ES2916217T3 - Una proteína de fusión SIRP1 ALPHA-41BBL y métodos de uso de la misma - Google Patents

Una proteína de fusión SIRP1 ALPHA-41BBL y métodos de uso de la misma Download PDF

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Abstract

Una proteína de fusión SIRPα-4-1BBL estando caracterizado por: (i) un enlazador de un solo aminoácido entre dicho SIRPα y dicho 4-1BBL; y/o (ii) estar en forma de al menos un homotrímero.

Description

DESCRIPCIÓN
Una proteína de fusión SIRP1a-41 BBL y métodos de uso de la misma
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Proteínas de señalización dual (DSP), también conocidas como proteínas de conversión de señal (SCP), que actualmente se conocen en la técnica como proteínas de fusión bifuncionales que unen una parte extracelular de una proteína de membrana tipo I (terminal amino extracelular), a una parte extracelular de una proteína de membrana tipo II (terminal carboxilo extracelular), formando una proteína de fusión con dos lados activos (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 7,569,663 y 8,039,437).
SIRPa (proteína reguladora de la señal alfa) es un receptor de superficie celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas. SIRPa se expresa principalmente en la superficie de células inmunes del linaje de fagocitos como macrófagos y células dendríticas (DC). CD47 es el ligando de SIRPa. CD47 es una molécula de superficie celular en la superfamilia de las inmunoglobulinas. CD47 funciona como un inhibidor de la fagocitosis a través de la ligadura de SIRPa expresada en los fagocitos. CD47 se expresa ampliamente en la mayoría de los tejidos normales. De esta manera, CD47 sirve como una " señal de no me comas" y un marcador de uno mismo, ya que la pérdida de CD47 conduce a la fagocitosis homeostática de células envejecidas o dañadas. Se ha encontrado que CD47 se expresa en múltiples tipos de tumores humanos. Los tumores evaden la fagocitosis de los macrófagos a través de la expresión de señales antifagocíticas, incluyendo el CD47. Mientras que CD47 se expresa ubicuamente a niveles bajos en células normales, múltiples tumores expresan niveles elevados de CD47 en comparación con sus contrapartes de células normales y la sobreexpresión de CD47 permitió a los tumores escapar de la vigilancia del sistema inmunitario innato a través de la evasión de la fagocitosis.
4-1BBL es el ligando activador del receptor 4-1BB (CD137), un miembro de la superfamilia de receptores TNF y una potente molécula coestimuladora de células T inducida por activación. 4-1BBL forma naturalmente un homotrímero, pero la señalización a través de 4-1BB requiere una oligomerización significativa de 4-1BBL. 4-1BB está presente en una variedad de células presentadoras de antígenos (APC), incluyendo las células dendríticas (DC), las células B y los macrófagos. El receptor 4-1BB no se detecta (<3%) en las células T en reposo o en las líneas de células T; sin embargo, el 4-1BB se regula positivamente de manera estable cuando las células T se activan. La activación de 4-1BB regula al alza los genes de supervivencia, mejora la división celular, induce la producción de citoquinas y previene la destrucción celular inducida por la activación en las células T.
La técnica anterior adicional incluye:
Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO2017059168;
Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO2001/049318;
Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO2016/139668;
Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO2014/106839;
Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO2012/042480;
Publicación de solicitud de patente de EE. UU.No. 20150183881;
Publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US20070110746;
Publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US20070036783; y
Patente de EE. UU. No. US9562087.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL que comprende un enlazador de un solo aminoácido entre SIRPa y 4-1 BBL.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL en forma de al menos un homotrímero.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el al menos homotrímero tiene un peso molecular de al menos 140 kD según lo determinado por SDS-PAGE.
Según algunas realizaciones de la invención, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL comprende un enlazador entre SIRPa y 4-1 BBL.
Según algunas realizaciones de la invención, el enlazador tiene una longitud de uno a seis aminoácidos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el enlazador es un enlazador de un solo aminoácido. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el enlazador no es un dominio Fc de un anticuerpo o un fragmento del mismo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el enlazador es glicina.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL es soluble.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, SIRPa comprende un dominio extracelular de SIRPa o un fragmento funcional del mismo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el 4-1BBL comprende un dominio extracelular del 4-1BBL o un fragmento funcional del mismo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la proteína de fusión es capaz de al menos uno de:
(i) unir de CD47 y 4-1BB;
(ii) activar la vía de señalización de 4-1BB en una célula que expresa el 4-1BB;
(iii) coestimular las células inmunitarias que expresan el 4-1BB; y/o
(iv) potenciar la fagocitosis de células patológicas que expresan el CD47 por fagocitos en comparación con las mismas en ausencia de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL comprende SEQ ID NO: 1.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL consiste en la SEQ ID NO: 1.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la presente invención.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la presente invención y un elemento regulador para dirigir la expresión del polinucleótido en una célula huésped.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido comprende la SEQ ID NO: 8.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona una célula huésped que comprende la proteína de fusión SIRPa-41BBL de la presente invención o el polinucleótido o el constructo de ácido nucleico de la presente invención.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, se proporciona un método para producir una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, comprendiendo el método expresar en una célula huésped el polinucleótido o el constructo de ácido nucleico de la presente invención.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el método comprende aislar la proteína de fusión.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula se selecciona del grupo que consiste en CHO, PERC.6 y 293.
De acuerdo con algunos casos de la descripción, se proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la presente invención a un sujeto que la necesite. Indicaciones médicas, pero no métodos de tratamiento per se, se abarcan en la presente invención.
De acuerdo con algunos casos de la descripción, se proporciona un método para tratar una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de células inmunitarias que comprende administrar a un sujeto que lo necesite la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la presente invención, el polinucleótido o el ácido nucleico constructo de la presente invención o la célula huésped de cualquiera de la presente invención. Indicaciones médicas, pero no métodos de tratamiento per se, se abarcan en la presente invención.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un artículo de fabricación identificado para el tratamiento de una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de células inmunitarias que comprende un material de envasado que contiene un agente terapéuti
y una proteína de fusión SIRPa-41BBL, un polinucleótido que la codifica, un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa.
De acuerdo con la invención, dicha enfermedad se selecciona entre una enfermedad hiperproliferativa, una enfermedad asociada a la inmunosupresión o una infección.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad hiperproliferativa comprende esclerosis o fibrosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, esclerosis sistémica/esclerodermia, colangitis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, fibrosis hepática, prevención de fibrosis pulmonar inducida por radiación, mielofibrosis o fibrosis retroperitoneal.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad hiperproliferativa comprende cáncer.
De acuerdo con un aspecto de algunos ejemplos de la descripción, se proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un agente anticanceroso; y una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido que la codifica, un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa. Indicaciones médicas, pero no métodos de tratamiento per se, se abarcan en la presente invención.
El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en linfoma, leucemia, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón y carcinoma de células escamosas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las células del cáncer expresan CD47.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad comprende una enfermedad asociada con inmunosupresión o inmunosupresión inducida por medicación.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad comprende VIH, sarampión, influenza, LCCM, RSV, rinovirus humano, EBV, CMV o parvovirus.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la enfermedad comprende una infección.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las células enfermas del sujeto expresan CD47.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para activar células T, comprendiendo el método activar células T in vitro en presencia de una proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL y células que expresan CD47.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para activar fagocitos, comprendiendo el método activar fagocitos in vitro en presencia de una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL y células que expresan CD47.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para activar células inmunitarias, comprendiendo el método la activación in vitro de células inmunitarias en presencia de una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido que la codifica, un constructo de ácido nucleico constructoque codifica lo mismo o una célula huésped que lo expresa.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la activación se realiza en presencia de células que expresan CD47 o CD47 exógeno.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las células que expresan el CD47 comprenden células patológicas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las células patológicas comprenden células cancerosas. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, carcinoma y leucemia.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la activación se realiza en presencia de un agente anticancerígeno.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente anticanceroso comprende un anticuerpo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en rituximab, cetuximab, trastuzumab, edrecolomab, almetuzumab, gemtuzumab, ibritumomab, panitumumab, Belimumab, Bevacizumab, Bivatuzumab mertansine, Blinatumomab, Blontuvetmab, Brentuximab vedotin, Catumaxomab, Cixutumumab, Daclizumab, Adalimumab, Bezlotoxumab, Certolizumab pegol, Citatuzumab bogatox, Daratumumab, Dinutuximab, Elotuzumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Gemtuzumab ozogamicina, Girentuximab, Necitumumab, Obinutuzumab, Ofatumumab, Pertuzumab, Ramucirumab, Siltuximab, Tositumomab, ipilimumab y Trastuzumab. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en rituximab, cetuximab y alemtuzumab.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el método comprende transferir adoptivamente las células inmunitarias después de la activación a un sujeto que las necesite.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el sujeto padece una enfermedad asociada con las células que expresan el CD47.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL comprende la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la presente invención, el polinucleótido o el constructo de ácido nucleico comprende el polinucleótido o el constructo de ácido nucleico de la presente invención, y la célula huésped comprende la célula huésped de la presente invención.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las células inmunitarias comprenden células T.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las células inmunitarias comprenden fagocitos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de realizaciones de la invención, a continuación se describen métodos y/o materiales ilustrativos. En caso de conflicto, prevalecerá la especificación de la patente, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
Algunas realizaciones de la invención se describen aquí, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.
En los dibujos:
la FIG. 1 es una fotografía del análisis de transferencia Western de SIRPa-4-1 BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) bajo condiciones reductoras o no reductoras. Después de la purificación por afinidad, las proteínas (250 ng/pocillo) se separaron en gel SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes o no desnaturalizantes, como se indica, seguido de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-His-tag.
las Figs. 2A-B son fotografías de análisis de transferencia Western de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) bajo condiciones reductoras o no reductoras. Después de la purificación por afinidad, las proteínas (250 ng/pocillo) se separaron en gel SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes (FIG. 2A) o no desnaturalizantes (FIG. 2B), seguido de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-41BBL.
la FIG. 2C es una fotografía de la tinción con azul de Coomassie del análisis SDS-PAGE de SIRPa-4-1 BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) bajo condiciones reductoras tratadas o no tratadas con desglicosilasa. Las bandas SIRPa-4-1BBL marcadas con His están marcadas con pequeñas flechas negras.
las Figs. 3A-B son gráficos que demuestran la interacción de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) con sus ligandos homólogos, según lo determinado por el ensayo Blitz® de interferometría de biocapa. La FIG. 3A demuestra la unión a CD47 - el biosensor se cargó previamente con CD47:Fc y después se incubó con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) o PD1-CD70 (SEQ ID NO: 6, como control negativo). La FIG. 3B demuestra la unión a 4-1BB - el biosensor se cargó previamente con 4-1BB:Fc y después se incubó con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) o PD1-CD70 (SEQ ID NO: 6, como control negativo).
las Figs. 4A-B son histogramas que demuestran patrones de expresión de los receptores indicados en células CHO-K1-WT (FIG. 4A) y células CHO-KI-CD47 (FIG. 4B). Los niveles de expresión superficial de 4-1BB y CD47 se determinaron mediante inmunotinción de cada línea celular con los anticuerpos correspondientes, seguido de análisis de citometría de flujo.
las Figs. 5A-B demuestran la unión de la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) a células CHO-K1-47 (FIG. 5A) pero no a células CHO-K1-WT (FIG. 5B). Las células se incubaron con diferentes concentraciones de proteína SIRpa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) durante 30 minutos, seguido de inmunotinción con anticuerpo anti-41BBL y análisis de citometría de flujo. Los valores GMFI se usaron para crear un gráfico de curva vinculante con un software GraphPad Prism.
la FIG. 6 es un gráfico que demuestra que la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) promueve la señalización de TNFR como se demuestra mediante la secreción de IL-8 de células HT1080-4-1BB en medio que contiene FBS.
la FIG. 7 es un gráfico que demuestra que la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) promueve la señalización de TNFR como lo demuestra la secreción de IL-8 de células HT1080-4-1BB en medios sin suero.
las Figs. 8A-E demuestran que la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) desencadena la señalización coestimuladora de 41BB y potencia la activación de las células T. La FIG. 8A es un gráfico que demuestra la concentración de IL-8 en el sobrenadante de cultivos celulares HT1080-4-1BB y co-cultivos de células HT1080-4-1BB y CHO después del tratamiento con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 8B es un gráfico que demuestra la concentración de IL-8 en el sobrenadante de cultivos celulares HT1080-4-1BB y cocultivos de células HT1080-4-1BB y CHO-CD47 después del tratamiento con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 8C es un gráfico que demuestra la activación de las células T, evaluada por la expresión de CD25, en células T cultivadas durante 3 días en placas de 96 pocillos recubiertas con CD47:Fc y tratadas con una concentración subóptima de esferas anti-CD3/anti-CD38 y concentraciones crecientes de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5). Las figs. 8D-E muestran diagramas de puntos representativos (FIG. 8D) y un gráfico de resumen (media ± error estándar, se tomaron dos donantes independientes en dos experimentos independientes. Cada donante se analizó por triplicado. La FIG. 8E son diagramas de puntos que demuestran la activación de células T, según lo evaluado por la expresión de CD25, en cocultivos de células T aisladas de sangre periférica de voluntarios sanos mezcladas con células DLD-1 y tratadas durante 3 días con una concentración subóptima de microesferas anti-CD3/anti-CD28 con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5).
las Figs. 9A-C demuestran que SIRPa-4-1 BBL no tiene un efecto de destrucción directo sobre las células cancerosas MV4-11. La FIG. 9A es un histograma que demuestra la expresión de CD47 en la superficie de las células MV4-11, la FIG. 9B demuestra la unión de la proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ iD NO: 5) a células MV4-11. Las células se incubaron con bloqueador de Fc durante 15 minutos en hielo seguido de incubación con diferentes concentraciones de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) durante 30 minutos, inmunotinción con anticuerpo anti-4-1 BBL y análisis de citometría de flujo. La FIG. 9C es un gráfico que muestra que la incubación de células MV4-11 con diferentes concentraciones de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) donde hasta 72 horas no mostró ningún efecto de destrucción directo, según lo determinado por tinción con PI.
las Figs. 10A-B demuestran que SIRPa-4-1BBL promueve la secreción de INF-y a partir de PBMC humanas cebadas con anti-CD3. La FIG. 10A es un gráfico que demuestra la concentración de IFN-y detectada en el sobrenadante de cultivo de PBMC humanas incubadas durante 40 horas con diferentes concentraciones de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) en presencia de anti-CD3 o anti-CD3 más IL2, como se indica. La FIG. 10B es un gráfico que demuestra la concentración de IFN-y detectada en el sobrenadante de cultivo de PBMC humanas cocultivadas con células MV-4-11 de cáncer humano e incubadas durante 40 horas con diferentes concentraciones de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5), con o sin anti-CD3; y con o sin IL2, como se indica.
las Figs. 11A-L demuestran que SIRPa-4-1BBL potencia la fagocitosis mediada por granulocitos. La FIG. 11A muestra una estrategia de sincronización representativa del análisis de fagocitosis por citometría de flujo. La FIG.
11B es un gráfico que demuestra la fagocitosis de la línea celular BJAB de linfoma de células B por granulocitos después del tratamiento con las concentraciones indicadas de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11C es un gráfico que demuestra la fagocitosis de las líneas celulares de linfoma de células B indicadas por granulocitos obtenidos de 2-3 donantes individuales incubados con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11D es un gráfico que demuestra la fagocitosis de las líneas celulares de linfoma de células B indicadas por granulocitos después del tratamiento con rituximab con o sin proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11E es un gráfico que demuestra la fagocitosis de las líneas celulares de carcinoma indicadas por granulocitos obtenidos de 3-6 donantes individuales incubados con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11F es un gráfico que demuestra la fagocitosis de las líneas celulares de carcinoma indicadas por granulocitos después del tratamiento con cetuximab con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11G es un gráfico que demuestra la fagocitosis de las líneas celulares de leucemia mieloide indicadas por granulocitos obtenidos de 3 donantes individuales incubados durante 2 horas con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La La FIG. 11H es un gráfico que demuestra la fagocitosis de las líneas celulares de leucemia mieloide indicadas por granulocitos obtenidos de 3 donantes individuales incubados durante 24 horas con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11I es un gráfico que demuestra la fagocitosis de HL60 y MOLM13 por granulocitos después del tratamiento con las concentraciones indicadas de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG.
11J es un gráfico que demuestra la fagocitosis de células de leucemia mieloide aguda primaria por granulocitos después de 2 horas o 24 horas de tratamiento con las concentraciones indicadas de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11K es un gráfico que demuestra la fagocitosis (media ± error estándar) de células de leucemia mieloide aguda primaria por granulocitos alogénicos obtenidos de 5 donantes individuales después de 2 o 24 horas de incubación con o sin 2,5 pg/ml de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 11L muestra la fagocitosis de células cancerosas DLD1 por células polimorfonucleares tratadas durante 2 horas con SIRPa soluble, 4-1BBL soluble, combinación de ambos o proteína de fusión SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5).
las Figs. 12A-D demuestran que SIRPa-4-1BBL potencia la fagocitosis mediada por macrófagos. La FIG. 12A muestra imágenes microscópicas representativas de cocultivos de macrófagos y línea celular U2932 de linfoma de células B teñidas previamente V450 después de 2 horas de incubación con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) y con o sin el anticuerpo monoclonal rituximab (mAb). Los macrófagos adheridos son visibles en campo claro, y las células cancerosas marcadas con V450 son visibles como células brillantes. Las flechas oscuras indican células tumorales viables. Las flechas blancas indican células tumorales que han sido fagocitadas por macrófagos. La FIG. 12B es un gráfico que demuestra la fagocitosis mediada por macrófagos de células U2932 después del tratamiento con las concentraciones indicadas de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 12C es un gráfico que demuestra la fagocitosis mediada por macrófagos de células U2932 después del tratamiento con rituximab con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La FIG. 12D es un gráfico que demuestra la fagocitosis inducida por macrófagos (media ± error estándar) de leucemia linfocítica crónica maligna de células B primaria incubada con o sin proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) y con o sin alemtuzumab,
las Figs. 13A-B demuestran que el tratamiento de ratones inoculados con CT-26 con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) reduce el volumen del tumor. La Fig. 13A es una ilustración esquemática de las líneas de tiempo del experimento: los ratones fueron inoculados S.C. con 1 * 106 células CT-26 el día 0, se inyectaron control PBS, aPD1 o SIRPa-4-1BBL los días 3, 7 y 10. La FIG. 13B es un gráfico que demuestra el volumen tumoral medio ± error estándar en los tres grupos de tratamiento.
las Figs. 14A-B demuestran que la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) es eficaz para el tratamiento de ratones inoculados con tumor de leucemia singénica P388. La FIG. 14A es una ilustración esquemática de los plazos del experimento: los ratones se inocularon I.P. con 1 * 106 células P388 el día 0, se inyectaron control PBS, aPD1 o SIRPa-4-1BBL los días 1, 3, 5 y 7. La FIG. 14B es un gráfico que demuestra el peso del bazo en los tres grupos de tratamiento tras el sacrificio.
Las figuras 15A-C demuestran que la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) reduce la carga tumoral en la BM de ratones NSG inoculados con tumor de leucemia humana. La FIG. 15A es una ilustración esquemática de los plazos del experimento: los ratones se irradiaron 24 h antes de la inoculación de células MV4.11, trece (13) días después, los ratones se inocularon con PBMC humanas y el tratamiento comenzó 4 horas después. A 5 animales por grupo se les administraron inyecciones cada dos días (EOD) con cuatro inyecciones intraperitoneales de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (100 pg/inyección) o su tampón soluble (PBS) (en los días 13, 15, 17 y 19). Veinticuatro (24) horas después de la última inyección, se sacrificaron los ratones. La FIG. 15B muestra el número de células leucémicas en la BM según se determinó usando citometría de flujo. La FIG. 15C muestra el peso del bazo en mg.
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES DETAALLDAS DE LA INVENCIÓN
La invención reivindicada se refiere a una proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL y uso de la misma.
Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención, debe entenderse que la aplicación de la invención no está necesariamente limitada a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de varias maneras.
Las proteínas de señalización dual (DSP), también conocidas como proteínas de conversión de señal (SCP), que actualmente se conocen en la técnica como proteínas de fusión bifuncionales que unen una parte extracelular de una proteína de membrana tipo I (terminal amino extracelular), a una parte extracelular de una proteína de membrana tipo II (terminal carboxilo extracelular), forman una proteína de fusión con dos lados activos.
Sorprendentemente, se encontró que una proteína de fusión específica puede administrarse ventajosamente a sujetos que padecen enfermedades cancerosas, dependiendo de la presencia de tumores que tienen linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) en el microambiente del tumor, así como tumores con una expresión relativamente alta. de CD47 en las células tumorales o en el microambiente tumoral.
Como se ilustra a continuación y en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores han producido una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL marcada con his (SEQ ID NO: 5) y muestran que la proteína de fusión (SEQ ID NO: 5) contiene ambos dominios y producidos en forma de al menos trímeros (Experimentos 1A-B, Figs. 1 y 2A-C). A continuación, los presentes inventores demuestran que la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL marcada con his producida (SEQ ID NO: 5) retiene la actividad de unión funcional para sus receptores afines CD47 y 4-1BB (Experimentos 1C-D, FIGs. 3A-B, 4A-B y 5A-B) y puede desencadenar la coestimulación de 4-1BB y la activación de células que expresan 4-1BB (p. ej., células T, PBMC) en donde la presencia de CD47 aumenta esta actividad (Experimentos 2-3 y 3A-B, Figuras 6-7, 8A-E 9A-C y 10A-B). Además, los inventores demuestran que el SIRPa-4-1 BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) a través de su dominio SIRPa aumenta la captación fagocítica de varios tipos de células malignas, incluyendo las células malignas primarias, particularmente en el tratamiento combinado con varios anticuerpos monoclonales terapéuticos. actualmente en uso clínico (Experimento 4 FIGs. 11A-L y 12A-D). Los inventores demuestran además que la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL marcada con his (SEQ ID NO: 5) es eficaz para el tratamiento de tumores como se muestra en modelos in vivo de carcinoma de colon y leucemia en ratones (Experimentos 5 y 5A-C, FIGs. 13A-B, 14A-B y 15A-C).
En consecuencia, las presentes enseñanzas sugieren proteínas de fusión SIRPa-4-1BBL, polinucleótidos que las codifican y células huésped que las expresan; y usos de los mismos en p. ej., activar las células inmunitarias (a través de la coestimulación) en general y tratar enfermedades que pueden beneficiarse de la activación de las células inmunitarias (p. ej., cáncer) en particular.
Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL o cualquier variante o fragmento de la misma o una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, que es al menos aproximadamente 70% homologa a la secuencia como se establece en SEQ ID No. 4 opcionalmente con un enlazador entre ellas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL que comprende un enlazador de un solo aminoácido entre dicho SlRPa y dicho 4-1BBL.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL en forma de al menos un homotrímero.
De acuerdo con realizaciones específicas, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL está en forma de al menos un homotrímero, cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, el al menos homotrímero comprende un homotrímero.
De acuerdo con realizaciones específicas, el al menos homotrímero comprende un homotetrámero.
De acuerdo con realizaciones específicas, el al menos homotrímero comprende un homopentámero.
De acuerdo con realizaciones específicas, el al menos homotrímero comprende un homohexámero.
