ES2916409T3 - Glicoproteínas recombinantes con fucosilación antenaria reducida - Google Patents

Abstract

Un método para reducir la fucosilación antenaria de N-glicanos complejos en una glicoproteína que se expresa de forma recombinante en una línea celular de amniocitos primarios humanos, en donde dicha línea celular comprende al menos un ácido nucleico que codifica los productos génicos de las regiones adenovirales E1 y pIX, y en donde dicha línea celular está modificada genéticamente para sobreexpresar β-galactósido α-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6Gal1) y/o β-galactósido α-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3Gal4) en comparación con el nivel de expresión de sialiltransferasa antes de la modificación genética.

Description

DESCRIPCIÓN

Glicoproteínas recombinantes con fucosilación antenaria reducida

La presente invención se refiere a métodos para reducir la fucosilación antenaria de N-glicanos complejos en glicoproteínas expresadas de forma recombinante, a líneas celulares que pueden usarse en dichos métodos y a métodos para expresar las respectivas glicoproteínas recombinantes en dichas líneas celulares.

La mayoría de las proteínas terapéuticas recombinantes actuales son glicoproteínas. Tienen residuos de azúcar fijados al grupo amino de una asparagina (glicanos ligados por N) o al grupo hidroxilo de una serina o treonina (glicanos ligados por O). La estructura de los glicanos es muy variable, dependiendo de la proteína específica y la célula hospedadora utilizada para la expresión recombinante.

Una estructura muy común de los N-glicanos que se encuentra en glicoproteínas expresadas con plataformas de expresión de mamíferos son los llamados N-glicanos complejos, caracterizados por la secuencia de azúcar central Mana1-6(Mana1-3)Manp1-4GIcNAcp1-4GIcNAcp1-Asn-. Esta estructura central se extiende mediante "antenas" que se inician con N-acetilglucosamina (GlcNAc). Por lo general, los N-glicanos de tipo complejo tienen dos, tres o cuatro antenas, pero en casos raros se pueden encontrar cinco o seis antenas. En la Fig. 1A se representa una estructura típica de un N-glicano de tipo complejo diantenario.

Los N-glicanos complejos se pueden fucosilar. En las células de mamíferos, la fucosa está ligada a la GIcNAc proximal por un enlace a1 -6 (fucosa central) o a una GIcNAc distal en una o varias de las antenas, a través de un enlace a1 -3 (fucosa antenaria; también denominada antígeno LewisX (Lex), CD15 o SSEA-1), que se muestra en la Fig. 1B. Si la estructura de LewisX (Gal(p-4)[Fuc(a)]GIcNAc-R) alberga un ácido siálico adicional, la estructura resultante se denomina sialil-LewisX, sialil-Lex o SLex (NeuAc(a1 ->4)Gal(p-4)[Fuc(a1 ->3)]GIcNAc-R), que se muestra en la Fig. 1C. Las estructuras sialil-LewisX emergen por la fucosilación de N-glicanos de tipo complejo sializado en la GIcNAc distal catalizada por varias fucosiltransferasas. El papel de la fucosilación central a1-6 se ha estudiado ampliamente para los anticuerpos. Los anticuerpos de la clase IgG típicamente portan un N-glicano en el dominio CH2 de la región Fc. La presencia de una fucosa central en esos N-glicanos reduce significativamente la respuesta ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) mediada por el anticuerpo in vivo. Dado que la ADCC suele ser un efecto muy deseado de un anticuerpo terapéutico, se están adoptando varios enfoques para reducir la presencia de fucosa central en las IgGs. La estructura de fucosa ligada a 1 -3 central altamente inmunogénica solo existe en plantas e invertebrados y está ausente en las células humanas.

En las inmunoglobulinas, normalmente no se encuentra fucosa antenaria, sin embargo, las estructuras LewisX o sialil-LewisX se detectan fácilmente en otras glicoproteínas séricas. Hasta la fecha se sabe poco sobre su papel fisiológico. Existe una evidencia de que la fucosa antenaria podría aumentar la orientación hacia sitios de inflamación a través de interacciones con selectina, pero aparte de eso, se sabe relativamente poco sobre el papel fisiológico de la fucosilación antenaria.

Cuando las proteínas plasmáticas se expresan de forma recombinante, el producto muestra frecuentemente un nivel elevado de fucosa antenaria en comparación con el homólogo natural en el plasma. Con el fin de reducir los posibles efectos inmunogénicos de las proteínas recombinantes utilizadas en la terapia de reemplazo, es deseable que sean lo más similares posible a la proteína endógena. Una reducción de la fucosa antenaria en las proteínas terapéuticas recombinantes es un paso importante hacia este objetivo.

En consecuencia, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar medios para reducir la fucosilación antenaria (Lex o SLex) de N-glicanos complejos en glicoproteínas expresadas de forma recombinante, así como medios para producir las mismas.

La solución del problema técnico anterior se logra mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En particular, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para reducir la fucosilación antenaria de N-glicanos complejos, ya sea Lex o sialil-Lex en una glicoproteína que se expresa de forma recombinante en una línea celular de amniocitos primarios humanos que comprende al menos un ácido nucleico que codifica los productos génicos de las regiones adenovirales E1 y pIX, que comprende la etapa de sobreexpresar junto con la glicoproteína p-galactósido a-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6Gal1) y/o a-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3Gal4).

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "N-glicanos complejos" se refiere a N-glicanos que se caracterizan por la secuencia de azúcar central Mana1-6(Mana1-3)Manp1-4GIcNAcp1-4GIcNAcp1-Asn-. Esa secuencia de azúcar central de N-glicano complejo se puede extender con 2 a 6 antenas que se inician con N-acetilglucosamina (GIcNAc), en donde son típicas dos, tres o cuatro antenas. Dichas antenas se denominan a veces en el presente documento "antenas de N-glicano complejo". Además, tal y como se usa en el presente documento, la expresión "fucosilación antenaria de N-glicanos complejos" se refiere al enlace a1-3 de la fucosa con una GIcNAc distal en al menos una de las antenas de los N-glicanos complejos. En este contexto, la expresión "GIcNAc distal" se refiere a cualquier GIcNAc presente en una antena distinta de las GIcNAc iniciales del glicano.

