ES2916048T3 - Métodos para evaluar la potencia de transducción de vectores víricos - Google Patents
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Abstract
Método para fabricar linfocitos T aptos para la inmunoterapia, el cual comprende: (A1)La obtención de linfocitos T primarios de al menos un individuo sano (A2)La activación de los linfocitos T obtenidos en la etapa (A1) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (A3)La transducción de los linfocitos T activados en la etapa (A2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x 108 células/ml y un vector retrovírico inoculado con distintas concentraciones volumétricas; a saber, volumen de la muestra de virus por volumen de la mezcla de transducción, en que el vector retrovírico porta un transgén (A4)La expansión de los linfocitos T que han sido transducidos en la etapa (A3), y (A5)La determinación de la concentración volumétrica del vector retrovírico que brinda en promedio la máxima cantidad de linfocitos T expandidos que expresan el transgén o en promedio el máximo número de copias integradas del transgén sin que se superen las cinco copias integradas por célula en los linfocitos T que ha sido expandidos en la etapa (A4), y (B1)La obtención de linfocitos T primarios de un paciente (B2)La activación de los linfocitos T obtenidos en la etapa (B1) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (B3)La transducción de los linfocitos T activados en la etapa (B2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x 108 células/ml y el retrovirus usado en la etapa (A3) inoculado en la concentración volumétrica que se ha determinado en la etapa (A5) (B4)La expansión de los linfocitos T primarios que han sido transducidos en la etapa (B3).
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para evaluar la potencia de transducción de vectores víricos
GENERALIDADES
1. Ámbito
La presente descripción concierne a un método de fabricación de linfocitos T aptos para la inmunoterapia.
2. Antecedentes
Uno de los problemas que plantea la inserción de un gen mediante un vector vírico o un virus con fines terapéuticos estriba en la preparación y la cuantificación precisas de las formulaciones clínicas. La producción de vacunas víricas, proteínas recombinantes mediante vectores víricos o antígenos víricos exige siempre la cuantificación del virus para supervisar y adaptar continuamente el proceso con el fin de optimizar el rendimiento de la producción y responder a las demandas y las aplicaciones siempre cambiantes.
La determinación del título de virus o la cuantificación de virus implica el recuento de la cantidad de virus presentes en un volumen específico para determinar la concentración del virus. Los métodos tradicionales incluyen los ensayos de placas de lisis, donde se determina la cantidad de unidades formadoras de placas (UFP) en una muestra de virus y la dosis infecciosa en cultivo tisular (DICT50) o la dosis infecciosa activa por fluorescencia (DIAF50) que mide el título de virus infecciosos. Este ensayo de DICT50 cuantifica la cantidad de virus que es necesaria para matar el 50% de las hospedadoras infectadas o para producir un efecto citopático en el 50% de las células del cultivo inoculado. Los métodos tradicionales son en general lentos y laboriosos, y adolecen de limitaciones como es un alto grado de variabilidad interensayo.
El ensayo de enzimoinmunoadsorción (ELISA) es una modalidad más moderna de un ensayo basado en proteínas que consta de un anticuerpo específico enlazado a una enzima que detecta la presencia de una cantidad de antígeno desconocida (el virus) contenida en una muestra. La unión del anticuerpo al antígeno se detecta o se cuantifica mediante la capacidad de la enzima para convertir un reactivo en una señal detectable con la que se puede calcular la concentración del antígeno en la muestra. Se han desarrollado ensayos en placa para la determinación del título de virus que están basados en la detección de inmunofluorescencia con un ELISA, pero se emplean para cuantificar proteínas de muestras víricas, no para cuantificar las partículas víricas infecciosas.
Se han usado los ensayos de citometría de flujo o FACS (selección celular activada por fluorescencia) para medir el número de células infectadas en cultivos celulares con multiplicidades de infección (MOI) relativamente altas. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.248.514 describe el uso de la citometría de flujo para analizar células infectadas mediante intervalos específicos de concentración de partículas víricas y diferentes tiempos de adsorción. La patente de EE.UU. N.° 7.476.507 describe métodos basados en la FACS para la determinación del título vírico de un cultivo de células hospedadoras animales que han sido infectadas con un circovirus. Ahora bien, el coste, el tamaño y la complejidad de los citómetros de flujo impiden su uso generalizado en numerosas aplicaciones.
Los métodos destinados a evaluar los títulos de vectores retrovíricos se dividen en general en métodos de titulación funcionales y no funcionales. Entre los métodos no funcionales figuran el ELISA con antígeno p24, la evaluación de la actividad de la retrotranscriptasa (RT) y la determinación de la concentración de ARN genómico en preparaciones de vector mediante la técnica Northern semicuantitativa, la inmunotransferencia por puntos o la RT-qPCR. En ocasiones dichas técnicas sobrestiman el título de vector funcional y adolecen de ciertos inconvenientes. Así, por ejemplo, la cantidad de proteína p24 cuantificada puede incluir una cantidad variable tanto de p24 libre como de partículas del vector no funcionales. De modo similar, los títulos de ARN pueden incluir las partículas defectuosas, en tanto que el ensayo de la RT puede demostrar actividad RT. Es posible obtener títulos funcionales más precisos mediante la transducción de las células con el vector poco diluido evaluando a continuación la actividad de una proteína indicadora, p. ej., células positivas para la p-galactosidasa, o mediante la evaluación del número de unidades formadoras de colonias que aparecen tras la selección con antibiótico. Como técnicas más difundidas y sencillas para cuantificar los títulos de vectores funcionales se puede recurrir a la selección de células activada por fluorescencia (FACS) y la fluorescencia con eGFP. No obstante, el análisis de la expresión de transgenes con FACS puede quedar limitado a las proteínas fluorescentes indicadoras y en ocasiones no diferencia entre las células que presentan una sola o varias integraciones.
US20170166866 describe un método para transducir un linfocito T primario, que consiste en la puesta en contacto del linfocito T primario con un vector vírico que contiene un ácido nucleico, p. ej. un vecto lentivírico, con una multiplicidad de infección (MOI) de 1,5 a 2,5 y con un compuesto que es un inhibidor del sistema inmunitario innato, de modo que el ácido nucleico es transducido en el linfocito T.
