos de IgG de longitud completa (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15).

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención emplea técnicas de biología molecular, biología celular, bioquímica e inmunología convencionales que son bien conocidas en la técnica y que se describen, por ejemplo, en Methods in Molecular Biology, Humana Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989), Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Phage display: a laboratory manual (C. Barbas III et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); y Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).

Esta divulgación proporciona métodos para producir los anticuerpos y los fragmentos o variantes descritos en el presente documento que comprenden inmunizar a los ratones con un inmunógeno del receptor CB1 tal como, por ejemplo, ADN del receptor CB1, proteína del receptor CB1 o complejo de CB1/lípido. En algunas divulgaciones, los ratones se inmunizan 1, 2, 3, 4, 5 o más veces. En algunas divulgaciones, los ratones se inmunizan con ADN del receptor CB1 y la respuesta del receptor CB1 es impulsada por más inmunización con ADN del receptor CB1 y/o proteína del receptor CB1 purificada, membranas que comprenden la proteína del receptor CB1 o iCAPS del receptor CB1. En algunas divulgaciones, se usan células de los ratones inmunizados para generar hibridomas y bibliotecas de fagos.

En algunas divulgaciones, los anticuerpos del receptor CB1 se generan mediante la recuperación de células B de ratones inmunizados y la generación de células de hibridoma productoras del anticuerpo del receptor CB1. La generación de hibridomas es una técnica conocida en la técnica y comprende la fusión de células productoras de anticuerpos con mieloma u otras células inmortalizadas para generar la línea celular de hibridomas productora del anticuerpo inmortalizada (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495). Los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma pueden aislarse del sobrenadante a través de medios convencionales de purificación de inmunoglobulina como precipitación, cromatografía, ultrafiltración, centrifugación, electroforesis en gel y/o cualquier otro método conocido en la técnica. Los sobrenadantes o los anticuerpos monoclonales aislados pueden evaluarse en cuanto a la unión con el receptor CB1 mediante la evaluación de la unión a las membranas del receptor CB1 con respecto a las membranas sin tratamiento. Por ejemplo, los sobrenadantes o los anticuerpos monoclonales aislados pueden evaluarse en cuanto a la unión con el receptor CB1 en un ELISA.

Esta divulgación proporciona métodos para producir los anticuerpos y los fragmentos o variantes descritos en el presente documento que comprenden el uso de una biblioteca de fagos. Los métodos para generar de forma recombinante los anticuerpos mediante tecnología de expresión en fagos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994), McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990) y Clackson et al. Nature 352:624 (1991)). En algunas divulgaciones, se usan bazos de ratones inmunizados para aislar una matriz de anticuerpos anti-receptor CB1 y formar una biblioteca combinatoria aleatoria de genes variables derivados de dichos anticuerpos. En algunas divulgaciones, en lugar de usar las células de ratones inmunizados para generar la biblioteca de expresión en fagos, se genera la biblioteca a partir de genes de cadena pesada y ligera variables de linfocitos de sangre primaria humana.

En algunas divulgaciones, la biblioteca de fagos se selecciona para el fago de unión al receptor CB1 en al menos 3 ciclos de selección y las proteínas que se unen de fagos se seleccionan posteriormente en cuanto a la unión específica con el receptor CB1 mediante ELISA. Pueden seleccionarse proteínas que se unen específicas y convertirse en anticuerpos completos.

En algunas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos proporcionados en el presente documento son anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados. Los métodos para generar anticuerpos quiméricos y humanizados son conocidos en la técnica y se resumen, por ejemplo, en Lo, Benny, K. C., editor, en Antibody Engineering: Methods and Protocols, volumen 248, Humana Press, Nueva Jersey, 2004.

Un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que tiene al menos una parte de la región variable de cadena pesada y al menos una parte de la región variable de cadena ligera derivada de una especie; y al menos una parte de una región constante derivada de otra especie. Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo quimérico puede comprender regiones variables murinas y una región constante humana. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que contiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) derivadas de un anticuerpo no humano; y regiones marco así como regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano.

Como se usa en el presente documento, el término "CDR" o la expresión "región determinante de complementariedad" se refiere a sitios de combinación de antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable tanto de los polipéptidos de cadena pesada como de los de cadena ligera. Estas regiones particulares han sido descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) en donde las definiciones incluyen las superposiciones o subconjuntos de restos de aminoácidos comparados entre sí. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de las secuencias. La numeración exclusiva de IMGT para todas las regiones V de IG y TR de todas las especies se basa en la alta conservación de la estructura de la región variable (Lefranc, Mp et al., Dev comp. Immunol. 27:55-77, 2003). La numeración IMGT, que se establece después de alinear más de 5.000 secuencias considera y combina la definición del marco y las CDR. La definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucle estructural. La definición de Contact (MacCallum et al.) se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas y las interacciones anticuerpo-antígeno. Los restos de aminoácidos que comprenden las CDR tal como las definen cada una de las referencias citadas anteriormente se establecen para su comparación. En una realización desvelada en el presente documento, el término "CDR" es una CDR según lo define la definición de Kabat. En otra realización desvelada en el presente documento, la CDR es una CDR según lo define IMGT.

Las CDR generalmente son importantes para el reconocimiento de epítopos y la unión de anticuerpos. Sin embargo, pueden realizarse cambios a los restos que comprenden las CDR sin interferir con la capacidad del anticuerpo de reconocer y de unirse al epítopo afín. Por ejemplo, pueden realizarse cambios que no afectan el reconocimiento de los epítopos, pero que aumentan la afinidad de unión del anticuerpo por el epítopo. Varios estudios han analizado los efectos de la introducción de uno o más cambios de aminoácidos en diversas posiciones en la secuencia de un anticuerpo, basándose en el conocimiento de la secuencia del anticuerpo primario, en sus propiedades, como el nivel de expresión y de unión (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci EUA 95:8910-8915; y Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539).

Por lo tanto, pueden generarse equivalentes de un anticuerpo de interés mediante el cambio de las secuencias de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera en las regiones CDR1, CDR2 o CDR3 o marco, usando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio, mediada por oligonucleótidos, mutagénesis de casete, PCR susceptible a errores, transposición de ADN o cepas del mutador de E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; y Adey et al., 1996, Chap. 16, pp. 277-291, en Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press). Los métodos para cambiar la secuencia de ácidos nucleicos del anticuerpo primario pueden producir anticuerpos con afinidad mejorada (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci EUA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci EUA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; y Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).

Por ejemplo, los anticuerpos CB1 proporcionados en el presente documento pueden comprender CDR derivadas de uno o más anticuerpos murinos y regiones constantes y marco humanas. Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo humanizado proporcionado en el presente documento se une al mismo epítopo sobre CB1 que el anticuerpo murino del cual derivan las CDR del anticuerpo. En el presente documento, se proporcionan anticuerpos humanizados ilustrativos. Los anticuerpos CB1 humanizados adicionales que comprenden las CDR de cadena pesada y de cadena ligera proporcionados en el presente documento, o variantes de los mismos, pueden generarse usando cualquier secuencia marco humana y también están comprendidos en la presente invención. En una realización, las secuencias marco adecuadas para su uso en la presente invención incluyen aquellas secuencias marco que son estructuralmente similares a las secuencias marco proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones, se seleccionaron marcos humanos basándose en la homología entre el anticuerpo parental y los genes VH y VK de línea germinal humana. Los marcos seleccionados, en algunas realizaciones, tuvieron la homología más alta con los genes VH y VK del anticuerpo parental y también se predijeron, basándose en un modelado informático u otros medios, para apoyar la estructura de CDR prevista para ser presentada por el anticuerpo parental.

Pueden realizarse modificaciones adicionales en las regiones marco para mejorar las propiedades de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Dichas modificaciones marco adicionales pueden incluir modificaciones químicas; mutaciones puntuales para reducir la inmunogenicidad o retirar epítopos de células T; o retromutación al resto en la secuencia de línea germinal original. En una realización de la presente invención, los anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos comprenden un marco humano y las CDR injertadas proporcionadas en el presente documento, sin modificaciones adicionales a la región variable. Los anticuerpos humanizados que no comprenden una retromutación de marco humano se denominan en el presente documento H0 (por ejemplo, P1C4-H0). En otra realización de la presente invención, los anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos comprenden un marco humano y las CDR injertadas proporcionadas en el presente documento, en donde el aminoácido en la posición 27 y/o 28 de la región marco de cadena pesada 1 se retromuta. En una realización adicional, el aminoácido en la posición 27 se retromuta de Gly (G) a Tyr (Y); y el aminoácido en la posición 28 se retromuta de Thr (T) a Glu (E). Los anticuerpos humanizados que tienen dichas mutaciones en las posiciones 27 y 28 se describen en el presente documento como "H2" o "H2 (YE)" (por ejemplo, P1C4-H2 o P1C4-H2 (YE)). En otra realización de la presente invención, los anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos comprenden un marco humano y las CDR injertadas proporcionadas en el presente documento, en donde el aminoácido en la posición 27 y/o 28 de la región marco de cadena pesada 1 y el aminoácido en la posición 60 y/o 61 de la región marco de cadena pesada 3 se retromuta. En una realización adicional, el aminoácido en la posición 27 se retromuta de Gly (G) a Tyr (Y); el aminoácido en la posición 28 se retromuta de Thr (T) a Glu (E); el aminoácido en la posición 60 se retromuta de Ala (A) a Asn (N); y el aminoácido en la posición 61 se retromuta de Gln (Q) a Gly (G). Los anticuerpos humanizados que tienen dichas mutaciones en las posiciones 27, 28, 60 y 61 se describen en el presente documento como "H4" o "H4 (YENG)" (por ejemplo, P1C4-H4 o P1C4-H4 (YENG)). En una realización de la presente invención, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden modificaciones marco como retromutaciones en la cadena ligera. Por ejemplo, en una realización, los anticuerpos comprenden una mutación en la posición 45 y/o 47 de la región marco de cadena ligera 2. En una realización adicional, el aminoácido en la posición 45 se muta de Arg (R) a Lys (K) y el aminoácido en la posición 47 se muta de Leu (L) a Trp (W). La presente invención también comprende anticuerpos humanizados que se unen a CB1 y comprenden modificaciones marco que corresponden a las modificaciones ilustrativas descritas en el presente documento con respecto a cualquier secuencia marco adecuada, así como otras modificaciones marco que mejoran de otro modo las propiedades de los anticuerpos. Los anticuerpos CB1 y los fragmentos de los mismos desvelados en el presente documento pueden ser de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o cualquier combinación de los mismos. El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos codificada por los genes de región constante de cadena pesada. Además, la región constante de cadena pesada puede derivar de cualquier especie incluyendo, pero no limitado a, ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, primate, llama o ser humano. Por ejemplo, en una realización, los anticuerpos CB1 y los fragmentos de los mismos de la presente invención comprenden una región constante Fc de IgG1 humana. En otra realización, los anticuerpos CB1 y los fragmentos de los mismos comprenden una región constante Fc de IgG2 humana, IgG4 humana o IgG2-IgG4 híbrida.

II. Funciones efectoras y modificaciones de Fc

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos CB1 que comprenden regiones Fc variantes. La región Fc de un anticuerpo es la parte del anticuerpo que se une a los receptores Fcy (FcyR) y la molécula del complemento C1q. La región Fc cumple una función en la mediación de las funciones efectoras del anticuerpo. La expresión "funciones efectoras", como se usa en el presente documento con relación a la Fc del anticuerpo, se refiere a funciones del anticuerpo tales como, por ejemplo, la unión a C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); la unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; opsonización; transcitosis; y regulación negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B). Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar dichas funciones efectoras del anticuerpo. Las regiones Fc variantes son regiones Fc que comprenden modificaciones que alteran las funciones efectoras. En algunas realizaciones, los anticuerpos CB1 proporcionados en el presente documento comprenden modificaciones de la región Fc que reducen, deterioraran o eliminan una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en una realización, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos desvelados en el presente documento se unen a CB1 y presentan unión a C1q y/o CDC y/o ADCC reducida, deteriorada o ausente. Las modificaciones Fc pueden ser inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos, o pueden ser modificaciones químicas. Por ejemplo, pueden realizarse modificaciones de la región Fc para aumentar o disminuir la unión al complemento; para aumentar o disminuir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo; o para modificar la glucosilación. Se conocen diversas modificaciones de Fc en la técnica y se han descrito, por ejemplo, en Labrijin et al., Nature Biotech 27(8):767-71 (2009); Idusogie, et al. J Immunol 2000; Greenwood et al Eur J Immunol 23:1098-104 (1993); Mueller et al. Mol Immunol 1997; 34:441-52; y Rother et al Nature Biotechnol 2007; 25:1256-64. Puede aplicarse cualquiera de las modificaciones de Fc conocidas en la técnica a los anticuerpos CB1 ilustrativos desvelados en el presente documento para modificar la función efectora. Además, se han diseñado diversos anticuerpos terapéuticos con modificaciones de la región Fc para modificar la función efectora. Dichos anticuerpos terapéuticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, alemtuzumab, benralizumab, bevacizumab, bimekizumab, cantuzumab, codrituzumab, dalotuzumab, efalizumab, elotuzumab, enavatuzumab, enokizumab, etrolizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, imgatuzumab, itolizumab, lifastuzumab, ligelizumab, lodelcizumab, lorvotuzumab, mogamulizumab, motavizumab, obinutuzumab, ocaratuzumab, omalizumab, parsatuzumab, pateclizumab, perakizumab, pertuzumab, pidilizumab, quilizumab, rontalizumab, sofituzumab, solanezumab, suvizumab, teplizumab, tildrakizumab, tocilizumab, trastuzumab, trastuzumab emtansina, tregalizumab, vedolizumab, vorsetuzumab, vorsetuzumab mafodotina, ytrio (90 Y) clivatuzumab tetraxetan, anrukinzumab, dacetuzumab, daclizumab, etaracizumab, milatuzumab, ozanezumab, pinatuzumab vedotina, polatuzumab vedotina, tigatuzumab, veltuzumab, abituzumab, bococizumab, demcizumab, gevokizumab, ponezumab, ralpancizumab, romosozumab, tanezumab, blosozumab, concizumab, crenezumab, ibalizumab, ixekizumab, lebrikizumab, olokizumab, pembrolizumab, simtuzumab, ulocuplumab, vatelizumab y samalizumab (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 358-432). Puede aplicarse cualquiera de las modificaciones de Fc conocidas en la técnica a los anticuerpos del receptor CB1 proporcionados en el presente documento para modificar la función efectora, la semivida del anticuerpo u otras propiedades de los anticuerpos.

En una realización, el anticuerpo CB1 presenta una función efectora reducida. En una realización adicional, el anticuerpo CB1 comprende una región Fc de IgG4 que tiene una mutación en la posición 228. En una realización adicional, el aminoácido en la posición 228 se muta de serina (S) a prolina (P) (es decir, S228P). En otra realización, el anticuerpo CB1 presenta función efectora reducida y comprende una región Fc de IgG2 que tiene una mutación en la posición 330 y/o 331. En una realización adicional, el aminoácido en la posición 330 se muta de alanina (A) a serina (S) y/o el aminoácido en la posición 331 se muta de prolina (P) a serina (S). En una realización adicional, el anticuerpo CB1 comprende un dominio Fc de IgG2 que tiene las mutaciones A330S y P331S. En otra realización, el anticuerpo CB1 comprende una región Fc híbrida de IgG2/IgG4. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo CB1 comprende una región CH1 y bisagra derivada de IgG2 y una región c H2 y CH3 derivadas de IgG4.

Sistema de presentación del antígeno de conformación (iCAPS). El iCAPS permite la presentación conformacionalmente correcta, aislada, purificada de los GPCR funcionales. Los GPCR purificados se estabilizan en bicapas de lípidos rodeadas por una proteína cinturón.

La divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que codifica uno cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno o variantes de los mismos desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un vector que comprende el ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, se proporciona una célula hospedadora transformada con el vector. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula procariota. En realizaciones adicionales, la célula hospedadora es Escherichia coli. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula eucariota. En realizaciones adicionales, la célula eucariota se selecciona del grupo que consiste en una célula protista, célula animal, célula vegetal y célula fúngica. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero que incluye, pero no se limita a, 293, COS, NS0 y CHO y; o una célula fúngica tal como Saccharomyces cerevisiae; o una célula de insecto tal como Sf9. Una divulgación proporciona métodos para producir los anticuerpos y los fragmentos o variantes descritos en el presente documento que comprenden el cultivo de una cualquiera de las células hospedadoras también en el presente documento en un medio de cultivo en condiciones suficientes para producir la proteína de unión.

Se proporcionan anticuerpos de unión al receptor CB1 ilustrativos a continuación en la Tabla 1. Los anticuerpos de unión al receptor CB1 ilustrativos adicionales se definen por SEQ ID NO y se proporcionan en el listado de secuencias como se muestra en la Tabla 2. Las secuencias para los anticuerpos de unión al receptor CB1 humanizado ilustrativos se proporcionan en la Tabla 3.

Tabla 1. Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena li era de anticuerpos de unión al receptor CB1 ilustrativos

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T l 2. E ID N r l ni r ni n l r r B1 i i n l

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(continuación)

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Los anticuerpos anti-receptor CB1 proporcionados en el presente documento comprenden las secuencias proporcionadas en el presente documento o variantes conservativas de la mismas. Las "variantes conservativas", como se usan en el presente documento, incluyen sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos conservativas. La persona experta en la materia reconocerá que una sustitución de aminoácidos conservativa es una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas similares, tales como, por ejemplo, una cadena lateral similar; y una sustitución, inserción o eliminación de aminoácidos conservativa da como resultado una secuencia que retiene la actividad biológica de la secuencia de referencia. En la técnica, se describen sustituciones conservativas ilustrativas, por ejemplo, en Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Bengamin/Cummings Publication Company, 4a Ed. (1987).

MI. Métodos para tratar trastornos asociados a CB1

Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento pueden administrarse a un sujeto humano con fines terapéuticos. En algunas divulgaciones, se describen en el presente documento métodos de tratamiento que comprenden la administración de anticuerpos y fragmentos de unión o variantes de los mismos a un sujeto.

En determinadas divulgaciones, se proporcionan métodos para el tratamiento de enfermedades en donde los receptores CB1 periféricos se marcan como diana preferencialmente. Los "receptores CB1 periféricos", como se define en el presente documento, son aquellos receptores CB1 que no se localizan en el cerebro o en el sistema nervioso central (por ejemplo, receptores c B l restringidos periféricamente). En cambio, la expresión "receptores CB1 globales" se refiere a los receptores CB1 que se encuentran en cualquier parte del cuerpo, incluyendo en el cerebro y el SNC.

En una divulgación, los anticuerpos aislados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos tales como, por ejemplo, obesidad, diabetes, dislipidemia, fibrosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedades hepáticas, cirrosis biliar primaria, enfermedad cardiovascular, cáncer, dolor, espasticidad por esclerosis múltiple (MS), glaucoma, enfermedades inflamatorias, nefropatías, osteoporosis, trastornos metabólicos, trastornos psiquiátricos, trastornos neurológicos, trastornos neurodegenerativos, trastornos reproductivos, enfermedad renal, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, ateroesclerosis, cáncer y trastornos de la piel, entre otros.

Se ha demostrado que la señalización del receptor CB1 presenta actividad perjudicial, por ejemplo, en la obesidad, la diabetes, la fibrosis, las enfermedades hepáticas, la enfermedad cardiovascular y el cáncer (Kunos et al., 2009, Trends Pharmacol Sci 30:1-7.). En un aspecto, los anticuerpos anti-CB1, o los fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento son útiles para antagonizar la actividad de CB1. En consecuencia, en otro aspecto, la divulgación proporciona métodos para tratar enfermedades o trastornos asociados a CB1 mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos anti-CB1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento. En algunas divulgaciones, los anticuerpos del receptor CB1 antagonistas y los fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento proporcionan un efecto beneficioso cuando se usan como un tratamiento para, o para la prevención de, obesidad, diabetes, fibrosis, enfermedades hepáticas, enfermedades cardiovasculares, adicciones tales como la adicción a la nicotina o cánceres.

