ES2922902T3 - Plantas con digestibilidad mejorada y haplotipos marcadores - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a plantas, tales como maíz, sorgo o caña de azúcar, que tienen una digestibilidad mejorada, en particular una digestibilidad mejorada del rastrojo. La presente invención se refiere a un alelo QTL asociado con una digestibilidad mejorada y alelos marcadores específicos asociados con el alelo QTL. La presente invención se refiere además a dichas plantas, en las que el gen F35H está mutado o en las que la expresión de F35H está alterada. La invención también se refiere a métodos para identificar plantas que tienen digestibilidad mejorada y métodos para obtener tales plantas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Plantas con digestibilidad mejorada y haplotipos marcadores
Campo de la invención
La invención se refiere a loci de rasgos cuantitativos (QTL) y marcadores asociados implicados y/o asociados con una digestibilidad mejorada de plantas y partes de plantas, como el maíz. La invención se refiere además a los usos de tales QTL o marcadores para propósitos de identificación y/o selección, así como plantas transgénicas o no transgénicas.
Antecedentes de la invención
El maíz (Zea mays L.) es el cultivo forrajero anual más importante del mundo. Cada año se ensilan más de 3 millones de hectáreas de maíz, principalmente en el norte de Europa. Debido al alto contenido energético y a la eficiencia de conversión alimenticia, el maíz forrajero es un cultivo alimenticio importante para el ganado lechero y de carne, y está afectando significativamente la producción de leche y carne. Existe una amplia variación genética en las características del forraje tanto para la planta entera de maíz como para el rastrojo (Geiger et al., 1992; Barriére et al., 2003).
Por lo tanto, mejorar la digestibilidad es un objetivo importante para los programas de mejoramiento de maíz forrajero. La energía suministrada por el forraje a la dieta de un animal rumiante o herbívoro está relacionada con la ingestibilidad y digestibilidad del forraje. La digestibilidad de cualquier componente del forraje (materia seca, materia orgánica o pared celular) se mide como porcentaje de ensilaje absorbido en el tracto digestivo del animal (Barriére et al., 2003). La digestibilidad general del maíz forrajero se ve afectada por la fracción altamente digestible del grano y el rastrojo. La composición y la digestibilidad del rastrojo limitan la calidad del maíz forrajero. Las principales fracciones de rastrojos son las hemicelulosas, la celulosa y las ligninas. Los cultivares modernos de maíz forrajero combinan un alto rendimiento de materia seca con una alta digestibilidad del rastrojo.
Es demasiado costoso realizar mediciones de digestibilidad con animales, especialmente cuando se realiza una evaluación a gran escala de germoplasma en programas de fitomejoramiento. Se han desarrollado métodos biológicos y químicos para evaluar la digestibilidad del maíz y otros cultivos forrajeros (Van Soest et al., 1963). La fibra detergente neutra (NDF), el residuo después de eliminar el contenido soluble de las células, es un indicador importante de la pared celular y la celulosa de las plantas. La digestibilidad in vitro de la NDF (IVNDFD) de los forrajes es una estimación de la digestibilidad de la pared celular asumiendo que la parte del material vegetal que no es de n Df es completamente digerible (Méchin et al. 2000). Además, se ha informado que el uso de NIRS mide con precisión las características de digestibilidad en muchos cultivos forrajeros, incluido el maíz (Lübberstedt et al., 1997a, b; Zimmer et al., 1990).
Lübberstedt et al. (1997a, b) publicaron por primera vez QTL relacionados con las características agronómicas y de calidad del maíz forrajero, y QTL para la digestibilidad de toda la planta. La explotación de la variación genética disponible para la digestibilidad del rastrojo mediante la selección asistida por marcadores (MAS) parece ser una forma prometedora de mejorar la digestibilidad del forraje. Además de la variación genética, la variación ambiental podría ser la razón de esos rasgos inconsistentes. Los análisis de QTL de las características del forraje en cuatro poblaciones de maíz diferentes revelaron solo unos pocos QTL que mostraban interacciones epistáticas o interacciones con el medio ambiente (Lübberstedt et al., 1998). Se detectaron siete QTL para DNDF mediante el uso de 242 RIL derivados del cruce F838 x F286 que se evaluaron en experimentos de valor propio de por sí valiosos en seis entornos, y se encontraron dos QTL principales (Barriére et al., 2010). Se realizaron análisis de QTL adicionales mediante el uso de progenie RIL derivada de un cruce entre una línea antigua dentada y una línea dentada moderna, y se informaron por primera vez nuevos QTL en los contenedores 2.06 y 5.04 para ADL/NDF y DNDF (Barriére et al. 2012).
Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención abordar una o más de las deficiencias de la técnica anterior. Existe una necesidad persistente de mejorar la digestibilidad de los cultivos forrajeros, así como la identificación de plantas, incluidas partes o derivados de plantas particulares que tengan una mayor digestibilidad. En particular, es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevos QTL principales para la digestibilidad y el gen o genes causantes y la provisión de marcadores que permitan el uso económico de estos QTL en el desarrollo y mejoramiento del maíz.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en la identificación de un QTL principal para la digestibilidad de las plantas, así como en la identificación de un gen F35H enlazado y responsable del q Tl para la digestibilidad de las plantas y la descripción de un haplotipo marcador único para mejorar la digestibilidad.
Se han identificado marcadores moleculares que están asociados con la digestibilidad de las plantas y se describen alelos marcadores asociados con una digestibilidad mejorada. Uno de los alelos marcadores descritos es un gen F35H mutado.
La invención en particular se refiere a métodos para detectar el alelo de QTL identificado asociado con una digestibilidad mejorada, así como a la detección de cualquiera de los alelos marcadores descritos. La invención se refiere además a los alelos marcadores y ácidos polinucleicos descritos útiles para la detección de los alelos
marcadores, tales como cebadores y sondas, y kits que los comprenden. La invención se refiere además a métodos para mejorar la digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz, en particular mediante la introducción artificial en las plantas y/o la selección de plantas que comprenden los alelos marcadores descritos en el presente documento, como en particular la inducción de mutaciones de F35H, preferiblemente mutaciones que alteran expresión de F35H o la actividad enzimática de F35H, por ejemplo, reducir o eliminar la expresión de F35H o la actividad de F35H o bien reducir la expresión de F35H o la actividad de F35H, o aumentar la actividad de F35H. La invención se refiere además a plantas de maíz con digestibilidad mejorada, así como partes de plantas, en particular rastrojo, con digestibilidad mejorada, en la que la planta de maíz o parte de una planta de maíz no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.
La presente invención está capturada en particular por una cualquiera o cualquier combinación de uno o más de los siguientes elementos numerados [01] a [25], con cualquier otro elemento y/o realizaciones.