US20170023570 describe un método de alto rendimiento para cuantificar partículas víricas infecciosas en una muestra. Este método de cuantificación vírica incluye las etapas siguientes: 1) obtención de una muestra que contenga un virus; 2) preparación de diluciones en serie de la muestra; 3) infección de células hospedadoras con el virus e incubación del cultivo; 4) reacción de un antígeno expresado por el virus en las células infectadas con un anticuerpo
marcado con un marcador fluorescente; 5) determinación del número de células infectadas; y 6) determinación del título de virus presente en la muestra. Persiste la necesidad de mejores métodos con que evaluar las concentraciones de virus óptimas para la transducción vírica de cara a la fabricación de linfocitos destinados a inmunoterapia.
Levine et al., 2017 (Mol. Therapy - Methods & Clin. Development, Vol. 4:92-101), Verhoyen et al., 2009 (Methods in Mol. Biol., Methods & Protocols, Chapter 8) y Cribbs et al., 2013 (BMC Biotechnology, Vol. 13(98) dan a conocer métodos de preparación de linfocitos T genomodificados procedentes de pacientes y destinados a inmunoterapia. Sin embargo, ninguno de los métodos indica cómo determinar la cantidad óptima de virus que ha de añadirse para la transducción.
En la disciplina existe la necesidad de métodos que permitan cuantificar con precisión las partículas víricas de cara a la fabricación de productos a base de linfocitos T.
RESUMEN CONCISO
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para fabricar linfocitos T aptos para la inmunoterapia, los cuales comprenden:
(A1) La obtención de linfocitos T primarios de al menos un individuo sano
(A2) La activación de los linfocitos T obtenidos en la etapa (A1) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (A3) La transducción de los linfocitos T activados en la etapa (A2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106células/ml a 1,0 x 108células/ml y un vector retrovírico añadido con distintas concentraciones volumétricas; a saber, volumen de la muestra de virus por volumen de la mezcla de transducción, en que el vector retrovírico porta un transgén
(A4) La expansión de los linfocitos T transducidos en la etapa (A3), y
(A5) La determinación de la concentración volumétrica del vector retrovírico que brinda en promedio el máximo número de linfocitos T expandidos que expresan el transgén o en promedio el máximo número de copias integradas del transgén sin superar las cinco copias por célula en los linfocitos T expandidos de la etapa (A1), y
(B1) La obtención de linfocitos T primarios de un paciente
(B2) La activación de los linfocitos T obtenidos en la etapa (B1) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x 108 células/ml y el retrovirus usado en la etapa (A3) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28
(B3) La transducción de los linfocitos T activados en la etapa (B2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x 108 células/ml con la concentración volumétrica del retrovirus que se ha determinado en la etapa (A5), y
(B4) La expansión de los linfocitos T primarios que han sido transducidos en la etapa (B3).
En otro aspecto, el vector retrovírico es un vector retrovírico que expresa un receptor de linfocito T (TCR).
En otro aspecto más, el vector retrovírico es un vector lentivírico que expresa un TCR.
En otro aspecto, la mezcla de transducción puede contener una concentración celular de aproximadamente 0,1 x 106 células/ml a aproximadamente 1,0x106 células/ml, de aproximadamente 0 ,5x106 células/ml a aproximadamente 1,0x106 células/ml, de aproximadamente 1,0x106 células/ml a aproximadamente 1,0x107 células/ml, de aproximadamente 5 ,0x106 células/ml a aproximadamente 1,0x107 células/ml, de aproximadamente 1,0x107 células/ml a aproximadamente 1,0 x 108 células/ml, o de aproximadamente 5,0 x 107 células/ml a aproximadamente 1,0 x 108 células/ml.
En un aspecto, los linfocitos T de la etapa (A1) se obtienen de una pluralidad de individuos sanos.
En un aspecto, el paciente o individuo que necesita de los mismos es un paciente con cáncer. En otro aspecto, el cáncer a tratar se selecciona entre el grupo consistente en: carcinoma hepatocelular (CHC), carcinoma colorrectal (CRC), glioblastoma (GB), cáncer gástrico (CG), cáncer de esófago, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de páncreas (CPc), carcinoma de células renales (CCR), hiperplasia benigna de próstata (HPB), cáncer de próstata (CPr), cáncer de ovario (CO), melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica (LLC), carcinoma de células de Merkel (CCM), cáncer de pulmón microcítico (CPM), Non-Hodgkin-Syndrom.
En otro aspecto, los linfocitos T obtenidos en la etapa (A1) y la etapa (B1) son linfocitos T CD8+.
Otros aspectos y formas de realización de la presente invención se dan a conocer en el conjunto de reivindicaciones anexo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
En la FIG. 1 se observa que las copias integradas del vector vírico (lentivirus (LV)-R73) (líneas continuas) y la cantidad de linfocitos T (% de dextrámeros MHC (Dex)+) que expresan el transgén (R7P1D5 TCR) (líneas discontinuas) resultan similares en los linfocitos T obtenidos del donante sano n.° 6 en los lotes técnicos («Lotes técnicos») y los lotes de BPF («Lotes de BPF») cuando se alinean en función de las concentraciones volumétricas.
En la FIG. 2 se constata que las copias integradas del vector vírico (LV-R73) (líneas continuas) y la cantidad de linfocitos T (% de Dex+) que expresan el transgén (R7P1D5 TCR) (líneas discontinuas) difieren en los linfocitos T obtenidos del donante sano n.° 6 en los lotes técnicos y en los lotes de BPF cuando se alinean en función de las multiplicidades de infección (MOI).
En la FIG. 3 se observa que las copias integradas del vector vírico (LV-R73) (líneas continuas) y la cantidad de linfocitos T (% de Dex+) que expresan el transgén (R7P1D5 TCR) (líneas discontinuas) resultan similares en los linfocitos T obtenidos del donante sano n.° 7 en los lotes técnicos y los lotes de BPF cuando se alinean en función de las concentraciones volumétricas.
