ES2920850T3 - Procedimientos y composiciones para el tratamiento de enfermedades oculares genéticas - Google Patents

Abstract

La presente divulgación proporciona péptidos y vectores dirigidos que contienen una secuencia que codifica péptidos dirigidos que entregan agentes, al ojo. Los inventores actuales han descubierto péptidos que funcionan a los agentes dirigidos, como los vectores virales, a las células oculares. La presente divulgación describe un método para utilizar estos nuevos péptidos para dirigir, por ejemplo, cápsidas virales al tipo de interés celular. En este caso, las células oculares (como las células retinianas) son atacadas por los péptidos identificados. Los vectores que albergan proteínas de la cápside modificadas para incluir dichos péptidos pueden usarse para proporcionar agentes terapéuticos al ojo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y composiciones para el tratamiento de enfermedades oculares genéticas

INTRODUCCIÓN

Actualmente se reconoce ampliamente la transferencia de genes como una poderosa herramienta para el análisis de eventos biológicos y procesos de enfermedades, tanto a nivel celular como molecular. Recientemente, la aplicación de la terapia génica para el tratamiento de enfermedades humanas, ya sea hereditarias (por ejemplo, deficiencia de adenosina desaminasa (ADA, adenosine desaminase deficiency)) o adquiridas (por ejemplo, cáncer o enfermedades infecciosas), ha recibido una atención considerable. Con el advenimiento de técnicas mejoradas de transferencia de genes y la identificación de una biblioteca en constante expansión de enfermedades relacionadas con genes defectuosos, la terapia génica ha evolucionado rápidamente desde una teoría de tratamiento hasta una realidad práctica.

Tradicionalmente, la terapia génica se ha definido como un procedimiento en el que se introduce un gen exógeno en las células de un paciente para corregir un error genético congénito. Aunque actualmente más de 4.500 enfermedades humanas se clasifican como genéticas, se han identificado mutaciones específicas en el genoma humano para relativamente pocas de estas enfermedades. Hasta hace poco, estas enfermedades genéticas raras representaban los objetivos exclusivos de los esfuerzos de la terapia génica. Por consiguiente, la mayoría de los protocolos de terapia génica aprobados por los NIH hasta la fecha se han dirigido a la introducción de una copia funcional de un gen defectuoso en las células somáticas de un individuo que tiene un error genético congénito conocido. Solo recientemente, los investigadores y los médicos han comenzado a apreciar que la mayoría de los cánceres humanos, ciertas formas de enfermedades cardiovasculares y muchas enfermedades degenerativas también tienen componentes genéticos importantes y, a los efectos de diseñar terapias génicas novedosas, deberían considerarse “trastornos genéticos”. Por lo tanto, la terapia génica se ha definido más recientemente como la corrección del fenotipo de una enfermedad mediante la introducción de nueva información genética en el organismo afectado.

En la terapia génica in vivo, un gen transferido se introduce en las células del organismo receptor in situ, es decir, dentro del receptor. La terapia génica in vivo se ha examinado en varios modelos animales. Varias publicaciones recientes han informado sobre la viabilidad de la transferencia directa de genes in situ a órganos y tejidos, tales como músculos, células madre hematopoyéticas, la pared arterial, el sistema nervioso y los pulmones. También se ha informado que la inyección directa de ADN en el músculo esquelético, el músculo cardíaco y la inyección de complejos de ADN-lípidos en la vasculatura producen un nivel de expresión detectable del producto o los productos génicos insertados in vivo.

El tratamiento de enfermedades genéticas del ojo, por ejemplo, enfermedades genéticas hereditarias del ojo, tales como enfermedades que causan ceguera, sigue siendo un problema. Entre los ejemplos de las mismas se encuentran la retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT, spinocerebellar ataxia type), daltonismo y enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII. Por tanto, es necesario desarrollar terapias para las enfermedades genéticas del ojo.

Work et al. “Development of Efficient Viral Vectors Selective for Vascular Smooth Muscle Cells”, Molecular Therapy, vol. 9, No. 2, 2004, páginas 198-208, describen la incorporación del péptido GETRAPL en una proteína de la cápside de AAV-2.

Dalkara et al. “In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous”, Science Translational Medicine, vol. 5, número 189, 2013, página 189ra76, describen la incorporación del péptido LALGETTRP en la proteína de la cápside de AAV, la dirección a células oculares con el correspondiente vector de AAV que administra un gen terapéutico y el rescate de fenotipos de enfermedad de retinosquisis ligada a X y amaurosis congénita de Leber en modelos de ratón correspondientes tras las inyección intravítrea del vector de AAV.

La Patente WO 2014/124282 A1 describe la terapia génica mediada por AAV para trastornos de la retina que implica la dirección a varios tipos de células oculares con vectores de AAV que tienen una proteína de la cápside mutada.

CARACTERÍSTICAS

La presente invención se refiere a una proteína de la cápside del virus adenoasociado (AAV) modificada que comprende un péptido director a células oculares, en la que el péptido director tiene una longitud de hasta 10 aminoácidos, en la que el péptido director dirige un AAV a una célula ocular, y en la que el péptido director comprende la secuencia de aminoácidos GSTPPPM (SEQ ID NO: 1) en una orientación de amino a carboxilo o en una orientación de carboxilo a amino.

La presente invención se refiere, además, a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside modificada de la presente invención.

La presente invención se refiere, además, a un vector de AAV que comprende la proteína de la cápside de la presente invención.

La presente invención se refiere, además, a una composición que comprende el vector de AAV de la presente invención y un vehículo.

La presente invención se refiere, además, a una célula in vitro que comprende el vector de AAV de la presente invención.

La presente invención se refiere, además, a un vector de AAV de la presente invención para su utilización en el tratamiento de una enfermedad ocular en un mamífero.

La presente invención se refiere, además, a una composición que comprende el vector de AAV de la presente invención y un vehículo para su utilización en el tratamiento de la retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como la mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII.

La presente invención se refiere, además, a una composición farmacéutica que comprende el vector de AAV de la presente invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente para su utilización en el tratamiento de la retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como la mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII.

Los inventores de la presente invención han descubierto péptidos que funcionan para dirigir agentes, tales como vectores virales, a las células oculares. La presente invención describe un procedimiento para utilizar estos péptidos novedosos para dirigir, por ejemplo, las cápsides virales al tipo celular de interés. En este caso, células oculares (tales como células de la retina) son la diana de los péptidos identificados. Los vectores que albergan proteínas de la cápside modificadas para incluir tales péptidos pueden utilizarse para administrar agentes terapéuticos al ojo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “se dirige” significa que la proteína de la cápside de un virus, tal como un virus adenoasociado (AAV), se une de forma preferente a un tipo de tejido (por ejemplo, células de la retina) con respecto a otro tipo de tejido (por ejemplo, tejido cerebral). La proteína de la cápside modificada genéticamente puede “dirigirse” a las células oculares uniéndose a un nivel del 10 % al 1.000 % más alto que una proteína de la cápside no modificada comparable. Por ejemplo, un AAV que tiene una proteína de la cápside modificada genéticamente puede unirse a las células oculares a un nivel del 50 % al 100 % más alto que un virus AAV no modificado.

Los productos y procedimientos descritos en las siguientes características de la presente invención no están dentro del alcance de la invención reivindicada.

La presente invención da a conocer una proteína de la cápside del virus adenoasociado (AAV) modificada que contiene un péptido director, en la que el péptido director tiene una longitud de 3 a 10 aminoácidos (es decir, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) y en la que el péptido director dirige un AAV a una célula ocular. En algunas realizaciones, el péptido director tiene una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos.

La presente invención da a conocer un virus AAV que contiene la proteína de la cápside modificada genéticamente para codificar los péptidos descritos anteriormente.

La presente invención da a conocer un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad ocular) en un mamífero administrando el vector viral descrito anteriormente o la célula descrita anteriormente al mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano. En algunas realizaciones, la enfermedad es retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, SCAT, daltonismo y enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como MPS IV y MPS VII.

En algunas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad o trastorno de almacenamiento lisosómico. En algunas realizaciones, la enfermedad es una deficiencia o defecto en la expresión o actividad de TPP1 (tripeptidil peptidasa I), CLN3 (Battenina), PPT1 (palmitoil proteína tioesterasa I), CLN6 (proteína 6 de lipofuscinosis ceroide neuronal) o CLN8. En algunas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad neurodegenerativa, tal como lipofuscinosis ceroide neuronal (NCL), tal como NCL infantil, NCL infantil tardía, NCL juvenil (enfermedad de Batten) y NCL adulta.

La presente invención da a conocer un procedimiento para administrar un agente al ojo de un individuo, mediante la transducción de células oculares con un vector viral descrito anteriormente, de modo que las células oculares transducidas expresan el agente terapéutico y lo administran al ojo del individuo. En algunas realizaciones, el agente es miARN de ataxina 7 (por ejemplo, para el tratamiento de SCA7). En algunas realizaciones, el agente es proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE 65) (por ejemplo, para el tratamiento de la amaurosis congénita de Leber). En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o el receptor 1 de VEGF soluble (sFif1) (por ejemplo, para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad). En algunas realizaciones, el agente es REP1 (por ejemplo, para el tratamiento de la coroideremia). En algunas realizaciones, el agente es L-opsina (por ejemplo, para el tratamiento del daltonismo). La tabla 1 muestra enfermedades de ejemplo, genes diana y proteínas codificadas correspondientes.

Tabla 1

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Secuencia de AAV modificado con péptido (PMAAV)-GST. AAV2/2 (ITR de AAV2/cápside de AAV2) secuencia de la cápside (en cursiva) y péptido diana de la retina glutatión S-transferasa (GST) (negrita y subrayado).

Figura 2. Las imágenes fluorescentes en animales vivos mostraron eficiencias de infección relativas. Se observaron regiones moteadas de positividad en proteína fluorescente verde (GFP, green fluorescent protein) en ojos con inyección de AAV2/2, mientras que había señales de GFP amplias y uniformes en ojos de PMAAV-GST.

Figura 3. PMAAV-GST.CMV.eGFP se dirigió al epitelio pigmentario de la retina (RPE, retinalpigment epithelium) y las capas de la capa nuclear externa (ONL, outer nuclear layer), y algunas células en la capa de células ganglionares (GCL, ganglion cell layer). AAV2/2 se dirigió principalmente a la OPL. CMV: citomegalovirus; eGFP: GFP aumentada.

Figura 4. Inyección subretiniana.

Figura 5. Inyección subretiniana de AAV2 no modificado.

Figura 6. Inyección subretiniana de AAV2 no modificado.

Figura 7. Imágenes de 20x de inyección subretiniana de AAV2 modificado con PM:

Figura 8. Inyección intravítrea.

Figura 9. Inyección intravítrea de AAV2.

Figura 10. Inyección intravítrea de AAV2.

Figura 11. Inyección intravítrea de AAV2 PM GST.

