ES2918336T3 - Detección y clasificación de gotas microfluídicas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la microfluídica y, en particular, con los métodos para detectar gotas y partículas microfluídicas dentro de las gotas, así como para clasificar las gotas. Estos métodos permiten cuantificar las propiedades y actividades de las partículas dentro de las gotas. Para este propósito, la invención proporciona gotas microfluídicas que comprenden partículas marcadas adecuadamente. La invención también proporciona dispositivos y sistemas microfluídicos que tienen propiedades que los hacen particularmente adecuados para su uso en los métodos de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Detección y clasificación de gotas microfluídicas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la microfluídica y, en particular, a métodos para detectar gotas y partículas microfluídicas dentro de gotas, así como también clasificar las gotas, de acuerdo con el conjunto de reivindicaciones adjunto. Estos métodos permiten cuantificar las propiedades y actividades de las partículas dentro de las gotas. Para este propósito, la invención proporciona gotas microfluídicas que comprenden partículas adecuadamente marcadas.
Antecedente de la invención
La microfluídica basada en gotas tiene un gran potencial para aplicaciones de selección de alto rendimiento. La encapsulación de células individuales en gotas permite la selección de productos celulares, como anticuerpos, con un rendimiento muy alto, por ejemplo, hasta varios cientos de miles de muestras por día. Por ejemplo, las células secretoras de anticuerpos individuales (por ejemplo, hibridomas o células B) pueden encapsularse en gotas junto con una diana farmacológica recombinante de interés, como una enzima. La adición de un sustrato fluorogénico de la enzima revelará qué gotas contienen una célula que libera anticuerpos que inhiben la actividad enzimática y facilitan la clasificación específica de estos. Sin embargo, para muchas aplicaciones de selección, sería muy útil encapsular conjuntamente (además de la célula secretora de anticuerpos) otra célula indicadora, en lugar de una enzima recombinante. Esta célula indicadora podría mediar una señal de fluorescencia (por ejemplo, la expresión de una enzima indicadora que puede detectarse fácilmente en gotas, como p-Gal) sobre el efecto deseado de un anticuerpo, como la estimulación o inhibición de vías celulares sobre la unión de anticuerpos de receptores acoplados a la proteína G (GPCR). Los GPCR son las dianas de la mayoría de los medicamentos más vendidos y aproximadamente el 40 % de todos los productos farmacéuticos recetados.
Una etapa crucial para este tipo de selección es la generación de gotas que albergan ambos tipos celulares, opcionalmente a nivel de una sola célula. La encapsulación celular no determinista está limitada por las estadísticas de Poisson, lo que significa que el número de células por gota varía significativamente. Se han descrito procedimientos de encapsulación deterministas alternativos, sin embargo, hasta el día de hoy no se ha demostrado la encapsulación conjunta fiable de dos tipos celulares diferentes, especialmente a nivel de una sola célula. Por lo tanto, los ensayos basados en células que requieren la encapsulación conjunta de dos tipos celulares diferentes a nivel de una sola célula (como se requiere para la selección de fármacos; por ejemplo, una célula B que secreta anticuerpos y otra célula indicadora que indica el efecto del anticuerpo en una diana celular) difícilmente puede realizarse en gotas. Esto se debe al hecho de que la ocupación de células en cada gota no puede controlarse de forma estricta, incluida la encapsulación conjunta controlada de células y perlas como se requiere para los ensayos de unión de anticuerpos. Además, el análisis cuantitativo de la unión de anticuerpos es un desafío, ya que la perla (y cualquier objeto marcado con fluorescencia unido a ella) puede flotar fuera del plano focal y/o fuera del centro del punto láser (que tiene la mayor intensidad). El documento WO2013/13426 A1 describe gotas microfluídicas que comprenden múltiples partículas diferentes, cada una marcada de manera diferente.
Li, y otros (Li, M. y otros "A review of microfabrication techniques and dielectrophoretic microdevices for particle manipulation and separation." Journal of Physics D 47 (2014): 063001) describen métodos y dispositivos para la manipulación de partículas con sistemas microfluídicos. Lagus y Edd (Lagus, T. P. y Edd, J. F. (2012). High throughput single-cell and multiplecell micro-encapsulation. Journal of visualized experiments: JoVE, (64), e4096) revelan poblaciones de gotas microfluídicas, en donde la eficiencia de encapsulación de partículas dobles es del 79,5 %. El documento WO2011/042564 A1 describe una gota microfluídica que comprende una primera partícula asociada con una cantidad de un primer marcador detectable, y una posible pareja de unión de partículas asociado con una cantidad de un segundo marcador detectable.
Para superar estas limitaciones, los inventores han desarrollado nuevos dispositivos de clasificación y métodos de clasificación que permiten la selección de gotas para cualquier ocupación de gotas deseada, que incluye la presencia de dos tipos celulares diferentes, tales como una célula secretora de anticuerpos (o cualquier otra "célula efectora") y una célula indicadora. Además, han desarrollado un sistema, más específicamente una aproximación de marcaje particular de las parejas de unión en las gotas, que permite realizar ensayos de unión cuantitativos, incluso si el objeto de interés está fuera del plano focal o fuera del punto láser más intenso. En conjunto, esto debería tener múltiples aplicaciones en la selección de fármacos y el descubrimiento de anticuerpos, un mercado con ventas anuales que superan los 50 mil millones de dólares.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una gota microfluídica como se define en las reivindicaciones que comprende una primera partícula que se ha asociado con una cantidad de un primer marcador detectable y una posible pareja de unión de partículas que se ha asociado con una cantidad de un segundo marcador detectable, en donde se conoce la cantidad del primer marcador detectable y/o es ± 50 % de la cantidad del primer marcador detectable que se ha asociado con una partícula adicional comprendida en una gota microfluídica adicional.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para cuantificar la unión entre una partícula y una posible pareja de unión de partículas en una gota microfluídica de acuerdo con el primer aspecto, que comprende las etapas de
(i) medir la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
(ii) medir la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable, y
(iii) normalizar la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable mediante el uso de la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
en donde la intensidad normalizada del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable representa la cantidad de unión entre la partícula y la posible pareja de unión de partículas.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar una o más partículas comprendidas en una gota microfluídica como se define en las reivindicaciones, que comprende las etapas de:
a) alimentar una gota microfluídica que comprende una o más partículas en un canal de detección que comprende un punto de detección,
b) restringir al menos el movimiento vertical de la(s) partícula(s) dentro de la gota microfluídica al menos en el punto de detección en el canal de detección, en comparación con la misma gota microfluídica cuando tiene forma esférica, y
c) detectar al menos una partícula comprendida en la gota microfluídica en el punto de detección.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Encapsulación conjunta de dos tipos celulares diferentes. A) La clasificación activa de gotas que albergan exactamente una célula de cada tipo puede lograrse mediante la tinción con colorantes fluorescentes. Antes de la encapsulación, cada tipo de célula se tiñe con un colorante fluorescente diferente (por ejemplo, calceína-AM-azul y calceína rojo-naranja). Posteriormente a la formación de gotas, se lleva a cabo la clasificación dielectroforética de las muestras que muestran señales de fluorescencia positivas dobles. Solo estas gotas se aplican al procedimiento de selección aguas abajo (mediante el uso de una señal de ensayo en el canal verde), iniciado por la incubación fuera del chip y la posterior reinyección en el segundo dispositivo de microfluidos. B) Señales de fluorescencia de gotas vacías (izquierda) y ocupadas (derecha) mediante el uso de la tinción de un solo color (verde). C) Señal de fluorescencia de una muestra doble positiva que muestra una señal de fluorescencia en ambos canales (valor máximo superior e inferior).
Figura 2: Enriquecimiento de gotas que albergan dos tipos celulares diferentes mediante clasificación. Las células de hibridoma se tiñeron con calceína-AM (visible en el canal verde) o calceína-violeta (visible en el canal azul). Posteriormente, las gotas que mostraban un valor máximo en cada canal de fluorescencia se clasificaron y atraparon en un segundo chip de microfluidos. Puede observarse un claro enriquecimiento de gotas que albergan células de ambos tipos (indicado por flechas) después de la clasificación.
Figura 3: Diseño del nuevo chip de clasificación. Para aumentar la sensibilidad cuando se mide la fluorescencia de partículas/células encapsuladas en gotas, se han añadido varias características en comparación con los dispositivos de clasificación convencionales. Mientras que para los clasificadores de gotas lo suficientemente grandes como para manipular gotas de 100 pm (como se requiere para el cultivo de células eucariotas) descritos anteriormente, el punto de detección y el divisor de clasificación no encajan en el mismo campo de visión cuando se usa un objetivo de 40x (rectángulo interior en la parte superior). Sin embargo, este es el caso del chip de clasificación desarrollado recientemente (abajo). Para permitir un diseño muy compacto, los electrodos de clasificación y los canales de clasificación se han inclinado 45° con respecto al canal de detección. Además, el canal de detección es más estrecho y menos profundo en comparación con los canales restantes del diseño (abajo a la derecha). De esta manera, las gotas se comprimen en los ejes y y z, lo que restringe la libertad espacial de las partículas/células encapsuladas. Además, una entrada de aceite adicional entre el punto de detección y el divisor de clasificación permite ajustar con precisión la trayectoria de las gotas en la unión de clasificación.
Figura 4: Ventaja de tener el canal de detección y el canal de clasificación en un ángulo de 45°. En una configuración de clasificación normal (izquierda), la distancia (d) entre el punto de detección (blanco) y la unión de clasificación no encaja en el mismo campo de visión (rectángulo) cuando se usan grandes aumentos como se requiere para mediciones sensibles. Esto hace que sea muy difícil ajustar todos los parámetros de clasificación (por ejemplo, tasas de flujo, duración de los pulsos eléctricos, acústicos u ópticos o tiempos de apertura de las válvulas) para una clasificación confiable. Por el contrario, si el canal de clasificación está dispuesto en un ángulo relativo al punto de detección (derecha), todas las características relevantes encajan en el mismo campo de visión. Tenga en cuenta que la distancia d (ilustrada como una línea negra) es la misma en ambos casos.
Figura 5: Influencia de la posición de una partícula de fluorescencia en una gota en la intensidad de fluorescencia medida. Incluso cuando se usan partículas fluorescentes con el mismo número de fluoróforos (por ejemplo, anticuerpos marcados con fluorescencia verde unidos), la señal de fluorescencia medida puede variar. Por ejemplo, si la partícula está fuera del plano focal (arriba a la izquierda, 2), el valor máximo de fluorescencia (arriba a la derecha) es más débil en comparación con una partícula dentro del plano focal (1). Lo mismo ocurre con las partículas fuera del centro del foco del láser (panel central). Sin embargo, este problema puede superarse mediante el uso de un segundo color fluorescente (por ejemplo, un colorante de fluorescencia naranja, indicado por flechas y/o la etiqueta "b" en el panel inferior) en las perlas: mientras que los colores individuales todavía varían en dependencia de la posición de la perla dentro de la gota, la señal normalizada (por ejemplo, verde/naranja) no lo hace, o al menos en un grado mucho menor. De esta forma, el número de anticuerpos verdes unidos puede medirse cuantitativamente, independientemente de la posición de la perla dentro de la gota. Figura 6: Normalización de señales de fluorescencia. Para demostrar la viabilidad de la aproximación, las células se tiñeron con calceína verde, solamente, o además también con calceína azul. Cuando se trazan las señales de los canales de fluorescencia individuales (arriba) entre sí (abajo), se hacen visibles diferentes poblaciones: Las células que solo se tiñen con el colorante verde muestran intensidades muy variables, provocada por su posición arbitraria dentro de la gota (derecha, elipse punteada). Sin embargo, todas las células con doble tinción se encuentran en una línea recta (elipse sólida, derecha), lo que significa que su señal normalizada es casi idéntica. Figura 7: Normalización de señales de perlas de Fluoresbrite. A/B) Las perlas de Fluoresbrite de 6 pm en gotas muestran una distribución muy amplia de intensidades de fluorescencia cuando solo se analiza un único canal de fluorescencia (por ejemplo, se analiza el rango verde (A) o azul (B)) (indicado por flechas negras), debido a las perlas flotando libremente dentro de las gotas. C) Cuando se normaliza la señal verde a la señal azul, puede minimizarse el efecto de las perlas que flotan dentro de las gotas (indicado por la flecha blanca).
Descripción detallada de la invención
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos.
Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en la presente descripción, ya que estos pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir modalidades particulares solamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención la que se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.
Preferentemente, los términos usados en la presente descripción se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza) y en "Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics", Springer Reference, Volumen 1.
A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con modalidades específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear modalidades adicionales. Los ejemplos descritos de diversas formas y las modalidades preferidas no deben interpretarse como una limitación de la presente invención únicamente a las modalidades descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción respalda y abarca modalidades que combinan las modalidades descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse descrita por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique otra cosa.
A lo largo de esta descripción y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias al plural, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una gota microfluídica que comprende una primera partícula que se ha asociado con una cantidad de un primer marcador detectable y una posible pareja de unión de partículas que se ha asociado con una cantidad de un segundo marcador detectable, en donde la primera partícula se ha asociado con el segundo marcador a través de la unión a la posible pareja de unión de partículas, en donde se conoce la cantidad del primer marcador detectable y/o es ± 50 % de la cantidad del primer marcador detectable que se ha asociado con un partícula adicional comprendida en una gota microfluídica adicional, en donde el primer marcador detectable es diferente del segundo marcador detectable, y en donde la gota microfluídica adicional está comprendida en una pluralidad de gotas microfluídicas que también comprenden dicha gota microfluídica que comprende dicha primera partícula, en donde la asociación de la primera partícula con el primer marcador detectable, la asociación de la posible pareja de unión de partículas con el segundo marcador detectable, la asociación de la primera partícula con el segundo marcador y la asociación de la partícula adicional con el primer marcador detectable es una interacción directa o indirecta, en donde la interacción directa es una unión covalente o no covalente sin otra molécula como intermediario y en donde la interacción indirecta es una unión no covalente o covalente con una molécula adicional como intermediario.