La expresión "fucosilación antenaria reductora de N-glicanos complejos" se refiere al hecho de que, de acuerdo con la presente invención, mediante la sobreexpresión de ST6Gal1 y/o ST3Gal4 junto con la glicoproteína, se genera una glicoproteína recombinante que tiene una menor cantidad de antenas de N-glicanos complejos fucosilados, en comparación con una glicoproteína recombinante convencional. Preferiblemente, esa glicoproteína recombinante se caracteriza por una fucosilación antenaria significativamente reducida de los N-glicanos complejos, en comparación con la misma glicoproteína recombinante expresada sin una sobreexpresión de ST6Gal1 y/o ST3Gal4.

En realizaciones particularmente preferidas, al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95% o más, de las antenas de N-glicanos complejos de la glicoproteína expresada recombinantemente, no están fucosiladas.

La glicoproteína que se someterá a los métodos de la presente invención no está particularmente limitada, siempre que sea una glicoproteína que tenga N-glicanos complejos y las respectivas antenas de N-glicanos complejos. En realizaciones preferidas, la glicoproteína se selecciona a partir del grupo que consiste en a1-antitripsina (AAT), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor VII (FVII), factor VIII (FVIII), factor IX (FIX), factor de von Willebrand (vWF), fosfatasa alcalina e inhibidor de C1 esterasa (inhibidor de C1; C1 Inh). Además, la glicoproteína es preferiblemente una glicoproteína de mamífero, más preferiblemente humana.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "glicoproteína expresada de forma recombinante" se refiere a las glicoproteínas que se producen biotecnológicamente en organismos o células modificados genéticamente.

Los métodos para glicoproteínas que se expresan de forma recombinante, así como para sobreexpresar ST6Gal1 y/o ST3Gal4 junto con esas glicoproteínas, no están particularmente limitados y son conocidos en la técnica. A continuación se proporcionan más detalles a este respecto para el segundo aspecto de la presente invención, en relación con las líneas celulares de la presente invención.

En realizaciones específicas de la presente invención, tanto ST6Gal1 como ST3Gal4 se sobreexpresan junto con la glicoproteína recombinante.

En realizaciones específicas adicionales de la presente invención, (i) la p-galactósido a-2,3-sialiltransferasa 1 (ST3Gal1) no se sobreexpresa junto con la glicoproteína recombinante y/o (ii) la expresión de a-1,3-manosil-glicoproteína 4-p-N-acetilglucosaminiltransferasa A (GnTIVa), a-1,3-manosil-glicoproteína 4-p-N-acetilglucosaminiltransferasa B (GnTIVb) y a-1,6-manosilglicoproteína 6-p-N-acetilglucosaminiltransferasa A (GnTV) no se reduce.

En este contexto, la expresión "ST3Gal1 no se sobreexpresa junto con la glicoproteína recombinante" se refiere al hecho de que la expresión de ST3Gal1 no aumenta de ninguna manera en comparación con la expresión de ST3Gal1 natural. En realizaciones particulares, ST3Gal1 no se expresa en absoluto. Además, la expresión "la expresión de GnTIVa, GnTIVb y GnTV no se reduce" se refiere al hecho de que la expresión de dichas proteínas no disminuye de ninguna manera en comparación con la expresión natural de dichas proteínas.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una línea celular que se modifica genéticamente para sobreexpresar la p-galactósido a-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6Gal1) y/o la a-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3Gal4), en donde la línea celular es una línea celular de amniocitos primarios humanos que comprende al menos un ácido nucleico que codifica los productos génicos de las regiones adenovirales E1 y pIX.

Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "línea celular modificada genéticamente para sobreexpresar ST6Gal1 y/o ST3Gal4" indica que tras la modificación genética, las células individuales de la línea celular muestran una expresión más alta de la(s) sialiltransferasa(s) respectiva(s) que antes de la modificación genética.

Las modificaciones genéticas que permiten la sobreexpresión de una proteína determinada no están particularmente limitadas y son conocidas en la técnica. En un ejemplo particular, la línea celular comprende un gen o genes endógenos que codifican ST6Gal1 y/o ST3Gal4, como por ejemplo, líneas celulares humanas. En tales casos, las células pueden modificarse genéticamente mediante la inserción de un promotor, un elemento potenciador y/o un elemento estabilizador en el genoma de las células, en una posición adecuada para provocar la sobreexpresión de dicho ácido nucleico. Esto se puede realizar mediante recombinación homóloga utilizando TALENS, proteínas con dedos de Zn, CRISPR-CAS9 u otros métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la línea celular comprende un gen o genes endógenos que codifican ST6Gal1 y/o ST3Gal4, y además tiene al menos un elemento genético, seleccionado a partir del grupo que consiste en un promotor, un elemento potenciador y un elemento estabilizador insertado en el genoma en una o varias posiciones adecuadas para provocar la sobreexpresión de ST6Gal1 y/o ST3Gal4. Los promotores, elementos potenciadores y elementos estabilizadores adecuados no están particularmente limitados y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los promotores incluyen promotores constitutivos, por ejemplo, un promotor de CMV, EF1 alfa, SV40, RSV, UbC, CAG, BOS o PGK, y promotores inducibles, por ejemplo, promotores inducibles con tetraciclina u otros promotores inducibles conocidos en la técnica. Además, los elementos potenciadores (potenciadores) incluyen el potenciador de CMV, el potenciador de p-globina, el potenciador de inmunoglobulina y el potenciador de PGK. Además, los elementos estabilizadores (elementos de cromatina) incluyen regiones de fijación de la matriz (MARs), regiones de control de locus (LCRs) y elementos de apertura de cromatina de acción ubicua (UCOEs).