Figura 12. Inyección intravítrea de AAV2 PM GST.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a una proteína de la cápside de virus adenoasociado (AAV) modificada que comprende un péptido director a células oculares, en la que el péptido director tiene una longitud de hasta 10 aminoácidos, en la que el péptido director dirige un AAV a una célula ocular, y en la que el péptido director comprende una secuencia de aminoácidos GSTPPPM (SEQ ID NO: 1) en una orientación de amino a carboxilo o en una orientación de carboxilo a amino.

La presente invención se refiere, además, a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside modificada de la presente invención.

La presente invención se refiere, además, a un vector de AAV que comprende la proteína de la cápside de la presente invención.

La presente invención se refiere, además, a una composición que comprende el vector de AAV de la presente invención y un vehículo.

La presente invención se refiere, además, a una célula in vitro que comprende el vector de AAV de la presente invención.

La presente invención se refiere, además, a un vector de AAV de la presente invención para su utilización en el tratamiento de una enfermedad ocular en un mamífero.

La presente invención se refiere, además, a una composición que comprende el vector de AAV de la presente invención y un vehículo para su utilización en el tratamiento de la retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como la mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII.

La presente invención se refiere, además, a una composición farmacéutica que comprende el vector de AAV de la presente invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente para su utilización en el tratamiento de la retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como la mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un vector viral que comprende una cápside modificada, en el que la cápside modificada comprende, como mínimo, una secuencia de aminoácidos que dirige el vector viral a células oculares. Según la invención reivindicada, el vector viral es un vector de AAV y la secuencia de aminoácidos tiene una longitud de hasta 10 aminoácidos y comprende la secuencia de aminoácidos GSTPPPM (SEQ ID NO: 1), en una orientación de amino a carboxilo o en una orientación de carboxilo a amino. En algunas realizaciones, la célula ocular es una célula de la retina.

El vector viral es un vector viral adenoasociado (AAV). En algunas realizaciones, el AAV es AAV2, aunque el tropismo se modifica, por lo que cabría deducir que dichas modificaciones cambiarían el tropismo de cualquier AAV. El péptido director comprende una secuencia con una longitud de hasta 10 aminoácidos que tiene en la misma (o consiste en) GSTPPPM (SEQ ID NO: 1), tal como se expresa en una orientación de amino a carboxilo o en una orientación de carboxilo a amino. Debería indicarse que la orientación de la secuencia no es importante. Por ejemplo, el péptido puede estar orientado desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal del péptido para ser GSTPPPM (SEQ ID NO: 1) o puede estarlo desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxilo-terminal del péptido para ser MPP^pT^sG (SEQ ID NO: 5).

En algunas realizaciones, el péptido director se inserta entre los residuos de la cápside de AAV2 en las posiciones P34-A35, T138-A139, A139-P140, G453-T454, N587-R588 y/o R588-Q589. En la SEQ ID NO: 10 se proporciona una secuencia de proteína de la cápside de AAV2 de referencia de tipo salvaje de ejemplo.

En algunas realizaciones, el péptido director se inserta después de los residuos de la cápside de AAV9 en las posiciones D384, G385, 1560, T561, N562, E563, E564, E565, N704 y/o Y705. En la SEQ ID NO: 11 se proporciona una secuencia de proteína de la cápside de AAV9 de referencia de tipo salvaje de ejemplo.

En algunas realizaciones, la proteína de la cápside consiste en la SEQ ID NO: 9.

La presente invención da a conocer un vector de AAV que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside, tal como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, el vector de a Av contiene, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de interés. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de interés es un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es una enzima o una molécula de ARNi (por ejemplo, molécula de ARNip, ARNhc o miARN). En algunas realizaciones, el agente terapéutico es miARN de ataxina 7, RPE65, inhibidor de VEGF o receptor 1 de VEGF soluble (sFifl), REP1, L-opsina, Rho, PDE6p, ABCA4, LRAT, RDS/periferina, MERTK, IMPDH1, GUCY2D, RDS/periferina, AIPL1, ABCA4, RPGRIP1, IMPDH1, AIPL1, GUCY2D, LRAT, MERTK, RPGRIP1, RPE65, ABCA4, GNAT2, CNGB3, RsI, OA1, tirosinasa (OCAI), P21 WAF-1/Cipl, PDGF, endostatina, angiostatina, arilsulfatasa B o p-glucuronidasa.

Algunas realizaciones de la presente invención que no están dentro del alcance de la invención reivindicada dan a conocer una secuencia de ácido nucleico que codifica un vector viral, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer una secuencia de ácido nucleico que codifica una cápside modificada, tal como se describe en el presente documento. Según la invención reivindicada, la secuencia de ácido nucleico codifica la proteína de la cápside modificada, según la invención reivindicada. Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 2 (GGGTCGACGCCGCCTCCTATG) o consiste en la misma. Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer una cápside modificada codificada por una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer una célula que comprende un vector viral, tal como se describe en el presente documento. Según la invención reivindicada, la célula es una célula in vitro y el vector viral es un vector de AAV, según la invención reivindicada.

Algunas realizaciones de la presente invención que no están dentro del alcance de la invención reivindicada dan a conocer una célula transducida por un vector viral, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la célula es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana. En algunas realizaciones, la célula es una célula no humana. Según la invención reivindicada, la célula es in vitro. En algunas realizaciones que no están dentro del alcance de la invención reivindicada, la célula es in vivo. En algunas realizaciones, la célula es una célula ocular, tal como una célula de la retina.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero que comprende administrar un vector viral o la célula, tal como se describe en el presente documento, al mamífero. El procedimiento de tratamiento de una enfermedad en un mamífero no es parte de la invención reivindicada. En algunas realizaciones, el péptido director se dirige a una célula ocular enferma. En algunas realizaciones, el péptido director se dirige a una célula ocular en un individuo que tiene retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, SCAT, daltonismo y enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como MPS IV y MPS VII.

En algunas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad o un trastorno de almacenamiento lisosómico. En algunas realizaciones, la enfermedad es una deficiencia o defecto en la expresión o actividad de TPP1 (tripeptidil peptidasa I), CLN3 (Battenina), PPT1 (palmitoil proteína tioesterasa I), CLN6 (proteína 6 de lipofuscinosis ceroide neuronal) o CLN8. Las enfermedades incluyen enfermedades neurodegenerativas, tales como lipofuscinosis ceroide neuronal (NCL), tales como NCL infantil, ⁿC^l infantil tardía, NCL juvenil (enfermedad de Batten) y NCL adulta. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para administrar un agente al ojo de un individuo, que comprende transducir células oculares con un vector viral descrito en el presente documento para que las células oculares transducidas expresen el agente terapéutico y lo administren al ojo del individuo. El procedimiento para la administración de un agente al ojo de un individuo no es parte de la invención reivindicada. En algunas realizaciones, el vector viral transduce células oculares.

En algunas realizaciones, las células oculares transducidas están dentro de la capa plexiforme externa (OPL, outer plexiform layer) de la retina o comprenden la misma.

Algunas realizaciones de la presente invención que no están dentro del alcance de la invención reivindicada dan a conocer un vector viral o una célula, tal como se describe en el presente documento, para su utilización en tratamiento médico o diagnóstico.

Algunas realizaciones de la presente invención que no están dentro del alcance de la invención reivindicada dan a conocer una utilización de un vector viral o una célula, tal como se describe en el presente documento, para preparar un medicamento útil para el tratamiento de una enfermedad ocular, por ejemplo, una enfermedad ocular genética, en un mamífero.

Algunas realizaciones de la presente invención que no están dentro del alcance de la invención reivindicada dan a conocer un procedimiento para identificar péptidos que se dirigen al tejido ocular que comprende la utilización de selección de fagos por afinidad (“biopanning”) para identificar dichos péptidos.

El vector puede comprender, además, una enzima, una proteína secretada, una proteína nuclear o una proteína citoplasmática. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “proteína secretada” incluye cualquier proteína secretada, ya sea secretada de forma natural o modificada para contener una secuencia señal para que pueda secretarse. Por ejemplo, la proteína secretada podría ser beta-glucuronidasa.

El ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. En general, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue por ligadura en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional. Además, múltiples copias de las enzimas que codifican el ácido nucleico pueden unirse en el vector de expresión. Dichos ácidos nucleicos múltiples pueden separarse mediante enlazadores.

El vector de la presente invención puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV), un vector de adenovirus, un vector de retrovirus o de lentivirus basado en el virus de la inmunodeficiencia humana o el virus de la inmunodeficiencia felina. Se encuentran ejemplos de dichos AAV en Davidson et al., PNAS (2000) 97:3428-3432. Los AAV y los lentivirus pueden conferir una expresión duradera mientras que los adenovirus pueden proporcionar una expresión transitoria. Según la invención reivindicada, el vector es un vector de AAV.

La presente invención también da a conocer una célula de mamífero que contiene un vector descrito en el presente documento. La célula puede ser humana y puede ser de un ojo. El tipo de célula puede ser una población de células madre o progenitoras.

La presente invención da a conocer un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad, tal como una enfermedad ocular genética o cáncer en un mamífero mediante la administración de un polinucleótido, polipéptido, vector de expresión o célula descritos en el presente documento. El procedimiento para el tratamiento de una enfermedad no está dentro del alcance de la invención reivindicada. La enfermedad ocular genética o el cáncer pueden ser retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, SCAT, daltonismo y enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como MPS IV y MPS VII.

La enfermedad genética puede ser una enfermedad o un trastorno de almacenamiento lisosómico. En algunas realizaciones, la enfermedad es una deficiencia o defecto en la expresión o actividad de TPP1 (tripeptidil peptidasa I), CLN3 (Battenina), PPT1 (palmitoil proteína tioesterasa I), CLN6 (proteína 6 de lipofuscinosis ceroide neuronal) o CLN8. La enfermedad genética puede ser una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, una lipofuscinosis ceroide neuronal (NCL), tal como NCL infantil, NCL infantil tardía, NCL juvenil (enfermedad de Batten) y NCL adulta. Ciertos aspectos de la presente invención se relacionan con polinucleótidos, polipéptidos, vectores y células modificadas genéticamente (modificadas in vivo) y la utilización de los mismos. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la terapia génica o proteica que es capaz de administrar localmente una dosis eficaz terapéuticamente del agente terapéutico. El procedimiento para la terapia génica o proteica no está dentro del alcance de la invención reivindicada.

Según un aspecto que no está dentro del alcance de la invención reivindicada, se da a conocer un sistema de expresión celular para expresar un agente terapéutico en un receptor mamífero. El sistema de expresión (al que también se hace referencia en el presente documento como “célula modificada genéticamente”) comprende una célula y un vector de expresión para expresar el agente terapéutico. Los vectores de expresión incluyen, aunque sin limitación a los mismos, virus, plásmidos y otros vehículos para administrar material genético heterólogo a las células. Por consiguiente, el término “vector de expresión”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un vehículo para administrar material genético heterólogo a una célula. En particular, el vector de expresión es un vector de adenovirus, virus adenoasociado o lentivirus o retrovirus recombinante.