Preferentemente, también se conoce la cantidad del segundo marcador detectable y/o es sustancialmente idéntica para todas las posibles parejas de unión de partículas.
El término "gota microfluídica" se refiere a un microcompartimento acuoso de cierto tamaño que encapsula un líquido acuoso. El tamaño de la gota microfluídica se expresa habitualmente como el diámetro de la gota cuando tiene forma esférica. El diámetro está generalmente entre 20 y 400 pm y preferentemente entre 30 y 350 pm, entre 40 y 300 pm, entre 40 y 250 pm, entre 40 y 200 pm o entre 40 y 100 pm (en donde se prefiere cada intervalo más estrecho a los intervalos más amplios anteriores y "entre" incluye los valores mencionados). En una modalidad preferida, el diámetro de la gota microfluídica está entre 2 y 20 veces el diámetro de la partícula más grande (por ejemplo, la primera partícula o una partícula adicional) en la gota, preferentemente entre 3 y 18 veces, entre 4 y 16 veces o entre 5 y l4 veces o entre 6 y 12 veces (en donde cada intervalo más estrecho se prefiere a los anteriores intervalos más amplios y "entre" incluye los valores mencionados). Preferentemente, el diámetro de la gota está definido por los parámetros absolutos y relativos anteriores. Por ejemplo, el diámetro está
(i) entre 20 y 400 pm, entre 30 y 350 pm, entre 40 y 300 pm, entre 40 y 300 pm, entre 40 y 250 pm, entre 40 y 200 pm o entre 40 y 100 pm y entre 2 y 20 veces el diámetro de la partícula más grande (por ejemplo, la primera partícula o una partícula adicional) en la gota,
(ii) entre 20 y 400 pm, entre 30 y 350 pm, entre 40 y 300 pm, entre 40 y 300 pm, entre 40 y 250 pm, entre 40 y 200 pm o entre 40 y 100 pm y entre 4 y 16 veces el diámetro de la partícula más grande (por ejemplo, la primera partícula o una partícula adicional) en la gota, o
(iii) entre 20 y 400 pm, entre 30 y 350 pm, entre 40 y 300 pm, entre 40 y 300 pm, entre 40 y 250 pm, entre 40 y 200 pm o entre 40 y 100 pm y entre 6 y 12 veces el diámetro de la partícula más grande (por ejemplo, la primera partícula o una partícula adicional) en la gota.
Alternativamente, el tamaño de la gota microfluídica también puede definirse por el volumen. Por ejemplo, habitualmente es inferior a 1 microlitro (ul). Preferentemente, es inferior a 500 nanolitros (nl), inferior a 250, inferior a 150, inferior a 100 o inferior a 50 nl. En una modalidad preferida, está entre 0,05 y 150 nl, preferentemente entre O, 05 y 125 nl, entre 0,05 y 100 nl, entre 0,05 y 80 nl, o entre 0,05 y 4 nl (en donde se prefiere cada intervalo más estrecho a los intervalos más amplios anteriores y "entre" incluye los valores mencionados).
Se dispone de una amplia variedad de procedimientos de compartimentación o microencapsulación (Benita, S., Ed. (1996). Microencapsulation: methods and industrial applications. Drugs and pharmaceutical sciences. Editado por Swarbrick, J. Nueva York: Marcel Dekker) y puede usarse para crear la gota microfluídica usada de acuerdo con la presente invención. De hecho, se han identificado en la literatura más de 200 métodos de microencapsulación o compartimentación (Finch, C. A. (1993) Encapsulation and controlled release. Spec. Publ.-R. Soc. Chem. 138, 35). Estos incluyen vesículas acuosas envueltas en membrana, como vesículas lipídicas (liposomas) (New, R. R. C., Ed. (1990). Liposomes: a practical approach. The practical approach series. Editado por Rickwood, D. y Hames, B.D. Oxford: Oxford University Press) y vesículas de surfactante no iónico (van Hal, D.A., Bouwstra, J.A. y Junginger, H.E. (1996). Nonionic surfactant vesicles containing estradiol for topical application. En Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), pp. 329-347. Marcel Dekker, New York). Preferentemente, los microcompartimentos de la presente invención se forman a partir de emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersada en la otra como gotas de tamaño microscópico (Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, Nueva York; Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, Londres; Lissant, K.J., ed Emulsions and emulsion technology.| Surfactant Science Nueva York: Marcel Dekker, 1974; Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science Nueva York: Marcel Dekker, 1984). Las emulsiones pueden producirse a partir de cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. Preferentemente, la emulsión de la presente invención tiene agua (que contiene una partícula y otros componentes) como fase presente en forma de gotas y un líquido hidrófobo e inmiscible (preferentemente un aceite) como matriz circundante en la que están suspendidas estas gotas. Dichas emulsiones se denominan 'agua en aceite'. Esto tiene la ventaja de que la fase acuosa se compartimenta en gotas discretas. La fase externa, siendo preferentemente un aceite hidrófobo, generalmente es inerte. La emulsión puede estabilizarse mediante la adición de uno o más agentes surfactantes (tensioactivos). Estos tensioactivos actúan en la interfase agua/aceite para evitar (o al menos retrasar) la separación de las fases. Pueden usarse muchos aceites y muchos emulsionantes para generar emulsiones de agua en aceite; una compilación reciente enumeró más de 16 000 tensioactivos, muchos de los cuales se usan como agentes emulsionantes (Ash, M. y Ash, I. (1993) Handbook of industrial surfactants. Gower, Aldershot). Los aceites adecuados se enumeran a continuación.
Preferentemente, los microcompartimentos acuosos se crean, manipulan y/o controlan en un sistema microfluídico. Esta tecnología se basa en la manipulación de flujo continuo de líquido a través de canales microfabricados. El accionamiento del flujo de líquido se implementa mediante fuentes de presión externas, bombas mecánicas externas, microbombas mecánicas integradas o mediante combinaciones de fuerzas capilares y mecanismos electrocinéticos. Las capacidades de monitoreo de procesos en sistemas de flujo continuo pueden lograrse con detectores de flujo de microfluidos altamente sensibles basados en tecnología MEMS que ofrecen resoluciones bajas hasta el intervalo de nanolitros.
Los dispositivos microfluídicos habitualmente consisten en redes de canales de aproximadamente diez a unos pocos cientos de micrómetros de diámetro en los que pueden inyectarse pequeñas cantidades de reactivos en una secuencia específica, mezclarse e incubarse durante un tiempo específico. Los ensayos pueden paralelizarse en gran medida mediante la generación de compartimentos independientes mediante el uso de válvulas (tras comprimir regiones específicas de los canales) o microfluidos de dos fases, en los que las gotas acuosas rodeadas por una fase oleosa inmiscible actúan como recipientes cerrados. Estas aproximaciones permiten volúmenes de ensayo drásticamente reducidos (pico - nanolitros) y un rendimiento fuertemente mejorado. Por ejemplo, las gotas pueden generarse a velocidades de más de 1000 por segundo. Además, se han desarrollado módulos de microfluidos para dividir, fusionar y clasificar gotas a velocidades similares, lo que proporciona un repertorio de manipulaciones que imitan los procedimientos clásicos de laboratorio.
En una modalidad preferida (que se aplica a todos los aspectos de la presente descripción), el dispositivo, en particular los canales, es/son lo suficientemente grandes para manipular gotas que comprenden células eucariotas. En otras palabras, el dispositivo, en particular los canales, es/son lo suficientemente grandes para manipular gotas de los tamaños descritos en la presente descripción, en particular gotas de 100 pm.
Por lo tanto, el microcompartimento descrito en la presente descripción también se denomina "gota microfluídica", por ejemplo, de una emulsión de agua en aceite (Schaerli y Hollfelder, The potential of microfluidic water-in-oil droplets in experimental biology. Mol Biosyst (2009) vol. 5 (12) págs. 1392-404).
El "líquido inmiscible" es preferentemente un líquido hidrófobo, preferentemente un aceite. La fase oleosa debe permitir que los microcompartimentos sean estables frente a la coalescencia, tengan una viscosidad próxima a la del agua y/o sean inertes frente a los reactivos biológicos contenidos en ellos. Pueden usarse varios aceites. Los aceites de silicona de baja viscosidad se hinchan. Polidimetilsiloxano, también llamado PDMS o dimeticona. El PDMS es un polímero ampliamente usado para la fabricación de chips microfluídicos y es un polímero orgánico mineral (una estructura que contiene carbono y silicio de la familia de los siloxanos), que puede cambiar las dimensiones de la sección transversal de los canales microfluídicos e influir en las propiedades de flujo de dispositivos microfluídicos si se produce hinchazón. Los aceites de silicona también pueden usarse en dispositivos microfluídicos fabricados en vidrio, que son impermeables a estos aceites. Los aceites de silicona de alta viscosidad pueden usarse en dispositivos PDMS con una hinchazón mínima a expensas de aumentar significativamente las presiones requeridas para bombearlos a través de los microcanales. Los aceites de hidrocarburos también pueden obtenerse en un intervalo de viscosidades y tienen la ventaja de que hay una gran cantidad de tensioactivos disponibles comercialmente para ellos que pueden estabilizar las emulsiones acuosas en aceite. Sin embargo, también hinchan el PDMS y tienden a presentar una mala retención de los reactivos orgánicos encapsulados, que a menudo son parcialmente solubles en estos aceites. Los aceites preferidos para su uso en los métodos de la invención son los aceites de fluorocarbono (o aceites fluorados), porque incluso las versiones de baja viscosidad de estos aceites no hinchan el PDMS. Además, tienden a exhibir una excelente retención de reactivos en las gotas y tienen una alta solubilidad para los gases, lo que permite que el oxígeno y el dióxido de carbono se difundan pasivamente dentro y fuera de los microcompartimentos, para una respiración celular sin perturbaciones. Esto permite que las células sobrevivan en emulsiones de aceite de fluorocarbono durante horas después de la encapsulación. Sin embargo, una desventaja de los aceites de fluorocarbono es que, debido a su prevalencia mucho menor en comparación con los aceites de silicona e hidrocarburo, hay menos tensioactivos disponibles comercialmente para estabilizar las emulsiones acuosas en fluorocarbono. Los tensioactivos son útiles para reducir la tensión superficial de la interfase aceite-agua y minimizar la coalescencia de las gotas. La elección de qué tensioactivo usar también es importante para limitar la transferencia de reactivos entre microcompartimentos. Una revisión comprensible de los tensioactivos para la microfluídica basada en gotas se proporciona en Baret (2012 Lab Chip 12, 422). Los tensioactivos usados en la microfluídica basada en gotas normalmente consisten en un grupo de cabeza hidrófila y una cola hidrófoba. El carácter anfifílico de estas moléculas les permite ensamblarse en la interfaz aceite-agua de la gota, por consiguiente se reduce su tensión interfacial y mejora la estabilidad. Las propiedades químicas del grupo de la cabeza del tensioactivo impactan en la biocompatibilidad de la interfase de las gotas. Se prefieren los tensioactivos con grupos de cabeza no iónicos, ya que minimizan la adsorción de macromoléculas tales como proteínas y ADN en la interfaz de las gotas, lo que afecta mínimamente a los métodos de la invención. Los tensioactivos fluorados adecuados que pueden sintetizarse fácilmente en el laboratorio se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Clausell-Tormos J y otros 2008 Chem. Biol. 15, 427-37 o Sadler y otros 1996 Angew. Chem. Int. Edn Engl. 35, 1976-8. Los aditivos para la fase acuosa también pueden mejorar la biocompatibilidad tras aumentar la retención de moléculas pequeñas en las gotas y minimizar la adsorción en la interfaz agua-aceite. Pueden mezclarse diferentes aceites para optimizar las propiedades de la emulsión para una aplicación particular y se conocen en la técnica métodos para caracterizar fácilmente las propiedades de la combinación que se ha seleccionado (Kaltenbach y otros. 2012 Lab Chip 12, 4185).
El término "partícula" se refiere a cualquier objeto lo suficientemente pequeño como para caber en la gota microfluídica y que puede marcarse con un marcador detectable definido en la presente descripción. Preferentemente, se selecciona del grupo que consiste en una célula, una perla, un virus, una proteína y una nanopartícula. La célula puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Preferentemente, es una célula eucariota, por ejemplo, una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal. Las células animales incluyen células de insectos, nemátodos, peces y mamíferos. Más preferentemente, es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula de ratón, rata, mono o humana. Por ejemplo, puede ser una célula aleatoria de una población celular heterogénea (por ejemplo, de un tejido) o puede ser una célula seleccionada específicamente, seleccionada, por ejemplo, por FACS. Además, puede ser una célula de una línea celular o un cultivo homogéneo, por ejemplo de una célula primaria, en donde "primario" significa derivado directamente de un tejido u organismo y no manipulado para tener propiedades alteradas, por ejemplo, para dividirse indefinidamente. Otros ejemplos de células son células en desarrollo, células madre o células cancerosas. Los ejemplos preferidos de células son células productoras de anticuerpos (por ejemplo, células B o células de hibridoma) y células indicadoras, por ejemplo, que señalizan, preferentemente mediante fluorescencia, el efecto del anticuerpo producido por la célula productora de anticuerpos sobre la célula indicadora (por ejemplo, la activación o inhibición de un receptor, preferentemente un receptor acoplado a proteína G).
La "perla" (también denominada "microperla") es una partícula de polímero uniforme con un diámetro de hasta 1 micrómetro, preferentemente de 0,5 a 500 pm y con una superficie a la que se adhieren entidades biológicas tales como células, proteínas, que incluyen anticuerpos y/o ácidos nucleicos, así como también marcadores detectables, como se describe a continuación, que pueden unirse o acoplarse. Las perlas a las que se hace referencia en la presente descripción son habitualmente perlas de polietileno o poliestireno o perlas hechas de matrices de gel, por ejemplo, recubiertas con proteína/péptido/antígeno, por ejemplo, antígeno celular (por ejemplo, un antígeno de superficie celular).