Un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada que comprende
(i) opcionalmente, aislar material genético, preferiblemente material genético, de al menos una célula de la planta o parte de la planta;
(ii) a) detección de la presencia de un alelo de QTL, tal como un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (p. proteína F35H) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, o
(ii) b) detección de la expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H o una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H con actividad enzimática reducida, o
(ii) c) detección de la presencia de una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H (como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción;
(iii) opcionalmente, seleccionar la planta o parte de la planta en la que está presente el QTL o la mutación o en la que se reduce o elimina la expresión del ARNm y/o la proteína F35H o se reduce la actividad enzimática de F35H;
en el que la digestibilidad mejorada se refiere a una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b) o c) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica; y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3;
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
El método de acuerdo con el punto [01], en el que el método comprende la detección de la presencia del alelo marcador molecular ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
Una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada que comprende un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a la expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida
tras la traducción; o una planta de maíz o parte de una planta de maíz que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción; o una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H o que tiene actividad enzimática reducida; o una planta de maíz o parte de una planta de maíz que comprende una molécula de ARNi, tal como ARNbc, ARNpi, ARNph o miARN, dirigida contra, que se dirige o que hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína F35H, o que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica (y expresa o es capaz de expresar) una molécula de a Rní dirigida contra, que se dirige a o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína F35H; o una planta de maíz o parte de una planta de maíz que comprende un sistema CRISPR/Cas específico de ARN, tal como un sistema CRISPR/Cas13a, dirigido contra o que se dirige a una secuencia de nucleótidos que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican (y expresan o son capaces de expresar) dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas;
en el que la planta de maíz o parte de la planta de maíz no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.
La planta de maíz o parte de una planta de maíz de acuerdo con el punto [03] que comprende el alelo marcador de ma61134xxx.
La planta de maíz o parte de una planta de maíz de acuerdo con el punto [03] o [04], en la que dicha planta comprende dicho alelo de QTL, dicho alelo marcador, dicha secuencia de nucleótidos del gen que codifica el flavonoide 3',5-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene la mutación, codificando dicha molécula de ARNi o dicha secuencia de polinucleótidos (y expresando o siendo capaz de expresar) la molécula de ARNi, dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN y/o dichas una o más secuencias de polinucleótidos que codifican (y que expresan o son capaces de expresar) el sistema CRISPR/Cas específico de ARN como transgén o como (gen) endógeno editado.
Un método para mejorar la digestibilidad de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, que comprende la introducción a través de una integración estable o transitoria por medio de transformación, inserción usando tecnología de edición de genes o modificación usando mutagénesis aleatoria o dirigida en el genoma de la planta o parte de la planta
(a) una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una flavonoide 3',5-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción.
Un método para mejorar la digestibilidad de una planta o parte de una planta, que comprende reducir la expresión del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H, reduciendo la actividad enzimática de un flavonoide 3',5-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a) o b) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
El método de acuerdo con el punto [07], que comprende
(a) introducir en una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno que codifica el flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 (en el genoma de la planta o de la parte de la planta) una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción, o
(b) introducir en la planta o en la parte de la planta una molécula de ARNi, tal como ARNbc, ARNpi, ARNph o miARN, dirigida contra, que se dirige a, o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una secuencia de polinucleótidos que codifica (y expresa o es capaz de expresar) una molécula de ARNi dirigida contra, que se dirige a, o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o
(c) introducir en la planta o la parte de la planta un sistema CRISPR/Cas específico de ARN, tal como un sistema CRISPR/Cas13a, dirigido contra o que se dirige a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican (y expresan o son capaces de expresar) dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN, o
(d) introducir en la planta o parte de la planta un compuesto químico o un anticuerpo que reduzca (o sea capaz de reducir) la actividad enzimática de la proteína F35H o inhiba (o sea capaz de inhibir) la actividad enzimática de la proteína F35H tras la interacción con dicho F35H.
Un método para producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, que comprende
(a) introducir mediante integración estable o transitoria mediante transformación, inserción usando tecnología de edición de genes o modificación mediante mutagénesis aleatoria o dirigida en el genoma de una planta o parte de una planta una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, o
(b) introducir mediante modificación utilizando mutagénesis aleatoria o dirigida en una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno que codifica el flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 (en el genoma de la planta o una parte de la planta) una mutación que conduce a la expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción, o
(c) introducir a través de integración estable o transitoria por medio de transformación o inserción utilizando tecnología de edición de genes en la planta o la parte de la planta una molécula de ARNi, tal como ARNbc, ARNpi, ARNph o miARN, dirigida contra, que se dirige a, o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una secuencia de polinucleótidos que codifica (y que expresa o es capaz de expresar) una molécula de ARNi dirigida contra, que se dirige a, o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o
(d) introducir mediante integración estable o transitoria por medio de transformación o inserción utilizando tecnología de edición de genes en la planta o la parte de la planta un sistema CRISPR/Cas específico de ARN, tal como un sistema CRISPR/Cas13a, dirigido contra, o que se dirige a, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican (y expresan o son capaces de expresar) dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN, o
(e) introducir en la planta o parte de la planta un compuesto químico o un anticuerpo que reduzca (o sea capaz de reducir) la actividad enzimática de la proteína F35H tras la interacción con dicha F35H; y
(f) opcionalmente, regenerar una planta a partir de la parte de la planta de cualquiera de (a) a (e);
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
Una planta o parte de una planta producida por el método de acuerdo con el punto [9].
Una progenie de la planta de acuerdo con cualquiera de los puntos [03] a [05] o [10].
El método, planta o parte de la planta de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha planta es una planta de maíz, el QTL está ubicado en el cromosoma 9 y comprende y/o está flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01.
El método, la planta o la parte de la planta de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que ma61134xxx es una inserción de uno o más nucleótidos entre las posiciones 134254381 y 134254382 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, preferiblemente una inserción como se establece en la SEQ ID NO: 12; y/o ma61070s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 121588825 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en la que dicho nucleótido es A o T, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 13; y/o ma30168s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 139452428 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en la que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 14; y/o ma50827s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 127454426 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en la que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la Se Q ID NO: 15; y/o ma16983s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 137363784 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en la que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 16; y/o ma17117s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 132038900 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en la que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 17; y/o ma61125s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 135947973 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en la que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 18
El método, la planta o la parte de la planta de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que la mutación es una mutación de marco de lectura o una mutación no sentido, da como resultado una expresión alterada de la secuencia de nucleótidos o una actividad enzimática alterada de la proteína codificada, preferiblemente en una expresión reducida o ausente de la secuencia de nucleótidos o una actividad enzimática reducida de la proteína codificada o una actividad enzimática aumentada de la proteína codificada, da como resultado una secuencia de proteína alterada codificada por la secuencia de nucleótidos, o es una inserción, eliminación o sustitución de al menos un nucleótido en una región codificante, en una señal de empalme o en un elemento regulador de dicha secuencia de nucleótidos.