En la FIG. 4 se constata que las copias integradas del vector vírico (LV-R73) (líneas continuas) y la cantidad de linfocitos T (% de Dex+) que expresan el transgén (R7P1D5 TCR) (líneas discontinuas) difieren en los linfocitos T obtenidos del donante sano n.° 7 en los lotes técnicos y los lotes de BPF cuando se alinean en función de las multiplicidades de infección (MOI).
En la FIG. 5 se observa que las copias integradas del vector vírico (LV-R73) (líneas continuas) y la cantidad de linfocitos T (% de Dex+) que expresan el transgén (R7P1D5 TCR) (líneas discontinuas) resultan similares en los linfocitos T obtenidos del donante sano n.° 9 en los lotes técnicos y los lotes de BPF cuando se alinean en función de las concentraciones volumétricas.
En la FIG. 6 se constata que las copias integradas del vector vírico (LV-R73) (líneas continuas) y la cantidad de linfocitos T (% de Dex+) que expresan el transgén (R7P1D5 TCR) (líneas discontinuas) difieren en los linfocitos T obtenidos del donante sano n.° 9 en los lotes técnicos y los lotes de BPF cuando se alinean en función de las multiplicidades de infección (MOI).
En la FIG. 7 se muestra la cantidad de linfocitos T (% Dex+ de los linfocitos CD3+CD8+) que expresan el transgén (R7P1D5 TCR) entre los obtenidos de 10 donantes sanos que habían sido transducidos con tres concentraciones volumétricas distintas del vector vírico elegidas para seleccionar el volumen óptimo de virus.
En la FIG. 8 se muestran las copias del vector vírico (LV-R73) integradas en los linfocitos T de 10 donantes sanos que habían sido transducidos con tres concentraciones volumétricas distintas del vector vírico elegidas para seleccionar el volumen óptimo de virus.
La FIG. 9 ilustra un método acorde con una forma de realización de la presente descripción.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Se dan a conocer linfocitos T que son transducidos con un vector vírico añadido en una concentración volumétrica y métodos relacionados con los mismos. En un aspecto, la presente descripción proporciona una evaluación de las concentraciones de vector lentivírico que son óptimas para transducir los linfocitos T.
También se dan a conocer poblaciones de linfocitos T producidas con métodos descritos en la presente memoria.
En un aspecto, la presente descripción comprende un método para fabricar linfocitos T aptos para la inmunoterapia, método que comprende:
(A1) La obtención de linfocitos T primarios de al menos un individuo sano
(A2) La activación de los linfocitos T obtenidos en la etapa (a1) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (A3) La transducción de los linfocitos T activados de la etapa (A2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x l08 células/ml y un vector retrovírico añadido con distintas concentraciones volumétricas; a saber, volumen de la muestra de virus por volumen de la mezcla de transducción, en que el vector retrovírico porta un transgén
(A4) La expansión de los linfocitos T que han sido transducidos en la etapa (A3), y
(A5) La determinación de la concentración volumétrica del vector retrovírico que brinda en promedio el máximo número de linfocitos T expandidos que expresan el transgén o en promedio el máximo número de copias integradas del transgén sin superar las cinco copias por célula en los linfocitos T expandidos de la etapa (A1),
y
(B1) La obtención de linfocitos T primarios de un paciente
(B2) La activación de linfocitos T obtenidos en la etapa (B1) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (B3) La transducción de los linfocitos T activados en la etapa (B2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x 108 células/ml con la concentración volumétrica de retrovirus que ha sido determinada en la etapa (A5), y
(B4) La expansión de los linfocitos T primarios transducidos en la etapa (B3).
Los linfocitos T se pueden obtener de una pluralidad de donantes sanos, pacientes o individuos. Los linfocitos T se pueden obtener de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, diez o más, o 20 o más donantes sanos, pacientes o individuos.
En otro aspecto, el vector retrovírico es un vector retrovírico que expresa un receptor de linfocito T (TCR).
Las concentraciones volumétricas pueden ser de aproximadamente 0,01 |jl por aproximadamente 106 células a aproximadamente 1 ml por aproximadamente 106 células; de aproximadamente 0,01 j l por aproximadamente 2 x 106 células a aproximadamente 1 ml por aproximadamente 2 x 106 células; de aproximadamente 0,01 j l por aproximadamente 5 x 106 células a aproximadamente 1 ml por aproximadamente 5 x 106 células; de aproximadamente 0,01 j l por aproximadamente 107 células a aproximadamente 1 ml por aproximadamente 107 células; de aproximadamente 1 j l por aproximadamente 107 células a aproximadamente 500 j l por aproximadamente 107 células; de aproximadamente 5 j l por aproximadamente 107 células a aproximadamente 150 j l por aproximadamente 107 células; o de aproximadamente 8 j l por aproximadamente 107 células a aproximadamente 12 j l por aproximadamente 107 células.
En la presente memoria, el término “aproximadamente" define un intervalo del ± 5% respecto al valor indicado.
El término “concentración volumétrica” empleado en la presente memoria designa el volumen (p. ej. ml y j l ) de virus usado por volumen (p. ej., ml y j l ) de la mezcla de transducción (medio o diluyente). El volumen de la mezcla de transducción se puede determinar en función de la concentración de células durante la transducción. Por ejemplo, si la concentración de células para la transducción queda fijada en 2,0 x 106 células/ml, entonces las 2,0 x 106 células transducidas pueden permanecer en un volumen fijo de 1,0 ml de la mezcla de transducción, o bien se pueden introducir 1,0 x 106 células transducidas en un volumen fijo de 0,5 ml de mezcla de transducción.
Los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir la determinación de la concentración volumétrica que brinda en promedio la máxima cantidad de linfocitos T expandidos que expresan el transgén entre los linfocitos T expandidos procedentes de la pluralidad de donantes sanos, p. ej. midiendo el porcentaje de células que expresan el transgén.