El término "virus" se refiere a un pequeño agente infeccioso que se replica solo dentro de las células vivas de un organismo huésped. Preferentemente, es un virus patógeno, más preferentemente un virus patógeno en mamíferos, en particular humanos, por ejemplo, de la clase de herpesviridae, adenoviridae, papillomaviridae, polyomaviridae, poxviridae, anelloviridae, parvoviridae, reoviridae, coronaviridae, astroviridae, caliciviridae, flaviviridae, picornaviridae, togaviridae, rhabdoviridae, filoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, orthomyxoviridae, retroviridae o hapadnaviridae.
El término "proteína", tal como se usa en la presente descripción, indica un polipéptido con una estructura secundaria y terciaria particular que puede interactuar con otro analito y, en particular, con otras biomoléculas, que incluyen otras proteínas, ADN, ARN, lípidos, metabolitos, hormonas, quimiocinas y moléculas pequeñas. Puede ser una proteína natural (es decir, inalterada por el hombre) o recombinante. Preferentemente, aparte de las proteínas definidas anteriormente, tales como anticuerpos, es una molécula que se presenta en la superficie celular, un receptor o un ligando de receptor.
El término "nanopartícula" usado en la presente descripción se refiere a una partícula que tiene un diámetro de aproximadamente 1 a 1000 nm, preferentemente de 1 a 100 nm. Los componentes de la nanopartícula pueden incluir metales como oro, plata, cobre, aluminio, níquel, paladio, platino, sus aleaciones, un material semiconductor como CdSe, CdS, InAs, InP o estructuras de núcleo/carcasa de estos, o partículas orgánicas tales como partículas hechas de polímeros orgánicos, lípidos, azúcares u otros materiales orgánicos, por ejemplo, poliestireno, látex, acrilato o polipéptido. Dichas partículas orgánicas pueden contener opcionalmente algún material inorgánico; sin embargo, la cantidad de material inorgánico es inferior al 50 %, inferior al 25 %, inferior al 10 %, inferior al 5 % o inferior al 1 %.
El término "primera partícula" se refiere simplemente a una partícula comprendida en la gota microfluídica. "Primero" por sí mismo no describe ninguna propiedad ni está vinculado a ninguna propiedad a menos que se defina específicamente por referencia a la primera partícula; es simplemente un término que distingue una partícula de partículas adicionales.
El término "partícula adicional" se refiere a otra partícula que puede ser idéntica o diferente de la primera partícula y que está comprendida en una gota microfluídica adicional, preferentemente una gota microfluídica definida como la gota microfluídica del primer aspecto, en donde preferentemente la partícula o la posible pareja de unión de partículas de la primera y las siguientes gotas son diferentes. El término "partícula adicional" también puede entenderse como "partícula(s) adicional(es)", es decir, se refiere a una o más partículas adicionales, que están comprendidas en una o más gotas microfluídicas adicionales.
El término "asociado" se refiere a una proximidad espacial no aleatoria debida a una interacción directa o indirecta. Como se usa en la presente descripción, la interacción es unión directa o indirecta como se define a continuación para el primer y el segundo marcador detectable o la unión entre la partícula y la posible pareja de unión de partículas. También puede significar, por ejemplo, cuando la partícula es una célula, que el marcador detectable puede estar comprendido en la partícula, por ejemplo, se ubica dentro de la partícula.
El término "marcador detectable" (o "marcador" o "etiqueta") como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier tipo de sustancia que sea capaz de indicar la presencia de otra sustancia o complejo de sustancias, en particular de una partícula o una posible pareja de unión de partículas como se define en la presente descripción, cuando se asocia con él. El marcador detectable puede ser una sustancia que se une o se introduce o se incorpora a la sustancia a detectar. Se prefiere un marcador detectable adecuado para permitir la detección y opcionalmente también la cuantificación, por ejemplo, un marcador detectable que emite una señal detectable y preferentemente medible, preferentemente una señal luminosa. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen un colorante, un fluoróforo, una nanopartícula fluorescente (por ejemplo, punto cuántico o lipidot), un cromóforo, un radiomarcador, un coloide metálico, una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, luciferasa, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante) o una molécula quimioluminiscente o bioluminiscente. En el contexto de la presente invención, los marcadores detectables adecuados son preferentemente etiquetas de proteínas cuyas secuencias peptídicas se injertan genéticamente en o sobre una proteína recombinante. Las etiquetas de proteína son preferentemente etiquetas de fluorescencia. Las etiquetas de fluorescencia se usan para dar una lectura visual de una proteína. GFP y sus variantes (por ejemplo, GFP mutantes que tienen un espectro fluorescente diferente) y RFP y sus variantes (por ejemplo, RFP mutantes que tienen un espectro fluorescente diferente) son las etiquetas de fluorescencia más usadas. Las aplicaciones más avanzadas de GFP/RFP incluyen su uso como indicador de plegamiento (fluorescente si está plegado, incoloro si no lo está). Los ejemplos adicionales de fluoróforos incluyen fluoresceína, rodamina y colorante de sulfoindocianina Cy5.
El término "primer marcador detectable" se refiere a un marcador detectable que siempre se asocia con la primera partícula y opcionalmente, con una partícula adicional como se definió anteriormente. Puede conocerse la cantidad del primer marcador detectable asociado con la primera y opcionalmente, una partícula adicional. En el caso de que sólo se asocia con la primera partícula, es decir, en el caso de que no haya más partículas, se conoce la cantidad. Sin embargo, no es necesario conocer la cantidad del primer marcador detectable asociado con la primera partícula. En este caso, el primer marcador también se asocia con una partícula adicional como se definió anteriormente (es decir, el mismo tipo de marcador, ya que no es la misma molécula en el sentido de que una única molécula del primer marcador está unida a cada una de las primeras y una partícula adicional), en donde la cantidad de primer marcador asociado con la primera partícula es sustancialmente idéntica a la cantidad del primer marcador asociado con la partícula adicional, de hecho con todas las partículas adicionales. La cantidad del primer marcador detectable asociado con la primera y opcionalmente una partícula adicional no es 0.
De acuerdo con esta invención, el primer marcador detectable es diferente del segundo marcador detectable. En particular, si el primero y segundo marcadores detectables son colorantes, especialmente colorantes fluorescentes, difieren en su color, es decir, en la longitud de onda de la luz emitida.
En una modalidad preferida, la asociación de la primera partícula con el primer marcador es por unión directa o por unión indirecta a través de un enlazador. La "unión directa" puede ser una unión no covalente, pero preferentemente es una unión covalente del primer marcador detectable a la primera partícula sin una molécula adicional como intermediario. La "unión indirecta" es preferentemente una unión no covalente (por ejemplo, a través de interacciones biotina-estreptavidina) o covalente del primer marcador detectable a la primera partícula con una molécula adicional como intermediario, es decir, con un enlazador.
El término "segundo marcador detectable" se refiere a un marcador detectable que siempre se asocia con la posible pareja de unión de partículas. De acuerdo con esta invención, la asociación de la posible pareja de unión de partículas con el segundo marcador es por unión directa o por unión indirecta a través de un enlazador. La "unión directa" es preferentemente una unión covalente o no covalente del segundo marcador detectable a la posible pareja de unión de partículas sin una molécula adicional como intermediario. La "unión indirecta" es preferentemente una unión no covalente o covalente del segundo marcador detectable a la posible pareja de unión de partículas con una molécula adicional como intermediario, es decir, con un enlazador. Además, en dependencia de si la partícula y la posible pareja de unión se unen o no, el segundo marcador detectable también se asocia con la primera partícula o no. En una modalidad preferida, la asociación de la primera partícula con el segundo marcador se realiza mediante unión indirecta a través de la posible pareja de unión de partículas. Como tal, la asociación entre la(s) partícula(s) y el segundo marcador depende de si la posible pareja de unión de partículas se une a la partícula y la cantidad del segundo marcador asociado con la partícula depende de la afinidad de la posible pareja de unión con la partícula, así como también el número de sitios de unión si hay más de un sitio de unión en la partícula. Preferentemente, la unión entre la posible pareja de unión de partículas y la partícula es mediante uniones no covalentes, por ejemplo, mediante interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas, enlaces de hidrógeno y/o fuerzas de Van der Waals. En una modalidad preferida, la unión entre la posible pareja de unión de partículas y la partícula es específica. "Unión específica", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a una reacción de unión que determina la presencia de la posible pareja de unión (por ejemplo, la posible pareja de unión de partículas o la partícula), por ejemplo, en una situación en la que están presentes diferentes partículas o posibles parejas de unión, que no se unen específicamente. En general, "se une específicamente" se refiere a una constante de disociación de equilibrio KD que es inferior a aproximadamente 1°'5 M (por ejemplo, 1°'6 M, 1°'7 M, 1°'8 M, 1°'9 M, 10'1° M, 1°'11 M y 10-12 M o inferior), preferentemente a temperatura ambiente o a una temperatura adecuada para mantener las células, tal como aproximadamente 34-40 °C, 35-39 °C, 36-38 °C o preferentemente aproximadamente 37 °C. Los métodos para medir las constantes de disociación de equilibrio se conocen bien en la técnica. Un método preferido usa un sistema BiaCore®.
En una modalidad preferida, la cantidad del segundo marcador asociado con la primera partícula puede ser sustancialmente diferente de la cantidad del segundo marcador asociado con la partícula adicional, en donde "puede" significa que esto no es necesariamente así. En una modalidad relacionada, es sustancialmente diferente. Ambos incluyen preferentemente la posibilidad de que la cantidad del segundo marcador asociado con la primera y/o la partícula adicional sea 0. Mientras que en este caso no hay unión entre la posible pareja de unión de partículas y la partícula, la gota microfluídica todavía comprende también la posible pareja de unión de partículas y el segundo marcador detectable. "Sustancialmente diferente" significa que no es sustancialmente idéntico como se define en la presente descripción.
Generalmente, la idea es que pueda analizarse la unión, preferentemente la cantidad de unión, de una posible pareja de unión de partículas a una primera partícula. Esto incluye una modalidad en donde todas las posibles parejas de unión son idénticas y las partículas son diferentes (evaluación/selección de partículas), así como también una modalidad en donde las partículas son idénticas y las posibles parejas de unión son diferentes (evaluación/selección de parejas de unión de partículas). Por lo tanto, se prevé que en la primera modalidad, la posible pareja de unión de partículas de la primera partícula y la posible pareja de unión a partículas de la partícula adicional son idénticas; y en la última modalidad, la primera partícula y la partícula adicional son idénticas.
El término "posible pareja de unión de partículas" se refiere a cualquier tipo de pareja de unión, en donde "posible" significa que la pareja de unión de partículas puede o no unirse a la(s) partícula(s) dentro de la misma gota microfluídica. Preferentemente, la pareja de unión de partículas se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un mimético de anticuerpo, un bacteriófago, un complejo de ARNmpolipéptido, un complejo de ARNm-ribosoma-polipéptido, una célula, un virus, un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un aptámero y una molécula pequeña.
El término "anticuerpo" se refiere tanto a anticuerpos monoclonales como policlonales, es decir, cualquier proteína de inmunoglobulina o porción de esta que sea capaz de reconocer un antígeno o un hapteno. Los anticuerpos ilustrativos son IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY o IgW. En una modalidad particular, el anticuerpo se produce por una célula productora de anticuerpos, por ejemplo, una célula B o una célula de hibridoma, dentro de la misma gota microfluídica.
El término "derivado de anticuerpo", como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula que comprende al menos un dominio variable de anticuerpo, pero que no tiene la estructura general de un anticuerpo tal como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY o IgW, aunque sigue siendo capaz de unirse a una molécula diana. Dichos derivados pueden ser, pero no se limitan a, fragmentos de anticuerpos funcionales (es decir, unión a diana, particularmente unión a diana específica) tales como Fab, Fab2, scFv, Fv o partes de estos u otros derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas tales como nanocuerpos, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio único de camélido, dominios únicos o fragmentos Fab, dominios de las cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tales como Fd, VL, que incluye Vlambda y Vkappa, VH, VHH), así como también minidominios que consisten en dos cadenas beta de un dominio de inmunoglobulina conectadas por al menos dos bucles estructurales. Preferentemente, el derivado de anticuerpo es monovalente. Más preferentemente, el derivado es un anticuerpo monocatenario, con la mayor preferencia que tiene la estructura VL-enlazador peptídico-VH o VH-enlazador peptídico-VL.
El término "enlazador peptídico" a este respecto se refiere a una cadena peptídica de entre 1 y 100 aminoácidos. En modalidades preferidas, un enlazador peptídico tiene una longitud mínima de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. En modalidades preferidas adicionales, un enlazador peptídico usado en la presente invención tiene una longitud máxima de 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 aminoácidos. Los intervalos preferidos son de 5 a 25 y de 10 a 20 aminoácidos de longitud. Se prefiere que el enlazador peptídico sea un enlazador peptídico flexible, es decir, que proporcione flexibilidad entre los dominios que están unidos entre sí. Dicha flexibilidad generalmente aumenta si los aminoácidos son pequeños y no tienen cadenas laterales voluminosas que impidan la rotación o la flexión de la cadena de aminoácidos. Por lo tanto, preferentemente, el enlazador peptídico usado en la presente invención tiene un mayor contenido de aminoácidos pequeños, en particular de glicinas, alaninas, serinas, treoninas, leucinas e isoleucinas. Preferentemente, al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80, 90 % o más de los aminoácidos del enlazador peptídico son aminoácidos pequeños. En una modalidad preferida, los aminoácidos del enlazador se seleccionan de glicinas y serinas, es decir, dicho enlazador es una poliglicina o un enlazador poliglicina/serina, en donde "poli" significa una relación de al menos 50 %, 60 % 70 %, 80, 90 % o incluso 100 % de residuos de glicina y/o serina en el enlazador. En modalidades especialmente preferidas, pueden combinarse las longitudes mínima y máxima preferidas indicadas anteriormente del enlazador peptídico usado en la presente invención.
