ES2920357T3 - Polisacárido morfológico único - Google Patents

Abstract

En este documento, se divulgan composiciones que comprenden agregados de alfago insoluble con enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Estos agregados tienen un radio hidrodinámico promedio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 300 nm, y una dimensión fractal de aproximadamente 1.6 a aproximadamente 2.4. Los agregados de alfa-glucano insolubles en algunos aspectos revelados son arborescentes. Se divulgan más métodos para preparar estas composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polisacárido morfológico único

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/584.150 (presentada el 10 de noviembre de 2017).

CAMPO

La presente divulgación está en el campo de los materiales de polisacárido. Por ejemplo, la divulgación se refiere a composiciones que comprenden agregados de alfa-glucano insoluble con morfología única.

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO ELECTRÓNICAMENTE

La copia oficial del listado de secuencias se presenta electrónicamente por EFS-Web como un listado de secuencias en formato ASCII con un archivo llamado 20181106_CL6617WOPCT_SecuenceListing.txt, creado el 6 de noviembre de 2018, y que tiene un tamaño de aproximadamente 315 kilobytes y se presenta simultáneamente con la memoria descriptiva. El listado de secuencias contenido en este documento con formato ASCII es parte de la memoria descriptiva y se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES

Impulsado por un deseo de usar polisacáridos en diversas aplicaciones, los investigadores han explorado polisacáridos que son biodegradables y que se pueden preparar económicamente a partir de materias primas de origen renovable. Uno de dichos polisacáridos es el alfa-1,3-glucano, un polímero de glucano insoluble caracterizado por tener enlaces alfa-1,3-glicosídicos. Este polímero ha sido preparado, por ejemplo, usando una enzima glucosiltransferasa aislada de Streptococcus salivarius (Simpson et al., Microbiology 141:1451 - 1460, 1995). También, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 7000000 desveló la preparación de una fibra hilada a partir de alfa-1,3-glucano producido enzimáticamente. También se han estudiado diversos otros materiales de glucano para el desarrollo de aplicaciones nuevas o mejoradas. Por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2015/0232819 desvela la síntesis enzimática de varios glucanos insolubles que tienen enlaces mixtos alfa-1,3 y -1,6.

A pesar de este trabajo, se desean nuevas formas de alfa-glucano insoluble para potenciar el valor económico y las características de rendimiento de este material en diversas aplicaciones. Se desvelan en el presente documento composiciones que comprenden agregados de alfa-glucano insoluble con características morfológicas únicas para tratar esta necesidad.

SUMARIO

En una realización, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende agregados de alfa-glucano insoluble, en donde los agregados tienen un radio hidrodinámico promedio de aproximadamente 50-300 nm y una dimensión fractal de aproximadamente 1,6-2,4, y el alfa-glucano insoluble comprende enlaces alfa-1,3-glicosídicos.

En el presente documento también se desvela un método de producción de agregados de alfa-glucano insoluble en el presente documento, comprendiendo el método: (a) poner en contacto al menos agua, sacarosa y una enzima glucosiltransferasa que sintetiza alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos aproximadamente el 40%; y (b) preparar una dispersión del alfa-glucano insoluble producido en la etapa (a). La presente divulgación también se refiere a una composición que comprende agregados de alfa-glucano insoluble producidos según este método.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Y SECUENCIAS

FIG. 1. Estructuras arborescentes típicas de simulaciones informáticas de agregados formados por difusión de partículas esféricas primarias. Se proporciona la dimensión fractal de cada estructura. En algunos aspectos se contempla que dichas estructuras se formen, al menos en parte, a partir de agregados de partículas primarias de tipo varilla.

Tabla 1. Sumario de números de SEQ ID de ácido nucleico y proteínab

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A menos que se desvele de otro modo, los términos "un" y "una", como se usan en el presente documento, pretenden englobar una o más (es decir, al menos una) de una característica referenciada.

Donde estén presentes, todos los intervalos son incluyentes y combinables, excepto que se indique de otro modo. Por ejemplo, cuando se cite un intervalo de "1 a 5" (es decir, 1-5), el intervalo citado se debe interpretar como que incluye los intervalos "1 a 4", "1 a 3", "1-2", "1 -2 y 4-5", "1-3 y 5", y similares.

Los términos "alfa-glucano", "polímero de alfa-glucano" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Un alfa-glucano es un polímero que comprende unidades monoméricas de glucosa unidas juntas por enlaces alfa-glicosídicos. En realizaciones típicas, un alfa-glucano en el presente documento comprende al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de enlaces alfa-glicosídicos. Los ejemplos de polímeros de alfa-glucano en el presente documento incluyen alfa-1,3-glucano.

Los términos "poli alfa-1,3-glucano", "alfa-1,3-glucano", "polímero de alfa-1,3-glucano" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Alfa-1,3-glucano es un polímero que comprende unidades monoméricas de glucosa unidas juntas por enlaces glicosídicos, en donde al menos aproximadamente el 30% de los enlaces glicosídicos son alfa-1,3. El alfa-1,3-glucano en ciertas realizaciones comprende al menos aproximadamente 90% o 95% de enlaces alfa-1,3 glicosídicos. La mayoría o todos de los otros enlaces en el alfa-1,3-glucano en el presente documento son normalmente alfa-1,6, aunque algunos enlaces también pueden ser alfa-1,2 y/o alfa-1,4.

Los términos "enlace glicosídico", "unión glicosídica", "enlace" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren al enlace covalente que une una molécula de hidrato de carbono (azúcar) con otro grupo, tal como otro hidrato de carbono. El término "enlace alfa-1,3-glicosídico", como se usa en el presente documento, se refiere al tipo de enlace covalente que une moléculas de alfa-D-glucosa entre sí mediante los carbonos 1 y 3 en anillos de alfa-D-glucosa adyacentes. El término "enlace alfa-1,6-glicosídico", como se usa en el presente documento, se refiere al enlace covalente que une moléculas de alfa-D-glucosa entre sí mediante los carbonos 1 y 6 en anillos de alfa-D-glucosa adyacentes. Los enlaces glicosídicos de un polímero de glucano en el presente documento también se pueden denominar "enlaces glucosídicos". En el presente documento, "alfa-D-glucosa" se denomina "glucosa".

El perfil de enlaces glicosídicos de un alfa-glucano en el presente documento se puede determinar usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar un perfil de enlaces usando métodos que usan espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) (por ejemplo, r Mn 13C o RMN 1H). Estos y otros métodos que se pueden usar se desvelan en, por ejemplo, Food Carbohydrates: Chemistry, Physical Properties, and Applications (S.

W. Cui, Ed., Capítulo 3, S. W. Cui, Structural Analysis of Polysaccharides, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, FL, 2005), que se incorpora en el presente documento por referencia.

El "peso molecular" de polímeros de alfa-glucano grandes en el presente documento se puede representar como el peso molecular medio ponderal (Mw) o el peso molecular medio numérico (Mn), cuyas unidades están en dáltones o gramos/mol. Alternativamente, el peso molecular de polímeros de alfa-glucano grandes se puede representar como DPw (grado de polimerización promedio ponderal) o DPn (grado de polimerización promedio numérico). El peso molecular de polímeros de alfa-glucano más pequeños, tales como oligosacáridos, se puede proporcionar normalmente como "DP" (grado de polimerización), que simplemente se refiere al número de glucosas comprendidas dentro del alfa-glucano. Se conocen en la técnica diversos medios para calcular estas diversas mediciones de peso molecular, tales como con cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o cromatografía de exclusión molecular (GPC).

El término "sacarosa" en el presente documento se refiere a un disacárido no reductor compuesto de una molécula de alfa-D-glucosa y una molécula de beta-D-fructosa unidas por un enlace alfa-1,2-glicosídico. La sacarosa se conoce comúnmente como el azúcar de mesa. La sacarosa se puede denominar alternativamente "alfa-D-glucopiranosil-(1^2)-beta-D-fructofuranósido". Se usan indistintamente en el presente documento "alfa-D-glucopiranosilo" y "glucosilo".

Los términos "partícula", "partícula primaria" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Una partícula es la unidad identificable más pequeña en un sistema de partículas que usa la tecnología empleada en los Ejemplos de más adelante (o tecnología similar), y es una subunidad de un agregado. Las partículas en el presente documento tienen un tamaño promedio de aproximadamente 5-25 nm (nanómetros). El tamaño en algunos aspectos se puede referir al diámetro de partículas y/o la longitud de la dimensión más larga de la partícula (por ejemplo, longitud de una partícula de tipo varilla). El tamaño promedio se puede basar en el promedio de diámetros y/o las dimensiones más largas de al menos, por ejemplo, 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000 o 10000 o más partículas.

Los términos "agregado", "agregado de partículas", "grupo de partículas" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Un agregado es un cuerpo o masa que comprende partículas, y normalmente se forma por la agrupación/agregación (unión) de partículas en agua o disolución acuosa. Los agregados en el presente documento se pueden formar, por ejemplo, tras la dispersión de las partículas en agua o disolución acuosa. Los agregados pueden estar comprendidos dentro de un aglomerado. Los agregados en el presente documento tienen un radio hidrodinámico promedio (Rh) de aproximadamente 50-300 nm. El tamaño en algunos aspectos se puede referir en su lugar al diámetro hidrodinámico (Dh) del agregado, diámetro y/o a la longitud de la dimensión más larga del agregado. Cualquiera de las anteriores mediciones promedio se puede obtener con, por ejemplo, al menos 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000 o 10000 o más agregados.

El "radio hidrodinámico" (Rh) de un agregado como se desvela en el presente documento se puede medir por dispersión dinámica de luz (DLS) siguiendo la metodología descrita en los Ejemplos de más adelante y/o en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2017/0055540 o 2010/0056361, por ejemplo, que se incorporan en el presente documento como referencia. La DLS también se puede denominar espectroscopía de correlación fotónica (PCS) o dispersión de luz cuasi-elástica. El radio hidrodinámico de un agregado es el radio de una esfera rígida hipotética que difunde del mismo modo que el agregado. Dicha medición se hace puesto que los agregados desvelados normalmente no son esféricos y de movimiento dinámico (volteo). El tamaño de un agregado también se puede denominar en términos de diámetro hidrodinámico (Dh), si se desea, que es dos veces su valor de Rh.

El término "dimensión fractal", como se usa en el presente documento, describe la abertura de una estructura de agregado. Para ilustrar cómo la dimensión fractal de un agregado caracteriza su abertura, es instructivo considerar, por ejemplo, un agregado de 100 nm que comprende partículas de 10 nm. Si la dimensión fractal del agregado en este ejemplo es 3, la densidad en el centro del agregado será la misma que la densidad en la periferia del agregado. Una dimensión fractal de 3 describe un objeto que llena el espacio y designa una estructura cerrada en términos de área superficial interna. Si la dimensión fractal del agregado es 2, la densidad en la periferia del agregado será diez veces inferior a la densidad en su centro. Si la dimensión fractal del agregado es 1, la densidad en la periferia del agregado será 100 veces inferior a la densidad en su centro. Los agregados de la presente divulgación tienen estructuras abiertas con elevadas áreas superficiales internas; su dimensión fractal de 1,6-2,4 indica una reducción en la densidad desde el centro del agregado hasta la periferia. La dimensión fractal promedio se puede basar en el promedio de las dimensiones fractales de, por ejemplo, al menos 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000 o 10000 o más agregados.

El término "arborescente" y términos similares se pueden usar opcionalmente en el presente documento para caracterizar la naturaleza/estructura de tipo árbol/ramificada de los agregados de alfa-glucano insoluble.

Los términos "tipo varilla", "en forma de varilla" y términos similares se pueden usar para caracterizar partículas primarias en algunos aspectos. Una partícula que es de tipo varilla tiene una forma cilíndrica con una longitud que normalmente es mayor (por ejemplo, al menos el 10%) que su diámetro en sección transversal.

El término "aglomerado" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo de agregados. Los aglomerados en el presente documento tienen un tamaño promedio de aproximadamente 1 -200 micrómetros (micrómetros). El tamaño en algunos aspectos se puede referir a un diámetro de aglomerado y/o la longitud de la dimensión más larga del aglomerado. El tamaño promedio se puede basar en el promedio de diámetros y/o las dimensiones más largas de al menos 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000, o 10000 o más aglomerados, por ejemplo.