El vector de expresión incluye, además, un promotor para controlar la transcripción del gen heterólogo. El promotor puede ser un promotor inducible (descrito a continuación). El sistema de expresión es adecuado para la administración al receptor mamífero. El sistema de expresión puede comprender una pluralidad de células modificadas genéticamente no inmortalizadas, conteniendo cada célula, como mínimo, un gen recombinante que codifica, como mínimo, un agente terapéutico.

El sistema de expresión celular se puede formar in vivo. Todavía según otro aspecto, se da a conocer un procedimiento para el tratamiento de un receptor mamífero in vivo. El procedimiento para el tratamiento de un receptor mamífero no está dentro del alcance de la invención reivindicada. El procedimiento incluye la introducción de un vector de expresión para expresar un producto génico heterólogo en una célula del paciente in situ, tal como mediante administración intraocular. Para formar el sistema de expresión in vivo, se introduce in vivo en el receptor mamífero un vector de expresión para expresar el agente terapéutico.

Todavía según otro aspecto, se da a conocer un procedimiento para el tratamiento de un receptor mamífero in vivo. El procedimiento para el tratamiento de un receptor mamífero no está dentro del alcance de la invención reivindicada. El procedimiento incluye la introducción de la proteína dirigida en el paciente in vivo.

El vector de expresión para expresar el gen heterólogo puede incluir un promotor inducible para controlar la transcripción del producto del gen heterólogo. Por consiguiente, la administración del agente terapéutico in situ se controla exponiendo la célula in situ a condiciones que inducen la transcripción del gen heterólogo.

El receptor mamífero puede tener una afección que sea susceptible de terapia de reemplazo de genes. Tal como se utiliza en el presente documento, “terapia de reemplazo de genes” se refiere a la administración al receptor de material genético exógeno que codifica un agente terapéutico y la posterior expresión in situ del material genético administrado. Por tanto, la frase “afección susceptible de terapia de reemplazo de genes” abarca afecciones, tales como enfermedades genéticas (es decir, una afección de enfermedad que es atribuible a uno o más defectos genéticos), patologías adquiridas (es decir, una afección patológica que no es atribuible a un defecto congénito), cánceres y procesos profilácticos (es decir, prevención de una enfermedad o de una afección médica no deseada). Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, el término “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente o material que tenga un efecto beneficioso sobre el receptor mamífero. Por tanto, “agente terapéutico” abarca moléculas tanto terapéuticas como profilácticas que tienen componentes de ácido nucleico o proteína.

Según una realización, el receptor mamífero tiene una enfermedad genética y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéutico para el tratamiento de la enfermedad. Todavía en otra realización, el mamífero receptor tiene una patología adquirida y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéutico para el tratamiento de la patología. Según otra realización, el paciente tiene un cáncer y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente antineoplásico. Todavía en otra realización, el paciente tiene una afección médica no deseada y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéutico para el tratamiento de la afección.

Todavía según otra realización que no está dentro del alcance de la invención reivindicada, se da a conocer una composición farmacéutica. La composición farmacéutica comprende una pluralidad de las células o polipéptidos modificados genéticamente descritos anteriormente y un vehículo aceptable farmacéuticamente. La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de una afección susceptible de terapia de reemplazo de genes y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéutico para el tratamiento de la afección. La composición farmacéutica puede contener una cantidad de células o polipéptidos modificados genéticamente suficientes para administrar al paciente una dosis eficaz terapéuticamente del agente terapéutico. A continuación, se describen afecciones de ejemplo susceptibles de terapia de reemplazo de genes.

Según otro aspecto que no está dentro del alcance de la invención reivindicada, se da a conocer un procedimiento para formar la composición farmacéutica descrita anteriormente. El procedimiento incluye introducir un vector de expresión para expresar un producto génico heterólogo en una célula para formar una célula modificada genéticamente y colocar la célula modificada genéticamente en un vehículo aceptable farmacéuticamente.

Estos y otros aspectos, así como diversas ventajas y utilidades, serán más evidentes con referencia a la descripción detallada y a las figuras adjuntas.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “enzima”, una “proteína secretada”, una “proteína nuclear” o una “proteína citoplasmática” incluyen variantes o fragmentos activos o inactivos biológicamente de estos polipéptidos. Una “variante” de uno de los polipéptidos es un polipéptido que no es completamente idéntico a una proteína nativa. Dicha proteína variante se puede obtener alterando la secuencia de aminoácidos mediante inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína se modifica, por ejemplo, por sustitución, para crear un polipéptido que tiene sustancialmente las mismas o mejores cualidades en comparación con el polipéptido nativo. La sustitución puede ser una sustitución conservada. Una “sustitución conservada” es una sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Una sustitución conservada sería una sustitución con un aminoácido que hace el cambio más pequeño posible en la carga del aminoácido o el tamaño de la cadena lateral del aminoácido (de manera alternativa, en el tamaño, la carga o el tipo de grupo químico dentro de la cadena lateral) de modo que el péptido global retiene su conformación espacial, pero tiene una actividad biológica alterada. Por ejemplo, los cambios comunes conservados podrían ser Asp a Glu, Asn o Gln; His a Lys, Arg o Phe; Asn a Gln, Asp o Glu y Ser a Cys, Thr o Gly. ”Aline” se utiliza habitualmente para sustituir a otros aminoácidos. Los 20 aminoácidos esenciales se pueden agrupar de la siguiente manera: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina que tienen cadenas laterales no polares; glicina, serina, treonina, cistina, tirosina, asparagina y glutamina que tienen cadenas laterales polares sin carga; aspartato y glutamato que tienen cadenas laterales ácidas; y lisina, arginina e histidina que tienen cadenas laterales básicas.

Los cambios de aminoácidos se consiguen cambiando los codones de la secuencia de ácido nucleico correspondiente. Se sabe que dichos polipéptidos pueden obtenerse en base a la sustitución de ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en la estructura del polipéptido para modificar o mejorar la actividad biológica. Por ejemplo, mediante la sustitución de aminoácidos alternativos, se pueden conferir pequeños cambios conformacionales a un polipéptido que dan como resultado una actividad aumentada. De manera alternativa, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos en ciertos polipéptidos para proporcionar residuos que, a continuación, se pueden unir a otras moléculas para proporcionar conjugados de péptido-molécula que conservan suficientes propiedades del polipéptido de partida para ser útiles para otros fines.

Se puede utilizar el índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a un polipéptido, en el que se encuentra que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen índices hidropáticos similares y aún conservan una actividad biológica similar. De manera alternativa, la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar sobre la base de la hidrofilicidad, en particular cuando la función biológica deseada en el polipéptido que se va a generar está destinada a su utilización en realizaciones inmunológicas. La mayor hidrofilicidad promedio local de una “proteína”, determinada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad. Por consiguiente, se observa que se pueden realizar sustituciones basándose en la hidrofilicidad asignada a cada aminoácido.

Al utilizar el índice de hidrofilicidad o bien el índice hidropático, que asigna valores a cada aminoácido, es preferente realizar sustituciones de aminoácidos en las que estos valores sean ±2, siendo ±1 particularmente preferente, y siendo aquellas con ±0,5 las sustituciones más preferentes.

La proteína variante tiene, como mínimo, el 50 %, como mínimo, aproximadamente el 80 %, o incluso, como mínimo, el 90 % pero menos del 100 %, de homología o identidad de secuencia de aminoácidos contiguos con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa correspondiente.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido variante corresponde básicamente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido nativo. Tal como se utiliza en el presente documento, “corresponde básicamente a” se refiere a una secuencia polipeptídica que provocará una respuesta biológica sustancialmente igual a la respuesta generada por la proteína nativa. Una respuesta de este tipo puede ser, como mínimo, el 60 % del nivel generado por la proteína nativa, e incluso puede ser, como mínimo, el 80 % del nivel generado por la proteína nativa.

Una variante puede incluir residuos de aminoácidos no presentes en la proteína nativa correspondiente o deleciones relativas a la proteína nativa correspondiente. Una variante también puede ser un “fragmento” truncado en comparación con la proteína nativa correspondiente, es decir, solo una porción de una proteína de longitud completa. Las variantes de proteínas también incluyen péptidos que tienen, como mínimo, un D-aminoácido.

La proteína variante puede expresarse a partir de una secuencia de ADN aislada que codifica la proteína variante. “Recombinante” se define como un péptido o ácido nucleico producido mediante procesos de ingeniería genética. Debe señalarse que es bien conocido en la técnica que, debido a la redundancia en el código genético, los nucleótidos individuales pueden intercambiarse fácilmente en un codón y todavía dar como resultado una secuencia de aminoácidos idéntica. Los términos “proteína”, “péptido” y “polipéptido” se utilizan indistintamente en el presente documento.

La presente invención da a conocer procedimientos para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero mediante la administración de un vector de expresión a una célula o paciente. Los procedimientos para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero no están dentro del alcance de la invención reivindicada. Para los procedimientos de terapia génica, un experto en la materia de la biología molecular y la terapia génica podría determinar, sin experimentación excesiva, las dosis y vías de administración adecuadas del vector de expresión utilizado en los procedimientos novedosos de la presente invención.

Según una realización, las células se transforman o se modifican genéticamente de otro modo in vivo. Las células del receptor mamífero se transforman (es decir, se transducen o transfectan) in vivo con un vector que contiene material genético exógeno para expresar un gen heterólogo (por ejemplo, recombinante) que codifica un agente terapéutico y el agente terapéutico se administra in situ.

Tal como se utiliza en el presente documento, “material genético exógeno” se refiere a un ácido nucleico o un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, que no se encuentra de forma natural en las células; o si se encuentra de forma natural en las células, no se transcribe ni se expresa por las células a niveles biológicamente significativos. Por tanto, “material genético exógeno” incluye, por ejemplo, un ácido nucleico de origen no natural que puede transcribirse en ARN antisentido, así como un “gen heterólogo” (es decir, un gen que codifica una proteína que no se expresa o se expresa a niveles biológicamente insignificantes en una célula de origen natural del mismo tipo).

En algunas realizaciones, el receptor mamífero tiene una afección que es susceptible de terapia de reemplazo de genes. Tal como se utiliza en el presente documento, “terapia de reemplazo de genes” se refiere a la administración al receptor de material genético exógeno que codifica un agente terapéutico y la posterior expresión in situ del material genético administrado. Por tanto, la frase “afección susceptible de terapia de reemplazo de genes” abarca afecciones, tales como enfermedades genéticas (es decir, una afección que es atribuible a uno o más defectos genéticos), patologías adquiridas (es decir, una afección patológica que no es atribuible a un defecto congénito, cánceres y procesos profilácticos (es decir, prevención de una enfermedad o de una afección médica no deseada). Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, el término “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente o material que tenga un efecto beneficioso sobre el receptor mamífero. Por tanto, “agente terapéutico” abarca moléculas tanto terapéuticas como profilácticas que tienen componentes de ácido nucleico (por ejemplo, ARN antisentido) y/o proteína.

Se conocen varias enfermedades oculares genéticas. También se conocen agentes terapéuticos eficaces contra estas enfermedades, dado que es la proteína/enzima que se sabe que es deficiente en estas enfermedades. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, SCAT, daltonismo y enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como MPS IV y MPS VII.