El término "anticuerpo mimético", como se usa en la presente descripción, se refiere a compuestos orgánicos que, como los anticuerpos, pueden unirse específicamente a antígenos, pero que no están relacionados estructuralmente con los anticuerpos. Habitualmente son péptidos o proteínas artificiales con una masa molar de aproximadamente 3 a 20 kDa. Los ejemplos no limitantes de miméticos de anticuerpos son afficuerpos, afilinas, afímeros, afitinas, anticalinas, avímeros, DARPins, finómeros, péptidos del dominio de Kunitz, monocuerpos, dominio Z de la proteína A, gamma B cristalina, ubiquitina, cistatina, Sac7D de Sulfolobus acidocaldarius, lipocalina, el dominio A de un receptor de membrana, motivo de repetición de anquirina, el dominio SH3 de Fyn, el dominio Kunits de inhibidores de proteasa, el 10mo dominio de tipo III de la fibronectina, ligandos heterobivalentes o heteromultivalentes sintéticos (Josan y otros, Bioconjug Chem. 2011 22(7): 1270-1278; Xu y otros, PNAS 2012 109 (52) 21295-21300; Shallal y otros, Bioconjug Chem. 201425(2) 393-405) o ligandos de péptidos sintéticos o no sintéticos, por ejemplo, a partir de una biblioteca de péptidos (al azar). Los ligandos peptídicos sintéticos tienen secuencias de aminoácidos no naturales que funcionan para unirse a una molécula diana particular. Los ligandos peptídicos dentro del contexto de la presente invención generalmente están restringidos (es decir, tienen algún elemento de estructura como, por ejemplo, la presencia de aminoácidos que inician un giro p o una lámina plisada p, o por ejemplo, ciclados por la presencia de residuos de Cys enlazados por disulfuro) o secuencias de aminoácidos no restringidas (lineales) de menos de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos y preferentemente menos de aproximadamente 40 residuos de aminoácidos. De los ligandos peptídicos de menos de aproximadamente 40 o 50 residuos de aminoácidos, se prefieren los ligandos peptídicos de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 residuos de aminoácidos.
El término "bacteriófago" se refiere a un virus que infecta y se replica en bacterias. En una modalidad preferida, el bacteriófago presenta una proteína o péptido heterólogo (es decir, extraño) al bacteriófago, que de acuerdo con la presente invención es la posible pareja de unión de partículas. Esta modalidad se basa en la presentación en fagos, que es una técnica para estudiar las interacciones con péptidos o proteínas que presenta el bacteriófago. En esta técnica, un gen que codifica una proteína de interés se inserta en un gen de la proteína de la cubierta del fago, lo que provoca que el fago presente la proteína en su exterior mientras contiene el gen de la proteína en su interior, lo que da como resultado una conexión entre el genotipo y el fenotipo. Estos fagos de presentación pueden seleccionarse después frente a la(s) partícula(s), con el fin de detectar la interacción entre el péptido o la proteína presentados y la(s) partícula(s). De esta manera, grandes bibliotecas de péptidos o proteínas pueden seleccionarse y amplificarse en un proceso llamado selección in vitro. Los bacteriófagos preferidos son el fago M13, el fago filamentoso fd, el fago T4, el fago T7 y el fago lambda.
El término "complejo de ARNm-polipéptido" se refiere a un complejo para la presentación de ARNm. La presentación de ARNm es una técnica de presentación usada para la evolución de proteínas y/o péptidos in vitro para crear moléculas que puedan unirse a una diana deseada. El proceso da como resultado péptidos o proteínas traducidos que se asocian con su progenitor de ARNm a través de un enlace de puromicina. Después, el complejo se une a una diana inmovilizada en una etapa de selección. Las fusiones de ARNm-proteína que se unen bien se transcriben de forma inversa a ADNc y su secuencia se amplifica a través de una reacción en cadena de la polimerasa. El resultado es una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido con alta afinidad por la molécula de interés. Véase también Lipovsek y Plückthun, Journal of Immunological Methods 290 (2004) 51 - 67.
El término "complejo ARNm-ribosoma-polipéptido" se refiere a un complejo para la presentación de ribosomas. La presentación de ribosomas es una técnica usada para realizar la evolución de proteínas in vitro para crear proteínas que puedan unirse a un ligando deseado. El proceso da como resultado proteínas traducidas que se asocian con su progenitor de ARNm que se usa, como un complejo, para unirse a un ligando inmovilizado en una etapa de selección. Los híbridos de ARNm-proteína que se unen bien se transcriben de forma inversa a ADNc y su secuencia se amplifica a través de PCR. El resultado final es una secuencia de nucleótidos que puede usarse para crear proteínas de unión estrecha. Véase también Lipovsek y Plückthun, Journal of Immunological Methods 290 (2004) 51 -67.
El término "célula" se refiere a una célula como se definió anteriormente.
El término virus se refiere a un pequeño agente infeccioso que se replica solo dentro de las células vivas de un organismo huésped. Preferentemente, es un virus patógeno, más preferentemente un virus patógeno en mamíferos, en particular humanos, por ejemplo, de la clase de herpesviridae, adenoviridae, papillomaviridae, polyomaviridae, poxviridae, anelloviridae, parvoviridae, reoviridae, coronaviridae, astroviridae, caliciviridae, flaviviridae, picornaviridae, togaviridae, rhabdoviridae, filoviridae, paramyxoviridae, arenaviridae, bunyaviridae, orthomyxoviridae, retroviridae o hapadnaviridae. Preferentemente, la posible pareja de unión de partículas no es un virus si la partícula es un virus.
Una proteína como posible pareja de unión de partículas puede ser una proteína natural o recombinante. Preferentemente, aparte de las proteínas definidas anteriormente, tales como los anticuerpos, es una proteína que se presenta o está presente en la superficie de una célula, un receptor o un ligando del receptor.
Un ácido nucleico como posible pareja de unión de partículas puede ser un ácido nucleico natural o recombinante. Los ácidos nucleicos preferidos son ADN, ARN y análogos de ácidos nucleicos de estos. Los análogos nucleicos son compuestos que son estructuralmente similares al ARN y al ADN naturales. Los ácidos nucleicos son cadenas de nucleótidos, que se componen de tres partes: una cadena principal de fosfato, una pentosa con forma de fruncido, ya sea ribosa o desoxirribosa, y una de cuatro nucleobases. Un análogo puede tener cualquiera de estos alterados. Típicamente, las nucleobases análogas confieren, posiblemente entre otras cosas, diferentes propiedades de apareamiento y apilamiento de bases. Los ejemplos incluyen bases universales, que pueden emparejarse con las cuatro bases canónicas. Los análogos nucleicos, también denominados ácidos nucleicos artificiales, incluyen ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino, ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA) y ácido nucleico de treosa (TNA). Cada uno de estos se distingue del ADN o ARN natural por cambios en la cadena principal de la molécula. Un análogo de ácido nucleico preferido es el aptámero del ácido L-ribonucleico (aptámero de L-ARN, nombre comercial Spiegelmer), que es una molécula similar al ARN construida a partir de unidades de L-ribosa. Es una imagen especular de los oligonucleótidos naturales y una forma de aptámero. Debido a sus L-nucleótidos, es altamente resistente a la degradación por nucleasas.
El término "aptámero" se refiere a una molécula de oligonucleótido o péptido que se une a una molécula diana específica. Los aptámeros habitualmente se crean tras seleccionarlos de un gran grupo de secuencias aleatorias, pero también existen aptámeros naturales en ribointerruptores.
El término "moléculas pequeñas" se refiere a moléculas que tienen un peso molecular entre 50 y aproximadamente 2500 Dalton, preferentemente en el intervalo de 200 a 800 Dalton. En una modalidad preferida, dicha molécula pequeña se deriva de una biblioteca, por ejemplo, una biblioteca de inhibidores de moléculas pequeñas. Las bibliotecas de compuestos pequeños incluyen una pluralidad de compuestos químicos y se han ensamblado a partir de cualquiera de múltiples fuentes, que incluye moléculas sintetizadas químicamente y productos naturales o se han generado mediante técnicas de química combinatoria. Pueden comprender compuestos químicos de una estructura particular o compuestos de un organismo particular tal como una planta. Generalmente, los compuestos pequeños pueden derivarse o seleccionarse a partir de bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, las bibliotecas de compuestos sintéticos están disponibles comercialmente en Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), ChemBridge Corporation (San Diego, CA) o Aldrich (Milwaukee, WI). Una biblioteca de compuestos naturales está disponible, por ejemplo, en TimTec LLC (Newark, DE). Alternativamente, pueden usarse bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos de células y tejidos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Además, los compuestos de prueba pueden producirse sintéticamente mediante el uso de química combinatoria ya sea como compuestos individuales o como mezclas. Una colección de compuestos elaborados mediante el uso de química combinatoria se denomina en la presente descripción biblioteca combinatoria.
El término "conocido" comprende el conocimiento proporcionado por un tercero o determinado por uno mismo de antemano.
El término "cantidad sustancialmente idéntica" se refiere a una cantidad equivalente y no necesariamente significa exactamente lo mismo. Se determina más bien por lo que el experto en la técnica puede considerar sustancialmente idéntico, similar o comparable en vista de lo que es técnicamente factible cuando se proporciona la "cantidad sustancialmente idéntica". Allí, las desviaciones son normales y aceptables dentro de unos límites: En la invención, esta es una desviación de hasta ± 50 %.
En una modalidad preferida, la desviación puede ser de hasta ± 40 %, hasta ± 30 %, hasta ± 20 % o incluso solo hasta ± 10 % o ± 5 %, calculada preferentemente a partir de una partícula de referencia arbitraria tal como la primera partícula, a partir de una partícula con el valor medio de una población de al menos tres partículas (en donde, si el número de partículas en la población es tal que dos partículas podrían proporcionar el valor medio, la partícula se toma como la mediana que tiene el valor cercano al promedio de la población) o a partir del valor promedio de una población de al menos dos partículas. Por consiguiente, en lugar de la expresión "cantidad sustancialmente idéntica", puede usarse la expresión "cantidad sustancialmente similar". Se prevé que si los métodos de marcaje no logran la uniformidad deseada, es decir, una cantidad sustancialmente idéntica para una población de partículas (por ejemplo, de al menos dos o al menos tres partículas), partículas con la uniformidad deseada, es decir, con una cantidad deseada de marcador, puede seleccionarse de la población inicial creada por el método de marcaje, por ejemplo con el método del tercer aspecto de la invención que incluye una etapa (d) de clasificación como se describe a continuación.
En una modalidad particular, la gota microfluídica comprende además (i) una partícula no aglutinante o (ii) una segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas, en donde la partícula no aglutinante o la segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas se ha asociado con una cantidad de un tercer marcador detectable, en donde la asociación de la partícula no aglutinante o la segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas con una cantidad de un tercer marcador detectable es una interacción directa o indirecta, y en donde la interacción directa es una unión covalente o no covalente sin una molécula adicional como intermediario, y en donde la interacción indirecta es una unión no covalente o covalente con una molécula adicional como intermediario.
El término "partícula no aglutinante" o "no aglutinante de la partícula" se refiere a cualquier tipo de compuesto o estructura que no se une a la(s) partícula(s) dentro de la misma gota microfluídica. Preferentemente, la pareja de unión de partículas se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un mimético de anticuerpo, un bacteriófago, un complejo de ARNm-polipéptido, un complejo de ARNm-ribosoma-polipéptido, una célula, un virus, un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un aptámero y una molécula pequeña. Más preferentemente, es del mismo tipo que la posible pareja de unión de partículas, es decir, si la posible pareja de unión es un anticuerpo, la partícula no aglutinante es un anticuerpo, si la posible pareja de unión es un derivado de anticuerpo, la partícula no aglutinante es un derivado de anticuerpo, y así sucesivamente.
La "segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas" o simplemente la "segunda partícula" es una partícula como se definió anteriormente que es diferente de la primera partícula, aunque puede ser del mismo tipo, es decir, si la primera partícula es una célula, la segunda partícula también es una célula y si la primera partícula es una perla, la segunda partícula también es una perla y así sucesivamente.
El término "tercer marcador detectable" se refiere a un marcador detectable que siempre se asocia con la partícula no aglutinante o la segunda partícula, respectivamente. En una modalidad preferida, la asociación de la partícula no aglutinante o la segunda partícula, respectivamente, con el tercer marcador es por unión directa o por unión indirecta a través de un enlazador. La "unión directa" es preferentemente una unión covalente o no covalente del tercer marcador detectable a la partícula no aglutinante o a la segunda partícula, respectivamente, sin otra molécula como intermediario. La "unión indirecta" es preferentemente una unión no covalente o covalente del tercer marcador detectable a la partícula no aglutinante o a la segunda partícula, respectivamente, con una molécula adicional como intermediario, es decir, con un enlazador. Dado que la partícula no aglutinante no se une a la(s) partícula(s) o la segunda partícula no se une a la posible pareja de unión de partículas, respectivamente, el tercer marcador detectable no se asocia (i) con la primera partícula o una partícula adicional o (ii) con la posible pareja de unión de partículas, respectivamente. Generalmente, el tercer marcador detectable es diferente, es decir, distinguible, del primer y del segundo marcador detectable.
La idea del uso de la partícula no aglutinante o la segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas es la inclusión de una contraselección como se ilustra en el Ejemplo 4, es decir, la posibilidad de seleccionar la unión entre la primera partícula y la posible pareja de unión de partículas mientras que al mismo tiempo se selecciona contra la unión entre la primera partícula y la partícula no aglutinante o entre la posible pareja de unión de partículas y la segunda partícula.
La selección y selección en contra a este respecto puede implicar la clasificación de la gota microfluídica para la unión entre la primera partícula y la posible pareja de unión de partículas y para la no unión entre la primera partícula y la partícula no aglutinante o entre la posible pareja de unión de partículas y la segunda partícula, con la clasificación como se describió en la presente descripción, en particular con respecto al tercer aspecto de la invención.
En una modalidad preferida, la invención se refiere a una pluralidad de gotas microfluídicas del primer aspecto, en donde las partículas son idénticas en todas las gotas microfluídicas y las posibles parejas de unión de partículas son diferentes entre las gotas microfluídicas o las posibles parejas de unión de partículas son idénticas en todas las gotas microfluídicas y las partículas son diferentes entre las gotas microfluídicas.