La esteatohepatitis no alcohólica (NASH), también conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólica (NAFLD), se refiere a la acumulación de esteatosis hepática que no se debe al consumo excesivo de alcohol. NASH es una enfermedad hepática caracterizada por la inflamación del hígado con acumulación de grasa concurrente. NASH también se encuentra comúnmente en personas con diabetes y obesidad y se relaciona con el síndrome metabólico. NASH es la forma progresiva de la enfermedad del hígado graso no alcohólica relativamente benigna, ya que se puede agravar lentamente y provocar acumulación de fibrosis en el hígado, lo que produce cirrosis (revisado en Smith, et al., 2011, Crit Rev Clin Lab Sci., 48(3):97-113). Actualmente, no existen terapias específicas para NASH.

En un aspecto, los anticuerpos anti-CB1 o los fragmentos de los mismos desvelados en el presente documento se usan en el tratamiento, prevención, detección o estudio de la fibrosis. Varios estudios en modelos de ratón han confirmado la función del receptor CB1 en la fibrosis, incluyendo la fibrosis hepática. (Véase, por ejemplo, Wei et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2):183-192; Tam et al., 2010, J. Clin. Invest. 120(8):2953-66; Wan et al., 2014, Cell Metabolism, 19(6):900-1; Takano et al., 2014, Synapse, 68:89-97). El CB1 periférico se ha relacionado con diversos mecanismos que contribuyen con la NASH y la fibrosis hepática, incluyendo la esteatosis (hígado graso), inflamación y lesión hepática (revisado por Mallat et al., 2013, J Hepatology, 59(4):891-896). Se ha demostrado que CB1 se encuentra regulado por aumento en las células estelares hepáticas humanas (HSC) activadas, que median la fibrosis mediante la transición a miofibroblastos. (Teixeira-Clerc et al., 2006, Nature Med., 12(6):671-76). CB1 también se ha relacionado con la nefropatía diabética. Lin et al., 2014 J. Mol. Med. 92(7):779-92.).

Estudios en ratones con CB1 específico de hepatocitos y global inactivado han encontrado una función importante de CB1 en el tipo celular periférico (hepatocitos) pertinente para diversas enfermedades y trastornos metabólicos. En un modelo de ratón de obesidad inducida por una dieta, los ratones con CB1 global inactivado (CB1-/-) y con CB1 específico de hepatocitos inactivado (LCB1-/-) demostraron esteatosis reducida (hígado graso) y un aumento de la función hepática, por lo tanto demostraron una función de CB1 en el tipo celular periférico (hepatocitos) pertinentes para las patologías esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes y enfermedad de síndrome metabólico. (Osei-Hyiaman et al., 2008, J. Clin. Invest., 118(9):3160-3169; Liu et al., 2012, Gastroenterology, 142:1218-1228). La atenuación selectiva de CB1 usando un ARNip de inactivación de CB1 específico de macrófagos (CB1R-GeRPs) previene la hiperglucemia progresiva y la disminución de la insulina en plasma y el péptido C en ratas diabéticas obesas Zucker (ZDF), que son un modelo común para la resistencia a la insulina t 2d , hiperglucemia y la insuficiencia de las células beta. (Jourdan et al., 2013, Nature Med. 19(9):1132-1140). En un modelo de ratón de esteatosis hepática inducida por alcohol, los ratones con CB1 global inactivado (CB1-/-) y con CB1 específico de hepatocitos inactivado (LCB1-/-) presentan esteatosis reducida y un aumento de la función hepática, por lo tanto demostraron una función de CB1 en el tipo celular periférico (hepatocitos) pertinentes para la patología de la enfermedad esteatosis. (Jeong, et al., 2008, Cell Metabolism, 7:227-235). Se demostró que la acumulación de lípidos se redujo en líneas celulares adiposas blancas epididimales generadas a partir de ratones con CB1 inactivado con respecto al control de tipo silvestre (Wagner et al., 2011, Nutrition and Diabetes, 1:e16).

Estudios en modelos diferentes de enfermedades en ratones han demostrado que los antagonistas de molécula pequeña del receptor CB1 restringidos periféricamente pueden inhibir eficazmente el avance de la fibrosis hepática. (Véase, por ejemplo, Wei et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2):183-192; Tam et al., 2010, J. Clin. Invest. 120(8):2953-66; Wan et al., 2014, Cell Metabolism, 19(6):900-1; Takano et al., 2014, Synapse, 68:89-97). Los ejemplos no limitantes de antagonistas de CB1 conocidos incluyen rimonabant, taranabant, VD60, CB1 antisentido Isis-414930, JD5037, AM6545 y TM38837. Se ha demostrado que los antagonistas de CB1, como rimonabant, inhiben la proliferación celular y regulan por disminución la expresión de genes pro-fibróticos en células estelares hepáticas humanas primarias (HSC), lo que media la fibrosis mediante la transición a miofibroblastos (Patsenker et al., 2011, Mol Med.,17(11-12):1285-1294). En el modelo de ratón de fibrosis hepática inducida por cC l⁴, se demostró que el antagonista de CB1 VD60 (3,4-tionocarbonato de 3,4,22-3-demetoxicarbonil-3-hidroxilmetil-4-deacetil-vindolina) inhibe la producción de la expresión de genes pro-fibróticos (colágeno alfa) y la proliferación en las células estelares hepáticas activadas (línea HSC LX-2), mientras que el agonista de CB1 selectivo Ac EA (N-(2-cloroetil)-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenamida) impidió este efecto (Wei Y. et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2):183-192). Se ha demostrado que el antagonista de CB1 JD5037 revierte la inhibición inducida por endocannabinoides de la señalización de la insulina. (Cinar et al., 2014, Hepatology, 59(1)143-153). El bloqueo de CB1 usando rimonabant revierte el deterioro inducido por la inflamación de la absorción de glucosa en los adipocitos aislados de ratas con dieta alta en grasas (Miranville et al, 2010, Obesity 18: 2247-2254).

Los estudios en seres humanos también vinculan a los receptores CB1 periféricos con la etiología y el avance de la enfermedad. Por ejemplo, la regulación positiva de CB1 en el hígado de pacientes con NASH y HCV se correlacionó con la gravedad de la esteatosis y la fibrosis hepática. (Auguet et al., 2014, BioMed Res. Intl. Vol. 2014, Article ID 502542). Además, el agonismo de CB1 crónico (mediante el uso de cannabis) se correlaciona con la mayor gravedad de la esteatosis hepática y la fibrosis en pacientes con HCV. (Van der Poorten et al., 2010, PlosOne 5, e12841). Además, se ha demostrado que el bloqueo de CB1 en los pacientes obesos mejora la esteatosis hepática. (Despres et al., 2009, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29:416-423).

También se reconocerá que el efecto del antagonismo de CB1 difiere según la ubicación del receptor. Por ejemplo, se sabe que los efectos del antagonismo de CB1 son específicos de los tejidos, porque los efectos cardiometabólicos beneficiosos del rimonabant observados en los pacientes son independientes de la pérdida de peso. (Pi-Sunyeret al, 2006, J Am Coll Cardio. 147: 362A). Adicionalmente, se sabe que rimonabant mejora el control glucémico en los pacientes con diabetes tipo 2, (véase, por ejemplo, Hollander et al., 2010, Diabetes Care. 33(3):605-7) pero que este efecto va acompañado por efectos secundarios psiquiátricos significativos impartidos por los receptores CB1 ubicados en el SNC. (Kunos et al, 2009, Trends Pharmacol Sci 30:1-7; Moreira et al., 2009, Rev Bras Psiquiatr. 31(2):145-53; Pacher P et al, 2013, FEBS J. 280(9): 1918-1943.). Se demostró que el antagonista del receptor CB1 rimonabant mejora el perfil de diversos factores de riesgo metabólicos (incluyendo los niveles de adiponectina) en pacientes con sobrepeso de acuerdo con el Rimonabant en el estudio de obesidad-lípidos (RIO-lípidos). (Véase, por ejemplo, Després et al., 2005, N Engl J Med, 353:2121-2134).

Se ha demostrado que la señalización del receptor CB1 presenta actividad beneficiosa en el dolor, espasticidad por MS y el glaucoma, entre otros. (Pacher et al., 2013, FEBS J. 280(9):1918-1943). En algunas realizaciones, los anticuerpos del receptor CB1 agonistas y los fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento proporcionan un efecto beneficioso cuando se utilizan para tratar, o para prevenir, el dolor, la espasticidad por MS o el glaucoma. Se ha demostrado que los agonistas de CB1 activan la síntesis de ácido graso en el hígado, gluconeogénesis y otras rutas metabólicas. (Véase, por ejemplo, Osei-Hyiaman et al, 2005, J. Clin. Invest., 115(5):1298-1305; Chanda et al., 2012, JBC, 287(45):38041-38049).

La espasticidad por esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés) se refiere a sensaciones de rigidez y una amplia gama de espasmos musculares involuntarios (contracciones musculares sostenidas o movimientos repentinos). La espasticidad es uno de los síntomas más comunes de la MS y puede variar en cuanto al grado de rigidez leve a espasmos dolorosos incontrolables de las extremidades. Si no se trata, la espasticidad puede producir complicaciones graves, incluyendo contracturas (articulaciones congeladas o inmovilizadas) y llagas por presión. Las opciones de tratamiento actuales para la espasticidad por MS incluyen baclofeno, tizanidina, diazepam, dantroleno, fenol, entre otros. Se ha demostrado que los receptores CB1 median el control de la espasticidad en un modelo de ratón de MS.

(Pryce et al., 2007, Br J Pharmacol. 150(4): 519-525).

La activación de los receptores CB1 produce efectos analgésicos en diversos modelos experimentales de dolor, incluyendo dolor visceral derivado del tracto gastrointestinal. También se ha demostrado que los agonistas CB1 tales como WIN55.212-2 y SAB-378 inhiben las respuestas relacionadas con el dolor a los estímulos nocivos repetitivos (Brusberg et al., 2009, J. Neuroscience, 29(5):1554-1564; Talwar et al., 2011, CNS Neurol Disord Drug Targets.

10(5):536-44).

Un experto en la materia sería capaz, mediante experimentación de rutina, de determinar cuál sería una cantidad eficaz y no tóxica de un anticuerpo (o agente terapéutico adicional) a los efectos de tratar una enfermedad o trastorno asociado al CB1. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un polipéptido puede variar de acuerdo con factores tales como la fase de enfermedad (por ejemplo, la fase I en comparación con la fase IV), edad, sexo, complicaciones médicas (por ejemplo, afecciones o enfermedades inmunosuprimidas) y peso del sujeto y la capacidad del anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el sujeto. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas pueden administrarse diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente como se indica según las exigencias de la situación terapéutica. En general, sin embargo, se espera que una dosis eficaz se encuentre en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal por día y, en una divulgación, de aproximadamente 0,5 a 10 miligramos por kilogramo de peso corporal por día.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-CB1 y los fragmentos desvelados en el presente documento se usan en los métodos que utilizan una terapia de combinación en donde los anticuerpos humanos se administran a un sujeto con otro agente terapéutico, tal como uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o que se unen a las moléculas de la superficie celular). Como las redundancias de las rutas de señalización pueden producir falta de respuesta a un anticuerpo único, se han propuesto diversas estrategias para usar terapia combinada con anticuerpos que se unen a epítopos diferentes o antígenos diferentes sobre la misma célula diana. Las combinaciones tales como anti-CD20 y anti-CD22 (Stein et al., Clin Cancer Res 2004, 10:2868-2878), anti-CD20 y anti-HLA-DR (Tobin et al., Leuk Lymphoma 2007, 48:944-956), anti-CD20 y anti-TRAIL-R1 (Maddipatla et al., Clin Cancer Res 2007, 13:4556-4564), anti-IGF-1R y anti-EGFR (Goetsche et al., Int J Cancer 2005, 113:316-328), anti-IGF-1R y anti-VEGF (Shang et al., Mol Cancer Ther 2008, 7:2599-2608) o trastuzumab y pertuzumab que se dirigen a diferentes regiones de EGFR2 humano (Nahta et al., Cancer Res 2004, 64:2343-2346) se han evaluado preclínicamente y mostraron actividad antitumoral mejorada o sinérgica in vitro e in vivo. Estas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas del agente terapéutico administrado, evitando de esta manera las posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias.

Los anticuerpos y los fragmentos desvelados en el presente documento pueden administrarse en combinación con cualquier agente terapéutico deseado. En determinadas divulgaciones, los anticuerpos y los fragmentos desvelados en el presente documento se administran en combinación, por ejemplo, con un anticuerpo LOXL2, anticuerpo TGFp, nintedanib, inhibidor de tirosina quinasa, agonista PPAR, agonista del receptor de Farnesoide X (FXR), agonista del receptor de péptido 1 similar al glucagón o inhibidor de caspasa.

IV. Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-CB1 o un fragmento del mismo.

Los métodos para preparar y administrar los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento a un sujeto son bien conocidos para el experto en la materia o son fácilmente determinados por este. La vía de administración de los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Las formas intravenosa, intraarterial, subcutánea e intramuscular de administración parenteral pueden usarse en determinadas realizaciones. Aunque todas estas formas de administración se contemplan claramente como dentro del alcance desvelado en el presente documento, una forma de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección intravenosa o intraarterial o goteo. Habitualmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (por ejemplo, tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizante (por ejemplo, albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros métodos compatibles con las enseñanzas en el presente documento, los polipéptidos pueden administrarse directamente en el lugar de la población celular adversa, aumentando de la misma forma la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. En la invención objeto, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampón fosfato 0,01-0,1 M (por ejemplo, 0,05 M) o solución salina al 0,8 %. Otros vehículos parenterales comunes incluyen las soluciones de fosfato de sodio, solución Ringer con dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, solución Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como aquellos basados en la solución Ringer con dextrosa y similares. Los conservantes y otros aditivos también pueden estar presentes como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen dispersiones o soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles. En dichos casos, la composición debe ser estéril y fluida en la medida en que exista la posibilidad de colocarla en una jeringa fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y, en una realización, se preservará contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula necesario en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En determinadas realizaciones, se incluyen agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En cualquier caso, las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de un compuesto activo (por ejemplo, un anticuerpo solo o en combinación con otros principios activos) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con un ingrediente de los mencionados anteriormente o una combinación de los mismos, según sea necesario, seguido por una esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los mencionados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación pueden ser los siguientes: secado al vacío y liofilizado que proporcionan un polvo de un principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente en condiciones estériles del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se colocan en recipientes tales como ampollas, bolsas, frascos, jeringas o viales y se sellan en condiciones asépticas de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones se pueden envasar y vender en forma de un kit como los que se describen en el N.° de serie estadounidense 09/259.337 y N.° de serie estadounidense 09/259.338 co-pendiente. Dichos artículos de fabricación, en una realización, tendrán etiquetas o prospectos que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para el tratamiento de un sujeto que padece de trastornos autoinmunitarios o neoplásicos, o que tiene una predisposición a ellos.

Las dosis eficaces de los anticuerpos estabilizados, o fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento se pueden titular utilizando métodos de rutina conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y la efectividad.

Para la inmunización pasiva con un anticuerpo desvelado en el presente documento, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg y, más habitualmente, de 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg o, en realizaciones específicas, al menos 1 mg/kg. También se considera que los intermedios de las dosis en los intervalos anteriores se encuentran dentro del alcance desvelado en el presente documento.

Los sujetos pueden recibir dichas dosis diariamente, en días alternativos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro plan determinado a través de análisis empíricos. Un tratamiento ilustrativo comprende la administración en múltiples dosificaciones durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ilustrativos adicionales comprenden la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los planes de dosificación ilustrativos incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, se administran dos o más anticuerpos monoclonales con especificidades de unión diferentes simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado puede encontrarse dentro de los intervalos indicados.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento, pueden administrarse en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis únicas pueden ser, por ejemplo, diaria, semanal, mensual o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica mediante la medición de los niveles en sangre del polipéptido o de la molécula diana en el paciente. En algunos métodos, se ajusta la dosificación para lograr determinada concentración del anticuerpo o toxina en plasma, por ejemplo, 1-1000 ug/ml o 25-300 ug/ml.

Alternativamente, los anticuerpos, o los fragmentos de los mismos, pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran la mayor semivida, seguido de los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. En una divulgación, los anticuerpos, o los fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento pueden administrarse de forma no conjugada. En otra divulgación, los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden administrarse múltiples veces en forma conjugada. En otra divulgación más, los anticuerpos, o los fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento pueden administrarse en forma no conjugada, después en forma conjugada, o viceversa.

La dosificación y la frecuencia de administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos del presente documento o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que todavía no se encuentra en estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente. Dicha cantidad se define como una "dosis profiláctica eficaz". En este uso, las cantidades precisas dependen, nuevamente, del estado de salud y de inmunidad general del paciente, pero generalmente varían de 0,1 a 25 mg por dosis, especialmente de 0,5 a 2,5 mg por dosis. Se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas.

En aplicaciones terapéuticas, a menudo se requiere una dosificación relativamente alta (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de anticuerpo por dosis, con dosificaciones de 5 a 25 mg que se usan más comúnmente para radioinmunoconjugados y dosis más altas para moléculas conjugadas con fármacos de citotoxina) en intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o finaliza el avance de la enfermedad y, en realizaciones particulares, hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se le puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

En una realización, un sujeto se puede tratar con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido desvelado en el presente documento (por ejemplo, en un vector). Las dosis para ácidos nucleicos que codifican polipéptidos varían de aproximadamente 10 ng a 1 g, de 100 ng a 100 mg, de 1 ug a 10 mg o 30-300 ug de ADN por paciente. Las dosis para vectores víricos infecciosos varían de 10-100, o más, viriones por dosis.

Los agentes terapéuticos pueden administrarse por medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para el tratamiento profiláctico o terapéutico. La inyección intramuscular o la infusión intravenosa pueden usarse para la administración de un anticuerpo desvelado en el presente documento. En algunos métodos, los anticuerpos terapéuticos, o los fragmentos de los mismos, se inyectan directamente en el cráneo. En algunos métodos, los anticuerpos, o los fragmentos de los mismos, se administran como una composición o dispositivo de liberación progresiva, tales como el dispositivo Medipad™.

Los agentes desvelados en el presente documento pueden administrarse, opcionalmente, en combinación con otros agentes que son eficaces para tratar el trastorno o afección que necesita tratamiento (por ejemplo, profiláctico o terapéutico). Los agentes adicionales son aquellos que son reconocidos en la técnica y que se administran rutinariamente para un trastorno particular.

Aunque se ha obtenido mucha experiencia clínica con 131I y 90Y, en la técnica, se conocen otros radiomarcadores y se han usado para fines similares. Se usan otros radioisótopos más para la formación de imágenes. Por ejemplo, los radioisótopos adicionales que son compatibles con el alcance de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211A 213Bi. En este sentido, los emisores alfa, gamma y beta son todos compatibles con la presente invención. Además, a la luz de la presente divulgación, se establece que los expertos en la materia podrán determinar fácilmente qué radionúclidos son compatibles con un tratamiento seleccionado sin experimentación indebida. Para este fin, otros radionúclidos que ya se han usado en diagnóstico clínico incluyen 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga así como 111In. Los anticuerpos también se han marcado con diversos radionúclidos para el uso potencial en inmunoterapia dirigida (Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111, 1987). Estos radionúclidos incluyen 188Re y 186Re, así como 199Au y 67Cu en menor medida. La patente de EE.UU. N.° 5.460.785 proporciona datos adicionales con respecto a dichos radioisótopos.

Como se analizó anteriormente, los anticuerpos, o los fragmentos de los mismos, desvelados en el presente documento pueden administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamiento in vivo de los trastornos en mamíferos. En este aspecto, se observará que los anticuerpos desvelados, o los fragmentos de los mismos, se formularán para facilitar la administración y promover la estabilidad del principio activo. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden un vehículo estéril, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tales como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. Para los fines de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo desvelado en el presente documento, conjugado o no conjugado a un agente terapéutico, significará una cantidad suficiente para lograr una unión eficaz a una diana y lograr un beneficio, por ejemplo, mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno o detectar una sustancia o célula. En el caso de las células tumorales, el polipéptido será, en determinadas realizaciones, capaz de interactuar con antígenos inmunorreactivos en células neoplásicas o inmunorreactivas y proporcionará un aumento en la muerte de esas células. Por supuesto, las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento pueden administrarse en dosis únicas o múltiples para proporcionar una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido.