El método puede incluir la determinación de la concentración volumétrica con la que no se supere el promedio máximo de 5 copias integradas del transgén en los linfocitos T expandidos procedentes de la pluralidad de donantes sanos.
En un aspecto, el paciente o el individuo es un paciente con cáncer. En otro aspecto, el cáncer descrito en la presente memoria se selecciona entre el grupo consistente en: carcinoma hepatocelular (CHC), carcinoma colorrectal (CRC), glioblastoma (GB), cáncer gástrico (CG), cáncer de esófago, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de páncreas (CPc), carcinoma de células renales (CCR), hiperplasia benigna de próstata (HBP), cáncer de próstata (CPr), cáncer de ovario (CO), melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica (LLC), carcinoma de células de Merkel (CCM), cáncer de pulmón microcítico (SCLC), linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), cáncer de vesícula biliar y colangiocarcinoma (CVB, CCC), cáncer de vejiga urinaria (CVU), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y cáncer de útero (CU).
También se dan a conocer vectores. Un “vector” ha de ser capaz de transferir secuencias de genes a células diana. Normalmente, “constructo de vector”, “vector de expresión” y “vector de transferencia génica” designan cualquier constructo de ácidos nucleicos capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y de transferir secuencias génicas a células diana. Así pues, el término comprende los vectores de clonación y de expresión, así como los vectores de integración.
Se han diseñado vectores retrovíricos a partir de varios miembros de la familia Retroviridae como son spumavirus, virus de la inmunodeficiencia humana (HlV-1), virus de la inmunodeficiencia simia (SIV), virus de la inmunodeficiencia bovina, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la leucemia bovina, virus del sarcoma de Rous (RSV), virus de la necrosis esplénica (SNV) y el virus del tumor mamario del ratón. Las plataformas de uso habitual pueden consistir en vectores lentivíricos derivados de spumavirus y del HIV-1 y vectores gammaretrovíricos derivados del MLV. El tropismo de los retrovirus se puede alterar incorporando proteínas de la envuelta exógenas, y ampliar así la población potencial de células diana. Por ejemplo, se puede ampliar el tropismo incorporando como proteína de la envuelta a la glucoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que posibilita la transferencia génica en una amplia variedad de células tanto in vitro, como p. ej. en citoblastos CD34+, como in vivo, p. ej. en el cerebro, el músculo y el hígado. El seudotipado con proteínas de la envuelta como la GP64 de baculovirus o las E1 y E2 de la hepatitis C puede potenciar la transducción hepática y el seudotipado con la proteína de la envuelta RD114 puede favorecer la transducción en las células linfohametopoyéticas. Los vectores lentivíricos pueden transducir o infectar células que no se estén dividiendo, produciendo normalmente títulos elevados de virus. La selección de un sistema de transferencia génica lentivírico o gammaretrovírico depende del tejido diana. Estos vectores pueden comprender repeticiones terminales largas en cis con una capacidad de encapsidación de hasta 6-10 kb de secuencia exógena. Los LTR en cis mínimos son suficientes para la replicación y la encapsidación de los vectores, mediante los cuales se integra el gen terapéutico en la célula diana y se obtiene la expresión permanente del transgén.
En ciertas formas de realización el vector es un vector lentivírico que expresa un TCR. Tal y como se emplea en la presente memoria, un vector lentivírico es un vector que comprende al menos una parte componente derivada de un lentivirus. Se puede consultar una lista detallada de lentivirus en Coffin et al. (1997) “Retroviruses” Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763). Los vectores lentivíricos se pueden producir
con diversos métodos, véanse, entre otras, las patentes de EE.UU. N.° 5.994.136, 6.165.782 y 6.428.953. Preferentemente, el vector lentivírico es una vector lentivírico deficiente en integrasa (IDLV), véase, p. ej., la publicación de patente de EE.UU. 2009/0117617. Los IDLV se pueden producir del modo descrito, por ejemplo mediante vectores lentivíricos portadores de una o más mutaciones en el gen nativo de la integrasa lentivírica, por ejemplo, como dan a conocer Leavitt et al. (1996) J. Virol. 70(2):721-728, Philippe et al. (2006) Proc. Natl Acad. Sci USA 103(47): 17684-17689 o la WO 06/010834. El IDLV es preferentemente un vector lentívirico VIH que comprende una mutación en la posición 64 de la proteína integrasa (D64V), como describen Leavitt et al. (1996) J. Virol. 70(2):721-728.
En las aplicaciones de terapia génica puede ser deseable que el vector de terapia génica se inserte en un tipo concreto de tejido con gran especificidad. De ser así, el vector vírico se modifica para que tenga especificidad por un tipo concreto de célula mediante la expresión de un ligando como es una proteína de fusión a partir de una proteína de la cápside vírica situada en la superficie externa del virus. El ligando se elige en virtud de su afinidad por un receptor que se sabe presente en el tipo de célula en cuestión. Por ejemplo, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), describieron una modificación del virus de la leucemia murina de Moloney para que expresase una heregulina humana fusionada con la gp70, de modo que el virus recombinante infectara ciertas células del cáncer de mama humano que expresaban el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio se puede hacer extensible a otras parejas de virus y células diana, en que la célula exprese un receptor y el virus exprese una proteína de fusión que contenga un ligando de ese receptor situado en la superficie celular. Por ejemplo, se puede modificar un bacteriófago filamentoso para que muestre fragmentos de anticuerpos (p. ej., FAB o Fv) dotados de una afinidad de unión específica por cualquier receptor celular elegido. Si bien la anterior descripción atañe principalmente a vectores víricos, se pueden aplicar los mismos principios a vectores de otro tipo. Tales vectores no víricos se pueden modificar para que contengan secuencias específicas de entrada que favorezcan su entrada en ciertas células diana en concreto.
Los vectores de terapia génica se pueden administrar in vivo directamente al paciente, normalmente por vía sistémica (infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o tópica, tal y como se describe más adelante. Otra alternativa consiste en inocular ex vivo los vectores en células, como células explantadas de un paciente (p. ej., linfocitos, aspirados de médula ósea o tejido biópsico) o células hematopoyéticas de un donante universal, y después reimplantárselas al paciente, normalmente después de seleccionar las que hayan incorporado el vector.