En una modalidad particular, cada gota microfluídica de la pluralidad de gotas microfluídicas comprende una partícula no aglutinante o una segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas.
El término "población" o "pluralidad" significa "más de uno". En modalidades preferidas, significa más de 10, más de 20, más de 30, más de 40, más de 50, más de 100, más de 250, más de 500 o más de 1000.
En una modalidad de la gota microfluídica de acuerdo con el primer aspecto de esta invención, la partícula es una célula seleccionada de una célula productora de anticuerpos o una célula indicadora, en donde la célula indicadora es capaz de señalizar un efecto de un anticuerpo producido por una célula productora de anticuerpos sobre la célula indicadora.
Una modalidad adicional se refiere a la gota microfluídica de acuerdo con el primer aspecto de esta invención, en donde el efecto es la activación o inhibición de un receptor, tal como un receptor acoplado a la proteína G.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para cuantificar la unión entre una partícula y una posible pareja de unión de partículas en una gota microfluídica de acuerdo con el primer aspecto, que comprende las etapas de
(i) medir la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
(ii) medir la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable, y
(iii) normalizar la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable mediante el uso de la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
en donde la intensidad normalizada del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable representa la cantidad de unión entre la partícula y la posible pareja de unión de partículas.
Todos los términos tienen los significados definidos anteriormente y las modalidades definidas en relación con estos términos también se aplican al método del segundo aspecto.
Dicho método del segundo aspecto es para cuantificar la unión entre una partícula y una posible pareja de unión de partículas en una gota microfluídica de acuerdo con el primer aspecto, que comprende las etapas de
(i) medir la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
(ii) medir la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable, y
(iii) normalizar la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable mediante el uso de la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
en donde la intensidad normalizada del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable representa la cantidad de unión entre una partícula y una pareja de unión de partículas.
Preferentemente, la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable se mide en el mismo lugar dentro de la gota microfluídica que la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable, más preferentemente al mismo tiempo, es decir, simultáneamente.
"Medir la señal" se refiere a medir la intensidad de la señal o la intensidad de la señal del marcador detectable en cualquier posición dentro de la gota, es decir, no necesariamente en la posición del marcador dentro de la gota. La intensidad de la señal varía dentro de la gota según la posición del marcador detectable, pero la medición en cualquier posición (que incluye otra) se compensa mediante el uso de dos marcadores detectables, es decir, el primer y el segundo marcador y la etapa de normalización. Esta etapa de normalización permite cuantificar la unión independientemente de la posición de los marcadores dentro de la gota y de la posición en la que se mide la señal, siempre que la señal de todos los marcadores se mida en la misma posición, véase la Figura 5. Los medios para la detección dependen del marcador detectable usado. Preferentemente, el marcador detectable emite una señal luminosa. Las señales luminosas pueden medirse, por ejemplo, mediante detectores de luz, por ejemplo, tubos fotomultiplicadores, cámaras CMOS o CCD. Si el marcador detectable es excitable, la etapa de determinar la cantidad puede incluir una etapa de excitación, por ejemplo, con una fuente de luz láser. En una modalidad preferida, la señal es fluorescencia inducida por láser y la señal se detecta, es decir, se determina la cantidad, mediante espectroscopia láser.
"Normalizar", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a ajustar el valor de la señal del primer marcador detectable de la etapa (i) con el valor de la señal del primer marcador detectable de la etapa (ii). En principio, cualquier ajuste sirve para la normalización, por ejemplo el ajuste por cualquier operación matemática tal como suma, resta, multiplicación, división o cualquier combinación de estas. En una modalidad preferida, la etapa (iii) comprende dividir el valor de la señal del segundo marcador por el valor de la señal del primer marcador.
En otra modalidad preferida, la etapa (iii) comprende además normalizar la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador tras sustraer el fondo del segundo marcador detectable, preferentemente además de la división anterior, más preferentemente antes de la división. El fondo del segundo marcador detectable es la señal del segundo marcador detectable que no se asocia con la partícula. Puede determinarse, por ejemplo, en una ubicación en la gota microfluídica donde la señal del primer marcador detectable es 0 o mínima dentro de la gota microfluídica. Alternativamente, es la señal del segundo marcador en una gota microfluídica de control, que puede estar vacía (es decir, que no comprende al menos marcadores detectables o incluso ninguna partícula ni una posible pareja de unión de partículas) o que difiere de la gota microfluídica de acuerdo con el primer aspecto solo porque el segundo marcador no se asocia con la primera partícula en la gota microfluídica de control, es decir, porque la posible pareja de unión de partículas a la que está unido el segundo marcador no se une específicamente a la partícula, o porque la primera partícula no está presente en la gota microfluídica de control.
En una modalidad particular, el método del segundo aspecto comprende una etapa (iv) de medir la intensidad del valor máximo de la señal de un tercer marcador detectable que se ha asociado con una partícula no aglutinante o una segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas mediante una interacción directa o indirecta, en donde la interacción directa es una unión covalente o no covalente sin otra molécula como intermediario y en donde la interacción indirecta es una unión no covalente o covalente con otra molécula como intermediario, como se definió anteriormente.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar una o más partículas comprendidas en una gota microfluídica como se define en las reivindicaciones, que comprende las etapas de:
a) alimentar una gota microfluídica que comprende una o más partículas en un canal de detección que comprende un punto de detección,
b) restringir al menos el movimiento vertical de la(s) partícula(s) dentro de la gota microfluídica al menos en el punto de detección en el canal de detección, en comparación con la misma gota microfluídica cuando tiene forma esférica, y
c) detectar al menos una partícula comprendida en la gota microfluídica en el punto de detección.
El término "canal" puede significar un rebaje o cavidad formada en un material tras impartir un patrón en un material o mediante cualquier técnica de eliminación de material adecuada, o puede significar un rebaje o cavidad en combinación con cualquier estructura conductora de fluidos adecuada montada en el rebaje o la cavidad, tal como un tubo, capilar o similar. Generalmente, se refiere a un microcanal de un diámetro de 3000 pm o inferior, 2000 pm o inferior, 1000 pm o inferior, preferentemente 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50 nm o inferior, preferentemente el diámetro está entre 20 nm y 3000 pm, preferentemente entre 20 nm y 1000 pm y más preferentemente entre 20 nm y 100 pm. En una modalidad preferida, el canal es parte de una red de microfluidos. Si el canal no tiene una sección transversal circular, la altura y/o el ancho del canal son de acuerdo con los tamaños indicados para el diámetro anterior.
En la presente descripción se describen varios tipos de canales, tales como un canal de alimentación, un canal de detección, un canal de clasificación y canales de ramificación. Estos términos no necesariamente delimitan un tipo de canal de otro, ya que estos términos describen parcialmente secciones del canal cuyos límites no están definidos en todos los casos. Por ejemplo, el canal de alimentación se fusiona con el canal de detección aguas abajo de este y el canal de detección se fusiona con el canal de clasificación aguas abajo de este. Una demarcación clara es solo la unión de clasificación, que es donde termina el canal de clasificación y comienzan los canales de ramificación. De lo contrario, los canales o secciones de canales pueden distinguirse por su altura y opcionalmente, por su ancho, tal como se define a continuación o por otras características que posean, tales como un punto de detección, un medio de clasificación, etc.
El término "canal de detección" se refiere a un canal o parte de un canal donde las gotas microfluídicas o su contenido pueden detectarse en un "punto de detección". Preferentemente, una o más, más preferentemente todas las paredes del canal de detección son transparentes al menos en el punto de detección.
El término "movimiento vertical" se refiere al movimiento de la(s) partícula(s) o el espacio para el movimiento dentro de la gota microfluídica en la dirección de la gravedad o en sentido contrario cuando el canal de detección y, en particular, un dispositivo microfluídico (por ejemplo, un chip) que comprende el canal de detección está en la posición u orientación espacial prevista, por ejemplo, acostado sobre un área horizontal.
"Restringir" el movimiento vertical se refiere a una reducción del movimiento vertical o del espacio para el movimiento de la partícula dentro de la gota microfluídica. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el confinamiento del espacio vertical dentro de la gota en el que la(s) partícula(s) puede(n) moverse, es decir, tras deformar la gota, lo que da como resultado un espacio vertical reducido. En una modalidad preferida, la altura del canal de detección es menor al menos en el punto de detección que el diámetro de la gota cuando tiene forma esférica, es decir, la altura reducida del canal conduce a una deformación de la gota que da como resultado un espacio vertical reducido. En otra modalidad, los electrodos por debajo o por encima del canal de detección, preferentemente en el punto de detección, pueden tirar de la gota hacia la parte inferior o superior del canal mediante la aplicación de voltajes de AC con una fuerza suficiente para deformar la gota, lo que da como resultado un espacio vertical reducido dentro de la gota.
En una modalidad preferida, la etapa (b) comprende restringir también el movimiento horizontal de la(s) partícula(s) dentro de la gota microfluídica al menos en el punto de detección en el canal de detección, en comparación con la misma gota microfluídica cuando tiene forma esférica. El término "movimiento horizontal" se refiere al movimiento en un ángulo de 90° con respecto al movimiento vertical como se definió anteriormente. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el confinamiento del espacio horizontal dentro de la gota en el que la(s) partícula(s) puede(n) moverse, es decir, tras deformar la gota, lo que da como resultado un espacio horizontal reducido. En una modalidad preferida, el ancho del canal de detección es más pequeño al menos en el punto de detección que el diámetro de la gota cuando tiene forma esférica, es decir, el ancho reducido del canal conduce a una deformación de la gota, lo que da como resultado un espacio horizontal reducido. En otra modalidad, los electrodos en un lado del canal de detección, preferentemente en el punto de detección, pueden tirar de la gota hacia el lado del canal tras aplicar voltajes de AC con una fuerza suficiente para deformar la gota, lo que da como resultado un espacio horizontal reducido.
Por consiguiente, en una modalidad preferida, el movimiento vertical y opcionalmente también el movimiento horizontal de la(s) partícula(s) está restringido por la altura del canal y opcionalmente el ancho y/o por dielectroforesis. En el primer caso (constricción de altura y ancho), la gota microfluídica forma un tapón en el canal de detección al menos en el punto de detección, es decir, llena la sección transversal del canal y no más que una fina película del fluido (el líquido inmiscible) rodea la gota microfluídica.
El término "forma esférica" se refiere a una forma de la gota que no está confinada en el espacio y cuando no se mueve. Preferentemente, el diámetro de una gota esférica es uniforme, es decir, el mismo en cualquier punto, con una desviación de hasta 1, 2, 3, 4, 5 o hasta 10 %.
El término "detectar" una partícula se refiere a determinar la presencia o ausencia de la partícula. En una modalidad preferida, una partícula se detecta mediante la detección de un marcador asociado con la partícula, tal como un primer marcador como se definió anteriormente. Los medios de detección se conocen bien en la técnica e incluyen los medios indicados anteriormente, por ejemplo, detectores de luz, por ejemplo, tubos fotomultiplicadores, cámaras CMOS o CCD, o electrodos de detección. Generalmente, el medio de detección es adecuado para detectar una partícula y/o una gota microfluídica marcadora como se define en la presente descripción. En particular con respecto al marcador, el medio de detección es adecuado para medir la intensidad de la señal de un marcador y preferentemente para medir la señal de un marcador. Por lo tanto, en una modalidad preferida, los medios de detección detectan un marcador asociado con una o más partículas y, opcionalmente, los medios de detección miden la señal del marcador asociado con una o más partículas.
En una modalidad particularmente preferida, la detección en la etapa (c) comprende una cuantificación de acuerdo con el método del segundo aspecto.
En una modalidad, la gota microfluídica se alimenta al canal de detección en la etapa (a) a través de un canal de alimentación aguas arriba del canal de detección, caracterizado porque la altura y el ancho del canal de alimentación son tales que el movimiento vertical y horizontal de la(s) partícula (s) dentro de la gota microfluídica no se restringen, es decir, de manera que la gota microfluídica tiene forma esférica. En particular, la gota microfluídica no forma un tapón en el canal de alimentación. El término "canal de alimentación" se refiere a un canal que suministra fluidos y gotas microfluídicas al canal de detección.
En una modalidad preferida, el canal de detección y alimentación se caracterizan porque la altura y, opcionalmente, el ancho del canal de detección al menos en el punto de detección es inferior a 100, 90, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o inferior al 10 % de la altura y, opcionalmente, del ancho del canal de alimentación. Preferentemente, la altura y opcionalmente el ancho del canal de detección al menos en el punto de detección está entre 20 y 50 pm, preferentemente entre 30 y 40 pm y/o la altura y opcionalmente el ancho del canal de alimentación está entre 50 y 3000 pm, preferentemente entre 100 y 1000 pm.
Además, el canal de detección puede caracterizarse porque la altura y opcionalmente el ancho del canal de detección al menos en el punto de detección es inferior al 100, 90, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o inferior al 10 % de la altura promedio y opcionalmente, el ancho promedio de todos los canales comprendidos en el mismo dispositivo microfluídico como canal de detección. Preferentemente, la altura y opcionalmente el ancho del canal de detección al menos en el punto de detección está entre 20 y 50 pm, preferentemente entre 30 y 40 pm y/o la altura promedio y opcionalmente el ancho promedio de todos los canales comprendidos en el mismo dispositivo microfluídico ya que el canal de detección está entre 50 y 3000 pm, preferentemente entre 100 y 1000 pm.
En una modalidad preferida, el método del tercer aspecto comprende además una etapa (d) de clasificación de la gota microfluídica basada en la detección de la(s) partícula(s), en particular basada en la señal de la(s) partícula(s) detectada(s), en un canal de clasificación aguas abajo del canal de detección, preferentemente en una unión de clasificación al final del canal de clasificación.
El término "clasificación" se refiere a seleccionar o separar una gota microfluídica basada en sus propiedades, preferentemente basada en su contenido, que incluye la presencia o ausencia de una o más partículas, las posibles parejas de unión de partículas y/o partículas unidas a posibles parejas de unión de partículas como se describió anteriormente. Cómo pueden detectarse estos contenidos también se describió anteriormente.