Los métodos para determinar la trimerización son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, SDS-PAGE, NATIVE-PAGE, SEC-HPLC, geles 2D, filtración en gel, SEC MALLS, ultracentrifugación analítica (AUC), espectrometría de masas (MS), electroforesis en gel capilar (CGE).
De acuerdo con realizaciones específicas, el al menos homotrímero tiene un peso molecular de al menos 140 kD, al menos 160 kD, al menos 180 kD, al menos 200 kD, al menos 220 kD, al menos 240 kD determinado por SDS-PAGE. De acuerdo con realizaciones específicas, el al menos homotrímero tiene un peso molecular de al menos 140 kD según lo determinado por SDS-PAGE.
De acuerdo con realizaciones específicas, el al menos homotrímero tiene un peso molecular de al menos 200 kD según lo determinado por SDS-PAGE.
Como se usa en el presente documento, el término "SIRPa (proteína alfa reguladora de la señal, también conocida como CD172a)" se refiere al polipéptido del gen SIRPA (Gen ID 140885) o un homólogo funcional, p. ej., un fragmento funcional del mismo. De acuerdo con realizaciones específicas, el término "SIRPa" se refiere a un homólogo funcional del polipéptido SIRPa. Según realizaciones específicas, SIRPa es SIRPa humana. De acuerdo con una realización específica, la proteína SIRPa se refiere a la proteína humana, tal como se proporciona en el siguiente número de GenBank NP_001035111, NP_001035112, NP_001317657 o NP_542970.
Como se usa en el presente documento, un "SIRPa funcional" es capaz de unirse a su receptor CD47 afín [también conocido como proteína asociada a integrina (IAP)].
Como se usa en el presente documento, la frase "homólogo funcional" o "fragmento funcional" cuando se relaciona con SIRPa, se refiere a una parte del polipéptido que mantiene la actividad del SIRPa de longitud completa, p. ej., unión a CD47.
De acuerdo con una realización específica, la proteína CD47 se refiere a la proteína humana, tal como se proporciona en los siguientes números de GenBank NP_001768 o NP_942088.
Los ensayos para probar la unión son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, citometría de flujo, BiaCore, ensayo Blitz® de interferometría de biocapa, HPLC.
De acuerdo con realizaciones específicas, SIRPa se une a CD47 con una Kd de 0,1 — 100 pM, 0,1 — 10 pM, 1-10 pM, 0,1-5 pM o 1-2 pM según lo determinado por SPR, cada posibilidad representó una realización separada de la presente invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, la SIRPa comprende un dominio extracelular de dicha SIRPa o un fragmento funcional del mismo.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa comprende SEQ ID NO: 9.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa consiste en la SEQ ID NO: 9. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de SIRPa comprende SEQ ID NO: 10.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de SIRPa consiste en laSEQ ID NO: 10. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa comprende SEQ ID NO: 2.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa consiste en laSEQ ID NO: 2. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de SIRPa comprende SEQ ID NO: 11. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de SIRPa consiste en laSEQ ID NO: 11. El término "SIRPa" también abarca homólogos funcionales (de origen natural o producidos de forma sintética/recombinante), que presentan la actividad deseada (es decir, unión a CD47). Tales homólogos pueden ser, por ejemplo, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idénticos u homólogos al polipéptido SEQ ID NO: 2 o 9; o al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87% , al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97% , al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de polinucleótidos que codifica la misma (como se describe más adelante en el presente documento).
La identidad u homología de secuencia se puede determinar utilizando cualquier algoritmo de alineación de secuencia de proteína o ácido nucleico como Blast, ClustalW y MUSCLE.
El homólogo también puede referirse a un ortólogo, una variante de deleción, inserción o sustitución, incluida una sustitución de aminoácido, como se describe más adelante en el presente documento.
De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido SIRPa puede comprender sustituciones conservativas de aminoácidos como se describe más adelante en el presente documento.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa comprende 100-500 aminoácidos, 150-450 aminoácidos, 200-400 aminoácidos, 250-400 aminoácidos, 300-400 aminoácidos, 320-420 aminoácidos, 340­ 350 aminoácidos ácidos, cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa tiene una longitud de 300-400 aminoácidos.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa tiene una longitud de 340-450 aminoácidos.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa tiene una longitud de 343 aminoácidos.
Como se usa aquí, el término "4-1BBL (también conocido como CD137L y TNFSF9)" se refiere al polipéptido del gen TNFSF9 (Gen ID 8744) o un homólogo funcional, p. ej., un fragmento funcional del mismo. De acuerdo con realizaciones específicas, el término "4-1BBL" se refiere a un homólogo funcional del polipéptido 4-1BBL. Según realizaciones específicas, 4-1BBL es 4-1BBL humano. De acuerdo con una realización específica, la proteína 4-1BBL se refiere a la proteína humana, tal como se proporciona en el siguiente número de GenBank NP_003802.
De acuerdo con realizaciones específicas, el 4-1BBL comprende un dominio extracelular de dicho 4-1BBL o un fragmento funcional del mismo.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de 4-1BBL comprende SEQ ID NO: 12. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de 4-1BBL consiste en la SEQ ID NO: 12. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de 4-1BBL comprende SEQ ID NO: 13. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de 4-1BBL consiste en laSEQ ID NO: 13. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de 4-1BBL comprende SEQ ID NO: 3. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de 4-1BBL consiste en laSEQ ID NO: 3. De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico 4-1BBL comprende SEQ ID NO: 14.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de ácido nucleico de 4-1BBL consiste en laSEQ ID NO: 14.
El término "4-1BBL" también abarca homólogos funcionales (de origen natural o producidos de forma sintética/recombinante), que presentan la actividad deseada (como se define a continuación). Dichos homólogos pueden ser, por ejemplo, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idénticos u homólogos al polipéptido SEQ ID NO: 3, 12; o al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87% , al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97% , al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de polinucleótidos que codifica la misma (como se describe más adelante en el presente documento).
De acuerdo con realizaciones específicas, el polipéptido 4-1BBL puede comprender sustituciones de aminoácidos conservadoras, como se describe más adelante en el presente documento.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos 4-1BBL comprende 100-300 aminoácidos, 150-250 aminoácidos, 100-250 aminoácidos, 150-220 aminoácidos, 180-220 aminoácidos, 190-210 aminoácidos, cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de 4-1BBL tiene una longitud de 190-210 aminoácidos.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de 4-1BBL tiene una longitud de 204 aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, un "4-1BBL funcional" es capaz de al menos uno de:
(i) unirse a su receptor 4-1BB afín (también conocido como CD137),
(ii) activar la vía de señalización de 4-1BB en una célula inmunitaria que expresa 4-1BB; y/o
(iii) activar las células inmunitarias que expresan dicho 4-1BB.
De acuerdo con realizaciones específicas, el 4-1BBL funcional es capaz de (i), (ii), (iii), (i)+(ii), (i)+(iii), (ii)+(iii).
De acuerdo con realizaciones específicas, el 4-1BBL funcional es capaz de (i)+(ii)+(iii).
Como se usa en el presente documento, la frase "homólogo funcional" o "fragmento funcional" cuando se relaciona con 4-1BBL, se refiere a una parte del polipéptido que mantiene la actividad del 4-1BBL de longitud completa, p. ej., uniendo 4-1BB, activando la vía de señalización de 4-1BB, activando células inmunitarias que expresan 4-1BB.
De acuerdo con una realización específica, la proteína 4-1BB se refiere a la proteína humana, tal como se proporciona en el siguiente número de GenBank NP_001552.
Los ensayos para probar la unión son bien conocidos en la técnica y se describen con más detalle anteriormente.
De acuerdo con realizaciones específicas, el 4-1BBL se une a 4-1BB con una Kd de aproximadamente 0,1 - 1000 nM, 0,1 - 100 nM, 1-100 nM o 55,2 nM según lo determinado por SPR, cada posibilidad representa una realización separada de la invención reivindicada.
Como se usa en el presente documento, los términos "activar" o "activación" se refieren al proceso de estimulación de una célula inmunitaria (p. ej., célula T, célula B, célula NK, célula fagocítica) que da como resultado la proliferación celular, maduración, producción de citocinas, fagocitosis y/o inducción de funciones reguladoras o efectoras.
De acuerdo con realizaciones específicas, la activación comprende la coestimulación.
Como se usa en el presente documento, el término "coestimular" o "coestimulación" se refiere a la transmisión de una señal estimuladora independiente del antígeno secundario (p. ej., señal 4-1BB) que da como resultado la activación de la célula inmunitaria.
De acuerdo con realizaciones específicas, la activación comprende la supresión de una señal inhibidora (p. ej., la señal de CD47) que da como resultado la activación de la célula inmunitaria.
Los métodos para determinar la señalización de una señal estimuladora o inhibidora son bien conocidos en la técnica y también se describen en la sección de Ejemplos que sigue, e incluyen, pero no se limitan a, ensayo de unión usando, p. ej., BiaCore, HPLC o citometría de flujo, ensayos de actividad enzimática tales como ensayos de actividad de quinasa y expresión de moléculas involucradas en la cascada de señalización usando p. ej., p Cr , transferencia de Western, inmunoprecipitación e inmunohistoquímica. Adicional o alternativamente, la determinación de la transmisión de una señal (coestimuladora o inhibidora) puede efectuarse evaluando la activación o función de las células inmunitarias. Los métodos para evaluar la activación o la función de las células inmunitarias son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a , ensayos de proliferación como tinción con CFSE, MTS, azul Alamar, BRDU e incorporación de timidina, ensayos de citotoxicidad como tinción con CFSE, liberación de cromo, Calcina AM, ensayos de secreción de citocinas como tinción de citocinas intracelulares, ELISPOT y ELISA, expresión de marcadores de activación como CD25, CD69, CD137, CD107a, PD1 y CD62L usando citometría de flujo.
De acuerdo con casos específicos, la determinación de la actividad de señalización o activación se efectúa in vitro o ex vivo, p. ej., una reacción mixta de linfocitos (MLR), como se describe más adelante en el presente documento.
Para las mismas condiciones de cultivo, la actividad de señalización o la activación o función de las células inmunitarias generalmente se expresan en comparación con la señalización, activación o función en una célula de la misma especie, pero no en contacto con la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido que codifica mismo o una célula huésped que codifica el mismo; o contactado con un control de vehículo, también denominado control.
Los términos "DSP" y "proteína de fusión", "proteína quimérica" o "quimera" se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a una secuencia de aminoácidos que tiene dos o más partes que no se encuentran juntas en una sola secuencia de aminoácidos en la naturaleza.
En una realización, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una SIRPa-4-1BBL (en adelante, proteína de fusión SIRPa-4-1BBL) o cualquier variante o fragmento de la misma, opcionalmente con un enlazador entre ellas.
SIRPa-4-1BBL es una proteína quimera de proteína de señalización dual (DSP) que fusiona los dominios extracelulares de dos proteínas de membrana humana diferentes. El dominio N terminal es el dominio extracelular de la SIRPa humana (gen: SIRPA), que es una proteína de membrana tipo 1, y el dominio C terminal de la quimera es el dominio extracelular de la 4-1BBL humana (gen: 4-1BBL), que es una proteína de membrana tipo 2.
De acuerdo con realizaciones específicas, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL es soluble (es decir, no está inmovilizada en una superficie sintética o natural).
De acuerdo con realizaciones específicas, la proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL se inmoviliza en una superficie sintética o natural.
De acuerdo con realizaciones específicas, SIRPa-4-1BBL no comprende un enlazador entre SIRPa y 4-1BBL.
En alguna realización, el SIRPa-4-1 BBL comprende un enlazador que puede tener cualquier longitud.
Por tanto, según realizaciones específicas, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL comprende un enlazador entre dicho SIRPa y dicho 4-1BBL.
Puede usarse cualquier enlazador conocido en la técnica con realizaciones específicas de la invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, el enlazador puede derivar de proteínas multidominio naturales o es un enlazador empírico como se describe, por ejemplo, en Chichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2): 153-167, Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369. En algunas realizaciones, el enlazador puede diseñarse utilizando bases de datos de diseño de enlazadores y programas informáticos como los descritos en Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369 y Crasto et al (2000), Protein Eng. 13(5):309-312.
De acuerdo con realizaciones específicas, el enlazador es un enlazador sintético tal como PEG.
De acuerdo con realizaciones específicas, el enlazador es un dominio Fc o la región bisagra de un anticuerpo (p. ej., de IgG, IgA, IgD o IgE) o un fragmento del mismo.
De acuerdo con otras realizaciones específicas, el enlazador no es un dominio Fc o una región bisagra de un anticuerpo o un fragmento del mismo.
De acuerdo con realizaciones específicas, el enlazador puede ser funcional. Por ejemplo, sin limitación, el enlazador puede funcionar para mejorar el plegamiento y/o la estabilidad, mejorar la expresión, mejorar la farmacocinética y/o mejorar la bioactividad de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL. En otro ejemplo, el enlazador puede funcionar para dirigir la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL a un tipo de célula o ubicación en particular.
Según realizaciones específicas, el enlazador es un polipéptido.
En algunas realizaciones, SIRPa-4-1 BBL comprende un enlazador con una longitud de uno a seis aminoácidos.
De acuerdo con realizaciones específicas, el enlazador está compuesto sustancialmente por residuos de glicina y/o serina (p. ej., aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80% o aproximadamente 90%, o aproximadamente 95%, o aproximadamente 97% o 100% de glicinas y serinas).
De acuerdo con realizaciones específicas, el enlazador es un enlazador de un solo aminoácido.
En algunas realizaciones de la invención, el aminoácido que une SIRPa y 4-1BBL es la glicina, también referida en el presente documento proteína de fusión SIRPa-G-4-1 BBL.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL comprende SEQ ID NO: 1.
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL consiste en la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el término "proteína de fusión SIRPa-G-4-1BBL" se refiere a una proteína identificada por SEQ ID NO. 1:
Secuencia de aminoácidos de la proteína quimera (SIRPa-G-4-1BBL):
EEELQ VIOPDKS VLV AAGET ATLRCTATSLIPV GPIOWFRGAGPGRELIYN OKEGHF PR VTT V S DLTKRNNMDFSIRIGNITP AD AGT Y Y C VKFRKGS PDD VEFKS G AGTELS VRAK PS AP V V S GP A AR ATPQHTV S FTCES HGFS PRDITLKWFKN GNELS DF OTN VDP V GES VS Y
S1HSTAKVVLTREDVHSOVICEVAHVTLOGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTOOPVRAEN OVNVTCOVRKFYPORLOLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHR DDVKLTCOVEHDGOPAVSKSHDLKVSAHPKEOGSNTAAENTGSNERNIYGACPW AVSG ARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPG LAGVSLTGGLSYKEDTKELYVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHA WQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
El dominio extracelular de la proteína SIRPa humana está subrayado, es decir,
EEELQVIQPDKS VLV AAGETATLRCT ATS LIPV GPIQWFRGAGPGRELIYN QKEGHFPRVT TVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAP VVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSfflST AKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNV TCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVK LTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIY (SEQ ID NO. 2) El dominio extracelular del 4-1BBL humano está en negrita, es decir ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLID GPLS W YS DPGLAG VSLT GGLS YKEDTKELV V AKAG V Y Y VFF QLELRRV V AGEGSGSVSL ALHLQPLRS A AGA A ALALT VDLPP AS S E ARN S AFGFQGRLLHLS AGQRLG VHLHTE ARA RHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE (SEQ ID NO. 3)
De acuerdo con realizaciones específicas, la secuencia de aminoácidos de SIRPa-G-4-1BBL es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID No. 1 o a la secuencia de polinucleótidos que codifica la misma.
En algunas realizaciones, se proporciona una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, que es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homóloga a la secuencia tal como se establece en SEQ ID No. 4 opcionalmente con un enlazador entre el péptido SIRPa o el ECD del mismo y el péptido 4-1BBL o el ECD del mismo, donde la SEQ ID No. 4 es:
EEELQ VIOPDKS VLV AAGET ATLRCTATSLIPV GPIOWFRGAGPGRELIYNOKEGHF PR VTT V S DLTKRNNMDFSIRIGNITP AD AGT Y Y C VKFRKGS PDD VEFKS G AGTELS VRAK PSAPVVSGPAARATPOHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSY
S1HS T AKV VFTRED VHS O VICE V AH VTLO GDPFRGT ANFS ETIR VPPTFE VTOOP VR AEN OVNVTCQYRKFYPORLOLTWLENGNYSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHR DDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIYACPW AVSGA RASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGL AGYSLTGGLSYKEDTKELYVAKAGYYYYFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
En algunas realizaciones, se proporciona un SIRPa-4-1BBL tal como se establece en SEQ ID No. 4 opcionalmente con un enlazador entre el péptido SIRPa o el ECD del mismo y el péptido 4-1BBL o el ECD del mismo, donde SEQ ID No. 4 es:
EEELQ VIOPDKS VLV AAGET ATLRCTATSLIPV GPIOWFRGAGPGRELIYNOKEGHF PR VTT V S DLTKRNNMDFS IRIGNITP AD AGT Y Y C VKFRKGS PDD VEFKS G AGTELS VRAK PSAPVVSGPAARATPOHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFOTNVDPVGESVSY
S1HS T AKV VLTRED VHS O VICE V AH VTLO GDPLRGT ANLS ETIR VPPTLE VT OOP VR AEN OVNVTCOVRKFYPORLOLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHR DDVKLTCOVEHDGOPAVSKSHDLKVSAHPKEOGSNTAAENTGSNERNIYACPW AVSGA RASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGL AGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW QLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
En realizaciones adicionales, la proteína de fusión SIRPa-G-4-1BBL puede ser una variante y/o un derivado de la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO. 1. Se conocen en la técnica varias de tales variantes, véase, por ejemplo, en Weiskopf et al, 2013; Young Won, et al, 2010 y Rabu, et al, 2005.
De acuerdo con realizaciones específicas, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL es capaz de al menos uno de:
(i) unir CD47 y 4-1BB,
(ii) activar la vía de señalización de 4-1BB en una célula inmunitaria (p. ej., célula T) que expresa 4-1BB;
(iii) activar células inmunitarias (p. ej., células T) que expresan dicho 4-1 BB; y/o
(iv) potenciar la fagocitosis de células patológicas que expresan CD47 por fagocitos en comparación con las mismas en ausencia de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL.
De acuerdo con realizaciones específicas, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL es capaz de (i), (ii), (iii), (iv), (i)+(ii), (i)+(iii), (i)+(iv), (ii)+(iii), (ii)+(iv), (i)+(ii)+(iii), (i)+(ii)+(iv), (ii)+ (iii)+(iv).
De acuerdo con realizaciones específicas, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL es capaz de (i)+(ii)+(iii)+(iv).
Los métodos para determinar la unión, activar la vía de señalización de 4-1BB y activar las células inmunitarias son bien conocidos en la técnica y se describen más adelante y más adelante en el presente documento y en la sección de Ejemplos que sigue.
De acuerdo con realizaciones específicas, la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL potencia la fagocitosis de células patológicas que expresan CD47 por fagocitos.
Los métodos para analizar la fagocitosis son bien conocidos en la técnica y también se describen en el Experimento 4 en la sección de Ejemplos que sigue; e incluyen, por ejemplo, ensayos de destrucción, citometría de flujo y/o evaluación microscópica (imágenes de células vivas, microscopía fluorescente, microscopía confocal, microscopía electrónica).
De acuerdo con realizaciones específicas, la mejora en la fagocitosis es al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces en comparación con la misma en ausencia de proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, el polinucleótido o el constructo de ácido nucleico que la codifica o la célula huésped que la expresa de la presente invención, según lo determinado, p. ej., por citometría de flujo o evaluación microscópica.
De acuerdo con otras realizaciones específicas, el aumento de la supervivencia es de al menos un 5%, de al menos un 10%, de al menos un 20%, de al menos un 30%, de al menos un 40%, de al menos un 50%, de al menos un 60%, de al menos un 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100% en comparación con la misma en ausencia de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, el polinucleótido o el constructo de ácido nucleico que la codifica o el huésped célula que expresa la misma de la presente invención, según lo determinado, p. ej., por citometría de flujo o evaluación microscópica.
Como las composiciones de algunas realizaciones de la presente invención (p. ej., la proteína de fusión, un polinucleótido o ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa) son capaces de activar las células inmunitarias, pueden usarse en el método de activación de las células inmunitarias, in vitro, ex-vivo y/o in-vivo.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para activar células inmunitarias, comprendiendo el método la activación in vitro o ex vivo de células inmunitarias en presencia de una proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL, un polinucleótido que codifica mismo, un constructo de ácido nucleico que lo codifica o una célula huésped que expresa la misma.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para activar células T, método que comprende activar células T in vitro o ex vivo en presencia de una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL y células que expresan CD47.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para activar fagocitos, comprendiendo el método activar fagocitos in vitro en presencia de una proteína de fusión SlRPa-4-1BBL y células que expresan CD47.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias expresan 4-1BB.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC).
Como se usa en el presente documento, el término "células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC)" se refiere a una célula sanguínea que tiene un solo núcleo e incluye linfocitos, monocitos y células dendríticas (DC).
De acuerdo con realizaciones específicas, las PBMC se seleccionan del grupo que consiste en células dendríticas (DC), células T, células B, células NK y células NKT.
De acuerdo con realizaciones específicas, las PBMC comprenden células T, células B, células NK y células NKT.
Los métodos para obtener PBMC son bien conocidos en la técnica, tales como la extracción de sangre completa de un sujeto y la recolección en un recipiente que contiene un anticoagulante (p. ej., heparina o citrato); y aféresis. A continuación, de acuerdo con casos específicos, al menos un tipo de PBMC se purifica de la sangre periférica. Hay varios métodos y reactivos conocidos por los expertos en la técnica para purificar PBMC de sangre total, tales como leucoféresis, sedimentación, centrifugación en gradiente de densidad (p. ej., ficoll), elutriación centrífuga, fraccionamiento, lisis química de, p. ej., glóbulos rojos (p. ej., mediante ACK), selección de tipos de células específicos mediante marcadores de superficie celular (utilizando, p. ej., clasificador FACS o técnicas de separación de células magnéticas, tales como las disponibles comercialmente, p. ej., de Invitrogen, Stemcell Technologies, Cellpro, Advanced Magnetics o Miltenyi Biotec.) y agotamiento de tipos de células específicos mediante métodos tal como la erradicación (por ejemplo, destrucción) con anticuerpos específicos o por purificación basada en afinidad basada en selección negativa (utilizando, p. ej., técnicas de separación celular magnética, clasificador FACS y/o marcaje ELISA de captura). Tales métodos se describen, por ejemplo, en THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor) and FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000). De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden linfocitos que se infiltran en el tumor.
Como se usa en el presente documento, el término "linfocitos infiltrantes de tumor (TIL)" se refiere a glóbulos blancos mononucleares que han llegado al torrente sanguíneo y migrado a un tumor.
De acuerdo con realizaciones específicas, los TIL se seleccionan del grupo que consiste en células T, células B, células NK y monocitos.