Las células aptas son, entre otras, células o estirpes celulares eucariotas y procariotas. Ejemplos no limitantes de tales células o de estirpes celulares generadas a partir de tales células son: células COS, CHO (p. ej., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX o CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (e.g., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) y perC6, así como células de insecto como las de Spodoptera fugiperda (Sf), o células fúngicas como las de Saccharomyces, Pichia y Schizosaccharomyces. Las estirpes celulares preferidas serían las estirpes CHO-K1, MDCK o HEK293. Además, se pueden aislar células primarias y usarse ex vivo antes de reintroducirlas en el sujeto a tratar después de someterlas a tratamiento con nucleasas (p. ej., ZFN o TALEN) o sistemas de nucleasas (p. ej., CRISPR/Cas). Las células primarias aptas son los leucocitos monomorfonucleares de sangre periférica (PBMC) y otras subpoblaciones de células sanguíneas como, por ejemplo, los linfocitos T como los linfocitos T CD4+ o CD8+. Las células adecuadas también incluyen células madre como, por ejemplo, embriocitoblastos, citoblastos pluripotentes inducidos, hemocitoblastos (CD34+), neurocitoblastos y citoblastos mesenquimáticos. Los vectores adecuados para la introducción de transgenes en células inmunitarias (p. ej., linfocitos T) engloban vectores lentivíricos no integradores.
En la fabricación convencional de linfocitos T, la cantidad de vector vírico que se ha de usar se basa a menudo en el título del lote de virus, que se determina con una estirpe celular como la 293t . Con ese título, el virus se prueba en un intervalo de multiplicidades de infección (MOI), que, cuando concierne a un grupo de células inoculadas con partículas víricas, es la proporción entre partículas víricas y células diana que están presentes en un espacio definido. Los valores más altos de las multiplicidades de infección (MOI) en el intervalo lineal se pueden seleccionar como las MOI óptimas. Sin embargo, este método puede estar sujeto a una variación amplia debido al uso de estirpes de células tumorales para la determinación del título, como p. ej. la 293T, y el hecho de que las multiplicidades de infección (MOI) dependen del título. En la presente memoria se dan a conocer métodos para determinar el volumen óptimo de virus que es necesario para fabricar y evaluar la potencia de distintos lotes de vector vírico. Por ejemplo, en lugar de usar estirpes celulares, como p. ej. células 293T, se pueden usar linfocitos T primarios humanos procedentes de donantes sanos siguiendo el mismo proceso de fabricación de linfocitos T a pequeña escala, p. ej. con 1 o 2 millones de linfocitos en un pocillo de una placa de 24 pocillos G-Rex (2 cm2), que a media escala pueden ser 5 millones de células en un pocillo de una placa de 6 pocillos G-Rex (10 cm2), o a gran escala con 50 millones de células en una placa G-Rex 100 (100 cm2). La escala de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF, o GMP en inglés) puede comenzar con 250-400 millones de células en placas 5-8 G-Rex100. Las lecturas obtenidas en las diferentes escalas pueden ser directamente relevantes para la fabricación clínica.
Y es así que los métodos de la presente descripción pueden ser más robustos que los métodos convencionales en que se usan títulos y multiplicidades de infección (MOI) derivados de estirpes celulares y pueden reducir la variación cuando se precisan varias lotes de vector lentivírico para fabricar el mismo producto de linfocitos T.
Una molécula “exógena” es una molécula que normalmente no está presente en la célula, pero que se puede introducir en ella mediante uno o varios métodos genéticos, bioquímicos o de otro tipo. La “presencia normal en la célula” se determina en relación con un estadio concreto del desarrollo y con unas condiciones ambientales concretas de la célula. Así pues, por ejemplo, una molécula que solo esté presente durante el desarrollo embrionario del músculo será exógena en una célula muscular del adulto. De modo similar, una molécula que sea inducida por el choque térmico será una molécula exógena si la célula en cuestión no ha experimentado ese choque. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena funcionalmente anómala o una versión funcionalmente anómala de una molécula endógena normofuncional.
Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, como la generada con un proceso de química combinatoria, o una macromolécula como una proteína, ácido nucleico, glúcido, lípido, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen el ADN y el ARN, pueden ser mono o bicatenarios, pueden ser lineales, ramificados o circulares, y tener cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los capaces de formar dúplex, así como ácidos nucleicos formadores de tríplex. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.u U. N.° 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, entre otras, proteínas de unión a ADN, factores de transcripción, factores remodeladores de la cromatina, proteínas de unión a ADN metilado, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, cinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas o helicasas.
Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, p. ej., una proteína o un ácido nucleico exógenos. Por ejemplo, el ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma vírico infeccioso, un plásmido o un episoma introducido en una célula, o un cromosoma que normalmente no esté presente en la célula. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en las células son conocidos por las personas versadas en la materia y consisten, entre otros, en la transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluidos con lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo con partículas, coprecipitación con fosfato cálcico, transferencia mediante DEAE-dextrano y transferencia mediante vector vírico.
En contraste, una molécula “endógena” es una molécula que normalmente está presente en una célula concreta en un estadio del desarrollo en particular y en unas condiciones ambientales determinadas. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, de un cloroplasto o de otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico natural. Otras moléculas endógenas pueden ser proteínas como, por ejemplo, factores de transcripción o enzimas.
A efectos de la presente descripción, “gen” define una región de ADN que codifica un producto génico (véase abajo), así como todas las regiones de ADN que regulen la producción del producto génico en cuestión, sean tales secuencias reguladoras adyacentes o no a las secuencias codificantes o transcritas. Por consiguiente, el gen incluye, sin quedar limitado necesariamente a ello, secuencias promotoras, de terminación, secuencias reguladoras de la traducción como los sitios de unión al ribosoma y sitios de entrada al ribosoma, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos limítrofes, orígenes de replicación, sitios de anclaje a la matriz y regiones de control del locus.