El método, planta o parte de la planta de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que la mutación es una inserción, preferiblemente en un exón, preferiblemente una inserción en el primer exón, de uno o más nucleótidos, preferiblemente una inserción de cambio de marco, más preferiblemente la inserción es de 187 nucleótidos o aproximadamente 187 nucleótidos y/o la inserción está entre la posición 97 y 98 del gen F35H representado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida particular, el F35H mutado comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11
El método, planta o parte de planta de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha parte de planta no es material de propagación.
El método, planta o parte de planta de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que dicha parte de la planta es rastrojo.
El método, la planta o la parte de la planta de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que la planta es o la parte de la planta es de maíz.
Un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), que se hibrida específicamente con cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18, o el complemento o el complemento inverso de las mismas.
Uso del ácido polinucleico de acuerdo con el punto [19] o ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), para la identificación de una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada o para la selección de una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada de acuerdo con uno cualquiera de los puntos [03] a [05], preferiblemente en el método de acuerdo con el punto [01] o [02], en el que preferiblemente el ácido polinucleico es adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso para un locus en un intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada, en el que el intervalo cromosómico está en el cromosoma 9 y flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01.
Un método para producir un material vegetal ensilado o alimento para animales que tiene una digestibilidad mejorada, que comprende
(a) cultivar la planta de acuerdo con cualquiera de los puntos [03] a [05] u [11] o una planta identificada o identificable por el método de las reivindicaciones 1 o 2,
(b) cosechar la planta o una parte de ella,
(c) opcionalmente, trocear y/o triturar la planta o una parte de ella, y
(d) ensilar la planta o una parte de la misma de (b) o (c), opcionalmente añadiendo un estimulante como un inoculante bacteriano, un azúcar y una enzima.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Efectos de la DNDF (fibra detergente neutra digestible) de QTL en el cromosoma 9 del maíz (Zea mays). Identificación de un QTL fuerte para la digestibilidad en el cromosoma 9. Se indica el porcentaje de DNDF del rastrojo de maíz.
Figura 2: Posiciones de loci marcadores para QTL de ensilaje. SeqCapture ha encontrado marcadores con base en AGPv02 y WGS (secuenciación del genoma completo) de la línea de QTL y la comparación con la referencia PH207. Figura 3: Región genética finamente mapeada de QTL de ensilaje por marcadores moleculares en diferentes genotipos recombinantes.
Figura 4: Alineación de la secuencia de nucleótidos de un gen de referencia F35H y un gen F35H mutado de acuerdo con una realización de la invención.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir el presente sistema y método de la invención, debe entenderse que esta invención no se limita a sistemas y métodos o combinaciones particulares descritos, ya que tales sistemas, métodos y combinaciones pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en este documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen tanto los referentes en singular como en plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
Los términos "que comprende", "comprende" y "comprendido por" tal como se utilizan en este documento son sinónimos de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene" y son inclusivos o abiertos y no excluyen miembros, elementos o etapas del método adicionales no mencionados. Se apreciará que los términos "que comprende", "comprende" y "comprendido por" tal como se utilizan en el presente documento comprenden los términos "que consiste en", "consiste" y "consiste en", así como los términos "que consiste esencialmente en", "consiste esencialmente" y "consiste esencialmente en".
La mención de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los números y fracciones incluidos dentro de los respectivos intervalos, así como los puntos finales mencionados.
El término "aproximado" o "aproximadamente", como se usa en este documento cuando se refiere a un valor medible tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de /- 20 % o menos, preferiblemente /-10 % o menos, más preferiblemente /- 5 % o menos, y aún más preferiblemente /-1 % o menos y del valor especificado, en la medida en que tales variaciones sean apropiadas para realizar en la invención divulgada. Debe entenderse que el valor al que se refiere el modificador "aproximada" o "aproximadamente" también se describe de forma específica y preferiblemente.
Mientras que los términos "uno o más" o "al menos uno", tal como uno o más o al menos uno o unos miembros de un grupo de miembros, es claro en sí mismo, por medio de una mayor ejemplificación, el término abarca, entre otras cosas una referencia a cualquiera de dichos miembros, o a dos o más de dichos miembros, tales como, por ejemplo, cualquiera >3, >4, >5, >6 o >7, etc. de dichos miembros, y hasta todos de dichos miembros.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos utilizados en la divulgación de la invención, incluidos los términos técnicos y científicos, tienen el significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que
pertenece esta invención. A modo de orientación adicional, se incluyen definiciones de términos para apreciar mejor las enseñanzas de la presente invención. Trabajos de referencia estándar que establecen los principios generales de tecnología de ADN recombinante incluyen Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) ("Ausubel et al. 1992"); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990; PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995); Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; y Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987). Los principios generales de la microbiología se exponen, por ejemplo, en Davis, B. D. et al., Microbiology, 3a ed., Harper & Row publishers, Filadelfia, Pensilvania (1980).
En los siguientes pasajes, se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización de la presente invención. Por lo tanto, la aparición de la frase "en una realización" en varios lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refiere necesariamente a la misma realización, pero puede. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada, como será evidente para un experto en la materia a partir de esta divulgación, en una o más realizaciones. Además, aunque algunas realizaciones descritas en el presente documento incluyen algunas pero no otras características incluidas en otras realizaciones, las combinaciones de características de diferentes realizaciones están destinadas a estar dentro del alcance de la invención y forman diferentes realizaciones, como entenderán los expertos en la técnica. Por ejemplo, en las reivindicaciones adjuntas, cualquiera de las realizaciones reivindicadas puede usarse en cualquier combinación.
En la siguiente descripción detallada de la invención, se hace referencia a los dibujos adjuntos que forman parte de la misma, y en los que se muestran a modo de ilustración únicamente realizaciones específicas en las que se puede poner en práctica la invención. Debe entenderse que pueden utilizarse otras realizaciones y pueden realizarse cambios estructurales o lógicos sin apartarse del alcance de la presente invención. La siguiente descripción detallada, por lo tanto, no debe tomarse en un sentido limitativo, y el alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
Los elementos (características) y realizaciones preferidas de esta invención se establecen a continuación. Cada uno de los elementos y realizaciones de la invención así definidos puede combinarse con cualquier otro elemento y/o realizaciones a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otro rasgo o característica o elemento indicados como preferidos o ventajosos.
Como se usa en este documento, "maíz" se refiere a una planta de la especie Zea mays, preferiblemente Zea mays ssp mays.
Como se usa en este documento, "sorghum" se refiere a una planta del género Sorghum, e incluye, sin limitación Sorghum bicolor, Sorghum sudanense, Sorghum bicolor x Sorghum sudanense, Sorghum x almum (Sorghum bicolor x Sorghum halepense), Sorghum bicolor x Sorghum halepense, Sorghum x drummondii, Sorghum halepense y/o Sorghum propinquum.