De acuerdo con el alcance de la presente divulgación, los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden administrarse a un ser humano u otro animal de acuerdo con los métodos de tratamiento anteriormente mencionados en una cantidad suficiente como para producir un efecto terapéutico o profiláctico. Los polipéptidos desvelados en el presente documento pueden administrarse a dicho ser humano u otro animal en una forma de dosificación convencional preparada mediante la combinación del anticuerpo desvelado en el presente documento con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional, de acuerdo con las técnicas conocidas. Los expertos en la materia reconocerán que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable estará indicada por la cantidad de principio activo con el que se combinará, la vía de administración y otras variables bien conocidas. Los expertos en la materia apreciarán además que un cóctel que comprende una o más especies de polipéptidos de acuerdo con la presente invención puede demostrar ser particularmente eficaz.

También se desvela en el presente documento un método para tratar una afección provocada por un aumento de la expresión de CB1 o de la sensibilidad a CB1 que comprende la administración a un paciente u otro sujeto, por vía oral, parenteral, mediante una solución para inyección, mediante inhalación, o por vía tópica de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo CB1.

También se desvela en el presente documento el uso de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo CB1 para la fabricación de un medicamento para tratar una afección provocada por un aumento de la expresión de CB1 o de la sensibilidad a CB1 que comprende la administración a un paciente u otro sujeto, por vía oral, parenteral, mediante una solución para inyección, mediante inhalación, o por vía tópica.

En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados desvelados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen la ventaja de una penetración en el cerebro mínima. En algunas realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de los mismos presentan alta selectividad por el receptor CB1 y no penetran en la barrera hematoencefálica, o presentan penetración reducida de la barrera hematoencefálica con respecto a los compuestos del receptor CB1 de molécula pequeña, de modo que se minimicen los efectos secundarios sobre el SNC. En otras realizaciones, los anticuerpos aislados y los fragmentos de los mismos no penetran en la barrera hematoencefálica, o presentan penetración reducida de la barrera hematoencefálica con respecto a los compuestos del receptor CB1 de molécula pequeña, como el rimonabant, después de la inyección intravenosa.

En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión o variantes de los mismos desvelados en el presente documento pueden administrarse al sujeto a través de al menos una vía seleccionada de las vías parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavidad, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardial, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intratimpánica, intrauterina, intravesical, intravitreal, bolo, subconjuntival, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.

La presente invención proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de acuerdo con las reivindicaciones, así como composiciones que comprenden dichos anticuerpos aislados y fragmentos. La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos y que además comprenden uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, excipientes, diluyentes, materiales encapsulantes, cargas, tampones u otros agentes.

DESCRIPCIÓN DE ASPECTOS PARTICULARES

Los diferentes aspectos desvelados en el presente documento pueden combinarse entre sí. Además, cualquiera de los aspectos descritos anteriormente pueden combinarse con cualquiera de los aspectos particulares descritos a continuación en el presente documento.

Algunos aspectos y divulgaciones particulares que sirven adicionalmente para ilustrar la presente invención se proporcionan a continuación:

1. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor cannabinoide 1 (CB1) caracterizado por que el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 1 pM menos.

2. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 100 nM menos.

3. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 10 nM menos.

4. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 1 nM menos.

5. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento se une a un epítopo extracelular en el receptor CB1.

6. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento se une a un receptor CB1 humano.

7. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento inhibe la actividad de señalización del receptor CB1.

8. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 7, en donde el anticuerpo o fragmento tiene actividad inhibidora de la señalización del receptor CB1 que es al menos equivalente en potencia con respecto a la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia se mide mediante inhibición de la transducción de señales mediada por el antagonista del receptor CB1 en un ensayo AMPc.

9. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 7, en donde el anticuerpo o fragmento tiene actividad inhibidora de la señalización del receptor CB1 que es al menos 3 veces más potente que la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia se mide mediante inhibición de la transducción de señales mediada por el antagonista del receptor CB1 en un ensayo AMPc.

10. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 7, en donde el anticuerpo o fragmento tiene actividad inhibidora de la señalización del receptor CB1 que es al menos equivalente en potencia con respecto a la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia se mide mediante la inhibición de la fosforilación de ERK mediada por el agonista del receptor CB1.

11. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 7, en donde el anticuerpo o fragmento tiene actividad inhibidora de la señalización del receptor CB1 que es al menos 3 veces más potente que la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia se mide mediante la inhibición de la fosforilación de ERK mediada por el agonista del receptor CB1.

12. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento activa o mejora la actividad del receptor CB1.

13. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento es un modulador alostérico del receptor CB1.

14. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento es un agonista inverso del receptor CB1.

15. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento es murino.

16. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento es quimérico.

17. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento es humanizado.

18. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento se une selectivamente a CB1.

19. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo se conjuga con un agente, por ejemplo, un agente terapéutico adicional, un agente citotóxico, una molécula de inmunoadhesión o un agente de formación de imágenes.

20. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 19, en donde el agente es un agente terapéutico adicional, un agente citotóxico, una molécula de inmunoadhesión o un agente de formación de imágenes.

21. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 20, en donde el agente terapéutico es rimonabant.

22. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 20, en donde el agente de formación de imágenes se selecciona del grupo que consiste en un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético y biotina.

23. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 18, en donde el anticuerpo no tiene actividad agonista o antagonista.

24. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de competir por la unión al receptor CB1 con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación 1.

25. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de unirse específicamente a esencialmente el mismo epítopo en el receptor CB1 que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación 1.

26. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 2, 10, 18 y 26; y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 6, 14, 22 y 30.

27. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento comprende una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 4, 12, 20 y 28, y una región constante de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 8, 16, 24 y 32.

28. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 6, y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 8.

29. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 10; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 12; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 14, y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 16.

30. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 18; una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 20; una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 22, y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 24.

31. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 26; una región constante de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 28; una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 30 y una región constante de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 32.

32. Un método para antagonizar CB1, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa al receptor CB1 con un anticuerpo o fragmento de unión de acuerdo con la divulgación 1.

33. Un método para agonizar CB1, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa al receptor CB1 con un anticuerpo o fragmento de unión de acuerdo con la divulgación 1.

34. Un método para tratar una enfermedad o trastorno que responde al antagonismo o agonismo del receptor CB1 en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación 1.

35. El método de la divulgación 34, en donde el sujeto es un ser humano.

36. Un método para detectar CB1, que comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación 1.

37. El método de la divulgación 34, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes, dislipidemia, enfermedades metabólicas, fibrosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad hepática, cirrosis biliar primaria, enfermedad renal, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, osteoporosis, ateroesclerosis, enfermedad cardiovascular, cáncer y enfermedad inflamatoria.

38. El método de la divulgación 34, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en dolor, espasticidad por esclerosis múltiple y glaucoma.

39. El método de la divulgación 37, en donde la enfermedad o el trastorno es fibrosis.

40. El método de la divulgación 37, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno antagoniza CB1. 41. El método de la divulgación 38, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno agoniza CB1.

42. Un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno asociado a CB1, comprendiendo el método poner en contacto una célula con un anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la divulgación 1.

43. Un método para determinar el pronóstico para un sujeto al que se le diagnosticó una enfermedad o trastorno asociado a CB1, comprendiendo el método medir la expresión de CB1 poniendo en contacto una célula con un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la divulgación 1.

44. El método de la divulgación 42-43, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes, dislipidemia, enfermedades metabólicas, fibrosis, NASH, enfermedad hepática, cirrosis biliar primaria, enfermedad renal, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, osteoporosis, ateroesclerosis, enfermedad cardiovascular, cáncer, una enfermedad inflamatoria, dolor, espasticidad por MS y enfermedades oculares, incluyendo el glaucoma.

45. El método de la divulgación 44, en donde la enfermedad o el trastorno es fibrosis.

46. El método de la divulgación 36, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga con un agente de formación de imágenes.

47. El método de la divulgación 46, en donde el agente de formación de imágenes se selecciona del grupo que consiste en un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético y biotina.

48. El método de la divulgación 42-43, en donde la célula está presente en un sujeto.

49. El método de la divulgación 48, en donde el sujeto es un ser humano.

50. Una célula hospedadora que expresa el anticuerpo aislado o fragmento de acuerdo con la divulgación 1. 51. Un método para fabricar un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente al receptor CB1, comprendiendo el método la inmunización de mamíferos con receptor CB1 purificado o un fragmento antigénico del mismo, complejos CB1/lípido y/o ADN del receptor CB1.

52. El método de la divulgación 51, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se genera a partir de una línea celular de hibridoma que comprende células derivadas de los mamíferos inmunizados.

53. El método de la divulgación 51, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se genera a partir de una biblioteca de fagos.

54. Un método para fabricar un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente al receptor CB1, comprendiendo el método generar una biblioteca de fagos que comprende regiones de cadena pesada y ligera variables a partir de linfocitos de sangre primaria humana y cribar la biblioteca de fagos para la unión al receptor CB1.

55. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con el SEQ ID NO: 352, 353 y 354, respectivamente.

56. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los SEQ ID NO: 355, 356 y 357, respectivamente.

57. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 352, 353 y 354, respectivamente.

58. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tiene al menos el 80 %, el menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de homología con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 355, 356 y 357, respectivamente.

60. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones enumeradas o desveladas en el presente documento.

61. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 443-463; una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 464-577 y una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 578-625.

61. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 626 661; una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 662-742 y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 742-824.

62. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de acuerdo con la divulgación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo humanizado.

63. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo según se desvela en el presente documento, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región Fc de IgG1 humana.

64. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las divulgaciones anteriores, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región Fc modificada.

65. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 64, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región Fc seleccionada del grupo que consiste en un híbrido de IgG2/IgG4, una IgG2 que comprende mutaciones A330S y P331S y una IgG4 que comprende una mutación S228P.

66. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 339 341 y, opcionalmente, una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 337.

67. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 66, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 342.

68. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 66, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 343-351 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con el s Eq ID NO: 338.

69. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 341 y una región constante de cadena pesada que compren de los SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434 o SEQ ID NO: 435.

70. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 340 y una región constante de cadena pesada que compren de los SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434 o SEQ ID NO: 435.

71. Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo que comprende una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO. 1-351 y en los SEQ ID NO. 436-824.

72. Un anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CB1, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 100 nM menos.

73. El anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 72, en donde el anticuerpo o fragmento tiene una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 5 nM menos. 74. Un anticuerpo humanizado aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CB1, en donde el anticuerpo o fragmento tiene actividad inhibidora del receptor CB1 que es al menos 10 veces más potente que la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia se mide mediante inhibición de la transducción de señales mediada por el antagonista del receptor CB1 en un ensayo AMPc.

75. El anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 74, en donde el anticuerpo o fragmento tiene actividad inhibidora del receptor CB1 que es al menos 5 veces más potente que la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia se mide mediante inhibición de la transducción de señales mediada por el antagonista del receptor CB1 en un ensayo AMPc.

76. El anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 74, en donde el anticuerpo o fragmento tiene actividad inhibidora del receptor CB1 que es al menos equivalente en potencia con respecto a la molécula pequeña rimonabant, en donde la potencia se mide mediante inhibición de la transducción de señales mediada por el antagonista del receptor CB1 en un ensayo AMPc.

77. Un anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CB1, en donde el anticuerpo o fragmento presenta mayor potencia que un anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento y el anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente comprenden las mismas CDR de cadena pesada y ligera, y en donde la potencia se mide mediante inhibición de la transducción de señales mediada por el antagonista del receptor CB1 en un ensayo AMPc.

78. El anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 77, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento tiene actividad inhibidora del receptor CB1 que es al menos 2 veces más potente que el fragmento o anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente.

79. El anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 78, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento tiene actividad inhibidora del receptor CB1 que es al menos 3 veces más potente que el fragmento o anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente.

80. El anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de unión a antígeno de la divulgación 79, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento tiene actividad inhibidora del receptor CB1 que es al menos 5 veces más potente que el fragmento o anticuerpo no humanizado o quimérico correspondiente.

81. El anticuerpo humanizado aislado o fragmento de unión a antígeno desvelado en el presente documento, en donde el anticuerpo o fragmento presenta penetración en el cerebro reducida o inexistente.

82. El anticuerpo humanizado aislado o fragmento de unión a antígeno de la divulgación 81, en donde la penetración en el cerebro del anticuerpo o fragmento presenta penetración en el cerebro reducida con respecto a un agonista o antagonista del receptor CB1 de molécula pequeña.

83. El anticuerpo humanizado aislado o fragmento de unión a antígeno de la divulgación 81, en donde el anticuerpo o fragmento presenta efectos secundarios sobre el sistema nervioso central (SNC) reducidos con respecto a un agonista o antagonista del receptor CB1 de molécula pequeña.

84. El anticuerpo humanizado aislado o fragmento de unión a antígeno de la divulgación 83, en donde el agonista o antagonista del receptor CB1 de molécula pequeña es AM6545, AM251, taranabant o rimonabant.

85. Un método para tratar una enfermedad o trastorno que responde al antagonismo o agonismo del receptor CB1 en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las divulgaciones 55-84.

86. El método de la divulgación 85, en donde el sujeto es un ser humano.

87. El método de la divulgación 85, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes, dislipidemia, enfermedades metabólicas, fibrosis, NASH, enfermedad hepática, cirrosis biliar primaria, enfermedad renal, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, osteoporosis, ateroesclerosis, enfermedad cardiovascular, cáncer, una enfermedad inflamatoria, dolor, espasticidad por MS y enfermedades oculares, incluyendo el glaucoma.

88. El método de la divulgación 85, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno presenta penetración en el cerebro reducida o inexistente.

Ejemplos

Ejemplo 1. Inmunización de ratones para la generación de anticuerpos del receptor CB1

La secuencia de ADNc y los cebadores para clonar al receptor CB1 humano se basaron en la secuencia de referencia de NCBI pubmed NM_001160258. Se expresó el receptor CB1 mediante expresión transitoria con lipofectamina en células 293 o mediante la generación de líneas celulares estables. Para la generación de líneas celulares estables, se transfectó la construcción del receptor CB1 humano de longitud completa nativo pcDNA4/TO en células Trex-CHO y Trex-293 del sistema inducible por tetraciclina. Se cultivaron las células con los antibióticos zeocina y blasticidina. Los clones que expresaron CB1 tras la inducción de tetraciclina se identificaron mediante tinción FACS con el anticuerpo anti-receptor CB1 de R&D (clon 368302). Se prepararon las membranas y se usaron para la inmunización directamente o después de la solubilización de las proteínas de membrana en detergente seguido por purificación talon. Se estabilizó el receptor CB1 purificado en una bicapa de lípidos. El complejo CB1/lípido se designó iCAPS del receptor CB1.

Se inmunizaron ratones Balb/c en 2 ciclos con ADN del receptor CB1 seguido de refuerzos con membranas del receptor CB1 o iCAPS del receptor CB1. Se tomaron muestras de sangre antes y después de las inmunizaciones y se evaluó el suero en cuanto a la unión con las membranas que expresan el receptor CB1 contra las membranas sin tratamiento en ELISA. Una vez que el suero de ratón mostró una señal positiva sobre las membranas del receptor CB1 contra las membranas sin tratamiento, se sacrificaron los ratones y se les retiraron los bazos para la generación de bibliotecas de fagos e hibridomas.

Ejemplo 2. Recuperación de linfocitos, aislamiento de células B, fusión y selección de hibridomas de unión al receptor CB1.

Se retiraron los bazos de los ratones inmunizados y se generaron suspensiones celulares únicas. Para generar suspensiones celulares únicas, se transfirió los bazos a un filtro colocado sobre un tubo de centrífuga cónico de 50 ml y se utilizó el émbolo de una jeringa de 3 ml para moler las células fuera del bazo. Se lisaron los glóbulos rojos con tampón ACK helado durante 10 min, se añadieron 5 ml de DMEM y se centrifugaron las células. Se repitió esta etapa una vez y se resuspendieron las células hasta una concentración de 2x107/ml en medio DMEM.

Recuperación y preparación de células de mieloma: se sembraron células SP2/0 a una densidad de aproximadamente 5 x 104 células/ml y se pasaron cada 2 días. Antes de la fusión celular, se recolectaron células de mieloma parentales mediante centrifugación en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml a temperatura ambiente (RT) a 500 x g durante 10 minutos. Se lavaron las células 3 veces mediante el añadido de 30 ml de medio sin suero y se repitió la centrifugación. Se retiró el sobrenadante mediante pipeteado y se resuspendió el sedimento celular en 25 ml de medio y se ajustó a una concentración de 2 x 107/ml de células viables.

Fusión celular: se mezclaron células de mieloma y células de bazo en una proporción de 1:5. Se centrifugó la mezcla celular a 1000 rpm durante 5 min y se descartó el sobrenadante para obtener el sedimento celular. Se lavó la mezcla celular dos veces con tampón de trabajo de fusión y se centrifugó para obtener el sedimento celular. Se resuspendió suavemente el sedimento celular con tampón de fusión hasta una concentración celular final de 8x107/ml. Se añadieron mezclas celulares en el baño de electrodos y se realizó electrofusión. Se dejó reposar las células durante 5 min después de la fusión celular, se lavaron 1x con medio DMEM y se añadió medio HAT precalentado en las células de fusión hasta una concentración final de 0,5*10® B células/ml. Se añadieron 100 pl de suspensión celular (5x104 de células B) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. La eficacia de fusión promedio es 1 hibridoma/1x104 células B, por lo tanto el protocolo tiene como objetivo 5 hibridomas en cada pocillo.

Cultivo celular de hibridomas. Se cultivaron hibridomas fusionados en una incubadora de cultivo celular en CO²al 5 %, a 37 °C. Se controló diariamente la condición del crecimiento de los hibridomas. Normalmente, las colonias resultaron visibles después de 5 días. Se cambió el medio por medio DMEM nuevo en el día 7 antes de la evaluación positiva.

Evaluación positiva: después de 7 - 9 días de fusión celular, cuando la colonia creció, se transfirieron 100 pl de sobrenadante de cada pocillo de hibridoma a un pocillo separado en una placa de 96 pocillos nueva y se analizaron usando ELISA con proteína CB1.

Ejemplo 3. Generación y evaluación de bibliotecas de fagos

Extracción de ARN total: se recolectó tejido de bazo en RNAlater. Se homogeneizó un trozo pequeño de tejido congelado (~30 mg) en un mortero enfriado con N²líquido y se molió hasta obtener un polvo fino. Se añadió reactivo TRIzol® con agitación fuerte manual durante 30 segundos. Se transfirió 1 ml de solución a tubos de microcentrífuga de 1,5 a temperatura ambiente 2-3 min y se dejó reposar a temperatura ambiente durante algunos minutos. A la mezcla, se le añadieron 0,2 ml de cloroformo por 1 ml de solución y se agitó con fuerza manualmente durante 30 segundos. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min y después se centrifugó a 12.000 xg durante 20 min a 4 °C. Se retiró la fase acuosa y se transfirió a un tubo nuevo. Se añadió un volumen igual de alcohol isopropílico al tubo y se mezcló durante 30 segundos. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 min, se centrifugó la mezcla a 12.000 g durante 15 min a 4 °C. Se lavó el sedimento mediante la adición de 500 pl de etanol al 75 % y centrifugación a 12.000 g durante 15 min a 4 °C. Se secó al aire el sedimento de ARN total resultante y se disolvió con 50 pl de agua sin RNasa por 1 pg de ARN esperado. Se midió la DO a 260 nm y 280 nm de una dilución 1:10 de la muestra de ARN.

Preparación del ADNc: la síntesis del ADNc de primera cadena se realizó con un kit comercial (Invitrogen, N.° de cat.: 18080-051), en resumen, se mezclaron 20 pg de ARN total con oligo(dT)20 5 pM y dNTP 1 mM en agua tratada con DEPC en 40 pl y se incubó a 65 °C durante 5 min, después se añadieron 80 pl de tampón TA con MgCh 5 mM, DTT 10 pM, 16 unidades de RNaseOUT y 80 unidades de transcriptasa inversa Superscript III. Se incubó la mezcla resultante a 50 °C durante 50 min y se inactivó por calor antes de añadir 4 pl de RNasa H para retirar el ARN residual. Se utilizó el ADNc para la construcción de la biblioteca posterior.