Los métodos para obtener TIL son bien conocidos en la técnica, tal como la obtención de muestras de tumores de un sujeto, p. ej., biopsia o necropsia y preparar una suspensión de células individuales de las mismas. La suspensión de células individuales se puede obtener de cualquier manera adecuada, p. ej., mecánicamente (desagregando el tumor usando, p. ej., un disociador GentleMACS™, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.) o enzimáticamente (p. ej., colagenasa o ADNasa). A continuación, al menos un tipo de TIL puede purificarse a partir de la suspensión celular. Hay varios métodos y reactivos conocidos por los expertos en la técnica para purificar el tipo deseado de TIL, tal como la selección de tipos de células específicos usando marcadores de superficie celular (usando, p. ej., clasificador FACS o técnicas de separación de células magnéticas como las que están disponibles comercialmente, p. ej., de Invitrogen , Stemcell Technologies, Cellpro, Advanced Magnetics o Miltenyi Biotec.), y el agotamiento de tipos de células específicos mediante métodos como la erradicación (p. ej., destrucción) con anticuerpos específicos o mediante purificación basada en la afinidad basada en la selección negativa (utilizando, p. ej., técnicas de separación de células magnéticas, clasificador FACS y/o marcaje ELISA de captura). Tales métodos se describen, por ejemplo, en THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor) and FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000). De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden fagocitos.
Como se usa en el presente documento, el término "fagocitos" se refiere a una célula que es capaz de fagocitosis e incluye fagocitos tanto profesionales como no profesionales. Los métodos para analizar la fagocitosis son bien conocidos en la técnica y se describen más adelante y más adelante. De acuerdo con casos específicos, las células fagocíticas se seleccionan del grupo que consiste en monocitos, células dendríticas (DC) y granulocitos.
De acuerdo con realizaciones específicas, los fagocitos comprenden granulocitos.
De acuerdo con realizaciones específicas, los fagocitos comprenden monocitos.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden monocitos.
De acuerdo con realizaciones específicas, el término "monocitos" se refiere tanto a los monocitos circulantes como a los macrófagos (también denominados fagocitos mononucleares) presentes en un tejido.
De acuerdo con realizaciones específicas, los monocitos comprenden macrófagos. Normalmente, el fenotipo de la superficie celular de los macrófagos incluye CD14, CD40, CD11b, CD64, F4/80 (ratones)/EMR1 (humano), lisozima M, MAC-1/MAC-3 y CD68.
Según realizaciones específicas, los monocitos comprenden monocitos circulantes. Normalmente, los fenotipos de la superficie celular de los monocitos circulantes incluyen CD14 y CD16 (p. ej., CD14++ CD16-, CD14+CD16++, CD14++CD16+).
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden DC
Como se usa en el presente documento, el término "células dendríticas (DC)" se refiere a cualquier miembro de una población diversa de tipos de células morfológicamente similares que se encuentran en tejidos linfoides o no linfoides. Las DC son una clase de células presentadoras de antígenos profesionales y tienen una alta capacidad para sensibilizar las células T restringidas por HLA. Las CD incluyen, por ejemplo, células dendríticas plasmocitoides, células dendríticas mieloides (incluyendo células dendríticas inmaduras y maduras), células de Langerhans, células interdigitadas, células dendríticas foliculares. Las células dendríticas pueden reconocerse por su función o por su fenotipo, particularmente por el fenotipo de la superficie celular. Estas células se caracterizan por su morfología distintiva que tiene proyecciones en forma de velo en la superficie celular, niveles intermedios a altos de expresión de HLA clase II en la superficie y la capacidad de presentar antígenos a las células T, particularmente a las células T vírgenes (véase Steinman R, et al., Ann. Rev. Inmunol. 1991; 9:271-196.). Típicamente, el fenotipo de la superficie celular de las DC incluye CDla+, CD4+, CD86+ o HLA-DR. El término DC abarca tanto las DC inmaduras como las maduras.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden granulocitos.
Como se usa en el presente documento, el término "granulocitos" se refiere a leucocitos polimorfonucleares caracterizados por la presencia de gránulos en su citoplasma.
De acuerdo con realizaciones específicas, los granulocitos comprenden neutrófilos.
De acuerdo con realizaciones específicas, los granulocitos comprenden mastocitos.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden células T.
Como se usa en el presente documento, el término "células T" se refiere a un linfocito diferenciado con un receptor de células T CD3+ (TCR)+ que tiene un fenotipo CD4+ o CD8+. La célula T puede ser una célula T efectora o reguladora.
Como se usa en el presente documento, el término "células T efectoras" se refiere a una célula T que activa o dirige a otras células inmunitarias, p. mediante la producción de citocinas o tiene una actividad citotóxica, por ejemplo, linfocitos T citotóxicos CD4+, Th1/Th2, CD8+.
Como se usa en el presente documento, el término "célula T reguladora" o "Treg" se refiere a una célula T que regula negativamente la activación de otras células T, incluyendo las células T efectoras, así como células del sistema inmunitario innato. Las células Treg se caracterizan por la supresión sostenida de las respuestas de las células T efectoras. Según una realización específica, la Treg es una célula T CD4+CD25+Foxp3+.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células T son células T CD4+.
De acuerdo con otras realizaciones específicas, las células T son células T CD8+.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células T son células T de memoria. Los ejemplos no limitantes de células T de memoria incluyen células T CD4+ de memoria efectora con un fenotipo CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7-, células T CD4+ de memoria central con un fenotipo CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7+, células T CD8+ de memoria efectora con un fenotipo CD3+/CD8+ CD45RA-/CCR7- y células T CD8+ de memoria central con un fenotipo CD3+/CD8+ CD45RA-/CCR7+.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células T comprenden células T manipuladas transducidas con una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto de expresión de interés.
Según realizaciones específicas, el producto de expresión de interés es un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
Como se usa en el presente documento, la frase "transducido con una secuencia de ácido nucleico que codifica un TCR" o "transducido con una secuencia de ácido nucleico que codifica un TCR" se refiere a la clonación de variables a- y ^-cadenas de células T con especificidad contra un antígeno deseado presentado en el contexto de MHC. Los métodos de transducción con un TCR son conocidos en la técnica y se describen, p. ej., en Nicholson et al. Adv Hematol. 2012; 2012:404081; Wang y Riviére Cancer Gene Ther. 2015 marzo;22(2):85-94); y Lamers et al, Cancer Gene Therapy (2002) 9, 613-623.
Como se usa en el presente documento, la frase "transducido con una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR" o "transducido con una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR" se refiere a la clonación de una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en donde el CAR comprende un resto de reconocimiento de antígeno y un resto de activación de células T. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo (p. ej., un fragmento variable de cadena única [scFv]) vinculado a la señalización de células T o dominios de activación de células T. Los métodos de transducción con un CAR son conocidos en la técnica y se describen, p. ej., en Davila et al. Oncoimmunology. 1 de diciembre 2012; 1 (9): 1577-1583; Wang y Riviére Cancer Gene Ther. Marzo 2015;22(2):85-94); Maus et al. Blood. 24 de abril 2014; 123 (17): 2625-35; Porter DL The New England journal of medicine. 2011, 365(8):725-733; Jackson HJ, Nat. Rev. Clin Oncol. 2016;13(6):370-383; y Globerson-Levin et al. Mol Ther. 2014;22(5):1029-1038.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden células B.
Como se usa en el presente documento, el término "células B" se refiere a un linfocito con un fenotipo receptor de células B (BCR)+, CD19+ y/o B220+. Las células B se caracterizan por su capacidad para unirse a un antígeno específico y provocar una respuesta humoral.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden células NK.
Como se usa en el presente documento, el término "células NK" se refiere a linfocitos diferenciados con un fenotipo CD16+ CD56+ y/o CD57+ TCR-. Las NK se caracterizan por su capacidad para unirse y matar células que no expresan antígenos MHC/HLA "propios" mediante la activación de enzimas citolíticas específicas, la capacidad de matar células tumorales u otras células enfermas que expresan un ligando para receptores activadores de NK, y la capacidad de liberar moléculas de proteínas ALLmadas citocinas que estimulan o inhiben la respuesta inmunitaria.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias comprenden células NKT.
Como se usa en el presente documento, el término "células NKT" se refiere a una población especializada de células T que expresan un receptor de células T ap semiinvariable, pero también expresan una variedad de marcadores moleculares que normalmente se asocian con las células NK, tal como NK1.1. Las células NKT incluyen NK1.1+ y NK1.1-, así como células CD4+, CD4-, CD8+ y CD8-. El TCR en las células NKT es único en el sentido de que reconoce los antígenos de glicolípidos presentados por la molécula similar al MHC I CD1d. Las células NKT pueden tener efectos protectores o perjudiciales debido a su capacidad para producir citoquinas que promueven la inflamación o la tolerancia inmunitaria.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias se obtienen de un sujeto sano.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias se obtienen de un sujeto que padece una patología (p. ej., cáncer).
De acuerdo con realizaciones específicas, la activación se realiza en presencia de células que expresan CD47 o CD47 exógeno.
De acuerdo con realizaciones específicas, la activación es en presencia de CD47 exógeno,
De acuerdo con realizaciones específicas, el CD47 exógeno es soluble.
De acuerdo con otras realizaciones específicas, el CD47 exógeno se inmoviliza en un soporte sólido.
De acuerdo con realizaciones específicas, la activación se realiza en presencia de células que expresan CD47.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células que expresan el CD47 comprenden células patológicas (enfermas).
De acuerdo con realizaciones específicas, las células que expresan el CD47 comprenden células cancerosas.
De acuerdo con realizaciones específicas, la activación se realiza en presencia de un agente estimulador capaz de transmitir al menos una señal de activación primaria [p. ej. ligadura del receptor de células T (TCR) con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC)/complejo peptídico en la célula presentadora de antígeno (APC)] que da como resultado proliferación celular, maduración, producción de citoquinas, fagocitosis y/o inducción de funciones reguladoras o efectoras de la célula inmune. De acuerdo con realizaciones específicas, el agente estimulador también puede transmitir una señal coestimuladora secundaria.
Los métodos para determinar la cantidad del agente estimulador y la relación entre el agente estimulador y las células inmunitarias están dentro de las capacidades de los expertos en la técnica y, por lo tanto, no se especifican en el presente documento.
El agente estimulador puede activar las células inmunitarias de manera dependiente o independiente de antígeno (es decir, policlonal).
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente estimulador comprende un estimulador no específico de antígeno.
Los estimuladores no específicos son conocidos por los expertos en la técnica. Por lo tanto, como un ejemplo no limitante, cuando las células inmunitarias comprenden células T, el estimulador no específico de antígeno puede ser un agente capaz de unirse a una estructura de la superficie de la célula T e inducir la estimulación policlonal de la célula T, tal comopero no se limita, al anticuerpo anti-CD3 en combinación con una proteína coestimuladora como el anticuerpo anti-CD28. Otros ejemplos no limitantes incluyen ligandos anti-CD2, anti-CD137, anti-CD134, Notch, p. Delta-like 1/4, Jaggedl/2 ya sea solo o en varias combinaciones con anti-CD3. Otros agentes que pueden inducir la estimulación policlonal de las células T incluyen, peor no se limitan a, mitógenos, PHA, PMA-ionomicina, CEB y CytoStim (Miltenyi Biotech). De acuerdo con casos específicos, el estimulador no específico de antígeno comprende anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. De acuerdo con realizaciones específicas, el estimulador de células T comprende esferas recubiertas con anti-CD3 y anti-CD28, tales como las CD3CD28 MACSiBeads obtenidas de Miltenyi Biotec.
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente estimulador comprende un estimulador específico de antígeno.
Los ejemplos no limitantes de estimuladores de células T específicos de antígeno incluyen una célula presentadora de antígeno cargada de antígeno [APC, p. ej., célula dendrítica] y MHC recombinante cargado con péptido. Por tanto, por ejemplo, un estimulador de células T puede ser una célula dendrítica precargada con un antígeno deseado (p. ej., un antígeno tumoral) o transfectada con ARNm que codifica el antígeno deseado.
De acuerdo con realizaciones específicas, el antígeno es un antígeno de cáncer.
Como se usa en el presente documento, el término "antígeno del cáncer" se refiere a un antígeno sobreexpresado o expresado únicamente por una célula cancerosa en comparación con una célula no cancerosa. Un antígeno canceroso puede ser un antígeno canceroso conocido o un nuevo antígeno específico que se desarroALL en una célula cancerosa (es decir, neoantígenos).
Los ejemplos no limitantes de antígenos de cáncer conocidos incluyen MAGE-AI, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-AS, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-AS, MAGE-A9, MAGE-AIO, MAGE -Todos, MAGE-A12, GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-l, RAGE-1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-Cl/CT7, MAGE-C2, NY-ES0-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y XAGE, antígenos de diferenciación de melanocitos, p53, ras, CEA, MuCI, PMSA , PSA, tirosinasa, Melan-A, MART-I, gplOO, gp75, alfaactinina-4, proteína de fusión Bcr-Abl, Casp-8, beta-catenina, cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-l, proteína de fusión dek-can, EF2, proteína de fusión ETV6-AML1, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, HLA-A2, HLA-All, hsp70-2, KIAA0205, Mart2, Mum-2 y 3, neo-PAP, miosina clase I, OS-9, proteína de fusión pml-RAR alfa, PTPRK, K-ras, N-ras, triosafosfato isomerasa, GnTV, Herv-K-mel, NA-88, SP17 y TRP2-Int2, (MART-I), E2A-PRL, H4 -RET, IGH-IGK, MYL-RAR, Epstein Antígenos del virus Barr, EBNA, antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH), TSP-180, MaGe-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, plSOerbB-3, c-met, nm-23Hl, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, alfa.-fetoproteína, 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195 , CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, C0-029, FGF-5, 0250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\170K, NYCO-I, RCASI, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, proteínas relacionadas con tirosinasa, TRP-1 o TRP-2.
Otros antígenos tumorales que pueden expresarse son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo el documento WO00/20581; Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley y Carroll, Cambridge University Press, Cambridge). Las secuencias de estos antígenos tumorales están fácilmente disponibles en bases de datos públicas, pero también se encuentran en los documentos WO 1992/020356 A1, WO 1994/005304 A1, WO 1994/023031 A1, WO 1995/020974 A1, WO 1995/023874 A1 & WO 1996/026214 A1.
Slternativa, o adicionalmente, se puede identificar un antígeno tumoral utilizando células cancerosas obtenidas del sujeto, p. ej., biopsia.
Por tanto, de acuerdo con realizaciones específicas, el agente estimulador comprende una célula cancerosa.
De acuerdo con realizaciones específicas, la activación se realiza en presencia de un agente anticanceroso.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias se purifican después de la activación.
Por lo tanto, la presente invención también contemplaba células inmunitarias aisladas obtenibles según los métodos de la presente invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células inmunitarias usadas y/u obtenidas de acuerdo con la presente invención pueden aislarse recientemente, almacenarse, p. ej., crioconservarse (es decir, congelarse) en, p. ej., temperatura del nitrógeno líquido en cualquier etapa durante largos períodos de tiempo (p. ej., meses, años) para uso futuro; y líneas celulares.
Los métodos de crioconservación son comúnmente conocidos por los expertos en la materia y se describen, p. ej., en las Publicaciones de Solicitudes de Patentes Internacionales Nos. WO2007054160 y WO 2001039594 y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. US20120149108.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células obtenidas según la presente invención se pueden almacenar en un banco de células o en una instalación de depósito o almacenamiento.
En consecuencia, las presentes enseñanzas sugieren además el uso de las células inmunitarias aisladas y los métodos de la presente invención como, pero no se limita a, una fuente de terapias con células inmunitarias adoptivas para enfermedades que pueden beneficiarse de la activación de las células inmunitarias, p. ej., una enfermedad hiperproliferativa; una enfermedad asociada con la inmunosupresión e infecciones.
Por tanto, de acuerdo con realizaciones específicas, el método de la presente invención comprende transferir de forma adoptiva las células inmunitarias después de dicha activación a un sujeto que las necesite.
De acuerdo con realizaciones específicas, se proporcionan células inmunitarias que se pueden obtener de acuerdo con los métodos de la presente invención para uso en terapia celular adoptiva.
Las células utilizadas de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención pueden ser autólogas o no autólogas; pueden ser singénicos o no singénicos: alogénicos o xenogénicos al sujeto; cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
Las presentes enseñanzas también contemplan el uso de las composiciones de la presente invención (p. ej., la proteína de fusión, un polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa) en métodos para tratar una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de las células inmunitarias. Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de células inmunitarias que comprende administrar a un sujeto que lo necesite la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido o un constructo de ácido nucleico. codificando lo mismo o una célula huésped codificando lo mismo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la codifica para su uso en el tratamiento de una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de las células inmunitarias.
El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a inhibir, prevenir o detener el desarrollo de una patología (enfermedad, trastorno o condición médica) y/o causar la reducción, remisión o regresión de una patología o un síntoma de una patología. Los expertos en la técnica comprenderán que se pueden usar varias metodologías y ensayos para evaluar el desarrollo de una patología y, de manera similar, se pueden usar varias metodologías y ensayos para evaluar la reducción, remisión o regresión de una patología.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye mamíferos, por ejemplo, seres humanos de cualquier edad y género. De acuerdo con realizaciones específicas, el término "sujeto" se refiere a un sujeto que padece la patología (enfermedad, trastorno o condición médica). De acuerdo con realizaciones específicas, este término engloba a individuos que están en riesgo de desarroALLr la patología.
De acuerdo con realizaciones específicas, el sujeto padece una enfermedad asociada con células que expresan CD47.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células enfermas del sujeto expresan CD47.
Como se usa en el presente documento, la frase "una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de las células inmunitarias" se refiere a enfermedades en las que la actividad de la respuesta inmunitaria del sujeto puede ser suficiente para al menos mejorar los síntomas de la enfermedad o retrasar la aparición de los síntomas, sin embargo, por cualquier motivo, la actividad de la respuesta inmunitaria del sujeto al hacerlo es inferior a la óptima.
Los ejemplos no limitantes de enfermedades que pueden beneficiarse de la activación de células inmunitarias incluyen enfermedades hiperproliferativas, enfermedades asociadas con supresión inmunitaria, inmunosupresión provocada por medicación (p. ej., inhibidores de mTOR, inhibidores de calcineurina, esteroides) e infecciones.
De acuerdo con realizaciones específicas, la enfermedad comprende una enfermedad hiperproliferativa.
De acuerdo con realizaciones específicas, la enfermedad hiperproliferativa comprende esclerosis o fibrosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, esclerosis/esclerodermia sistémica, colangitis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, fibrosis hepática, prevención de fibrosis pulmonar inducida por radiación, mielofibrosis o fibrosis retroperitoneal.
De acuerdo con otras realizaciones específicas, la enfermedad hiperproliferativa comprende el cáncer.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL a un sujeto que la necesite.
Como se usa en el presente documento, el término cáncer abarca tanto los cánceres malignos como los premalignos.
Con respecto a las formas de cáncer premalignas o benignas, opcionalmente las composiciones y los métodos de las mismas se pueden aplicar para detener la progresión del cáncer premaligno a una forma maligna.
Los cánceres que pueden ser tratados por la invención pueden ser cualquier cáncer sólido o no sólido y/o metástasis de cáncer.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer comprende cáncer maligno.
Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluido el cáncer gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, riñón o riñón cáncer, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluido el linfoma no Hodgkin (NHL) folicular de bajo grado); linfoma de Burkitt, difuso linfoma de células B grandes (DLBCL), NHL de linfocitos pequeños (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; SMA de alto grado ll NHL de células no escindidas; enfermedad voluminosa NHL; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom); linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML), leucemia promielocítica aguda (APL), leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica (CML); y trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y síndrome de Meigs. Preferiblemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de células blandas. sarcoma tisular, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. Las condiciones cancerosas susceptibles de tratamiento de la invención incluyen cánceres metastásicos.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer comprende cáncer premaligno.
Los cánceres premalignos (o precánceres) están bien caracterizados y son conocidos en la técnica (consulte, por ejemplo, Berman JJ. y Henson DE., 2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med Inform Decis Mak.3:8). Las clases de cánceres premalignos susceptibles de tratamiento a través del método de la invención incluyen cánceres premalignos pequeños o microscópicos adquiridos, lesiones grandes adquiridas con atipia nuclear, lesiones precursoras que ocurren con síndromes hiperplásicos hereditarios que progresan a cáncer e hiperplasias difusas adquiridas y cánceres difusos. metaplasias. Los ejemplos de cánceres premalignos pequeños o microscópicos incluyen h Gs IL (lesión intraepitelial escamosa de alto grado del cuello uterino), AIN (neoplasia intraepitelial anal), displasia de cuerda vocal, criptas aberrantes (de colon), PIN (neoplasia intraepitelial prostática). Los ejemplos de lesiones grandes adquiridas con atipia nuclear incluyen adenoma tubular, AILD (linfadenopatía angioinmunoblástica con disproteinemia), meningioma atípico, pólipo gástrico, parapsoriasis en placas grandes, mielodisplasia, carcinoma papilar de células de transición in situ, anemia refractaria con exceso de blastos y papiloma de Schneider. Los ejemplos de lesiones precursoras que ocurren con síndromes hiperplásicos hereditarios que progresan a cáncer incluyen síndrome de lunar atípico, adenomatosis de células C y MEA. Los ejemplos de hiperplasias difusas adquiridas y metaplasias difusas incluyen SIDA, hiperplasia linfoide atípica, enfermedad ósea de Paget, enfermedad linfoproliferativa posterior al trasplante y colitis ulcerosa.
En algunas realizaciones de la invención, las enfermedades a tratar por una proteína de fusión que comprende SIRPa o su ECD y 4-1BBL o ECD de la misma, tales como por ejemplo, SIRPa-G-4-1BBL son: leucemia, leucemia mielomonocítica crónica ( CMML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML), linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), linfoma de células del manto (MCL) , Linfoma folicular (FL), Linfoma de la zona marginal (MZL), Leucemia linfoblástica aguda Pre-B (ALL pre-B), Leiomiosarcoma, Cáncer de ovario, Cáncer de mama, Cáncer de colon, Cáncer de vejiga, Glioblastoma, Carcinoma hepatocelular, Cáncer de próstata, Agudo leucemia linfoblástica (ALL), mieloma múltiple, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de células B de la zona marginal, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer de cerebro
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, las indicaciones de las enfermedades a tratar por una proteína de fusión que comprende SIRPa o su ECD y 4-1BBL o su ECD, tales como por ejemplo, SIRPa-G-4-1BBL son: leucemia mieloide aguda, Cáncer de vejiga, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer colorrectal, linfoma difuso de células B grandes, cáncer epitelial de ovario, tumor epitelial, cáncer de las trompas de Falopio, linfoma folicular, glioblastoma multiforme, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, leucemia , Linfoma, Linfoma de células del manto, Melanoma, Mesotelioma, Mieloma múltiple, Cáncer de nasofaringe, Linfoma no Hodgkin, Carcinoma de pulmón de células no pequeñas, Cáncer de ovario, Cáncer de próstata, Carcinoma de células renales.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, leucemia, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón y carcinoma de células escamosas.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, carcinoma y leucemia.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer es carcinoma de colon.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer es carcinoma de ovario.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer es carcinoma de pulmón.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer es carcinoma de cabeza y cuello.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer es leucemia.
De acuerdo con realizaciones específicas, la leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de células T adultas, leucemia aleucémica, leucemia leucocítica, leucemia basófila, leucemia blástica leucemia de células, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinofílica, leucemia de ()ross, leucemia de células peludas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células madre, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfogénica, leucemia linfoide, leucemia de células de linfosarcoma, leucemia de mastocitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, células plasmáticas leucemia, leucemia plasmocítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células madre, leucemia subleucémica y leucemia de células indiferenciadas.