El término “expresión génica” designa la conversión de la información contenida en un gen en un producto del gen. El producto del gen puede ser el producto directo de la transcripción del gen (p. ej., ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozimas, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida mediante la traducción de un ARNm. Los productos génicos también engloban los ARN que son modificados mediante procesos como la adición de la caperuza, poliadenilación, metilación y edición, y las proteínas modificadas, por ejemplo por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación o glucosilación.
La “modulación” de la expresión génica concierne a cambios en la actividad en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, entre otros, la activación y la represión del gen en cuestión. La modulación también puede ser completa, es decir, que la expresión génica quede totalmente inactivada o quede activada a los niveles naturales o más allá; o puede ser parcial, es decir, que la expresión génica quede reducida parcialmente, o se active parcialmente hasta cierta fracción de los niveles naturales.
Los términos “ácido nucleico”, “polinucleótido” y “oligonucleótido” se usan indistintamente para designar un polímero de desoxiribonucleótidos o de ribonucleótidos, en conformación lineal o circular, y en forma mono o bicatenaria. A efectos de la presente descripción, estos términos no se deben interpretar como limitantes con respecto a la longitud del polímero. Los términos pueden englobar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos cuya base nitrogenada, glúcido o grupo fosfato hayan sido modificados (p. ej., esqueletos de fosforotioato). En general, los análogos de un nucleótido particular tienen la misma especificidad de emparejamiento con las otras bases; es decir, un análogo de la A se emparejará con la T.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente para designar un polímero de residuos de aminoácidos. El término también designa los polímeros de aminoácidos en que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados del correspondiente aminoácido natural.
El término “secuencia” designa una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN, puede ser lineal, circular o ramificada y monocatenaria o bicatenaria. El término “secuencia del donante” designa una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. La secuencia del donante puede tener cualquier longitud, por ejemplo de 2 a 10.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor intermedio entre las dos cifras indicadas), preferentemente de unos 100 a 1.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor intermedio entre ambas cifras), más preferentemente entre unos 200 y 500 nucleótidos de longitud.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Lotes
Los lotes preclínico (I+D), técnico y de BPF pueden ser tres lotes de vector lentivírico adquiridos a LENTIGEN. El lote técnico puede ser similar al lote de BPF (32 litros cada uno), pero los controles de calidad y las especificaciones para la liberación pueden ser más estrictos en el caso del lote de BPF. Los lotes preclínicos (no mostrados) pueden ser preparaciones de lotes del vector más pequeñas (4 litros) que los lotes técnicos y de BPF. Por ejemplo, los títulos del lote preclínico, del lote técnico y del lote de BPF pueden ser 1,1x109 UT/ml, 1,9x109 UT/ml y 8,3 x109 UT/ml, en ese orden.
Eficiencia similar de la transducción con lotes distintos basados en las concentraciones volumétricas
La transducción de linfocitos T procedentes de donantes sanos con un vector lentivírico que facilite la expresión del TCR R7P1D5 (LV-R73) se puede llevar a cabo activando los linfocitos T con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 (Invitrogen) inmovilizados mientras se cultivan en medio TexMACS (Miltenyi) con seroalbúmina humana al 5% e IL-7 e IL-15 para estimular la expansión, siempre que las citocinas no sean la IL-2 sola, ni la IL-7 sola, ni la combinación de IL-2, IL-7 e IL-15, ni la combinación de IL-2 e IL-7. Este procedimiento conservó el fenotipo de diferenciación temprana de los linfocitos T (T vírgenes o de memoria indiferenciados: CD45RA+CCR7+ o CD45RA+CCR7+CD62L+ o CD45RO-CCR7+ o CD45RO-CCR7+CD62L+), y los linfocitos T transducidos proliferaron en comparación con los que no lo habían sido. También se pueden usar otras citocinas, como las IL-10, IL-12 e IL-21, los interferones y el TGF-p. Los linfocitos transducidos también pueden presentar fenotipos CD28+CD27+.
Número de copias
Por número de copias se entiende la cuantificación de los genomas del vector provírico en el ADN genómico extraído del producto de linfocitos T y su normalización con respecto a la cantidad de un gen de referencia que tiene un número de copias conocido. El método más habitual para determinar el número de copias es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) basada en la plataforma estándar TaqMan (Applied Systems). Así pues, el número de copias puede referirse al promedio de secuencias del vector integradas que se detecta con la PCR cuantitativa en el ADN genómico aislado del producto de linfocitos T. El ADN genómico se puede aislar de los linfocitos T y amplificarse con un ensayo con cebadores o sondas específicos para el vector lentivírico y un gen de expresión constitutiva. Por ejemplo, la determinación de las copias con la qPCR puede servir para cuantificar los genomas en que se ha integrado el vector lentivírico en comparación con un gen de referencia endógeno (albúmina). La eficacia y la seguridad de los productos a base de linfocitos T se determinan mediante el promedio de copias. En general a mayor integración más expresión del transgén, aunque también aumenta el riesgo de mutagénesis por inserción. Las normas de la FDA fijan para los productos celulares un promedio de 5 copias o menos como especificación de seguridad. Por lo tanto, el número de copias se puede considerar como un parámetro crítico a la hora de determinar la potencia de un lote de vector lentivírico y la concentración volumétrica óptima para la fabricación clínica.
La concentración celular durante la transducción quedó fijada en aproximadamente 2 x 106 células/ml. En las figuras 1, 3 y 5 (líneas continuas) se observa que los linfocitos T primarios obtenidos de tres donantes sanos, los donantes 6, 7 y 9, que fueron transducidos con concentraciones volumétricas crecientes del lentivirus (LV)-R73, muestran un número creciente y comparable de copias integradas del LV-R73 en los lotes técnicos y de BPF que depende de la concentración volumétrica del LV-R73 (p. ej., dilución en serie 1:3 representada en escala logarítmica) por 1,0 ml de la mezcla de transducción, que puede contener alrededor de 2 x 106 células.