Se construyó la biblioteca de Fab quimérica del siguiente modo: se amplificaron las regiones variables de cadena pesada o de cadena ligera mediante cebadores específicos de cadena pesada o de cadena ligera que representan múltiples familias de líneas germinales descritas en Barbas et al, usando la plantilla de ADNc de ratón preparada anteriormente. Se amplificaron la región constante de cadena pesada y de cadena ligera humana, Ch1 y CL1, respectivamente, a partir de un clon pCOM3xTT existente. La región variable y la región constante de cadena pesada se conectaron mediante PCR superpuesta. La cadena pesada y la cadena ligera resultante se conectaron mediante PCR superpuesta nuevamente para obtener el fragmento de ADN de Fab quimérico, que se clonó en un vector pCOM3x modificado como el inserto del fragmento SfiI mediante ligación. El ADN de biblioteca ligado se limpió y se transformó en la célula competente de alta eficiencia SS320. La cantidad de transformantes únicos totales obtenida fue de al menos 5x107.

Para el cribado de las bibliotecas de fagos, se sustrajo dos veces una bibliotecas de fagos de ratón inmunizado en inmunotubos Maxisorp (Thermo Scientific) recubiertos con iCAPS vacío, después se sustrajo dos veces con Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Life Technologies) recubierto con proteína Bril biotinilada. Todas las etapas de sustracción duraron 30 minutos. Mientras tanto, iCAPS del receptor CB1 biotinilado se recubrieron sobre Dynabeads MyOne Strepavidin T1 (Life Technologies). Se mezcló el grupo de fagos sustraído y los iCAPS de CB1 sobre las perlas, junto con la proteína Bril no biotinilada e iCAPS vacíos para competición y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con rotación. Se separaron las perlas de la mezcla de unión con imán y se lavaron varias veces para eliminar los fagos no unidos (5 veces en el ciclo 1, 10 veces cada uno en los ciclos 2 y 3). Se eluyeron los fagos unidos dos veces con tampón de glicina pH 2,2 durante 10 minutos cada uno. Se combinaron los eluatos, se neutralizaron con Tris-HCl pH 8,0 y se utilizaron para infectar células TG1 para producir fagos para el siguiente ciclo de cribado. Después de 3 ciclos de cribado, se tomaron colonias únicas y se evaluaron mediante ELISA de fago monoclonal.

Para la evaluación de las proteínas que se unen de fagos, se tomaron colonias únicas de TG1 infectadas con el resultado del cribado en placas de 96 pocillos que contenían medio 2YT/carbenicilina/glucosa y se agitaron durante la noche a 30 °C. El día siguiente, se transfirió un volumen pequeño de cultivo saturado a medio de 2YT/carbenicilina/glucosa nuevo y se agitó a 37 °C hasta que la DO 600 nm alcanzara 0,6-0,7. Después se infectó el cultivo con fago auxiliar KO7. Se centrifugaron las células TG1 infectadas, se resuspendieron en medio 2YT/carbenicilina/canamicina y se agitó a 30 °C durante la noche. Mientras tanto, se recubrieron placas de 96 pocillos Maxisorp (Thermo Scientific) con streptavidina (Wako) a 4 °C durante la noche. Al tercer día, se capturaron antígenos biotinilados sobre las placas recubiertas con streptavidina, que después se bloquearon con 3 % de leche descremada en PBST. Se centrifugaron las células TG1 nuevamente. Se bloquearon los sobrenadantes que contenían fagos en 3 % de leche desnatada y se cargaron en las placas de ELISA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres ciclos de lavado mediante PBST, se añadió anticuerpo anti-M13 de ratón HRP (GE Healthcare) diluido 1:2000 en 3% de leche descremada en PBST a las placas y se incubó durante otra hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con PBST y después se ampliaron en TMB (Biopanda). Se añadió HCl a las placas para detener la reacción. Se leyó la absorbancia a 450nm en un lector de microplacas Emax precision (Molecular Devices). Se seleccionaron los clones que se unieron a iCAPS específicamente para caracterización y secuenciación posterior.

Se retiraron los plásmidos que albergaban colonias de E. coli que producían Fab desplegado en fagos. Se extrajo el ADN plásmido y se secuenció para obtener la información del ADN de Fab. Se diseñaron cebadores específicos para amplificar la región V de cadena pesada, se clonó el producto de PCR en pTT5-HCV3, una versión modificada del vector de expresión de pTT5, tratado previamente con enzimas de restricción ApaI y SacI, en frente de la región constante pesada humana mediante clonación perfecta. También se diseñaron cebadores específicos para amplificar la región de cadena ligera completa del fragmento Fab. Se clonó el fragmento de PCR resultante en pTT5-IL2-LCC, un vector pTT5 modificado, se trató con EcoRI y NotI mediante clonación perfecta. Se verificó la secuencia de los 2 plásmidos resultantes.

Ejemplo 4. Secuenciación de hibridomas.

Se recolectaron células de hibridoma (1x107) y se extrajo el ARN total usando reactivo Tri como se describió anteriormente para el tejido de bazo. Se preparó el ADNc utilizando el kit SuperScript III de acuerdo con las instrucciones del fabricante, descrito anteriormente. Se usó el producto de ADNc resultante como plantilla para PCR con los cebadores VhRevU y VhForU, se limpió el producto de PCR 300 pb resultante usando un kit de limpieza de PCR y se secuenció con el mismo cebador. También se realizó la reacción de PCR con el cebador específico VkRev7 y VkFor de región V de cadena ligera (solo para la región variable) o cebadores KappaFor (para la cadena ligera kappa completa). Se realizaron reacciones de secuenciación sobre el producto de PCR limpio para obtener la secuencia de ADN.

Ejemplo 5. Expresión y análisis de IgG

Expresión de IgG: se cotransfectaron dos plásmidos basados en pTT5, uno que contenía ADN de cadena pesada y el otro que contenía ADN de cadena ligera, en células HEK293F para la expresión de IgG. 24 horas antes de la transfección, se diluyeron células 293F hasta la densidad de 8X105 células/ml. En el día de la transfección, las células se mantuvieron a 1,1-1,3X106 células/ml. Se usó un |jg de ADN plásmido para la transfección de 1 ml de cultivo de suspensión celular. Se diluyeron 80 jg de ADN en 4 ml de medio 293F freestyle nuevo. Se diluyeron 240 jg del reactivo de transfección polietilenimina (PEI) en un volumen final de 4 ml de medio 293F freestyle. Después de 3 minutos de incubación, se mezclaron exhaustivamente 4 ml de ADN con 4 ml de PEI. Se incubaron los 8 ml de mezcla de ADN y PEI durante 15 minutos a temperatura ambiente y se añadieron lentamente en 80 ml de cultivo de suspensión de células 293F. Se incubaron las células en una plataforma de agitación orbital a una velocidad de 130 rpm a 37 °C con CO²al 5 % y se recogieron en 4 días.

Purificación de IgG: se colocaron 0,4 ml de volumen de lecho de proteína A en una columna de 1 ml y se lavaron con 10 ml de dH²O y 10 ml de pH 8,0 PBS. Se centrifugaron las suspensiones de células 293F transfectadas a 4000 rpm durante 45 minutos a 4 °C. Se descartaron los sedimentos y se ajustó el sobrenadante a un pH de 8,0 sobre hielo y se cargó en una columna de proteína A preparada. Cuando finalizó la carga de sobrenadante, se lavó la columna con 5 ml de PBS (pH = 8,0) y se eluyó con 4 ml de 0,1 M Na citrato-HCl (pH = 3,5). Se neutralizó la elución que contenía IgG con 200 j l de tampón Tris-Hcl 1,5M (pH = 8,8) y se concentró con un concentrador de 30 kD 4 ml. Se colocaron 4,5 ml de PBS en el concentrador y se centrifugaron. Por último, se intercambiaron las IgG y se almacenaron en PBS. Se detectaron las IgG mediante DO280 y se determinó la pureza mediante gel SDS-PAGE y SEC.

Las concentraciones, los volúmenes y los rendimientos de PA13R3-P1C4 logrados en cuatro experimentos diferentes se muestran en la Tabla 4. Las concentraciones, los volúmenes y las cantidades de clones diferentes se muestran a continuación en la Tabla 5.

Tabla 4. Ex resión de PA13R3-P1C4

Tabla 5. Ex resión de clones

continuación

Ejemplo 6. Unión de IgG a iCAPS de CB1 mediante ELISA

Se evaluó la IgG purificada en cuanto a la unión al receptor CB1 purificado (sistema de presentación del antígeno de conformación CB1 (iCAPS)) mediante ELISA. Se recubrieron antígenos no biotinilados (por ejemplo, iCAPS vacíos) directamente sobre placas Maxisorp. Los anticuerpos primarios fueron IgG purificadas con diluciones seriadas 1:3, se incubaron en la placa durante 1 hora. Después de 3 ciclos de lavado con PBST, se añadieron y se incubaron durante otra hora los anticuerpos secundarios IgG anti-ratón de cabra HRP (Abmart) o IgG anti-humano de cabra HRP (Sigma), según la especie de IgG. Se lavaron las placas tres veces con PBST y después se ampliaron en TMB (Biopanda). Se añadió HCl a las placas para detener la reacción. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas Emax precision (Molecular Devices). Los datos de la unión se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6. Unión a iCAPS de CB1

Ejemplo 7. Unión de IgG mediante FACS

Se recolectaron células parentales TRex CHO, CB1 sobreexpresado de TRex CHO A56 (CB1 T210A/compañero de fusión) y TRex CHO A l56 CB1 humano nativo de matraces. Se incubaron 100 pl de 1x106 células/ml de células con IgG de anticuerpo primario. Se diluyó anti-humano y anti-ratón conjugado de anticuerpo secundario PE en 1:200 veces. Se diluyó FITC Fab anti-humano en 1:32 veces. Se lavaron las células con 200 pl de tampón FACS dos veces y se transfirieron a un tubo Falcon de 5ml BD y se analizaron mediante citometría de flujo. Se evaluó inicialmente la unión de IgG purificada en concentraciones de 30 nM y 300 nM. Se identificaron varias proteínas que se unen como se muestra en la figura 1A-1F.

Para evaluar adicionalmente las células parentales TRex CHO, CB1 sobreexpresado de TRex CHO A56, TRex CHO A156 CB1 humano nativo, se utilizaron 5HT2b, CB1 de ratón y CB2 humano para examinar la especificidad de la unión IgG. Se incubaron 100 |jl de 1x106 células/ml de células con IgG de anticuerpo primario en diluciones seriadas de 3 veces a partir de 1 jM a 0,5 nM durante 30 minutos sobre hielo. Después de lavar con 200 j l de tampón FACS dos veces, se incubaron las células con anticuerpo secundario durante 30 minutos sobre hielo. Se lavaron las células con 200 j l de tampón FACS dos veces y se transfirieron a un tubo Falcon de 5ml BD y se analizaron mediante FACS.

Se usaron anticuerpo policlonal de conejo anti-CB1 Santa Cruz y el anticuerpo secundario FITC conjugado anti-conejo para detectar la expresión de CB1 de ratón. Se usaron anti-CB2 monoclonal de ratón R&D y P2C2 de IgG humana para confirmar la expresión de CB2 y 5HT2b respectivamente. Se conjugaron con PE ambos anticuerpos secundarios anti-ratón y anti-humano.

Para las proteínas que se unen seleccionadas, se generaron curvas de unión completas en el receptor CB1 mediante la evaluación de un intervalo de concentraciones. Se prepararon diluciones seriadas de tres veces de 1 pM a 0,1 pM. Se determinó la selectividad mediante la medición de la unión a las células que expresan 5HT2B o CB2, con respecto a la unión a A156 (que expresa el receptor CB1 humano nativo) o A56 (receptor CB1 sobreexpresado con modificación T210A y reemplazo de ICL3 con compañero de fusión) mediante citometría de flujo. Como se muestra en la figura 2C y en la figura 2D, la expresión de c B2 y 5HT2B se confirmó utilizando anti-CB2 monoclonal de ratón e IgG humana de P2C2 para confirmar la expresión de CB2 y 5HT2B, respectivamente. Se usaron anticuerpos anti-ratón conjugados con PE (para la detección de anti-CB2) y anti-humano conjugado con PE para detectar CB2 y 5HT2B, respectivamente. Los anticuerpos PA13R3-P1C4 y 36E12B6C2 se unen selectivamente a CB1, como se muestra en la figura 2A y la figura 2B. Además, la Tabla 7 muestra las concentraciones y las constantes de disociación (Kd) para cada uno de varios lotes de PA13R3-P1C4 y 36E12B6C2.

Los resultados del estudio mostraron que PA13R3-P1C4 IgG y Fab y 36E12B6C2 se unen a A56 y A156, pero no TRex CHO parental y no tienen actividad cruzada con 5ht2b, CB2 humano o CB1 de ratón.

Tabla 7. R l i m rí fl r iv r l n i uerpos

Ejemplo 8. Ensayo de competición

Se usaron células CB1 humano nativo Trex CHO A156 para evaluar si 36E12B6C2 y P1C4 se unen a epítopos similares. Se usaron las concentraciones en CE80 y CE50 de P1C4 y 36E12B6C2 para la tinción. Se usó un exceso de PA13R3-P1C4 IgG, Fab y 36E12B6C2 para la competición. Se incubaron 100 j l de 1x106 células/ml de células A156 con IgG competidor durante 30 minutos sobre hielo y se añadieron IgG de tinción en la mezcla con 30 minutos de incubación sobre hielo. Después de lavar con 200 j l de tampón FACS dos veces, se incubaron las células con anticuerpo secundario durante 30 minutos sobre hielo. Se diluyó anti-humano y anti-ratón conjugado de PE en 1:200 veces. Se lavaron las células con 200 j l de tampón FACS dos veces y se transfirieron a un tubo Falcon de 5 ml BD y se analizaron mediante FACS.

Los resultados del estudio mostraron que PA13R3-P1C4 Fab e IgG compitieron con 36E12B6C2 por la unión a CB1, lo que sugiere que PA13R3-P1C4 y 36E12B6C2 se unen a epítopos superpuestos (figura 3A y B). El competidor 36E12B6C2 aumentado de 100 nM a 500 nM también pudo competir con PA13R3-P1C4 por la unión a CB1.

Ejemplo 9. Ensayo funcional AMPc

Se llevó a cabo un ensayo funcional AMPc para medir el antagonismo de los anticuerpos. El ensayo funcional AMPc (Cisbio) se realizó sobre una placa de bajo volumen de 384 pocillos blanca (Greiner). Se sembraron 8000 células/pocillo de células TRex CHO con expresión estable de CB1 en la placa, seguido de incubación del antagonista en diversas concentraciones (que varían de 10 j M a 0 j M) a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadieron forskolina 5 j M (Sigma Aldrich) y cannabinoide CP559409 j M (Sigma Aldrich) a la mezcla de estimulación celular y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente para activar el CB1. Después de 30 min de incubación, 5 pl de AMPc-d2 (dilución 1:39 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) y 5 pl de criptato anti-AMPc (dilución 1:9 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) se añadieron a la estimulación celular y se incubaron durante una hora. Se detectó la señal FRET con un lector de placas Envision multilabel (Perkin Elmer) en excitación de criptato anti-AMPc a 620 nm y emisión a 665 nm. Se realizó el análisis de datos usando GraphPad Prism.

Como se muestra en la figura 4A-G, dos anticuerpos, 36E12B2H8 (hibridoma) y PA13R3-P1C4 (derivado de fagos) presentaron actividad antagonista equipotente (36E12B2H8) o más potente (PA13R3-PIC4) que los controles positivos de molécula pequeña (agonistas del receptor CB1 inverso SR141716A (rimonabant) y AM251 y antagonista neutro AM6545) con valores de IC50 de 350 28 nM y 90 13 nM, respectivamente.

Ejemplo 10: Ensayo de activación ERK

Para confirmar adicionalmente la actividad antagonista de mAb, se evaluó la activación de ERK como parte de la vía de señalización del receptor CB1. Dos días antes del experimento, se sembraron células de receptor CB1 Trex-CHO a 500.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos. Se usó 1 jg/m l de tetraciclina para inducir la expresión del receptor CB1 después de 24 horas. Se privó de suero a las células durante al menos dos horas antes del experimento. Se añadió IgG purificada a 300 nM al medio de cultivo, después de 30 minutos, se estimularon las células con agonista del receptor CB1 WIN55.212 (100 nM) durante 10 y 15 minutos. Se recolectaron los lisados celulares y se determinó el nivel de activación de ERK mediante transferencia western. Se obtuvieron anticuerpos Anti-ERK y Anti-fosfoespecífico ERK de Cell Signaling Inc.

El tratamiento con el agonista del receptor CB1 WIN55.212 indujo la activación de ERK como lo demuestra el aumento en la señal de ERK fosforilada. Se utilizó ERK total como el control de carga de transferencia western para mostrar una misma carga de las muestras. Como se muestra en la figura 5A, el anticuerpo derivado de fagos PA13R3-P1C4 (300 nM), pero no la IgG de control (proteína que se une irrelevante) o PA13R3-P1E4, bloquearon la fosforilación de ERK inducida por WIN55.212 (100 nM). Como se muestra en la figura 5B, los anticuerpos derivados de hibridoma 36E12B2E5, 36E12B6C2 y 36E12B6F2, pero no la IgG de control, bloquearon la fosforilación de ERK inducida por WIN55.212. AM6545 (antagonista neutro) se usó como control positivo como se muestra en la figura 5A y 5B.

Ejemplo 11. Ensayos funcionales AMPc

El ensayo funcional agonista AMPc (Cisbio) se realizó sobre una placa de bajo volumen de 384 pocillos blanca (Greiner). Se sembraron 8000 células/pocillo de células TRex CHO con expresión estable de CB1 en la placa, seguido de incubación del agonista en diversas concentraciones (que oscilan entre 1,5 j M y 0 j M) a temperatura ambiente durante 10 min. Para evaluar las actividades agonistas (figura 6A y 6B), se añadieron 5 j M de forskolina (Sigma Aldrich) a la mezcla de estimulación celular y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Para evaluar la actividad moduladora alostérica (figura 6C y 6D), se añadieron 5 j M de forskolina (Sigma Aldrich) y 1 j M de CP55940 a la mezcla de estimulación celular y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente.

Después de 30 min de incubación, 5 pl de AMPc-d2 (dilución 1:39 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) y 5 pl de criptato anti-AMPc (dilución 1:9 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) se añadieron a la estimulación celular y se incubaron durante una hora. Se detectó la señal FRET con un lector de placas Envision multilabel (Perkin Elmer) en excitación de criptato anti-AMPc a 620 nm y emisión a 665 nm. Se realizó el análisis de datos utilizando software GraphPad Prism.

Los resultados del análisis del agonista AMPc identificaron cuatro IgG agonistas potenciales incluyendo PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6G7 y PA2LR3-P6B12. En particular, PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1 y PA2LR3-P6G7 presentaron CE50 > 300 nM, como se muestra en la figura 6A y 6B. Además, PA2LR3-P6B12 es un modulador alostérico potencial, con una CE50 de aproximadamente 1000nM en presencia de CP55940, como se muestra en la figura 6C. Los controles positivos y negativos se muestran en la figura 6B y 6D.