En algunas realizaciones, la enfermedad o afección puede ser una enfermedad o trastorno de almacenamiento lisosómico. En algunas realizaciones, la enfermedad es una deficiencia o defecto en la expresión o actividad de TPP1 (tripeptidil peptidasa I), CLN3 (Battenina), PPT1 (palmitoil proteína tioesterasa I), CLN6 (proteína 6 de lipofuscinosis ceroide neuronal) o CLN8. La enfermedad puede ser una enfermedad neurodegenerativa, tal como lipofuscinosis ceroide neuronal (NCL), tal como NCL infantil, NCL infantil tardía, NCL juvenil (enfermedad de Batten) y NCL adulta.

Tal como se utiliza en el presente documento, “patología adquirida” se refiere a una enfermedad o síndrome manifestado por un estado fisiológico, bioquímico, celular, estructural o biológico molecular anormal. En la tabla 2 se proporcionan ejemplos de patologías adquiridas. También se muestran agentes terapéuticos eficaces contra estas enfermedades.

Tabla 2. Terapias génicas potenciales para patologías adquiridas. Las proteínas correspondientes ifi r l n m r n n l l 1.

De manera alternativa, la afección susceptible de terapia de reemplazo de genes es un proceso profiláctico, es decir, un proceso para prevenir una enfermedad o una afección médica no deseada. De este modo, la presente invención abarca un sistema de expresión celular para administrar un agente terapéutico que tiene una función profiláctica (es decir, un agente profiláctico) al receptor mamífero.

En resumen, el término “agente terapéutico” incluye, aunque sin limitación a los mismos, los agentes enumerados en las tablas anteriores, así como sus equivalentes funcionales. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “equivalente funcional” se refiere a una molécula (por ejemplo, un péptido o una proteína) que tiene el mismo efecto beneficioso sobre el receptor mamífero o uno mejorado con respecto al agente terapéutico del que se considera un equivalente funcional. Tal como apreciará un experto en la materia, se pueden producir proteínas equivalentes funcionalmente mediante técnicas recombinantes, por ejemplo, expresando un “ADN equivalente funcionalmente”. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “ADN equivalente funcionalmente” se refiere a un ADN de origen no natural, que codifica un agente terapéutico. Por ejemplo, muchos, si no todos, los agentes dados a conocer en las tablas 1-2 tienen secuencias de aminoácidos conocidas, que están codificadas por ácidos nucleicos de origen natural. Sin embargo, debido a la degeneración del código genético, más de un ácido nucleico puede codificar el mismo agente terapéutico. Por consiguiente, la presente invención abarca agentes terapéuticos codificados por ADN de origen natural, así como por ADN de origen no natural, que codifican la misma proteína que codifica el ADN de origen natural.

Los agentes terapéuticos dados a conocer anteriormente y las afecciones susceptibles de terapia de reemplazo de genes son meramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. La selección de un agente terapéutico adecuado para el tratamiento de una afección conocida se considera que está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación excesiva.

Procedimientos de cribado

La presente invención da a conocer procedimientos, que no están dentro del alcance de la invención reivindicada, para cribar e identificar secuencias de aminoácidos que se dirigen, por ejemplo, se dirigen específicamente, a un área específica, tal como la vasculatura del sistema nervioso central. Este procedimiento se puede utilizar para identificar secuencias directoras que son específicas para estados de enfermedad específicos. En otras palabras, las secuencias directoras se pueden identificar y utilizar en el tratamiento de enfermedades específicas.

Vectores de AAV

El virus adenoasociado (AAV) es un virus pequeño (20 nm), no patógeno, que es útil en el tratamiento de enfermedades humanas, tales como la enfermedad de Parkinson y enfermedades genéticas recesivas. Se genera una construcción que rodea un promotor vinculado a un gen diana con secuencias de repetición terminal invertida (ITR, inverted terminal repeat) de AAV.

Según la presente invención, el vector viral es un vector de AAV. Un vector de “AAV” se refiere a un virus adenoasociado, y se puede utilizar para referirse al propio virus de tipo salvaje de origen natural o derivados del mismo. El término cubre todos los subtipos, serotipos y pseudotipos, y tanto las formas de origen natural como las recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “serotipo” se refiere a un AAV que se identifica y se distingue de otros AAV basándose en la reactividad de la proteína de la cápside con antisueros definidos, por ejemplo, hay muchos serotipos conocidos de AAV de primate (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV-Rh74 y AAVRh10, y cápsides modificadas de estos serotipos). Por ejemplo, el serotipo AAV-2 se utiliza para referirse a un AAV que contiene proteínas de la cápside codificadas a partir del gen cap de AAV-2 y un genoma que contiene secuencias ITR 5' y 3' del mismo serotipo de AAV-2. AAV pseudotipado se refiere a un AAV que contiene proteínas de la cápside de un serotipo y un genoma viral que incluye ITR 5'-3' de un segundo serotipo. Se esperaría que el rAAV pseudotipado tuviera propiedades de unión a la superficie celular del serotipo de la cápside y propiedades genéticas consistentes con el serotipo de ITR. Los rAAV pseudotipados se producen utilizando técnicas estándar descritas en la técnica. Tal como se utiliza en el presente documento, por ejemplo, rAAV1 se puede utilizar para referirse a un AAV que tiene proteínas de la cápside e ITR 5'-3' del mismo serotipo o puede referirse a un AAV que tiene proteínas de la cápside del serotipo 1 e ITR 5'-3' de un serotipo de AAV diferente, por ejemplo, el serotipo 2 de AAV. Para cada ejemplo ilustrado en el presente documento, la descripción del diseño y la producción del vector describe el serotipo de la cápside y las secuencias ITR 5'-3'. La abreviatura “rAAV” se refiere al virus adenoasociado recombinante, también denominado vector de AAV recombinante (o “vector de rAAV”).

Un “virus AAV” o “partícula viral de AAV” se refiere a una partícula viral compuesta, como mínimo, por una proteína de la cápside de AAV (de forma preferente, por todas las proteínas de la cápside de un AAV de tipo salvaje) y un polinucleótido encapsidado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido que no sea un genoma de AAV de tipo salvaje, tal como un transgén que se va a administrar a una célula de mamífero), normalmente se denomina “rAAV”.

En una realización, los vectores de expresión de AAV se construyen utilizando técnicas conocidas para proporcionar, como mínimo, como componentes unidos operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de inicio de la transcripción, el ADN de interés y una región de terminación de la transcripción. Los elementos de control se seleccionan para que sean funcionales en una célula de mamífero. La construcción resultante que contiene los componentes unidos operativamente está flanqueada (5' y 3') con secuencias ITR de AAV funcionales.

Por “repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado” o “ITR de AAV” se entienden las regiones reconocidas en la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma de AAV que funcionan juntas en cis como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR de AAV, junto con la región codificante de rep de AAV, proporcionan la escisión y el rescate eficaces, y la integración de una secuencia de nucleótidos interpuesta entre dos ⁱT^r flanqueantes en el genoma de una célula de mamífero.

Las secuencias de nucleótidos de las regiones ITR de AAV son conocidas. Véase, por ejemplo, Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Berns, K. I. “Parvoviridae and their Replication” en Fundamental Virology, 2.a edición, (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds.). Tal como se utiliza en el presente documento, no es necesario que una “ITR de AAV” tenga representada la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, pero puede alterarse, por ejemplo, mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Además, la ITR de AAV puede derivarse de cualquiera de varios serotipos de AAV, entre los que se incluyen, sin limitación a los mismos, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74 y AAVRh10, y cápsides modificadas de estos serotipos. Además, las ITR 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de AAV no tienen que ser necesariamente idénticas o derivar del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre que funcionen según lo previsto, es decir, para permitir la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de una célula huésped, y para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.

En una realización, las ITR de AAV pueden derivarse de cualquiera de varios serotipos de AAV, entre los que se incluyen, sin limitación a los mismos, AAV1, AAV2, AAV3, A^a V4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74 (AAV derivado de macaco Rhesus) y AAVRh10. Además, las ITR 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de expresión de AAV no necesariamente tienen que ser idénticas o derivar del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre que funcionen según lo previsto, es decir, para permitir la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de una célula huésped, y para permitir la integración de la molécula de ADN en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.

En una realización, las cápsides de AAV pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV, entre los que se incluyen, sin limitación a los mismos, A^a V1, AAV2, AAV3, ^a A^v 4, AAV5, AAV6, A^a V7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74 (AAV derivado de macaco Rhesus), y AAVRh10, y las It R de AAV se derivan del serotipo 2 de AAV. En algunas realizaciones, la cápside de AAV es la cápside de AAV2. Las moléculas de ADN adecuadas para su utilización en vectores de AAV tendrán un tamaño inferior a aproximadamente 5 kilobases (kb), inferior a aproximadamente 4,5 kb, inferior a aproximadamente 4 kb, inferior a aproximadamente 3,5 kb, inferior a aproximadamente 3 kb, inferior a aproximadamente 2,5 kb y son conocidas en la técnica.

En algunas realizaciones de la presente invención las moléculas de ADN para su utilización en los vectores de AAV contendrán una o más copias de una única secuencia de ARNip. Tal como se utiliza en el presente documento, el término copias múltiples de una secuencia de ARNip significa, como mínimo, 2 copias, como mínimo, 3 copias, como mínimo, 4 copias, como mínimo, 5 copias, como mínimo, 6 copias, como mínimo, 7 copias, como mínimo, 8 copias, como mínimo, 9 copias, y, como mínimo, 10 copias. En algunas realizaciones, las moléculas de ADN para su utilización en los vectores de AAV contendrán múltiples secuencias de ARNip. Tal como se utiliza en el presente documento, el término múltiples secuencias de ARNip significa, como mínimo, 2 secuencias de ARNip, como mínimo, 3 secuencias de ARNip, como mínimo, 4 secuencias de ARNip, como mínimo, 5 secuencias de ARNip, como mínimo, 6 secuencias de ARNip, como mínimo, 7 secuencias de ARNip, como mínimo, 8 secuencias de ARNip, como mínimo, 9 secuencias de ARNip y, como mínimo, 10 secuencias de ARNip. En algunas realizaciones, los vectores de ADN adecuados de la presente invención contendrán una secuencia que codifica la molécula de ARNip de la presente invención y un fragmento de relleno. Los fragmentos de relleno adecuados de la presente invención incluyen secuencias conocidas en la técnica que incluyen, sin limitación a las mismas, secuencias que no codifican una molécula de proteína expresada; secuencias que codifican una proteína celular normal que no tendría un efecto perjudicial sobre los tipos de células en los que se expresa; y secuencias que no codificarían por sí mismas una molécula dúplex de ARNip funcional.