De acuerdo con realizaciones específicas, la leucemia es leucemia promielocítica, leucemia mieloide aguda o leucemia mielógena crónica.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer es un linfoma.
De acuerdo con realizaciones específicas, el linfoma es un linfoma de células B
De acuerdo con realizaciones específicas, el linfoma es un linfoma de células T.
De acuerdo con otras realizaciones específicas, el linfoma es el linfoma de Hodgkins.
De acuerdo con realizaciones específicas, el linfoma es un linfoma no Hodgkin.
De acuerdo con realizaciones específicas, el linfoma no Hodgkin se selecciona del grupo que consiste en NHL agresivo, NHL transformado, NHL indolente, NHL recidivante, NHL refractario, linfoma no Hodgkin de bajo grado, linfoma folicular, linfoma de células grandes, linfoma de células B linfoma, linfoma de células T, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, linfoma de células NK, linfoma difuso de células B grandes, linfoma linfoblástico agudo y cáncer cutáneo de células T, incluyendo síndrome fungoides/ de Sezry micosos .
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer es mieloma múltiple.
De acuerdo con al menos algunas realizaciones, el mieloma múltiple se selecciona del grupo que consiste en cánceres de mieloma múltiple que producen cadenas ligeras de tipo kappa y/o cadenas ligeras de tipo lambda; mieloma múltiple agresivo, incluida la leucemia primaria de células plasmáticas (PCL); trastornos benignos de células plasmáticas tales como MGUS (gamopatía monoclonal de significado incierto), macroglobulinemia de Waldenstrom (WM, también conocida como linfoma linfoplasmocitario) que puede derivar en mieloma múltiple; mieloma múltiple latente (SMM), mieloma múltiple indolente, formas premalignas de mieloma múltiple que también pueden convertirse en mieloma múltiple; amiloidosis primaria.
Un Modo de acción sugerido de SIRPa-4-1BBL
En una realización de la invención, la SIRPa-4-1BBL quimérica se puede usar para tratar el cáncer a través del siguiente modo de acción posible:
• Debido a la expresión relativamente alta de CD47 en la superficie de las células tumorales y en el microambiente tumoral, el resto de SIRPa de la quimera de SIRPa-4-1 BBL dirigirá la molécula a los sitios de metástasis y tumor, y unirá la quimera a CD47 dentro del microambiente tumoral.
• Dirigir la quimera a las células tumorales y/o al microambiente tumoral facilitará un aumento en la concentración de SIRPa-4-1BBL en el microambiente tumoral y la posterior oligomerización del resto 4-1BBL de la quimera en el sitio del tumor. Dado que la oligomerización de 4-1 BBL es una etapa necesaria para la señalización de 4-1BB, esta unión y oligomerización de 4-1BBL generará una señal coestimuladora de 4-1BB que promoverá la activación de las células T, las células B y las células NK, especialmente los Linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) y otras células inmunitarias en el sitio del tumor para destruir las células cancerosas.
• Además de la señal coestimuladora 4-1BBL- 4-1BB, la unión de la fracción SIRPa de la quimera a CD47 en el sitio del tumor competirá con la SIRPa endógena expresada en macrófagos y células dendríticas, eliminando así la inhibición de estas células y contribuyendo aún más a la fagocitosis de células tumorales ya la activación de células dendríticas y células T en el microambiente tumoral.
Se anticipa que las actividades anteriores de SIRPa-4-1BBL conducirán a un efecto sinérgico en la activación de TIL, células dendríticas y macrófagos dentro del microambiente tumoral, que se espera que sea un efecto más específico y robusto en comparación con el efecto de cada péptido o ECD del mismo por separado, así como cuando se usan los dos péptidos diferentes o ECD del mismo en combinación.
Así, según realizaciones específicas, el cáncer se define por la presencia de tumores que tienen linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) en el microambiente tumoral y/o tumores con expresión de CD47 en el microambiente tumoral.
De acuerdo con realizaciones específicas, el cáncer se define por la presencia de tumores que tienen linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) en el microambiente tumoral y/o tumores con una expresión relativamente alta de CD47 en el microambiente tumoral.
De acuerdo con realizaciones específicas, las células del cáncer expresan CD47.
De acuerdo con realizaciones específicas, la enfermedad comprende una enfermedad asociada con la inmunosupresión o inmunosupresión causada por medicación (p.ej., inhibidores de mTOR, inhibidores de calcineurina, esteroides).
De acuerdo con realizaciones específicas, la enfermedad comprende VIH, sarampión, influenza, LCCM, RSV, rinovirus humanos, EBV, CMV, parvovirus.
De acuerdo con realizaciones específicas, la enfermedad comprende una infección.
Como se usa en el presente documento, el término "infección" o "enfermedad infecciosa" se refiere a una enfermedad inducida por un patógeno. Los ejemplos específicos de patógenos incluyen patógenos virales, patógenos bacterianos, p. ej., patógenos micobacterianos intracelulares (tal como, por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis), patógenos bacterianos intracelulares (tal como, por ejemplo, Listeria monocytogenes) o patógenos protozoarios intracelulares (tal como, por ejemplo, ejemplo, Leishmania y Trypanosoma).
Los tipos específicos de patógenos virales que causan enfermedades infecciosas tratables de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, circovirus, parvovirus, papovavirus, adenovirus, herpesvirus, iridovirus, poxvirus, hepadnavirus, picornavirus, calicivirus, togavirus, flavivirus, reovirus, orthomixovirus, paramixovirus, rhabdovirus, bunyavirus, coronavirus, arenavirus y filovirus.
Los ejemplos específicos de infecciones virales que pueden tratarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) inducido por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), influenza, infección por rinovirus, meningitis viral, Iinfección por el virus de Epstein-Barr (EBV), infección por el virus de la hepatitis A, B o C, sarampión, infección por el virus del papiloma/verrugas, infección por citomegalovirus (CMV), infección por el virus del herpes simple, fiebre amariALL, infección por el virus del Ébola, rabia, etc.
De acuerdo con realizaciones específicas, las composiciones de la presente invención (p. ej., proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL, constructo de polinucleótido o ácido nucleico que codifica la misma y/o célula huésped que la expresa) se pueden administrar a un sujeto en combinación con otro régimen terapéutico establecido o experimentales para tratar una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de células inmunitarias (p. ej., cáncer) incluyendo, entre otros, analgésicos, agentes quimioterapéuticos, agentes radioterapéuticos, terapias citotóxicas (acondicionamiento), terapia hormonal, anticuerpos y otros regímenes de tratamiento (p. ej., cirugía) que son bien conocidos en la técnica.
De acuerdo con realizaciones específicas, las composiciones de la presente invención (p. ej., proteína de fusión SIRPa-4 -1BBL, constructo de polinucleótido o ácido nucleico que la codifica y/o célula huésped que la expresa) se pueden administrar a un sujeto en combinación con un trasplante de células adoptivo tal como, pero sin limitarse a, trasplante de células de médula ósea, células madre hematopoyéticas, PBMC, células madre de sangre de cordón umbilical y/o células madre pluripotentes inducidas.
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente terapéutico administrado en combinación con la composición de la invención comprende un agente anticancerígeno.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un agente anticanceroso; y una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido que la codifica, un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa.
Los agentes anticancerosos que se pueden usar con realizaciones específicas de la invención incluyen, pero no se limitan a, los fármacos anticancerosos Acivicin; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adriamicina; adozelesina; aldesleukina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastato; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemida; Carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; Enpromete; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; Estramustina Fosfato De Sodio; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etorina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; Interferón Alfa-2a; Interferón Alfa-2b; interferón alfa-nl; Interferón Alfa-n3; Interferón Beta-I a; Interferón Gamma-I b; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sodio; metoprina; Meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitospera; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromán; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero de sodio; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtraceno; esparfosato de sodio; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptongrina; estreptozocina; sulfenuro; talisomicina; taxol; tecogalan sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofuirina; tirapazamina; clorhidrato de topotecán; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; Trimetrexato Glucuronato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; Vorozol; zeniplatino; zinostatina; Clorhidrato de zorubicina. Los agentes antineoplásicos adicionales incluyen los descritos en el Chapter 52, Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner), and the introduction thereto, 1202-1263, de "Goodman and Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", octava edición, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division).
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente anticanceroso comprende un anticuerpo.
De acuerdo con realizaciones específicas, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en rituximab, cetuximab, trastuzumab, edrecolomab, alemtuzumab, gemtuzumab, ibritumomab, panitumumab, Belimumab, Bevacizumab, Bivatuzumab mertansine, Blinatumomab, Blontuvetmab, Brentuximab vedotin, Catumaxomab, Cixutumumab, Daclitumumab, Adalimumab, Adalimumab , Bezlotoxumab, Certolizumab pegol, Citatuzumab bogatox, Daratumumab, Dinutuximab, Elotuzumab, Ertumaxomab, Etaracizumab, Gemtuzumab ozogamicina, Girentuximab, Necitumumab, Obinutuzumab, Ofatumumab, Pertuzumab, Ramucirumab, Siltuximab, Tositumomab, Trastuzumab e ipilimumab.
De acuerdo con realizaciones específicas, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en rituximab y cetuximab.
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente terapéutico administrado en combinación con la composición de la invención comprende un agente antiinfeccioso (p. ej., antibióticos y agentes antivirales)
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente terapéutico administrado en combinación con la composición de la invención comprende un agente inmunosupresor (p. ej., GCSF y otros estimuladores de la médula ósea, esteroides)
De acuerdo con realizaciones específicas, la terapia de combinación tiene un efecto aditivo.
De acuerdo con realizaciones específicas, la terapia de combinación tiene un efecto sinérgico.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un artículo de fabricación identificado para el tratamiento de una enfermedad que puede beneficiarse de la activación de células inmunitarias que comprende un material de envasado que contiene un agente terapéutico para tratar dicha enfermedad; y una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido que la codifica, un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa.
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente terapéutico para el tratamiento de dicha enfermedad; y una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, un polinucleótido que la codifica, un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa son paquetes en contenedores separados.
De acuerdo con realizaciones específicas, el agente terapéutico para el tratamiento de dicha enfermedad; y una proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL, un polinucleótido o un ácido nucleico que la codifica, un constructo de ácido nucleico que la codifica o una célula huésped que la expresa son paquetes en una coformulación.
Como se usa en el presente documento, en una realización, el término "derivado de aminoácido" o "derivado" se refiere a un grupo derivable de un aminoácido natural o no natural, como se describe y ejemplifica en el presente documento. Los derivados de aminoácidos son evidentes para los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, derivados de éster, amino alcohol, amino aldehído, amino lactona y N-metilo de aminoácidos naturales y no naturales. En un caso, se proporciona un derivado de aminoácido como sustituyente de un compuesto descrito en el presente documento, en donde el sustituyente es -NH-G(Sc)-C(0)-Q o -OC(0)G(S)c)-Q, en donde Q es -SR, -NRR o alcoxilo, R es hidrógeno o alquilo, Se es una cadena lateral de un aminoácido natural o no natural y G es alquilo C1-C2. En ciertas realizaciones, G es alquilo Ci y Sc se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilalquilo y heteroarilalquilo.
Como se usa en el presente documento, en una realización, el término "péptido", "polipéptido" o "proteína" que se usan indistintamente en el presente documento pueden derivar de una fuente biológica natural, sintetizarse o producirse mediante tecnología recombinante. Puede generarse de cualquier manera conocida en la técnica de la síntesis de péptidos o proteínas, incluyendo la síntesis química. Para la síntesis de péptidos en fase sólida, se puede encontrar un resumen de las muchas técnicas en J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 y J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, pág. 46, Academic Press (Nueva York), 1973. Para la síntesis de solución clásica ver G. Schroder y K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (Nueva York), 1965. Uno o más de los aminoácidos pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofamesita, un grupo ácido graso, un grupo acilo (p. ej., grupo acetilo), un enlazador para conjugación, funcionalización u otros grupos protectores/bloqueadores conocidos. Las modificaciones en el péptido o la proteína pueden introducirse mediante síntesis de genes, mutagénesis dirigida al sitio (p. ej., basada en PCR) o aleatoria (p. ej., EMS) mediante eliminación de exonucleasas, modificación química o fusión de secuencias de polinucleótidos que codifican un dominio heterólogo o unión. proteína, por ejemplo.
Como se usa en el presente documento, en una realización, el término "péptido" puede ser fragmentos, derivados, análogos o variantes de los péptidos anteriores y cualquier combinación de los mismos. Los fragmentos de péptidos, como se usa ese término o frase en el presente documento, incluyendo fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción. Las variantes de péptidos incluyen fragmentos y péptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos.
Las variantes pueden ocurrir naturalmente o no ocurrir naturalmente. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión, péptidos que tienen uno o más residuos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional y péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar. Estas modificaciones también pueden incluir la incorporación de D-aminoácidos u otros aminoácidos no codificados. En una realización, ninguna de las modificaciones debería interferir sustancialmente con la actividad biológica deseada del péptido o fragmento del mismo. En otra realización, las modificaciones pueden alterar una característica del péptido, fragmento del mismo, por ejemplo, la estabilidad o la vida media, sin interferir con la actividad biológica deseada del péptido, fragmento del mismo. En una realización, como se usa en el presente documento, los términos "péptido" y "proteína" se pueden usar de manera intercambiable teniendo todos los mismos significados y cualidades.
En una realización, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada se puede diseñar para codificar el péptido de la presente invención y el resto escindible fusionado. En una realización, se puede diseñar una proteína de fusión para que el péptido se pueda aislar fácilmente mediante cromatografía de afinidad; p. ej., mediante inmovilización en una columna específica para el resto escindible. En una realización, se diseña un sitio de escisión entre el péptido y el resto escindible y el péptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante tratamiento con una enzima o agente apropiado que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio [p. ej., véase Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y GardeALL et al., J. Biol. Chem. et al.265:15854-15859 (1990))].
En una realización, cada uno de los péptidos que forman la proteína de fusión (también denominada aquí "el péptido") de la presente invención también se puede sintetizar usando sistemas de expresión in vitro. En una realización, los métodos de síntesis in vitro son bien conocidos en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.
En una realización, la producción de un péptido de esta invención utiliza tecnología de ADN recombinante. Un péptido o proteína "recombinante" se refiere a un péptido o proteína producido mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, producido a partir de células transformadas por un constructo de ADN exógeno que codifica el péptido o la proteína deseados.
Por tanto, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, el polinucleótido comprende SEQ ID NO: 8.
De acuerdo con realizaciones específicas, el polinucleótido consiste en la SEQ ID NO: 8.
De acuerdo con realizaciones específicas, el polinucleótido es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homólogo a la secuencia nucleica como se establece en la SEQ ID No. 8.
Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de cadena simple o doble que se aísla y se proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómicos y/o secuencias de polinucleótidos compuestas (p. ej., una combinación de los anteriores).
Para expresar SIRPa-4-1 BBL exógeno en células de mamífero, una secuencia polinucleotídica que codifica SIRPa-4-1BBL se liga preferiblemente en un constructo de ácido nucleico adecuado para la expresión en células de mamífero. Tal constructo de ácido nucleico incluye una secuencia promotora para dirigir la transcripción de la secuencia de polinucleótidos en la célula de manera constitutiva o inducible.
Por tanto, de acuerdo con realizaciones específicas, se proporciona un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido y un elemento regulador para dirigir la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped.
El constructo de ácido nucleico (también denominada en el presente documento "vector de expresión") de algunas realizaciones de la invención incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas, eucariotas o, preferiblemente, en ambos (p. ej., vectores lanzadera). Además, los vectores de clonación típicos también pueden contener una secuencia de inicio de transcripción y traducción, un terminador de transcripción y traducción y una señal de poliadenilación. A modo de ejemplo, tales constructos incluirán normalmente una LTR en 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de la síntesis de ADN de la segunda cadena y una LTR en 3' o una parte de la misma.
El constructo de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención normalmente incluye una secuencia señal para la secreción del péptido de una célula huésped en la que se coloca. Preferiblemente, la secuencia señal para este propósito es una secuencia señal de mamífero o la secuencia señal de las variantes polipeptídicas de algunas realizaciones de la invención.
Los promotores eucarióticos suelen contener dos tipos de secuencias de reconocimiento, la caja TATA y los elementos promotores corriente arriba. Se cree que la caja TATA, ubicada entre 25-30 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción, está involucrada en la dirección de la ARN polimerasa para comenzar la síntesis de ARN. Los otros elementos promotores aguas arriba determinan la velocidad a la que se inicia la transcripción.
Preferiblemente, el promotor utilizado por el constructo de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención es activo en la población celular específica transformada. Los ejemplos de promotores específicos del tipo de célula y/o específicos del tejido incluyen promotores tales como la albúmina que es específica del hígado. [Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], promotores específicos linfoides [Calame et al., (1988) Adv. Inmunol. 43:235-275]; en particular promotores de receptores de células T [Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] e inmunoglobulinas;
[Banerji et al. (1983) Celda 33729-740], promotores específicos de neuronas como el promotor de neurofilamentos [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], promotores específicos del páncreas [Edlunch et al. (1985) Ciencia 230: 912-916] o promotores específicos de las glándulas mamarias tal como el promotor del suero de leche (Patente de EE.UU. No. 4,873,316 y Publicación de Solicitud Europea No. 264,166).
Los elementos potenciadores pueden estimular la transcripción hasta 1000 veces a partir de promotores homólogos o heterólogos enlazados. Los potenciadores están activos cuando se colocan aguas arriba o aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción. Muchos elementos potenciadores derivados de virus tienen una amplia gama de huéspedes y son activos en una variedad de tejidos. Por ejemplo, el potenciador del gen temprano SV40 es adecuado para muchos tipos de células. Otras combinaciones de potenciador/promotor que son adecuadas para algunas realizaciones de la invención incluyen aqueALLs derivadas del virus del polioma, el citomegalovirus (CMV) humano o murino, la repetición a largo plazo de varios retrovirus tales como el virus de la leucemia murina, el virus del sarcoma murino o de Rous y el VIH. Véase, Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1983. En el constructo del vector de expresión, el promotor se coloca preferentemente aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heterólogo que del sitio de inicio de la transcripción en su entorno natural. Sin embargo, como se conoce en la técnica, se puede acomodar alguna variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora.
Las secuencias de poliadenilación también se pueden añadir al vector de expresión para aumentar la eficiencia de la traducción del ARNm de SIRPa-4-1BBL. Se requieren dos elementos de secuencia distintos para una poliadenilación precisa y eficiente: secuencias ricas en GU o U ubicadas aguas abajo del sitio de poliadenilación y una secuencia altamente conservada de seis nucleótidos, AAUAAA, ubicada 11-30 nucleótidos aguas arriba. Las señales de terminación y poliadenilación que son adecuadas para algunas realizaciones de la invención incluyen las derivadas de SV40.
Además de los elementos ya descritos, el vector de expresión de algunas realizaciones de la invención puede contener típicamente otros elementos especializados destinados a incrementar el nivel de expresión de los ácidos nucleicos clonados o a facilitar la identificación de células portadoras del ADN recombinante. Por ejemplo, varios virus animales contienen secuencias de ADN que promueven la replicación extracromosómica del genoma viral en tipos de células permisivas. Los plásmidos que portan estos replicones víricos se replican episomalmente siempre que los factores apropiados sean proporcionados por genes transportados en el plásmido o en el genoma de la célula huésped.
El vector puede incluir o no un replicón eucariótico. Si está presente un replicón eucariota, entonces el vector se puede amplificar en células eucariotas usando el marcador seleccionable apropiado. Si el vector no comprende un replicón eucariótico, no es posible la amplificación episomal. En cambio, el ADN recombinante se integra en el genoma de la célula manipulada, donde el promotor dirige la expresión del ácido nucleico deseado.
El vector de expresión de algunas realizaciones de la invención puede incluir además secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas a partir de un solo ARNm, tal como un sitio de entrada de ribosoma interno (IREs) y secuencias para la integración genómica del promotor-quimérico polipéptido.
Se apreciará que los elementos individuales comprendidos en el vector de expresión se pueden disponer en una variedad de configuraciones. Por ejemplo, los elementos potenciadores, promotores y similares, e incluso la(s) secuencia(s) de polinucleótidos que codifican un SIRPa-4-1BBL pueden disponerse en una configuración de "cabeza a cola", pueden estar presentes como un complemento invertido, o en una configuración complementaria, como una hebra antiparalela. Aunque tal variedad de configuración es más probable que ocurra con elementos no codificantes del vector de expresión, también se prevén configuraciones alternativas de la secuencia codificante dentro del vector de expresión.
Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, pZeoSV2 (+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, d H26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que están disponibles en Invitrogen, pCI, que está disponible en Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV, que están disponibles en Strategene, pTRES, que está disponible en Clontech, y sus derivados.
También se pueden usar vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas tales como retrovirus. Los vectores SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. Los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus Epstein Bar incluyen pHEBO y p2O5. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, el promotor posterior de SV-40, el promotor de metalotioneína, el promotor murino promotor del virus del tumor mamario, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de la polihedrina u otros promotores que se hayan mostrado eficaces para la expresión en células eucariotas.
Como se describió anteriormente, los virus son agentes infecciosos muy especializados que han evolucionado, en muchos casos, para eludir los mecanismos de defensa del huésped. Típicamente, los virus infectan y se propagan en tipos de células específicos. La especificidad de direccionamiento de los vectores virales utiliza su especificidad natural para dirigirse específicamente a tipos de células predeterminados y, por lo tanto, introducir un gen recombinante en la célula infectada. Por tanto, el tipo de vector utilizado por algunas realizaciones de la invención dependerá del tipo de célula transformada. La capacidad de seleccionar vectores adecuados de acuerdo con el tipo de célula transformada está dentro de las capacidades del experto en la materia y, como tal, no se proporciona una descripción general de las consideraciones de selección en el presente documento. Por ejemplo, las células de la médula ósea pueden dirigirse usando el virus de la leucemia de células T humanas tipo I (HTLV-I) y las células renales pueden dirigirse usando el promotor heterólogo presente en el baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) como se describe en Liang CY et al., 2004 (Arch Virol. 149: 51-60).
Los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión in vivo de SIRPa-4-1 BBL ya que ofrecen ventajas tales como infección lateral y especificidad de direccionamiento. La infección lateral es inherente al ciclo de vida de, por ejemplo, retrovirus y es el proceso por el cual una sola célula infectada produce muchos viriones de progenie que brotan e infectan células vecinas. El resultado es que una gran área se infecta rápidamente, la mayor parte de la cual no estaba inicialmente infectada por las partículas virales originales. Esto contrasta con el tipo de infección vertical en el que el agente infeccioso se propaga solo a través de la progenie hija. También se pueden producir vectores virales que no pueden propagarse lateralmente. Esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico solo en un número localizado de células objetivo.
Se pueden usar varios métodos para introducir el vector de expresión de algunas realizaciones de la invención en las células. Tales métodos se describen generalmente en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véase la Pat, de EE.UU. Nos. 5,464,764 y 5,487,992 para métodos de selección positivo-negativo.
La introducción de ácidos nucleicos por infección viral ofrece varias ventajas sobre otros métodos tales como la lipofección y la electroporación, ya que se puede obtener una mayor eficiencia de transfección debido a la naturaleza infecciosa de los virus.