Los términos "glucosiltransferasa", "enzima glucosiltransferasa", "GTF", "glucansucrasa" y similares se usan indistintamente en el presente documento. La actividad de una glucosiltransferasa en el presente documento cataliza la reacción del sustrato sacarosa para producir los productos alfa-glucano y fructosa. Otros productos (subproductos) de una reacción de GTF pueden incluir glucosa, diversos gluco-oligosacáridos solubles y leucrosa. Las formas naturales de enzimas glucosiltransferasa contienen, en general, (en la dirección de aminoterminal a carboxiterminal) un péptido señal (que normalmente se retira por procesos de escisión), un dominio variable, un dominio catalítico y un dominio de unión a glucano. Una glucosiltransferasa en el presente documento se clasifica en la familia70 de las glucósido hidrolasas (GH70) según la base de datos CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes) (Cantarel et al., Nucleic Acids Res. 37:D233-238, 2009).

El término "dominio catalítico de glucosiltransferasa" en el presente documento se refiere al dominio de una enzima glucosiltransferasa que proporciona actividad de síntesis de alfa-glucano a una enzima glucosiltransferasa. Un dominio catalítico de glucosiltransferasa no requiere preferentemente la presencia de ningún otro dominio que tenga esta actividad.

Los términos "reacción enzimática", "reacción de glucosiltransferasa", "reacción de síntesis de glucano", "composición de reacción", "formulación de reacción" y similares se usan indistintamente en el presente documento y, en general, se refieren a una reacción que comprende inicialmente agua, sacarosa, al menos una enzima glucosiltransferasa activa, y opcionalmente otros componentes. Los componentes que pueden estar además presentes en una reacción de glucosiltransferasa normalmente después de que haya comenzado incluyen fructosa, glucosa, leucrosa, glucooligosacáridos solubles (por ejemplo, DP2-DP7) (tal que se pueden considerar productos o subproductos, dependiendo de la glucosiltransferasa usada) y/o producto(s) de alfa-glucano insoluble de DP8 o superior (por ejemplo, DP100 y superior). Se entendería que ciertos productos de glucano, tales como el alfa-1,3-glucano con un grado de polimerización (DP) de al menos 8 o 9, son insolubles en agua y, por lo tanto, no se disuelven en una reacción de síntesis de glucano, sino que pueden estar presentes fuera de disolución (por ejemplo, en virtud de haber precipitado de la reacción). Es en una reacción de síntesis de glucanos donde se realiza la etapa de poner en contacto agua, sacarosa y una enzima glucosiltransferasa. El término "en condiciones de reacción adecuadas", como se usa en el presente documento, se refiere a condiciones de reacción que soportan la conversión de sacarosa en producto(s) de alfa-glucano por la actividad enzimática de glucosiltransferasa. Es durante dicha reacción que los grupos glucosilo derivados originalmente de la sacarosa de entrada se transfieren enzimáticamente y se usan en la síntesis de polímeros de alfa-glucano; por lo tanto, los grupos glucosilo que participan en este proceso se pueden denominar opcionalmente el componente o resto de glucosilo (o términos similares) de una reacción de glucosiltransferasa.

El "rendimiento" de producto de alfa-glucano insoluble en una reacción de glucosiltransferasa en algunos aspectos en el presente documento representa el rendimiento molar basado en la sacarosa convertida. El rendimiento molar de un producto de alfa-glucano se puede calcular basándose en los moles de producto de alfa-glucano insoluble divididos entre los moles de la sacarosa convertida. Los moles de sacarosa convertida se pueden calcular del siguiente modo: (masa de sacarosa inicial - masa de sacarosa final) / peso molecular de sacarosa [342 g/mol]. Este cálculo de rendimiento molar se puede considerar una medida de la selectividad de la reacción hacia el alfa-glucano. En algunos aspectos, el "rendimiento" de producto de alfa-glucano insoluble en una reacción de glucosiltransferasa se puede basar en el componente de glucosilo de la reacción.

Rendimiento de alfa-glucano insoluble = ((IS/2 -(FS/2 LE/2 GL SO)) / (IS/2 - FS/2)) x 100 %.

El equilibrio de fructosa de una reacción de glucosiltransferasa se puede medir para garantizar que los datos de HPLC, si procede, no están fuera del intervalo (90-110% se considera aceptable).

Equilibrio de fructosa = ((180/342 x (FS LE) FR) / (180/342 x IS)) x 100 %.

En las dos fórmulas anteriores, IS es [Sacarosa inicial], FS es [Sacarosa final], LE es [Leucrosa], GL es [Glucosa], SO es [Oligómeros solubles] (gluco-oligosacáridos) y FR es [Fructosa]; las concentraciones de cada uno del sustrato/producto anterior proporcionados entre paréntesis dobles son en unidades de gramos/l y como se mide, por ejemplo, por HPLC.

Una "torta" de alfa-glucano insoluble en el presente documento se refiere a una preparación en forma condensada, compactada, empaquetada, estrujada y/o comprimida que comprende al menos (i) aproximadamente 50%-90% en peso de agua o una disolución acuosa, y (ii) aproximadamente 10%-50% en peso de alfa-glucano insoluble. Una torta en algunos aspectos se puede denominar una "torta de filtración" o una "torta húmeda". Una torta en el presente documento normalmente tiene una consistencia blanda de tipo sólido.

Los términos "porcentaje en volumen", "% en vol", "% v/v" y similares se usan indistintamente en el presente documento. El porcentaje en volumen de un soluto en una disolución se puede determinar usando la fórmula: [(volumen de soluto)/(volumen de disolución)] x 100%.

Los términos "porcentaje en peso", (% en peso)", "porcentaje en peso-peso (% p/p)" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Porcentaje en peso se refiere al porcentaje de un material en una base en masa como está comprendido en una composición, mezcla o disolución.

Los términos "líquido acuoso", "fluido acuoso" y similares, como se usan en el presente documento, se pueden referir a agua o a una disolución acuosa. Una "disolución acuosa" en el presente documento puede comprender una o más sales disueltas, donde la concentración total máxima de sales puede ser aproximadamente del 3,5% en peso en algunas realizaciones. Aunque los líquidos acuosos en el presente documento normalmente comprenden agua como el único disolvente en el líquido, un líquido acuoso puede comprender opcionalmente uno o varios de otros disolventes (por ejemplo, disolvente orgánico polar) que son miscibles en agua. Por lo tanto, una disolución acuosa puede comprender un disolvente que tiene al menos aproximadamente 10% en peso de agua.

Una "composición acuosa" en el presente documento tiene un componente líquido que comprende al menos, por ejemplo, aproximadamente 10% en peso de agua. Los ejemplos de composiciones acuosas incluyen, por ejemplo, mezclas, disoluciones, dispersiones (por ejemplo, dispersiones coloidales), suspensiones y emulsiones. Una composición acuosa en ciertas realizaciones puede comprender agregados de alfa-glucano insoluble como se desvela en el presente documento, en cuyo caso la composición acuosa se puede caracterizar opcionalmente como un sólido en composición líquida, dada la insolubilidad de los agregados.

Como se usa en el presente documento, el término "dispersión coloidal" se refiere a un sistema heterogéneo que tiene una fase dispersa y un medio de dispersión, es decir, partículas insolubles microscópicamente dispersadas se suspenden en otra sustancia (por ejemplo, una composición acuosa, tal como agua o disolución acuosa). Un ejemplo de una dispersión coloidal en el presente documento es un hidrocoloide. Todas, o una porción de, las partículas de una dispersión coloidal, tal como un hidrocoloide, pueden comprender agregados de la presente divulgación. Los términos "dispersante" y "agente de dispersión" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un material que promueve la formación y/o estabilización de una dispersión.

Un glucano que es "insoluble", "insoluble acuoso", "insoluble en agua" (y términos similares) (por ejemplo, alfa-1,3-glucano insoluble) no se disuelve (o no se disuelve apreciablemente) en agua u otras condiciones acuosas, opcionalmente donde las condiciones acuosas se caracterizan aún más por tener un pH de 4-9 (por ejemplo, pH 6-8) y/o temperatura de aproximadamente 1 a 85 °C (por ejemplo, 20-25 °C). A diferencia, los glucanos, tales como ciertos oligosacáridos en el presente documento, que son "solubles", "solubles acuosos", "solubles en agua" y similares (por ejemplo, alfa-1,3-glucano con un DP inferior a 8) se disuelven apreciablemente en estas condiciones.

El término "viscosidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la medida del grado al que un fluido (acuoso o no acuoso) resiste a una fuerza que tiende a hacer que fluya. Diversas unidades de viscosidad que se puede usar en el presente documento incluyen, por ejemplo, centipoise (cP, cps) y Pascal-segundo (Pa s). Un centipoise es una centésima de un poise; un poise es igual a 0,100 kgm -1s-1.

Los términos "identidad de secuencia", "identidad" y similares, como se usan en el presente documento con respecto a una secuencia de aminoácidos del polipéptido, son como se definen y determinan en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2017/0002336.

Se desvelan diversas secuencias de aminoácidos del polipéptido y secuencias de polinucleótidos en el presente documento como características de ciertas realizaciones. Se pueden usar o referenciar variantes de estas secuencias, que son al menos aproximadamente 70-85%, 85-90% o 90%-95% idénticas a las secuencias desveladas en el presente documento. Alternativamente, una secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótidos de variante puede tener al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia desvelada en el presente documento. La secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótidos de variante tiene la misma función/actividad de la secuencia desvelada, o al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de la función/actividad de la secuencia desvelada. Cualquier secuencia de aminoácidos del polipéptido desvelada en el presente documento que no empiece con una metionina puede comprender normalmente además al menos una metionina de inicio en el extremo N de la secuencia de aminoácidos. A diferencia, cualquier secuencia de aminoácidos del polipéptido desvelada en el presente documento que empiece con una metionina puede carecer opcionalmente de dicho resto de metionina.

Los términos "alinea con", "corresponde a" y similares se pueden usar indistintamente en el presente documento. Algunas realizaciones en el presente documento se refieren a una glucosiltransferasa que comprende al menos una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a al menos un resto de aminoácido particular de SEQ ID NO: 62. Una posición de aminoácido de una glucosiltransferasa o subsecuencia de la misma (por ejemplo, dominio catalítico o dominio catalítico más dominios de unión a glucano) (se puede referir a dicha posición de aminoácido o secuencia como una posición o secuencia "problema") se puede caracterizar para correspondencia con un resto de aminoácido particular de SEQ ID NO: 62 (se puede referir a dicha posición de aminoácido o secuencia como una posición o secuencia "objeto") si (1) la secuencia problema se puede alinear con la secuencia objeto (por ejemplo, donde un alineamiento indica que la secuencia problema y la secuencia objeto [o una subsecuencia de la secuencia objeto] son al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% idénticas), y (2) si la posición problema de aminoácido se alinea directamente con (se alinea directamente contra) la posición objeto del aminoácido en el alineamiento de (1). En general, se puede alinear una secuencia de aminoácidos problema con una secuencia objeto (SEQ ID NO: 62 o una subsecuencia de SEQ ID NO: 62) usando cualquier algoritmo, herramienta y/o software de alineamiento descrito desvelado en el presente documento (por ejemplo, BLASTP,ClustalW, ClustalV, Clustal-Omega, EMBOSS) para determinar el porcentaje de identidad. Solo para un ejemplo adicional, se puede alinear una secuencia problema con una secuencia objeto en el presente documento usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) como se implementó en el programa de Needleman del European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS [por ejemplo, versión 5.0.0 o posterior], Rice et al., Trends Genet. 16:276-277, 2000). Los parámetros de dicho alineamiento de EMBOSS pueden comprender, por ejemplo: penalización por abertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5, matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62).

La numeración de restos de aminoácidos particulares de SEQ ID NO: 62 en el presente documento es con respecto a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 62. El primer aminoácido (es decir, la posición 1, Met-1) de SEQ ID NO: 62 está al comienzo del péptido señal. A menos que se desvele de otro modo, las sustituciones en el presente documento son con respecto a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 62.