En cambio, como se evidencia en las figuras 2, 4 y 6 (líneas continuas), de los donantes n.° 6, 7 y 9 se obtuvieron diferencias significativas en el número de copias integradas del LV-R73 entre los lotes técnicos y de BPF, cuando el criterio son las multiplicidades de infección crecientes (MOI).
Esos resultados muestran que en función de las concentraciones volumétricas se obtiene un número comparable de copias integradas del vector lentivírico en los dos lotes de fabricación del vector LV-R73 (lote técnico y lote de BPF).
Expresión del transgén
La expresión del transgén concierne a la detección del TCR transgénico en la superficie de los linfocitos T mediante la citometría de flujo con un dextrámero-HLA específico. Los resultados aparecen expresados en forma del porcentaje de linfocitos dextrámero+ve del total de linfocitos CD3+CD8+ (% de Dex+).
Los linfocitos T transducidos con el LV-R73 se analizaron para determinar su unión a un dextrámero de MHC HLA-A2 con péptido. El dextrámero de MHC (Dex) puede contener un esqueleto polimérico de dextrano que incorpore un número optimizado de moléculas de MHC y de fluorocromo. Los reactivos a base de dextrámeros MHC llevan más moléculas de MHC y más fluorocromos que los multímeros MHC convencionales. Así se aumenta la afinidad por el linfocito T específico y se realza la intensidad de la tinción, lo cual aumenta la resolución y la relación señal-ruido (S/N). La tinción se hizo siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras se introdujeron en un citómetro MACS Quant Analyzer (Miltenyi) y los datos se analizaron con el software Flow Jo.
En las figuras 1, 3 y 5 (líneas discontinuas) se observan que los linfocitos T primarios obtenidos de tres donantes sanos, los donantes 6, 7 y 9, en ese orden, que habían sido transducidos con el LV-R73, muestran niveles crecientes y comparables de expresión (% de Dex+) del transgén, p. ej. del TCR R73, en los lotes a gran escala técnicos y de BPF, niveles que dependen de la concentración volumétrica del LV-R73 (p. ej., dilución en serie 1:3 en escala logarítmica) por 1,0 ml de la mezcla de transducción, que puede contener alrededor de 2 x 106 células.
En cambio, como se evidencia en las figuras 2, 4 y 6 (líneas discontinuas), cuando se comparan los porcentajes de linfocitos Dex+ del lote técnico y del lote de BPF en función de los valores de las multiplicidades de infección (MOI) determinadas a partir de los títulos virales, ambos lotes (los técnicos y los de BPF) difieren de forma significativa.
Esos resultados indican que mediante las concentraciones volumétricas se obtiene una expresión comparable del transgén (% de dextrámeros+ve entre los linfocitos CD3+CD8+) en los linfocitos T primarios procedentes de donantes sanos en dos lotes fabricados con el vector LV-R73 (lote técnico y lote de BPF).
Estos resultados indican que el método volumétrico puede ser más fiable que el método basado en las multiplicidades de infección (MOI), el cual depende de los títulos víricos determinados con p. ej. células HEK293T, a la hora comparar la potencia de distintos lotes del vector y de determinar el volumen óptimo de vector para la fabricación clínica de productos genéticamente modificados en las fases avanzadas de ensayo clínico que exigen el uso de más de un lote de vector.
Optimización de la concentración volumétrica del virus para la transducción de los linfocitos T
Después de la comparación en un intervalo amplio, que se muestra en las figuras 1 a 6, se seleccionan unas pocas concentraciones volumétricas para seguir la selección de los linfocitos T primarios obtenidos de varios donantes sanos. Con las concentraciones volumétricas seleccionadas, p. ej. 5 pl, 7,5 pl y 10 pl, se emprendió la fabricación de los linfocitos T a pequeña, mediana y gran escala.
La concentración celular durante la transducción quedó fijada en alrededor de 2 x 106 células/ml. Los linfocitos T primarios obtenidos de 10 donantes sanos se transdujeron con el LV-R73 aplicado en concentraciones volumétricas crecientes, p. ej., 5 pl, 7,5 pl y 10 pl de LV-R73 por 0,5 ml de mezcla de transducción, que puede contener aproximadamente 1 x 106 células. Como se ha descrito antes, a los 8 y 10 días de la transducción se determinó tanto el número de copias del vector vírico que se integraron, p. ej. del LV-R73, como la expresión del transgén.
En la Fig. 7 se observa que en promedio la expresión del transgén (%Dex+) aumenta en los linfocitos T transducidos de 10 donantes (cuadrados vacíos y llenos) en función de la concentración volumétrica aplicada. Es decir, 5 pl de LV-R73 por 0,5 ml de la mezcla de transducción dieron como resultado la cantidad promedio más baja de linfocitos T transducidos que expresaban el transgén, mientras que 10 pl de LV-R73 por 0,5 ml de mezcla de transducción propiciaron en promedio la cantidad más alta de linfocitos T transducidos que expresaban el transgén. Además, la cantidad promedio de linfocitos T transducidos que expresaron el transgén no varió de forma significativa desde el octavo hasta el décimo día posterior a la transducción con ninguna de las concentraciones volumétricas aplicadas.
En la Fig. 8 se observa que el promedio de copias integradas (n.° de copias) del vector vírico, p. ej., el LV-R73, hallado en los linfocitos T transducidos procedentes de 10 donantes (cuadrados vacíos y llenos) aumenta en función de la concentración volumétrica. Es decir, 5 pl del LV-R73 por 0,5 ml de la mezcla de transducción dan como resultado el promedio más bajo de copias integradas del vector vírico, en tanto que 10 pl del LV-R73 por 0,5 ml de la mezcla de transducción dan como resultado el promedio más alto de copias integradas del vector vírico. Sin embargo, el promedio de copias integradas desciende a partir del octavo posterior a la transducción hasta el décimo día con cada concentración volumétrica. Estos resultados indican que, si bien el promedio de copias integradas disminuye a los diez días de la transducción, el promedio de linfocitos T transducidos que expresan el transgén sigue siendo comparable al observado ocho días después de la transducción.