Alternativamente, en los casos en los que las células no comprenden un gen o genes endógenos que codifican ST6Gal1 y/o ST3Gal4, o adicionalmente, en los casos en que las células comprenden un gen o genes endógenos que codifican ST6Gal1 y/o ST3Gal4, la modificación genética de las células puede lograrse introduciendo ácido(s) nucleico(s), que codifica(n) ST6Gal1 y/o ST3Gal4 en las células. Los métodos para introducir ácidos nucleicos en las células no están particularmente limitados y son conocidos en la técnica. Por ejemplo, dichos ácidos nucleicos podrían introducirse en forma circular o linealizada en las células mediante electroporación, nucleofección, microinyección, a través de vectores virales, por ejemplo, vectores lentivirales, métodos basados en reactivos, por ejemplo, lípidos, fosfato de calcio, polímeros catiónicos u otros métodos conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos se pueden introducir de forma transitoria o estable en la célula mediante sistemas episomales o mediante la integración estable del ácido nucleico en el genoma. Dichos ácidos nucleicos pueden estar presentes en las células en forma de uno o más vectores de expresión, por ejemplo, pcDNA, pCEP, pLenti, pEntr, pDest, pEF, pEAK, pCMV, pStbl u otros vectores de expresión conocidos en la técnica. La expresión de ST6Gal1 y/o ST3Gal4 puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, por ejemplo, un promotor de CMV, EF1 alfa, SV40, RSV, UbC, CAG, BOS o pGk , el promotor endógeno, o de un promotor inducible, por ejemplo, el promotor inducible de tetraciclina u otros promotores inducibles conocidos en la técnica. Además, los ácidos nucleicos que codifican ST6Gal1 y/o ST3Gal4 pueden estar presentes como un ácido nucleico continuo, o pueden estar presentes como ácidos nucleicos separados, por ejemplo, como vectores de expresión separados. Dichos ácidos nucleicos pueden contener, además de la región codificante y un promotor, sitios de restricción adecuados, secuencias de Kozak, sitios de unión a ribosomas, elementos moduladores de la cromatina, casetes de selección, sistemas de replicación episomal, por ejemplo, el antígeno nuclear de Epstein-Barr y ori P, o SV40 ori y SV40 T-large, sitios de entrada al ribosoma internos (IRES), señales de corte y empalme y señales de poliadenilación conocidas en la técnica. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la línea celular comprende ácido(s) nucleico(s) exógeno(s) que codifica(n) ST6Gal1 y/o ST3Gal4.

Los genes adecuados que codifican ST6Gal1 y/o ST3Gal4 para la transfección de líneas celulares no están particularmente limitados e incluyen cualquier gen con cualquier origen que codifique proteínas que tengan actividad ST6Gal1 o ST3Gal4. Preferiblemente, esos genes son genes ST6Gal1 y ST3Gal4 de mamíferos, más preferiblemente humanos.

Las líneas celulares según la presente invención son amniocitos humanos (CAP; cf. documento EP 1230354 B1), en donde se prefieren las células CAP.

En este contexto, las células CAP son líneas celulares amniocíticas permanentes que comprenden un ácido nucleico que codifica los productos génicos del adenovirus, en particular las regiones E1A y E1B del adenovirus de tipo 5 (Ad5). Las células CAP se obtienen a partir de amniocitos humanos primarios que se transforman con un ácido nucleico que codifica E1A y E1B de Ad5.

Por consiguiente, las líneas celulares según la presente invención son amniocitos primarios humanos que comprenden al menos un ácido nucleico que codifica los productos génicos de la región adenoviral E1 y pIX, preferiblemente la región E1 y pIX del adenovirus de tipo 5 (Ad5) desde el nt. 505 al 4079, en donde E1A está bajo el control del promotor de la fosfoglicerato cinasa murina (pgk), mientras que la expresión de E1B y pIX está controlada por sus promotores naturales. El intrón aguas abajo de E1B, el aceptor del corte y empalme y la señal poliA se reemplazan por motivos correspondientes de SV40.

En realizaciones específicas de la presente invención, la línea celular de la presente invención se modifica genéticamente para sobreexpresar tanto ST6Gal1 como ST3Gal4.

En realizaciones específicas adicionales de la presente invención, la línea celular de la presente invención no se modifica genéticamente para (i) sobreexpresar p-galactósido a-2,3-sialiltransferasa 1 (ST3Gal1), y/o (ii) reducir la expresión de a-1,3-manosil-glicoproteína 4-p-N-acetilglucosaminiltransferasa A (GnTIVa), a-1,3-manosil-glicoproteína 4-p-N-acetilglucosaminiltransferasa B (GnTIVb) y a-1,6-manosilglicoproteína 6-p-N-acetilglucosaminiltransferasa A (GnTV).

En este contexto, la expresión "la línea celular no se modifica genéticamente para sobreexpresar ST3Gal1" se refiere al hecho de que la expresión de ST3Gal1 no aumenta de ninguna manera, en comparación con la expresión natural de ST3Gal1 de la línea celular. En realizaciones particulares, ST3Gal1 no se expresa en absoluto. Además, la expresión "la línea celular no se modifica genéticamente para reducir la expresión de GnTIVa, GnTIVb y GnTV" se refiere al hecho de que la expresión de dichas proteínas no disminuye de ninguna manera, en comparación con la expresión natural de dichas proteínas en la línea celular.

Las líneas celulares según este segundo aspecto de la presente invención son capaces de reducir la fucosilación antenaria de N-glicanos complejos en glicoproteínas recombinantes expresadas en dichas líneas celulares.

En el presente documento se describe una glicoproteína recombinante que tiene N-glicanos complejos, en la que se reduce la fucosilación antenaria de los N-glicanos complejos, de modo que al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95%, o más, de las antenas de N-glicanos complejos de la glicoproteína recombinante, no están fucosiladas.