Una "glucosiltransferasa no nativa" en el presente documento (alternativamente, asimismo se pueden usar "mutante", "variante", "modificada" y términos similares para describir dicha glucosiltransferasa) tiene al menos una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a un resto de aminoácido particular de SEQ ID NO: 62. En la mayoría de los casos, dicha al menos una sustitución de aminoácidos está en lugar del (de los) resto(s) de aminoácido que normalmente ocurre(n) (nativamente) en la misma posición en el homólogo nativo (parental) de la glucosiltransferasa no nativa. El aminoácido que ocurre normalmente en el sitio relevante en la glucosiltransferasa homóloga nativa es frecuentemente el mismo que (o conservado con) el resto de aminoácido particular de SEQ ID NO: 62 para el que se hace el alineamiento. Una glucosiltransferasa no nativa puede tener opcionalmente otros cambios de aminoácidos (mutaciones, deleciones y/o inserciones) con respecto a su secuencia homóloga nativa.

Puede ser instructivo ilustrar una sustitución/alineamiento en el presente documento. SEQ ID NO: 12 (GTF 0544) es una forma truncada de una glucosiltransferasa de Streptococcus sobrinus. Se observa que Leu-193 de SEQ ID NO: 12 corresponde con Leu-373 de SEQ ID NO: 62 (alineamiento no mostrado). Si SEQ ID NO: 12 se muta en la posición 193 para sustituir el resto Leu con un resto diferente (por ejemplo, Gln), entonces se puede establecer que la versión mutada en la posición 193 de SEQ ID NO: 12 representa una glucosiltransferasa no nativa que tiene una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente, por ejemplo, a Leu-373 de SEQ ID NO: 62.

El término "aislado" significa una sustancia (o proceso) en una forma o entorno que no ocurre en la naturaleza. Un ejemplo no limitante de una sustancia aislada incluye cualquier sustancia que no existe de forma natural, tal como un agregado o partícula de alfa-glucano insoluble en el presente documento (así como las reacciones enzimáticas y otros procesos usados en preparación de cualquiera de estos materiales). Se cree que las realizaciones desveladas en el presente documento son sintéticas/artificiales (no podrían haber sido hechas excepto por intervención/participación humana), y/o tienen propiedades que no existen de forma natural.

El término "incrementado", como se usa en el presente documento, se puede referir a una cantidad o actividad que es al menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 50%, 100%, o 200% superior a la cantidad o actividad con la que se compara la cantidad o actividad incrementada. Los términos "incrementado", "elevado", "potenciado", "superior a", "mejorado" y similares se usan indistintamente en el presente documento.

Se desean nuevas formas de alfa-glucano insoluble para potenciar el valor económico y las características de rendimiento de este material en diversas aplicaciones. Se desvelan en el presente documento composiciones que comprenden agregados de alfa-glucano insoluble con características morfológicas únicas para tratar esta necesidad.

Ciertas realizaciones de la presente divulgación se refieren a una composición que comprende agregados de alfa-glucano insoluble, en donde los agregados tienen un radio hidrodinámico promedio de aproximadamente 50-300 nm y una dimensión fractal de aproximadamente 1,6-2,4, y en donde el alfa-glucano insoluble comprende enlaces alfa-1,3-glicosídicos. El intervalo de la dimensión fractal de los agregados desvelados indica que tienen una elevada área superficial interna, que a su vez indica que los agregados desvelados son útiles en aplicaciones que se aprovechan, por ejemplo, de la elevada área superficial interna.

El radio hidrodinámico promedio de los agregados en el presente documento es aproximadamente 50-300 nm. En algunos aspectos, el radio hidrodinámico promedio de los agregados es aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 50-300, 50-250, 50­ 200, 50-150, 60-140, 60-130, 60-120, 60-115, 60-110, 60-105, 60-100, 70-130, 70-120, 70-11570-110, 70-105, 70-100, 80-130, 80-120, 80-115, 80-110, 80-105, 80-100, 90-130, 90-120, 90-115, 90-110, 90-105, 90-100, 100-130, 100-120, 100-115, 100-110, o 100-105 nm. Aún en algunos aspectos, el radio hidrodinámico promedio de los agregados puede ser aproximadamente, o hasta aproximadamente, 300, 350, 400, 450 o 500 (es decir, 600, 700, 800, 900 o 1000 nm, respectivamente, de diámetro hidrodinámico) (o cualquier intervalo intermedio). El radio hidrodinámico de los agregados se puede medir por dispersión dinámica de luz (DLS) siguiendo la metodología descrita en los Ejemplos de más adelante y/o como se describe en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2017/0055540 o 2010/0056361.

En algunos aspectos, el radio hidrodinámico de los agregados puede ser como se mide después de romper una dispersión de alfa-glucano insoluble (por ejemplo, aproximadamente 0,05-0,15, o 0,1 mg/ml) por aplicación de una fuerza de cizallamiento (por ejemplo, usando un sonicador) de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 8, 9, 10, 11 o 12 kJ/kg de energía específica (por ejemplo, durante aproximadamente 30-50, 35-45 o 40 minutos). Esta medición se puede hacer inmediatamente (por ejemplo, en 1-5 o 1-10 minutos), o, por ejemplo, en aproximadamente 1,3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 o 48 horas, después de terminar la aplicación de la fuerza de cizallamiento. El tamaño de los agregados en algunos aspectos adicionales o alternativos se puede medir usando cualquier técnica adecuada conocida en la técnica, tal como microscopía electrónica (de transmisión [TEM] o de barrido [SEM]), microscopía de fuerza atómica (AFM), dispersión de rayos X por ángulo pequeño (SAXS), dispersión de neutrones por ángulo pequeño (SANS), dispersión de la luz, y/o empleando las técnicas desveladas en los Ejemplos de más adelante.

Los agregados de alfa-glucano insoluble en el presente documento tienen una dimensión fractal de aproximadamente 1.6- 2,4. En algunos aspectos, la dimensión fractal puede ser aproximadamente 1,6, 1,7, 1,8. 1,9, 1,95, 2,0, 2,05, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, 1,6-2,4, 1,7-2,4, 1,8-2,4, 1,9-2,4, 1,95-2,4, 2,0-2,4, 1,6-2,3, 1,7-2,3, 1,8-2,3, 1,9-2,3, 1,95-2,3, 2,0-2,3, 1,6-2,2, 1.7- 2,2, 1,8-2,2, 1,9-2,2, 1,95-2,2, 2,0-2,2, 1,6-2,1, 1,7-2,1, 1,8-2,1, 1,9-2,1, 1,95-2,1,2,0-2,1, 1,6-2,05, 1,7-2,05, 1,8-2,05, I , 9-2,05, 1,95-2,05, o 2,0-2,05. La dimensión fractal se puede medir usando cualquier técnica adecuada conocida en la técnica, tal como dispersión (dispersión de la luz, dispersión de rayos X [por ejemplo, SAXS] o dispersión de neutrones [por ejemplo, SANS]) y/o empleando las técnicas desveladas en los Ejemplos de más adelante. Los agregados en el presente documento se pueden caracterizar opcionalmente por ser planos en forma/morfología; en general, cuanto más próxima sea la dimensión fractal a 2,0 (como se aproxima desde arriba de 2,0), más plana será la forma. La dimensión fractal en algunos aspectos se puede medir con respecto a los agregados que tienen aproximadamente 10-150, 10-125, 10-110 o 10-100 nm de radio hidrodinámico; sin embargo, también se puede medir, si se desea, la dimensión fractal de los agregados de cualquier radio hidrodinámico (o intervalo del mismo) como se enumera anteriormente (por ejemplo, hasta 500 nm).

Los agregados en algunos aspectos son arborescentes y, por lo tanto, tienen una estructura de tipo árbol o ramificada. La naturaleza arborescente de los agregados puede ser como se representa, por ejemplo, en la FIG. 1. Se contempla que esta arborescencia produce la organización fractal de las partículas de alfa-glucano insoluble que forman un agregado. La arborescencia de los agregados en el presente documento se puede detectar por microscopía (por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión [TEM], tal como TEM criogénica [también conocida como crio-TEM]), por ejemplo, y/o empleando las técnicas desveladas en los Ejemplos de más adelante.

Los agregados en el presente documento tienen una elevada área superficial. Se contempla que el área superficial de los agregados en algunos aspectos sea aproximadamente, o al menos aproximadamente, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 150-250, 150-225, 175-250, o 175-225 m2/g. El área superficial en algunos aspectos particulares caracteriza los agregados que comprenden partículas con un tamaño promedio de aproximadamente 13-17 nm (por ejemplo, ~15 nm).

Los agregados en el presente documento comprenden partículas (partículas primarias) de alfa-glucano insoluble. Estas partículas pueden tener un tamaño promedio de, por ejemplo, aproximadamente 5-25 nm. En algunos aspectos, las partículas de alfa-glucano insoluble pueden tener un tamaño promedio de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 10-20, 10­ 18, 10-16, 12-20, 12-18, 12-16, 14-20, 14-18, o 14-16 nm. El tamaño de partículas se puede medir usando cualquier técnica adecuada conocida en la técnica (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente para medir el tamaño de los agregados, tal como SAXS), y/o empleando las técnicas desveladas en los Ejemplos de más adelante. Los agregados en algunos aspectos consisten en partículas de alfa-glucano insoluble. Las partículas pueden ser, por ejemplo, de forma esférica y/o de tipo varilla. Se contempla que, en algunos aspectos, aproximadamente 0%, 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de las partículas de agregados en el presente documento sean (i) esféricas, (ii) de tipo varilla, o una combinación de (i) y (ii) que suma aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 95% o 100%. En algunos aspectos, el tamaño de partículas primarias (por ejemplo, diámetro) puede ser como se mide usando dispersión por ángulo pequeño (por ejemplo, con datos sometidos a un ajuste universal, tal como según Beaucage [1995, J. Appl. 28:717-728, para calcular el radio de giro de las partículas (Rg), que luego se

usa en la siguiente ecuación para calcular el diámetro de partículas (D):

En cualquier ámbito acuoso como se desvela en el presente documento, los agregados son, en general, reacios a la rotura (generalmente son resistentes a ser destruidos) cuando se someten a una fuerza de cizallamiento con energía específica de hasta varios MJ/kg (por ejemplo, se contempla que es de hasta aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7 u 8 MJ/kg de energía específica) (por ejemplo, durante hasta 30-40 minutos); por ejemplo, se contempla que hasta el 80%, 85%, 90% o 95% de los agregados no se rompen dando partículas primarias cuando se someten a una fuerza de cizallamiento en el presente documento.

Las moléculas individuales de alfa-glucano insoluble en una partícula en el presente documento pueden tener cada una un grado de polimerización promedio en peso (DPw) de, por ejemplo, aproximadamente, o al menos aproximadamente, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 200-1200, 400-1200, 600-1200, 200-1000, 400-1000 o 600-1000. Puede haber aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 6-12 o 8-12 moléculas individuales de alfa-glucano insoluble en una partícula en algunos aspectos; este número de moléculas depende normalmente del DPw de la molécula individual y el tamaño de la partícula (por ejemplo, una partícula de 14-16 nm puede tener 10 moléculas que tienen cada una 800 de DPw).

Una composición en ciertas realizaciones puede comprender aglomerados de agregados como se desvela en el presente documento. Los aglomerados pueden tener un tamaño promedio de, por ejemplo, aproximadamente 1,5, 10, 25, 50, 75, 90, 100, 110, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 1-200, 2,5-200, 5-200, 7,5-200, 1-150, 2,5-150, 5-150, 7,5-150, 1-125, 2,5-125, 5-125, 7,5-125, 1-110, 2,5-110, 5-110, 7,5-110, 1-100, 2,5-100, 5-100, 7,5-100, 1-90, 2,5-90, 5-90, 7,5-90, 1-50, 5-50, 10-50, o 25-50 micras (micrómetros). En cualquier entorno acuoso como se desvela en el presente documento, los aglomerados en el presente documento pueden ser normalmente cizallados/alterados/destruidos por una fuerza de cizallamiento de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 8, 9, 10, 11 o 12 kJ/kg de energía específica (por ejemplo, durante aproximadamente 3, 4, 5, 6, 8 o 10 minutos), por ejemplo, para producir aglomerados más pequeños o agregados constituyentes. A su vez, los agregados pueden reensamblarse en aglomerados tras la retirada de dicha fuerza de cizallamiento. En algunos aspectos, los valores del tamaño del aglomerado desvelados en el presente documento representan la mediana de diámetro (D50) de una distribución del tamaño de partículas como se mide usando un analizador del tamaño de partículas adecuado (por ejemplo, basándose en dispersión de la luz), tal como un Mastersizer® (Malvern) y/o como se describe en los Ejemplos de más adelante. El tamaño del aglomerado en algunos aspectos es como se mide para los aglomerados no rotos (por ejemplo, no sonicados).