En una realización, las moléculas de ADN adecuadas para su utilización en vectores AAV tendrán un tamaño inferior a aproximadamente 5 kilobases (kb) e incluirán, por ejemplo, una secuencia de relleno y una secuencia que codifica una molécula de ARNip de la presente invención. Por ejemplo, para evitar cualquier empaquetamiento de secuencias genómicas de AAV que contengan los genes rep y cap, se puede modificar un plásmido que contiene el fragmento de ADN rep y cap mediante la inclusión de un fragmento de relleno, tal como se conoce en la técnica, en el genoma de AAV que hace que el ADN exceda la longitud para un empaquetamiento óptimo. De este modo, el fragmento auxiliar no se empaqueta en los viriones de AAV. Esta es una característica de seguridad, que garantiza que solo un genoma de vector de AAV recombinante que no exceda el tamaño de empaquetamiento óptimo se empaquete en viriones. Un fragmento auxiliar de AAV que incorpora una secuencia de relleno puede exceder la longitud del genoma de tipo salvaje de 4,6 kb, y las longitudes superiores al 105 % del tipo salvaje generalmente no se empaquetarán. El fragmento de relleno se puede derivar, por ejemplo, de fuentes no virales, tales como el gen Lac-Z o beta-galactosidasa.

En una realización, la secuencia de nucleótidos seleccionada se une operativamente a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de la misma en el individuo in vivo. Dichos elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado. De manera alternativa, se pueden emplear secuencias de control heterólogas. Las secuencias de control heterólogas útiles generalmente incluyen aquellas derivadas de secuencias que codifican genes virales o de mamíferos. Entre los ejemplos se incluyen, aunque sin limitación a los mismos, el promotor temprano del virus de simio 40 (SV40), el promotor de repetición terminal larga (LTR, long terminal repeat) del virus del tumor mamario de ratón; el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP, major late promoter); un promotor del virus del herpes simple (HSV, herpes simplex virus), un promotor del citomegalovirus (CMV), tal como la región promotora temprana inmediata del CMV (CMVIE, CMV immediate early), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV, Rous sarcoma virus), promotores de la pol II, promotores de la pol III, promotores sintéticos, promotores híbridos, y similares. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metalotioneína murina, también encontrarán utilización en el presente documento. Dichas secuencias promotoras están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Stratagene (San Diego, CA).

En una realización, serán de utilización particular tanto los promotores heterólogos como otros elementos de control, tales como promotores inducibles y específicos de la retina, potenciadores y similares. Entre los ejemplos de promotores heterólogos se incluyen el promotor CMV. Entre los ejemplos de promotores específicos de la retina se incluyen el promotor IRBP (proteína de unión a retinoides interfotorreceptores, interphotoreceptor retinoid-binding protein), el promotor hGRK1 (rodopsina cinasa humana), IRBPe/GNAT2 (un elemento potenciador del promotor de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores) y una secuencia mínima del promotor de la subunidad alfa de la transducina humana.

En una realización, el vector de expresión de AAV que alberga la molécula de ADN de interés delimitada por las ITR de AAV puede construirse insertando directamente la secuencia o las secuencias seleccionada en un genoma de AAV en el que se han escindido del mismo los principales marcos de lectura abiertos (“ORF, open reading trames") de AAV. También se pueden eliminar otras porciones del genoma de AAV, siempre que quede una porción suficiente de las ITR para permitir las funciones de replicación y empaquetamiento. Dichas construcciones pueden diseñarse utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.

De manera alternativa, las ITR de AAV pueden escindirse del genoma viral o de un vector de AAV que contiene los mismos y 5' y 3' fusionados de una construcción de ácido nucleico seleccionada que está presente en otro vector utilizando técnicas de ligadura estándar. Por ejemplo, las ligaduras se pueden conseguir en Tris-Cl 20 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, BSA 33 gg/ml, NaCl 10 mM-50 mM y ATP 40 pMI, 0,01 -0,02 unidades (Weiss) de ADN ligasa de T4 a 0 °C (para ligadura de “extremo pegajoso”) o ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de ADN ligasa de T4 a 14 °C (para ligadura de “extremo romo”). Las ligaduras intermoleculares de “extremo pegajoso” generalmente se realizan a concentraciones de ADN total de 30-100 |¿g/ml (concentración final total de 5-100 nM). Vectores de AAV que contienen ITR. En particular, se describen varios vectores de AAV que están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (“ATCC, American Type Culture Collection") con los Números de Acceso 53222, 53223, 53224, 53225 y 53226.

Además, se pueden producir sintéticamente genes quiméricos para incluir secuencias ITR de AAV dispuestas en 5' y 3' de una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas. La secuencia quimérica completa se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados mediante procedimientos estándar.

Para producir viriones de rAAV, se introduce un vector de expresión de AAV en una célula huésped adecuada utilizando técnicas conocidas, tal como mediante transfección. Generalmente se conocen en la técnica varias técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York. Los procedimientos de transfección particularmente adecuados incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio, la microinyección directa en células cultivadas, la electroporación, la transferencia de genes mediada por liposomas, la transducción mediada por lípidos y la administración de ácidos nucleicos utilizando microproyectiles de alta velocidad.

En una realización, las células huésped adecuadas para producir viriones de rAAV incluyen microorganismos, células de levadura, células de insecto y células de mamífero, que se pueden utilizar o que se han utilizado como receptores de una molécula de ADN heteróloga. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. De este modo, una “célula huésped”, tal como se utiliza en el presente documento, generalmente se refiere a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Las células de la línea celular humana estable, 293 (fácilmente disponible a través de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Número de Acceso ATCC CRL1573) se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. En particular, la línea celular humana 293 es una línea celular de riñón embrionario humano que se ha transformado con fragmentos de ADN de adenovirus tipo 5 y expresa los genes adenovirales E1a y E1 b. La línea celular 293 se transfecta fácilmente y proporciona una plataforma particularmente conveniente para producir viriones de rAAV.

En una realización, las células huésped que contienen los vectores de expresión de AAV descritos anteriormente se vuelven capaces de proporcionar funciones auxiliares de AAV para replicar y encapsidar las secuencias de nucleótidos flanqueadas por las ITR de AAV para producir viriones de rAAV. Las funciones auxiliares de AAV son generalmente secuencias de codificación derivadas de AAV que se pueden expresar para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, funcionan en trans para la replicación productiva de AAV. Las funciones auxiliares de AAV se utilizan en el presente documento para complementar las funciones de AAV necesarias que faltan en los vectores de expresión de AAV. Por tanto, las funciones auxiliares de AAV incluyen uno o ambos de los principales ORF (marcos de lectura abiertos) de AAV, a saber, las regiones codificantes de rep y cap, o sus homólogos funcionales.

Se ha demostrado que los productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, entre las que se incluyen, entre otras: reconocimiento, unión y mellado (“nicking”) del origen de AAV de la replicación del ADN; actividad de ADN helicasa; y modulación de la transcripción de promotores de AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión de Cap proporcionan las funciones de empaquetamiento necesarias. Las funciones auxiliares de AAV se utilizan en el presente documento para complementar las funciones de AAV en trans que faltan de los vectores de AAV.

En una realización, las funciones auxiliares de AAV se introducen en la célula huésped mediante la transfección de la célula huésped con una construcción auxiliar de AAV antes que la transfección del vector de expresión de AAV o al mismo tiempo que la misma. El término “construcción auxiliar de AAV” se refiere generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones de AAV eliminadas de un vector de AAV que se utilizará para producir un vector de transducción para la administración de una secuencia de nucleótidos de interés. Las construcciones auxiliares de AAV se utilizan comúnmente para proporcionar una expresión transitoria de los genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones de AAV que faltan que son necesarias para la replicación lítica de AAV; sin embargo, las construcciones auxiliares carecen de las ITR de AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse por sí mismas. Las construcciones auxiliares de AAV pueden estar en forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito varias construcciones auxiliares de AAV, tales como los plásmidos pAAV/Ad y pIM29+45 utilizados habitualmente que codifican los productos de expresión de Rep y Cap. Se han descrito varios otros vectores que codifican productos de expresión de Rep y/o Cap.

Por “región codificante de rep de AAV” se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40. Se ha demostrado que estos productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, entre las que se incluyen el reconocimiento, la unión y el mellado del origen de AAV de la replicación del ADN, la actividad de la ADN helicasa y la modulación de la transcripción de los promotores de AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión de Rep se requieren colectivamente para replicar el genoma de AAV. Los homólogos adecuados de la región codificante de rep de AAV incluyen el gen rep del virus del herpes humano 6 (HHV-6) que también se sabe que media en la replicación del ADN de AAV-2.

Por “región codificante de cap de AAV” se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3, o sus homólogos funcionales. Estos productos de expresión de Cap proporcionan las funciones de empaquetamiento que se requieren colectivamente para empaquetar el genoma viral. En algunas realizaciones, se realizan modificaciones, tales como inserciones, en las proteínas de la cápside de AAV2 en P34-A35, T138-A139, A139-P140, G453-T454, N587-R588 y/o R588-Q589. En algunas realizaciones, las inserciones se realizan en D384, G385, 1560, T561, N562, E563, E564, E565, N704 y/o Y705 de AAV9.

En una realización, tanto los vectores de expresión de AAV como las construcciones auxiliares de AAV pueden construirse para contener uno o más marcadores seleccionables opcionales. Los marcadores adecuados incluyen genes que confieren resistencia o sensibilidad antibiótica, imparten color o cambian las características antigénicas de aquellas células que han sido transfectadas con una construcción de ácido nucleico que contiene el marcador seleccionable cuando las células se cultivan en un medio selectivo adecuado. Varios genes marcadores seleccionables que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen el gen de resistencia a la higromicina B (que codifica la aminoglucósido fosfotransferasa (APH)) que permite la selección en células de mamífero al conferir resistencia a G418 (disponible en Sigma, St. Louis, Mo.). Los expertos en la materia conocen otros marcadores adecuados.

En una realización, la célula huésped (o célula de empaquetamiento) se vuelve capaz de proporcionar funciones no derivadas de AAV, o “funciones accesorias”, para producir viriones de rAAV. Las funciones accesorias son funciones virales y/o celulares no derivadas de AAV de las que depende AAV para su replicación. De este modo, las funciones accesorias incluyen, como mínimo, aquellas proteínas y ARN que no son de AAV que se requieren en la replicación de AAV, incluidos los involucrados en la activación de la transcripción de genes de AAV, el corte y empalme del ARNm de AAV específico de la etapa, la replicación del ADN de AAV, la síntesis de los productos de expresión de Cap y el ensamblaje de la cápside de AAV. Las funciones accesorias basadas en virus se pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares conocidos.

En una realización, las funciones accesorias pueden introducirse y luego expresarse en células huésped utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Habitualmente, las funciones accesorias son proporcionadas por la infección de las células huésped con un virus auxiliar no relacionado. Se conocen varios virus auxiliares adecuados, entre los que se incluyen los adenovirus; virus del herpes, tales como virus del herpes simple tipo 1 y 2; y virus de la variolovacuna. Las funciones accesorias no virales también encontrarán utilización en el presente documento, tales como las proporcionadas por la sincronización celular utilizando cualquiera de diversos agentes conocidos.