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con constructos virales o no virales, tales como adenovirus, lentivirus, virus Herpes simplex I o virus adenoasociados (AAV) y sistemas basados en lípidos. Los lípidos útiles para la transferencia del gen mediada por lípidos son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol [Tonkinson et al., Cancer Research, 14(1): 54-65 (1996)]. Los constructos más preferidos para uso en terapia génica son virus, más preferiblemente adenovirus, AAV, lentivirus o retrovirus. Un constructo viral, tal como un constructo retroviral, incluye al menos un promotor/potenciador transcripcional o elemento(s) definidor(es) de locus, u otros elementos que controlan la expresión génica por otros medios, como corte y empalme alternativo, exportación de ARN nuclear o modificación postraduccional de Mensajero. Tales constructos de vectores también incluyen una señal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTR) o partes de las mismas, y sitios de unión de cebadores de hebra positiva y negativa apropiados para el virus utilizado, a menos que ya esté presente en el constructo viral. Además, tal constructo normalmente incluye una secuencia señal para la secreción del péptido de una célula huésped en la que se coloca. Preferiblemente, la secuencia señal para este propósito es una secuencia señal de mamífero o la secuencia señal de las variantes polipeptídicas de algunas realizaciones de la invención. Opcionalmente, el constructo también puede incluir una señal que dirija la poliadenilación, así como uno o más sitios de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. A modo de ejemplo, dichas constructos incluirán normalmente una LTR en 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de la síntesis de ADN de la segunda cadena y una LTR en 3' o una parte de la misma. Pueden usarse otros vectores que no sean virales, tales como lípidos catiónicos, polilisina y dendrímeros.
Como se mencionó, además de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, el constructo de expresión de algunas realizaciones de la invención también puede incluir secuencias diseñadas para mejorar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o toxicidad del péptido expresado. Por ejemplo, puede diseñarse la expresión de una proteína de fusión o una proteína de fusión escindible que comprende la proteína SIRPa-4-1BBL de algunas realizaciones de la invención y una proteína heteróloga. Tal proteína de fusión puede diseñarse de modo que la proteína de fusión pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; p. ej., por inmovilización en una columna específica para la proteína heteróloga. Cuando se diseña un sitio de escisión entre la proteína SIRPa-4-1BBL y la proteína heteróloga, la proteína SIRPa-4-1BBL se puede liberar de la columna cromatográfica mediante tratamiento con una enzima o agente apropiado que interrumpa el sitio de escisión [p. ej., véase Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70; y GardeALL et al., (1990) J. Biol. química 265:15854-15859].
La presente invención también contempla células que comprenden la composición descrita en el presente documento.
Por tanto, de acuerdo con realizaciones específicas, se proporciona una célula huésped que comprende la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, el polinucleótido que la codifica o el constructo de ácido nucleico que la codifica.
Como se mencionó anteriormente, se puede usar una variedad de células procariotas o eucariotas como sistemas de expresión del huésped para expresar los polipéptidos de algunas realizaciones de la invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contiene la secuencia codificante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen la secuencia codificante; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes, tal como el plásmido Ti, que contienen la secuencia codificante. Los sistemas de expresión de mamíferos también se pueden usar para expresar los polipéptidos de algunas realizaciones de la invención.
Los ejemplos de constructos bacterianos incluyen la serie pET de vectores de expresión de E. coli (Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89).
Los ejemplos de células eucariotas que se pueden usar junto con las enseñanzas de la invención incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero, células de hongos, células de levadura, células de insecto, células de algas o células de plantas.
En levadura, se pueden usar varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, como se describe en la Solicitud de Pat. de EE.UU. No: 5,932,447. Alternativamente, se pueden usar vectores que promuevan la integración de secuencias de ADN extrañas en el cromosoma de la levadura.
En los casos en los que se utilizan vectores de expresión de plantas, la expresión de la secuencia codificante puede estar impulsada por una serie de promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como los promotores de ARN 35S y ARN 19S de CaMV [Brison et al. (1984) Nature 310: 511-514], o el promotor de la proteína de cubierta a TMV [Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311] puede ser usado. Alternativamente, se pueden usar los promotores de plantas como la subunidad pequeña de RUBiSc O [Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli et al., (1984) Science 224:838-843] o promotores de choque térmico, p. ej., soyabean hsp17.5-E o hsp17.3-B [Gurley et al. (1986) Mol. Celda. Biol. 6:559-565]. Estos constructos pueden introducirse en células vegetales usando plásmido Ti, plásmido Ri, vectores virales de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación y otras técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421-463.
Otros sistemas de expresión tales como sistemas de células huésped de insectos y mamíferos que son bien conocidos en la técnica también pueden ser utilizados por algunas realizaciones de la invención.
De acuerdo con realizaciones específicas, la célula es una célula de mamífero.
De acuerdo con la realización específica, la célula es una célula humana.
De acuerdo con una realización específica, la célula es una línea celular.
De acuerdo con otra realización particular, la celda es una celda primaria.
La célula puede derivar de un tejido adecuado que incluye, pero no se limita a, sangre, músculo, nervio, cerebro, corazón, pulmón, hígado, páncreas, bazo, timo, esófago, estómago, intestino, riñón, testículo, ovario, cabello, piel, hueso, mama, útero, vejiga, médula espinal o varios tipos de fluidos corporales. Las células pueden proceder de cualquier etapa de desarrollo, incluyendo las etapas embrionaria, fetal y adulta, así como del origen del desarrollo, es decir, origen ectodérmico, mesodérmico y endodérmico.
Los ejemplos no limitantes de células de mamífero incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS, p. ej., COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o HEK293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 1977); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC cCl 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); NIH3T3, Jurkat, células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A, ATcC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); Células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2), PER.C6, K562 y células de ovario de hámster chino (CHO).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una célula de ovario de hámster chino (CHO), HEK293, PER.C6, HT1080, NS0, Sp2/0, BHK, Namalwa, COS, HeLa y Vero.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la célula huésped comprende una célula de ovario de hámster chino (CHO), PER.C6 y 293 (por ejemplo, Expi293F).
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, comprendiendo el método expresar en una célula huésped el polinucleótido o el constructo de ácido nucleico descrita en el presente documento.
De acuerdo con realizaciones específicas, los métodos comprenden aislar la proteína de fusión.
De acuerdo con realizaciones específicas, la recuperación del polipéptido recombinante se efectúa después de un tiempo apropiado en cultivo. La frase "recuperar el polipéptido recombinante" se refiere a recoger el medio de fermentación completo que contiene el polipéptido y no implica necesariamente etapas adicionales de separación o purificación. No obstante lo anterior, los polipéptidos de algunas realizaciones de la invención se pueden purificar usando una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de concanavalina A, cromatografía de modo mixto, cromatografía de afinidad de metales, cromatografía de afinidad de lectinas, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
En algunas realizaciones, los péptidos recombinantes, fragmentos de los mismos o péptidos se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica se puede ensayar en vivo o in vitro. En una realización, las actividades de los fragmentos o péptidos recombinantes de la presente invención se pueden determinar usando varios ensayos que incluyen la viabilidad celular, la supervivencia de ratones transgénicos y la expresión de marcadores de ARN megacariocítico y linfoide.
En una realización, un péptido de esta invención comprende al menos 3 aminoácidos. En otra realización, un péptido comprende al menos 5 aminoácidos. En otra realización, un péptido comprende al menos 10 aminoácidos. En otra realización, un péptido comprende al menos 20 aminoácidos. En otra realización, un péptido comprende al menos 25 aminoácidos. En otras realizaciones, un péptido comprende al menos 30 aminoácidos o al menos 50 aminoácidos o 75 aminoácidos o 100 aminoácidos o 125 aminoácidos o 150 aminoácidos o 200 aminoácidos o 250 aminoácidos o 300 aminoácidos ácidos o 350 aminoácidos o 400 aminoácidos. En una realización, un péptido de esta invención consta esencialmente de al menos 5 aminoácidos. En otra realización, un péptido consta esencialmente de al menos 10 aminoácidos. En otras realizaciones, un péptido consta esencialmente de al menos 30 aminoácidos o al menos 50 aminoácidos o 75 aminoácidos o 100 aminoácidos o 125 aminoácidos o 150 aminoácidos o 200 aminoácidos o 250 aminoácidos o 300 aminoácidos o 350 aminoácidos o 400 aminoácidos. En una realización, un péptido de esta invención consta de al menos 5 aminoácidos. En otra realización, un péptido consta de al menos 10 aminoácidos. En otras realizaciones, un péptido consta de al menos 30 aminoácidos o al menos 50 aminoácidos o 75 aminoácidos o 100 aminoácidos o 125 aminoácidos o 150 aminoácidos o 200 aminoácidos o 250 aminoácidos o 300 aminoácidos o 350 aminoácidos o 400 aminoácidos o 500 o 600 o 700 aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, en una realización, los términos "péptido" y "fragmento" se pueden usar de manera intercambiable teniendo todos los mismos significados y cualidades. Como se usa en el presente documento, en una realización, el término "péptido" incluye péptidos nativos (ya sean productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, péptidos sintetizados sintéticamente), tales como peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos, que pueden tienen, por ejemplo, modificaciones que hacen que los péptidos sean más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células bacterianas. Tales modificaciones incluyen, entre otras, la modificación del extremo N, la modificación del extremo C, la modificación del enlace peptídico, incluyendo, entre otras, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=cH, modificaciones del esqueleto y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos son bien conocidos en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)).
A continuación, en el presente documento se proporcionan más detalles a este respecto.
Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido pueden sustituirse, por ejemplo, por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces éster (-C(r )h COOC(R)-N- ), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, p. ej., metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), enlaces dobles olefínicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N( R)-CH2-CO-), donde R es la cadena lateral "normal", presentada naturalmente en el átomo de carbono.
Estas modificaciones pueden ocurrir en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo.
Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, pueden sustituirse por ácidos no naturales sintéticos tales como TIC, naftilamina (Nol), derivados de Phe metilados en el anillo, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr.
En una realización, el péptido de esta invención comprende además un marcador marcadordetectable. Como se usa en el presente documento, en una realización, el término "marca detectable" se refiere a cualquier resto que puede ser detectado por un médico experto usando técnicas conocidas en la técnica. marcadorLos marcadores detectables para usar en los métodos de selección de la presente invención pueden ser secuencias peptídicas. Opcionalmente, marcadorel marcador detectable puede eliminarse mediante agentes químicos o mediante medios enzimáticos, como la proteólisis. Por ejemplo, el término "marcador detectable" incluye marcador de proteína de unión a quitina (CBP), marcador de proteína de unión a maltosa (MBP), marcador de glutatión-S-transferasa (GST), marcador de poli(His), marcador FLAG, marcadors de epítopo, tal como marcador V5, marcador c-myc y marcador HA, y marcadors fluorescentes como proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente amariALL (YFP), proteína fluorescente azul (BFP), y proteína fluorescente cian (CFP); así como derivados de estas marcadors, o cualquier marcador conocida en la técnica. El término "marcador detectable" también incluye el término "marcador detectable".
En una realización, un péptido de esta invención es un péptido aislado. Dicho péptido aislado puede incluir un marcador peptídico.
Los péptidos de algunas realizaciones de la invención se utilizan preferiblemente en forma lineal, aunque se apreciará que en los casos en los que la ciclación no interfiere gravemente con las características del péptido, también se pueden utilizar formas cíclicas del péptido.
Como se usa en el presente documento, en una realización, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos a, p y o 6 naturales y sintéticos, e incluye, pero no se limita, aminoácidos que se encuentran en proteínas, es decir, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina. En ciertas realizaciones, el aminoácido está en configuración L. Alternativamente, el aminoácido puede ser un derivado de alanilo, valinilo, leucinilo, isoleuccinilo, prolinilo, fenilalaninilo, triptofanilo, metioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaroilo, lisinilo, argininilo, histidinilo, p-alanilo, p-valinilo, p-leucinilo, p-isoleuccinilo, p-prolinilo, pfenilalaninilo, p-triptofanilo, p-metioninilo, p-glicinilo, p-serinilo, p-treoninilo, p-cisteinilo, p- tirosinilo, p-asparaginilo, pglutaminilo, p-aspartoilo, p-glutaroilo, p-lisinilo, p-argininilo o p-histidinilo.
Dado que los presentes péptidos se utilizan preferiblemente en terapias o diagnósticos que requieren que los péptidos estén en forma soluble, los péptidos de algunas realizaciones de la invención incluyen preferiblemente uno o más aminoácidos polares naturales o no naturales, que incluyen, pero no se limitan a, serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del péptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.
Como se usa en el presente documento, en una realización, la frase "variantes modificadas de forma conservadora" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. "Variantes de aminoácidos" se refiere a secuencias de aminoácidos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, secuencias esencialmente idénticass o asociadoa (p. ej., naturalmente contiguos). Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican la mayoría de las proteínas. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos los aminoácidos alanina. Por tanto, en cada posición donde un codón especifica una alanina, el codón se puede alterar a otro de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que en ciertos contextos cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido están implícitas en una secuencia descrita con respecto al producto de expresión.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, añade o elimina un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora", que incluye cuando la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. También se puede encontrar orientación sobre qué cambios de aminoácidos es probable que sean fenotípicamente silenciosos en Bowie et al., 1990, Science 247: 1306 1310. Tales variantes modificadas de forma conservadora se suman y no excluyen las variantes polimórficas, los homólogos entre especies y los alelos. Las sustituciones conservadoras típicas incluyen, pero no se limitan a: 1) alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) cisteína (C), metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). Los aminoácidos pueden sustituirse basándose en las propiedades asociadas con las cadenas laterales, por ejemplo, los aminoácidos con cadenas laterales polares pueden sustituirse, por ejemplo, serina (S) y treonina (T); aminoácidos basados en la carga eléctrica de cadenas laterales, por ejemplo, Arginina (R) e Histidina (H); y aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrofóbicas, por ejemplo, Valina (V) y Leucina (L). Como se indica, los cambios son típicamente de naturaleza menor, como las sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad de la proteína.
MODIFICACIONES QUÍMICAS DE PROTEÍNAS
En la presente invención, cualquier parte de una proteína de la invención puede opcionalmente modificarse químicamente, es decir, cambiarse mediante la adición de grupos funcionales. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos laterales que aparecen en la secuencia nativa pueden modificarse opcionalmente, aunque, como se describe a continuación, alternativamente, otras partes de la proteína pueden modificarse opcionalmente, además de o en lugar de los residuos de aminoácidos laterales. La modificación puede realizarse opcionalmente durante la síntesis de la molécula si se sigue un proceso de síntesis química, por ejemplo añadiendo un aminoácido modificado químicamente. Sin embargo, también es posible la modificación química de un aminoácido cuando ya está presente en la molécula (modificación "in situ").
El aminoácido de cualquiera de las regiones de secuencia de la molécula puede modificarse opcionalmente de acuerdo con cualquiera de los siguientes tipos de modificación ilustrativos (en el péptido considerado conceptualmente como "modificado químicamente"). Los tipos de modificación ilustrativos no limitantes incluyen carboximetilación, acilación, fosforilación, glicosilación o acilación grasa. Los enlaces éter se pueden usar opcionalmente para unir el hidroxilo de serina o treonina al hidroxilo de un azúcar. Los enlaces amida se pueden usar opcionalmente para unir los grupos carboxilo de glutamato o aspartato a un grupo amino en un azúcar (Garg y Jeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press (1985); Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308 (1987)). Los enlaces acetal y cetal también se pueden formar opcionalmente entre aminoácidos y carbohidratos. Los derivados de acilo de ácidos grasos se pueden preparar opcionalmente, por ejemplo, por acilación de un grupo amino libre (p. ej., lisina) (Toth et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOm Publ., Leiden, 1078-1079 (1990)).
Como se usa en el presente documento, el término "modificación química", cuando se refiere a una proteína o péptido según la presente invención, se refiere a una proteína o péptido donde al menos uno de sus residuos de aminoácidos se modifica mediante procesos naturales, como procesamiento u otras modificaciones postraduccionales, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos de las numerosas modificaciones conocidas incluyen típicamente, pero no se limitan a: acetilación, acilación, amidación, ADP-ribosilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, metilación, miristilación, pegilación, prenilación, fosforilación, ubiquitinación, o cualquier proceso similar.
Otros tipos de modificaciones incluyen opcionalmente la adición de un resto de cicloalcano a una molécula biológica, tal como una proteína, como se describe en la Solicitud de PCT No. WO 2006/050262.
Estos restos están diseñados para su uso con biomoléculas y pueden usarse opcionalmente para impartir diversas propiedades a las proteínas.
Además, opcionalmente se puede modificar cualquier punto de una proteína. Por ejemplo, la pegilación de un resto de glicosilación en una proteína se puede realizar opcionalmente, como se describe en la Solicitud de PCT No. WO 2006/050247. Se pueden añadir opcionalmente uno o más grupos de polietilenglicol (PEG) a la glicosilación con enlace O y/o enlace N. El grupo PEG puede ser opcionalmente ramificado o lineal. Opcionalmente, se puede unir cualquier tipo de polímero soluble en agua a un sitio de glicosilación en una proteína a través de un enlazador de glicosilo.
Por "proteína PEGilada" se entiende una proteína, o un fragmento de la misma que tiene actividad biológica, que tiene un resto de polietilenglicol (PEG) unido covalentemente a un residuo de aminoácido de la proteína.
Por "polietilenglicol" o "PEG" se entiende un compuesto de polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivatización con restos de acoplamiento o activación (p. ej., con tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano, o preferiblemente con unresto maleimida). Los compuestos tales como maleimido monometoxi PEG son ejemplos de compuestos de PEG activados de la invención. En la presente invención pueden usarse otros compuestos de polialquilenglicol, tales como polipropilenglicol. Otros compuestos de polialquilenglicol apropiados incluyen, pero no se limitan a, polímeros cargados o neutros de los siguientes tipos: dextrano, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidratos, polímeros de aminoácidos y derivados de biotina.
MODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE GLICOSILACIÓN ALTERADA
Las proteínas de la invención pueden modificarse para tener un patrón de glicosilación alterado (es decir, alterado del patrón de glicosilación original o nativo). Como se usa en el presente documento, "alterado" significa tener uno o más restos de carbohidrato eliminados y/o tener al menos un sitio de glicosilación añadido a la proteína original.
La glicosilación de proteínas está típicamente enlazada a N o enlazada a O. Enlazado a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación enlazada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación a las proteínas de la invención se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de la proteína de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación enlazados a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia de la proteína original (para sitios de glicosilación enlazados a O). La secuencia de aminoácidos de la proteína también puede alterarse introduciendo cambios a nivel del ADN.
Otro medio de aumentar el número de restos de carbohidrato en las proteínas es mediante el acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos a los residuos de aminoácidos de la proteína. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en los documentos WO 87/05330, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306 (1981).
La eliminación de cualquier resto carbohidrato presente en las proteínas de la invención se puede realizar químicamente, enzimáticamente o introduciendo cambios a nivel del ADN. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al ácido trifluorometanosulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacta la secuencia de aminoácidos.
La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al., Arq. Bioquímica Biophys., 259: 52 (1987); y Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). La escisión enzimática de los restos de carbohidratos en las proteínas se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo y exoglucosidasas, como se describe en Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Las composiciones (p. ej., proteína de fusión SRIPa-4-1BBL, polinucleótido que codifica la misma, constructo de ácido nucleico que codifica la misma y/o células) de algunas realizaciones de la invención se pueden administrar a un organismo per se, o en una composición farmacéutica donde se mezcla con vehículos o excipientes adecuados.
La presente invención, en algunas realizaciones, presenta una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con la presente invención, el agente terapéutico podría ser un polipéptido como se describe en este documento. La composición farmacéutica según la presente invención se usa además para el tratamiento del cáncer o de un trastorno relacionado con el sistema inmunitario como se describe en el presente documento. Los agentes terapéuticos de la presente invención se pueden proporcionar al sujeto solos o como parte de una composición farmacéutica donde se mezclan con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los principios activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En el presente documento, el término "principio activo" se refiere a la composición (p. ej., proteína de fusión SIRPa-4-1BBL, polinucleótido, constructo de ácido nucleico y/o células descritas en el presente documento) responsable del efecto biológico.
En el presente documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un principio activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
De aquí en adelante, las frases "vehículo fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable" que pueden usarse indistintamente se refieren a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Bajo estas frases se incluye un adyuvante.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, un polipéptido, un polinucleótido, un constructo de ácido nucleico y/o una célula como se describe en el presente documento, puede incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, p. ej., Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Science 66: 1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácido incluyen aqueALLs derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fósforo y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina. , etilendiamina, procaína y similares.
Una composición farmacéutica de acuerdo con al menos algunas realizaciones de la presente invención también puede incluir antioxidantes farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Una composición farmacéutica de acuerdo con al menos algunas realizaciones de la presente invención también puede incluir aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (p. ej., TWEEN 20 (polisorbato-20), TWEEN 80 (polisorbato-80)) y conservantes (p. ej., timersol, bencil alcohol) y sustancias de carga (p. ej., lactosa, manitol).
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de acuerdo con al menos algunas realizaciones de la presente invención incluyen agua, solución salina tamponada de varios contenidos de tampón (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, como oleato de etilo.
La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar mediante procedimientos de esterilización, mencionados anteriormente, y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tal como el monoestearato de aluminio y la gelatina.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas según al menos algunas realizaciones de la presente invención. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos complementarios.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los principios enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás principios requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier principio adicional deseado a partir de una disolución previamente filtrada en condiciones estériles.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los principios enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás principios requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier principio adicional deseado a partir de unadi solución previamente filtrada en condiciones estériles.
La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una única forma de dosificación generalmente será la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, del cien por ciento, esta cantidad oscilará entre aproximadamente el 0,01 por ciento y aproximadamente el noventa y nueve por ciento del principio activo, preferiblemente entre aproximadamente el 0,1 por ciento y aproximadamente el 70 por ciento, más preferiblemente entre aproximadamente el 1 por ciento y aproximadamente el 30 por ciento de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación de acuerdo con al menos algunas realizaciones de la presente invención están dictadas y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de preparar un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en " Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Las composiciones farmacéuticas de algunas realizaciones de la invención pueden fabricarse mediante procesos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Una composición de la presente invención se puede administrar a través de una o más vías de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías preferidas de administración para agentes terapéuticos según al menos algunas realizaciones de la presente invención incluyen administración intravascular (p. ej., inyección o infusión), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal, oral, enteral, rectal, pulmonar (p. ej., inhalación) , nasal, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), intravesical, intravítrea, intraperitoneal, vaginal, cerebro (p. ej., intracerebroventricular, intracerebral y difusión mejorada por convección), administración del SNC (p. ej., intratecal, periespinal e intra- espinal) o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) e intradérmica), transdérmica (ya sea de forma pasiva o usando iontoforesis o electroporación), transmucosa (p. ej., administración sublingual, nasal, vaginal, rectal o sublingual), administración o administración a través de un implante, u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, u otros r rutas de envía y/o formas de administración conocidas en la técnica. La frase "administración parenteral", tal como se usa en el presente documento, significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluye, entre otros, intravenoso, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitario, intracardíaco, intradérmico, intraperitoneal, transtraqueal, inyección e infusión subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal o utilizando insertos bioerosionables, y pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración. En una realización específica, una proteína, un agente terapéutico o una composición farmacéutica según al menos algunas realizaciones de la presente invención pueden administrarse por vía intraperitoneal o intravenosa.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse a los pulmones mientras se inhala y atravesar el revestimiento epitelial del pulmón hasta el torrente sanguíneo cuando se administran como un aerosol o como partículas secadas por atomización que tienen un diámetro aerodinámico de menos de aproximadamente 5 micrómetros. Se puede utilizar un amplio intervalo de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, que incluyen, pero no se limitan a, nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles son el nebulizador Ultravent (Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.); el nebulizador Acorn II (Marquest Medical Products, Englewood, Colorado); el inhalador de dosis medida Ventolin (Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.); y el inhalador de polvo Spinhaler (Fisons Corp., Bedford, Mass). Nektar, Alkermes y Mannkind tienen preparaciones de polvo de insulina inhalable aprobadas o en ensayos clínicos donde la tecnología podría aplicarse a las formulaciones descritas en el presente documento.