Los agregados de la presente divulgación comprenden alfa-glucano insoluble que comprende enlaces alfa-1,3-glicosídicos. En algunos aspectos, al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, o 100% (o cualquier número entero entre el 50% y el 100%) de los enlaces glicosídicos constituyentes del alfa-glucano insoluble son enlaces alfa-1,3. En algunos aspectos, por consiguiente, el alfa-glucano insoluble tiene menos de aproximadamente 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, o 0% (o cualquier valor entero entre el 0% y el 50%) de enlaces glicosídicos que no son alfa-1,3. Normalmente, los enlaces glicosídicos que no son alfa-1,3 son principalmente o completamente alfa-1,6. Se debe entender que cuanto más alto sea el porcentaje de enlaces alfa-1,3 presentes en el alfa-glucano, mayor será la probabilidad de que el alfa-glucano sea lineal, puesto que hay menos manifestaciones de ciertos enlaces que forman puntos de ramificación en el polímero. Por lo tanto, se cree que el alfa-glucano insoluble con 100% de enlaces alfa-1,3 es completamente lineal. En ciertas realizaciones, el alfa-glucano insoluble no tiene puntos de ramificación o menos de aproximadamente el 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de puntos de ramificación como un porcentaje de los enlaces glicosídicos en el polímero. Los ejemplos de puntos de ramificación incluyen puntos de ramificación en alfa-1,6, - 1,2 y -1,4 que proceden de un esqueleto unido en alfa-1,3.

El alfa-glucano insoluble en el presente documento puede tener un peso molecular en DPw o DPn de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 100 en algunos aspectos. DPw o DPn en algunas realizaciones puede ser aproximadamente, o al menos aproximadamente, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, o 1200 (o cualquier número entero entre 100 y 1200). DPw o DPn de un alfa-glucano se puede expresar opcionalmente como un intervalo entre cualesquiera dos de estos valores (por ejemplo, 100-1200, 400­ 1200, 700-1200, 100-1000, 400-1000, 700-1000).

El alfa-glucano en el presente documento es insoluble en sistemas acuosos no cáusticos, tales como las condiciones de una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento (por ejemplo, pH 4-8, véase más adelante). En general, la solubilidad de un polímero de glucano en entornos acuosos en el presente documento está relacionada con su perfil de enlace, peso molecular y/o grado de ramificación. Por ejemplo, el alfa-1,3-glucano con >95% de enlaces 1,3 es, en general, insoluble a un DPw de 8 y superior en condiciones acuosas a 20 °C. En general, a medida que aumenta el peso molecular, disminuye el porcentaje de enlaces alfa-1,3 requeridos para la insolubilidad del alfa-1,3-glucano.

En algunas realizaciones, un alfa-glucano insoluble puede comprender al menos aproximadamente 30% de enlaces alfa-1,3 y un porcentaje de enlaces alfa-1,6 que lleva el total de tanto los enlaces alfa-1,3 como -1,6 en el alfa-glucano al 100%. Por ejemplo, el porcentaje de enlaces alfa-1,3 y -1,6 puede ser aproximadamente del 30-40% y del 60-70%, respectivamente. En algunos aspectos, un alfa-glucano insoluble que comprende al menos aproximadamente 30% de enlaces alfa-1,3 es lineal. Las glucosiltransferasas para producir alfa-glucano insoluble que comprende al menos aproximadamente 30% de enlaces alfa-1,3 se desvelan en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2015/0232819, que se incorpora en el presente documento como referencia.

El alfa-glucano insoluble en algunas realizaciones puede estar en forma de un copolímero (por ejemplo, copolímero de injerto) que tiene (i) un esqueleto que comprende dextrano (por ejemplo, con al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de enlaces alfa-1,6) con un peso molecular de al menos aproximadamente 100000 dáltones, y (ii) cadenas laterales de alfa-1,3-glucano que comprenden al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Dichos copolímeros pueden ser como se desvelan en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° WO2017/079595, que se incorpora en el presente documento como referencia.

Cualquiera de los perfiles de enlace y/o perfiles de peso molecular anteriores, por ejemplo, se puede combinar en el presente documento para caracterizar apropiadamente el alfa-glucano insoluble en el presente documento. En algunos aspectos, el perfil de enlace y/o de peso molecular de dicho alfa-glucano puede ser como se desvela en cualquiera de las siguientes publicaciones, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 7000000 y 8871474, la publicación de patente de EE. UU. N.° 2015/0232819, la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO2017/079595. El alfa-glucano insoluble de las realizaciones anteriores puede ser un producto de cualquiera de, por ejemplo, la reacción de síntesis de glucanos y procesos posteriores a la reacción desvelados a continuación.

El alfa-glucano insoluble en el presente documento no comprende alternano (que alterna enlaces 1,3 y 1,6), que es soluble acuoso. El alfa-glucano insoluble en el presente documento se obtiene normalmente enzimáticamente en un recipiente inerte (normalmente en condiciones sin células) y no deriva de una pared celular (por ejemplo, pared de célula fúngica).

Ciertas realizaciones de la presente divulgación se refieren a un método de producción (preparación) de agregados de alfa-glucano insoluble como se describe en el presente documento. Dicho método comprende: (a) poner en contacto al menos agua, sacarosa y una enzima glucosiltransferasa que sintetiza alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos aproximadamente el 40%; y (b) preparar una dispersión del alfa-glucano insoluble producido en la etapa (a). La etapa (a) se puede caracterizar opcionalmente por comprender preparar/proporcionar una reacción de glucosiltransferasa o composición de reacción. La etapa (a) puede emplear una enzima glucosiltransferasa que produce cualquier molécula de alfa-glucano insoluble como se desvela anteriormente (por ejemplo, >90% o >95% de enlaces alfa-1,3). La etapa de dispersión (b) produce agregados del alfa-glucano insoluble sintetizado en la etapa (a).

Una reacción de glucosiltransferasa como se desvela en el presente documento comprende poner en contacto al menos agua, sacarosa y una glucosiltransferasa en el presente documento que produce alfa-glucano insoluble. Estos y opcionalmente otros reactivos se pueden añadir por completo o en cualquier orden como se trata más adelante. La etapa de poner en contacto en el presente documento se puede realizar en cualquier número de formas. Por ejemplo, la cantidad deseada de sacarosa se puede disolver primero en agua (opcionalmente, también se pueden añadir otros componentes en esta etapa de la preparación, tales como componentes tampón), seguido por la adición de enzima glucosiltransferasa. La disolución se puede mantener quieta, o agitada, por ejemplo, removiendo o por agitación orbital. Una reacción de glucosiltransferasa se puede realizar en modo discontinuo, de lotes alimentados o continuo, o por cualquier variación de estos modos.

La finalización de una reacción en ciertas realizaciones se puede determinar visualmente (por ejemplo, no más acumulación de alfa-glucano insoluble), y/o midiendo la cantidad de sacarosa que queda en la disolución (sacarosa residual), donde un porcentaje de consumo de sacarosa de al menos aproximadamente el 90%, 95% o 99% puede indicar la finalización de la reacción. En algunos aspectos, una reacción se puede considerar completa cuando su contenido de sacarosa es de o por debajo de aproximadamente 2-5 g/l. Una reacción del proceso desvelado se puede realizar durante, por ejemplo, aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 144 o 168 horas. Una reacción puede ser terminada opcionalmente y/o tratada de otro modo para detener la actividad de glucosiltransferasa, por ejemplo, calentándola hasta al menos aproximadamente 65 °C durante al menos aproximadamente 30-60 minutos.

La temperatura de una composición de reacción en el presente documento se puede controlar, si se desea, y puede ser, por ejemplo, aproximadamente 5-50 °C, 20-40 °C, 30-40 °C, 20-30 °C, 20-25 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C, o 40 °C.

La concentración inicial de sacarosa en una composición de reacción en el presente documento puede ser, por ejemplo, aproximadamente 20-400 g/l, 75-175 g/l o 50-150 g/l. En algunos aspectos, la concentración inicial de sacarosa es al menos aproximadamente 50, 75, 100, 150 o 200 g/l, o es aproximadamente 50-600 g/l, 100-500 g/l, 50-100 g/l, 100-200 g/l, 150-450 g/l, 200-450 g/l o 250-600 g/l. "Concentración inicial de sacarosa" se refiere a la concentración de sacarosa en una composición de reacción justo después de que todos los componentes de reacción hayan sido añadidos/combinados (por ejemplo, al menos agua, sacarosa, enzima glucosiltransferasa).

El pH de una composición de reacción en ciertas realizaciones puede ser aproximadamente 4,0-9,0, 4,0-8,5, 4,0-8,0, 5,0­ 8,0, 5,5-7,5 o 5,5-6,5. En algunos aspectos, el pH puede ser aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 u 8,0. El pH se puede ajustar o controlar mediante la adición o incorporación de un tampón adecuado, que incluye, pero no se limita a: fosfato, tris, citrato, o una combinación de los mismos. La concentración de tampón en una composición de reacción en el presente documento puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,1-300 mM, 0,1-100 mM, 10-100 mM, 10 mM, 20 mM o 50 mM.

Una reacción de glucosiltransferasa puede estar contenida dentro de cualquier recipiente (por ejemplo, un recipiente/envase inerte) adecuado para aplicar una o más de las condiciones de reacción desveladas en el presente documento. Un recipiente inerte en algunos aspectos puede ser de acero inoxidable, plástico o vidrio (o comprender dos o más de estos componentes) y ser de un tamaño adecuado para contener una reacción particular. Por ejemplo, el volumen/la capacidad de un recipiente inerte (y/o el volumen de una composición de reacción en el presente documento) puede ser aproximadamente, o al menos aproximadamente, 1, 10, 50, 100, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 12500, 15000 o 20000 litros. Un recipiente inerte se puede equipar opcionalmente con un dispositivo de agitación. Cualquiera de las características anteriores, por ejemplo, se puede usar para caracterizar una reacción aislada en el presente documento.

Una composición de reacción en el presente documento puede contener, por ejemplo, una, dos o más enzimas glucosiltransferasa diferentes. En algunas realizaciones, solo una o dos enzimas glucosiltransferasa está/n comprendida/s en una composición de reacción. Una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento puede estar, y normalmente está, libre de células (por ejemplo, ninguna célula completa presente).

Los ejemplos de otras condiciones y/o componentes adecuados para sintetizar alfa-glucano insoluble en el presente documento se desvelan en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2014/0087431,2017/0166938 y 2017/0002335.

Una enzima glucosiltransferasa en el presente documento sintetiza alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos aproximadamente el 40%. El rendimiento del alfa-glucano insoluble por una enzima glucosiltransferasa en algunos aspectos puede ser aproximadamente, o al menos aproximadamente, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, o 96%. El rendimiento en algunos aspectos se puede medir basándose en el componente de glucosilo de la reacción. Por lo tanto, la etapa (a) se puede caracterizar por usar una enzima glucosiltransferasa que sintetiza alfa-glucano insoluble con un rendimiento que es al menos aproximadamente el 40% basado en el componente de glucosilo de la composición de reacción. El rendimiento en algunos aspectos se puede medir usando HPLC o espectroscopia de NIR. El rendimiento se puede lograr en una reacción realizada durante, por ejemplo, aproximadamente 16-24 horas (por ejemplo, ~20 horas).