También se llevó a cabo un ensayo AMPc para caracterizar adicionalmente a PA13R3-P1C4 y 36E12B6C2. El ensayo funcional AMPc (Cisbio) se realizó sobre placas de bajo volumen de 384 pocilios blanca (Greiner). Se sembraron 8000 células/pocillo de células TRex-CHO CB1 en la placa, seguido de incubación de antagonistas, incluyendo AM6545, SR141716A, PA12R3-P1C4 y 36E12B6C2, en concentraciones que oscilan entre 3 pM y 0 pM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos de incubación, se añadieron 5 pM de forskolina (Sigma Aldrich) a la mezcla de estimulación celular y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Para cuantificar la producción de AMPc, se añadieron 5 pl de AMPc-d2 y 5 pl de criptato anti-AMpc a la estimulación celular y se incubó durante una hora. Se detectó la señal FRET con un lector de placas EnVision multilabel (Perkin Elmer) en excitación de criptato anti-AMPc a 620 nm y emisión a 665 nm. Se realizó el análisis de datos usando software GraphPad Prism. Los resultados del estudio se muestran en la figura 7. Anteriormente, se caracterizaron AM6545 y SR141716A como antagonista neutro y agonista inverso, respectivamente. Los resultados de los ensayos funcionales AMPc indicaron que PA12R3-P1C4 y 36E12B6C2 tienen patrones de inhibición similares como SR141716A, lo que sugiere que PA12R3-P1C4 y 36E12B6C2 son agonistas inversos.

Ejemplo 12. Ensayo de unión ELISA de iCAPS

Se llevó a cabo un ensayo de unión ELISA para evaluar la unión de los anticuerpos IgG o Fab del receptor CB1 a iCAPS que expresan CB1 (A138 que contiene el reemplazo de la secuencia nativo lCL3 con la secuencia de la proteína 1 y A139 que contiene el reemplazo de la secuencia nativo ICL3 con BRIL), iCAPS que expresa 5HT2B (h13h), iCAPS vacío o rBril-0918. Las moléculas de IgG y Fab evaluadas fueron 36E12B6C2 IgG, 36E12B6C2 Fab, PA13R3-P1C4 IgG y PA13R3-P1C4 Fab, comparadas con el control negativo P1F7 IgG y P1F7 Fab de aglutinante BRIL. Para los anticuerpos IgG, el anticuerpo secundario utilizado para detectar la unión fue IgG-HRP anti-ratón; para Fab, el anticuerpo secundario utilizado para detectar la unión fue IgG-HRP anti-humano. Los resultados del estudio se muestran en las figuras 8A y 8B y abajo en la Tabla 8. Para la unión A138 iCAPS y A139 iCAPS, 36E12B6C2 Fab presentó mayores valores de CE50 con respecto a 36E12B6C2 IgG. Por el contrario, PA13R3-P1C4 IgG y Fab presentaron valores de CE50 aproximadamente equivalente para la unión a A139 y a A138. Ninguno de los anticuerpos CB1 o Fabs presentó unión a rBril-0918, iCAPS vacío o iCAPS que expresa 5HT2B. El mAb de control P1F7 reconoce BRIL y, por lo tanto, muestra unión a A139 que contiene la fusión BRIL en ICL3, pero no con A138 que carece de BRIL.

T l . V l r E n ELI A I F E12B 2 PA1 R -P1 4

Ejemplo 13. Estudio de internalización del receptor CB1

El impacto del anticuerpo CB1 sobre WIN55.212 (agonista específico de CB1) indujo la internalización de CB1 y se analizó mediante citometría de flujo. Se sembraron 5 x 105 células/pocillo de células TRex-CHO con expresión estable de CB1 en una placa de 6 pocillos. Se añadió tetraciclina (1 pg/ml) al medio de cultivo durante 24 horas para inducir la expresión de CB1. En el día del experimento, las células se privaron de suero durante 2 horas. Se preincubaron las células con anticuerpo CB1 (300 nM), AM6545 (antagonista neutro CB1) y control negativo (aglutinante BRIL) durante media hora. Se añadió agonista CB1 (1 pM WIN55.212) al medio de cultivo durante 1 hora para inducir la internalización del receptor. La expresión superficial de CB1 se tiñó con anticuerpo monoclonal de ratón de extremo N anti-CB1 de R&D y se determinó la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) usando citometría de flujo. Los resultados del estudio se muestran en la figura 9A. El tratamiento con el agonista CB1 WIN55.212 mostró una reducción en la MFI en comparación con el control, lo que sugiere la internalización de CB1 (figura 9A, fila superior de histogramas). El pretratamiento con el antagonista AM6545 neutro específico de CB1 bloqueó la internalización del receptor CB1 inducida por WIN55.212 (figura 9A, fila superior de histogramas). El pretratamiento de los anticuerpos CB1 (300 nM) no afectó la internalización del receptor CB1 inducida por WIN55.212 (figura 9A, fila central e inferior de histogramas).

El impacto del anticuerpo CB1 sobre la internalización del receptor también se investigó. Después de 2 horas de privación de suero, se añadieron 300 nM de anticuerpos CB1, control negativo P2A12 (aglutinante BRIL) y agonista CB1 WIN55.212 al medio de cultivo durante 1 hora. Se recolectaron las células y se tiñeron con anticuerpo monoclonal de ratón de extremo N anti-CB1 (R&D). Los resultados del estudio se muestran en la figura 9B. Nuevamente, se observa internalización del receptor CB1 inducida por WIN55212 y bloqueada por el pretratamiento con antagonista AM6545 neutro de CB1 (figura 9B, fila superior de histogramas). La expresión superficial de CB1 no se vio afectada por los anticuerpos CB1, lo que sugiere que los anticuerpos CB1 no indujeron la internalización del receptor (figura 9B, fila central e inferior de histogramas).

Ejemplo 14. Potencia de anticuerpos CB1 humanizados

Se generaron anticuerpos P1C4 humanizados y se evaluaron en cuanto a la potencia, especificidad y afinidad. Para generar los anticuerpos P1C4 humanizados, se seleccionaron marcos humanos basándose en la homología entre P1C4 y los genes v H y VK de línea germinal humana. Los marcos seleccionados tuvieron homología máxima con las regiones VH y VK de PIC4 y se seleccionaron basándose en modelado computacional como capaces de apoyar la estructura de CDR que se predice que presentará PIC4. Se generaron los siguientes anticuerpos humanizados: (1) P1C4-H0 - IgG; (2) P1C4-H2 (YE) - IgG (que comprende las mutaciones G27Y y T28E en la región variable de cadena pesada); y (3) P1C4-H4 (YEn G )- IgG (que comprende las mutaciones G27Y, T28E, A60N y Q61G en la región variable de cadena pesada).

Se llevó a cabo un ensayo AMPc para determinar la potencia de los anticuerpos PA13R3-P1C4 quiméricos y PA13R3-P1C4 humanizados. El ensayo funcional AMPc (Cisbio) se realizó sobre placas de bajo volumen de 384 pocillos blanca (Greiner). Se sembraron 8.000 células/pocillo de células TRex-CHO CB1 humano nativo en la placa, seguido de incubación de Rimonabant (SR141716A), PA12R3-P1C4 quimérico, PA12R3-P1C4 H0 (sin retromutación), PA12R3-P1C4 H2 (YE), PA12R3-P1C4 H4 (YEn G) y P2A12 (control negativo), en concentraciones que variaron de 1 jM a 0 |jM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, se añadieron 5 jM de forskolina (Sigma Aldrich) a la mezcla de estimulación y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Para cuantificar la producción de AMPc, se añadieron 5 pl de AMPc-d2 y 5 pl de criptato anti-AMPc y se incubó durante una hora. Se detectó la señal FRET con un lector de placas EnVision multilabel (Perkin Elmer) en excitación de criptato anti-AMPc a 620 nm y emisión a 665 nm. Se realizó el análisis de datos utilizando software GraphPad Prism.

Los resultados del estudio se proporcionan en la figura 10 y abajo en la tabla 9. El ensayo funcional AMPc indicó que P1C4-H2 y P1C4-H4 humanizados tienen un IC50 de 21 nM y 17 nM, respectivamente. Por ende, de los anticuerpos evaluados, los anticuerpos humanizados H1C4-H2 y PIC4-H4 presentaron potencia incluso mayor que el anticuerpo quimérico correspondiente, según lo medido por inhibición de AMPc.

T l . I r n i r B1 im ri h m niz

La afinidad de unión, la reactividad cruzada y la especificidad de los anticuerpos P1C4 humanizados se determinó mediante citometría de flujo con células parentales TRex CHO, células CB¹sobreexpresadas TRex CHO A56 (T210A/compañero de fusión), células TRex CHO A156 CB1 humano nativo, células parentales Trex (sin CB1), células CB1 de ratón y células estables de CB2 humano. Se incubaron 100 j l de 1x106 células/ml de células con PA13R3-P1C4 quimérico, P1C4-H0 humanizado (sin mutación), P1C4-H2 (YE), P1C4-H4 (YENG) o P2A12 (control) IgG en diluciones seriadas de 3 veces a partir de 300 nM a 0,5 nM durante 30 minutos sobre hielo. Después de lavar con 200 j l de tampón FACS dos veces, se incubaron las células con anticuerpo secundario anti-humano conjugado con PE (Southern Biotech) durante 30 minutos sobre hielo. Se lavaron las células con 200 j l de tampón FACS dos veces y se transfirieron a un tubo Falcon de 5ml BD y se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACScalibur).

Tabla 10. Afinidad de unión reactividad cruzada de anticuer os P1C4 humanizados

Los resultados del estudio se muestran en las figuras 11A y 11B y arriba en la Tabla 10. Los anticuerpos CB1 humanizados unidos a células A56 y células A156. Anticuerpos P1C4-H2 y PIC4-H4 humanizados unidos a células CB1 sobreexpresadas TRex CHO A56 así como a células A156 de CB1 humano nativo con mayor afinidad con respecto al anticuerpo P1C4 quimérico (figura 11A). Además, ninguno de los anticuerpos evaluados presentó reactividad cruzada con CB1 de ratón o con CB2 humano (figura 11B).

Ejemplo 15. Anticuerpos CB1 de función efectora reducida

Se construyen y evalúan anticuerpos antagonistas de CB1 diseñados para presentar función efectora reducida. Se generan anticuerpos antagonistas de CB1 que tienen una o más de las siguientes modificaciones de Fc: (1) región constante de IgG4 con una mutación de serina a prolina en la posición 228 (S228P); (2) región constante de IgG2 con una mutación de alanina a serina en la posición 330 (A330S) y una mutación de prolina a serina en la posición 331 (P331S); y (3) región constante híbrida de IgG2/IgG4.

Los anticuerpos de CB1 humanizados resultantes que tienen 0, 2 o 4 retromutaciones en las regiones marco se proporcionan como SEQ ID NO: 343-351. Los anticuerpos se evalúan para determinar el grado de unión de receptores Fcy y el complemento C1q a través de ELISA. Los anticuerpos de CB1 también se evalúan para determinar sus capacidades para activar células inmunológicas humanas primarias in vitro. Específicamente, los anticuerpos de CB1 que tienen una o más modificaciones de Fc se evalúan para determinar la activación de células inmunológicas, por ejemplo, mediante la evaluación de su capacidad de reticulación o la capacidad de los anticuerpos de inducir la expresión de marcadores de activación. Los resultados del estudio muestran que los anticuerpos antagonistas de CB1 tienen unión a FcyR reducida, unión a C1q reducida y/o activación de células inmunológicas reducida con respecto al anticuerpo antagonista de CB1 correspondiente que no contiene la modificación de la región constante.

Ejemplo 16. Estudio de biodistribución

Se llevó a cabo un estudio para determinar la biodistribución del anticuerpo P4B5 de CB1 in vivo en ratones. El anticuerpo P4B5 se marcó con Vivotag 680 XL (Perkin Elmer) y se inyectaron IV (por vía intravenosa) ratones sin pelo (n=4 por grupo) con 5 mg/kg o 25 mg/kg de anticuerpo marcado. Se llevó a cabo formación de imágenes de cuerpo entero utilizando tomografía mediada por fluorescencia (FMT) en las siguientes las referencias temporales: 0 horas (0 h), 1 h, 5 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 144 h para medir la fluorescencia en diversos tejidos. El P4B5 marcado presentó afinidad de unión a células de CB1 similar con respecto al P4B5 no marcado, como se muestra en la figura 12. La CE50 para el P4B5 no marcado fue de 60,5 nM y la CE50 para el anticuerpo de P4B5 marcado con Vivotag 680 XL fue de 57,8 nM.

Los resultados del estudio se muestran en las figuras 13A-C. El anticuerpo marcado se detectó durante todo el transcurso de tiempo, tal como se muestra en la figura 13A y 13B, en donde se proporcionan los datos de un ratón representativo que recibió la dosis mayor de anticuerpo (25 mg/kg). Sin embargo, cuando se sustrajo la señal de fondo de la sangre, el anticuerpo anti-CB1 no era detectable en el cerebro (figura 13C), lo que indica que el anticuerpo no penetró la barrera hematoencefálica después de la inyección IV.

Ejemplo 17. Expresión y análisis de IgG para variantes humanizadas de PA13R3-P1C4

Entre las subclases de IgG humanas diferentes, las regiones Fc de las subclases IgG2 e IgG4 se unen poco a moléculas efectoras, por ejemplo FcyR activadores o complemento 1q (C1q), lo cual produce una actividad de función efectora inferior. Para minimizar la activación de la función efectora inmune, se clonaron los anticuerpos de serie inicial humanizados P1C4-H2 y P1C4-H4 en 3 variantes marco de Fc humana, IgG2, IgG4 y un híbrido entre IgG2 e IgG4, para una caracterización adicional.

La región variable de la cadena pesada de P1C4-H2 humanizado (SEQ ID NO: 340), la región variable de la cadena pesada de P1C4-H4 humanizado (SEQ ID NO: 341) y la cadena ligera de P1C4 humanizado (SEQ ID NO: 338) se muestran a continuación en la Tabla 11. Los restos en negrita son retromutaciones y los restos subrayados denotan regiones CDR. Para producir las variantes de Fc en diferentes familias de IgG, se utilizaron tres secuencias de región constante de cadena pesada. La secuencia de la región constante de cadena pesada de IgG2 (SEQ ID NO: 433), la región constante de cadena pesada de IgG4 (SEQ ID NO: 434), la región constante de cadena pesada de IgG2/4 híbrido (SEQ ID NO: 435) se muestran a continuación en la Tabla 11.

Tabla 11. Diseño de variantes de Fc

(continuación)

(continuación)

Las variantes de anticuerpos se expresaron y se purificaron en células 293FreeStyle, CHO-S y CHO-K1 en distintos lotes en fechas diferentes.

Para la expresión 293 FreeStyle, se cotransfectaron plásmidos de pTT5 separados que codifican secuencias de cadena pesada y ligera en células de FreeStyle HEK293F para la expresión de anticuerpos de IgG completos. Se cultivaron células a 37 °C con el CO²al 5 % en medio de expresión FreeStyle 293. Veinticuatro horas antes de la transfección, se diluyeron células hasta una densidad de 8 x 105 células/ml. Para preparar la solución de transfección, se diluyeron 80 |jg de ADN (40 |jg de cadena ligera 40 |jg de cadena pesada) y 240 |jg de polietilenimina (PEI) en medio 8 ml Freestyle 293F, se mezclaron bien y se filtraron a través de un filtro superior de jeringa de 0,2 jim en un tubo cónico de 50 ml, después se incubaron durante 15 minutos a 22 °C. Se añadieron lentamente ocho ml de solución de transfección a 80 ml de cultivo celular 293F (diluido en medio de expresión FreeStyle 293 a una densidad de 1,1 -1,3 x 106 célula/ml), que después se incubaron a 37 °C con CO²al 5 % con rotación a 130 rpm durante 4 días. Se recolectaron los sobrenadantes de los cultivos celulares transfectados mediante centrifugación a 4000 rpm durante 45 minutos a 4 °C, se ajustó a un pH de 8,0 con NaOH 0,1 M y se mantuvo en hielo hasta la purificación de proteínas.

Para la expresión de CHO-S, se cotransfectaron plásmidos de pTT5 separados que codifican secuencias de cadena pesada y ligera en células de CHO-S para la expresión de anticuerpos de IgG completos. Se cultivaron células en medio CD-CHO a 37 °C con CO²al 5 %. Veinticuatro horas antes de la transfección, se diluyeron células hasta una densidad de 0,6-0,7 x 106 células/ml en medio CD-CHO. El día de la transfección, se diluyeron células hasta una densidad de 1,1-1,3 x 106 células/ml en medio CD-CHO en matraces de agitación de 250 ml. A cada matraz de agitación de 250 ml, se añadió 80 ml de células. Se diluyó ochenta jig de ADN plásmido (40 jig de cadena ligera 40 jig de cadena pesada) en un volumen final de 4 ml de medio CD-CHO y se filtró a través de un filtro superior de jeringa de 0,2 jim en un tubo cónico de 50 ml. En un tubo cónico de 50 ml separado, se diluyó 80 jil de reactivo FreeStyle Max en un volumen final de 4 ml de medio CD-CHO. Estas 2 mezclas se incubaron a 22 °C durante 3 minutos antes de combinarse, mezclarse e incubarse durante 15 minutos adicionales a 22 °C. La mezcla de 8 ml de ADN/reactivo de transfección se añadió lentamente al cultivo celular de 80 ml en el matraz de 250 ml. Esto produjo la densidad final de las células hasta ~1,0 x 106 células/ml. Los matraces de cultivo después se incubaron en una plataforma de agitación orbital a 37 °C con CO²al 5 % a una velocidad de 133 rpm durante 6 días. Después se recolectaron los sobrenadantes de cultivo mediante centrifugación (Allegra X-15R, Beckman) a 4000xg durante 40 minutos a 4 °C, se reguló el pH en 8,0 con NaOH 0,1 M y se mantuvo en hielo hasta la purificación de proteínas.

La purificación de IgG a partir de 293 FreeStyle y CHO-S se realizó de la siguiente manera: se cargaron los sobrenadantes en columnas de proteína A (0,4 ml de volumen de lecho) preequilibradas con PBS pH = 7,4 y se dejó fluir por gravedad. Las columnas se lavaron con 5 ml de PBS (pH = 7,4) y se eluyó la proteína con 4 ml de Na Citrato-HCl 0,1 M pH = 3,5. El eluyente se neutralizó con 200 pl de tampón Tris-HCl 1,5 M (pH = 8,8), se concentró y se intercambió con tampón con PBS (pH = 7,4) usando un concentrador Amicon de 30 kDa de 4 ml (Millipore), de acuerdo con las instrucciones de fabricante, hasta un volumen final de aproximadamente 0,5-1 ml. Se determinaron las concentraciones de proteína mediante absorbancia a 280nm y se determinó la pureza a través de SDS-PAGE y SEC.

La purificación y expresión de proteína en CHO-K1 se realizó con métodos patentados e una organización de investigación por contrato (CRO). En resumen, se utilizaron células CHO-K1 para la transfección. Se purificó IgG con perlas MabSelect™ SuRe™ y las etapas de lavado utilizaron PBS de Dulbecco (Lonza BE17-512Q). Se eluyó IgG con glicina 0,1 M pH = 3,5.

Para la proteína QC, se usaron 3 pg de anticuerpo para cada prueba, análisis SDS-PAGE y SEC. Los criterios de pasaje de QC fueron pureza > 90 % en SDS PAGE y pico monomérico > 90 % en SEC. Para la proteína IgG purificada que pasó las pruebas QC, la proteína se separó en alícuotas en tubos con tapas a rosca a 100 pl/tubo, con concentración de ~5 mg/ml. Las alícuotas se congelaron de forma instantánea en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Los rendimientos de la proteína en 293FreeStyle oscilaron entre un bajo nivel de mg/l y 53mg/l. Los rendimientos en células CHO-S fueron menores a aproximadamente 1 mg/l. Los rendimientos en células CHO-K1 oscilaron entre 198 mg/l y 350 mg/l. SDS-PAGE mostró ejecución de proteína intacta a aproximadamente 150 kDa en condiciones no reductoras y 2 bandas que representan cadena pesada y cadena ligera sin ninguna degradación o agregación visible. Los perfiles de SEC y los análisis SDS-PAGE para uno de los lotes de 293 FreeStyle se muestra en la figura 14A y uno de los lotes de CHO-K1 en la figura 14B, como ejemplos. Los datos de la purificación de la proteína para los lotes 293FreeStyle y CHO-S se resumen en la tabla 12.