En una realización, las funciones accesorias se proporcionan utilizando un vector de funciones accesorias. Los vectores de funciones accesorias incluyen secuencias de nucleótidos que proporcionan una o más funciones accesorias. Un vector de función accesoria puede introducirse en una célula huésped adecuada para apoyar la producción eficaz de viriones de AAV en la célula huésped. Los vectores de funciones accesorias pueden estar en forma de plásmido, fago, transposón o cósmido. Los vectores accesorios también pueden estar en forma de uno o más fragmentos de ADN o ARN linealizados que, cuando se asocian con los elementos de control y enzimas adecuados, pueden transcribirse o expresarse en una célula huésped para proporcionar funciones accesorias. En una realización, las secuencias de ácido nucleico que proporcionan las funciones accesorias pueden obtenerse de fuentes naturales, tales como del genoma de una partícula de adenovirus, o construirse utilizando procedimientos recombinantes o sintéticos conocidos en la técnica. A este respecto, las funciones accesorias derivadas de adenovirus han sido ampliamente estudiadas y se han identificado y caracterizado parcialmente varios genes de adenovirus implicados en funciones accesorias. Específicamente, se cree que las regiones tempranas de genes de adenovirus E1a, E2a, E4, ARN VAI y, posiblemente, E1b participan en el proceso accesorio. Se han descrito funciones accesorias derivadas de virus del herpes. También se han descrito funciones accesorias derivadas del virus de la variolovacuna.

En una realización, como consecuencia de la infección de la célula huésped con un virus auxiliar, o la transfección de la célula huésped con un vector de función accesoria, se expresan funciones accesorias que transactivan la construcción auxiliar de AAV para producir proteínas Rep y/o Cap de AAV. Los productos de expresión de Rep escinden el ADN recombinante (incluyendo el ADN de interés) del vector de expresión de AAV. Las proteínas Rep también sirven para duplicar el genoma de AAV. Las proteínas Cap expresadas se ensamblan en cápsides, y el genoma de AAV recombinante se empaqueta en las cápsides. De este modo, se produce una replicación productiva de AAV y el ADN se empaqueta en viriones de rAAV.

En una realización, después de la replicación de AAV recombinante, los viriones de rAAV se pueden purificar a partir de la célula huésped utilizando una variedad de procedimientos de purificación convencionales, tales como gradientes de CsC1. Además, si se emplea la infección para expresar las funciones accesorias, el virus auxiliar residual puede inactivarse utilizando procedimientos conocidos. Por ejemplo, el adenovirus se puede inactivar calentando a temperaturas de aproximadamente 60 °C durante, por ejemplo, 20 minutos o más. Este tratamiento inactiva, de forma eficaz, solo el virus auxiliar, ya que el AAV es extremadamente estable al calor, mientras que el adenovirus auxiliar es lábil al calor. A continuación, los viriones de rAAV resultantes están listos para su utilización para la administración de ADN al ojo del individuo.

Los procedimientos de administración de vectores virales incluyen, aunque sin limitación a los mismos, vías intraoculares, subretinianas e intravítreas. En general, los viriones de rAAV pueden introducirse en las células del ojo utilizando técnicas de transducción in vivo o bien in vitro. Si se transduce in vitro, la célula receptora deseada se eliminará del individuo, se transducirá con viriones de rAAV y se reintroducirá en el individuo. De manera alternativa, se pueden utilizar células singénicas o xenogénicas cuando esas células no generarán una respuesta inmunitaria inadecuada en el individuo.

Se han descrito procedimientos adecuados para la administración e introducción de células transducidas en un individuo. Por ejemplo, las células se pueden transducir in vitro mediante la combinación de viriones de AAV recombinantes con células oculares, por ejemplo, en medios adecuados, y la detección de aquellas células que albergan el ADN de interés se puede cribar utilizando técnicas convencionales, tales como transferencias Southern y/o PCR, o mediante la utilización de marcadores seleccionables. A continuación, las células transducidas pueden formularse en composiciones farmacéuticas, descritas más detalladamente a continuación, y la composición puede introducirse en el individuo mediante diversas técnicas, tales como injerto, inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal.

En una realización, para la administración in vivo, los viriones de rAAV se formulan en composiciones farmacéuticas y generalmente se administrarán por vía intraocular, por ejemplo, mediante inyección subretiniana.

En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenderán material genético suficiente para producir una cantidad eficaz terapéuticamente del ácido nucleico de interés, es decir, una cantidad suficiente para reducir o mejorar los síntomas del estado de enfermedad en cuestión o una cantidad suficiente para conferir el beneficio deseado. Las composiciones farmacéuticas también contendrán un excipiente aceptable farmacéuticamente. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que pueda administrarse sin toxicidad indebida. Entre los excipientes aceptables farmacéuticamente se incluyen, aunque sin limitación a los mismos, sorbitol, Tween80 y líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Se pueden incluir sales aceptables farmacéuticamente, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, en dichos vehículos pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH y similares. En Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Nueva Jersey 1991) está disponible una discusión rigurosa de excipientes aceptables farmacéuticamente.

Tal como es evidente para los expertos en la materia, en vista de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, se puede determinar empíricamente una cantidad eficaz de vector viral que debe añadirse. La administración puede efectuarse en una sola dosis, de forma continua o intermitente a lo largo del curso del tratamiento. Los procedimientos para determinar los medios y las dosis de administración más eficaces son bien conocidos por los expertos en la materia y variarán con el vector viral, la composición de la terapia, las células diana y el individuo que se está tratando. Pueden llevarse a cabo administraciones únicas y múltiples con el nivel de dosis y el patrón seleccionados por el médico tratante.

Debe entenderse que mediante el vector viral administrado se podría expresar más de un transgén. De manera alternativa, también se pueden administrar al ojo vectores separados, cada uno expresando uno o más transgenes diferentes, tal como se describe en el presente documento. Además, también se pretende que los vectores virales administrados por los procedimientos de la presente invención se combinen con otras composiciones y terapias adecuadas.

Procedimientos para introducir material genético en las células

El material genético exógeno (por ejemplo, un ADNc que codifica una o más proteínas terapéuticas) se introduce en la célula ex vivo o in vivo mediante procedimientos de transferencia genética, tales como transfección o transducción, para proporcionar una célula modificada genéticamente. Diversos vectores de expresión (es decir, vehículos para facilitar la administración de material genético exógeno a una célula diana) son conocidos por los expertos en la materia.

Tal como se utiliza en el presente documento, “transfección de células” se refiere a la adquisición por parte de una célula de material genético nuevo mediante la incorporación de ADN añadido. De este modo, la transfección se refiere a la inserción de ácido nucleico en una célula utilizando procedimientos físicos o químicos. Los expertos en la materia conocen varias técnicas de transfección que incluyen: coprecipitación de ADN con fosfato de calcio; DEAE-dextrano; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; y bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno. La coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio es otro posible procedimiento de transfección.

Por el contrario, “transducción de células” se refiere al proceso de transferir ácido nucleico a una célula utilizando un virus de ADN o ARN. Un virus de ARN (es decir, un retrovirus) para transferir un ácido nucleico a una célula se denomina en el presente documento retrovirus quimérico de transducción. El material genético exógeno contenido en el retrovirus se incorpora al genoma de la célula transducida. Una célula que ha sido transducida con un virus de ADN quimérico (por ejemplo, un adenovirus que lleva un ADNc que codifica un agente terapéutico), no tendrá el material genético exógeno incorporado en su genoma, pero será capaz de expresar el material genético exógeno que se retiene de forma extracromosómica dentro de la célula.

Normalmente, el material genético exógeno incluye el gen heterólogo (normalmente en forma de ADNc que comprende los exones que codifican la proteína terapéutica) junto con un promotor para controlar la transcripción del nuevo gen. El promotor, de forma característica, tiene una secuencia de nucleótidos específica necesaria para iniciar la transcripción. Opcionalmente, el material genético exógeno incluye, además, secuencias adicionales (es decir, potenciadores) necesarias para obtener la actividad de transcripción génica deseada. Para el propósito de esta discusión, un “potenciador” es simplemente cualquier secuencia de ADN no traducida que funciona contigua a la secuencia codificante (en cis) para cambiar el nivel de transcripción basal dictado por el promotor. El material genético exógeno puede introducirse en el genoma de la célula inmediatamente aguas abajo del promotor, de modo que el promotor y la secuencia codificante se unen operativamente para permitir la transcripción de la secuencia codificante. Un vector de expresión retroviral puede incluir un elemento promotor exógeno para controlar la transcripción del gen exógeno insertado. Dichos promotores exógenos incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles.

Los promotores constitutivos de origen natural controlan la expresión de funciones celulares esenciales. Como resultado, un gen bajo el control de un promotor constitutivo se expresa en todas las condiciones de crecimiento celular. Los promotores constitutivos de ejemplo incluyen los promotores de los siguientes genes que codifican ciertas funciones constitutivas o de “mantenimiento”: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), dihidrofolato reductasa (DHFR), adenosina desaminasa, fosfoglicerol cinasa (PGK), piruvato cinasa, fosfoglicerol mutasa, el promotor de actina y otros promotores constitutivos conocidos por los expertos en la materia. Además, muchos promotores virales funcionan de forma constitutiva en las células eucarióticas. Entre estos se incluyen: los promotores tempranos y tardíos de SV40; las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus; y el promotor de la timidina cinasa del virus del herpes simple, entre muchos otros. Por consiguiente, cualquiera de los promotores constitutivos mencionados anteriormente se puede utilizar para controlar la transcripción de un inserto de gen heterólogo.

Los genes que están bajo el control de promotores inducibles se expresan solo, o en mayor grado, en presencia de un agente inductor (por ejemplo, la transcripción bajo el control del promotor de metalotioneína aumenta mucho en presencia de ciertos iones metálicos). Los promotores inducibles incluyen elementos sensibles (RE, responsive elements) que estimulan la transcripción cuando se unen sus factores inductores. Por ejemplo, existen R^e para factores séricos, hormonas esferoides, ácido retinoico y AMP cíclico. Los promotores que contienen un RE particular pueden elegirse para obtener una respuesta inducible y, en algunos casos, el propio RE puede unirse a un promotor diferente, confiriendo así inducibilidad al gen recombinante. De este modo, seleccionando el promotor apropiado (constitutivo frente a inducible; fuerte frente a débil), es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión de un agente terapéutico en la célula modificada genéticamente. Si el gen que codifica el agente terapéutico está bajo el control de un promotor inducible, la administración del agente terapéutico in situ se desencadena al exponer la célula modificada genéticamente in situ a condiciones que permitan la transcripción del agente terapéutico, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal de inductores específicos de los promotores inducibles que controlan la transcripción del agente. Por ejemplo, la expresión in situ por parte de células modificadas genéticamente de un agente terapéutico codificado por un gen bajo el control del promotor de la metalotioneína se potencia poniendo en contacto las células modificadas genéticamente con una solución que contiene los iones metálicos adecuados (es decir, inductores) in situ.