Como se usa en este documento, "caña de azúcar" se refiere a una planta de la especie Saccharum officinarum.
El término "planta" incluye plantas enteras, incluidos los descendientes o descendientes de las mismas. El término "parte de la planta" incluye cualquier parte o derivado de la planta, incluidos tejidos o estructuras vegetales particulares, células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de células o tejidos vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas, callos de plantas, grupos de plantas y células vegetales que están intactos en plantas o partes de plantas, tales como semillas, granos, mazorcas, flores, cotiledones, hojas, tallos, yemas, raíces, puntas de raíces, rastrojos y similares. Las partes de plantas pueden incluir partes o derivados de plantas procesadas, que incluyen flores, aceites, extractos, etc. En ciertas realizaciones la parte o derivado de planta como se menciona en el presente documento es rastrojo.
Rastrojo, como se usa en este documento, tiene su significado habitual conocido en la técnica. A modo de orientación adicional, y sin limitación, el rastrojo puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en hojas y tallos de cultivos de campo, tales como el maíz o el sorgo, que comúnmente se dejan en un campo después de cosechar el grano, o como caña de azúcar. El rastrojo también puede incluir mazorcas (por ejemplo, el núcleo central de una mazorca de maíz, sin los granos). El rastrojo también puede excluir las mazorcas. El rastrojo también puede incluir vainas o cascarillas (por ejemplo, la cubierta exterior frondosa de una mazorca de maíz). El rastrojo también puede excluir vainas o cascarillas. El rastrojo es similar a la paja, el residuo que queda después de que cualquier grano de cereal o pasto haya sido cosechado en la madurez para su semilla. Puede ser pastoreado directamente por el ganado
o secado para su uso como forraje. El rastrojo (de maíz) se puede usar como alimento, ya sea pastoreado como forraje, picado como ensilaje para usarlo más tarde como forraje, o recolectado para uso forrajero directo (no ensilado). El forraje de maíz generalmente se ensila en regiones más frías, pero se puede cosechar durante todo el año en los trópicos y alimentar a los animales como forraje verde. En el caso de uso de ensilaje, es habitual que toda la planta (grano y rastrojo juntos) se corte en pedazos que luego se trituran entre rodillos durante la cosecha. Además de los tallos, hojas, cáscaras y mazorcas que quedan en el campo, también pueden quedar núcleos de grano de la cosecha. Estos granos sobrantes, junto con el rastrojo de maíz, sirven como fuente adicional de alimento para el ganado en pastoreo.
En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta comprende, consiste en, o consiste esencialmente en uno o más, preferiblemente todos entre, tallos, hojas y mazorcas. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta son hojas. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta son tallos. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta son mazorcas. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta comprende, consiste en, o consiste esencialmente en uno o más, preferiblemente todos entre, tallos y hojas. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta comprende, consiste en, o consiste esencialmente en uno o más, preferiblemente todos, entre tallos y mazorcas. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta comprende, consiste en, o consiste esencialmente en una o más, preferiblemente todos, entre hojas y mazorcas. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta no es material de propagación (funcional), tal como germoplasma, semilla o embrión de planta u otro material a partir del cual se puede regenerar una planta. En ciertas realizaciones, la parte o derivado de la planta no comprende órganos reproductores masculinos y femeninos (funcionales). En determinadas realizaciones, la parte o el derivado de la planta es o comprende material de propagación, pero material de propagación que no se usa o no se puede usar (más) para producir o generar nuevas plantas, tal como material de propagación que se ha convertido química, mecánicamente o de otro modo en no funcionales, por ejemplo mediante tratamiento térmico, tratamiento con ácido, compactación, trituración, troceado, ensilaje, etc.
Como se usa en el presente documento, "digestibilidad" se refiere y se mide como porcentaje de producto (tal como una planta de maíz, sorgo o caña de azúcar o parte o derivado de una planta, incluidos, por ejemplo, materia seca, materia orgánica o pared celular del producto) absorbido en el tracto digestivo animal (Barriére et al. 2003). Se han desarrollado métodos biológicos y químicos para evaluar la digestibilidad del maíz y otros cultivos forrajeros (Van Soest et al., 1963). La fibra detergente neutra (NDF), el residuo después de eliminar el contenido soluble de las células, es un indicador importante de la pared celular y la celulosa de las plantas. La digestibilidad in vitro de la NDF (IVNDFD) de los forrajes es una estimación de la digestibilidad de la pared celular asumiendo que la parte del material vegetal que no es NDF es completamente digerible (Méchin et al., 2000). Además, se ha informado que el uso de NIRS mide con precisión las características de digestibilidad en muchos cultivos forrajeros, incluido el maíz (Lübberstedt et al., 1997a, b; Zimmer et al., 1990). En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero. En ciertas realizaciones, el animal es un rumiante. En ciertas realizaciones, el animal es un herbívoro. En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero herbívoro.
La digestibilidad mejorada a la que se hace referencia en el presente documento se refiere al aumento de la digestibilidad de una planta o parte de una planta o derivado que tiene una característica de acuerdo con la invención, tal como una mutación, marcador, SNP o QTL, como se describe en este documento en otro lugar, en comparación con una planta o parte de una planta o derivado que no tenga tal característica. En determinadas realizaciones, una digestibilidad mejorada o aumentada se refiere a un aumento en el DNDF medio en al menos un 1 %, tal como al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 6 %, al menos el 7 %, al menos el 8 %, al menos el 9 % o al menos el 10 %, preferiblemente al menos el 2 %, más preferiblemente al menos el 3 %, tal como al menos el 4 %.
El término "locus" (plural loci) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma en el que, por ejemplo, se encuentra un QTL, un gen o un marcador genético. Como se usa en el presente documento, el término "locus de rasgos cuantitativos" o "QTL" tiene su significado habitual conocido en la técnica. Por medio de orientación adicional, y sin limitación, un QTL puede referirse a una región de ADN que está asociada con la expresión diferencial de un rasgo fenotípico cuantitativo en al menos un trasfondo genético, por ejemplo, en al menos una población reproductora. La región del QTL engloba o está íntimamente ligada al gen o genes que afectan al rasgo en cuestión. Un "alelo de un QTL" puede comprender múltiples genes u otros factores genéticos dentro de una región genómica contigua o grupo de enlace, tal como un haplotipo. Un alelo de un QTL puede indicar un haplotipo dentro de una ventana específica en la que dicha ventana es una región genómica contigua que puede definirse y rastrearse con un conjunto de uno o más marcadores monomórficos y/o polimórficos. Un haplotipo se puede definir por la huella digital única de los alelos en cada marcador dentro de la ventana especificada. Un QTL puede codificar para uno o más alelos que afectan la expresividad de un fenotipo distribuido continuamente (cuantitativo). En ciertas realizaciones, el QTL como se describe en el presente documento puede ser homocigoto. En ciertas realizaciones, el QTL como se describe en el presente documento puede ser heterocigoto.