Los ejemplos de enzimas glucosiltransferasa en el presente documento que sintetizan alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos aproximadamente el 40% incluyen ciertas glucosiltransferasas no nativas como se describe a continuación. Una glucosiltransferasa no nativa, por ejemplo, puede (i) comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 99,5% idéntica a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 26, 28, 30, 34 o 59; y (ii) tiene al menos una sustitución de aminoácidos que proporciona a la glucosiltransferasa no nativa la capacidad de producir alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos el 40% (ejemplos de sustituciones adecuadas se describen a continuación). Cierta información referente a los productos de alfa-glucano insoluble de glucosiltransferasas con las secuencias de aminoácidos anteriores se proporciona en la Tabla 2 (a continuación). Una glucosiltransferasa no nativa en el presente documento tiene normalmente un homólogo parental (por ejemplo, nativo y/o sin sustituir) que tiene un rendimiento de alfa-glucano insoluble inferior a, por ejemplo, aproximadamente el 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28% o 27%.

Tabla 2. Enzimas GTF y productos de alfa-glucano relacionados3

En algunos aspectos, una glucosiltransferasa no nativa comprende al menos una sustitución de aminoácidos correspondiente a una sustitución en la Tabla 3 (a continuación, Ejemplo 1) que está asociada con un rendimiento de alfaglucano insoluble de al menos el 40% (la numeración de posiciones de dicha al menos una sustitución corresponde con la numeración de posiciones de SEQ ID

NO: 62). En algunos aspectos, una glucosiltransferasa no nativa comprende un conjunto de sustituciones de aminoácidos correspondiente a un conjunto de sustituciones en las Tablas 4 o 5 (a continuación, Ejemplo 1) que está asociado con un rendimiento de alfa-glucano insoluble de al menos el 40% (la numeración de posiciones de este conjunto de sustituciones corresponde con la numeración de posiciones de SEQ ID NO: 62).

En algunos aspectos, una glucosiltransferasa no nativa (i) comprende al menos una sustitución de aminoácidos o un conjunto de sustituciones de aminoácidos (descrito anteriormente), y (ii) comprende o consiste en un dominio catalítico de glucosiltransferasa que es al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,5% idéntico a los restos de aminoácidos 55-960 de SEQ ID NO: 4, los restos 54-957 de SEQ ID n O: 65, los restos 55­ 960 de SEQ ID NO: 30, los restos 55-960 de SEQ ID NO: 28, o los restos 55-960 de SEQ ID NO: 20. Se cree que dicha glucosiltransferasa no nativa, por ejemplo, es capaz de producir alfa-glucano que es insoluble en agua y comprende al menos aproximadamente el 50% (por ejemplo, >90% o >95%) de enlaces alfa-1,3, y opcionalmente además tiene un DPw de al menos 100. Se observa que una glucosiltransferasa con posiciones de aminoácidos 54-957 de SEQ ID NO: 65 puede producir alfa-1,3-glucano con 100% de enlaces alfa-1,3 y un DPw de al menos 400 (datos no mostrados, véase, por ejemplo, la Tabla 6 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.22017/0002335. Se indica además que SEQ ID NO: 65 (GTF 7527), 30 (GTF 2678), 4 (GTF 6855), 28 (GTF 2919) y 20 (GTF 2765) representan cada una una glucosiltransferasa que, en comparación con su homólogo nativo respectivo, carece del dominio de péptido señal y todo o una porción sustancial del dominio variable. Por lo tanto, cada una de estas enzimas glucosiltransferasa tiene un dominio catalítico seguido por un dominio de unión a glucano. La localización aproximada de las secuencias del dominio catalítico de estas enzimas es del siguiente modo: 7527 (restos 54- 957 de SEQ ID NO: 65), 2678 (restos 55-960 de SEQ ID NO: 30), 6855 (restos 55-960 de SEQ ID NO: 4), 2919 (restos 55- 960 de SEQ ID NO: 28), 2765 (restos 55-960 de SEQ ID NO: 20). Las secuencias de aminoácidos de los dominios catalíticos (aprox.) de las Gt F 2678, 6855, 2919 y 2765 tienen aproximadamente 94,9%, 99,0%, 95,5% y 96,4% de identidad, respectivamente, con la secuencia aproximada del dominio catalítico de GTF 7527 (es decir, los aminoácidos 54-957 de SEQ ID NO: 65). Cada una de estas glucosiltransferasas particulares (GTF 2678, 6855, 2919 y 2765) puede producir alfa-1,3-glucano con 100% de enlaces alfa-1,3 y un DPw de al menos 400 (datos no mostrados, véase la Tabla 4 de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2017/0002335). Basándose en esta actividad, y la vinculación (elevado porcentaje de identidad) de los dominios catalíticos anteriores, se contempla que una glucosiltransferasa no nativa en el presente documento que tiene uno de los dominios catalíticos anteriores adicionales con al menos una sustitución de aminoácidos como se desvela en el presente documento puede producir alfa-glucano que comprende al menos aproximadamente el 50% (por ejemplo, >90% o >95%) de enlaces alfa-1,3 y un DPw de al menos 100.

En algunos aspectos, una glucosiltransferasa no nativa (i) comprende al menos una sustitución de aminoácidos o un conjunto de sustituciones de aminoácidos (descrito anteriormente), y (ii) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 69%, 70%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 99,5% idéntica a SEQ ID No : 62 o una subsecuencia de la misma, tal como SEQ ID NO: 4 (sin metionina de inicio de la misma) o las posiciones 55-960 de SEQ ID NO: 4 (dominio catalítico aproximado).

Una enzima glucosiltransferasa no nativa en el presente documento puede derivar de una fuente microbiana, tal como bacterias. Los ejemplos de enzimas glucosiltransferasa bacterianas son las derivadas de una especie de Streptococcus, especie de Leuconostoc o especie de Lactobacillus. Los ejemplos de especie de Streptococcus incluyen S. salivarius, S.

sobrinus, S. dentirousetti, S. downei, S. mutans, S. oralis, S. gallolyticus y S. sanguinis. Los ejemplos de especies de Leuconostoc incluyen L. mesenteroides, L. amelibiosum, L. argentinum, L. carnosum, L. citreum, L. cremoris, L. dextranicum y L. fructosum. Examples de especies de Lactobacillus incluyen L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius, L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum y L. reuteri.

La etapa (b) de un método de producción de agregados en el presente documento comprende preparar una dispersión del alfa-glucano insoluble producido en la etapa (a). Esta dispersión puede ser, por ejemplo, una dispersión coloidal. El alfaglucano insoluble producido por una reacción de glucosiltransferasa de la etapa (a) se puede retirar de la reacción, por ejemplo, y luego dispersar en agua o una disolución acuosa usando cualquier método adecuado. En algunos aspectos, dicha dispersión se puede realizar aplicando alto cizallamiento usando cualquier medio adecuado. El alto cizallamiento puede ser de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 8, 9, 10, 11 o 12 kJ/kg de energía específica, y/o puede comprender mezclar a aproximadamente, o hasta aproximadamente, por ejemplo, 3000, 4000, 6000, 8000, 10000, 12000, 14000 o 15000 rpm. Se puede aplicar alto cizallamiento durante aproximadamente, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 8 o 10 minutos. Medios adecuados para aplicar el alto cizallamiento incluyen, por ejemplo, el uso de una herramienta de dispersión adecuada, tal como un dispersador, sonicador (por ejemplo, ultrasonicador), homomezclador, homogeneizador (por ejemplo, giratorio o pistón, rotar-estátor), microfluidizador, mezcladora planetaria, molino de coloides, molino de chorro, vórtex, y/o cualquier metodología como se describe en los Ejemplos de más adelante y/o en las publicaciones de solicitud de patente internacional N.2 WO2016/126685 o WO2016/030234, las patentes de EE. UU. N.25767176, 6139875 o 8722092, o las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.22017/0055540 o 2018/0021238.

El alfa-glucano insoluble producido en la etapa (a) del método presentemente desvelado se aísla normalmente antes de la dispersión del alfa-glucano insoluble en la etapa (b) para obtener agregados. En ciertas realizaciones, el aislamiento del alfa-glucano insoluble puede incluir al menos realizar una etapa de centrifugación y/o filtración. El aislamiento puede comprender opcionalmente además lavar el alfa-glucano insoluble una, dos o más veces con agua u otro líquido acuoso (por ejemplo, usando una disolución acuosa en el presente documento). Un volumen de lavado puede ser opcionalmente al menos, por ejemplo, aproximadamente el 10-100% del volumen de la reacción de glucosiltransferasa usada para producir el alfa-glucano insoluble. El lavado se puede hacer por diversos modos, según se desee, tal como por lavado por desplazamiento o resuspensión. El aislamiento en el presente documento no comprende el secado del alfa-glucano insoluble.

La preparación de una dispersión de alfa-glucano insoluble en algunos aspectos puede comprender: preparar una torta húmeda de alfa-glucano insoluble producida en la reacción de glucosiltransferasa de la etapa (a), y dispersar la torta húmeda en agua o una disolución acuosa. El aislamiento del alfa-glucano insoluble para la preparación de la torta húmeda puede incluir al menos realizar una etapa de centrifugación (es decir, la torta húmeda es glucano peletizado) y/o filtración (es decir, la torta húmeda es glucano filtrado). Por ejemplo, la torta húmeda en el presente documento se puede obtener usando un embudo, filtro (por ejemplo, un filtro de superficie, tal como un filtro rotativo de tambor de vacío, filtro de flujo cruzado, filtro de tamiz, filtro de banda, prensa de tornillo o prensa de filtro con o con capacidad de exprimir la membrana; o un filtro de profundidad, tal como un filtro de arena) y/o centrífuga; la filtración puede ser, por ejemplo, por gravedad, vacío, o filtración en prensa. El aislamiento de la torta húmeda puede comprender opcionalmente además lavarla como se ha descrito anteriormente. Una torta húmeda en el presente documento puede comprender, por ejemplo, al menos (i) aproximadamente 50%-90% en peso de agua o una disolución acuosa, y (ii) aproximadamente 10%-50% en peso de alfaglucano insoluble. Una torta húmeda en algunos aspectos puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, 20-50, 20-40, 20-30, 30-50, 30-40, 40-50, 30-45, 35-45, 37,5-42,5, 35-40, o 40-45% en peso de alfa-glucano insoluble (añadiéndose agua o disolución acuosa hasta el 100% en peso). En algunos aspectos, la porción acuosa de una torta húmeda tiene un perfil de solutos y/o de pH según lo que se describe para una disolución acuosa en el presente documento.

Una composición de la presente divulgación puede comprender agregados de alfa-1,3-glucano insoluble como se produjeron, por ejemplo, en un método como se ha descrito anteriormente.

Los agregados de alfa-glucano insoluble en el presente documento pueden estar presentes en una composición, tal como una composición acuosa (por ejemplo, dispersión coloidal), en un % en peso de, por ejemplo, aproximadamente, o al menos aproximadamente, 0.01,0,05, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, o 90% en peso. El componente líquido de una composición acuosa puede ser, por ejemplo, agua o una disolución acuosa. El disolvente de una disolución acuosa es normalmente agua, o puede comprender, por ejemplo, aproximadamente, o al menos aproximadamente, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98% en peso de agua.

Una disolución acuosa en algunos aspectos no tiene azúcares disueltos (detectables), o aproximadamente 0,1-1,5, 0,1­ 1,25, 0,1-1,0, 0,1-,75, 0,1-0,5, 0,2-0,6, 0,3-0,5, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 o 0,6% en peso de azúcares disueltos. Dichos azúcares disueltos pueden incluir, por ejemplo, sacarosa, fructosa, leucrosa y/o gluco-oligosacáridos solubles. Una disolución acuosa en algunos aspectos puede tener una o más sales/tampones (por ejemplo, Na+, Cl-, NaCl, fosfato, tris, citrato) (por ejemplo, < 0,1,0,5, 1,0, 2,0, o 3,0% en peso) y/o un pH de, por ejemplo, aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 4,0-9,0, 4,0-8,5, 4,0-8,0, 5,0-9,0, 5,0-8,5, 5,0-8,0, 6,0-9,0, 6,0-8,5, o 6,0-8,0,.