Las glicoproteínas recombinantes respectivas se pueden producir tal y como se describe en el presente documento, por ejemplo, mediante sobreexpresión de ST6Gal1 y/o ST3Gal4 junto con la glicoproteína recombinante. Preferiblemente, dichas glicoproteínas se producen en una línea celular según la presente invención, tal y como se describe en este documento.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la expresión de una glicoproteína recombinante tal y como se describe en este documento, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una línea celular según la presente invención,

(b) expresar la glicoproteína recombinante en dicha línea celular; y

(c) aislar la glicoproteína recombinante a partir de las células o del material sobrenadante del cultivo celular.

En este aspecto, todas las definiciones y limitaciones relevantes proporcionadas anteriormente para el primer y el segundo aspecto de la presente invención, se aplican de manera análoga. En particular, la glicoproteína recombinante y la línea celular son como se han definido anteriormente.

Los medios para la expresión de proteínas en las líneas celulares de la presente invención no están particularmente limitados y son conocidos en la técnica. En este contexto, la etapa (b) de expresar la glicoproteína de interés en dicha línea celular incluye la transfección de un ácido nucleico codificante respectivo en dicha línea celular, antes de la expresión real de la glicoproteína. Además, los medios para aislar una glicoproteína de interés a partir de un cultivo celular no están particularmente limitados y son conocidos en la técnica.

En el presente documento se describe el uso de una línea celular según la presente invención para la producción de glicoproteínas recombinantes como se ha descrito anteriormente.

Las figuras muestran:

Figura 1:

La familia de glicoepítopos de Lewis, que muestra un subconjunto de posibles variantes. Los glicoepítopos de Lex transportan fucosa en un enlace a1-3 con el monosacárido GIcNAc. A) GIcNAc sializada, no fucosilada; B) Lewis X (Lex) también denominado CD15 o SSEA-1; C) Sialil Lewis X (sLex).

Figura 2:

El análisis IEF (enfoque isoeléctrico) muestra un aumento de la sialización de hAAT purificada a partir de células CAP glico-optimizadas, estables que expresan recombinantemente hAAT y ST3Gal4 o ST6Gal1, en comparación con hAAT purificada a partir de células CAP que expresan hAAT no modificadas. Se sometieron a enfoque isoeléctrico 5 gg por pista de hAAT purificada por afinidad. Se muestran diferentes puntos de tiempo durante la generación del grupo. Muestras: CAP-hAAT-ST3Gal4, hAAT procedente de células CAP que expresan AAT humana de forma estable así como sialiltransferasa ST3Gal4, CAP-hAAT-ST6Gal1, hAAT procedente de células CAP que expresan de forma estable AAT humana así como sialiltransferasa ST6Gal1. La hAAT obtenida a partir del plasma (prolastina), la hAAT procedente de células CAP no glico-optimizadas y la hAAT desializada procedente de células CAP, sirvieron como controles.

Figura 3:

El análisis comparativo de transferencia de lectina de AAT recombinante revela que una cantidad reducida de la fucosilación se correlaciona con cantidades aumentadas de sialización. rAAT humana purificada procedente de células CAP de tipo silvestre, células CAP-ST3Gal4 o células CAP-ST6Gal1, se separó mediante SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se detectó mediante lectinas específicas. El análisis densitométrico correspondiente (B) se normalizó sobre el contenido de proteína AAT en la transferencia Western correspondiente. El análisis de la lectina de Erythrina crista-galli (ECL-lectina) detecta galactosas libres sobre N-glicanos, lo que indica una sialización incompleta. La fucosa ligada a a1-3 se detecta mediante aglutinina de Lotus tetragonolobus (LTA).

Figura 4:

El análisis FACS de las glicoproteínas de la superficie celular de las células CAP glico-optimizadas que expresan ST3Gal4 o ST6Gal1 de manera estable, en comparación con las células CAP no modificadas, revela que la sobreexpresión de una de esas dos sialiltransferasas no solo aumenta el grado de sialización en la mayoría de las glicoproteínas expresadas. También disminuye la cantidad de fucosa antenaria en las estructuras de N-glicanos, lo que da lugar a una cantidad reducida de estructuras de LewisX.

Figura 5:

Cantidades crecientes de ácido siálico (NANA) y cantidades reducidas de fucosa (Fuc) en hAAT purificada a partir de células CAP que expresan de manera estable ST3Gal4 o ST6Gal1, en comparación con hAAT purificada a partir de material sobrenadante de un cultivo celular de células CAP no modificadas. Se muestra hAAT (prolastina) obtenida a partir de plasma como control. El análisis de los monosacáridos se realizó mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada (HPAEC PAD).

Figura 6:

Un análisis comparativo de la transferencia de lectina del inhibidor de C1 recombinante revela que un aumento en la sialización se correlaciona con una disminución en la fucosilación antenaria. El inhibidor de C1 purificado procedente de células CAP de tipo silvestre, células CAP-ST3Gal4 o células CAP-ST6Gal1, se separó mediante SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se detectó mediante lectinas específicas. El análisis densitométrico correspondiente (B) se normalizó frente al contenido en proteína C1-Inh en la transferencia Western correspondiente. Él análisis de lectina de Erythrina crista-galli (ECL-lectina) (A y B) detecta galactosas libres sobre los N-glicanos, lo que indica una sialización incompleta. La fucosa ligada a a1 -3 se detecta mediante aglutinina de Lotus tetragonolobus (LTA).

Figura 7:

Un análisis MS-MS del inhibidor C1 recombinante: PNGasa F liberaba N-glicanos permetilados desde el inhibidor C1 purificado a partir de células CAP de tipo silvestre, de células CAP-ST3Gal4 o de células CAP-ST6Gal1 analizadas mediante ^m A^l DI TOF/TOF. Solo la señal en 3196,8 en MS1 del inhibidor C1 obtenido a partir del tipo silvestre (A) contenía dos residuos de fucosa y el patrón de fragmentación característico para la fucosa antenaria (M/z 638, 505, 260; D) en MS2. En CAP-ST3Gal4 (^b ) y CAP-ST6Gal1 (C) no se pudo detectar la señal en 3196,8, tampoco ninguna otra señal de MS1 contenía un patrón de fragmentación de fucosa antenaria en MS2.