T l 12. R m n rifi i n r ín PA1 R -P1 4 mA

Ejemplo 18. Ensayos funcionales de AMPc para variantes humanizadas de PA13R3-P1C4

Un kit disponible en el mercado (Cisbio) basado en un formato de inmunoensayo competitivo que usa anticuerpo anti-AMPc marcado con criptato y AMPc marcado con d2 se usó para caracterizar anticuerpos variantes humanizados de PA13R3-P1C4 mediante la medición de cambios en niveles de AMPc intracelulares en células TRex-CHO que expresan establemente CB1. Se optimizaron las cantidades celulares, la concentración de forskolina y la concentración de CP55.940 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo funcional antagonista AMPc se realizó en placas de bajo volumen de 384 pocillos blanca (Greiner). Se sembraron células TRex-CHO que expresan CB1 humana a una densidad de ocho mil células/pocillo en medio Ham F12 libre de suero seguido de la incubación de mAb o el compuesto de control en diversas concentraciones a 22 °C durante 10 minutos. Posteriormente, se añadieron cinco |jM de forskolina (en EC20, Sigma Aldrich) y 9 nM de CP55.940 (en CE80, Sigma Aldrich) a las células y se incubaron durante 30 minutos a 22 °C para mejorar la actividad de adenilil ciclasa y activar la señalización de CB1, respectivamente. Cinco j l de AMPc-d2 (dilución 1:39 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) y 5 |jl de criptato anti-AMPc (dilución 1:9 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) después se añadieron a las células y se incubaron durante 1 hora a 22 °C. Se detectó la señal FRET con un lector de placas Envision multilabel (Perkin Elmer) en excitación de criptato anti-AMPc a 620 nm y emisión a 665 nm. Se realizó el análisis de datos usando GraphPad Prism.

Las actividades de anticuerpos de PA13R3-P1C4 humanizados en este ensayo se compararon con PA13R3-P1C4 quimérico parental, rimonabant, un agonista inverso de molécula pequeña de CB1 y P2A12 mAb, un anticuerpo de control negativo mAb no dirigido a GPCR de isotipo IgG1. PA13R3-P1C4 mAb y sus variantes humanizadas inhibieron de forma dependiente de la dosis la reducción inducida por CP55.940 en los niveles de AMPc intracelulares mientras que P2A12 mAb de control negativo no tuvo ningún efecto (figuras 15A y 15B). Los valores promedio de las CI50 ± Sd de variantes humanizadas de PA13R3-P1C4 se incluyen en la tabla 13.

Tabla 13. Resumen de las CI ⁵⁰ de variantes de P1C4 humanizadas determinadas mediante el ensayo de la acción anta onista de AMPc

Las variantes P1C4-h2 y h4 humanizadas fueron más potentes (1,6 - 3,3 veces) que PA13R3-P1C4 mAb quimérico en un ensayo de acción antagonista de AMPc (p<0,005). Las variantes humanizadas de P1C4-h2 y P1C4-h4 exhibieron una potencia comparable, mientras que entre los diferentes isotipos de variantes de PA13R3-P1C4 humanizadas, se observó una tendencia de mayor potencia de las variantes IgG1 e IgG4 contra las variantes IgG2 y IgG2/4.

Además, se caracterizó el mecanismo del antagonismo de anticuerpo de variante humanizada de PA13R3-P1C4, en particular si dichos anticuerpos se comportan como agonistas inversos o antagonistas neutrales de CB1. Se usaron rimonabant (SR141716A), un agonista inverso de CB1 conocido, y AM6545, un antagonista neutral de CB1 conocido, como compuestos de referencia.

Para caracterizar si los anticuerpos de variante humanizada de PA13R3-P1C4 actúan como un agonista inverso o antagonista neutral, se realizó un ensayo AMPc en ausencia de agonista exógeno. Se añadió forskolina, un activador de adenilil ciclasa no específico, al medio de ensayo para elevar los niveles de AMPc basales a dentro de los límites de detección. El ensayo funcional agonista AMPc (Cisbio) se realizó sobre una placas de bajo volumen de 384 pocillos blanca (Greiner). Ocho mil células/pocillo en medio Ham F12 libre se suero de CB1 humana que expresa células TRex-CHO se sembraron en la placa seguido de la incubación de mAb o compuestos de control en diversas concentraciones a 22 °C durante 10 minutos. Se añadieron cinco jM de forskolina (Sigma Aldrich) a las células y se incubaron durante 30 minutos a 22 °C. Después de una incubación de 30 minutos a 22 °C, 5 jL de AMPc-d2 (dilución 1:39 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) y 5 jL de criptato anti-AMPc (dilución 1:9 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) se añadió a las células y se incubaron durante 1 hora. Se detectó la señal FRET con el lector de placas Envision multilabel (Perkin Elmer) en excitación de criptato anti-AMPc a 620 nm y emisión a 665 nm. Se realizó el análisis de datos utilizando GraphPad Prism.

Se comparó la actividad de las variantes humanizadas P1C4-h2-IgG2 y P1C4-h2-IgG4 con rimonabant, AM6545 y el anticuerpo de control negativo P2A12-IgG1 en células TRex-CHO CB1 estimuladas por forskolina 1,5 pM (figura 16A), así como células TRex-CHO CB1 estimuladas por forskolina 5 pM (figura 16B). Los resultados muestran que P1C4-h2-IgG1, P1C4-h2-IgG2, P1C4-h2-IgG4 y rimonabant aumentaron en forma dependiente de la dosis los niveles de AMPc, los cuales indican un mecanismo agonista inverso. Por el contrario, el antagonista neutral AM6545 de CB1 y el anticuerpo de control negativo P2A12-IgG1 no afectaron los niveles de AMPc.

Se realizó un análisis de gráficas de Schild para determinar la constante de disociación de equilibrio (Kb), la cual es la medida de la afinidad de unión del antagonista por su receptor independiente de la naturaleza y concentración del agonista usado. Se determinaron las curvas de respuesta a la dosis de los agonistas CP55.940 y WIN55.212 de CB1 en ensayos antagonistas HTRF de AMPc en presencia de diversas concentraciones de P1C4-h2-IgG4.

Las figuras 17A-D muestran el efecto del aumento de las concentraciones de P1C4-h2-IgG4 en la actividad de CB1 inducida por CP55.940 y WIN55.212 a través del ensayo AMPc (respectivamente). Se calculó la proporción de dosis (R) basado en CE50 de CP55.940 o WIN55.212 por el cual la concentración de agonistas de CB1 (CP55.940 o WIN55.212) necesita aumentarse para obtener la misma respuesta en presencia de P1C4-h2-IgG4 tal como se obtuvo en su ausencia. Las Tablas 14 y 15 a continuación muestran la pendiente de Schild y la constante de disociación de equilibrio (Kb) medida a partir de 4 experimentos diferentes.

Tabla 14. Pendiente de Schild constante de disociación de e uilibrio CP55.940

Tabla 15. Pendiente de Schild constante de disociación de equilibrio WIN55.212

Ejemplo 19. Ensayo de activación de ERK para variantes humanizadas de PA13R3-P1C4

En el Ejemplo 10 y la figura 5A se mostró que el anticuerpo parental PA13R3-P1C4 bloquea la activación de ERK inducida por WIN55.212. Para confirmar que las variantes humanizadas de PA13R3-P1C4 también bloquean la activación de ERK inducida por WIN55.212, se evaluó la capacidad de estos anticuerpos de inhibir la fosforilación de ERK inducida por WIN55.212.

Dos días antes del experimento, se sembraron células de receptor que expresa CB1 Trex-CHO a 500.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos. Se usó 1 pg/ml de tetraciclina para inducir la expresión del receptor CB1 después de 24 horas. Se privó de suero a las células durante al menos dos horas antes del experimento. Se añadió IgG purificada a 300 nM al medio de cultivo, después de 30 minutos, se estimularon las células con agonista del receptor CB1 WIN55.212 (100 nM) durante 10 y 15 minutos. Se recogieron los lisados celulares y se determinó el nivel de activación de ERK mediante transferencia Western. Se obtuvieron anticuerpos Anti-ERK y Anti-fosfo-específico ERK de Cell Signaling Inc.

Tal como se muestra en la figura 18A, el tratamiento con agonista WIN55.212 de CB1 aumentó el nivel de ERK fosforilada, lo cual sugiere que las señales del receptor CB1 señaliza a través de la vía de ERK. El pretratamiento con rimonabant antagonista específico de CB1 inhibió la activación de ERK inducida por WIN55.212. Al igual que con rimonabant, el pretratamiento con los anticuerpos P1C4-h2-IgG1 y P1C4-h4-IgG1 anti-CB1 inhibió la activación de ERK inducida por WIN55.212 (figura 18A). P1C4-h0-IgG1 no inhibió la activación de ERK inducida por WIN55.212. Esto es consistente con el ensayo antagonista de AMPc, el cual mostró que P1C4-h0-IgG1 es menos potente que otras variantes de P1C4 humanizadas y se llegó a la hipótesis de la falta de efecto en el bloqueo de la activación de ERK inducida por WIN55.212.

También se examinó el efecto de P1C4-h2 en los marcos IgG2 e IgG4 en la vía de ERK activada por WIN55.212. Al igual que con PA13R3-P1C4 quimérico y P1C4-h2-IgG1 humanizado, el pretratamiento con los anticuerpos P1C4-h2-IgG2 y P1C4-h2-IgG4 de CB1 bloqueó la fosforilación de ERK inducida por WIN55.212 (figura 18B). Se observó que el mAb P2A12 no dirigido a GPCR no bloqueó la activación de ERK inducida por WIN55.212. Estos resultados indican que estos marcos de Fc no afectan las características antagonistas de PA13R3-P1C4.

Ejemplo 20. Estudio de internalización del receptor CB1 para variantes humanizadas de PA13R3-P1C4

Se usó citometría de flujo para caracterizar la actividad de PA13R3-P1C4 y los antagonistas variantes humanizados en un ensayo de intemalización del receptor CB1 en presencia o ausencia de compuestos agonistas o antagonistas.

En el día del experimento, las células se privaron de suero durante 2 horas. Se preincubaron las células con anticuerpo CB1 (300 nM), AM6545 (antagonista neutral CB1) y control negativo (aglutinante BRIL) durante media hora. Se añadió agonista CB1 (WIN55.212 1 j M) al medio de cultivo durante 1 hora para inducir la internalización del receptor. La expresión superficial de CB1 se tiñó con anticuerpo monoclonal de ratón de extremo N anti-CB1 de R&D y se determinó la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) usando citometría de flujo (Guava).

La expresión de CB1 en células TRex-293 se indujo por tetraciclina como es evidente por el aumento de la tinción de superficie usando un anticuerpo monoclonal de ratón que se dirige al extremo N de c B l (figura 19A, panel A, trazo punteado). El tratamiento con tetraciclina y agonista WIN55.212 de CB1 redujo la tinción de superficie, lo cual indica la pérdida de CB1 en la superficie celular a través de la internalización (figura 19A, panel A, trazo discontinuo). El pretratamiento con rimonabant antagonista específico de CB1 (figura 19A, panel B, trazo negro sólido) inhibió la reducción inducida por agonista de la tinción de CB1 de superficie celular. Al igual que con rimonabant, el pretratamiento con anticuerpos anti-CB1 (PA13R3-P1C4 (figura 19A, panel D, trazo negro sólido), P1C4-h2-IgG1 (figura 19A, panel F, trazo negro sólido) y P1C4-h4-IgG1 (figura 19A, panel G, trazo negro sólido)) inhibió la internalización del receptor CB1 inducida por WIN55.212. P1C4-h0-IgG1 (figura 19A, panel E, trazo negro sólido) y el anticuerpo de control negativo P2A12-IgG1 (figura 19A, panel C, trazo negro sólido) no inhibieron la internalización de CB1 inducida por WIN55.212. De acuerdo con los ensayos de activación de ERK y antagonista AMPc, P1C4-h0-IgG1 es menos potente que otras variantes de P1C4 humanizadas y la falta de efecto en el bloqueo de la internalización del receptor inducida por WIN55.212 puede ser debido a la alta tasa de disociación de P1C4-h0-igG i.

Entre las subclases de IgG humanas diferentes, las regiones Fc de las subclases IgG2 y IgG4 se unen poco a moléculas efectoras, por ejemplo FcyR activadores y a complemento 1q (Ciq), lo cual produce una actividad de función efectora inferior. Como tal, se clonó P1C4-h2 en los marcos IgG2 y IgG4 de Fc humanos ya que no se desea la activación de aplicaciones terapéuticas de funciones efectoras inmunes (planteado en el ejemplo 17). Después, se evaluaron las variantes humanizadas P1C4-h2-IgG1, P1C4-h4-IgG1, P1c4-h2-IgG2 y P1C4-h2-IgG4 para determinar el bloqueo de la internalización del receptor CB1. Como anteriormente, la expresión de CB1 en células TRex-293 se indujo por tetraciclina como fue evidente por el aumento de la tinción de superficie utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón que se dirige al extremo N de CB1 (figura 19B, panel A, trazo punteado). El tratamiento con tetraciclina y agonista WIN55.212 de CB1 redujo la tinción de superficie, lo cual indica la pérdida de CB1 en la superficie celular a través de la internalización (figura 19B, panel A, trazo discontinuo). El pretratamiento con rimonabant antagonista específico de CB1 (figura 19B, panel B, trazo negro sólido) inhibió la reducción inducida por agonista de la tinción de CB1 de superficie celular. Al igual que con rimonabant, el pretratamiento con anticuerpos anti-CB1 (PA13R3-P1C4 (figura 19B, panel D, trazo negro sólido), P1C4-h2-IgG1 (figura 19B, panel F, trazo negro sólido) y P1C4-h4-IgG1 (figura 19B, panel G, trazo negro sólido)) inhibió la internalización del receptor CB1 inducida por WIN55.212. P1C4-h0-IgG1 (figura 19B, panel E, trazo negro sólido) y el anticuerpo de control negativo P2A12-IgG1 (figura 19B, panel C, trazo negro sólido) no inhibieron la internalización de CB1 inducida por WIN55.212.

Ejemplo 21. Unión de variantes de anticuerpos PA13R3-P1C4 humanizadas por citometría de flujo

Se determinó la afinidad de unión de las variantes humanizadas de PA13R3-P1C4 por citometría de flujo utilizando células TRex CHO transfectadas de forma estable con el CB1. Se recogieron células parentales TRex c Ho y células TRex-CHO transfectadas de forma estable con construcciones de expresión de CB1 humano, CB2 humano o CB1 de ratón inducibles por tetraciclina. Para determinar la unión de los anticuerpos de la prueba, se incubaron cien microlitros de 1 x 106 células/ml de células con los anticuerpos de la prueba con un intervalo de concentraciones entre 1 j M y 1,3 nM durante 30 minutos en hielo. Después, las células se centrifugaron a 4 °C a 1600 rpm durante 3 minutos; el sobrenadante se aspiró y las células se lavaron con 200 j l de tampón FACS. El procedimiento de lavado se repitió dos veces. Después del lavado final, las células se resuspendieron en tampón FACS que contenía anticuerpo secundario Fc anti-humano conjugado con PE (1:200 diluciones) y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. Las células se lavaron con 200 j l de tampón FACS dos veces y se analizaron por citometría de flujo (Guava). El análisis de datos y la medición de la afinidad de unión (Kd) se realizaron utilizando software GraphPad Prism. Se determinó la constante de disociación promedio (Kd) de variantes humanizadas de PA13R3-P1C4 mediante el promedio de al menos 4 experimentos diferentes que usan al menos 2 lotes diferentes de proteína (figura 20A-D y tabla 16).

Tabla 16. Constante de disociación Kd media de variantes humanizadas de PA13R3-P1C4

continuación

Las variantes humanizadas excepto h2-IgG2, h2-IgG2/4 y h4-IgG2/4 mostraron aumento de afinidad de unión estadísticamente significativo a CB1 humano con respecto al anticuerpo quimérico parental PA13R3-P1C4. La constante de disociación promedio para cada especie se determinó utilizando al menos dos preparaciones de proteína diferentes (excepto P1C4-h2-IgG1 que solo tuvo una preparación de proteína). Las constantes de disociación de cada especie fueron comparables entre diferentes preparaciones de proteína (Tabla 16). Las afinidades de unión de las variantes P1C4-h2 y P1C4-h4 fueron similares. Sin embargo, se observó una ligera tendencia, aunque no estadísticamente significativa, de afinidades de unión mayores de las variantes de IgG1 en comparación con las variantes IgG2, IgG4 y IgG2/4.

P1C4-h0-IgG1 exhibió la menor constante de disociación aparente medida (Kd 24 nM). Sin embargo, la señal de FACS máxima (intensidad de fluorescencia media) de P1C4-h0-IgG1 no aumentó tanto como las otras variantes de P1C4. Esto puede indicar una mayor tasa de disociación de P1C4-h0-IgG1.

La selectividad de unión y la reactividad cruzada de PA13R3-P1C4 y sus variantes humanizadas también se caracterizaron mediante citometría de flujo usando células TRex CHO transfectadas de forma estable con GPCR de interés. Específicamente, se determinó la selectividad de unión de CB1 sobre CB2. También se determinó la reactividad cruzada de CB1 de ratón. Para detectar la expresión de CB1 de ratón, se incubaron 100 pl de 1 x 106 células/ml de células con anticuerpo policlonal de conejo anti-CB1 (Santa Cruz) en 1 pg/100 pl en hielo durante 30 min. Se usó el anticuerpo anti-CB2 monoclonal de ratón de R&D Systems para confirmar la expresión de CB2. Se incubaron 100 pl de 1 x 1o6 células/ml de células con anticuerpo anti-CB2 en 0,5 pg/100 pl en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se centrifugaron a 4 ° Ca 1600 rpm durante 3 minutos; el sobrenadante se aspiró y las células se lavaron con 200 pl de tampón FACS. El procedimiento se repitió dos veces. Después del lavado final, las células se resuspendieron en tampón FACS que contenía anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con FITC (diluciones 1:200) para la detección de CB1 de ratón y anticuerpo secundario IgG anti-ratones conjugado con PE (diluciones 1:200) para la expresión de CB2 y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. Después de una incubación de 30 minutos con anticuerpo secundario, las células se centrifugaron a 4 °C a 1600 rpm durante 3 minutos; el sobrenadante se aspiró para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios. Las células se lavaron con 200 pl de tampón FACS dos veces y se analizaron por citometría de flujo (Guava). Se determinó la unión de curvas de concentración completa de IgG purificada que varían de 1 pM a 1,3 nM. El análisis de datos y la medición de la afinidad de unión (Kd) se llevaron a cabo usando el software GraphPad Prism.

La selectividad de unión y la reactividad cruzada de variantes de PA13R3-P1C4 humanizadas a CB1 humano contra CB2 humano y CB1 de ratón se muestra en las figuras 20E-M. Al igual que PA13R3-P1C4, las variantes humanizadas se unieron selectivamente a CB1 humano contra CB2 humano. No se observó unión sustancial a CB1 de ratón en concentraciones hasta 1 pM, lo cual indica falta de reactividad cruzada con esta especie a pesar de la alta identidad de aminoácidos entre CB1 humano y de ratón en los dominios extracelulares (el 97 % de identidad).

Ejemplo 22. Intercambio de efecto de ELC2 en unión de FACS

Para evaluar el efecto de las mutaciones de ECL2 en la capacidad de P1C4 de unirse a CB1 expresada en la superficie celular, se construyó una construcción de expresión de celular de CB1 mediante mutagénesis dirigida al sitio. En resumen, se usaron 2 oligos, Apollo_ECL2_h2m_F (CTGCAATCTGTTTGCTCAGACATTTTCCCACTCATTGATGAAACCTACCT) (SEQ ID NO: 826) y Apollo_ECL2_h2m_R (GGAAAATGTCTGAGCAAACAGATTGCAGTTTCTTGCAGTTCCAGCCCAGG) (SEQ ID NO: 827) como cebadores en una reacción PCR que usa CB1 humano de pcDNA4TO como plantilla. La reacción introdujo mutaciones E ^ K y H ^ L en ECL2, haciendo que la secuencia ECL2 de humano humana sea idéntica a ECL2 de CB1 murino. La mezcla de reacción de PCR de 50 pl contenía 10 pl 5*PCR de tampón, 2 pl de dNTPs (10 mM cada uno), 0,25 |jl de cada cebador directo e inverso (100 jM de solución madre), 50 ng de ADN molde, 1 |jl de DMSO y 1 |jl de polimerasa de Phusion (NEB). Los ciclos de PCR fueron 95 °C durante 30 segundos, 55 °C 1 minuto, 72 °C 7 minutos y se repitieron 16 veces. Después de la finalización de la reacción PCR, se añadió 1 jl de Dpnl (20U/ jl) en el producto de PCR. El producto de PCR se incubó a 37 °C durante 1 hora antes la transformación de 1 jl en Dh5a E. coli. Los transformantes resultantes se colocaron en placas y las colonias únicas se secuenciaron para verificar la mutación. La construcción resultante se nombró como CB1-IRES-GFP cambiado de pcDNA4TO-humano/ECL2 de ratón.