Una composición que comprende agregados de la presente divulgación puede tener una viscosidad de, por ejemplo, aproximadamente, o al menos aproximadamente, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 250000, 500000, o 1000000 centipoise (cP). La viscosidad se puede medir usando un viscosímetro o reómetro, o usando cualquier otro medio conocido en la técnica. Se puede aplicar una velocidad de cizallamiento rotacional de, por ejemplo, aproximadamente, o al menos aproximadamente, 10, 60, 150, 250, 600, 800, 1000 o 10-1000 rpm (revoluciones por minuto) cuando se mide la viscosidad de una composición en el presente documento. La viscosidad se puede medir a cualquier temperatura adecuada (por ejemplo, entre 4-30, 20-30, 20-25 o 3-110 °C) y/o a cualquier presión adecuada (por ejemplo, presión atmosférica, aproximadamente 760 torr).

Una composición que comprende agregados de la presente divulgación puede ser, en algunos aspectos, no acuosa (por ejemplo, una composición seca). Los ejemplos de dichas realizaciones incluyen polvos, gránulos, microcápsulas, escamas, o cualquier otra forma de materia particulada. Otros ejemplos incluyen composiciones más grandes, tales como pellas, barras, granos, perlas, pastillas, astillas, u otros aglomerados. Una composición no acuosa o seca tiene normalmente menos del 3, 2, 1,0,5 o 0,1% en peso de agua comprendida en su interior.

Una composición que comprende agregados en el presente documento, tal como una composición acuosa o una composición no acuosa (arriba), puede estar en forma de un producto de uso doméstico, producto de cuidado personal, producto industrial, producto farmacéutico o producto alimenticio, por ejemplo, tal como se describe en cualquiera de las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2016/0311935, 2016/0304629, 2015/0232785, 2015/0368594, 2015/0368595 y 2016/0122445, y las publicaciones de patente internacional N.2 WO2016/160737, WO2016/160738, WO2016/133734 y WO2016/160740. En algunos aspectos, una composición que comprende agregados puede comprender al menos un componente/ingrediente de un producto de uso doméstico, producto de cuidado personal, producto industrial, producto farmacéutico o producto alimenticio como se desvela en cualquiera de las publicaciones anteriores.

Una composición que comprende agregados en el presente documento puede contener opcionalmente una o más enzimas activas. Los ejemplos no limitantes de enzimas adecuadas incluyen proteasas, celulasas, hemicelulasas, peroxidasas, enzimas lipolíticas (por ejemplo, enzimas metalolipolíticas), xilanasas, lipasas, fosfolipasas, esterasas (por ejemplo, arilesterasa, poliesterasa), perhidrolasas, cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas, reductasas, oxidasas (por ejemplo, colina oxidasa, fenoloxidasa), lipoxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, beta-glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasas, condroitinasas, lacasas, metaloproteinasas, amadoriasas, galactosidasas, galactanasas, catalasas, carragenasas, lactasas, fosfatasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, transglutaminasas, xiloglucanasas, xilosidasas, metaloproteasas, arabinofuranosidasas, fitasas, isomerasas, transferasas, glucosiltransferasas (por ejemplo, como se desvela en el presente documento), amilasas (por ejemplo, glucoamilasas, alfa-amilasas, beta-amilasas), y cualquier combinación de las mismas. Si se incluye una enzima(s), puede estar comprendida en una composición en el presente documento en, por ejemplo, aproximadamente 0,0001-0,1% en peso (por ejemplo, 0,01-0,03% en peso) de enzima activa (por ejemplo, calculada como la proteína de enzima pura).

Al menos una, dos, o más celulasas se pueden incluir en una composición en el presente documento. Una celulasa en el presente documento puede tener actividad de endocelulasa (EC 3.2.1.4), actividad de exocelulasa (EC 3.2.1.91), o actividad de celobiasa (EC 3.2.1.21). Una celulasa en el presente documento es una "celulasa activa" que tiene actividad en condiciones adecuadas para mantener la actividad de celulasa; está dentro de la experiencia de la técnica determinar dichas condiciones adecuadas.

Una celulasa en el presente documento puede derivar de cualquier fuente microbiana, tal como una bacteria u hongo. Están incluidas las celulasas químicamente modificadas o celulasas mutantes manipuladas por proteína. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thielavia y Acremonium. Como otros ejemplos, una celulasa puede derivar de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila o Fusarium oxysporum; estas y otras celulasas se desvelan en las patentes de EE. UU. N.° 4435307, 5648263, 5691178, 5776757 y 7604974. Las celulasas de Trichoderma reesei a modo de ejemplo se desvelan en las patentes de EE. UU. N.° 4689297, 5814501,5324649 y la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO92/06221 y WO92/06165. Las celulasas de Bacillus a modo de ejemplo se desvelan en la patente de EE. UU. N.° 6562612, que se incorpora en el presente documento como referencia. Una celulasa, tal como cualquiera de las anteriores, está preferentemente en una forma madura que carece de un péptido señal aminoterminal. Las celulasas comercialmente disponibles útiles en el presente documento incluyen CELLUZYME® y CAREZYME® (Novozymes A/S); CLAZINASE® y PURADAX® HA (DuPont Industrial Biosciences) y KAC-500(B)® (Kao Corporation).

Una o más celulasas pueden ser directamente añadidas como un componente cuando se prepara una composición desvelada en el presente documento. Alternativamente, una o más celulasas pueden ser indirectamente (involuntariamente) proporcionadas en la composición desvelada. Por ejemplo, la celulasa se puede proporcionar en una composición en el presente documento en virtud de estar presente en una preparación de enzima no de celulasa usada para preparar una composición. La celulasa en composiciones en las que la celulasa se proporciona indirectamente a la misma puede estar presente en, por ejemplo, aproximadamente 0,1-10 ppb (por ejemplo, menos de 1 ppm).

La concentración eficaz de celulasa en una composición acuosa en la que se trata una tela puede ser determinada fácilmente por un experto. En los procesos de cuidado de telas, la celulasa puede estar presente en una composición acuosa (por ejemplo, líquido de lavado) en el que una tela se trata en una concentración que es como mínimo, por ejemplo, aproximadamente 0,01-0,1 ppm de la proteína celulasa total, o aproximadamente 0,1-10 ppb de proteína celulasa total (por ejemplo, menos de 1 ppm), hasta como máximo aproximadamente 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 o 5000 ppm de proteína celulasa total.

EJEMPLOS

La presente divulgación se ejemplifica adicionalmente en los siguientes Ejemplos: Se debe entender que estos ejemplos, aunque indican ciertos aspectos preferidos en el presente documento, se dan a modo de ilustración solo. A partir de la discusión anterior y estos ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de las realizaciones desveladas.

EJEMPLO 1 (no es parte de la invención)

Glucosiltransferasas no nativas que producen alfa-1,3-glucano insoluble con alto rendimiento

Este ejemplo describe la identificación de enzimas glucosiltransferasa no nativas que sintetizan alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos el 40%.

La secuencia de aminoácidos de la glucosiltransferasa usada para preparar sustituciones de aminoácidos en este ejemplo fue SEQ ID NO: 4 (GTF 6855), que es esencialmente una versión aminoterminalmente truncada (retirados el péptido señal y la región variable) de la glucosiltransferasa natural de longitud completa (representada por SEQ ID NO: 62) de SK126 de Streptococcus salivarius (véase la Tabla 1). Las sustituciones hechas en SEQ ID NO: 4 se pueden caracterizar como sustituciones de restos de aminoácidos nativos, ya que cada resto/posición de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (aparte del resto Met-1 de SEQ ID NO: 4) corresponde, por consiguiente, con un resto/posición de aminoácido dentro de SEQ ID NO: 62. En reacciones que comprenden al menos sacarosa y agua, la glucosiltransferasa de SEQ ID NO: 4 produce normalmente alfa-glucano que tiene aproximadamente 100% de enlaces alfa-1,3 y un DPw de 400 o mayor (por ejemplo, véanse las patentes de EE. UU. N.° 8871474 y 9169506, y

la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2017/0002336. Este producto de alfa-glucano, que es insoluble, se puede aislar tras la síntesis enzimática, por ejemplo, por filtración.

Sustituciones de un único aminoácido

Se expresaron cada una de las variantes de GTF 6855 (cada una con una sustitución de un único aminoácido como se indica en la Tabla 3) de las bibliotecas de evaluación de sitios (SEL) de forma bacteriana, se purificaron y se normalizaron hasta una concentración de 100 ppm. Cada preparación de enzima se cribó entonces (por triplicado) usando sacarosa como sustrato en reacciones de síntesis de alfa-1,3-glucano. Además de determinar la cantidad de polímero de alfa-1,3-glucano producida en cada reacción, se analizaron por HPLC los productos de azúcar soluble (fructosa, glucosa, leucrosa, gluco-oligosacáridos) y sacarosa residual de cada reacción después de aproximadamente una incubación de 20 horas.

Cada GTF (GTF 6855 y cada variante de la misma) participó en una reacción con sacarosa para determinar el rendimiento y la selectividad. Cada reacción se realizó del siguiente modo: se añadieron 37,5 pl de 100 ppm de muestra de enzima (ppm basadas en una curva de calibración de BSA) a 262,5 pl de 86 g/l de sacarosa (75 g/l final) en Na2HPO4/NaH2PO420 mM a pH 5,7 y se incubó durante la noche (aproximadamente 20 horas) a 30 °C. Después de esta incubación, cada reacción se inactivó por incubación durante 1 hora a 80 °C. Se filtró a vacío una alícuota de 200 pl de cada reacción extinguida por una placa filtrante de 0,45 pm (Millipore 0,45 pm hidrófila) y cada filtrado se diluyó 5x (10 pl de muestra 40 pl de Na2HPO4/NaH2PO4 20 mM) en preparación para el análisis de azúcares por HPLC. Los perfiles de estas reacciones (~20 horas) se proporcionan en la Tabla 3.

Tabla 3. Perfiles de productos de GTF 6855 (SEQ ID NO: 4) y variantes sustituidas de un solo aminoácido de las mismas

La Tabla 3 indica ejemplos de sustituciones de aminoácidos que se pueden emplear para producir una glucosiltransferasa no nativa útil en el presente documento para sintetizar alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos el 40%.

Múltiples sustituciones de aminoácidos

Brevemente, se hicieron ciertas combinaciones de sustituciones de aminoácidos en SEQ ID NO: 4 (GTF 6855). Estas sustituciones se enumeran en las Tablas 4 y 5 a continuación.

Cada enzima de variante de la Tabla 4 participó en una reacción de síntesis de glucanos con parámetros que fueron los mismos que, o similares a, los siguientes: recipiente, matraz oscilante de 250 ml indentado agitado a 120 rpm; pH inicial, 5,7; volumen de reacción, 50 ml; sacarosa, 75 g/l; GTF, 1,5 ml de lisado de células de E. coli que expresan de forma heteróloga la enzima; KH2PO4, 20 mM; temperatura, 30 °C; tiempo, aproximadamente 20-24 horas.

Cada enzima de variante de la Tabla 5 participó en una reacción de síntesis de glucanos con parámetros que fueron los mismos que, o similares a, los siguientes: recipiente, reactor de doble pared de 500 ml con turbina de aspas inclinadas de Teflon® (ángulo de 45 grados) en una varilla de agitación de vidrio y se agitó a 50-200 rpm; pH inicial, 5,5; volumen de reacción, 500 ml; sacarosa, 108 g/l; KH2PO4, 1 mM; temperatura, 39 °C; tiempo, aproximadamente 18-24 horas; filtrado de una reacción de síntesis de alfa-1,3-glucano previa, 50% en vol.

Los rendimientos de alfa-1,3-glucano de estas reacciones (medido similarmente como antes) se proporcionan en las Tablas 4 y 5.

Tabla 4. Rendimientos de alfa-1,3-glucano de variantes de GTF 6855

(SEQ ID NO: 4) con múltiples sustituciones de aminoácidos

Las Tablas 4 y 5 indican ejemplos de conjuntos de sustituciones de aminoácidos que se pueden emplear para producir una glucosiltransferasa no nativa útil en el presente documento para sintetizar alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos el 40%.

Por lo tanto, se identificaron enzimas glucosiltransferasa no nativa que sintetizan alfa-glucano insoluble con un rendimiento de al menos el 40%. Estas enzimas se pueden usar, por ejemplo, para sintetizar alfa-glucano insoluble para producir agregados en el presente documento, tal como se muestra en el Ejemplo 2 a continuación.