Por consiguiente, la cantidad de agente terapéutico que se administra in situ se regula controlando factores, tales como: (1) la naturaleza del promotor utilizado para dirigir la transcripción del gen insertado (es decir, si el promotor es constitutivo o inducible, fuerte o débil); (2) el número de copias del gen exógeno que se insertan en la célula; (3) el número de células transducidas/transfectadas que se administran (por ejemplo, se implantan) al paciente; (4) el tamaño del implante (por ejemplo, injerto o sistema de expresión encapsulado); (5) el número de implantes; (6) la cantidad de tiempo que se dejan en su lugar las células transducidas/transfectadas o los implantes; y (7) la tasa de producción del agente terapéutico por la célula modificada genéticamente. Se considera que la selección y optimización de estos factores para la administración de una dosis eficaz terapéuticamente de un agente terapéutico determinado está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación excesiva, teniendo en cuenta los factores dados a conocer anteriormente y el perfil clínico del paciente.

Además de, como mínimo, un promotor y, como mínimo, un ácido nucleico heterólogo que codifica el agente terapéutico, el vector de expresión puede incluir un gen de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina, para facilitar la selección de células que han sido transfectadas o transducidas con el vector de expresión. De manera alternativa, las células se transfectan con dos o más vectores de expresión, como mínimo, un vector que contiene el gen o los genes que codifican el agente o los agentes terapéuticos, y el otro vector contiene un gen de selección. La selección de un promotor, potenciador, gen de selección y/o secuencia señal adecuados (descritos a continuación) se considera que está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación excesiva.

El agente terapéutico puede dirigirse para la administración a una ubicación extracelular, intracelular o de membrana. Si es deseable que el producto génico sea secretado desde las células, el vector de expresión se diseña para incluir una secuencia “señal” de secreción adecuada para secretar el producto génico terapéutico desde la célula al medio extracelular. Si es deseable que el producto génico se mantenga dentro de la célula, se omite esta secuencia señal de secreción. De manera similar, el vector de expresión se puede construir para incluir secuencias señal de “retención” para anclar el agente terapéutico dentro de la membrana plasmática celular. Por ejemplo, todas las proteínas de membrana tienen regiones transmembrana hidrofóbicas, que detienen la translocación de la proteína en la membrana y no permiten que la proteína sea secretada. Se considera que la construcción de un vector de expresión que incluye secuencias señal para dirigir un producto génico a una ubicación particular está dentro del alcance de un experto en la materia sin necesidad de experimentación excesiva.

La siguiente discusión está dirigida a diversas utilidades de la presente invención. Las utilidades no están dentro del alcance de la invención reivindicada. Por ejemplo, la presente invención tiene utilidad como sistema de expresión adecuado para desintoxicar toxinas intracelulares y/o extracelulares in situ. Uniendo u omitiendo la secuencia señal adecuada a un gen que codifica un agente terapéutico capaz de desintoxicar una toxina, el agente terapéutico puede dirigirse para la administración al medio extracelular, a la membrana plasmática celular o a una ubicación intracelular. En una realización, el material genético exógeno que contiene un gen que codifica un agente terapéutico desintoxicante intracelular incluye, además, secuencias que codifican receptores de superficie para facilitar el transporte de toxinas extracelulares a la célula donde pueden ser desintoxicadas intracelularmente por el agente terapéutico. De manera alternativa, las células pueden modificarse genéticamente para expresar el agente terapéutico desintoxicante anclado dentro de la membrana plasmática celular, de modo que la porción activa se extienda al medio extracelular. La porción activa del agente terapéutico unido a la membrana desintoxica las toxinas, que están presentes en el medio extracelular.

Además de los agentes terapéuticos descritos anteriormente, algunos de los cuales están dirigidos a la retención intracelular, la presente invención también abarca agentes destinados a la administración al medio extracelular y/o agentes destinados a anclarse en la membrana plasmática celular.

La selección y optimización de un vector de expresión particular para expresar un producto génico específico en una célula aislada se consigue obteniendo el gen, potencialmente con una o más regiones de control adecuadas (por ejemplo, promotor, secuencia de inserción); preparando una construcción de vector que comprenda el vector en el que se inserta el gen; transfectando o transduciendo células cultivadas in vitro con la construcción del vector; y determinando si el producto génico está presente en las células cultivadas. En algunas realizaciones, se utiliza un virus de la familia de virus adenoasociados. En algunas realizaciones, se utiliza un vector de expresión para terapia génica basado en AAV2, AAV4 y/o AAV5.

De este modo, tal como será evidente para un experto en la materia, hay disponible una variedad de vectores de expresión viral adecuados para transferir material genético exógeno a las células. La selección de un vector de expresión adecuado para expresar un agente terapéutico para una afección particular susceptible de terapia de reemplazo de genes y la optimización de las condiciones para la inserción del vector de expresión seleccionado en la célula, están dentro del alcance de un experto en la materia sin necesidad de experimentación excesiva.

En una realización alternativa, el vector de expresión está en forma de plásmido, que se transfiere a las células diana por uno de una variedad de procedimientos: físicos (por ejemplo, microinyección, electroporación, carga por raspado, bombardeo con micropartículas) o por captación celular como un complejo químico (por ejemplo, coprecipitación con calcio o estroncio, formación de complejos con lípidos, formación de complejos con ligando). Varios productos comerciales están disponibles para la formación de complejos con liposomas catiónicos, incluidos Lipofectin® (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.) y Transfectam® (ProMega, Madison, Wis.). Sin embargo, la eficacia de la transfección por estos procedimientos depende en gran medida de la naturaleza de la célula diana y, por consiguiente, deben optimizarse las condiciones para la transfección óptima de ácidos nucleicos en células utilizando los procedimientos mencionados anteriormente. Dicha optimización está dentro del alcance de un experto en la materia sin necesidad de experimentación excesiva.

La presente invención también da a conocer diversos procedimientos que no están dentro del alcance de la invención reivindicada, para fabricar y utilizar las células modificadas genéticamente descritas anteriormente. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “aislado” significa una célula o una pluralidad de células que se han eliminado de su ubicación natural in vivo. Los procedimientos para eliminar células de un paciente, así como los procedimientos para mantener las células aisladas en cultivo, son conocidos por los expertos en la materia.

La presente invención también da a conocer procedimientos para modificar genéticamente células de un receptor mamífero in vivo. Según una realización, el procedimiento comprende introducir un vector de expresión para expresar un producto génico heterólogo en células del receptor de mamífero in situ, por ejemplo, inyectando el vector en el receptor.

En una realización, la preparación de células modificadas genéticamente contiene una cantidad de células suficiente para administrar una dosis terapéuticamente eficaz del agente terapéutico al receptor in situ. La determinación de una dosis eficaz terapéuticamente de un agente terapéutico específico para una afección conocida está dentro del alcance de un experto en la materia sin necesidad de experimentación excesiva. De este modo, para determinar la dosis eficaz, un experto en la materia consideraría la afección del paciente, la gravedad de la afección, así como los resultados de los estudios clínicos del agente terapéutico específico que se está administrando.

Si las células modificadas genéticamente no están ya presentes en un vehículo aceptable farmacéuticamente, se colocan en dicho vehículo antes de la administración al receptor. Dichos vehículos aceptables farmacéuticamente incluyen, por ejemplo, solución salina isotónica y otros tampones adecuados para el paciente y la terapia.

Se puede introducir más de un gen recombinante en cada célula modificada genéticamente en el mismo vector o en diferentes vectores, lo que permite la expresión de múltiples agentes terapéuticos por una sola célula.

EJEMPLO 1

Preparación de AAV modificados que se dirigen a las células oculares

Los inventores de la presente invención diseñaron AAV que se modifican para dirigirse a las células oculares después de la administración local. Para generar un virus adenoasociado (AAV) que se dirija a las células oculares, los inventores de la presente invención utilizaron primero la selección de expresión en fagos in vivo para identificar motivos peptídicos que se unen preferentemente a las células oculares. Se inyectó una biblioteca de expresión en fagos en los ojos de ratones y, posteriormente, se aislaron las células oculares junto con el fago unido. A continuación, el fago aislado se amplificó y se reinyectó, y después de cinco rondas de este tipo de selección in vivo, la secuenciación del ADN del fago recuperado reveló un enriquecimiento de distintos motivos peptídicos de la biblioteca de fagos inicial.

En los ratones, se identificaron los motivos peptídicos GSTPPPM (SEQ ID NO: 1) y GETRAPL (SEQ ID NO: 4). Para confirmar la afinidad de estos fagos por las células oculares, cada fago se reinyectó individualmente por vía intravenosa en ratones y se visualizó. Según los resultados de la selección, cada uno de los fagos seleccionados se acumuló en el ojo más allá de los niveles de base observados para los controles.

Los AAV modificados con péptidos se generaron mediante la inserción de los péptidos identificados a partir de la selección de expresión en fagos en la cápside de AAV2. Se insertaron péptidos entre las posiciones 587 y 588 de la proteína de la cápside VP3 para producir clones. El AAV-WT (tipo salvaje, wild type, sin inserción) sirvió como virus de control. El sitio 587/588 está ubicado en un dominio de la proteína de la cápside VP3 involucrada en la unión de AAV2 con su principal receptor, el proteoglicano de sulfato de heparina (HSPG, heparin sulfate proteoglycan), y la inserción de péptidos en este sitio puede alterar el tropismo de AAV sin comprometer la viabilidad del virus. Las proteínas de la cápside modificada empaquetaron genomas de vector AAV con títulos genómicos comparables a los del virus de tipo salvaje.

Secuencia de cápside de AAV2 de tipo salvaje

587 588

5 ' --AGA GGC AAC AGA CAA GCA-3’ (SEQ ID NO: 6)

R G N R Q A (SEQ ID NO: 7)

La secuencia de la cápside de AAV2 de tipo salvaje se representa, a continuación, en la SEQ ID NO: 8.

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYL

GPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKE

DTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTG

KAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMAD

NNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHIYKQISSQSGA

SNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQV

KEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAFIQGCLPPFPADVFMVPQ

YGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQS

LDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASD1RDQSRNWLPGPCYR

QQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQS

GVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAAT

XDVTNTQGVLPGMWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQ

[LIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNY

VKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL* (SEQ IDN08)

En el siguiente ejemplo, la secuencia de la cápside de AAV2 de tipo salvaje con motivo insertado (SEQ ID NO: 1) que se dirige a las células oculares está en cursiva, y los aminoácidos subrayados son espaciadores.

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVEPGYKYL

GPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKE

DTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTG

KAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMAD

NNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGA

SNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQV

KEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQ

YGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQS

LDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYR

QQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQS

GVLTFGKOGSEKTNVDIEKVMTTDEEEIRTTNPVATEOYGSVSTNLORGNAAAG.V

rPm/AAROAATADVNTOGVLPGMWQDRDVYLOGPIWAKIPHTDGHFHPSPL

MGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKE

NSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL* (SEQ ID

NO: 9)

La secuencia de la cápside de AAV2 de tipo salvaje con el motivo insertado SEQ ID NO: 4 se representa, a continuación, en la SEQ ID NO: 10. El motivo de aminoácidos que se dirige a las células oculares está en cursiva y los aminoácidos subrayados son espaciadores.