La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos sin limitarse a los mismos.

Ejemplos

Procedimientos experimentales:

Cultivo celular y fermentación

La línea celular permanente de amniocitos humanos CAP 1D5 se cultivó en suspensión, o bien en medio CAP-CDM definido químicamente sin componentes animales (CEVEC Pharmaceuticals, Alemania) complementado con glutamina estable 6 mM (Biochrom, Alemania), o en medio PEM sin suero (Life Technologies) complementado con glutamina estable 4 mM (Biochrom, Alemania). Las células CAP se cultivaron a 37 °C en matraces para agitación (Corning, n° 431143, 125 ml (25 ml wv) o n° 431252, 3000 ml (1000 ml wv)) con 5% de CO² y 185 rpm. Durante la fermentación, las células CAP se alimentaron en los días 3, 5 y 7 con solución de alimentación CAP-CDM al 10% (CEVEC Pharmaceuticals, Alemania) y glutamina estable 4 mM (Biochrom, Alemania).

Clonación

Para la generación de las líneas celulares CAP que expresaban de forma estable ST3Gal4 o ST6Gal1, las células se sometieron a nucleofectación con las estructuras artificiales de ácido nucleico correspondientes. La Tabla 1 muestra todas las líneas celulares creadas para ese proyecto.

Para diseñar el ADNc de ST3Gal4, la información de la secuencia de la proteína precursora y la proteína madura se basaba en el registro de la base de datos UniProt Q11206 (SEQ ID NO: 1). Para la clonación, se añadió un sitio de restricción Clal y una secuencia Kozak, 5' del codón de inicio del ADNc de ST3Gal4 humana y un sitio de restricción EcoRV se añadió 3' del codón de terminación para insertarlo entre los sitios de restricción Clal y EcoRV en el vector pStbl-Neo-CMV-MCS(-), dando como resultado el plásmido de expresión pStbl-Neo-CMV-ST3Gal4. Ese vector contiene un promotor de CMV que dirige la expresión del gen de interés, seguido de un intrón de SV40 para mejorar el transporte de ARNm mediado por corte y empalme y un sitio de clonación múltiple para la inserción del gen de interés. El marcador de selección está dirigido por el promotor de la ubicuitina humana (UbC). La síntesis del ADNc se realizó en GeneArt (Alemania, Life Technologies).

Tabla 1: Líneas celulares estables utilizadas en la presente invención.

Para diseñar el ADNc de ST6Gal1, la información de la secuencia de la proteína precursora y la proteína madura se basaba en el registro de la base de datos UniProt P15907 (SEQ ID NO: 2). Para la clonación, se añadió un sitio de restricción Clal y una secuencia Kozak, 5' del codón de inicio del ADNc de ST6Gal1 humano y un sitio de restricción EcoRV, 3' del codón de terminación para insertarlo entre los sitios de restricción Clal y EcoRV en el vector pStbl-Neo-CMV-MCS(-), dando como resultado el plásmido de expresión pStbl-Neo-CMV-ST6Gal1. La síntesis del ADNc se realizó en GeneArt (Alemania, Life Technologies).

Nucleofección y generación de agrupamiento

La nucleofección se realizó utilizando un Nucleofector II (LONZA) con el kit de Nucleofector (KitV) apropiado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, durante la fase de crecimiento exponencial del cultivo, 1 x 107 células se recogieron mediante centrifugación (150 g durante 5 min) y se resuspendieron en 100 |ul de solución Nucleofector completa y se mezclaron con un total de 5 qg de plásmido. La nucleofección se realizó utilizando el programa X001. Después del impulso, las células se recuperaron en 12 ml de medio de cultivo celular completo en un matraz de agitación de 125 ml. Las células se cultivaron como antes a 37 °C, 5% de CO² y 185 rpm.

De 72 a 96 h después de la nucleofección, las células se seleccionaron con 200 qg/ml de neomicina para generar agrupaciones estables.

Análisis de transferencia Western

Las soluciones de proteínas purificadas se separaron en un gel NuPAGE Novex 4-12% de Bis-Tris en condiciones reductoras, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las proteínas separadas se transfirieron a través de un módulo Blot (Invitrogen) (30 V durante 60 min a TA) a una membrana Hybond ECL de Amersham (100 V durante 60 min a TA). La membrana se bloqueó durante 1 h a TA con PBSTB (solución salina tamponada con fosfato, pH = 7,4, complementada con Tween 20 al 0,1% y BSA al 1%). Posteriormente, la membrana se incubó con el anticuerpo específico marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluido en PBSTB. Después de lavar la membrana con PBST (solución salina tamponada con fosfato pH = 7,4 complementada con Tween 20 al 0,1%), las proteínas se detectaron utilizando el kit de sustrato Pierce ECL WB a través de un detector de quimioluminiscencia (INTAS).

Inmunotransferencia de la lectina

Las lectinas son proteínas que se unen a estructuras específicas de carbohidratos. Por lo tanto, las lectinas acopladas con biotina se pueden usar para analizar los glicanos ligados a N. La lectina de Erythrina crista-galli (ECL) detecta galactosa terminal ligada a (31-4 en glicanos ligados a N, la aglutinina de Sambucus nigra (SNA) se une preferentemente al ácido siálico ligado a a2,6, mientras que la lectina de Maackia amurensis (MAL) se une preferentemente a los ácidos siálicos ligados a a2,3. La fucosa ligada a a1 -3 se detecta mediante aglutinina de Lotus tetragonolobus (LTA) y la lectina de Aleuria aurantia (AAL) detecta la fucosa ligada a a1 -2-, -3 o -6.