Tales resultados indican que la concentración volumétrica del virus que ofrezca sistemáticamente el máximo porcentaje de linfocitos con HLA-multímeros+ve en distintos donantes y escalas sin superar las cinco copias por célula puede ser elegida como la concentración volumétrica óptima del virus para la fabricación clínica.
En la Fig. 9 se expone un método (90) para la transducción de linfocitos T destinados a inmunoterapia acorde con una forma de realización de la presente descripción, método que incluye la obtención de linfocitos T de una pluralidad de donantes sanos (91), la activación de los linfocitos T con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (92), la transducción de los linfocitos T activados con un vector vírico inoculado en distintas concentraciones volumétricas (93), la expansión de los linfocitos T transducidos (94), p. ej., durante 4-6 días, la medición de la cantidad de linfocitos
T expandidos que expresan el transgén o del número de copias de este que se han integrado en los linfocitos T expandidos con las distintas concentraciones volumétricas (95), la determinación de la concentración volumétrica que brinda el promedio máximo de linfocitos T transducidos que expresan el transgén o el promedio máximo de copias integradas del transgén por célula en los linfocitos T expandidos procedentes de la pluralidad de donantes sanos (96), y la transducción de los linfocitos T obtenidos de un paciente con fines inmunoterapéuticos añadiendo el vector vírico en la concentración volumétrica determinada (97).
Entre las ventajas que pueden aportar los métodos de la presente descripción es que permiten definir con precisión la cantidad de vector lentivírico necesaria para la producción del producto a base de linfocitos T con el mismo proceso usado en la fabricación de ese producto de linfocitos T. Y dado que no existe relación entre el título del virus y la concentración volumétrica, el método basado en la concentración volumétrica resulta ventajoso con respecto al método basado en las multiplicidades de infección (MOI), que depende de los títulos víricos. Así pues, los métodos de la presente descripción pueden ser más robustos que los métodos convencionales que se basan en los títulos víricos determinados en estirpes celulares para obtener las multiplicidades de infección (MOI) óptimas y pueden reducir las variaciones cuando se precisan varios lotes de vector lentivírico para fabricar el mismo producto de linfocitos T
Claims (10)
1. Método para fabricar linfocitos T aptos para la inmunoterapia, el cual comprende:
(A1)La obtención de linfocitos T primarios de al menos un individuo sano
(A2)La activación de los linfocitos T obtenidos en la etapa (A1) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (A3)La transducción de los linfocitos T activados en la etapa (A2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x 108 células/ml y un vector retrovírico inoculado con distintas concentraciones volumétricas; a saber, volumen de la muestra de virus por volumen de la mezcla de transducción, en que el vector retrovírico porta un transgén
(A4)La expansión de los linfocitos T que han sido transducidos en la etapa (A3), y
(A5)La determinación de la concentración volumétrica del vector retrovírico que brinda en promedio la máxima cantidad de linfocitos T expandidos que expresan el transgén o en promedio el máximo número de copias integradas del transgén sin que se superen las cinco copias integradas por célula en los linfocitos T que ha sido expandidos en la etapa (A4),
y
(B1)La obtención de linfocitos T primarios de un paciente
(B2)La activación de los linfocitos T obtenidos en la etapa (B1) con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 (B3)La transducción de los linfocitos T activados en la etapa (B2) con una mezcla de transducción que comprende una concentración celular de 0,1 x 106 células/ml a 1,0 x 108 células/ml y el retrovirus usado en la etapa (A3) inoculado en la concentración volumétrica que se ha determinado en la etapa (A5)
(B4)La expansión de los linfocitos T primarios que han sido transducidos en la etapa (B3).
2. El método de la reivindicación 1, en que el vector retrovírico posibilita la expresión de un receptor de linfocito T (TCR).
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en que el vector retrovírico es un vector lentivírico que posibilita la expresión de un TCR.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que la mezcla de transducción comprende una concentración celular de aproximadamente 0,1 x106 células/ml a aproximadamente 1,0 x106 células/ml, de aproximadamente 0 ,5x106 células/ml a aproximadamente 1,0x106 células/ml, de aproximadamente 1,0x106 células/ml a aproximadamente 1,0 x 107 células/ml, de aproximadamente 5,0 x 106 células/ml a a aproximadamente I , 0 x 107 células/ml, de aproximadamente 1,0x107 células/ml a aproximadamente 1,0x108 células/ml, o de aproximadamente 5,0 x 107 células/ml a aproximadamente 1,0 x 108 células/ml.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que los linfocitos T de la etapa (A1) se obtienen de una pluralidad de individuos sanos.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que el paciente padece cáncer.
7. El método de la reivindicación 6, en que el cáncer se selecciona entre el grupo consistente en: carcinoma hepatocelular (CHC), carcinoma colorrectal (CRC), glioblastoma (GB), cáncer gástrico (CG), cáncer de esófago, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de páncreas (Cpc), carcinoma de células renales (CCR), hiperplasia benigna de próstata (HBP), cáncer de próstata (CPr), cáncer de ovario (CO), melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica (LLC), carcinoma de células de Merkel (CCM), cáncer de pulmón microcítico (CPM), linfoma no hodgkiniano (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), cáncer de vesícula biliar y colangiocarcinoma (CVB, CCC), cáncer de vejiga urinaria (CVU), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y cáncer de útero (CU).
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en que los linfocitos T obtenidos en la etapa (A1) y en la etapa (B1) son linfocitos T CD8+.
9. El método acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en que la expansión de las etapas (A4) y (B4) se efectúa en presencia de IL-7, lL-10, IL-12, IL-15 e IL-21, siempre que la activación no se haya efectuado solo en presencia de la IL-7.
10. El método acorde con la reivindicación 9, en que los linfocitos T transducidos muestran un fenotipo CD45RA+CCR7+ o CD45RA+CCR7+CD62L+ o CD45RO-CCR7+ o CD45RO-CCR7+CD62L+.
I I . El método acorde con la reivindicación 9, en que los linfocitos T transducidos muestran un fenotipo CD28+CD27+.
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