El término "canal de clasificación" se refiere a un canal o parte de un canal donde las gotas microfluídicas pueden clasificarse mediante el uso de un medio de clasificación tal como un divisor de clasificación, es decir, el canal de clasificación comprende preferentemente un divisor de clasificación. El término "divisor de clasificación" se refiere a una geometría de canal que comprende un canal de clasificación que tiene una unión de clasificación, donde el canal de clasificación se ramifica en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o al menos 10 canales de ramificación. Asociado con el divisor de clasificación habitualmente es una fuerza de clasificación o un medio de manipulación, que puede basarse en la dielectroforesis (X. Hu y otros, Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc Natl Acad Sci USA 102, 15757 (1 de noviembre de 2005)), válvulas (A. Y. Fu, C. Spence, A. Scherer, F. H. Arnold, S. R. Quake, A microfabricated fluorescence-activated cell sorter. Nat Biotechnol 17, 1109 (noviembre de 1999)), óptica (Z. C. Landry, S. J. Giovanonni, S. R. Quake, P. C. Blainey, Optofluidic cell selection from complex microbial communities for single-genome analysis. Methods in enzymology 531, 61 (2013)), acústica (L. Schmid, D. A. Weitz, T. Franke, Sorting drops and cells with acoustics: acoustic microfluidic fluorescence-activated cell sorter. Lab on a Chip 14, 3710 (7 de octubre de 2014))) o desviación de la corriente, preferentemente desviación de la corriente eléctrica (P. S. Dittrich, P. Schwille, An integrated microfluidic system for reaction, high-sensitivity detection, Anal Chem.;75(21):5767-74. (2003)).
En consecuencia, el divisor de clasificación puede ser un divisor de clasificación DEP, un divisor de clasificación por acustoforesis, un divisor de clasificación basado en microválvulas, un divisor de clasificación piezoeléctrico o un divisor de clasificación de deflexión de flujo dinámico. Se prefiere un divisor de clasificación DEP. En una modalidad particular, el divisor de clasificación d Ep es un divisor de clasificación dielectroforético ópticamente inducido (ODEP).
Por lo tanto, con respecto a la modalidad que comprende la etapa adicional (d), el canal de clasificación comprende preferentemente un divisor de clasificación que comprende una unión de clasificación donde el canal de clasificación se ramifica en al menos dos canales de ramificación. En una modalidad más preferida, el canal de clasificación comprende además un medio de manipulación de gotas, preferentemente seleccionado de los medios descritos anteriormente, más preferentemente un medio de manipulación de fuerza dielectroforética (DEP).
En una modalidad preferida, la altura y el ancho del canal de clasificación y preferentemente también de los canales de ramificación son tales que el movimiento vertical y horizontal de la(s) partícula(s) dentro de la gota microfluídica no se restringe, es decir, tal que la gota microfluídica tiene forma esférica. En particular, la gota microfluídica no forma un tapón en el canal de clasificación y preferentemente tampoco en los canales de ramificación.
En una modalidad preferida, el canal de detección y clasificación (preferentemente también los canales de ramificación) se caracterizan porque la altura y opcionalmente el ancho del canal de detección al menos en el punto de detección es inferior al 100, 90, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o inferior al 10 % de la altura y opcionalmente el ancho del canal de clasificación (preferentemente también de los canales de ramificación). Preferentemente, la altura y opcionalmente el ancho del canal de detección al menos en el punto de detección está entre 20 y 50 pm, preferentemente entre 30 y 40 pm y/o la altura y opcionalmente el ancho del canal de clasificación (preferentemente también de los canales de ramificación) está entre 50 y 3000 pm, preferentemente entre 100 y 1000 pm.
De acuerdo con la presente invención, el control tanto de la detección como de la clasificación de la gota microfluídica puede realizarse mediante el uso de un objetivo con un aumento de al menos 20x, preferentemente de al menos 30x, más preferentemente de al menos 40x o incluso de al menos 50x (es decir, dentro del mismo campo de visión del objetivo). Preferentemente, esta detección y clasificación se realiza mediante el uso de un microscopio que tiene dicho objetivo. Para esta modalidad, es ventajoso que la distancia entre el punto de detección y la unión de clasificación sea de 500 pm o inferior, 400 pm o inferior, 300 pm o inferior, 200 pm o inferior, o 100 pm o inferior, en donde la distancia mínima en cada caso es de al menos 50 pm. Preferentemente, independientemente de o incluyendo la limitación mencionada anteriormente, la distancia es inferior a 10x, 9x, 8x, 7x, 6x, 5x o incluso 3x del diámetro de la gota microfluídica en forma esférica. En este sentido, el término "distancia" no se refiere a la distancia que recorre una gota en el canal, sino a la distancia espacial más corta entre los puntos independientemente de la ruta del canal.
De acuerdo con la presente invención, el canal de clasificación y/o detección puede estar retorcido o doblado, tanto en el sentido de no ser recto, aguas abajo del punto de detección del canal de detección como aguas arriba de la unión de clasificación. "Retorcido" o "doblado" a este respecto significa preferentemente tener un ángulo lateral (es decir, hacia la izquierda o hacia la derecha desde una vista superior) de al menos 5°, 10°, 20°, 30°, 40°, 45°, 50°, 60°, 70°, 80° o 90°, preferentemente de 10° a 90°, más preferentemente de 10° a 45°. Esto contribuye ventajosamente a lograr una distancia corta entre el punto de detección y la unión de clasificación.
De acuerdo con la presente invención, el método para detectar una o más partículas comprendidas en una gota microfluídica puede comprender además inyectar fluido en el canal de clasificación a través de entradas de fluido aguas arriba de la unión de clasificación, por consiguiente se controlan las gotas que pasan, para facilitar la clasificación. Esto significa (aquí y en modalidades correspondientes en la presente descripción) que el fluido se inyecta aguas abajo del punto de detección del canal de detección y que las entradas de fluido correspondientes están aguas abajo del punto de detección y aguas arriba de la unión de clasificación. "Controlar las gotas que pasan" significa preferentemente espaciarlas a una distancia mínima o definida entre sí y/o concentrarlas cerca de la unión de clasificación. En una modalidad preferida, las gotas están espaciadas de tal manera que la distancia entre dos gotas consecutivas es al menos 10 veces, 8 veces, 6 veces, 4 veces o 2 veces el diámetro de la gota. Concentrar las gotas cerca de la unión de clasificación significa concentrarlas mediante entradas de fluido adicionales para ajustar la trayectoria de las gotas de tal manera que, en ausencia de cualquier manipulación de las gotas por los medios descritos anteriormente (como DEP, válvulas, etc.), las gotas que pasan terminan en un canal de residuos, es decir, un canal en el que se descartan gotas que muestran un fenotipo no deseado. El canal de residuos es preferentemente uno de los al menos dos canales de ramificación.
En una modalidad preferida, todas las gotas, independientemente de la detección y/o la decisión de clasificación, se controlan de la misma manera, es decir, el control no es una clasificación. Esta modalidad tiene la ventaja de que solo se requieren pulsos mínimos y/o uniformes para la clasificación, es decir, para empujar las gotas hacia un canal de ramificación en la unión de clasificación o incluso aguas arriba de la unión de clasificación y que la fuerza de los pulsos no tiene ajustarse tras variar la ubicación de las gotas dentro del canal. Preferentemente, el control de la gota se basa en la información de los medios de detección descritos en la presente descripción y/o una cámara (posiblemente adicional) o electrodo(s) de detección con respecto a la posición de la gota en el canal (en particular, en el canal de clasificación), preferentemente con respecto a su distancia a partir de las paredes del canal, la distancia del divisor de clasificación y/o la distancia o el tiempo entre detecciones con respecto a la gota anterior. En una modalidad preferida del método del tercer aspecto, las partículas son células y la gota microfluídica se clasifica para comprender células de dos tipos celulares diferentes, preferentemente dos células individuales diferentes, por ejemplo, una célula productora de anticuerpos y una célula indicadora de señalización, preferentemente por fluorescencia, el efecto del anticuerpo producido por la célula productora de anticuerpos sobre la célula indicadora (por ejemplo, la activación o inhibición de un receptor, preferentemente un receptor acoplado a la proteína G). En esta modalidad, los dos tipos celulares diferentes, preferentemente las dos células individuales diferentes, portan diferentes marcadores detectables. En otras palabras, en esta modalidad preferida, la gota microfluídica comprende una o más partículas diferentes que son células de diferentes tipos celulares, cada una asociada con un marcador detectable diferente, preferentemente un marcador fluorescente y las células se detectan a través del marcador detectable en la etapa (c) y la gota microfluídica se clasifica para comprender al menos dos células diferentes, preferentemente al menos dos células individuales diferentes, de diferentes tipos celulares en la etapa (d)
En otra modalidad preferida del método del tercer aspecto, la gota microfluídica comprende una partícula que es una célula o una perla recubierta con antígeno y una posible pareja de unión de partículas como se definió anteriormente, por ejemplo, un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un mimético de anticuerpo y la gota microfluídica se clasifica para la unión de una cierta cantidad, por ejemplo, una cierta cantidad mínima, de unión entre la partícula y la posible pareja de unión de la partícula.
En una modalidad particular, el método de la tercera etapa comprende, tras la etapa (d) de clasificación, una etapa (e) de identificación o análisis de la partícula y/o la posible pareja de unión de partículas (o fuente de esta si la posible pareja de unión de partículas se produce en la gota microfluídica, por ejemplo, un anticuerpo producido por una célula B o una célula de hibridoma) en una o más gotas microfluídicas clasificadas. Esto permite determinar qué partícula se une a qué posible pareja de unión de partículas. Por ejemplo, si la posible pareja de unión de partículas es un anticuerpo, los genes que codifican el anticuerpo de la célula B o hibridoma correspondiente pueden amplificarse mediante RT-PCR y secuenciarse para obtener información estructural sobre el anticuerpo.
Como se usa en la presente descripción, el término "dispositivo microfluídico" generalmente se refiere a un dispositivo a través del cual pueden transportarse materiales, particularmente materiales transportados por fluidos, como líquidos, en algunas modalidades a microescala y en algunas modalidades a nanoescala. Por lo tanto, los dispositivos microfluídicos pueden comprender características a microescala, características a nanoescala y combinaciones de estas.
En el contexto de la invención, el término también se refiere a a) un dispositivo que comprende una pluralidad de estructuras de microcanales encerrados, cada uno de los cuales comprende uno o más microcanales y/o microcavidades encerrados y b) que estas estructuras de microcanales se usan para transportar y procesar alícuotas líquidas, en particular gotas microfluídicas como se describió anteriormente, que están en el intervalo de nano a microlitros y pueden contener reactivos que incluyen, por ejemplo, analitos y reactivos. Las alícuotas líquidas típicamente son acuosas. El transporte y el procesamiento son típicamente parte de un protocolo de proceso analítico y/o preparativo. El número de estructuras de microcanales en un dispositivo puede ser superior a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25 o 50 y típicamente es inferior a 500, por ejemplo, inferior a 100.
Un dispositivo microfluídico ilustrativo típicamente comprende características estructurales o funcionales dimensionadas en el orden de una escala milimétrica o inferior, que son capaces de manipular un fluido a una tasa de flujo del orden de varios cientos de pL/h o inferior. Típicamente, dichas características incluyen, pero no se limitan a, canales, depósitos de fluidos, cámaras de reacción, cámaras de mezcla y regiones de separación. En algunos ejemplos, los canales incluyen al menos una dimensión de sección transversal que está en un intervalo de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 3000 pm, preferentemente a aproximadamente 1000 pm. El uso de dimensiones en este orden permite la incorporación de un mayor número de canales en un área más pequeña y utiliza menores volúmenes de fluidos.
El dispositivo microfluídico puede ser un chip microfluídico. Tal como se usa en la presente descripción, "chip" se refiere a un sustrato sólido con una pluralidad de microestructuras de una, dos o tres dimensiones o estructuras a microescala en las que pueden llevarse a cabo ciertos procesos, como procesos físicos, químicos, biológicos, biofísicos o bioquímicos, etcétera. Las microestructuras o estructuras a microescala tales como canales y pozos, elementos de electrodos, elementos electromagnéticos, se incorporan, fabrican o se unen de otro modo al sustrato para facilitar reacciones o procesos físicos, biofísicos, biológicos, bioquímicos, químicos en el chip. El chip puede ser delgado en una dimensión y puede tener varias formas en otras dimensiones, por ejemplo, un rectángulo, un círculo, una elipse u otras formas irregulares. El tamaño de la superficie principal de los chips usados en la presente invención puede variar considerablemente, por ejemplo, de aproximadamente 1 mm2 a aproximadamente 0,25 m2. Preferentemente, el tamaño de los chips es de aproximadamente 4 mm2 a aproximadamente 50 cm2 con una dimensión característica de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 5 cm. Las superficies del chip pueden ser planas o no planas. Los chips con superficies no planas pueden incluir canales o pozos fabricados en las superficies.
Preferentemente, el dispositivo microfluídico y en particular el chip microfluídico está hecho de un polímero ópticamente transparente o de vidrio. Un polímero transparente particularmente preferido es el poli(dimetilsiloxano) (PDMS). Los chips de PDMS pueden fabricarse, por ejemplo, mediante litografía blanda (Squires and Quake. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics, 2005, vol. 77). Otros polímeros adecuados son, por ejemplo, Ormocomp, polimetilmetacrilato (PMMA), Sifel, copolímero de cicloolefina (COC), fluoruro de polivinilideno (PVDF) o poliestireno (PS).
El término "diseñado de tal manera que..." se refiere a características relacionadas con el movimiento restrictivo como se describió anteriormente para el método del tercer aspecto. Preferentemente, se refiere al movimiento vertical y opcionalmente también al movimiento horizontal de la(s) partícula(s) siendo restringido por la altura del canal y opcionalmente el ancho y/o por dielectroforesis.