Las soluciones de proteínas purificadas procedentes de las células CAP parentales con o sin coexpresión de ST3Gal4 y/o ST6Gal1, se separaron tal y como se ha descrito anteriormente y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL de Amersham (GE Healthcare). La membrana se bloqueó durante 1 h a TA con PBSTB (solución salina tamponada con fosfato, pH = 7,4, complementada con Tween 20 al 0,1% y BSA al 1%). Posteriormente, la membrana se incubó con la lectina diluida en PBSTB. Después de lavar la membrana con PBST (solución salina tamponada con fosfato, pH = 7,4, complementada con Tween 20 al 0,1%), la membrana se tiñó con peroxidasa de rábano picante (HRP) acoplada a estreptavidina durante 1 h a temperatura ambiente (diluida en PBSTB). La señal de HRP se amplificó utilizando IgG anti-estreptavidina y anti-IgG-HRP. Las proteínas se detectaron utilizando el kit de sustrato Pierce ECL WB a través de un detector de quimioluminiscencia (INTAS).

Análisis de enfoque isoeléctrico (IEF)

Se realizó un enfoque isoeléctrico (IEF) para analizar el punto isoeléctrico (pI) de rhAAT purificada a partir de células CAP que expresaban rhAAT con o sin expresión adicional de ST3Gal4 o ST6Gal1. El grado de sialización se correlaciona con la acidez de una determinada proteína y, por tanto, con su pI. El análisis IEF se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Brevemente, se cargaron 5 |ug de proteína purificada en geles con pH 3-7 y se sometieron a electroforesis (1 h 100 V, 1 h 200 V, 30 min 500 V). Las proteínas se tiñeron con SimplyBlue SafeStain según el protocolo del fabricante (Invitrogen).

Ejemplo 1:

Cantidad significativamente reducida de estructuras de LewisX en la proteína hAAT purificada a partir de células CAP-ST3Gal4 o ST6Gal1.

La a1-antitripsina (AAT) es un inhibidor de la proteasa que pertenece a la superfamilia de las serpinas. AAT es un potente inhibidor de las proteasas de serina, en particular de la elastasa de neutrófilos. AAT es una glicoproteína de 52 kDa que es portadora de 3 sitios de N-glicosilación.

Las células de la línea celular de amniocitos humanos CAP que ya expresaban AAT humana de forma estable, se transfectaron adicionalmente de forma estable con un plásmido que codificaba la sialiltransferasa ST3Gal4 para lograr un aumento en la sialización ligada a 2,3 de la galactosa terminal de los N-glicanos o la sialiltransferasa ST6Gal1 para lograr un aumento en la 2,6-sialización de la galactosa terminal de los N-glicanos.

Una sialización 2,3 o 2,6 mejorada después de la sobreexpresión de la sialiltransferasa ST3Gal4 o ST6Gal1, se determinó mediante análisis con enfoque isoeléctrico (IEF) de hAAT purificada (Figura 2).

Como las estructuras principales de las diferentes rhAAT (hAAT recombinante) son idénticas, los cambios en el IEF indican cambios en el contenido en ácido siálico. La hAAT recombinante expresada en células CAP con expresión adicional de ST3Gal4, daba como resultado una rhAAT modificada que se desplazaba significativamente hacia un pI ácido, lo que indicaba un mayor grado de sialización; una rhAAT expresada en células CAP parentales que sobreexpresaban ST6Gal1 también se desplaza hacia un pI más ácido pero en menor grado (Figura 2). Esto probablemente se debe a las diferentes afinidades de sustrato de ST3Gal4 y ST6Gal1. ST6Gal1 cataliza la sialización de las ramificaciones primarias de los N-glicanos, mientras que ST3Gal4 cataliza la sialización de las ramificaciones primarias de los N-glicanos, así como las ramificaciones adicionales de los N-glicanos triantenarios y tetraantenarios. Por lo tanto, ST3Gal4 tiene más sustrato aceptor disponible que ST6Gal1.

Este resultado podía confirmarse mediante un análisis de transferencia de lectina (Figura 3). Se determinaron cantidades aumentadas de sialización a2,3 o a2,6 después de la sobreexpresión de la sialiltransferasa ST3Gal4 o ST6Gal1 mediante un análisis de la transferencia de lectina de Erythrina crista-galli (ECL). La lectina ECL detecta galactosa terminal ligada a p1 -4 en glicanos ligados a N. Por lo tanto, una señal disminuida en la transferencia de ECL se correlaciona con una mayor cantidad de sialización. La AAT purificada procedente de células CAP de control que expresan AAT, muestra una señal clara en la transferencia de lectina de ECL, lo que indica una sialización incompleta. La AAT obtenida a partir de células CAP que sobreexpresan ST6Gal1 o ST3Gal4 mostraba una fuerte reducción o ausencia total de la señal de ECL, lo que indica que en esas preparaciones solo existen cantidades mínimas de galactosa ligada a p1 -4 no sializada en el glicano ligada a N (Figura 3).

Sorprendentemente, el grado de fucosa antenaria (antígeno LewisX) se reduce en rhAAT después de la coexpresión de ST6Gal1 o ST3Gal4, tal y como se muestra por la reducción de la intensidad de la señal en el análisis de transferencia de aglutinina de Lotus tetragonolobus (lectina LTA) en la Figura 3. La aglutinina de Lotus tetragonolobus (LTA) detecta específicamente la fucosa antenaria ligada a a1-3. Por lo tanto, la sobreexpresión de las sialiltransferasas ST3Gal4 y ST6Gal1 es una forma inesperada pero apropiada de reducir significativamente la cantidad de estructuras de Lewis X no deseadas y potencialmente inmunogénicas sobre los glicanos ligados a N.

Ejemplo 2:

Análisis FACS de glicoproteínas sobre la superficie celular de células CAP que expresan ST3Gal4 o ST6Gal1

Para determinar el grado de fucosilación de las glicoproteínas en la superficie celular con un mayor grado de sialización mediante sobreexpresión de sialiltransferasas, se realizaron análisis de citometría de flujo (FACS) (Figura 4).