Como se usa en el presente documento, el término "alelo" o "alelos" se refiere a una o más formas alternativas, es decir, diferentes secuencias de nucleótidos, de un locus.
Como se usa en el presente documento, el término "alelos mutantes" o "mutación" de alelos incluye alelos que tienen una o más mutaciones, tales como inserciones, eliminaciones, codones de parada, cambios de base (por ejemplo,
transiciones o transversiones) o alteraciones en uniones de empalme/sitios de señal de empalme, que pueden o no dar lugar a productos genéticos alterados. Las modificaciones en los alelos pueden surgir en regiones codificantes o no codificantes (por ejemplo, regiones promotoras, exones, intrones o uniones de empalme).
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "introgresión", "introgresado" e "que introgresa" se refieren tanto a un proceso natural como artificial mediante el cual fragmentos cromosómicos o genes de una especie, variedad o variedad de cultivo se trasladan al genoma de otra especie, variedad o variedad de cultivo mediante cruzamiento de esas especies. El proceso puede completarse opcionalmente mediante retrocruzamiento con el padre recurrente. Por ejemplo, la introgresión de un alelo deseado en un locus específico puede transmitirse al menos a una progenie a través de un cruce sexual entre dos padres de la misma especie, en la que al menos uno de los padres tiene el alelo deseado en su genoma. Alternativamente, por ejemplo, la transmisión de un alelo puede ocurrir por recombinación entre dos genomas donantes, por ejemplo, en un protoplasto fusionado, en el que al menos uno de los protoplastos donantes tiene el alelo deseado en su genoma. El alelo deseado puede detectarse, por ejemplo, mediante un marcador que está asociado con un fenotipo, en un QTL, un transgén o similar. En cualquier caso, la descendencia que comprende el alelo deseado puede retrocruzarse repetidamente con una línea que tenga un ambiente genético deseado y seleccionarse para el alelo deseado, para dar como resultado que el alelo se fije en un ambiente genético seleccionado. "Fragmento de introgresión" o "segmento de introgresión" o "región de introgresión" se refiere a un fragmento cromosómico (o parte o región cromosómica) que se ha introducido en otra planta de la misma especie o de especies relacionadas, ya sea de forma artificial o natural, tal como por técnicas de cruzamiento o reproducción tradicional, tal como retrocruzamiento, es decir, el fragmento introgresado es el resultado de métodos de reproducción a los que se refiere el verbo "introgresar" (tal como retrocruzamiento). Se entiende que el término "fragmento de introgresión" nunca incluye un cromosoma completo, sino solo una parte de un cromosoma. El fragmento de introgresión puede ser grande, por ej., incluso tres cuartos o la mitad de un cromosoma, pero es preferiblemente más pequeño, tal como aproximadamente 50 Mb o menos, tal como aproximadamente 30 Mb o menos, aproximadamente 20 Mb o menos, aproximadamente 25 Mb o menos, aproximadamente 10 Mb o menos, aproximadamente 9 Mb o menos, aproximadamente 8 Mb o menos, aproximadamente 7 Mb o menos, aproximadamente 6 Mb o menos, aproximadamente 5 Mb o menos, aproximadamente 4 Mb o menos, aproximadamente 3 Mb o menos, aproximadamente 2.5 Mb o 2 Mb o menos, aproximadamente 1 Mb (igual a 1,000,000 de pares de bases) o menos, o aproximadamente 0.5 Mb (igual a 500,000 pares de bases) o menos, tal como aproximadamente 200,000 pb (igual a 200 kilopares de bases) o menos, aproximadamente 100,000 pb (100 kb) o menos, aproximadamente 50,000 pb (50 kb) o menos, aproximadamente 25,000 pb (25 kb) o menos.
Se dice que un elemento genético, un locus, un fragmento de introgresión, un QTL o un gen o alelo que confiere un rasgo (tal como digestibilidad mejorada) es "obtenible de" o puede "obtenerse de" o "derivable de" o puede "derivarse de" o "tal como está presente en" o "como se encuentra en" una planta o parte de una planta como se describe en este documento en otra parte si puede transferirse de la planta en la que está presente a otra planta en la que no está presente (tal como como una línea o variedad) utilizando técnicas tradicionales de reproducción sin que resulte en un cambio fenotípico de la planta receptora aparte de la adición del rasgo conferido por el elemento genético, locus, fragmento de introgresión, QTL, gen o alelo. Los términos se usan indistintamente y el elemento genético, el locus, el fragmento de introgresión, el QTL, el gen o el alelo pueden transferirse a cualquier otro ambiente genético que carezca del rasgo. No solo se pueden usar los componentes que comprenden el elemento genético, el locus, el fragmento de introgresión, el QTL, el gen o el alelo, sino también la progenie/descendientes de dichas plantas que han sido seleccionadas para retener el elemento genético, el locus, el fragmento de introgresión, el QTL, el gen o el alelo, se pueden usar y están incluidos en este documento. El experto en la materia puede determinar si una planta (o ADN genómico, célula o tejido de una planta) comprende el mismo elemento genético, locus, fragmento de introgresión, QTL, gen o alelo que puede obtenerse de dicha planta utilizando una o más técnicas conocidas en el arte, tales como ensayos fenotípicos, secuenciación del genoma completo, análisis de marcadores moleculares, mapeo de rasgos, descripción cromosómica, pruebas de alelismo y similares, o combinaciones de técnicas. Se entenderá que también pueden incluirse plantas transgénicas o modificadas genéticamente.
Tal como se usan en este documento, los términos "transformación" y "modificación transgénica" se usan todos en este documento como sinónimos de la transferencia de moléculas de ácido nucleico aisladas y clonadas al ADN, generalmente el ADN cromosómico o el genoma, de otro organismo/especie o del mismo organismo/especie pero en un lugar que difiere del lugar en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra naturalmente en el ADN cromosómico o genoma.
"Introducción" en el sentido de la presente invención incluye integración estable o transitoria por medio de transformación que incluye transformación mediada por Agrobacterium, transfección, microinyección, bombardeo biolístico, inserción utilizando tecnología de edición de genes tal como sistemas CRISPR (por ejemplo, CRISPR/Cas, en particular CRISPR/ Cas9 o CRISPR/Cpf1), CRISPR/CasX o CRISPR/CasY), TALEN, nucleasas o meganucleasas de dedos de zinc, recombinación homóloga opcionalmente mediante una de las tecnologías de edición de genes mencionadas a continuación, incluida preferiblemente una plantilla de reparación, modificación de genes endógenos utilizando mutagénesis aleatoria o dirigida tal como TILLING o la tecnología de edición de genes mencionada anteriormente, etc.