EJEMPLO 2

Preparación y análisis de agregados y aglomerados de alfa-glucano insoluble

Este ejemplo describe la preparación y el análisis de agregados de alfa-glucano insoluble. Estos agregados se prepararon dispersando alfa-1,3-glucano insoluble que se sintetizó en reacciones catalizadas por una glucosiltransferasa no nativa como se describe en el Ejemplo 1 (anteriormente).

Se prepararon reacciones de síntesis de glucano usando enzimas glucosiltransferasas como se describe en el Ejemplo 1 que producen alfa-1,3-glucano insoluble con un rendimiento entre 50-95% (basado en el componente de glucosilo de la reacción). Las reacciones se realizaron de un modo similar al descrito en el Ejemplo 1. Tras cada reacción, se filtraron muestras de cada producto de alfa-1,3-glucano (insoluble, aproximadamente 100% de enlaces alfa-1,3), se lavaron para retirar la mayoría de la fructosa y otros azúcares residuales, y se procesaron dando aproximadamente 10-40% en peso de sólidos usando un aparato de filtración. Las tortas de filtración de glucano resultantes ("tortas húmedas) contuvieron aproximadamente 90-75% en peso de agua, y no se secaron. En algunos casos, se encontró que las tortas de filtración tenían aproximadamente 0,4% en peso de azúcares.

Se prepararon dispersiones de productos individuales de alfa-1,3-glucano por agitación con vórtex de la torta húmeda que se había diluido con agua (100:1 de agua:muestra). Entonces se procesó cada dispersión y se analizó del siguiente modo.

La dispersión (20 pl) se depositó sobre mica recién partida, se dejó que se asentara durante 30 segundos, y luego se separó por centrifugación a 5000 rpm durante 30 segundos. Entonces se usó microscopía de fuerza atómica (AFM) para obtener imágenes de la estructura agregada que se depositó. Aunque esta obtención de imágenes pareció mostrar inicialmente partículas esféricas que estaban altamente agregadas, tras el análisis posterior se apreció que las partículas agregadas incluían partículas largas de tipo varilla. Las partículas primarías se pudieron medir por una exploración lineal a través de la imagen, usando una serie de protuberancias para el perfil de altura. De este perfil, fue posible medir que el tamaño lateral de las partículas era aproximadamente 30 nm. Puesto que esta medición era complicada por la anchura lateral de la sonda, fue muy probable una sobreestimación. La imagen de AFM también mostró que las partículas son de tamaño uniforme.

Se preparó similarmente una segunda muestra en una cuadrícula de microscopía electrónica de transmisión (TEM), depositando partículas por secado de una dispersión. La imagen de TEM mostró agregados de partículas esféricas y de tipo varilla. El tamaño de estas partículas pareció ser bastante uniforme. Se estimó que las partículas esféricas tenían aproximadamente 6,5 nm de diámetro a partir de la imagen. Fue difícil una medición inequívoca debido a que las partículas estaban muy agregadas al haber sido secadas excesivamente en el vacío del instrumento. Indudablemente, debido a las condiciones de preparación, la elevada área superficial original y la estructura muy abierta del glucano polimerizado sin postratamiento había colapsado para formar una estructura muy agregada, que entonces se registró en la imagen. Este resultado de TEM fue útil para mostrar que algunas de las partículas primarias son esféricas, de tamaño uniforme y aproximadamente 10 nm de diámetro. Sin embargo, se advierte que fue difícil una medición exacta de tamaño debido al colapso estructural, que oscurece los límites entre partículas y muy probablemente cambia el tamaño de partículas individuales.

Se compararon las imágenes de TEM para alfa-1,3-glucano agregado con las imágenes de TEM para el negro de carbón y la sílice pirogénica. Las partículas de sílice mostraron una intensa agregación, parecieron más grandes (~15 nm) que las partículas de glucano, y mostraron mayor polidispersidad. La comparación entre alfa-1,3-glucano y negro de carbón mostró su similitud en el tamaño de partículas, pero las muestras de negro de carbón tuvieron aproximadamente 30 nm de diámetro con mayor polidispersidad. La conclusión más fuerte que pudo extraerse de la comparación de imágenes de TEM de alfa-1,3-glucano, negro de carbón y sílice es que la forma de la partícula de estos tres materiales es esférica. A pesar de estas observaciones, desde entonces se ha apreciado (anteriormente) que las partículas de alfa-1,3-glucano de agregados también pueden tener forma de tipo varilla.

Se compararon las imágenes de TEM para las partículas esféricas de alfa-1,3-glucano, negro de carbón y sílice con las partículas en plaquetas formadas por celulosa enzimáticamente polimerizada, que se produjeron como se desvela en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2017/0327857 y la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO2016106011

El grado de polimerización de las cadenas de celulosa fue bajo (~15 DPw). Se llevó a cabo un procedimiento similar (como antes) de preparación de muestras por secado de una dispersión de la celulosa. La celulosa enzimáticamente polimerizada formó plaquetas tras el secado sobre la superficie plana de mica. Las plaquetas se dispusieron planas sobre la superficie y parecieron facetadas. Las superficies planas de las plaquetas fueron grandes y asimétricas, de ~100 nm de tamaño, y con una relación de aspecto superior a 2:1. Estas partículas planas fueron inequívocamente no esféricas. Mientras que las películas del material de celulosa enzimáticamente polimerizada fueron transparentes, las películas formadas por alfa-1,3-glucano fueron opacas. Esta diferencia es debida a los agregados y aglomerados de alfa-1,3-glucano, que dispersan la luz y dan lugar a la opacidad observada. Sin embargo, la transparencia de las películas de celulosa es debida a la perfección en el apilamiento de las plaquetas que ocurrió durante la formación de la película. No cabe duda de la información que se ha proporcionado anteriormente que la forma de la partícula primaria de alfa-1,3-glucano es esférica. A pesar de estas observaciones, desde entonces se ha apreciado (anteriormente) que las partículas de alfa-1,3-glucano de agregados también pueden tener forma de tipo varilla.

La dispersión de rayos X y de neutrones por ángulo pequeño (SAXS, SANS) son técnicas analíticas que se pueden usar para medir el tamaño de partículas primarias y agregados. A diferencia de la microscopía, la dispersión promedia a lo largo de un gran volumen (~1 mm3) en comparación con los volúmenes mucho más pequeños muestreados en las mediciones de microscopía de alta resolución (~10-9 mm3). Aunque la microscopía es útil para identificar la forma de la partícula, la dispersión es útil para medir el tamaño promedio de partículas. El uso de una regularización y métodos de entropía máxima para medir el tamaño de partículas de datos de SAXS está bien documentado (Ilavsky y Jemian, 2009, J. Appl. Cryst. 42:347-353; Jemian et al., 1991, Acta Metall. Mater. 39:2477-2487; los datos de SAXS se recogieron de dispersiones al 2% en peso de alfa-1,3-glucano preparado siguiendo la metodología anterior. Se prepararon gráficos logarítmicos dobles de intensidad dispersada frente a la magnitud del vector de dispersión, 0,0015 < q(= 4nsenG/Á) < 0,4 Á-1, para radiación de rayos X incidente de longitud de onda Á dispersada por un ángulo 2G. Las muestras incluidas en este estudio se enumeran en la Tabla 6. Se observó un perfil de dispersión similar para todas estas muestras. Los datos a la q más grande corresponden a la dispersión de las características más pequeñas en el material. Se observó un intervalo de Porod bien definido con dependencia terminal de l ~ q 4 en el intervalo 0,05 < q < 0,2 Á-1. Esta dependencia es debida a la presencia de partículas con interfases afiladas. Se observó una región de Guinier (rodilla) bien definida en el intervalo 0,02 < q < 0,05 Á-1, que es debida a un tamaño de partículas primarias de aproximadamente 15 nm de diámetro, como se especifica más abajo en más detalle. En el intervalo 0,002 < q < 0,02 Á-1, se observó una dependencia de l ~ q"2 , correspondiente a la dispersión de agregados dentro de la escala de longitud de 10 a 100 nm. Se aplicó el método de máxima entropía (Ilavsky y Jemian, 2009; Jemian et al., 1991) a estos datos. Los datos en el intervalo 0,01 < q < 0,1 Á-1 se incluyeron en este análisis, que agrupa el intervalo de Guinier especificado anteriormente. Las funciones de distribución de volumen-tamaño de partículas obtenidas de este procedimiento se aproximaron a una forma logarítmica normal, que tuvo un perfil gaussiano en un gráfico logarítmico lineal de distribución del volumen frente al diámetro de partículas. La mediana de los valores para cada muestra se tabula en la Tabla 6. El promedio de todos los valores tabulados de la mediana es 12,3 nm. Esta medición de tamaño de partículas primarias es intermedia entre el valor de AFM de 30 nm y el valor de TEM de 6,5 nm (anteriormente). La anchura a media altura de estas distribuciones fue ~14 nm, lo que da una estimación de la dispersidad de ± 7 nm. La dispersidad de ± 7 nm es una sobreestimación causada por el procedimiento de la transformada de Fourier. Los valores de tamaño y dispersidad se generan a continuación usando un método alternativo.

Tabla 6. Tamaño de partículas de alfa-1,3-glucano agregado

Los datos se recogieron dentro de un amplio intervalo de magnitud del vector de dispersión, 3 x 10-5 < q < 0,4 Á-1, correspondiente a un intervalo en la escala de longitud desde 1 nm hasta 10 gm. Se usaron instrumentos de ángulo pequeño y ángulo ultra-pequeño que funcionaban con fuentes de rayos X o de neutrones para recoger estos datos (SAXS, USAXS, SANS, USANS). Estos instrumentos estaban ubicados en el sincrotón en Advanced Photon Source cerca de Chicago, IL, en el NIST Center for Neutron Scattering en Gaithersburg, MD, y en la Experimental Station en Wilmington, DE. Los datos a la q más grande corresponden a dispersión de las características más pequeñas en el material. Se observó un intervalo de Porod bien definido con dependencia terminal de l ~ q 4 en el intervalo 0,05 < q < 0,2 Á-1. Esta dependencia es debida a la presencia de partículas con interfases afiladas. Se observó una región de Guinier bien definida (rodilla) en el intervalo 0,02 < q < 0,05 Á-1, que es debida al tamaño de partículas primarias de aproximadamente 15 nm de diámetro. En el intervalo 0,002 < q < 0,02 Á-1, se observó una dependencia de l ~ q 2 , correspondiente a la dispersión de agregados dentro de la escala de longitud de 10 a 100 nm. En el intervalo 3 x 10-5 < q < 0,002 Á-1, se observó una dependencia de l ~ q"3 , correspondientes a la dispersión de aglomerados en el intervalo de tamaño de 100 nm a 10 gm. La estructura interna de los agregados y aglomerados se puede deducir de las pendientes de los gráficos logarítmicos dobles, que se identifican como las dimensiones fractales de estos objetos de dispersión. Mientras que los agregados dentro de la escala de longitud de10 a100 nm son de naturaleza arborescente, los aglomerados son llenado del espacio.

Los datos de las muestras enumeradas en la Tabla 7 se ajustaron según el método de ajuste universal de Beaucage (1995, J. Appl. 28:717-728;

El radio de giro de la partícula primaria (Rg1) fue uno de los parámetros que se ajustó. La dimensión fractal, FD2, también se determinó por este procedimiento y los resultados para este parámetro se tratan a continuación. Estos parámetros están tabulados en la Tabla 7.