Un dispositivo microfluídico también puede comprender uno o más electrodos integrados, microválvulas, generadores de gotas de microbombas y/o una configuración de espectroscopia láser. "Integrado" significa incrustado entre dos capas de material del dispositivo como se describió anteriormente (por ejemplo, vidrio o PDMS) o colocado encima del dispositivo, preferentemente un chip.
En general, los electrodos pueden permitir funcionalidades en chip, como espectrometría de impedancia eléctrica, electroforesis, detección amperométrica, detección de temperatura, calentamiento eléctrico (por ejemplo, para proporcionar una temperatura adecuada para mantener las células, tal como aproximadamente 34-40 °C, 35-39 °C, 36-38°C o preferentemente aproximadamente 37 °C), lo que genera flujo electroosmótico y/o experimentación microfluídica de alto voltaje. Los electrodos ilustrativos son electrodos de campo, electrodos de detección y electrodos de calentamiento y detección. Los electrodos de campo se usan para conducir corriente eléctrica y generar campos eléctricos para controlar los flujos electroosmóticos. Los electrodos de detección se usan para medir la conductividad eléctrica local o la impedancia del líquido en un canal fluídico. Los electrodos de detección pueden usarse en particular, por ejemplo, para contar y caracterizar partículas, especialmente células, en gotas microfluídicas. Los electrodos de calentamiento y detección se usan como calentadores eléctricos y detectores de temperatura en un chip para proporcionar un medio conveniente para calentar fluidos dentro de microcanales y medir la temperatura. Esto es particularmente útil si las gotas microfluídicas contienen células, es decir, si las partículas de los aspectos de la invención son células. Si bien los electrodos de calentamiento y detección pueden usarse de forma independiente, es decir, mientras que el dispositivo puede comprender electrodos de calentamiento o detección, se prefiere que comprenda ambos y, aún más, se prefiere que estén funcionalmente acoplados y que los electrodos de calentamiento estén controlados por un bucle de retroalimentación de acuerdo con las temperaturas medidas con los electrodos de detección de manera que se mantenga una temperatura deseada, en particular una temperatura adecuada para mantener las células como se describió anteriormente. Entre los electrodos y los canales microfluídicos, pueden aplicarse capas aislantes.
Como se usa en la presente descripción, el término "microválvula" generalmente se refiere a una válvula que, con respecto a los fluidos, puede llevarse selectivamente a uno de dos estados distintos: un estado de válvula abierta en el que el fluido puede pasar a través de la válvula y un estado de válvula cerrada en el que el fluido no puede pasar a través de la válvula. Las microválvulas controlan el enrutamiento, la sincronización y la separación de fluidos dentro de un dispositivo microfluídico. Generalmente, las microválvulas pueden accionarse mecánicamente, neumáticamente, electrocinéticamente, por cambios de fase o mediante la introducción de una fuerza externa. En consecuencia, las microválvulas pueden seleccionarse independientemente (es decir, el dispositivo puede contener diferentes microválvulas) del grupo que consiste en microválvulas electrocinéticas, microválvulas neumáticas, microválvulas de compresión, microválvulas de cambio de fase, microválvulas de ráfaga y microválvulas de compresión de aguja Braille. Preferentemente, las microválvulas se seleccionan independientemente del grupo que consiste en microválvulas neumáticas y microválvulas de compresión de aguja Braille, microválvulas de cambio de fase y microválvulas de ráfaga. Las microválvulas electrocinéticas funcionan en sistemas de flujo continuo, actúan como un enrutador de fluidos que usa el flujo electroosmótico para cambiar los fluidos de un canal a otro. Las microválvulas neumáticas típicamente se basan en una membrana flexible para controlar el patrón de flujo en el canal de flujo. Las microválvulas de compresión funcionan tras deformar físicamente el material del dispositivo como se definió anteriormente, por ejemplo, PDMS, mediante el uso de presión mecánica. Las microválvulas de cambio de fase alternan entre diferentes fases de materiales tales como parafina, hidrogeles o soluciones acuosas para modular el flujo. Las microválvulas de ruptura son válvulas de un solo uso que se abren cuando se supera una resistencia al flujo o cuando se desintegra una membrana de sacrificio. Por último, las microválvulas de compresión de aguja Braille generan presión localizada a través de las agujas mecánicas de las pantallas Braille, que normalmente se usan para comunicarse con los ciegos y representan un método de control de válvula económico y fácilmente programable. Los puntos de compresión pueden, pero no necesariamente, ser los puntos de válvula. En el caso de este último, cada aguja presiona sobre un depósito lleno de líquido, que actúa como un pistón que transmite la presión a una válvula neumática basada en una membrana.
El término "microbomba", como se usa en la presente descripción, se refiere a una estructura que puede proporcionar fuerza para el desplazamiento de líquidos o gases dentro de un microcanal. En la técnica se conoce una amplia variedad de mecanismos de bombeo. Preferentemente, la "microbomba" es del tipo de desplazamiento positivo en donde la bomba genera una presión positiva, por encima de la presión atmosférica y la presión más alta está acoplada a al menos un canal microfluídico. La presión diferencial provoca el movimiento del gas o líquido. Una "microbomba integrada", también conocida como "fuente de presión integrada", "microbomba en chip" o "fuente de presión en chip", se refiere a una configuración de microbomba que es una parte integral del dispositivo microfluídico y preferentemente está unida de forma irreversible a ese. Por lo tanto, en el dispositivo microfluídico que puede usarse en los métodos de la invención, las microbombas son responsables de generar el movimiento temporal y volumétrico del fluido y se usan para reducir la cantidad de hardware externo necesario para operar el dispositivo microfluídico. Generalmente, una microbomba es activa o pasiva. Las microbombas pasivas se basan, por ejemplo, en el fenómeno de que pequeños volúmenes de fluido en contacto con superficies microestructuradas se mueven espontáneamente como resultado de la interacción entre la tensión superficial del líquido y la composición química y la topografía de la superficie en la dirección que minimiza las energías libres entre el vapor, el fluido e interfaces sólidas. Alternativamente, pueden depender de la tensión superficial de las gotas colocadas en las entradas/salidas de los microcanales para impulsar el flujo. Allí, las tasas de flujo están determinadas por la curvatura de las gotas, que a su vez están controladas por la cantidad de fluido dispensado. Sin embargo, se prefieren las microbombas activas ya que son susceptibles de control computarizado. Las microbombas activas dependen de una señal externa para iniciar y detener las actividades de bombeo. Esta señal externa añade la capacidad de controlar la velocidad y el comportamiento temporal de la bomba. Preferentemente, las microbombas activas se seleccionan de forma independiente (es decir, el dispositivo puede contener diferentes microbombas) del grupo formado por microbombas de jeringa, microbombas de membrana neumática, microbombas piezoeléctricas, microbombas de agujas Braille, microbombas electroquímicas, microbombas electroosmóticas, microbombas acústicas, microbombas magnetohidrodinámicas, microbombas electrohidrodinámicas y microbombas de permeación de gas; más preferentemente, las microbombas activas se seleccionan independientemente del grupo que consiste en microbombas de jeringa, microbombas de membrana neumática y microbombas de aguja Braille.
Las microbombas de jeringa son dispositivos de bombeo que incluyen una jeringa, es decir, un barril, carcasa o estructura similar que define una cavidad, cámara o estructura similar en la que un pistón, émbolo o estructura similar se desliza para expulsar un fluido allí. Una bomba de jeringa permite una actuación precisa de los fluidos. Las microbombas neumáticas de membrana generalmente se basan en un diseño de microválvula existente con varias de estas válvulas que actúan en serie para producir peristaltismo en el microcanal. Brevemente, un volumen de fluido ("bolo") se une entre las membranas de bombeo activadas y se mueve unidireccionalmente a través de la activación secuencial de las membranas de bombeo. En consecuencia, el bolo se alejará de su posición inicial, lo que genera un desplazamiento de volumen en el microcanal. Las microbombas piezoeléctricas se basan en un material de dispositivo piezoeléctrico que cambia de forma cuando se le suministra corriente eléctrica. La tensión ejercida por el material piezoeléctrico, acoplado a un diafragma (preferentemente delgado), puede usarse para bombear fluidos. Las microbombas de agujas Braille funcionan con las agujas de una pantalla Braille, que están programadas para operar en un patrón peristáltico. Las microbombas electroquímicas usan gas generado a partir de la electrólisis de una solución acuosa de, por ejemplo, KNO3 para bombear fluido a través de un microcanal. Tras ajustar la amplitud de la corriente y el pulso mediante el uso de electrodos conectados a un microcanal, puede lograrse un flujo. Las microbombas electroosmóticas se basan en el flujo electroosmótico, que es el movimiento masivo de líquido que resulta de un campo eléctrico aplicado a través de un material poroso, capilar, membrana o microcanal con paredes cargadas. Cuando, por ejemplo, se aplica un campo eléctrico de DC a través de al menos dos electrodos, se experimenta una gran fuerza en las paredes del microcanal, lo que da como resultado el movimiento de carga y fluido a través del microcanal. Las microbombas acústicas se basan en la transmisión acústica, que se refiere al fenómeno de que (i) el fluido comprimible experimenta una oscilación de alta frecuencia impulsada por una fuente de sonido, en donde la interacción no lineal provoca una corriente constante o (ii) el fluido incompresible oscila junto a un obstáculo o una interfaz. En particular, los flujos de flujo acústico basados en el viento de cuarzo, el flujo Euleriano y el polvo de Kundt son adecuados para dispositivos microfluídicos (véase Suh y Kang sobre separación acústica en "Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics", Springer Reference, volumen 1, páginas 25 a 32). Las microbombas magnetohidrodinámicas impulsan el flujo de fluidos en líquidos conductores que están sujetos a campos eléctricos y magnéticos aplicados perpendicularmente a través de un microcanal. Se genera una fuerza de Lorentz resultante en el líquido perpendicular a la dirección de los campos eléctrico y magnético, lo que provoca que el fluido sea bombeado a través del microcanal. Las microbombas electrohidrodinámicas usan la electrohumectación para manipular gotas discretas de fluido sobre una serie de electrodos en lo que se conoce como microfluídica digital. La electrohumectación es el cambio en el ángulo de contacto entre un sólido y un electrolito como resultado de la aplicación de un campo eléctrico entre los dos. Las microbombas de permeación de gas funcionan con materiales de dispositivos microfluídicos permeables al gas, tal como PDMS. El principio de funcionamiento es que la eliminación de todo el gas residual que está presente en el material permeable al gas (por ejemplo, tras colocar el dispositivo en vacío durante 15-20 min) creará un vacío local en los microcanales, que puede extraer fluido a través de los canales. Para una revisión de las microválvulas y microbombas anteriores, véase Au y otros, Micromachines 2011, 2, 179-220.
El término "generador de gotas" se refiere a una estructura que crea una corriente de agua monodispersa o gotas de aceite en una fase inmiscible. Los generadores de gotas microfluídicas funcionan tras combinar dos o más corrientes de fluidos inmiscibles y generar una fuerza de cizallamiento en la fase discontinua que provoca que se rompa en gotas discretas. Los generadores de gotas preferidos son los generadores de gotas de flujo concentrado y los generadores de gotas en forma de T. Los generadores de gotas de flujo concentrado se basan en un fluido de fase continua (fluido de concentración o envolvente) que flanquea o rodea a la fase dispersa (fluido concentrado o de núcleo), para dar lugar a la ruptura de las gotas en las proximidades de un orificio a través del cual ambos fluidos son extruidos. Los generadores de gotas en forma de T usan una unión en T de microcanal, en la que las gotas se forman espontáneamente en la intersección, se aprovecha la inestabilidad de la interfaz entre las corrientes de aceite y agua, cada una de las cuales viene desde una dirección hacia la unión. Para otros métodos de generación de gotas, véanse los procedimientos de compartimentación o microencapsulación descritos anteriormente.
La presente descripción se refiere al uso de gotas microfluídicas de la invención para los métodos de la invención. En particular, se refiere al uso de una gota microfluídica del primer aspecto para el método del segundo aspecto. La invención se describe por medio de los siguientes ejemplos que deben interpretarse como meramente ilustrativos y no limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1
En el primer ejemplo, la presente invención se usa para seleccionar células B que secretan anticuerpos que se unen a un GPCR humano. Los ratones se inmunizan con el dominio extracelular de GPCR y, después de algunas inyecciones de refuerzo, se aíslan las células B del bazo. Después, estas células B se encapsulan individualmente en gotas, junto con anticuerpos secundarios antimurinos marcados con Alexa-Fluor405 (excitación a 405 nm, emisión a 450 nm) y perlas de estreptavidina de 8 pm recubiertas con el dominio extracelular biotinilado del GPCR y un colorante biotinilado que emite a una longitud de onda diferente a la de los anticuerpos secundarios (tales como bio-Alexa488 o bio-Alexa568). Las gotas se incuban durante varias horas fuera del chip (para permitir una secreción celular suficiente de anticuerpos primarios dentro de las gotas) y después se reinyectan en el chip de detección y clasificación descrito anteriormente. La señal de fluorescencia de cada gota se mide mediante espectroscopia láser tanto para el anticuerpo secundario (para cuantificar la unión del anticuerpo primario a la perla) como para el colorante biotinilado (para determinar qué tan lejos está la perla fuera del plano focal y/o la intensidad máxima del punto láser). En caso de que una célula B encapsulada en particular secrete anticuerpos que se unan a la perla recubierta con GPCR, los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia también se inmovilizarán en la superficie de la perla. Esto da como resultado un valor máximo de emisión de fluorescencia fuerte pero estrecho cuando la gota pasa por el láser. Por el contrario, si los anticuerpos secretados por las células B no se unen a la perla, se observa un valor máximo de fluorescencia amplio y de baja intensidad. En caso de que la perla esté dentro del plano focal y/o el punto láser de intensidad máxima, la señal del colorante biotinilado será máxima. Por el contrario, si la perla está fuera del plano focal y/o del punto láser de máxima intensidad, la señal de fluorescencia medida será más débil. Por lo tanto, dividir la intensidad máxima de fluorescencia medida de los anticuerpos secundarios por la intensidad máxima de las perlas permite determinar cuantitativamente la unión del anticuerpo primario al GPCR, independientemente de la posición de la perla dentro de la gota. Por lo tanto, este valor normalizado puede explotarse como criterio de clasificación para aislar específicamente gotas que albergan células B que secretan anticuerpos que se unen al GPCR. Después de la etapa de clasificación, los genes que codifican anticuerpos de las células B individuales clasificadas positivamente se amplifican mediante RT-PCR y se secuencian para revelar la identidad de los anticuerpos deseados.