Los "organismos transgénicos" u "modificados genéticamente" (GMO) como se usan en este documento son organismos cuyo material genético ha sido alterado usando técnicas generalmente conocidas como "tecnología de
ADN recombinante". La tecnología de ADN recombinante abarca la capacidad de combinar moléculas de ADN de diferentes fuentes en una sola molécula ex vivo (por ejemplo, en un tubo de ensayo). Esta terminología generalmente no cubre los organismos cuya composición genética ha sido alterada por cruzamiento convencional o por "mutagénesis", ya que estos métodos son anteriores al descubrimiento de las técnicas de ADN recombinante. "No transgénico", tal como se usa en este documento, se refiere a plantas y productos alimenticios derivados de plantas que no son "transgénicos" u "organismos modificados genéticamente" como se definió anteriormente.
"Transgén" o "exógeno" se refiere a una molécula de ácido nucleico o un locus genético que comprende una secuencia de ADN, tal como un gen recombinante, que se ha introducido en el genoma de una planta mediante transformación, tal como la transformación mediada por Agrobacterium. Una planta que comprende un transgén integrado de forma estable en su genoma se denomina "planta transgénica". "Endógeno" se refiere a una molécula de ácido nucleico o un locus genético que ocurre naturalmente en el genoma de una planta. "Edición de genes" o "edición del genoma" se refiere a modificación genética en la que se inserta, elimina, modifica o reemplaza ADN o ARN en el genoma de un organismo. La edición de genes puede comprender mutagénesis dirigida o no dirigida (aleatoria). La mutagénesis dirigida se puede lograr, por ejemplo, con nucleasas de diseño, tal como por ejemplo con meganucleasas, nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de transcripción (TALEN) y el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR/Cas). Estas nucleasas crean roturas de doble cadena específicas del sitio (DSB) en las ubicaciones deseadas del genoma. Las roturas de doble cadena inducidas se reparan mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la recombinación homóloga (HR) o la reparación dirigida por homología (HDR), lo que da como resultado mutaciones dirigidas o modificaciones del ácido nucleico. El uso de nucleasas de diseño, opcionalmente junto con una plantilla de reparación/plantilla de recombinación, es particularmente adecuado para generar eliminaciones o inactivaciones de genes. En ciertas realizaciones, se desarrollan nucleasas de diseño que inducen específicamente una mutación en el gen F35H, como se describe en este documento en otra parte, para generar un F35H mutado o una eliminación del gen F35H. En determinadas realizaciones, se desarrollan nucleasas de diseño, en particular sistemas CRISPR/Cas específicos de ARN que se dirigen específicamente al ARNm de F35H, tal como para escindir el ARNm de F35H y generar una desactivación del gen/ARNm/proteína de F35H. Los sistemas de administración y expresión de los sistemas de nucleasas de diseño son bien conocidos en la técnica.
En ciertas realizaciones, la nucleasa o la nucleasa dirigida/específica del sitio/buscadora de blancos es, comprende, consiste esencialmente o consiste en un sistema o complejo CRISPR/Cas (modificado), una proteína Cas (modificada), un dedo de zinc (modificado), una nucleasa con dedos de zinc (modificada) (ZFN), un efector similar al factor de transcripción (TALE) (modificado), una nucleasa efectora similar al factor de transcripción (modificada) (TALEN), o una meganucleasa (modificada). En determinadas realizaciones, dicha nucleasa (modificada) o nucleasa dirigida/específica del sitio/buscadora de blancos es, comprende, consiste esencialmente en o consiste en una nucleasa guiada por ARN (modificada). Se entenderá que en ciertas realizaciones, las nucleasas pueden tener codones optimizados para la expresión en plantas. Como se usa en el presente documento, el término "direccionamiento" de una secuencia de ácido nucleico seleccionada significa que una nucleasa o complejo de nucleasa actúa de una manera específica de la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, en el contexto del sistema CRISPR/Cas, el ARN guía es capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico seleccionada. Como se usa en el presente documento, "hibridación" o "que hibrida" se refiere a una reacción en la que uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre las bases de los residuos de nucleótidos. El enlace de hidrógeno puede ocurrir por apareamiento de bases de Watson Crick, enlaces de Hoogstein o de cualquier otra manera específica de la secuencia. El complejo puede comprender dos cadenas que forman una estructura dúplex, tres o más cadenas que forman un complejo de múltiples cadenas, una única cadena que se hibrida consigo misma o cualquier combinación de éstas. Una reacción de hibridación puede constituir una etapa en un proceso más extenso, tal como el inicio de PGR o la escisión de un polinucleótido por una enzima. Una secuencia capaz de hibridarse con una secuencia dada se denomina "complemento" de la secuencia dada.
La edición de genes puede implicar la expresión transitoria, inducible o constitutiva de los componentes o sistemas de edición de genes. La edición de genes puede implicar la integración genómica o la presencia episomal de los componentes o sistemas de edición de genes. Los componentes o sistemas de edición de genes pueden proporcionarse en vectores, tales como plásmidos, que pueden administrarse mediante vehículos de administración apropiados, como se conoce en la técnica. Los vectores preferidos son los vectores de expresión.
La edición de genes puede comprender la provisión de plantillas de recombinación, para efectuar la reparación dirigida por homología (HDR). Por ejemplo, un elemento genético puede reemplazarse mediante la edición de genes en la que se proporciona una plantilla de recombinación. El ADN puede cortarse secuencia arriba y/o secuencia abajo de una secuencia que necesita ser reemplazada. Como tal, la secuencia a reemplazar se corta del ADN. A través de HDR, la secuencia extirpada se reemplaza luego por la plantilla. En ciertas realizaciones, el alelo de QTL de la invención como se describe en el presente documento puede proporcionarse en/como una plantilla. Al diseñar el sistema de manera que se introduzcan roturas de doble cadena secuencia arriba y/o secuencia abajo de la región correspondiente en el genoma de una planta que no comprende el alelo de QTL, esta región se corta y puede reemplazarse con la plantilla que comprende el alelo de QTL de la invención. De esta forma, la introducción del alelo de QTL de la invención en una planta no necesita implicar múltiples retrocruzamientos, en particular en una planta de antecedentes genéticos específicos. De manera similar, el f 35H mutado de la invención se puede proporcionar en/como una plantilla. Sin embargo, más ventajosamente, el F35H mutado de la invención puede generarse sin el uso de una plantilla de
recombinación, sino únicamente a través de la acción de la endonucleasa que conduce a una rotura de ADN bicatenario que es reparada por NHEJ, lo que da como resultado la generación de inserciones/eliminaciones.