Tabla 7. Dimensión fractal (FD2) de alfa-1,3-glucano agregado

El ajuste de datos se realizó varias veces y los errores citados en la Tabla 7 para los parámetros ajustados se determinaron de la desviación de la media cuadrática de los valores ajustados. Un diagrama de cajas para Rg1 muestra que los dos cuartiles centrales se encuentran entre 5,5 y 6,5 nm y, por lo tanto, muestra que Rg1 está estrechamente distribuido alrededor de 6 nm. Suponiendo que la forma de la partícula sea esférica, el diámetro del tamaño de partículas primarias, D, es 15,5 ± 1,5 nm; el error citado corresponde a ± la desviación estándar de los valores tabulados. Para una partícula

esférica, la relación entre el radio de giro y el diámetro es:

Si se supone que una única cadena de alfa-1,3-glucano tiene un grado de polimerización DPw de 800, entonces el número de cadenas por partícula primaria es ~10 ± 3, como se muestra en la Tabla 8. El número de 800 cadenas de DPw por partícula primaria puede ser de hasta ~13 para un tamaño de partículas de 15,5 nm o de tan solo 6 cadenas para un tamaño de partículas de 12,3 nm, que era el diámetro determinado anteriormente a partir del método de entropía máxima. Para un diámetro intermedio de 14,3 nm, el número calculado de 800 cadenas de DPw por glóbulo es 10. En el cálculo del número de cadenas por partícula primaria, se supuso que la partícula era un glóbulo esférico con densidad de 1,4 g/cm3, que es una estimación (~85%) de la densidad del alfa-1,3-glucano amorfo basado en una densidad cristalina de 1,6 g/cm3. A pesar de estos cálculos, desde entonces se ha apreciado (anteriormente) que las partículas de alfa-1,3-glucano de agregados también pueden ser forma de tipo varilla.

Tabla 8. Número de cadenas de polímeros en partículas primarias de alfa-1,3-glucano con diferentes diámetros (D)

Se tabularon los valores de FD2, la dimensión fractal de agregados dentro de la escala de longitud de 10 a 100 nm, en la Tabla 7. Se construyó un gráfico de frecuencia del parámetro FD2. La dimensión fractal del agregado está aproximadamente uniformemente distribuida por encima de 2, pero no se registraron valores por debajo de 2. Se muestran estructuras arborescentes típicas de simulaciones informáticas de agregados, como formadas por difusión de partículas primarias esféricas, en la FIG. 1. Las estructuras se diferencian ligeramente dependiendo de si el proceso de agregación está limitado por la difusión o por el proceso de agregación. Sus dimensiones fractales típicas son respectivamente 1,71 y 2,3, pero variaciones dentro de estos valores ocurren dependiendo de las suposiciones de la simulación. Las estructuras arborescentes y las dimensiones fractales de estos resultados de simulación son típicos de lo que se observa en la agregación de coloides, tal como con sílice pirogénica o negro de carbón. Por lo tanto, por razonamiento análogo basado en los resultados de la agregación de coloides, es posible deducir que no se observaron valores por debajo de 2 (en la Tabla 7) debido a que el valor limitante de ~2 viene impuesto por la estructura del agregado de glucano. La distribución de tamaños de los agregados es muy probablemente altamente polidispersa. Los valores ajustados de la dimensión fractal que fueron superiores a 2 podrían haber surgido de aglomerados de pequeños agregados dentro de la escala de longitud de 10 a 100 nm, sesgando los ajustes hacia mayores valores de FD2.

Se aplicó un elevado cizallamiento (velocidad de cizallamiento del microfluidizador ~107 s-1) a una muestra de alfa-1,3-glucano disperso que caracterizaba una gran intensidad dentro de la región de aglomerados. Antes del cizallamiento, se observó una dependencia de l ~ q 2 en el intervalo 5 x 10-3 < q < 0,02 Á-1, y se observó una dependencia de l ~ q4 en el intervalo 3 x 10-4 < q < 5 x 10-3 Á-1. Después del cizallamiento, se observó una dependencia de l ~ q 2 en todo el intervalo de 3 x 10-4 < q < 0,02 Á-1, y desapareció la dependencia de l ~ q4. El cizallamiento tuvo el efecto de reducir la intensidad de aglomerados, mientras que el intervalo de dispersión que surgió de los agregados, con una dependencia de l ~ q 2, se expandió para reducir q durante al menos una década. Estos resultados mostraron que los aglomerados eran comparativamente lábiles con respecto a los agregados. El cizallamiento tuvo el efecto de dispersar los aglomerados, mientras que los agregados persistieron después de que se aplicara el cizallamiento.

Los resultados de dispersión de la luz de un Mastersizer® 2000 (Malvern) también soportan el modelo jerárquico de la estructura de alfa-1,3-glucano, como se muestra en la Tabla 9. El tamaño de partículas del aglomerado de una muestra de glucano sin sonicar (~20 gm) se redujo aproximadamente un orden de magnitud (hasta ~3 gm) en la sonicación durante 3 minutos (9 kJ/kg) en 15 ml de agua desionizada.

Tabla 9. Análisis de dispersión de la luz de alfa-1,3-glucanoa antes y después de la sonicación

La sonicación tuvo en general el efecto de disminuir la floculación y el tamaño del aglomerado como se mide por dispersión de la luz. Una dispersión de alfa-1,3-glucano preparada y sonicada como antes (3 minutos a 9 kJ/kg) produjo aglomerados de aproximadamente 4,3 gm de mediana del diámetro (D50); antes de la sonicación, el D50 era 21,1 gm. El tamaño del aglomerado en función de la potencia de sonicación mostró que una energía específica mínima de aproximadamente 10 kJ/kg podría ser necesaria para romper aglomerados de alfa-1,3-glucano muy grandes, que se registró que tenían un D50 de aproximadamente 25 pm antes de la sonicación. A medida que aumentó la energía de sonicación específica, empezando en aproximadamente 10 kJ/kg, el D50 medido del aglomerado disminuyó y se estabilizó a aproximadamente 5 pm a ajustes de potencia superiores a 1 MJ/kg. Una mayor r frecuencia de sonicación tuvo un mayor efecto sobre el tamaño medido del aglomerado. En general, estos resultados muestran que los aglomerados de alfa-1,3-glucano son altamente polidispersos y lábiles, y su tamaño se puede afectar por cizallamiento y sonicación.

Se analizó la estructura interna de las dispersiones de alfa-1,3-glucano por diversos detectores que estuvieron o acoplados a un sistema de cromatografía de líquidos (en línea) o se usaron sin una columna (fuera de línea), como se especifica en la Tabla 10.

Tabla 10. Especificaciones de los sistemas de detección

El sistema de cromatografía se equipó con una columna monolítica basada en sílice para la separación de tamaño hasta 1 micrómetro en el modo de cromatografía hidrodinámica. Dicha columna monolítica comprende una estructura porosa bimodal que logra, en una columna, tanto elevada permeabilidad (2-3 pm de diámetro) como elevada área superficial (diámetro hasta 50 nm).

Las dispersiones de 0,1 mg/ml de alfa-1,3-glucano se sonicaron (9 kJ/kg) durante 40 minutos. Se midieron las distribuciones de tamaño de los agregados (PSD) fuera de línea por DLS 0, 360 y 1440 minutos después de la sonicación. Las PSD medidas fueron estrechas (dispersidad de ~±15%) y se distribuyeron respectivamente alrededor de los valores del tamaño medio de partículas (en Rh) de 111, 180 y 271 nm. La filtración de dicha dispersión a través de una membrana de 1,2 pm Acrodick™ sobre una placa de aluminio alquitranado mostró una pérdida de solo el 10% de material.

La dispersión del polisacárido con Rh = 180 nm (por DLS) se inyectó en el sistema de detección cromatográfica triple equipado con una columna monolítica y tres detectores en línea enumerados en la Tabla 10. Para la comparación, también se prepararon dos dispersiones de esferas de poliestireno que se diferenciaron en el diámetro de partículas (300 nm y 400 nm) a una concentración de 0,1 mg/m y se inyectaron en el mismo sistema cromatográfico. Para una esfera sólida

con diámetro D, y

Por lo tanto, las esferas de 400 nm y 300 nm de diámetro tienen Rh = 194 nm y 145 nm, respectivamente. Se observó que las partículas de poliestireno más pequeñas (300 nm) eluyeron después de la columna, seguidas por la dispersión de glucano y partículas más grandes (400 nm), confirmando la separación por tamaño en el modo de cromatografía hidrodinámica.

La estructura interna (dimensión fractal) de la dispersión de alfa-1,3-glucano sonicada (40 minutos) se caracterizó por el

parámetro estructural que varía inversamente a la dimensión fractal. Como se muestra en la Tabla 11, p aumenta para estructuras más abiertas, que tienen una menor dimensión fractal. Además, la dependencia angular de la intensidad dispersada de luz estática también se puede usar para caracterizar la conformación de objetos dispersados.

Tabla 11. Parámetro estructural p

Como un ejemplo del análisis conformacional por el parámetro estructural p y la dependencia angular de la intensidad dispersada, se compararon dos objetos de dispersión muy diferente.

Se preparó una dispersión de esferas de 60 nm de diámetro de poliestireno (PS) a 0,1 mg/ml. Esta dispersión de esferas duras se comparó con una dispersión de cadenas de 400 kDa de pululano a 0,1 mg/ml. Estas dispersiones, que comprendían objetos de dimensión fractal muy diferente, se separaron por la técnica de columna monolítica (antes). Se

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prepararon gráficos de intensidad dispersada dividida entre concentración frente aa partir de los datos de MALS recogidos en el vértice del perfil de elución, para luz dispersada por un ángulo G. En el caso de la esfera sólida, el vértice apareció a los 18,6 minutos de tiempo de elución, y para las cadenas de pululano el vértice fue a 19,4 minutos. Los perfiles de dispersión se ajustaron en consecuencia (software ASTRA™ , Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA) muy bien por modelos de una esfera sólida, para el caso de la esfera de PS, y una bobina aleatoria, para el caso del pululano, como era de esperar. El coeficiente de determinación fue superior a R2 = 0,99 para ambos ajustes. Las mediciones de Rg (Rh) de MALS (DLS) para las esferas de poliestireno fueron 26,4 (34) nm, dando p = 0,78, que concuerda con el valor esperado de 0,8 de la Tabla 9. Para el pululano Rg (Rh) los valores de 24 (14) nm, dan un valor de p = 1,7, que describe una estructura abierta y están de acuerdo con el valor correspondiente a una bobina aleatoria de la Tabla 11.

Se probó la separación monolítica de dispersiones de alfa-1,3-glucano sonicadas por el mismo método que las dispersiones de esferas de PS y pululano (antes). Se analizó una dispersión de alfa-1,3-glucano preparada a 0,1 mg/ml seis horas después de sonicarse (9 kJ/kg) durante 40 minutos. Las mediciones dieron valores medios de Rg (Rh) de MALS (DLS) de 356 (201,3) nm y p = 1,77. La PSD fue muy estrecha, y el perfil de dispersión se ajustó muy bien a la forma funcional para una bobina aleatoria (R2 = 0,99) y no se ajustó en absoluto con la forma funcional para una esfera sólida. Estos resultados muestran que la estructura de los agregados de alfa-1,3-glucano en el presente documento es muy abierta con una baja dimensión fractal.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende agregados de alfa-glucano insoluble, en donde los agregados tienen un radio hidrodinámico promedio de aproximadamente 50-300 nm y una dimensión fractal de aproximadamente 1,6-2,4, y el alfaglucano insoluble comprende enlaces alfa-1,3-glicosídicos.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde los agregados son arborescentes.

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde los agregados tienen un radio hidrodinámico promedio de aproximadamente 50-150 nm.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde los agregados tienen un radio hidrodinámico promedio de aproximadamente 60-120 nm.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde los agregados tienen una dimensión fractal de aproximadamente 1,9-2,1.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde los agregados comprenden partículas del alfaglucano insoluble con un tamaño promedio de aproximadamente 5-25 nm.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde las moléculas individuales del alfa-glucano insoluble tienen cada una un grado de polimerización promedio en peso (DPw) de al menos aproximadamente 600.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende aglomerados de dichos agregados, en donde los aglomerados tienen un tamaño promedio de aproximadamente 1-200 micrómetros.

9. La composición de la reivindicación 8, en donde los aglomerados tienen un tamaño promedio de aproximadamente 1 -110 micrómetros.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en donde el alfa-glucano insoluble tiene al menos 50% de enlaces alfa-1,3-glicosídicos.

11. La composición de la reivindicación 10, en donde el alfa-glucano insoluble tiene al menos 90% de enlaces alfa-1,3-glicosídicos.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la composición está en forma de un producto de uso doméstico o producto industrial.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la composición está en forma de un producto de cuidado personal.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la composición está en forma de un producto alimenticio.

15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la composición está forma de un producto farmacéutico.