Las células CAP-hAAT-ST3Gal4 o CAP-hAAT-ST6Gal1 se tiñeron con diferentes anticuerpos y lectinas para analizar los epítopos de azúcar en la superficie de las células. Por lo general, 1 x 107 células se centrifugaron durante 10 min a 140 x g y se volvieron a suspender en 100 gl de PBS/BSA. Se mezclaron 10 gl (106 células) con 10 gl de anticuerpo o lectina (1 mg/ml; conjugado con FITC o acoplado con DIG en combinación con un anticuerpo anti-DIG acoplado con FITC) y se añadieron 90 gl de PBS/BSA. Después de 10 min a 4 °C, las células se lavaron con PBS/BSA. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 500 gl de PBS/BSA y se sometieron a un análisis FACS en un citómetro de flujo FACSCalibur de Becton Dickinson. Las células muertas se identificaron y se excluyeron mediante tinción con yoduro de propidio. Por lo general, se contaron y analizaron 30000 eventos. Las células teñidas con FITC o PE se superpusieron gráficamente con las células no teñidas.

La Figura 4 muestra células CAP-hAAT parentales o células CAP-hAAT que expresan de manera estable a2,3 (CAP-hAAT+ST3Gal4) o a2,6 (CAP-hAAT+ST6Gal1) sialiltransferasa, respectivamente. Las células se tiñeron con lectinas específicas para ácido neuramínico acoplado a a2,3, MAA (aglutinina de Maackia amurensis) o residuos de ácido neuramínico acoplados a2,6, SNA (aglutinina de Sambucus nigra) o con LTA (aglutinina de Lotus tetragonolobus) que reconocen residuos de fucosa ligados a a1,3 (Lex). Células CAP-hAAT parentales, HL60 (Lex pos.), HEK293 negativas para Lex (Lex neg.), así como células incubadas con el anticuerpo anti-DIG acoplado con FITC, solo se muestran como controles.

Como era de esperar, la sobreexpresión de a2,3- o a2,6-sialiltransferasa aumenta los residuos de ácido neuramínico acoplados respectivos sobre los N-glicanos de las glicoproteínas de la superficie celular. Curiosamente, la expresión de ST3Gal4 o ST6Gal1 reduce la cantidad de estructuras de Lex no preferidas sobre las glicoproteínas en la superficie celular, como se indica con la tinción significativamente reducida con lectina LTA.

Ejemplo 3:

Análisis de monosacáridos de hAAT expresados en células CAP-ST3Gal4 o CAP-ST6Gal1 mediante análisis HPAEC PAD

Para determinar si la cantidad total de ácido siálico y fucosa de hAAT recombinante purificada procedente de células CAP cambia con la expresión adicional de las sialiltransferasas ST3Gal4 o ST6Gal1, se realizó un análisis de monosacáridos mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución, con detección amperométrica pulsada (HPAEC PAD).

La Figura 5 muestra las cantidades relativas de ácido siálico y fucosa determinadas mediante el análisis de los monosacáridos con HPAEC-PAD en células CAP-hAAT transfectadas de manera estable con un plásmido que codifica ST3Gal4 o ST6Gal1.

La Figura 5 muestra que al expresar las sialiltransferasas humanas, el contenido en ácido siálico se eleva, mientras que la cantidad de fucosa por molécula de rhAAT se reduce significativamente en relación con un control no transfectado, lo que indica que la cantidad de estructuras de Lex no preferidas o de sialil-Lex se reduce tras la sobreexpresión de las sialiltransferasas. Cabe destacar que en este experimento, la cantidad total de fucosa se determinó sin diferenciar entre los residuos de fucosa antenaria (fucosa ligada a a1 -3) y fucosa central (fucosa ligada a a1 -6) de los N-glicanos. Dado que la expresión adicional de las sialiltransferasas solo afecta a la cantidad de fucosa antenaria ligada a a1-3, pero no a la fucosa central relativamente abundante, la reducción general determinada de fucosa tras la sobreexpresión de las sialiltransferasas del 25% (ST6Gal1) y del 30% (ST3Gal4), indica una reducción pronunciada en la cantidad absoluta de fucosa antenaria ligada a a1-3.

Una reducción general de los residuos de fucosa es muy sorprendente ya que la GIcNAc distal procedente de N-glicanos complejos sializados (NeuAc(a1->4)Gal(p-4)GIcNAc-R), que aumentará tras la sobreexpresión de ST3Gal4 y/o ST6Gal1, es un sustrato para las fucosiltransferasas Fut5, Fut6 y Fut7. Por lo tanto, la sobreexpresión de sialiltransferasas tales como ST3Gal4, debería dar lugar a un aumento de las estructuras de sialil-LewisX más que a una disminución general de los residuos de fucosa.

Ejemplo 4:

Cantidad reducida de estructuras de LewisX sobre la proteína inhibidora de hC1 purificada a partir de células CAP-ST3Gal4 o ST6Gal1

Las células de la línea celular de amniocitos humanos CAP-hC1 Inh se transfectaron de manera estable con un plásmido que codificaba la sialiltransferasa ST3Gal4 para lograr una mayor sialización ligada a a2,3 de la galactosa terminal de los N-glicanos o la sialiltransferasa ST6Gal1 para lograr una mayor sialización a2,6 de la galactosa terminal de los N-glicanos.