En determinadas realizaciones, la modificación o mutación del ácido nucleico se efectúa mediante un sistema de nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (modificado) (TALEN). Los efectores similares a activadores de transcripción (TALE) se pueden diseñar para unir prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada. Ejemplos de métodos de edición del genoma utilizando el sistema TALEN se pueden encontrar, por ejemplo, en Cermak T. Doyle EL. Christian M. Wang L. Zhang Y. Schmidt C, et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 2011; 39: e82; Zhang F. Cong L. Lodato S. Kosuri S. Church GM. Arlotta P Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nat Biotechnol. 2011; 29: 149-153 y las patentes de los Estados Unidos n.° 8,450,471, 8,440,431 y 8,440,432. Por medio de orientación adicional, y sin limitación, los TALE de origen natural o "TALE de tipo silvestre" son proteínas de unión a ácido nucleico secretadas por numerosas especies de proteobacterias. Los polipéptidos TALE contienen un dominio de unión a ácido nucleico compuesto por repeticiones en tándem de polipéptidos monoméricos altamente conservados que tienen predominantemente 33, 34 o 35 aminoácidos de longitud y que difieren entre sí principalmente en las posiciones de los aminoácidos 12 y 13. En realizaciones ventajosas, el ácido nucleico es ADN. Tal como se usa en el presente documento, el término "monómeros polipeptídicos" o "monómeros TALE" se utilizará para referirse a las secuencias polipeptídicas repetitivas altamente conservadas dentro del dominio de unión al ácido nucleico TALE y el término "residuos dobles variables repetidos" o "RVD" se utilizará para referirse a los aminoácidos altamente variables en las posiciones 12 y 13 de los monómeros polipeptídicos. Tal como se proporciona a lo largo de la divulgación, los residuos de aminoácidos de los RVD se representan usando el código IUPAC de una sola letra para aminoácidos. Una representación general de un monómero TALE que está comprendido dentro del dominio de unión al ADN es X1-11-(X12X13)-X14-33 o 34 o 35, en el que el subíndice indica la posición del aminoácido y X representa cualquier aminoácido. X12X13 indican los RVD. En algunos monómeros polipeptídicos, el aminoácido variable en la posición 13 falta o está ausente y en dichos monómeros polipeptídicos, los RVD constan de un único aminoácido. En tales casos, los RVD pueden representarse alternativamente como X*, en el que X representa X12 y (*) indica que X13 está ausente. El dominio de unión al ADN comprende varias repeticiones de monómeros TALE y esto se puede representar como (X1-11-(X12X13)-X14-33 o 34 o 35)z, donde en una realización ventajosa, z es al menos 5 a 40. En otra realización ventajosa, z es al menos 10 a 26. Los monómeros TALE tienen una afinidad de unión a nucleótidos que está determinada por la identidad de los aminoácidos en sus RVD. Por ejemplo, los monómeros polipeptídicos con una RVD de NI se unen preferiblemente a la adenina (A), los monómeros polipeptídicos con una RVD de NG se unen preferiblemente a la timina (T), los monómeros polipeptídicos con una RVD de HD se unen preferiblemente a la citosina (C) y los monómeros polipeptídicos con un RVD de NN se unen preferiblemente tanto a la adenina (A) como a la guanina (G). En otra realización más de la invención, los monómeros polipeptídicos con un RVD de IG se unen preferiblemente a T. Por lo tanto, el número y el orden de las repeticiones del monómero polipeptídico en el dominio de unión del ácido nucleico de un TALE determina su especificidad objetivo de ácido nucleico. En aún otras realizaciones de la invención, los monómeros polipeptídicos con un RVD de NS reconocen los cuatro pares de bases y pueden unirse a A, T, G o C. La estructura y función de los TALE se describen adicionalmente, por ejemplo, en Moscou et al., Science 326:1501 (2009); Boch et al., Science 326: 1509-1512 (2009); y Zhang et al., Nature Biotechnology 29:149-153 (2011).
En determinadas realizaciones, la modificación o mutación del ácido nucleico se efectúa mediante un sistema de nucleasa con dedos de zinc (ZFN) (modificado). El sistema de ZFN utiliza enzimas de restricción artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión al ADN con dedos de zinc con un dominio de escisión de ADN que se puede diseñar para apuntar a las secuencias de ADN deseadas. Los ejemplos de métodos de edición del genoma utilizando ZFN se pueden encontrar, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos n.° 6,534,261, 6,607,882, 6,746,838, 6,794,136, 6,824,978, 6,866,997, 6,933,113, 6,979,539, 7,013,219, 7,030,215, 7,220,719, 7,241,573, 7,241,574, 7.585.849, 7.595.376, 6,903,185, y 6.479.626. Por medio de orientación adicional, y sin limitación, la tecnología de dedo de zinc (ZF) artificial involucra matrices de módulos de ZF para apuntar a nuevos sitios de unión al ADN en el genoma. Cada módulo de dedo en una matriz de ZF que se dirige a tres bases de ADN. Una matriz personalizada de dominios de dedos de zinc individuales se ensambla en una proteína de ZF (ZFP). Las ZFP pueden comprender un dominio funcional. Las primeras nucleasas con dedos de zinc (ZFN) sintéticas se desarrollaron fusionando una proteína de ZF con el dominio catalítico de la enzima de restricción de tipo IIS Fokl (Kim, Y. G. et al., 1994, Chimeric restriction endonuclease, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 883-887; Kim, Y. G. et al., 1996, Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160). Se puede lograr una mayor especificidad de escisión con una menor actividad fuera del objetivo mediante el uso de heterodímeros de ZFN emparejados, cada uno de los cuales se dirige a diferentes secuencias de nucleótidos separadas por un espaciador corto (Doyon, Y. et al., 2011, Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods 8, 74-79). Las ZFP también se pueden diseñar como activadores y represores de la transcripción y se han utilizado para dirigirse a muchos genes en una amplia variedad de organismos.
En determinadas realizaciones, la modificación del ácido nucleico se efectúa mediante una meganucleasa (modificada), que son endodesoxirribonucleasas caracterizadas por un gran sitio de reconocimiento (secuencias de ADN bicatenario de 12 a 40 pares de bases). Se puede encontrar un ejemplo de método para usar meganucleasas en las patentes de los Estados Unidos n.°: 8,163,514; 8,133,697; 8,021,867; 8,119,361; 8,119,381; 8,124,369; y 8,129,134.