En algunos enfoques in vivo, las composiciones descritas en el presente documento se administran a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una dosificación suficiente para tratar, inhibir o aliviar uno o más síntomas del trastorno que se está tratando o para proporcionar un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. La dosificación precisa variará de acuerdo con una variedad de factores tales como variables dependientes del sujeto (p. ej., edad, salud del sistema inmunológico, etc.), la enfermedad y el tratamiento que se está realizando. Para las composiciones polipeptídicas descritas en el presente documento, los constructos de polinucleótidos y ácidos nucleicos que las codifican y las células descritas en el presente documento, a medida que se realicen más estudios, surgirá información sobre los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes, y el trabajador calificado común, teniendo en cuenta el contexto terapéutico, la edad y el estado de salud general del receptor, se podrá determinar la dosificación adecuada. La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento deseado. Para composiciones polipeptídicas, generalmente se administran a mamíferos niveles de dosificación de 0,0001 a 100 mg/kg de peso corporal al día y más habitualmente de 0,001 a 20 mg/kg. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración 5 veces por semana, 4 veces por semana, 3 veces por semana, 2 veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada 3 a 6 meses. Generalmente, para inyección o infusión intravenosa, la dosis puede ser más baja. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación de acuerdo con al menos algunas realizaciones de la presente invención están dictadas y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de preparar un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Opcionalmente, la formulación polipeptídica se puede administrar en una cantidad entre 0,0001 y 100 mg/kg de peso del paciente/día, preferiblemente entre 0,001 y 20,0 mg/kg/día, según cualquier régimen de tiempo adecuado. Una composición terapéutica de acuerdo con al menos algunas realizaciones según al menos algunas realizaciones de la presente invención se puede administrar, por ejemplo, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana o una vez a la semana, una vez cada dos semanas o 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas. Además, la composición se puede administrar durante un período de tiempo corto o largo (por ejemplo, 1 semana, 1 mes, 1 año, 5 años).
Alternativamente, el agente terapéutico tal como las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían según la vida media del agente terapéutico en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más prolongada, seguidos de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La vida media de las proteínas de fusión puede variar ampliamente. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración en particular, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración de la tratamiento, otras drogas, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las artes médicas.
Una "dosis terapéuticamente eficaz" de un polipéptido como se describe en el presente documento da como resultado preferentemente una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, un aumento de la esperanza de vida, la remisión de la enfermedad o la prevención o reducción de deficiencia o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad.
Un experto en la materia podría determinar una cantidad terapéuticamente eficaz, especialmente a la luz de la descripción detallada que se proporciona en el presente documento, en función de factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición o vía particular de administración seleccionada.
En ciertas realizaciones, las composiciones de polipéptido, polinucleótido, constructo de ácido nucleico o células se administran localmente, por ejemplo mediante inyección directamente en un sitio a tratar. Típicamente, la inyección provoca un aumento de la concentración localizada de las composiciones de polipéptido, polinucleótido, constructo de ácido nucleico o células que es mayor que la que se puede lograr mediante la administración sistémica. Las composiciones polipeptídicas se pueden combinar con una matriz como se describe anteriormente para ayudar a crear una concentración localizada aumentada de las composiciones polipeptídicas al reducir la difusión pasiva de los polipéptidos fuera del sitio a tratar.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización opcional, una composición farmacéutica de acuerdo con al menos algunas realizaciones de la presente invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica con agujas, tales como los dispositivos descritos en la Pat. de EE.UU. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: U la Pat. de EE.UU. No. 4,487,603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a un ritmo controlado; U.S. Pat. No. 4,486,194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Pat. de EE.UU. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la Pat. de EE.UU. No.
4,447,224, que da a conocer un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos; la Pat. de EE.UU. No. 4,439,196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos que tiene compartimentos multicámara; y la Pat. de EE.UU. No. 4,475,196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos.
Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo.
Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización opcional, una composición terapéutica según al menos algunas realizaciones de la presente invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica con agujas, tal como los dispositivos descritos en las Pat. de EE.UU. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: la Pat. de EE.UU. No.
4,487,603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a un ritmo controlado; la Pat. de EE.UU. No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Pat. de EE.UU. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la Pat. de EE.UU. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos; la Pat. de EE.UU. No. 4,439,196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos que tiene compartimentos multicámara; y la Pat. de EE.UU. No. 4,475,196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos.
Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo.
En ciertas realizaciones, para garantizar que los compuestos terapéuticos de acuerdo con al menos algunas realizaciones de la presente invención cruzan la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, p. ej., las Pat. de Ee .UU. Nos. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más restos que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así la administración de fármacos dirigidos (véase, p. ej., V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los restos de direccionamiento ilustrativos incluyen folato o biotina (véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. No. 5,416,016 a Low et al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother.
39:180); receptor de la proteína A del tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem.269:9090); véase también K. Keinanen; ML Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; JJ Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
FORMULACIONES PARA ADMINISTRACIÓN PARENTERAL
En una realización adicional, las composiciones descritas en el presente documento, incluyendo las que contienen péptidos y polipéptidos, se administran en una disolución acuosa mediante inyección parenteral. La formulación también puede estar en forma de suspensión o emulsión. En general, las composiciones farmacéuticas se describen que incluyen cantidades eficaces de un péptido o polipéptido, polinucleótido, constructo de ácido nucleico o células descritas en el presente documento, y opcionalmente incluyen diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen opcionalmente uno o más para lo siguiente: diluyentes, agua estéril, disolución salina tamponada con diversos contenidos de tampón (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; y aditivos como detergentes y agentes solubilizantes (p. ej., TWEEN 20 (polisorbato-20), TWEEN 80 (polisorbato-80)), antioxidantes (p. ej., antioxidantes solubles en agua tal como ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio , metabisulfito de sodio, sulfito de sodio; antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y agentes quelantes de metales, como ácido cítrico, etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico) y conservantes (p. ej., timersol, alcohol bencílico) y sustancias de carga (p. ej., lactosa, manitol). Ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son el etanol, el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales, como el aceite de oliva y el aceite de maíz, la gelatina y los ésteres orgánicos inyectables, tal como el oleato de etilo. Las formulaciones se pueden liofilizar (liofilizar) o secar al vacío y volver a disolver/resuspender inmediatamente antes de su uso. La formulación puede esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando las composiciones o calentando las composiciones.
FORMULACIONES PARA ADMINISTRACIÓN TÓPICA
Varias composiciones (p. ej., polipéptidos) descritas en el presente documento se pueden aplicar por vía tópica. La administración tópica no funciona bien para la mayoría de las formulaciones de péptidos, aunque puede ser eficaz especialmente si se aplica a los pulmones, la mucosa nasal, oral (sublingual, bucal), vaginal o rectal.
Las composiciones pueden administrarse a los pulmones mientras se inhalan y atravesar el revestimiento epitelial del pulmón hasta el torrente sanguíneo cuando se administran como un aerosol o como partículas secadas por pulverización que tienen un diámetro aerodinámico de menos de aproximadamente 5 micrómetros.
Se puede utilizar una amplio rango de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a, nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles son el nebulizador Ultravent (Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.); el nebulizador Acorn II (Marquest Medical Products, Englewood, Colorado); el inhalador de dosis medida Ventolin (Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.); y el inhalador de polvo Spinhaler (Fisons Corp., Bedford, Mass). Nektar, Alkermes y Mannkind tienen preparaciones de polvo de insulina inhalable aprobadas o en ensayos clínicos donde la tecnología podría aplicarse a las formulaciones descritas en este documento.
Las formulaciones para la administración a la mucosa serán típicamente partículas de fármaco secadas por pulverización, que pueden incorporarse en una tableta, gel, cápsula, suspensión o emulsión. Los excipientes farmacéuticos estándar están disponibles de cualquier formulador. Las formulaciones orales pueden estar en forma de goma de mascar, tiras de gel, tabletas o pastiALLs.
También se pueden preparar formulaciones transdérmicas. Típicamente, estos serán ungüentos, lociones, aerosoles o parches, todos los cuales se pueden preparar utilizando tecnología estándar. Las formulaciones transdérmicas requerirán la inclusión de potenciadores de la penetración.
MATRICES POLIMÉRICAS DE ENVÍAADMINISTRACIÓN CONTROLADA
Varias composiciones (p. ej., polipéptidos) descritas en el presente documento también pueden administrarse en formulaciones de liberación controlada. Los dispositivos poliméricos de liberación controlada pueden fabricarse para una liberación sistémica a largo plazo después de la implantación de un dispositivo polimérico (varilla, cilindro, película, disco) o inyección (micropartículas). La matriz puede estar en forma de micropartículas tales como microesferas, donde los péptidos están dispersos dentro de una matriz polimérica sólida o microcápsulas, donde el núcleo es de un material diferente al de la cubierta polimérica, y el péptido está disperso o suspendido en el núcleo, lo que puede ser de naturaleza líquida o sólida. A menos que se defina específicamente en el presente documento, las micropartículas, las microesferas y las microcápsulas se usan indistintamente. Alternativamente, el polímero se puede moldear como una losa o película delgada, que varía de nanómetros a cuatro centímetros, un polvo producido por molienda u otras técnicas estándar, o incluso un gel como un hidrogel.
Pueden usarse matrices no biodegradables o biodegradables para la administración de polipéptidos o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, aunque se prefieren las matrices biodegradables. Estos pueden ser polímeros naturales o sintéticos, aunque se prefieren los polímeros sintéticos debido a la mejor caracterización de los perfiles de degradación y liberación. El polímero se selecciona en base al período durante el cual se desea la liberación. En algunos casos, la liberación lineal puede ser más útil, aunque en otros, una liberación de pulso o "liberación en masa" puede proporcionar resultados más efectivos. El polímero puede estar en forma de hidrogel (típicamente absorbiendo hasta aproximadamente el 90% en peso de agua), y opcionalmente puede estar entrecruzado con iones o polímeros multivalentes.
Las matrices se pueden formar por evaporación de disolventes, secado por atomización, extracción de disolventes y otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las microesferas bioerosionables se pueden preparar utilizando cualquiera de los métodos desarroALLdos para fabricar microesferas para la administración de fármacos, por ejemplo, como se describe en Mathiowitz y Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987); y Mathiowitz, et al., J. Appl Polymer ScL, 35:755-774 (1988).
Los dispositivos se pueden formular para liberación local para tratar el área de implantación o inyección - que típicamente administrará una dosis que es mucho menor que la dosis para el tratamiento de todo el cuerpo - o administración sistémica. Estos pueden implantarse o inyectarse por vía subcutánea, en el músculo, la grasa o tragarse.
Las composiciones de algunas realizaciones de la invención pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el principio activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, tal como un paquete de burbujas. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración. El paquete o dispensador también puede incluir un aviso asociado con el recipiente en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o o administración veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser una marcador aprobada por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. para fármacos recetados o un inserto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un vehículo farmacéutico compatible también se pueden preparar, colocar en un recipiente apropiado y marcar para el tratamiento de una condición indicada, como se detaALL más arriba.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye, pero no se limita a".
El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".
El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir principios, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los principios, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas del producto reivindicado. composición, método o estructura.
Como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo las mezclas de los mismos.
A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias realizaciones de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha revelado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo como del 1 al 6 tiene subintervalos revelados específicamente como del 1 al 3, del 1 al 4, del 1 al 5, del 2 al 4, del 2 al 6, del 3 al 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccional o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases " intervalo / intervalo entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y " intervalo / intervalo desde" un primer número indicado "a" un segundo número indicado se usan indistintamente en el presente documento y pretenden incluir el primer y el segundo número indicado y todos los números fraccionarios e enteros entre ellos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos conocidos o desarroALLdos fácilmente a partir de formas, medios, técnicas y procedimientos por profesionales de las artes químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.
Cuando se hace referencia a listados de secuencias particulares, se debe entender que dicha referencia también abarca secuencias que corresponden sustancialmente a su secuencia complementaria, incluidas variaciones menores de secuencia, resultantes, p. ej., de errores de secuenciación, errores de clonación u otras alteraciones que resultan en la sustitución de bases. , eliminación de base o adición de base, siempre que la frecuencia de tales variaciones sea inferior a 1 en 50 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 100 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 200 nucleótidos, alternativamente, inferior a 1 en 500 nucleótidos, alternativamente , menos de 1 en 1000 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 en 5000 nucleótidos, alternativamente, menos de 1 en 10000 nucleótidos.
EJEMPLOS
Experimentos de prueba de concepto (POC)
Fabricación de un SIRPa-4-1BBL marcado con His
Para el análisis POC inicial, se produce una proteína marcada con histidina. Una secuencia de ADNc, que codifica un SRPa-4-1BBL marcado con 6-His, se subclona en un vector de expresión de mamífero. La preparación de plásmidos de grado de transfección se utiliza para la transfección de plásmidos en células Expi293 u otras líneas celulares. Se evalúa la producción de SIRPa-4-1BBL en el sobrenadante de las células que expresan Expi293 (escala de 100 ml) mediante SDS-PAGE reducida y no reducida y transferencia Western (WB) con un anticuerpo anti-His. A continuación, SIRPa-4-1BBL marcado con His se purifica a partir de un sobrenadante positivo mediante una purificación basada en afinidad de una etapa (esferas de níquel). La producción de la proteína quimera marcada se verifica mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western usando anticuerpos específicos contra cada dominio de la molécula (es decir, el dominio extracelular de SIRPa y 4-1BBL).
Experimento 1A - producción de una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL marcada con His
La producción de la proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) se efectuó en células Expi293F transfectadas con un vector de expresión pcDNA3.4 clonado con la secuencia codificante de la proteína de fusión completa. La secuencia se clonó en el vector usando enzimas de restricción EcoRI y HindIII, con adición de secuencia Kozak, péptido señal artificial y marcada con 6 His en el extremo N terminal y un codón de parada en el extremo C terminal (SEQ ID NO: 15).
La proteína se recogió del sobrenadante del cultivo celular y se purificó mediante una purificación de una sola etapa mediante la columna HisTrap™ FF Crude.
Experimento 1B — La proteína de fusión SIRPa-4-1BBL producida contiene ambos dominios
Materiales — SIRPa-4-1 BBL marcado con His, proteína (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior, marcador de proteína: Spectra BR (Thermo Fisher Scientific, cat# 26634), anti-SIRPa (SHPS1) (Señalización celular, cat# 13379), anti-4-1BBL (BioVision, 5369-100), mAb anti-His de ratón (GenScript, cat# A00186), conjugado secundario de cabra anti-conejo IgG (H L)-Hr P (1:3333) (R&D, cat# 170-6515), hSIRPa recombinante 0,1 mg/ml (4546-SA-050) R&D, Tampón de eliminación de señalización celular h4-1BBL recombinante (TNFSF9) 0,1 mg/ml (8460 LF) (Thermoscientific, cat# 21059), mezcla de desglicosilación de proteínas: (NEB p6044).
Métodos - Las proteínas (250 ng por carril) se trataron en condiciones desnaturalizantes o no desnaturalizantes (en tampón de muestra que contenía p-mercaptoetanol y se hirvió durante 5 minutos a 95 °C, o en tampón de muestra sin p-mercaptoetanol sin calentar, respectivamente) y se separaron. en gel SDS-PAGE al 12%, seguido de transferencia Western. El tratamiento de desglicosilación se efectuó mediante la enzima PNGasa F de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la mezcla de desglicosilación de proteínas.
Resultados - Análisis de transferencia Western de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) separado en un SDS-PAGE bajo condiciones desnaturalizantes seguido de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-His-tag (FIG.
1) o un anticuerpo anti-4-1 BBL (FIG. 2A) demostró que tanto el lado N-terminal de la molécula como el lado C-terminal de la molécula están presentes. Aunque el peso molecular predicho de la proteína según su secuencia de aminoácidos es de aproximadamente 60 kDa, la proteína migró en condiciones de desnaturalización con un tamaño de aproximadamente 85 kDa. Se encontró que este cambio estaba relacionado con la glicosilación de la proteína, según lo determinado por el tratamiento de la proteína con la enzima PNGasa F que elimina casi todos los oligosacáridos unidos a N de las glicoproteínas. Tras el tratamiento, se observó una banda mayoritaria de alrededor de 60 kDa (FIG.
2C).
Cuando se separó en una SDS-PAGE bajo condiciones no desnaturalizantes (FIG. 1 y 2B), se detectó SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) con el mismo peso molecular que en las condiciones desnaturalizantes (FIGs .1,2A y 2B). También se detectaron bandas adicionales de mayor peso molecular, que eran más fuertes en condiciones no desnaturalizantes en comparación con las condiciones desnaturalizantes. Esto podría sugerir la formación de un multímero, probablemente un trímero según el tamaño del multímero y el hecho de que la proteína 4-1BBL tiende naturalmente a formar trímeros ((Eun-Young et al, 2010, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 285, NO. 12, pp. 9202-9210).
Experimento 1C - análisis de unión de los restos SIRPa y 4-1BBL de la quimera a CD47 y 4-1BB
La unión del dominio SIRPa de la molécula a CD47 y la unión del dominio 41BBL de la molécula a 4-1BB se determinó mediante el ensayo Blitz® de interferometría de biocapa.
Materiales - CD47:FC (Sino Biological, cat# 12283-H02H), 41BB:FC (Sino Biological, cat# 10041-H03H), proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior; Proteína PD1-CD70 (SEQ ID NO: 6, como control negativo).
Métodos y resultados - El biosensor estaba precargado con CD47:Fc, lo que condujo a una meseta de asociación estable (FlG. 3A). Tras la incubación posterior con SIRPa-4-1BBL marcado con his (SEQ ID NO: 5) se detectó una asociación rápida del SIRPa-4-1BBL marcado con his con CD47:Fc (FIG. 3A). Una incubación similar con la proteína de control PD1-CD70 (compuesta por un dominio PD-1 fusionado con CD70, SEQ ID NO: 6), no condujo a ninguna unión a CD47:Fc (FIG. 3A). Además, cuando el biosensor no estaba precargado con CD47:Fc, el SIRPa-4-1BBL marcado con his no se asociaba (FIG. 3A, línea inferior). Al alcanzar una meseta de asociación estable, el biosensor se lavó con medio para determinar la tasa de separación del SIRPa-4-1BBL marcado con his de CD47:Fc. La disociación del SIRPa-4-1BBL marcado con his del biosensor cargado con CD47:Fc fue muy lenta, lo que sugiere una interacción estable de SIRPa con CD47.
Tras una carga similar del biosensor con 4-1BB:Fc, se evaluó la unión de la unidad 4-1BBL de SIRPa-4-1BBL marcada con his (SEQ ID NO: 5) (FIG. 3B). Al igual que con el dominio SIRPa, el dominio 4-1BBL del SIRPa-4-1BBL marcado con his se unió rápidamente a su receptor objetivo (FIG. 3B), siendo también la tasa de desconexión para la interacción 4-1BBL/4-1BB. muy lento, como se desprende de la disociación limitada que se produce durante la última fase de disociación. El tratamiento de control con un PD1-CD70 (SEQ ID NO: 6), que carece del dominio 4-1BBL, no dio como resultado ninguna unión detectable a 4-1BBL:Fc (FIG. 3B). Además, en ausencia de precarga con 4-1BB:Fc, SIRPa-4-1BBL marcado con His no se unió de manera detectable al biosensor (FIG. 3B, línea inferior).
En conjunto, ambos dominios de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) conservan la actividad de unión funcional para sus receptores afines.
Identificación del experimento — Análisis de unión de los restos SIRPa y 4-1BBL de la quimera a CD47
La unión del dominio SIRPa de la molécula a CD47 humano se evalúa utilizando células HT1080 o células CHO-K1 u otra línea celular que sobreexpresa CD47 o con una línea celular cancerosa que se sabe que expresa CD47 a niveles elevados. Las células knock-out de CD47 sirven como control negativo. Las células se tiñen con diferentes concentraciones de SIRPa-4-1BBL marcado con His y después con un anticuerpo secundario anti 4-1BBL. La unión se analiza mediante citometría de flujo utilizando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). El uso de diferentes concentraciones de la quimera permite determinar la afinidad de la molécula por el CD47. En esta prueba de unión, también se utiliza un SIRPa recombinante como competidor del SIRPa-4-1 BBL para verificar la especificidad de la unión. Los anticuerpos que bloquean la interacción entre SIRPa y CD47 también pueden usarse para el mismo propósito.
La unión del resto 4-1 BBL de la quimera al 4-1 BB humano se prueba usando células HT1080 u otra línea celular que sobreexpresa 4-1BB. Las células se tiñen con diferentes concentraciones de SIRPa-4-1BBL y después con un anticuerpo anti SIRPa secundario, y la afinidad de unión se analiza mediante FACS. En esta prueba de unión, se utiliza un 41BBL recombinante como competidor del SIRPa-4-1BBL para verificar la especificidad de la unión. Los anticuerpos que bloquean la interacción entre 4-1 BB y 4-1 BBL también se pueden usar para el mismo propósito.
Materiales - Proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior; líneas celulares CHO-WT y CHO-CD47 (Bommel et al, 2017), tinte de viabilidad fijable (BD Biosciences, cat# cat#562247), bloqueador de Fc humano, Truestain FCX (Biolegend, cat# cat#422302) y los siguientes anticuerpos:
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Métodos - Para los ensayos de expresión, las células (0,5 M células/muestra) se ¡nmunotiñeron con los anticuerpos indicados, seguido de un análisis de citometría de flujo. Para los ensayos de unión, las células se preincubaron con bloqueador Fc humano antes de la incubación con diferentes concentraciones (0,01 - 50 pg/ml) de la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) durante 30 minutos en hielo, seguida de inmunotinción con anticuerpos contra el brazo "libre" de la molécula (4-1BBL), fijación y análisis por citometría de flujo.
Resultados — Como se muestra en las FIGs. 4A-B, las células CHO-K1-WT no expresan CD47 ni 4-1BB; mientras que las células CHO-K1-CD47 expresan CD47 pero no expresan 4-1BB.
Los ensayos de unión mostraron que SIRPa-4-1 BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) se une a las células CHO-CD47 de manera dependiente de la dosis, mientras que no se une a las células CHO-WT (Figuras 5A-B).
En conjunto, el terminal N de la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) puede unirse a CD47 sobreexpresado en la superficie de las células.