Se determinaron cantidades aumentadas de sialización a2,3 o a2,6 tras la sobreexpresión de la sialiltransferasa ST3Gal4 o ST6Gal1 mediante un análisis de transferencia de lectina de Erythrina crista-galli (ECL). La lectina ECL detecta la galactosa terminal ligada a (31-4 sobre glicanos ligados a N. Como se muestra en la Figura 6, una sobreexpresión de ST3Gal4 da como resultado una sialización incrementada de los glicanos ligados a N, en comparación con C1 Inh purificada a partir del material sobrenadante de un cultivo celular de células CAP sin glicomodificar. La sobreexpresión de ST6Gal1 también da como resultado un aumento de la sialización de la galactosa terminal en los glicanos ligados a N, en comparación con C1-Inh sin glicomodificar, aunque el efecto no es tan pronunciado como tras la sobreexpresión de ST3Gal4. Lo más probable es que esto se deba a las diferentes afinidades de sustrato de ST3Gal4 y ST6Gal1, tal y como se ha explicado en el Ejemplo 1.

La cantidad de fucosa antenaria ligada a a1-3 en las diferentes preparaciones de proteína C1 Inh (control CAP, CAP-ST3Gal4, CAP-ST6Gal1) se determinó mediante un análisis de transferencia de aglutinina de Lotus tetragonolobus (LTA). La Figura 6 indica que el aumento de la sialización tras la sobreexpresión de ST6Gal1 o ST3Gal4 se correlaciona con una cantidad reducida de fucosilación antenaria, lo que se demuestra por la disminución de la intensidad de la señal en el análisis de transferencia de lectina LTA.

Estos resultados se confirmaron mediante análisis MS-MS de N-glicanos de C1 Inh obtenidos en células de control CAP, células CAP-ST3Gal4 o CAP-ST6Gal1 (Figura 7). PNGaseF liberaba N-glicanos permetilados desde el inhibidor de C1 purificado a partir de células CAP de control, de células CAP-ST3Gal4 o de células CAP-ST6Gal1 que se analizaron mediante MALDI TOF/TOF. Solo la señal en 3196,8 en MS1 en el inhibidor de C1 obtenido a partir del tipo silvestre (Figura 7A) contenía dos residuos de fucosa y el patrón de fragmentación característico para la fucosa antenaria (M/z 638, 505, 260; D) en MS2. En CAP-ST3Gal4 y CAP-ST6Gal1 (Figura 7B y C) no se pudo detectar la señal en 3196,8. Además, ninguna otra señal de MS1 contenía un patrón de fragmentación de fucosa antenaria en MS2.

La presente invención se refiere a las siguientes secuencias de aminoácidos.

SEQ ID NO: 1

ST3Gal4 humana

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para reducir la fucosilación antenaria de N-glicanos complejos en una glicoproteína que se expresa de forma recombinante en una línea celular de amniocitos primarios humanos, en donde dicha línea celular comprende al menos un ácido nucleico que codifica los productos génicos de las regiones adenovirales E1 y pIX, y en donde dicha línea celular está modificada genéticamente para sobreexpresar p-galactósido a-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6Gal1) y/o p-galactósido a-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3Gal4) en comparación con el nivel de expresión de sialiltransferasa antes de la modificación genética.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la glicoproteína se caracteriza por una fucosilación antenaria significativamente reducida de los N-glicanos complejos en comparación con la misma glicoproteína recombinante expresada sin una sobreexpresión de ST6Gal1 y/o ST3Gal4.

3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde al menos el 80% de las antenas de N-glicano complejo de la glicoproteína expresada de forma recombinante, no están fucosiladas.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la glicoproteína se selecciona a partir del grupo que consiste en a1-antitripsina (AAT), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), Factor VII (FVII), Factor VIII (FVIII), Factor IX (FIX), Factor de von Willebrand (vWF), fosfatasa alcalina e inhibidor de la esterasa C1 (inhibidor de C1; C1 Inh).

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la glicoproteína es una glicoproteína de mamífero, preferiblemente humana.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde

(i) la p-galactósido a-2,3-sialiltransferasa 1 (ST3Gal1) no se sobreexpresa junto con la glicoproteína, y/o (ii) la expresión de la a-1,3-manosil-glicoproteína 4-p-N-acetilglucosaminiltransferasa A (GnTIVa), a-1,3-manosilglicoproteína 4-p-N-acetilglucosaminiltransferasa B (GnTIVb) y a-1,6-manosilglicoproteína 6-p-N-acetilglucosaminiltransferasa A (GnTV) no se reduce.

7. Una línea celular que se modifica genéticamente para sobreexpresar ST6Gal1 y/o ST3Gal4, en donde la línea celular es una línea celular de amniocitos primarios humanos que comprende al menos un ácido nucleico que codifica los productos génicos de las regiones adenovirales E1 y pIX.

8. La línea celular según la reivindicación 7, en donde la línea celular comprende un gen(es) endógeno(s) que codifica(n) ST6Gal1 y/o ST3Gal4, y además tiene al menos un elemento genético, seleccionado a partir del grupo que consiste en un promotor, un elemento potenciador y un elemento estabilizador insertado en el genoma en una varias más posiciones adecuadas para provocar una sobreexpresión de ST6Gal1 y/o ST3Gal4.

9. La línea celular según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde la línea celular comprende ácido(s) nucleico(s) exógeno(s) que codifica(n) ST6Gal1 y/o ST3Gal4.

10. La línea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la línea celular es la línea celular de amniocitos humanos CAP.

11. La línea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la línea celular no está modificada genéticamente para

(i) sobreexpresar ST3Gal1, y/o

(ii) reducir la expresión de GnTIVa, GnTIVb y GnTV.

12. Un método para la expresión de una glicoproteína recombinante que tiene N-glicanos complejos, en donde se reduce la fucosilación antenaria de los N-glicanos complejos, de modo que al menos el 80% de las antenas de los N-glicanos complejos de la glicoproteína recombinante no están fucosiladas, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una línea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11,

(b) expresar la glicoproteína recombinante en dicha línea celular; y

(c) aislar la glicoproteína recombinante a partir de las células o del material sobrenadante del cultivo celular.

13. El método según la reivindicación 12, en donde la glicoproteína se selecciona a partir del grupo que consiste en AAT, HGF, FVII, FVIII, FIX, vWF, fosfatasa alcalina y C1 Inh.