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYL

GPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKE

DTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTG

KAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMAD

NNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVnTSTRTWALPTYNNFILYKQISSQSGA SNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLrNNNWGFRPKRLNFKLFNIQV

KEVTQNDGTTTTANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQ

YGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQS

LDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYR

QQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASFTKDDEEKFFPQS

GVLIFGKOGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEOYGSVSTNLORGNAAAG/*T

/¿4/VAA ROA ATAD VNTQGVLPGVIVWODRDVYFOGPIWAKIPHTDGHFHPSPL

MGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKE

NSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL* (SEQ ID

NOMO)

La secuencia de la cápside de tipo salvaje de AAV9 se representa, a continuación, en la SEQ ID NO: 11.

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLG

PGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTS

FGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQP

a k k r l n f g q t g d t e sv p d p q p ig e p p a a p sg v g sl t m a sg g g a p v a d n n e g a d g v g

SSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYST

p w g y f d f n r f h c h fsp r d w q r l in n n w g fr p k r l n fk l fn iq v k e v t d n n g v k t ia

NNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRS

SFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKT

INGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGA

SSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITN

EEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVONOGILPGMVWQDRDVYLOGP

1WAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQ1LIKNTPVPADPPTAFNKDK.LNSFITQYST

GQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLT

RNL* (SEQ ID NO:l 1)

Materiales y procedimientos:

Selección de fagos por afinidad (“biopanning”) in vivo : Se inyectó 1 |j.l de biblioteca de fagos Ph.D.® 7 (título 2,0 x 1013 pfu/ml de NEB) en el espacio subretiniano de ojos de ratones. Después de 30 minutos, se separaron la retina y el RPE del ojo inyectado, se lavaron con 5 ml de PBS frío 3-5 veces. La retina y el RPE se homogeneizaron en 500 u1 de PBS. Los fagos recuperados se titularon, amplificaron, purificaron y reinyectaron en ojos adicionales para la siguiente ronda de selección in vivo. Todo el procedimiento se repitió durante cuatro rondas. Después de esto, se secuenciaron 50 clones seleccionados al azar para determinar motivos enriquecidos.

Construcción de cápsides de AAV2 modificadas con péptidos: El plásmido para la clonación de cápsides modificadas se desarrolló a partir de pXX2, que contenía Rep y Cap del AAV2 de tipo salvaje. Un plásmido con un fragmento de ADN que codificaba los aminoácidos AAAstopA y los sitios de restricción NotI y AscI insertados entre las posiciones 587 y 588 de los aminoácidos de Cap de AAV2 se construyó como el plásmido principal. Los insertos de ADNdc que codifican péptidos seleccionados se clonaron en el sitio NotI y AscI como pXX2 modificado con péptido.

Producción y título de AAV2: Se cotransfectaron placas de células 293T con tres plásmidos: pXX2 o pXX2 modificado con péptido, que suministró las proteínas Rep y Cap de AAV2; pHelper, que contenía las funciones auxiliares de adenovirus; y un plásmido vector, que contenía las ITR de AAV2 y el transgén de interés. Veinte placas de 150 mm de diámetro se cotransfectaron con 90 |¿g de ADN de los plásmidos pXX2, pHelper y vector en una relación molar de 1:1:1. Después de la incubación durante 60 horas, el virus se purificó con gradientes de iodixanol y purificación adicional a través de una membrana mustang Q. Los títulos de AAV recombinante se determinaron mediante PCR en tiempo real.

EJEMPLO 2

Tratamiento de enfermedad ocular genética mediante terapia génica

Se probaron dos procedimientos de administración de vectores virales en el ojo para probar la administración de agentes de terapia génica in vivo. Los modos de administración fueron la inyección de los vectores virales por vía subretiniana (figura A-D) e intravítrea (figura E-I).

El virus utilizado en este estudio fue AAV2/2. Como control, se utilizó AAV2/2.CMV.eGFP de tipo salvaje y el agente de prueba fue PMAAV-GST.CMV.eGFP. El virus se inyectó en ratones hembra C57BL/6 de cinco semanas de vida. A los ratones se les inyectó virus por vía subretiniana (2,26 x 109 vg/ojo). Tres semanas más tarde, los ratones se anestesiaron y las pupilas se dilataron. Se colocaron en una plataforma estereotáctica y se tomaron fotografías de fondo de ojo fluorescentes dinámicas. Cuatro semanas más tarde, los ratones se sacrificaron y los ojos se enuclearon y fijaron en paraformaldehído al 4 %. Las secciones de tejido se cortaron y montaron. La expresión de eGFP se observó bajo microscopio fluorescente.

Tres semanas después de la inyección subretiniana de AAV2/2.CMV.eGFP de tipo salvaje y PMAAV-GST.CMV.eGFP, las imágenes fluorescentes en animales vivos mostraron eficacias de infección relativas. Los péptidos directores utilizados en este experimento fueron GSTPPPM (SEQ ID NO: 1). Se observaron regiones moteadas de positividad de GFP en ojos con inyección de AAV2/2, mientras que hubo señales de GFP amplias y uniformes en ojos de PMAAV-GST (figura 2). En otros experimentos, el péptido director fue GETRAPL (SEQ ID NO: 4).

Cuatro semanas después de la inyección subretiniana, PMAAV-GST.CMV.eGFP se dirigió al epitelio pigmentario de la retina (RPE) y las capas de la capa nuclear externa (ONL), y algunas células en la capa de células ganglionares (GCL). AAV2/2 se dirigió a la capa plexiforme externa (OPL) principalmente (figura 3).

La utilización de los términos “un” y “una” y “el” y “la” y referencias similares en el contexto de la descripción de la presente invención deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan “que incluye, aunque sin limitación a los mismos”) a menos que se indique lo contrario. La enumeración de los intervalos de valores en el presente documento tiene la intención de servir simplemente como un procedimiento abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. La utilización de cualquiera y todos los ejemplos, o el lenguaje de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) que se proporciona en el presente documento, pretende simplemente ilustrar mejor la presente invención y no representa una limitación en el alcance de la presente invención a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como una indicación de cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la presente invención.

En el presente documento se describen realizaciones de la presente invención, que incluyen el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la presente invención. Las variaciones de esas realizaciones pueden resultar evidentes para los expertos en la materia al leer la descripción anterior.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Proteína de la cápside del virus adenoasociado (AAV) modificada que comprende un péptido director a células oculares, en la que el péptido director tiene una longitud de hasta 10 aminoácidos, en la que el péptido director dirige un AAV a una célula ocular, y en la que el péptido director comprende la secuencia de aminoácidos GSTPPPM (SEQ ID NO: 1), en una orientación de amino a carboxilo o en una orientación de carboxilo a amino.

2. Proteína de la cápside, según la reivindicación 1, en la que el péptido director tiene una longitud de 8 o 9 aminoácidos.

3. Proteína de la cápside, según la reivindicación 1, en la que el péptido director consiste en la secuencia de aminoácidos GSTPPPM (SEQ ID NO: 1), tal como se expresa en una orientación de amino a carboxilo o en una orientación de carboxilo a amino.

4. Proteína de la cápside, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el péptido director se inserta entre los residuos de la cápside de AAV2 en las posiciones P34-A35, T138-A139, A139-P140, G453-T454, N587-R588 y/o R588-Q589 de la SEQ ID NO: 8 o en la que el péptido director se inserta después de los residuos de la cápside de AAV9 en las posiciones D384, G385, 1560, T561, N562, E563, E564, E565, N704 y/o Y705 de la SEQ ID NO: 11.

5. Proteína de la cápside, según la reivindicación 1, en la que la proteína de la cápside consiste en la SEQ ID NO: 9.

6. Proteína de la cápside, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el péptido director se dirige a una célula ocular enferma, de forma preferente, a una célula ocular en un individuo que tiene retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII.

7. Proteína de la cápside, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 6, en la que la cápside de AAV se deriva del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-Rh74 (AAV derivado de macaco Rhesus), AAVRh10.

8. Secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de la cápside modificada, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Vector de AAV que comprende la proteína de la cápside, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7.

10. Vector de AAV, según la reivindicación 9, en el que el vector de AAV comprende, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico de interés, en el que el ácido nucleico de interés es un agente terapéutico.

11. Vector de AAV, según la reivindicación 10, en el que el agente terapéutico es una molécula de ARNi o miARN de ataxina 7.

12. Vector de AAV, según la reivindicación 9, en el que el vector de AAV comprende, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica un agente terapéutico.

13. Vector de AAV, según la reivindicación 12, en el que el agente terapéutico es una enzima o proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE 65), inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o receptor 1 de VEGF soluble (sFif1) (proteína escolta de Rab-1) REP1, L-opsina, rodopsina (Rho), fosfodiesterasa 6(3 (PDE6I3), casete de unión a ATP, subfamilia A, miembro 4 (ABCA4), lecitina retinol aciltransferasa (LRAT), degeneración retiniana lenta/periferina (RDS/periferina), proteína tirosina cinasa Mer (MERTK), inosina-5-prima-monofosfato deshidrogenasa, tipo I (IMPDHI), guanilato ciclasa 2D (GUCY2D), proteína de tipo 1 que interactúa con aril-hidrocarburo (AIPL 1), proteína 1 que interactúa con el regulador de GTPasa de la retinitis pigmentaria (RPGRIP1), inosina-5-prima-monofosfato deshidrogenasa, tipo I (IMPDH1), proteína de unión a nucleótido de guanina, polipéptido 2 con actividad transductora alfa (GNAT2), canal beta 3 regulado por nucleótidos cíclicos (CNGB3), retinosquisina 1 (Rs1), albinismo ocular tipo 1 (OA1), tirosinasa de albinismo oculocutáneo tipo 1 (OCA1), P21 WAF-1/Cipl, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), endostatina, angiostatina, arilsulfatasa B o 13-glucuronidasa.

14. Composición que comprende el vector de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, y un vehículo, de forma preferente, una composición farmacéutica que comprende el vector de AAV y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

15. Célula in vitro que comprende el vector de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13.

16. Vector de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad ocular en un mamífero, en el que la enfermedad ocular es, de forma preferente, retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII, y en el que el mamífero es, de manera preferente, un ser humano.

17. Composición que comprende el vector de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, y un vehículo para su utilización en el tratamiento de retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII.

18. Composición farmacéutica que comprende el vector de AAV, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, y un vehículo aceptable farmacéuticamente para su utilización en el tratamiento de retinitis pigmentaria, maculopatías, amaurosis congénita de Leber, neuropatía óptica hereditaria de Leber, distrofia retiniana grave de inicio temprano, acromatopsia, retinosquisis, albinismo ocular, albinismo oculocutáneo, glaucoma, enfermedad de Stargardt, coroideremia, degeneración macular relacionada con la edad, ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCAT), daltonismo o enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan a la córnea, tales como mucopolisacaridosis (MPS) IV y MPS VII.