Experimento 2 — Activación del receptor 4-1BB por la quimera
El efecto de activación del receptor 4-1BB por parte del SIRPa-4-1BBL marcado con His se prueba usando células HT1080 u otra línea celular que sobreexpresa el receptor 4-1BB. Específicamente, la línea celular HT1080-4-1BB sobreexpresa 4-1BB y se conoce que secreta IL-8 tras la unión de 4-1BBL (Wyzgol, et al, 2009, The Journal of Immunology). Tras la unión de 4-1BBL al receptor 4-1BB en la superficie de estas células, se activa una vía de señalización que da como resultado la secreción de IL8. Las células se incuban en presencia de SIRPa-4-1BBL marcado con His en diferentes concentraciones y la secreción de IL8 al medio de cultivo se determina mediante ELISA. La oligomerización se prueba mediante la adición de anticuerpos de entrecruzamiento anti-His-tag en diferentes concentraciones. Con la adición del anti-His-tag Ab, las moléculas quiméricas se entrecruzarán y formarán oligómeros, lo que resultará en una mayor secreción de IL8. El anticuerpo anti SIRPa también se puede usar para el mismo propósito (reticulación del resto SIRPa de la molécula).
La oligomerización también se analiza mediante el cocultivo de células que sobreexpresan el receptor 4-1BB con células HT1080 que sobreexpresan CD47 humano o con líneas de células cancerosas que expresan en gran medida CD47. El SIRPa-4-1BBL se une al CD47 que se expresa en el HT1080 o en las células cancerosas y el resto 4-1BBL se presenta al HT1080 que sobreexpresa el receptor 4-1BB. Debido a esta presentación de varias moléculas en estrecha vecindad, se cumple el requisito de oligomerización.
La activación del receptor 4-1BBL por SIRPa-4-1BBL marcado con His puede compararse con la de sus partes, a saber, SIRPa recombinante o 4-1BBL solos o en combinación.
Materiales - Proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior, células HT1080-4-1BB (Lang et al 2015), kit ELISA IL-8 (cat# D8000C, R&D), DMEM (cat#cat# 01-055-1A, industrias biológicas), FBS (cat# cat#10270106, renio), AIM V (medio sin suero) (ThermoScientific).
Métodos - Se incubaron células HT1080-4-1BB (5000 por pocillo) durante 24 horas con diferentes concentraciones de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5). La concentración de IL-8 en el sobrenadante se determinó mediante el kit ELISA de IL-8 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usó medio sin suero para algunos de los experimentos para eliminar el fondo relativamente alto que se detectó usando medio con FBS.
Resultados - Varios experimentos independientes mostraron la funcionalidad de SIRPa-4-1BBL: la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) pudo desencadenar la señalización de TNFR según lo determinado por la secreción de IL8 por las células HT1080-4-1BBL, en de manera dependiente de la dosis tanto en medio que contiene FBS (FIG. 6) como en medio sin suero (FIG. 7).
Experimento 3 — Activación de células T por SIRPa-4-1BBL
El efecto de SIRPa-4-1BBL sobre la activación de las células T se prueba usando células T en PBMC de donantes sanos humanos o usando TIL humanos. Las células T se cocultivan primero con células cancerosas de carcinoma humano y se tratan con anticuerpos biespecíficos anti CD3 y anti Epcam1 para inducir la activación de las células T y después con SIRPa-4-1BBL. El anticuerpo anti CD3/Epcam1 está enviando la primera señal para la activación de las células T contra las células cancerosas que expresan Epcam1. La molécula SlRPa-4-1BBL interactúa con el CD47 expresado en la superficie de las células cancerosas, esta interacción facilita la presentación y la oligomerización de la molécula y, por lo tanto, permite la interacción del resto 4-1BBL con el receptor 4-1BB en la célula T y envía de una segunda señal coestimuladora a la célula T. El nivel de activación de las células T se determina midiendo varios parámetros; En primer lugar, probando la expresión de marcadores de activación en la superficie de las células T (por ejemplo: CD25, CD69, CD62L, CD137, CD107a, PD1, etc.). La expresión de los marcadores de activación se prueba tiñendo las células con anticuerpos específicos y análisis de citometría de flujo (FACS). Una segunda forma de determinar la activación de las células T es midiendo la secreción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo: IL2, IL6, IL8, INF gamma, etc.). La secreción de citocinas inflamatorias se analiza mediante ELISA. La proliferación de células T se mide mediante la tinción previa de las células T con CFSE (éster de succinimidil carboxifluoresceína) y determinando la desviación de las células mediante la dilución de CFSE que se determina mediante FACS. Un parámetro adicional que se prueba es la destrucción de las células cancerosas que se mide marcando previamente las células cancerosas usando el reactivo Calcine-AM y midiendo la liberación de Calcine en el medio de cultivo usando un lector de placas de luminiscencia.
El efecto de SIRPa-4-1BBL sobre la activación de TIL se prueba en TIL que se extraen de tumores y después se cocultivan con las células cancerosas tumorales y se tratan con SIRPa-4-1BBL. La primera señal para la activación de las células T la envían las células cancerosas a través de la vía MHC clase I: péptido — TCR (receptor de células T). La proteína de fusión SIRPa-4-1BBL interactúa con el CD47 expresado en la superficie de las células tumorales, esta interacción facilita la presentación y la oligomerización de la molécula y, en consecuencia, permite la interacción del resto 4-1BBL con el receptor 4-1BB en el T célula y envía de una segunda señal coestimuladora a la célula T. El nivel de activación de los TIL y la destrucción de células tumorales se determina de la misma manera que se ha descrito (marcadores de activación, secreción de citoquinas, proliferación y destrucción de células tumorales).
La activación de las células T por His-SIRPa-41BBL se puede comparar con la de sus partes, denominada, SIRPa recombinante o 4-1BBL solos o en combinación.
Experimento 3A - la proteína SIRPa-4-1BBL demuestra actividad coestimuladora de células T
Materiales - Proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior; HT1080-4-1BB, líneas celulares CHO-WT, CHO-K1-CD47 y DLD1 (Bommel et al 2017, Lang et al 2015, ATCC-CCL-221), células T humanas recién aisladas, kit IL8 Elisa (R&D systems, cat# cat#DY208), CD47:FC (Sino Biological, cat# cat#12283-H02H), esferas de activación anti-CD3/anti-CD28 (Life Technologies, cat# cat#11131D), anticuerpo anti CD25 (Immuno Tools, cat# cat#21270256), Lymphoprep (Stemcell, 07851) Nombre: Microesferas CD14 , humano (miltenyi Biotec, 130-050-201).
Métodos y resultados - Tras el tratamiento de cultivos individuales de células HT1080 transducidas con 4-1BB (HT1080-4-1BB) con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5), se detectó una producción mínima de IL-8 después de 24 horas de incubación (Figura 8A). De manera similar, el tratamiento con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) indujo mínimamente la secreción de IL-8 cuando las células HT1080-4-1BB se mezclaron con células CHO de tipo salvaje (Figura 8A). Sin embargo, el tratamiento con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) de cultivos mixtos de Ht 1080-4-1b B con CHO-CD47 (permitiendo que el dominio SIRPa se una a CHO-CD47 y presente 4- 1 BBL a HT1080-4-1 BB), desencadenó un fuerte aumento en la secreción de IL-8 que alcanzó un máximo de 2000 pg/mL (FIG. 8B). Por lo tanto, la unión de la proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) a CD47 es beneficiosa para estimular la secreción de IL-8 tras la interacción 4-1BBL/4-1BB.
A continuación, se evaluó la inducción potencial de activación de células T por el dominio 4-1BBL de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5). Las PBMC se aislaron de la sangre de donantes sanos con Lymphoprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después, las células se tiñeron con Microesferas CD14 y las células T se aislaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el sistema de clasificación MACS. Con este fin, se añadieron células T recién aisladas a placas recubiertas con CD47-Fc y se activaron con concentraciones subóptimas de esferas de activación anti-CD3/anti-CD28 durante 3 días. Tras el tratamiento, se detectó un claro aumento en el porcentaje de células T CD25+ activadas en las células tratadas con SIRPa-4-1 BBL marcadas con His (FIG. 8C), con una inducción óptima a ~2,5 pg/ml. En cultivos mixtos posteriores de células DLD-1 y células T, el tratamiento con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) aumentó el porcentaje de células T CD25+ (FIGs. 8C-E), lo que indica que la proteína SIRPa-4-1BBL puede activar las células T. Por tanto, la unión de la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) a CD47 permite la coestimulación y activación de células T mediada por 4-1BBL/4-1BB.
En conjunto, estos datos proporcionan una clara evidencia de que tras la unión mediada por CD47, la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) gana actividad coestimuladora mediada por 4-1BBL que puede aumentar la activación de las células T.
Experimento 3B - La proteína SIRPa-4-1BBL aumenta la activación de las PBMC humanas
Materiales - Proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior; Kit ELISA INF-y [cat# 900-TM27, cat# 900-T00 — Kit Tampón Elisa (TMB)], RPMI (cat# 01-100-1A, industrias biológicas), FBS (cat# 12657-029, Gibco) , L-Glutamina (cat# 25030-24, Gibco), Pen/Strep (cat# 15140-122, Gibco), CD3 antihumano purificado en hojas (cat# BLG-317315, BioLegend), IL2 humana recombinante (cat# 202) -IL-500, R&D Systems), células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) aisladas de sangre periférica de donantes sanos por Ficoll-Paque (cat# 17-1440-03, GE Healthcare), anticuerpo anti-CD47 (cat# MCA2514A647, Biorad ), anticuerpo anti-4-1BBL (cat# 311504, Biolegend), células de leucemia humana MV4-11 (ATCC, Abraham et al 2017).
Métodos - Se analizó la expresión de CD47 en células MV4-11 y la unión de SIRPa-4-1 BBL marcado con His mediante citometría de flujo. Se aislaron PBMC humanas de sangre periférica de donantes sanos mediante el método Ficoll-Paque (Grienvic et al. 2016). A continuación, las PBMC se cultivaron durante 40 horas con la adición de diferentes concentraciones de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5), en presencia de anti-CD3 (30 ng/ml) o anti-CD3 más IL2. (1000 U/ml). El experimento se efectuó con o sin cocultivo con CD47 que expresa la línea celular de cáncer humano MV4-11 (proporción 1:1). La concentración de INF-y en el sobrenadante de las células se determinó mediante el kit ELISA de INF-y de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Resultados - Se sabe que las PBMC humanas, incluyendo las células NK, las células NKT, las células efectoras CD4+ y CD8+, secretan interferón-Y proinflamatorio (INF-y) en respuesta a la activación. La activación de una célula T requiere dos señales: la ligadura del receptor de células T (TCR) con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)/complejo peptídico en la célula presentadora de antígeno (APC) y el entrecruzamiento de los receptores coestimuladores en la Célula T con los ligandos correspondientes en la APC. 4-1BB, es un receptor coestimulador de células T inducido por la unión de 4-1 BBL. 4-1BB transmite una potente señal coestimuladora a las células T CD8+ y CD4+, promoviendo su expansión, supervivencia, diferenciación y expresión de citoquinas. Su ligando, 4-1BBL, es una proteína de membrana que proporciona una señal coestimuladora a las células T.
En este experimento se evaluó la funcionalidad de la molécula SIRPa-4-1BBL para mejorar la activación de las PBMC humanas.
CD47 está presente en la superficie de las células MV4-11 y la proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) se unió a estas células de una manera dependiente de la dosis (Figs. 9A-B). La incubación de células MV4-11 con diferentes concentraciones de proteína SIRpa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) hasta 72 horas no mostró ningún efecto de destrucción directo (FIG. 9C).
La adición de la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) mejoró la activación de las PBMC de una manera dependiente de la dosis, como puede verse por un aumento en la secreción de INF-y por parte de las PBMC que fueron estimuladas con anticuerpo anti-CD3, con o sin la adición de IL2 (FIG. 10A).
El cultivo conjunto de PBMC con la línea celular humana MV4-11 y la estimulación de las células con anticuerpo anti CD3 dio como resultado la secreción de INF-y, probablemente debido a la estimulación directa de las células PBMC por parte de las células MV4-11. El tratamiento con la proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) tuvo un efecto moderado que fue más pronunciado cuando se añadió junto con IL2 (FIG. 10B).
En conjunto, la proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) aumenta la activación de las PBMC humanas, como puede verse por el aumento en la secreción de IFN-y.
Experimento 4 - Efecto de SIRPa-4-1BBL sobre granulocitos y macrófagos
SIRPa es un receptor inhibidor expresado en la superficie celular de p. ej., células fagocíticas. CD47, el ligando de SIRPa, se expresa ampliamente en las células tumorales. Al activar SIRPa por CD47, SIRPa envía una señal de "no me comas" a las células fagocíticas. Mediante la interacción de SIRPa-4-1BBL con CD47, debería bloquear la interacción endógena de CD47 con SIRPa y, por tanto, bloquear la señal de "no me comas", permitiendo que las células fagocíticas absorban las células tumorales.
El efecto de SIRPa-4-1BBL en granulocitos, macrófagos y otras células fagocíticas se prueba in vitro en un ensayo de cocultivo utilizando granulocitos o macrófagos M1 de donantes sanos cocultivados con células cancerosas que expresan CD47 marcadas con fluorescencia. Se añade SIRPa-4-1BBL al cocultivo en diferentes concentraciones y se determina la fagocitosis midiendo la captación de fluorescencia por los granulocitos o macrófagos M1 mediante citometría de flujo. Las células fagocíticas se identifican y distinguen de las células cancerosas mediante la tinción de marcadores de superficie específicos (como CD11b).
El efecto fagocítico en este experimento se puede mejorar utilizando anticuerpos antitumorales terapéuticos (tal como Rituximab, Cetuximab, Trastuzumab, Alemtuzumab, etc.)
Se realiza un experimento similar usando granulocitos autólogos de pacientes con cáncer cocultivados con células malignas autólogas primarias también.
Materiales - Proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior, leucocitos humanos aislados de sangre periférica, líneas de células tumorales: BJAB, U2932, Raji, Sudhl6, DLD1, H292, FADU, OVCR, MOLM13, K562, OCIAML3, HL60 (ATCC), vybrant DiD (Invitrogen, cat# V22887), colorante de proliferación celular V450 (Thermofishr, 65-0842-85), Lymphoprep (tecnología Stemcell, 07851) SIRPa humano recombinante (sinobiológico , 11612-H08H) 4-1BBL humana recombinante (R&D systems, 2295-4L/CF).
Métodos y resultados - Se aislaron leucocitos de sangre periférica de donantes sanos. En resumen, se mezcló sangre completa con PBS que contenía EDTA en una proporción de 1:1 y se mezcló con lymphoprep. Para obtener neutrófilos, se eliminaron las PBMC después de lymphoprep y se recogió el sedimento celular. El sedimento celular se mezcló con tampón de lisis de eritrocitos en una proporción de 1:10 y se incubó a 4 °C durante 30-45 minutos. A continuación, los neutrófilos se recogieron mediante centrifugación a 450 g/5 minutos y se lavaron dos veces con PBS que contenía EDTA. Los leucocitos aislados se mezclaron con células tumorales, que se habían teñido previamente con vybrant DiD, en una proporción de 1:1. La captación de células tumorales por los granulocitos se evaluó posteriormente mediante citometría de flujo (para la estrategia de activación, véase la figura 11A). En tales cultivos mixtos, los granulocitos fagocitan mínimamente las células tumorales en ausencia de cualquier estímulo (FIG. 11A). Sin embargo, cuando se trataron cultivos mixtos de leucocitos y células B-NHL Ramos con una concentración creciente de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5), se detectó una clara inducción de fagocitosis dependiente de la dosis por parte de los granulocitos, con un efecto óptimo logrado a 2,5 pg/ml (Figuras 11A-B). Se detectó una actividad profagocítica similar del tratamiento con agente único con la proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) hacia un panel de líneas celulares de linfoma de células B, lo que produjo un aumento en la fagocitosis del 15% al 20% en comparación con cultivos no tratados (FIG. 11C).
A continuación, los cultivos mixtos se trataron con una combinación de proteína SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) y el anticuerpo anti-CD20 rituximab. Como se muestra en la FIG. 11D, el tratamiento con una concentración baja subóptima de rituximab ya desencadenó la fagocitosis por granulocitos, cuya extensión dependía del donante de leucocitos y la línea celular (FIG. 11D, cuadrados de diamantes blancos). Sin embargo, el tratamiento combinado con rituximab yla proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) aumentó aún más la captación fagocítica de todas las líneas celulares B-NHL analizadas (Figura 11D, cuadrados de diamante negro).
Para determinar si la combinación de SIRPa-4-1 BBL con otros anticuerpos terapéuticos aumentaría de manera similar la fagocitosis, se mezcló un panel de líneas celulares de carcinoma con leucocitos. La fagocitosis por granulocitos se evaluó tras el tratamiento con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) con o sin el anticuerpo anti-EGFR cetuximab. En todas las líneas celulares de carcinoma probadas, el tratamiento con un solo agente con SIRPa-4-1BBL marcado con His ya desencadenó fuertemente la captación fagocítica de células cancerosas (FIG. 11E), con hasta el 80% de granulocitos fagocitando células DLD-1. Tras el tratamiento combinado con SIRPa-4-1BBL marcado con His y cetuximab, la captación fagocítica de las células cancerosas aumentó aún más (FIG 11F): por ejemplo, en la línea de carcinoma de células escamosas FaDu, más del 90% fueron fagocitados, lo que sugiere una o incluso efecto sinérgico de cetuximab con SIRPa-4-1BBL para esta pero también para otras líneas celulares.
El análisis posterior de la fagocitosis de varias líneas celulares de leucemia mieloide aguda reveló que la mayoría de estas líneas celulares no respondieron al tratamiento con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) sola (FIG. 11G). Una excepción notable aquí fue HL60, una línea celular de leucemia promielocítica aguda, con un aumento en la fagocitosis de HL60 de -10-20% (dependiendo del donante) en comparación con cultivos no tratados, después de 2 horas de incubación. Tras un tratamiento prolongado de hasta 24 horas, la fagocitosis mediada por granulocitos de K562 (leucemia mielógena crónica) y Oci-AML3 (leucemia mieloide aguda) también aumentó considerablemente en comparación con los cultivos no tratados, mientras que la absorción de HL60 en este punto de tiempo prolongado ya era muy alta en los cultivos de control no tratados (FIG. 11H). El aumento de la dosis de SIRPa-4-1 BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) en el punto de tiempo de 2 horas aumentó aún más la fagocitosis de HL60, pero no de MOLM13 (FIG. 11I).
Es importante destacar que también los blastos primarios de AML, obtenidos de un paciente con AML con cariotipo complejo, se fagocitaron tras el tratamiento con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) de una manera dependiente de la dosis (FIG. 11J). En un panel extendido de granulocitos alogénicos de cinco donantes sanos, estos blastos primarios de AML se fagocitaron intensamente en 2 horas con un aumento medio en la fagocitosis de -35% en comparación con cultivos no tratados (FIG. 11K). Además, después de 24 horas, aumentó la fagocitosis en cultivos no tratados, pero aún mejoró con el tratamiento con SIRPa-4-1 BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) (FIG. 11K).
Para establecer aún más el potencial de SIRPa-4-1BBL para estimular la fagocitosis, se realizaron experimentos similares utilizando macrófagos derivados de monocitos. En breve, los monocitos se enriquecieron a partir de PBMC aisladas de donantes sanos mediante clasificación MACS utilizando microesferas magnéticas CD14 (Miltenyi Biotec). Los monocitos se diferenciaron a macrófagos (M0) en medio de cultivo RPMI 1640+FCS al 10% suplementado con GM-CSF (50 ng/ml) y M-CSF (50 ng/ml) durante 7 días. Para generar macrófagos de tipo 1, las células M0 se cebaron con LPS e IFN-y durante 24 horas más. A continuación, los macrófagos diferenciados in vitro se mezclaron con la línea celular U2932 de linfoma de células B que se tiñó previamente con el colorante de proliferación celular V450. Los macrófagos se mezclaron con U2932 durante 2 horas; y la captación fagocítica de células cancerosas se determinó mediante microscopía fluorescente (las imágenes de microscopía representativas se muestran en la FIG.
12A, con flechas oscuras que indican células cancerosas viables y flechas blancas que indican células cancerosas fagocitadas en macrófagos). El tratamiento con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) tuvo una actividad limitada en este entorno (FIG. 12B). El tratamiento con rituximab indujo un fuerte aumento de la fagocitosis (FIG. 12C, cuadrados de diamantes blancos), que se incrementó aún más mediante el cotratamiento con SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) en la mayoría de los donantes en concentraciones variables de rituximab (FIG. 12C, cuadrados de diamantes negros).
Además, en un experimento de cultivo mixto con blastos de leucemia linfocítica crónica de células B primarias (B-CLL) y macrófagos autólogos derivados de pacientes, el tratamiento solo con el anticuerpo anti-CD52 alemtuzumab (ya que estos blastos fueron altamente positivos para CD52) indujo la fagocitosis inducida macrófagos. de casi el 40% (FIG.
11D); el tratamiento con SIRPa-4-1 BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) solo tuvo una actividad profagocítica mínima; pero en esta muestra primaria la combinación de SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) y alemtuzumab aumentó la fagocitosis (en -20% en comparación con el tratamiento con alemtuzumab) (FIG. 12D).
Además, el efecto de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL marcada con his (SEQ ID NO: 5) sobre los fagocitos fue superior en comparación con los efectos de SIRPa soluble solo, 4-1 BBL soluble solo o su combinación (FIG 11L).
En conjunto, SIRPa-4-1BBL marcado con His (SEQ ID NO: 5) a través de su dominio SIRPa aumenta la captación fagocítica mediada por granulocitos y macrófagos de varios tipos de células malignas, incluyendo las células malignas primarias, particularmente en el tratamiento combinado con varios anticuerpos monoclonales terapéuticos actualmente en uso clínico.
Experimento 5 - Prueba de concepto in vivo
Los efectos de SIRPa-4-1BBL, tanto en la orientación y activación de las células T, NK y B como en la activación de las células fagocíticas y dendríticas, se prueban in vivo en modelos de ratón. La proteína de fusión SIRPa-4-1BBL marcada con His de ratón se produce y purifica como proteína marcada de la misma manera que la molécula humana. Los modelos de tumores de ratón se generan mediante la inyección de ratones con células cancerosas de ratón que se sabe que forman tumores que expresan CD47 de ratón. Los ratones se tratan con la molécula de proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL marcada con His de ratón o humana. Se controlan el tamaño del tumor, la supervivencia de los ratones y la reacción inflamatoria en el sitio del tumor.
Se pueden realizar experimentos similares en un modelo de ratón humanizado usando tumores humanos. Este modelo se construye utilizando ratones que carecen de cualquier sistema inmunológico de ratón (ratones desnudos/SCID/NSG). Se establece un sistema inmunitario similar al humano en estos ratones mediante la inyección de solo células T humanas o PBMC o mediante el uso de ratones modificados genéticamente que poseen un sistema inmunitario completamente humanizado. Los ratones se inoculan con células cancerosas humanas y se tratan con la molécula SIRPa-4-1 BBL marcada con His humana. El tamaño del tumor, la supervivencia de los ratones y la reacción inflamatoria en el sitio del tumor también se controlan en este modelo.
La eficacia in vivo de His-SIRPa-4-1 BBL se puede comparar con la de sus partes, denominadas, SIRPa recombinante o 4-1BBL solos o en combinación.