Para confirmar que los sitios E-->K y H-->L en ECL2 eran críticos para la unión de CB1 de PA13R3-P1C4, se usaron construcciones de expresión cambiadas de células TRex-CHO transfectadas en forma temporal con CB1 humano, CB1 de ratón o ECL2 humana/de ratón para investigar la unión de P1C4-h4-IgG1 mediante citometría de flujo.

Se cultivaron células TRex-CHO en medios de cultivo Ham F12 suplementado con el 10 % de suero bovino fetal, el 1 % de penicilina y estreptomicina y 10 jig/ml de blasticidina. El día antes de la transfección, las células se dividieron y sembraron en 0,5 x 106 células en 2 ml de medio de cultivo por pocillo en una placa de 6 pocillos. El día de la transfección, las células se transfectaron con control negativo de CB1-IRES-GFP o pcDNA4TO-GFP cambiado de CB1 humano de pcDNA4TO, CB1-IRES-GFP de ratón de pcDNA4TO, ECL2 humano/de ratón de pcDNA4TO usando lipofectamina 2000 siguiendo las instrucciones de Life Technologies. El día después de la transfección, las células se trataron con 1 jg/ml de tetraciclina durante 24 horas para inducir la expresión de CB1. El día del experimento, el medio se aspiró; las células se lavaron con DPBS una vez y se incubaron con tampón de disociación de célula durante 5 minutos. Se recolectaron las células y se centrifugaron a 1600 rpm durante 3 minutos. Los sobrenadantes se aspiraron y las células se lavaron con DPBS. Se determinaron los conteos celulares utilizando contador celular Bio-Rad T10. Las células se centrifugaron a 1600 rpm durante 3 minutos; el sobrenadante se aspiró para eliminar DPBS y se resuspendieron en 1 x 106 células/ml de tampón FACS (el 3 % de FBS en DPBS, el 0,09 % de azida de sodio). Para determinar la unión de PA13R3-P1C4 mAb a CB1 humana, CB1 de ratón, CB1 cambiado de ECL2 humana/de ratón y células de control, se incubaron 100 jl de 1 x 106 células/ de células con P1C4-h4-IgG1, R&D CB1 mAb o P2A12 durante 30 minutos en hielo. Se diluyó mAb anti-human conjugada con PE secundaria o mAb anti-ratón conjugada con PE 1:200 veces en tampón FACs . Se utilizaron células teñidas solo con anticuerpo secundario como control negativo. Después de la incubación con anticuerpo secundario, las células se lavaron con 200 jl de tampón FACS dos veces y se analizaron por citometría de flujo (Guava).

Tal como se muestra en la figura 21, P1C4-h4-IgG1 se unió a CB1 humano, pero no a CB1 de ratón o CB1 cambiada de ECL2 humano/de ratón. La única diferencia entre CB1 humano y CB1 cambiada de ECL2 humano/de ratón se encuentran en los restos ECL2 de E ^K y H^L. Los resultados de la unión de citometría de flujo indicaron que ECL2 son fundamentales para la unión de P1C4. Se usó anticuerpo monoclonal CB1 de R&D como control positivo que muestra la expresión de CB1. Se usaron P2A12 y pcDNA4TO-GFP como control de tinción y control de vector vacío, respectivamente.

Ejemplo 23. Análisis de función efectora de ADCC y CDC

Para confirmar la ausencia presumida de la función efectora de las variantes de P1C4 humanizadas P1C4-h2-IgG2 y P1C4-h2-IgG4, se realizaron ensayos de citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) usando células Daudi.

Para el ensayo ADCC, se ajustó la concentración de células diana Daudi a 12,5 * 104 células/ml con medio ADCC. Se añadieron 80 pL de suspensión celular (1 * 104 de células viables) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Se dispensaron veinte pl de anticuerpo, diluidos en serie en medio ADCC, en cada pocillo por triplicado. Las concentraciones finales de Rituximab y Anti-hel-hIgG1 fueron las siguientes: 0,128 ng/ml, 0,64 ng/ml, 3,2 ng/ml, 16 ng/ml, 80 ng/ml, 0,4 pg/ml, 2 pg/ml; las concentraciones finales de Anti-hel-hIgG2, Anti-hel-hIgG4, P1C4-h2-IgG2 y P1C4-h2-IgG4 fueron las siguientes: 3,2 ng/ml, 16 ng/ml, 80 ng/ml, 0,4 pg/ml, 2 pg/ml, 10 pg/ml, 50 pg/ml. Se incubó la placa a 22-25 °C durante 30 minutos. Se ajustó la concentración de p Bm C con medio ADCC de modo que mediante el añadido de 100 pl de células PBMC a las células diana, la proporción célula efectora:diana fue 25:1 y 50:1, respectivamente. Se centrifugó la placa a 250 x g durante 4 minutos y se incubó a 37 °C. 45 minutos antes de recolectar el sobrenadante, se añadieron 20 pl de solución de lisis del kit CytoTox 96 (Promega) a los pocillos de control de lisis máxima. Después de 5 horas de incubación, se centrifugó la placa a 250 x g durante 4 minutos. Se transfirieron 50 pl de sobrenadante de cada pocillo a una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo plano limpia. Se añadieron 50 pl de sustrato del kit CytoTox 96 (Promega) a cada pocillo y se mezcló durante 30 segundos. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de añadir 50 pl de solución de parada a cada pocillo y mezclar durante 30 segundos. Se leyó la absorbancia a 490 nm. Para el análisis de los datos: el % de lisis se calculó utilizando GraphPad Prism 5.0 para generar la CI ⁵⁰ , del siguiente modo:

% lisis

* 100 %

El rituximab indujo el efecto de ADCC en células Daudi con la CI ⁵⁰ de 1,19 ng/ml a 50:1 E/T de proporción, de 0,92 ng/ml a 25:1 E/T de proporción. Como se muestra en la figura 22A-C, los anticuerpos de variantes Fc de P1C4 no tuvieron efecto de ADCC en la proporción de E/T 50:1 y 25:1 en células Daudi.

Para el ensayo CDC, se recolectaron células diana Daudi y se ajustó la concentración de células diana Daudi a 80 * 104 células/ml con medio de cultivo celular. A una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano, se añadieron 25 jl /pocillo de células. Después, se añadieron 12,5 jl/pocillo de P1C4, Rituximab, Anti-HEL-hIgG1, y Anti-HEL-hIgG2, diluidos en serie en medio ADCC, a cada pocillo por duplicado. Las concentraciones finales de Rituximab y Anti-helhIgG1 fueron las siguientes: 0,128 ng/ml, 0,64 ng/ml, 3,2 ng/ml, 16 ng/ml, 80 ng/ml, 0,4 jg/ml, 2 jg/ml; las concentraciones finales de Anti-hel-hIgG2, Anti-hel-hIgG4, P1C4-H2-IgG2 y P1C4-H2-IgG4 fueron las siguientes: 3,2 ng/ml, 16 ng/ml, 80 ng/ml, 0,4 jg/ml, 2 jg/ml, 10 jg/ml, 50 jg/ml. Se incubaron las placas en la campana durante 15 minutos. Se añadió complemento humano, diluido con medio ADCC, a las placas que contenían células a 12,5 jl/pocillo para alcanzar una concentración final del 10%. Para los pocillos con lisis máxima, se añadieron 5 jl de solución de lisis. El volumen final de todos los pocillos se ajustó a 50 jL con medio ADCC. Se incubaron las placas a 37 °C durante 2 horas antes de añadir 50 jl/pocillo de solución CTG a las células. Se agitaron las placas en un agitador de microplacas durante 2 minutos a una velocidad de 200 y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La señal de luminiscencia fue roja con Envision. Para el análisis de los datos, el % de citotoxicidad e IC ⁵⁰ se calculó utilizando GraphPad Prism 5.0 del siguiente modo:

% citotoxicid ^{Experimental - Pro célula complemento)}ad ^{medio (}= x 100 % _{Promedio (lisis máx.) - Promedio (solo célula)}

Se evaluó el efecto de CDC de los anticuerpos en células Daudi, se accedió a la lisis celular de Daudi mediante PBMC por ensayo Glo de titulación celular, la concentración final de complemento fue del 10 %. Rituximab indujo el efecto de CDC en células Daudi con una IC ⁵⁰ de 399 ng/ml. Como se muestra en la figura 22D, los anticuerpos de variantes Fc de P1C4 no tuvieron efecto CDC en las células Daudi.

Ejemplo 24. Reconocimiento de proteína CB1 desnaturalizada por anticuerpos P1C4

Se realizó un estudio para analizar si PA13R3-P1C4 y sus anticuerpos variantes humanizados reconocen epítopos sobre la proteína CB1 desnaturalizada (CB1 truncado de extremos N/C marcado con His) mediante análisis de transferencia Western. Se mezcló la proteína CB1 humana purificada (750 ng por carril) con tampón de reducción SDS que contenía beta-mercaptoetanol (doble hélice). Se cargó la proteína recombinante CB1 desnaturalizada en geles SDS-PAGE al 12 % reductores y se separó la proteína a 120V durante una hora, después se electro-transfirió a membranas PVDF (presumergidas en metanol) a 300 mA durante 70 minutos. Se bloquearon las membranas con NFDM/PBS-T 5% durante una hora a 22 °C, seguido de inmuno-transferencia con anticuerpos de prueba (2 pg/ml) en NFDM/PBS-T 5% durante la noche a 4 °C. Se utilizaron el anticuerpo anti-His de ratón comercial y el anticuerpo anti-CB1 de ratón (R&D Systems) como controles positivos y el anticuerpo anti-CB1 de conejo (Cayman), que reconoce una región de extremo C que se eliminó de la proteína CB1 recombinante utilizado en este estudio, actuó como control negativo.

Después de la incubación durante la noche, se lavaron las membranas con Tween-20 PBS (PBS-T) 0,5% tres veces a 22 °C. Se añadieron los anticuerpos secundarios IgG anti-humano conjugado con AP (1:5000) o IgG anti-ratón o IgG anti-conejo en NFDM/PBS-T 5 % a las membranas respectivas y se incubaron durante 1 hora a 22 °C. Se lavaron las membranas tres veces con PBS-T cada una durante 5 minutos. Después del lavado final, se desarrolló una señal mediante incubación con solución de sustrato NBT/BCIP a 22 °C y se detuvo la reacción mediante lavado de la membrana bajo agua corriente.

Los resultados de la transferencia Western mostraron que los anticuerpos de control positivo pudieron detectar la proteína CB1 desnaturalizada con el peso molecular evidente correcto de 63 kDa (figura 23B, carriles 9 y 10). El anticuerpo específico de extremo C de control negativo no detectó bandas (figura 23B, carril 11), mediante PA13R3-P1C4 (figura 23A, carril 2) o por los anticuerpos variantes humanizados (figura 23A, carriles de 3 a 6). El anticuerpo secundario de Fc anti-humano utilizado en el experimento pudo detectar IgG humana purificada (figura 23A, carril 1). Los resultados indican que PA13R3-P1C4 y los anticuerpos variantes humanizados no pudieron reconocer la proteína CB1 desnaturalizada y linealizada. Junto con los experimentos de citometría de flujo, estos resultados confirman que PA13R3-P1C4 y los anticuerpos variantes humanizados reconocen epítopos conformacionales, pero no lineales.

Ejemplo 25. Unión FACS y AMPc de P1C4 Fab quimérico y humanizado

Para determinar la afinidad de unión de PA13R3-P1C4 Fab, se generaron curvas de unión completas en el receptor CB1 mediante la evaluación de un intervalo de concentraciones utilizando células TRex-CHO transfectadas de forma estable con construcción de expresión de CB1 inducible por tetraciclina mediante citometría de flujo. Se prepararon diluciones seriadas de tres veces de 3 jM a 0,1 jM . Se utilizó anticuerpo anti-humano conjugado con FlTC para detectar PA13R3-P1C4 Fab. PA13R3-P1C4 Fab se unió de forma dependiente de la dosis a células TRex-CHO CB1 (figura 24A, panel A y tabla 17).

Se llevó a cabo un ensayo funcional AMPc para medir el antagonismo de P1C4 Fab. El ensayo funcional AMPc (Cisbio) se realizó sobre una placa de bajo volumen de 384 pocillos blanca (Greiner). Se sembraron 8000 células/pocillo de células TRex CHO con expresión estable de CB1 en la placa, seguido de incubación de P1C4 Fab en diversas concentraciones a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 5 pM de forskolina (Sigma Aldrich) y 9 nM del cannabinoide CP55940 (Sigma Aldrich) a la mezcla de estimulación celular y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente para activar el CB1. Después de 30 minutos de incubación, 5 pL de AMPc-d2 (dilución 1:39 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) y 5 pl de criptato anti-AMPc (dilución 1:9 con conjugado y tampón de lisis proporcionado por Cisbio) se añadieron a la estimulación celular y se incubaron durante una hora. Se detectó la señal FRET con un lector de placas Envision multilabel (Perkin Elmer) en excitación de criptato anti-AMPc a 620 nm y emisión a 665 nm. Se realizó el análisis de datos utilizando GraphPad Prism.

Los resultados se muestran en la figura 24B, panel B y la Tabla 17. Los promedios ± SD de CI ⁵⁰ y las constantes de disociación (Kd) que se muestran se midieron de al menos 2 experimentos diferentes.

Tabla 16. CI ⁵⁰ constantes de disociación de PA13R3-P1C4 Fab

Ejemplo 26. Caracterización biofísica de variantes humanizadas de P1C4

Se caracterizó la estabilidad y la solubilidad de las variantes Fc humanizadas de PA13R3-P1C4 mediante la realización de pruebas para medir la estabilidad a pH bajo y alto y para probar la solubilidad máxima. También se caracterizó la estabilidad de estas moléculas en condiciones aceleradas, en suero humano y de primates no humanos, después de múltiples ciclos de congelamiento/descongelamiento y en condiciones de cambio de pH.

Para caracterizar la estabilidad de pH de las variantes humanizadas de P1C4, se prepararon 200 pl de cada anticuerpo (~5 mg/ml) y control PBS y se introdujeron en un casete de diálisis Pur-A-Lyzer Maxi 12000 (Sigma, n.° de Cat PURX12015-1KT). Se dializaron las proteínas contra 2 l de tampón con un pH = 3 (ácido acético 0,1 M ajustado a un pH = 3 usando NaOH) o tampón con un pH = 9 glicina (0,2 M ajustada a un pH = 9 usando NaOH) respectivamente a 4 °C durante la noche. Se recuperaron muestras de proteína de casetes de diálisis en tubos Eppendorf vacíos prepesados y se comprobó la precipitación visible. Se midió el volumen de la muestra en peso. Para confirmar el éxito de la diálisis, se tomaron 3 pl de muestra dializada y se comprobó mediante papel de pH. Se retiraron muestras de cincuenta pl para análisis s Ec . Las muestras restantes se mantuvieron en una incubadora a 40 °C durante 48 horas. Después de eso, se comprobó la precipitación visible de las muestras nuevamente. Se inyectó una muestra de seis pl con 48 horas de incubación en una columna TSK G3000SWXL SEC y se calculó la concentración de proteínas mediante área pico SEC (después de incubación a 40 °C). Para determinar la tasa de recuperación de proteína, se utilizó la siguiente fórmula: Antes de la diálisis (Vol. x Conc.)/ Después de la diálisis (Vol. x Conc.) x 100%.

No se observó precipitación de las 4 IgG después de la diálisis a tampones de pH 3 y pH 9, seguido de una incubación de 48 horas a 40 °C. Para las cuatro IgG, las tasas de recuperación fueron de aproximadamente el 71-83 %. La tasa de recuperación baja se debió, probablemente, a la muestra que permaneció en el casete de diálisis. Las IgG de monómero calculadas por perfil de SEC fueron más del 99 % para las 4 IgG dializadas. La IgG en tampón con un pH = 3 después de 48 horas de incubación a 40 °C mostró picos SEC más anchos, lo que sugiere mayor heterogeneidad de la IgG después de una incubación prolongada en tampón con un pH = 3. Se midió la actividad de unión a células que expresan CB1 y AMPc de acuerdo con los ejemplos 11 y 7 y los resultados se resumen en las Tablas 18 y 19, respectivamente. Los resultados mostraron que por debajo de un pH = 3, la actividad AMPc de P1C4-h2-IgG4, P1C4-h4-IgG2 y P1C4-h4-IgG4 disminuyó, al igual que P1C4-h4-IgG2 por debajo de un pH = 9.

T l 1 . E ili l H v ri n h m niz P1 4: l ili

continuación

T l 1 . E ili l H v ri n h m niz P1 4: ivi AMP

Se caracterizó la solubilidad de las variantes humanizadas de P1C4 mediante la concentración de 400 |jl IgG (~5 mg/ml), por filtración centrífuga (Amicon Ultra-0,5mL 30K) a 14000 x g a 4 °C hasta ~100 jl. Se añadieron 200 jl más de IgG a filtros centrífugos y se concentraron a 14000 x g a 4 °C hasta ~100 jl. Después del añadido de otros 200 jl de IgG en los filtros centrífugos y concentración a 14000 x g a 4 °C hasta ~100 jl (de 800 jl totales a 100 jl). Se inspeccionó la proteína concentrada en cuanto a la precipitación visible mediante pipeteado ascendente y descendente. Se mantuvo la concentración a 14000 x g a 4 °C hasta que el volumen fue inferior a 50 jl. Se invirtieron los filtros centrífugos y se colocaron en un tubo vacío prepesado. Se centrifugaron los filtros centrífugos a 1000 x g durante 5 minutos a 4 °C para recolectar la muestra concentrada. Se pesaron los tubos para obtener los volúmenes de las muestras. Si la precipitación era visible, se centrifugaron los tubos a 14000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Se retiraron los sobrenadantes en tubos Eppendorf de 1,5 ml nuevos y se incubaron a temperatura ambiente durante 24 horas. Después, se centrifugó la precipitación mediante centrifugación a 14000 x g durante 10 minutos a 4 °C y se pasaron los sobrenadantes a tubos Eppendorf de 1,5 ml nuevos. Para la caracterización SEC, se inyectaron 6 jl de sobrenadante de muestra concentrada en una columna TSK G3000SWXL SEC y se calculó la concentración de proteínas mediante área pico SEC. La tasa de recuperación de proteína se calculó del siguiente modo: Conc. antes (Vol. x Conc.)/ Conc. después (Vol. x Conc.) x 100 %.

Se concentraron cuatro variantes Fc a la concentración de proteína mayor que 85 mg/ml. Las tasas de recuperación de proteína fueron mayores que el 99 %. Se observó precipitación visible leve de P1C4-h2-IgG4 a 93,9 mg/ml antes y después de 24 horas de incubación a temperatura ambiente. No se observó precipitación visible para otras 3 IgG a una concentración mayor que 85 mg/ml después de 24 horas de incubación a temperatura ambiente. Las IgG de monómero calculadas por perfil SEC fueron más del 96 % para las 4 IgG concentradas en comparación con el nivel inicial a ~99 %. Los datos se resumen en la tabla 20.

Tabla 20. Solubilidad de variantes humanizadas de P1C4

También se evaluó la estabilidad acelerada de las variantes humanizadas de P1C4. En un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se colocó una muestra de proteína de 100 jl (~5mg/ml). Se selló el tubo con Parafilm. Se establecieron dos tubos, uno se mantuvo a 4 °C y el otro se mantuvo a 40 °C durante 33 días. Se retiró una alícuota de 20 jl para comprobar la precipitación visible y para el análisis SEC. Para el análisis SEC, se inyectaron 6 jl de muestra en una columna TSK G3000SWXL SEC y se midió la concentración de proteínas mediante área pico SEC. La tasa de recuperación de proteína se calculó del siguiente modo: Antes de la incubación (Vol. x Conc.)/ Después de la incubación (Vol. Conc.) x 100 %.