Ejemplo 2
Se lleva a cabo una selección del efecto agonista de los anticuerpos sobre los GPCR. Los ratones se inmunizan con el dominio extracelular de GPCR y, después de algunas inyecciones de refuerzo, se aíslan las células B del bazo. Paralelamente, las células indicadoras que generan una señal de fluorescencia intracelular verde tras la activación de GPCR (por ejemplo, mediante la expresión de GFP de vida corta) se tiñen con calceína azul. En la siguiente etapa, las células B y las células indicadoras se encapsulan conjuntamente en gotas y se incuban durante varias horas para permitir la secreción suficiente de anticuerpos dentro de las gotas. Posteriormente, las gotas se reinyectan en un dispositivo microfluídico para su clasificación, por ejemplo, como se describe en la presente descripción. Para la clasificación, la señal verde (que indica la activación de GPCR) se divide por la señal azul (que indica la proximidad de la célula indicadora al plano focal y el punto láser más intenso) y se recogen las gotas que muestran el valor más alto de este parámetro normalizado. Después de la etapa de clasificación, los genes que codifican anticuerpos de las células B individuales clasificadas positivamente se amplifican mediante RT-PCR y se secuencian para revelar la identidad de los anticuerpos deseados.
Ejemplo 3
Se lleva a cabo una selección del efecto antagónico de los anticuerpos sobre los GPCR. Los ratones se inmunizan con el dominio extracelular de GPCR y, después de algunas inyecciones de refuerzo, se aíslan las células B del bazo. Después, estas células B se tiñen con un colorante inespecífico tal como calceína naranja. Paralelamente, las células indicadoras que generan una señal de fluorescencia intracelular verde tras la activación de GPCR se tiñen con calceína azul. En la siguiente etapa, las células B, las células indicadoras y un fármaco que activa el GPCR de interés se encapsulan conjuntamente en gotas y se incuban durante varias horas para permitir la secreción suficiente de anticuerpos dentro de las gotas. En todas las gotas que no contienen anticuerpos antagonistas secretores de células B, la célula indicadora mostrará una señal verde intensa (debido a la presencia del fármaco). Por el contrario, las gotas que albergan células B que secretan anticuerpos antagónicos eliminarán esta señal indicadora e indicarán el fenotipo de interés. Sin embargo, si una gota en particular simplemente no alberga una célula indicadora, se detectará el mismo fenotipo (en el canal verde). Sin medidas adicionales, esto conduciría inevitablemente a la selección de muchas células B falsas positivas. Para superar este problema, las gotas se analizan de forma multicolor después de ser reinyectadas en un dispositivo de clasificación con varias características especiales para aumentar la sensibilidad: mediante el uso de un chip con un canal de detección en el que las gotas se comprimen al menos en la dimensión z y mediante el uso de un canal de clasificación en un ángulo de 45°, las gotas se analizan primero para determinar la presencia de una célula B (un valor máximo naranja) y una célula indicadora (un valor máximo azul) exactamente. Solo se clasifican las gotas que cumplen este criterio y que además no muestran o muestran al menos una señal de ensayo muy reducida en el canal verde. Después de la etapa de clasificación, los genes que codifican anticuerpos de las células B individuales clasificadas positivamente se amplifican mediante RT-PCr y se secuencian para revelar la identidad de los anticuerpos deseados.
Ejemplo 4
Se lleva a cabo una selección para la unión específica de anticuerpos a un antígeno tal como la metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1). Esta selección incluye una contraselección directa contra anticuerpos que también se unen a MMP-2. Los ratones se inmunizan con un péptido de MMP-1 y, después de algunas inyecciones de refuerzo, se aíslan las células B del bazo. Después, estas células B se encapsulan individualmente en gotas, junto con anticuerpos secundarios antimurinos marcados con Alexa-Fluor405 (excitación a 405 nm, emisión a 450 nm) y perlas de estreptavidina de 8 pm recubiertas con el péptido biotinilado de MMP-1 y bio-488. Además, las perlas recubiertas de estreptavidina de 8 pm recubiertas con MMP-2 y bio-Alexa568 se encapsulan conjuntamente adicionalmente en las gotas. Para la clasificación, solo se recogen las gotas que muestran un valor fuerte para la señal de fluorescencia a 405 nm dividida por la intensidad de la señal en 488 (valor normalizado que indica una unión eficiente al antígeno diana MMP-1) y, al mismo tiempo, que no muestran o muestran solo un valor débil para la señal de fluorescencia a 405 nm dividida por la intensidad de la señal a 568 (valor normalizado que indica una unión no deseada a MMP-2). De esta forma, pueden identificarse aglutinantes altamente específicos de MMP-1 que no se unen a MMP-2. Después de la etapa de clasificación, los genes que codifican anticuerpos de las células B individuales clasificadas positivamente se amplifican mediante RT-PCR y se secuencian para revelar la identidad de los anticuerpos deseados.
Ejemplo 5
La detección confiable de células teñidas dentro de una gota microfluídica es un desafío, ya que las células pueden flotar fuera del plano focal y/o el centro del punto láser, lo que da como resultado intensidades muy variables de la luz emitida. Para superar esto, los inventores han diseñado un novedoso chip de clasificación con una geometría especial (Figuras 3 y 4): En primer lugar, la parte del canal en la que se produce la detección (sobre la que se concentra el rayo láser) es más estrecha y menos profunda en comparación con el resto del chip (por ejemplo, < 50 % respecto al resto de los canales). Esto significa que las gotas se convierten en tapones (gotas que llenan completamente el canal) y las células encapsuladas tienen menos libertad espacial en la dimensión y (en la que la célula puede estar más cerca o más alejada del centro del punto láser) y la dimensión z (en la que la célula puede estar más cerca o más alejada del plano focal). Cabe destacar que el diseño de todo el chip como un canal estrecho y poco profundo no es factible, ya que, de lo contrario, la obstrucción ocurre con mucha más frecuencia.
Por el contrario, el chip de clasificación usado en la invención tiene diferentes profundidades y anchos para las etapas de análisis y clasificación.
La sensibilidad de la lectura de fluorescencia también puede aumentarse mediante el uso de objetivos de gran aumento. Sin embargo, para los dispositivos de clasificación capaces de manipular gotas lo suficientemente grandes para el cultivo de células de mamíferos (típicamente ~ 100 pm de diámetro), es muy difícil tener el punto de análisis y el divisor de clasificación en el mismo campo de visión cuando se usa, por ejemplo, un objetivo de 40x. Esto se debe al hecho de que las gotas grandes exigen dimensiones de canal más grandes en comparación con los clasificadores de gotas de 30 pm, pero también a los importantes requisitos de espacio de los electrodos usados para la clasificación dieletroforética. Los inventores han logrado diseñar un chip de clasificación muy compacto en el que el punto de análisis y el divisor de clasificación están en el mismo campo de visión (con una distancia entre ambos inferior a 500 pm), incluso cuando se usa un objetivo de 40x. El diseño compacto también se logra al tener un ángulo de 45° en el canal en el que se detectan y clasifican las gotas (véase la Figura 4). Otra característica de este chip de clasificación son las entradas de aceite adicionales aguas debajo de la constricción, pero aguas arriba del divisor de clasificación. Esto permite ajustar con precisión la trayectoria de las gotas hacia la unión de clasificación. Un chip ya es ventajoso si comprende una de estas características novedosas, pero particularmente ventajoso si se combinan más de una o todas ellas.
Ejemplo 6
Se encapsularon perlas de Fluoresbrite de 6 pm (perlas que emiten simultáneamente a diferentes longitudes de onda; disponibles comercialmente de Polysciences Inc.) en gotas y se analizaron las señales de fluorescencia resultantes. Todas las perlas tienen aproximadamente el mismo número de fluoróforos y, por lo tanto, deberían mostrar muy poca variación en cuanto a la intensidad de la fluorescencia. Sin embargo, cuando se analiza un solo canal de fluorescencia (por ejemplo, rango verde o azul), se observa una distribución muy amplia de intensidades de fluorescencia (véanse las Figuras 7 A, B). Esto se debe al hecho de que las perlas flotan libremente dentro de las gotas, lo que significa que pueden estar dentro o fuera del plano focal y/o el centro del punto láser. Sin embargo, cuando se normaliza la señal verde a la señal azul (por ejemplo, tras dividir los valores correspondientes), este efecto puede minimizarse (véase la Figura 7 C). Todos los eventos están aproximadamente en la misma línea diagonal, lo que significa que la clasificación de estos eventos de acuerdo con una lectura normalizada de dos colores da como resultado la recogida de perlas con intensidades de fluorescencia comparables, a pesar de su fuerte variación de señal cuando solo se observa un único canal de fluorescencia.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una gota microfluídica que comprende una primera partícula que se ha asociado con una cantidad de un primer marcador detectable y una posible pareja de unión de partículas que se ha asociado con una cantidad de un segundo marcador detectable, en donde la primera partícula se ha asociado con el segundo marcador a través de la unión a la posible pareja de unión de partículas, en donde se conoce la cantidad del primer marcador detectable y/o es ± 50 % de la cantidad del primer marcador detectable que se ha asociado con una partícula adicional comprendida en una gota microfluídica adicional, en donde el primer marcador detectable es diferente del segundo marcador detectable y en donde la gota microfluídica adicional está comprendida en una pluralidad de gotas microfluídicas que también comprende dicha gota microfluídica que comprende dicha primera partícula, en donde la asociación de la primera partícula con el primer marcador detectable, la asociación de la posible pareja de unión de partículas con el segundo marcador detectable, la asociación de la primera partícula con el segundo marcador detectable y la asociación de la partícula adicional con el primer marcador detectable es una interacción directa o indirecta, en donde la interacción directa es una unión covalente o no covalente sin una molécula adicional como intermediario y en donde la interacción indirecta es una unión no covalente o covalente con una molécula adicional como intermediario.
2. La gota microfluídica de la reivindicación 1, en donde la primera partícula y la partícula adicional se seleccionan del grupo que consiste en una célula, un virus, una perla, una proteína y una nanopartícula.
3. La gota microfluídica de la reivindicación 2, en donde la posible pareja de unión de partículas se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un mimético de anticuerpo, un bacteriófago, un complejo de ARNm-polipéptido, un complejo de ARNm-ribosoma-polipéptido, una célula, un virus, un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un aptámero y una molécula pequeña.
4. La gota microfluídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la gota microfluídica comprende además (i) una partícula no aglutinante o (ii) una segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas, en donde la partícula no aglutinante o la segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas se ha asociado con una cantidad de un tercer marcador detectable, en donde la asociación de la partícula no aglutinante o la segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas con una cantidad de un tercer marcador detectable es una interacción directa o indirecta y en donde la interacción directa es una unión covalente o no covalente sin una molécula adicional como intermediario y en donde la interacción indirecta es una unión no covalente o covalente con una molécula adicional como intermediario.
5. La gota microfluídica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la partícula es una célula seleccionada de una célula productora de anticuerpos o una célula indicadora,
en donde la célula indicadora es capaz de señalizar un efecto de un anticuerpo producido por una célula productora de anticuerpos sobre la célula indicadora.
6. La gota microfluídica de la reivindicación 5, en donde el efecto es la activación o inhibición de un receptor, tal como un receptor acoplado a la proteína G.
7. Un método para cuantificar la unión entre una partícula y una posible pareja de unión de partículas en una gota microfluídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de (i) medir la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
(ii) medir la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable y
(iii) normalizar la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable mediante el uso de la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable,
en donde la intensidad normalizada del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable representa la cantidad de unión entre la partícula y la posible pareja de unión de partículas.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador detectable se mide en el mismo lugar dentro de la gota microfluídica que la intensidad del valor máximo de la señal del primer marcador detectable.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde la intensidad del valor máximo de la señal del primer y el segundo marcador detectable se mide al mismo tiempo.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la etapa (iii) comprende además normalizar la intensidad del valor máximo de la señal del segundo marcador tras sustraer el fondo del segundo marcador detectable.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende además una etapa (iv) de medir la intensidad del valor máximo de la señal de un tercer marcador detectable que se ha asociado con una partícula no aglutinante o una segunda partícula que no se une a la posible pareja de unión de partículas mediante una interacción directa o indirecta, en donde la interacción directa es una unión covalente o no covalente sin una molécula adicional como intermediario y en donde la interacción indirecta es una unión no covalente o covalente con una molécula adicional como intermediario.
12. Un método para detectar una o más partículas comprendidas en una gota microfluídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de:
a) alimentar una gota microfluídica que comprende una o más partículas en un canal de detección que comprende un punto de detección,
b) restringir al menos el movimiento vertical de la(s) partícula(s) dentro de la gota microfluídica al menos en el punto de detección en el canal de detección, en comparación con la misma gota microfluídica cuando tiene forma esférica y
c) detectar al menos una partícula comprendida en la gota microfluídica en el punto de detección.
13. El método de la reivindicación 12, que comprende además una etapa (d) de clasificar la gota microfluídica basado en la detección de la(s) partícula(s) en un canal de clasificación, que comprende una unión de clasificación, aguas abajo del canal de detección.
14. El método de la reivindicación 13, en donde la gota microfluídica comprende una o más partículas diferentes que son células de diferentes tipos celulares, cada una asociada con un marcador detectable diferente, preferentemente un marcador fluorescente y en donde las células se detectan a través del marcador detectable en la etapa (c) y la gota microfluídica se clasifica para comprender al menos dos células diferentes, preferentemente al menos dos células individuales diferentes, de diferentes tipos celulares en la etapa (d).
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