Experimento 5A - La proteína SIRPa-4-1BBL inhibe el crecimiento tumoral en ratones inoculados con carcinoma de colon singénico
Materiales - Ratones esterilizados en autoclave con alimentos y ropa de cama (Ssniff, Soest, Alemania), ratones hembra Balb/C (Janvier, Saint Berthevin Cedex, Francia), línea celular de carcinoma de colon de ratón CT-26 (ATCC-CRL-2638), anti-ratón PD-1 anticuerpo (BioXcell, West Lebanon, EE. UU.), proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) producida como se describe en el Experimento 1A anterior, PBS
Métodos - Los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas individualmente en grupos de cuatro ratones por jaula. Los ratones recibieron comida y ropa de cama esterilizadas en autoclave y agua del grifo acidificada (pH 4,0) ad libitum. El animalario estaba equipado con regulación automática de luz/oscuridad de 12 horas, regulación de temperatura a 22± 2 °C y humedad relativa de 50±10%. Los ratones hembra Balb/C fueron inoculados por vía subcutánea con células CT-261 x 106 y el tratamiento empezó tres días después. Después de la asignación aleatoria, a 10 animales por grupo se les administraron dos veces por semana tres inyecciones intravenosas de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) (100 pg/inyección) o su tampón soluble (PBS). Se incluyeron como referencia terapéutica 5 mg/kg de anti-PD1 de ratón en el mismo programa (FIG. 13A). Todas las administraciones se realizaron por la mañana, sin anestesia. El volumen del tumor se determinó tres veces por semana usando medidas de calibre, y los volúmenes individuales se calcularon mediante la fórmula: V = ([ancho] 2 x largo)/2. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones del Comité Coordinador de Investigación del Cáncer del Reino Unido para el Bienestar de los Animales (Workman et al., Committee of the National Cancer Research Institute. Guidelines for the welfare of animals in cáncer research. Br J Cáncer 2010; 102:1555-77) y de la Ley Alemana de Protección Animal y aprobado por las autoridades locales responsables (Gen0030/15).
Resultados - En este experimento, se evaluó el efecto in vivo de SIRPa-4-1BBL utilizando el modelo de cáncer de colon de ratón CT-26. El tratamiento de ratones inoculados con CT-26 con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) redujo el volumen del tumor (en aproximadamente un 36% como máximo) (FIG. 13B).
Experimento 5B: la proteína SIRPa-4-1BBL es eficaz para el tratamiento de ratones inoculados con un tumor leucémico singénico
Materiales - Ratones tratados en autoclave con comida y ropa de cama (Ssniff, Soest, Alemania), ratones hembra DBA/2 (Janvier, Saint Berthevin Cedex, Francia), línea celular de leucemia P388 (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine, Berlín, Alemania), anticuerpo PD-1 de anti-ratón (BioXcell, West Lebanon, EE. UU.), proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5), PBS
Métodos - Los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas individualmente en grupos de cuatro ratones por jaula. Recibieron comida y ropa de cama esterilizadas en autoclave y agua del grifo acidificada (pH 4,0) ad libitum. El animalario estaba equipado con regulación automática de luz/oscuridad de 12 horas, regulación de temperatura a 22± 2 °C y humedad relativa de 50±10%. Se inocularon ratones hembra DBA/2 por vía intraperitoneal con células P388 1 x 106 y el tratamiento emnpezó al día siguiente. Después de la asignación aleatoria, a diez animales por grupo se les administró cada dos días cuatro inyecciones intravenosas de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) (100 pg/inyección) o su tampón soluble (PBS). Se incluyeron como referencia terapéutica 5 mg/kg de PD1 de anti­ ratón en el mismo esquema. Todas las administraciones se realizaron por la mañana, sin anestesia. Los ratones que portaban P388 se pesaron diariamente y una vez que los ratones estaban moribundos, se sacrificaron y se determinó el volumen de ascitis. Además, se tomó y pesó el bazo y el hígado de cada ratón.
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones del Comité Coordinador de Investigación del Cáncer del Reino Unido para el Bienestar de los Animales (Workman et al., committee of the National Cancer Research Institute. Guidelines for the welfare of animals in cancer research. Br J Cancer 2010; 102:1555-77) y de la Ley Alemana de Protección Animal y aprobado por las autoridades locales responsables (Gen0030/1
Resultados - En este experimento, se evaluó el efecto in vivo de SIRPa-4-1BBL utilizando el modelo de leucemia de ascitis en ratones P388. En este modelo, el peso del bazo es un marcador de la gravedad de la enfermedad, debido al hecho de que el bazo sirve como ganglio linfático de drenaje para la ascitis. El tratamiento de ratones inoculados con leucemia de ratón P388 con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) fue efectivo, como puede verse por la reducción significativa en el peso del bazo (19%, P valor = 0,03) (FIG .14B) apuntando a un mejor pronóstico de la enfermedad.
Experimento 5C - La proteína SIRPa-4-1BBL reduce la carga tumoral en la BM de ratones NSG inoculados con tumor de leucemia humana
Materiales - Ratones hembra NSG (ratones NOD-scid gamma) a la edad de 12-16 semanas (Jackson Laboratory), línea celular de leucemia mieloide aguda MV4.11 (ATCC-CRL-9591), anticuerpo CD45 de anti-ratón (eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.), anticuerpo CD45 anti-humano (eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.), anticuerpo CD123 anti-humano (BD Pharmingen, EE. UU.), proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5 ) producido como se describe en el Experimento 1A anterior, PBS. Se aislaron PBMC humanas de sangre periférica de donantes sanos utilizando el método Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich Israel Ltd.).
Métodos - Los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas individualmente en grupos de 5 ratones por jaula. Los ratones recibieron comida y ropa de cama esterilizadas en autoclave y agua del grifo acidificada (pH 4,0) ad libitum. El animalario estaba equipado con regulación automática de luz/oscuridad de 12 horas, regulación de temperatura a 22± 2 °C y humedad relativa de 50±10%. Ratones hembra NSG fueron irradiados con 200 rad 24 horas antes de la inoculación intravenosa a través de la vena de la cola con células MV4.11 7,8 x 106 en un volumen total de 200 pl de PBS. Trece (13) días después, se inoculó a los ratones a través de la vena de la cola conPBMC humanas 1,5 x 106 y el tratamiento comenzó 4 horas más tarde. Después de la asignación aleatoria, a 5 animales por grupo se les administró cada dos días (EOD) cuatro inyecciones intraperitoneales de proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5, 100 pg/inyección) o su tampón soluble (PBS) (los días 13, 15, 17 y 19) (FIG. 15A). Todas las administraciones se realizaron por la mañana, sin anestesia. Veinticuatro (24) horas después de la última inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron sangre, médula ósea (BM) y bazo. Se pesó el bazo y las células extraídas de BM se analizaron mediante FACS después de la tinción con hCD45, mCD45 y CD123.
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las normas del Comité del Centro Médico Hadassa para el Bienestar de los Animales y de la Ley de Protección Animal de Israel y fueron aprobados por las autoridades locales responsables.
Resultados - El tratamiento de ratones NSG irradiados e inoculados con MV4.11 no reconstituidos con PBMC humanas con proteína SIRPa-4-1BBL marcada con His (SEQ ID NO: 5) no afectó al número de células leucémicas en la BM (FIG. 15B). El tratamiento de ratones NSG inoculados con MV4.11 con PBMC humanas redujo la carga tumoral en la

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión SIRPa-4-1BBL estando caracterizado por:
(i) un enlazador de un solo aminoácido entre dicho SIRPa y dicho 4-1BBL; y/o
(ii) estar en forma de al menos un homotrímero.
2. La proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la reivindicación 1, en donde el enlazador es glicina.
3. La proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha proteína de fusión es capaz de al menos uno de:
(i) unir CD47 y 4-1BB;
(ii) activar la vía de señalización de 4-1BB en una célula que expresa dicho 4-1BB;
(iii) coestimular las células inmunitarias que expresan dicho 4-1BB; y/o
(iv) potenciar la fagocitosis de células patológicas que expresan dicho CD47 por fagocitos en comparación con las mismas en ausencia de dicha proteína de fusión SIRPa-4-1BBL.
4. La proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL comprende SEQ ID NO: 1.
5. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5 y un elemento regulador para dirigir la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped.
7. Una célula huésped que comprende la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el polinucleótido de la reivindicación 5 o el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6.
8. Un método in vitro para producir la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de las reivindicaciones 1-4, comprendiendo el método expresar en una célula huésped el polinucleótido de la reivindicación 5, o El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende aislar la proteína de fusión.
10. La proteína de fusión SIRPa-4-1 BBL de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, el polinucleótido de la reivindicación 5, El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6 o la célula huésped de la reivindicación 7 para usar en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa, una enfermedad asociada con inmunosupresión o inmunosupresión inducida por medicación o una infección en un sujeto.
11. Un agente anticanceroso y ya sea:
(i) la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la reivindicación 1-4;
(ii) el polinucleótido de la reivindicación 5;
(iii) el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6; o
(iv) la célula huésped de la reivindicación 7,
para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
12. La proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la reivindicación 1-4, el polinucleótido de la reivindicación 5, el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6, o la célula huésped de la reivindicación 7, para uso de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, donde las células enfermas de dicho sujeto expreso CD47.
13. Un método in vitro para activar células inmunitarias, comprendiendo el método activar células inmunitarias en presencia de la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de la reivindicación 1-4, el polinucleótido de la reivindicación 5, el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6, o la célula huésped de la reivindicación 7.
14. El método de la reivindicación 13, en donde dicha activación se realiza en presencia de células que expresan CD47 o CD47 exógeno.
15. El agente anticanceroso y: (i) la proteína de fusión SIRPa-4-1BBL de las reivindicaciones 1-4, (ii) el polinucleótido de la reivindicación 5, (iii) el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6, o (iv) el célula huésped de la reivindicación 7; el polinucleótido de la reivindicación 5, el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6, o la célula huésped de la reivindicación 7, para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, o el método de la reivindicación 13 o 14, en el que dicho SIRPa-4-1BBL la proteína de fusión es caracterizado por un enlazador de un solo aminoácido entre dicho SIRPa y dicho 4-1BBL; y/o estar en forma de al menos un homotrímero.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11566060B2 (en) 2017-01-05 2023-01-31 Kahr Medical Ltd. PD1-CD70 fusion protein and methods of use thereof
CN110536693B (zh) 2017-01-05 2023-12-22 卡尔医学有限公司 Pd1-41bbl融合蛋白及使用其的方法
RU2769769C2 (ru) 2017-01-05 2022-04-05 Кахр Медикал Лтд. СЛИТЫЙ БЕЛОК SIRPα-4-1BBL И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
US11299530B2 (en) 2017-01-05 2022-04-12 Kahr Medical Ltd. SIRP alpha-CD70 fusion protein and methods of use thereof
KR102945860B1 (ko) * 2018-07-11 2026-03-31 카 메디컬 리미티드 SIRPalpha-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법
EP3820887A4 (en) 2018-07-11 2022-04-20 KAHR Medical Ltd. Pd1-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
US20220267409A1 (en) * 2019-07-11 2022-08-25 Kahr Medical Ltd. Heterodimers and methods of use thereof
WO2021137231A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Kahr Medical Ltd. Methods of culturing t cells with a 4-1bbl fusion polypeptide and uses of same
US20230048361A1 (en) 2019-12-31 2023-02-16 Kahr Medical Ltd. Methods of culturing t cells and uses of same
KR20220138909A (ko) * 2021-04-06 2022-10-14 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 Cd47에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도
WO2022215920A1 (ko) * 2021-04-06 2022-10-13 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
CN119403829A (zh) 2022-05-11 2025-02-07 第一三共株式会社 对于肿瘤抗原特异性的抗体和cd47抑制剂的组合
AU2024314312A1 (en) * 2023-06-22 2025-10-30 Fbd Biologics Limited Multi-targeting protein complex and methods of use thereof
WO2025178407A1 (ko) * 2024-02-23 2025-08-28 마루테라퓨틱스 주식회사 고효율 유도 자연살해세포(ink) 증식 방법

Family Cites Families (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
DE122007000007I2 (de) 1986-04-09 2010-12-30 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5287386A (en) 1991-03-27 1994-02-15 Thinking Machines Corporation Differential driver/receiver circuit
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
US5342774A (en) 1991-05-23 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1
US5541104A (en) 1991-05-23 1996-07-30 Ludwig Institute For Cancer Research Monoclonal antibodies which bind to tumor rejection antigen precursor mage-1
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6222012B1 (en) 1992-08-31 2001-04-24 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nonapeptides presented by HLA molecules, and uses thereof
JP3608788B2 (ja) 1992-08-31 2005-01-12 ルドヴィグ・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ Ｍａｇｅ−３遺伝子から誘導されてｈｌａ−ａ１により提示される単離されたノナペプチドおよびそれらの用途
US5674704A (en) 1993-05-07 1997-10-07 Immunex Corporation Cytokine designated 4-IBB ligand
CA2184482A1 (en) 1994-03-01 1995-09-08 Etienne De Plaen Determination of cancerous conditions by mage gene expression
US5541110A (en) 1994-05-17 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Cloning and expression of a gene encoding bryodin 1 from Bryonia dioica
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6046048A (en) 1996-01-09 2000-04-04 Genetech, Inc. Apo-2 ligand
US6291430B1 (en) 1997-09-12 2001-09-18 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-3 peptides presented by HLA class II molecules
JP2002508962A (ja) 1998-01-15 2002-03-26 ジェネンテク・インコーポレイテッド Ａｐｏ−２リガンド
AU1811801A (en) 1999-12-03 2001-06-12 Dendreon Corporation Cryopreservation of antigen-loaded dendritic cells and their precursors in serum-free media
IL150571A0 (en) 2000-01-03 2003-02-12 Tr Associates L L C Novel chimeric proteins and methods for using the same
AU3087801A (en) 2000-02-04 2001-08-14 Molecular Dynamics Inc Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of geneexpression in human breast and hbl 100 cells
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
ES2394018T3 (es) 2001-11-27 2013-01-15 Ucb Pharma S.A. Procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres derivados de células epiteliales
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
KR20050082389A (ko) 2004-02-18 2005-08-23 메덱스젠 주식회사 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물
US7142018B2 (en) 2004-06-08 2006-11-28 Transmeta Corporation Circuits and methods for detecting and assisting wire transitions
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7807619B2 (en) 2004-11-01 2010-10-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
US7279925B1 (en) 2005-03-10 2007-10-09 Cypress Semiconductor Corp. Capacitive feedforward circuit, system, and method to reduce buffer propagation delay
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
EP1787512A1 (en) 2005-11-09 2007-05-23 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe Method for the cryopreservation of human blood
SG10202112838YA (en) 2008-04-09 2021-12-30 Genentech Inc Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2729351C (en) 2008-06-30 2017-01-24 University Of Pennsylvania Fn14/trail fusion proteins
JP2012500855A (ja) 2008-08-25 2012-01-12 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−１アンタゴニストおよび感染性疾患を処置するための方法
WO2010070047A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 Novartis Ag Soluble polypeptides for use in treating autoimmune and inflammatory disorders
HRP20150553T1 (hr) 2009-05-15 2015-08-28 University Health Network Sastavi i metode za lijeäśenje hematoloških maligniteta ciljajuä†i sirp - cd47 interakciju
EP2468850A4 (en) 2009-08-19 2013-02-20 Takara Bio Inc CELL PRESERVATION PROCESS
CA3253628A1 (en) * 2010-03-05 2025-11-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
AU2011309689B2 (en) 2010-09-28 2015-01-15 Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. Compositions and methods for treatment of hematological malignancies
US8675439B2 (en) 2011-10-12 2014-03-18 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Bit line voltage bias for low power memory design
US9926364B2 (en) 2011-11-03 2018-03-27 Argen-X N.V. Chimeric human-llama antigens and methods of use
ES2816647T3 (es) 2012-01-17 2021-04-05 Univ Leland Stanford Junior Reactivos SIRP-alfa de alta afinidad
WO2013112986A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Gliknik Inc. Fusion proteins comprising igg2 hinge domains
CA2868408A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunomodulating cyclic compounds from the bc loop of human pd1
PL3489254T3 (pl) 2012-04-30 2023-01-30 Biocon Limited Ukierunkowujące/immunomodulujące białko fuzyjne i sposoby jego otrzymywania
EP2730588A1 (en) 2012-11-12 2014-05-14 Intelectys Antibodies and fragments thereof raised against the alpha-3 domain of HLA-G protein, methods and means for their preparation, and uses thereof
EP3508215A3 (en) 2012-12-03 2019-10-02 Bristol-Myers Squibb Company Enhancing anti-cancer activity of immunomodulatory fc fusion proteins
WO2014106839A1 (en) 2013-01-01 2014-07-10 Kahr Medical Ltd. Stable form of signal converting protein fusion proteins, and methods of use and preparation thereof
WO2014121093A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Fusion proteins that facilitate cancer cell destruction
WO2014164519A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for inhibiting the effects of amyloid beta oligomers
EP2995626B1 (en) 2013-05-06 2018-07-11 China Pharmaceutical University Bifunctional fusion proteins to inhibit angiogenesis in tumour microenvironment and to activate adaptive immune responses and the genes and uses thereof
JP6355032B2 (ja) * 2014-03-24 2018-07-11 イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ （シャンハイ） カンパニー リミテッド 新規組換え二機能性融合タンパク質、それらの調製および使用
PT3177640T (pt) 2014-08-08 2020-08-31 Univ Leland Stanford Junior Agentes pd-1 de alta afinidade e métodos de utilização
WO2016023001A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multispecific high affinity pd-1 agents and methods of use
WO2016023040A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Alexo Therapeutics International Sirp-alpha variant constructs and uses thereof
PL3180363T3 (pl) 2014-08-15 2020-02-28 Merck Patent Gmbh Białka fuzyjne immunoglobulin sirp-alfa
EP3012271A1 (en) 2014-10-24 2016-04-27 Effimune Method and compositions for inducing differentiation of myeloid derived suppressor cell to treat cancer and infectious diseases
EP3224275B1 (en) 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
CN104403004B (zh) 2014-11-24 2017-10-13 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途
CN118271463A (zh) 2014-12-05 2024-07-02 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向g-蛋白偶联受体的嵌合抗原受体及其用途
AU2016227322A1 (en) 2015-03-03 2017-09-21 Kahr Medical Ltd Dual signaling protein (DSP) fusion proteins, and methods of using thereof for treating diseases
EP3973980A1 (en) 2015-03-31 2022-03-30 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
CN106146670B (zh) * 2015-04-24 2019-01-15 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 一种新的重组双功能融合蛋白及其制备和应用
CN114425077A (zh) * 2015-05-18 2022-05-03 起源生物医药公司 Sirp多肽组合物和使用方法
WO2017012770A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Ratiopharm Gmbh Acid addition salts of filgotinib
HUE068868T2 (hu) 2015-07-30 2025-02-28 Macrogenics Inc PD-1-hez kötõdõ molekulák és alkalmazásukra szolgáló eljárások
AU2016304794B2 (en) 2015-08-07 2021-07-15 ALX Oncology Inc. Constructs having a SIRP-alpha domain or variant thereof
EA034582B1 (ru) 2015-08-07 2020-02-21 АЭлЭкс ОНКОЛОДЖИ ИНК. Конструкции варианта sirp-альфа и их применение
JP6981973B2 (ja) 2015-10-01 2021-12-17 ヒート バイオロジクス，インコーポレイテッド Ｉ型及びｉｉ型細胞外ドメインを異種キメラタンパク質として連結する組成物及び方法
EP3364995B1 (en) 2015-10-23 2021-08-04 Apogenix AG Single-chain cd27-receptor agonist proteins
WO2017152132A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of identifying and treating immune checkpoint inhibitor-responsive neoplasms
CN109715808A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
TW201741337A (zh) 2016-05-13 2017-12-01 麥迪紐有限責任公司 ＣＤ４０Ｌ-Ｆｃ融合多肽及其使用方法
AU2017272875B2 (en) 2016-06-03 2023-10-19 Invectys Anti HLA-G specific antibodies
CN107586342A (zh) 2016-07-08 2018-01-16 生命序有限公司 重组免疫检查点受体及其应用
CN106267188B (zh) 2016-08-15 2025-06-17 深圳大学 小分子免疫激动剂偶联pd-1抗体的新型抗体及其在抗肿瘤中的应用
CN107868791B (zh) 2016-09-26 2021-11-23 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种加强型Slit2 CAR-T和CAR-NK细胞制备方法和应用
HRP20211703T1 (hr) 2016-11-02 2022-02-04 Jounce Therapeutics, Inc. Protutijela protiv pd-1 i njihova upotreba
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
AU2017380981B2 (en) 2016-12-19 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1BB (CD137) agonists
US11566060B2 (en) 2017-01-05 2023-01-31 Kahr Medical Ltd. PD1-CD70 fusion protein and methods of use thereof
CN110536693B (zh) 2017-01-05 2023-12-22 卡尔医学有限公司 Pd1-41bbl融合蛋白及使用其的方法
US11299530B2 (en) 2017-01-05 2022-04-12 Kahr Medical Ltd. SIRP alpha-CD70 fusion protein and methods of use thereof
RU2769769C2 (ru) 2017-01-05 2022-04-05 Кахр Медикал Лтд. СЛИТЫЙ БЕЛОК SIRPα-4-1BBL И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
CN107857819A (zh) 2017-07-03 2018-03-30 江苏西迪尔生物技术有限公司 多功能融合蛋白及其应用
JP7185698B2 (ja) 2017-10-23 2022-12-07 ジーケーエヌ オートモーティブ リミテッド 電界効果トランジスタ用の保護回路
JP2021500902A (ja) 2017-11-01 2021-01-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規ｔｎｆファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
EP3820887A4 (en) 2018-07-11 2022-04-20 KAHR Medical Ltd. Pd1-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
KR102945860B1 (ko) 2018-07-11 2026-03-31 카 메디컬 리미티드 SIRPalpha-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법
US20210301020A1 (en) 2018-07-24 2021-09-30 Amgen Inc. Combination of lilrb1/2 pathway inhibitors and pd-1 pathway inhibitors
EP3908664A4 (en) 2019-01-07 2023-01-25 Thomas Jefferson University MULTIFUNCTIONAL FUSION PROTEINS AND THEIR USES
TWI760751B (zh) 2019-05-29 2022-04-11 美商美國禮來大藥廠 Tigit及pd-1/tigit-結合分子
CN110128550B (zh) 2019-05-30 2023-01-13 南京惟亚德生物医药有限公司 一种新型的同时阻断免疫检查点pd-l1和tigit的复制型溶瘤腺病毒和应用
US20220267409A1 (en) 2019-07-11 2022-08-25 Kahr Medical Ltd. Heterodimers and methods of use thereof
WO2021137231A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Kahr Medical Ltd. Methods of culturing t cells with a 4-1bbl fusion polypeptide and uses of same
US20230048361A1 (en) 2019-12-31 2023-02-16 Kahr Medical Ltd. Methods of culturing t cells and uses of same
US20240076346A1 (en) 2021-01-13 2024-03-07 Kahr Medical Ltd. Type i membrane proteins heterodimers and methods of use thereof
US20250051410A1 (en) 2021-12-23 2025-02-13 Kahr Medical Ltd. Lilrb polypeptides and uses thereof

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