No se observó precipitación después de 33 días de incubación a 4 °C y 40 °C. Las IgG de monómero calculadas por perfil SEC fueron más del 98 % para las 4 IgG a 4 °C y 40 °C. La tasa de recuperación calculada por perfil SEC fue más del 96% para las 4 IgG a 4 °C y 40 °C (Tabla 21). No se observó cambio en la potencia de la variante Fc de P1C4 después de 33 días a 4 °C y 40 °C, excepto P1C4-h4-IgG2, que presentó CI ⁵⁰ fuera del intervalo mencionado, lo que indica que hubo una reducción leve en su potencia. (Tabla 22).

Tabla 21. Estabilidad acelerada: Solubilidad

Tabla 22. Estabilidad acelerada: Potencia

También se caracterizó la estabilidad en suero de las variantes humanizadas de P1C4. Se obtuvo suero humano de Sigma. Se recogió suero de primate no humano por Crown Bioscience. En un tubo Eppendorf, se mezclaron 950 pl de suero con 50 pl de IgG a una conc. final de 250 pg/ml (~1,67 pM) y se incubó a 37 °C. Se tomaron muestras de 200 pl en los momentos 0, 24, 48 y 72 horas para el ensayo de unión de citometría de flujo utilizando células que expresan CB1. La concentración inicial para las IgG evaluadas fue 500 nM y las muestras se diluyeron en serie 3 veces para los ensayos de citometría de flujo para determinar la Kd de unión. Los resultados, enumerados en las Tablas 23 y 24, no mostraron cambios en afinidad después de 24 horas de incubación con suero humano o de NHP a 37 °C. No se observó un cambio significativo en Kd para las muestras, excepto P1C4-h2-IgG2, que presentó una disminución de la afinidad de unión a células que expresan CB1 después de 48 horas de incubación con suero humano y de NHP. Además, P1C4-h4-IgG2 también mostró afinidad de unión a células que expresan CB1 reducida después de 48 horas.

Tabla 23. Estabilidad en suero humano de variantes humanizadas de P1C4 24 horas

Tabla 24. Estabilidad en suero de NHP de variantes humanizadas de P1C4

Se caracterizó la estabilidad de congelado/descongelado de las variantes humanizadas de P1C4 del siguiente modo. Se descongeló una alícuota de 100 jl de soluciones madre congeladas de cada variante Fc de P1C4 humanizada en un baño de agua a 22 °C, después se congeló rápidamente mediante nitrógeno líquido. Se mantuvo la muestra congelada a -80 °C durante al menos 20 minutos antes de descongelarse en un baño de agua a 22 °C nuevamente. Las muestras se sometieron a 10 de dichos ciclos de congelado/descongelado. Se usó la inspección visual para comprobar la precipitación. Se retiró una alícuota de 20 jl de la muestra para análisis SEC en los ciclos de congelado/descongelado 1, 5 y 10. Para la caracterización SEC, se inyectaron 6 jl de muestra incubada en una columna TSK G3000SWXL s Ec . Se midió la concentración de proteína mediante área pico de SEC. La tasa de recuperación de proteína se calculó utilizando la fórmula: Antes F/T (Conc.)/ Después F/T (Conc.) x 100 %.

Los resultados mostraron que después de 10 ciclos de congelado/descongelado las IgG de monómero fueron mayores que el 97 % para las 4 variantes de IgG evaluadas. La tasa de recuperación de proteína fue más del 96% para todas las IgG. P1C4-H2-IG4 mostró turbidez leve después del 1° ciclo de congelado descongelado, pero no se observó precipitación o disminución significativa de la concentración de proteína. Los resultados se resumen en las Tablas 25 28. También se evaluaron las muestras de proteína recuperadas después de 5 ciclos de congelado/descongelado en cuanto a la función utilizando el ensayo antagonista AMpc y los resultados de CI ⁵⁰ calculados no mostraron cambios significativos en la potencia con cifras dentro del intervalo normal (Tabla 29).

Tabla 25. Estabilidad de con elado/descon elado de P1C4-H2-I G2

Tabla 26. Estabilidad de con elado/descon elado de P1C4-H2-I G4

Tabla 27. Estabilidad de con elado/descon elado de P1C4-H4-I G2

Tabla 28. Estabilidad de con elado/descon elado de P1C4-H4-I G4

continuación

Tabla 29. Estabilidad de congelado/descongelado de variantes humanizadas: actividad AMPc después de 5 ciclos

Para examinar la estabilidad de 4 variantes Fc de P1C4 con cambio de pH, se empaquetaron 0,2 ml de resina MabSelect en una columna de 10 ml y se equilibró con 10 ml DPBS pH 7,4. Se cargó una muestra de 150 |jl de IgG (~ 5 mg/ml) en la columna. Se lavó la columna con 1,6 ml de DPBS. Después se eluyó la IgG con 1,6 ml de citrato de sodio (pH ~3,5). Se midió la concentración de la proteína. Se concentró la proteína a ~3 mg/ml para el ensayo funcional. No se observó precipitación visible. Se centrifugaron estas muestras a 14000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Se transfirió el sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo y se midió la concentración de proteína. También se comprobó esta muestra en cuanto a la agregación mediante SEC y se analizó funcionalmente mediante ensayo antagonista AMPc. Los perfiles SEC mostraron que el porcentaje de IgG de monómero fue más del 95% después que el pH cambiara a pH 3,5. Los resultados del antagonista AMPc se enumeran en la Tabla 30 y mostraron que P1C4-h2-IgG4, P1C4-h4-IgG2 y P1C4-h4-IgG4 se mantuvieron estables a pH 3,5, con las IC⁵⁰medidas dentro del intervalo aceptable. P1C4-h2-IgG2 se comportó de forma diferente a un pH = 3,5, con un valor de CI⁵⁰inferior en comparación con el intervalo aceptable. Este resultado fue similar al de la prueba de estabilidad del pH.

T l . E ili v ri n h m niz P1 4 n m i H

Ejemplo 27. Mutagénesis CDR de PA13R3-P1C4

Para investigar la función de cada posición de aminoácido en cada CDR, se realizó mutagénesis de saturación dirigida al sitio en cada posición CDR de P1C4 Fab quimérico. Se sintetizaron cebadores mutagénicos que contenían NNS o un codón específico, se disolvieron en tampón Tris-EDTA y se diluyeron a 10 jM de solución madre de trabajo. Se establecieron reacciones PCR de veinticinco j l en placas de 96 pocillos utilizando polimerasa de ADN de alta fidelidad. Los productos de PCR resultantes se trataron con 0,8 j l Dpnl (20 U /jl) en cada pocillo a 37 °C durante 5 horas. El producto de PCR tratado con Dpnl (2 j l ) se transformó en 30 j l de células competentes de E. coli Dh5a. Se aisló ADN de los transformantes mediante miniprep y se secuenció para identificar las mutaciones deseadas. Se usó ADN plásmido de clones deseados para transformar las células competentes de E. coli BL21 (CodonPlus). Se usaron colonias únicas para la expresión de la proteína Fab.

Para la expresión de Fab, se seleccionaron colonias en la placa de 96 pocillos que contenían 100 j l de medio SB y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, se usaron 10 j l de cada pocillo para inocular 500 j l de medio ZYM con 50 jg/m l kanamicina en una placa de 96 pocillos profundos. Se selló la placa con un sellador de placas transpirable y se agitó durante 36 horas a 25 °C en un agitador a 450 rpm.

Para preparar las muestras para ELISA, se centrifugó la placa de 96 pocillos profundos a 3000 rpm en una Beckman de mesa durante 20 minutos (~2050 rcf) a 4 °C. Se transfirieron 100 j l de sobrenadante de la placa de expresión a una placa de dilución que contenía 200 j l de PBS, con un pH = 7,4, y se mezcló bien.

Se midió la expresión de Fab mediante ELISA. Las placas ELISA de 96 pocillos de medio pocillo (Corning, 3690) se recubrieron directamente con 2 jg/m l de anticuerpo anti-his (Sigma H10292mg/ml) a 50 jl/pocillo durante la noche a 4 °C. Se lavó la placa 6 veces con 150 j l PBST. Se bloqueó cada pocillo con 175 jl/pocillo de leche al 3 %/PBS, pH 7,4 durante 1 hora a 22 °C. Después se lavó la placa 6 veces con PBST antes de añadir 25 jl/pocillo de medio de cultivo que contenía Fab diluido 3 veces en PBS, pH 7,4 a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 22 °C. Se lavó la placa nuevamente 6 veces con PBST antes de añadir 50 jl/pocillo de anticuerpo Fab anti-humano marcado con HRP (0293 Sigma) en una dilución 1:10000 en leche al 3 % y se incubó a 22 °C durante 1 hora. Para desarrollar el ELISA, se lavó la placa 6 veces con PBST y se añadieron 50 pl/pocillo de sustrato TMB. Se detuvo la reacción mediante el añadido de 50 pl/pocillo HCl 1 N y se leyó la DO ⁴⁵⁰ en el lector BioTek.

Para la medición de la unión iCAPS por ELISA, se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos de medio pocillo con 2 pg/ml, 25 pl/pocillo de streptavidina en PBS, pH 7,4 durante la noche, a 4 °C. Después se lavó la placa 6 veces con 150 pl PBST con rotación intermedia. Después se añadieron 25 pl/pocillo de 5ug/ml CB1 iCAPS a la placa durante 1 hora de incubación. Después de lavar 6 veces con PBST, se bloqueó cada pocillo con 175 pl/pocillo de leche al 3 %/PBS pH 7,4 durante 1 hora, a 22 °C. Se lavó la placa 6 veces con PBST antes de añadir 25 pl/pocillo de medio de cultivo que contenía Fab diluido 3 veces en PBS pH 7,4 a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 22 °C. Se lavó la placa nuevamente 6 veces con PBST antes de añadir 50 pl/pocillo de anticuerpo Fab anti-humano (0293 Sigma) en una dilución 1:10000 en leche al 3 % y se incubó a 22 °C durante 1 hora. Para desarrollar la placa, se lavó la placa 6 veces con PBST y se añadieron 50 pl/pocillo de sustrato TMB. Se detuvo la reacción mediante la adición de 50 pl/pocillo HCl 1 N y se leyó la DO ⁴⁵⁰ en el lector BioTek.

Cada clon se evaluó por triplicado. Para calcular la unión relativa a iCAPS normalizado por la expresión de Fab, la señal de ELISA para la unión de iCAPS se dividió en datos de ELISA de expresión de Fab y se comparó con los datos del clon parental. Los cambios permitidos se definieron como clones que mantenían al menos el 50 % de actividad de unión a iCAPS específica en comparación con los clones parentales. Estos cambios permitidos se resumen en la Tabla 31 y en la Tabla 32. Las secuencias de CDR de las mutaciones indicadas se pueden encontrar en la Tabla 34.

T l 1. M i n rmi i DR n PA1 R -P1 4

T l 2. M i n rmi i DR n li r PA1 R -P1 4

continuación

Ejemplo 28. Inmunotinción de CB1 en muestras de tejido hepático por anticuerpo P1C4-h2-IgG4 conjugado con HRP.

Se marcó el anticuerpo P1C4-h2-IgG4 con el kit de conjugación Lightning-Link HRP de (Innova Bioscience, 701-0010) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se trataron portaobjetos de muestras de hígado humano tratadas con Parafilm con disolvente Clearene (Leica Biosystems) durante 5 minutos y después con una menor concentración de etanol hasta una concentración final del 50 %. Se colocaron los portaobjetos en metanol/peróxido de hidrógeno durante 15 minutos después de lo cual se lavaron brevemente en PBS. Se trataron los portaobjetos con solución salina cítrica (Vector, H-3300) con calentamiento para la recuperación del antígeno antes de colocarse en PBS (350 ml) y tripsina (2,45 ml) precalentados en un baño de agua a 37 °C durante 20 minutos. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se bloquearon con caseína (Vector, SP-5020) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, se añadió P1C4-h2-IgG4 conjugado con HRP diluido 1:100 o anticuerpo de control de isotipo y se incubó durante la noche a 4 °C. Se lavaron los portaobjetos con PBS y se trataron con 3 gotas de Vector ABC Tertiary (Vector, PK-7100) a 22 °C durante 45 minutos. Se usó PBS para lavar los portaobjetos 3 veces y se añadió mezcla DAB (Vector, SK-4100) a los portaobjetos durante 5-10 minutos antes de lavarse nuevamente de forma breve con PBS. Después de esto, los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina Meyers (TCS Biosciences, HS315) durante 1 minuto, seguido de tratamiento en agua, aumentando la concentración de etanol (50 % a 100 %), 2 ciclos de disolvente Clearene antes de montarse en Pertex (Leica Biosystems).

Los resultados mostraron tinción específica de CB1 positiva en macrófagos, hepatocitos y miofibroblastos hepáticos en muestras de NASH temprana (figura 25, panel izquierdo), NASH fibrosis (figura 25, panel central) y fibrosis tardía (figura 25, panel derecho). No se observó tinción con los anticuerpos irrelevantes controlados por isotipo (figura 26) o muestras de tejido normal (figura 27).

Ejemplo 29. Medición de efectos de anticuerpo anti-CB1 sobre marcadores genéticos de fibrosis en células estelares hepáticas humanas primarias

Se aislaron células estelares hepáticas primarias (HSC) de tejido hepático obtenido de 3 donantes sanos. Después de 2-3 pasajes en DMEM 10 % FBS, se activaron las células sobre plástico y se colocaron en medio con 0,5 % de suero durante la noche. Se trataron las células durante 6 o 24 horas con rimonabant (un antagonista de CB1), P1C4-h2-IgG4 y anticuerpos de control no funcionales en concentraciones diferentes. Se midió la inhibición de las características génicas pro-fibróticas, incluyendo a-SMA, Pro-colágeno A1(I), TIMP1 y TGFp, mediante RT-PCR, y se graficaron los datos.

Los resultados mostraron que hubo una disminución significativa en la expresión de Pro-colágeno A1(I) cuando se trataron las HSC con anticuerpos P1C4-h2, pero no con control no funcional y PBS (figura 28). También hubo una disminución significativa de la expresión de TGFp (figura 29) y TIMP1 (figura 30) en comparación con PBS y los controles de anticuerpos no funcionales. Además, la disminución en la expresión de a-SMA también fue significativa en las células tratadas con P1C4-IgG1 o IgG4 en comparación con la de las células tratadas con proteína que se une no funcional o PBS (figura 31).

Ejemplo 30: Cuantificación de anticuerpo anti-CB1 en líquido cefalorraquídeo (LCR) de macaco cangrejero

Se trataron macacos cangrejeros (2 machos y 2 hembras/grupo) con P1C4-h2-IgG4 de acuerdo con el esquema de tratamiento en la Tabla 33 y se recogió CSF en los momentos indicados. Se cuantificó P1C4-h2-IgG4 mediante ELISA mediante recubrimiento de placas de 96 pocillos con un anticuerpo anti-ID a 1 ug/ml, seguido del añadido de CSF y detección con un anticuerpo anti-IgG conjugado con HRP (Abcam) y reactivo de color.

Como se muestra en la Tabla 33, el anticuerpo solo se detectó en niveles muy bajos, si es que se detectó. En el grupo de dosis más alta, menos del 0,1 % de la dosis inyectada fue detectable en el LCR, lo que indica que la exposición al anticuerpo de SNC es muy baja.

Tabla 33. Cuantificación de anticuer o anti-CB1 en LCR de macaco can re ero

Ejemplo 31. Medición de los efectos del anticuerpo anti-CB1 sobre los factores metabólicos y cardiovasculares en macacos cangrejeros

El programa RIO demostró los efectos cardiometabólicos del tratamiento con rimonabant usando diversos factores. Véase, por ejemplo, Pi-Sunyer et al., 2006, J Am Coll Cardio, 147:362A. Como tal, el efecto de los anticuerpos anti-CB1 descrito en el presente documento también se evaluó para los efectos sobre factores cardiometabólicos similares.

Se trataron macacos cangrejeros y macacos de la India obesos con el anticuerpo anti-CB1 P1C4-h2-IgG4 a 3 mg/kg o 0,3 mg/kg con dosificación semanal s.c. Para los controles negativos, se inyectó a un grupo de primates con (1) vehículo farmacéutico solo; o (2) un anticuerpo de control que se sabe que se une a CB1. Se observaron los efectos sobre ingesta de alimentos, pesos corporales, sensibilidad a la insulina, niveles de triglicéridos y otros factores de riesgo cardiovascular de los primates.

Los primates tratados con anticuerpo anti-CB1 P1C4-h2-IgG4 con 3 mg/kg o 0,3 mg/kg presentaron niveles de triglicéridos y otros factores de riesgo cardiovascular reducidos. Los primates tratados con el anticuerpo anti-CB1 P1C4-h2-IgG4 con 3 mg/kg o 0,3 mg/kg también presentaron mayor sensibilidad a la insulina. Los primates que recibieron inyección de anticuerpo de control o vehículo solo no presentaron mejoras en estos factores.

T l 4. n i m i n rmi i n r DR PA1 R -P1 4

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente al receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento comprenden una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de acuerdo con los SEQ ID NO: 352, 353 y 354, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera de acuerdo con los SEQ ID NO: 355, 356 y 357, respectivamente

en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo son un agonista inverso del receptor CB1. 2. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 con una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de aproximadamente 1 pM menos.

3. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o el fragmento tienen al menos una de las siguientes propiedades:

es un modulador alostérico de la actividad de señalización del receptor CB1; y/o

inhibe la actividad de señalización del receptor CB1.

4. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo se conjuga con un agente, por ejemplo, un agente terapéutico adicional, un agente citotóxico, una molécula de inmunoadhesión o un agente de formación de imágenes.

5. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que comprenden:

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica al SEQ ID NO: 2; y

una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica al SEQ ID NO: 6.

6. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, en donde el anticuerpo o el fragmento comprenden:

una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica al SEQ ID NO: 4; y

una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica al SEQ ID NO: 8.

7. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que comprenden:

una región variable de cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 340; y

una región variable de cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 337.

8. El anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7, que comprenden una región constante de cadena pesada que comprende los SEQ ID NO: 433 o 434.

9. El anticuerpo aislado o el fragmento de acuerdo con la reivindicación 7, que comprenden una cadena pesada de longitud completa que comprende los SEQ ID NO: 436 o 437; y/o una cadena ligera de longitud completa que comprende el SEQ ID NO: 338.

10. Un anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al receptor cannabinoide 1 (CB1), en donde el anticuerpo o el fragmento comprenden:

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10; y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14 y, opcionalmente, una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a los SEQ ID NO: 12 o 20; y una región constante de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a los SEQ ID NO: 16 o 24.

11. El anticuerpo aislado o el fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo tienen al menos una de las siguientes propiedades: es un anticuerpo humanizado;

comprende una región Fc de IgG1 humana;

comprende una región Fc modificada.

12. Un anticuerpo humanizado aislado o el fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 u 11 en donde el anticuerpo o el fragmento tienen al menos una de las siguientes propiedades:

una afinidad de unión Kd por el receptor CB1 de 100 nM o menos; y/o

exhibe penetración en el cerebro ausente.

13. Un método in vitro para antagonizar CB1, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa el receptor CB1 con un anticuerpo o un fragmento de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

14. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en un método para tratar una enfermedad o un trastorno que responden al antagonismo del receptor CB1 en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde la enfermedad o el trastorno se seleccionan del grupo que consiste en obesidad, diabetes, dislipidemia, enfermedades metabólicas, fibrosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad hepática, cirrosis biliar primaria, enfermedad renal, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, osteoporosis, ateroesclerosis, enfermedad cardiovascular, cáncer, enfermedades oculares, por ejemplo glaucoma, y enfermedad inflamatoria.

15. Una célula hospedadora que expresa el anticuerpo aislado o el fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 7.