En determinadas realizaciones, la modificación del ácido nucleico se efectúa mediante un sistema o complejo CRISPR/Cas (modificado). Con respecto a la información general sobre los sistemas CRISPR/Cas, sus componentes y el suministro de dichos componentes, incluidos métodos, materiales, vehículos de suministro, vectores, partículas y su fabricación y uso, incluidas las cantidades y formulaciones, así como las células eucariotas que expresan Cas9CRISPR/Cas9, eucariotas que expresan Cas-9 CRISPR/Cas, tales como un ratón, se hace referencia a: las patentes de los Estados Unidos n.° 8,999,641, 8,993,233, 8,697,359, 8,771,945, 8,795,965, 8,865,406, 8,871,445, 8,889,356, 8,889,418, 8,895,308, 8,906,616, 8,932,814, 8,945,839, 8,993,233 and 8,999,641; las publicaciones de patente de los Estados Unidos US 2014-0310830 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/105,031), US 2014-0287938 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/213,991), US 2014 0273234 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/293,674), US2014-0273232 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/290,575), US 2014-0273231 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/259,420), US 2014-0256046 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/226,274), US 2014-0248702 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/258,458), US 2014 0242700 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/222,930), US 2014-0242699 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/183,512), US 2014-0242664 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/104,990), US 2014-0234972 a 1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/183,471), US 2014-0227787 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/256,912), US 2014 0189896 a 1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/105,035), US 2014-0186958 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/105,017), US2014-0186919 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/104,977), US 2014-0186843 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/104,900), US 2014-0179770 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/104,837) y US 2014 0179006 A1 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/183,486), US 2014-0170753 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/183,429); US 2015-0184139 (solicitud de patente de los Estados Unidos con serial n.° 14/324,960); 14/054,414 solicitudes de patente europea EP 2 771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6), y EP 2 784 162 (EP14170383.5); y publicaciones de patente PCT WO 2014/093661 (PCT/US2013/074743), WO 2014/093694 (PCT/US2013/074790), WO 2014/093595 (PCT/US2013/074611), WO 2014/093718 (PCT/US2013/074825), WO 2014/093709 (PCT/US2013/074812), WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), WO 2014/093635 (PCT/US2013/074691), WO 2014/093655 (PCT/US2013/074736), WO 2014/093712 (PCT/US2013/074819), WO 2014/093701 (PCT/US2013/074800), WO 2014/018423 (PCT/US2013/051418), WO 2014/204723 (PCT/US2014/041790), WO 2014/204724 (PCT/US2014/041800), WO 2014/204725 (PCT/US2014/041803), WO 2014/204726 (PCT/US2014/041804), WO 2014/204727 (PCT/US2014/041806), WO 2014/204728 (PCT/US2014/041808), WO 2014/204729 (PCT/US2014/041809), WO 2015/089351 (PCT/US2014/069897), WO 2015/089354 (PCT/US2014/069902), WO 2015/089364 (PCT/US2014/069925), WO 2015/089427 (PCT/US2014/070068), WO 2015/089462 (PCT/US2014/070127), WO 2015/089419 (PCT/US2014/070057), WO 2015/089465 (PCT/US2014/070135), WO 2015/089486 (PCT/US2014/070175), PCT/US2015/051691, PCT/US2015/051830. También se hace referencia a las solicitudes provisionales de patente de los Estados Unidos 61/758,468; 61/802,174; 61/806,375; 61/814,263; 61/819,803 y 61/828.130, presentadas el 30 de enero de 2013; 15 de marzo de 2013; 28 de marzo de 2013; 20 de abril de 2013; 6 de mayo de 2013 y 28 de mayo de 2013 respectivamente. También se hace referencia a la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos 61/836,123, presentada el 17 de junio de 2013. Se hace referencia adicionalmente a las solicitudes de patentes provisionales de los Estados Unidos 61/835,931, 61/835,936, 61/835,973, 61/836,080, 61/836,101, y 61/836,127, cada uno presentado el 17 de junio de 2013. Se hace referencia adicional a las solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos 61/862,468 y 61/862,355 presentadas el 5 de agosto de 2013; 61/871,301 presentada el 28 de agosto de 2013; 61/960,777 presentada el 25 de septiembre de 2013 y 61/961,980 presentada el 28 de octubre de 2013. Se hace referencia aún más a: PCT/US2014/62558 presentado el 28 de octubre de 2014, y las solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos con seriales n.°: 61/915,148, 61/915,150, 61/915,153, 61/915,203, 61/915,251, 61/915,301, 61/915,267, 61/915,260, y 61/915,397, cada una presentada el 12 de diciembre de 2013; 61/757,972 y 61/768,959, presentada el 29 de enero de 2013 y 25 de febrero de 2013; 62/010,888 y 62/010,879, ambas presentadas el 11 de junio de 2014; 62/010,329, 62/010,439 y 62/010,441, cada una presentada el 10 de junio de 2014; 61/939,228 y 61/939,242, cada una presentado el 12 de febrero de 2014; 61/980,012, presentada el 15 de abril de 2014; 62/038,358, presentada el 17 de agosto de 2014; 62/055,484, 62/055,460 y 62/055,487, cada uno presentada el 25 de septiembre de 2014; y 62/069,243, presentada el 27 de octubre de 2014. Se hace referencia a la solicitud PCT que designa, entre otros, a la solicitud de los Estados Unidos, No. PCT/US14/41806, presentada el 10 de junio de 2014. Se hace referencia a la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos 61/930,214 presentada el 22 de enero de 2014. Se hace referencia a la solicitud PCT que designa, entre otros, a la solicitud de los Estados Unidos, n.° PCT/US14/41806, presentado el 10 de junio de 2014. También se hace mención a la solicitud de los Estados Unidos 62/180,709, 17-Jun-15, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); solicitud de los Estados Unidos 62/091,455, presentada el 12-Dic-14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); solicitud de los Estados Unidos 62/096,708, 24-Dic-14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); solicitudes de los Estados Unidos 62/091,462, 12-Dic-14, 62/096,324, 23-Dic-14, 62/180,681, 17-Jun-2015, y 62/237,496, 5-Oct-2015, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; solicitud de los Estados Unidos 62/091,456, 12-Dic-14 y 62/180,692, 17-Jun-2015, ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS; solicitud de los Estados Unidos 62/091,461, 12-Dic-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS (HSCs); solicitud de los Estados Unidos 62/094,903, 19-Dic-14, UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING; solicitud de
los Estados Unidos 62/096,761, 24-Dic-14, ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS FOR SEQUENCE MANIPULATION; solicitud de los Estados Unidos 62/098,059, 30-Dic-14, 62/181,641, 18-Jun-2015, y 62/181,667, 18-Jun-2015, RNATARGETING SYSTEM; solicitud de los Estados Unidos 62/096,656, 24-Dic-14 y 62/181,151, 17-Jun-2015, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH DESTABILIZATION DOMAINS; solicitud de los Estados Unidos 62/096,697, 24-Dic-14, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH AAV; solicitud de los Estados Unidos 62/098,158, 30-Dic-14, ENGINEERED CRISPR COMPLEX INSERTIONAL TARGETING SYSTEMS; solicitud de los Estados Unidos 62/151,052, 22-Abr-15, CELLULAR TARGETING FOR EXTRACELLULAR EXOSOMAL REPORTING; solicitud de los Estados Unidos 62/054,490, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS; solicitud de los Estados Unidos 61/939,154, 12-FEB-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; solicitud de los Estados Unidos 62/055,484, 25-Sep-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; solicitud de los Estados Unidos 62/087,537, 4-Dic-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; solicitud de los Estados Unidos 62/054,651, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; solicitud de los Estados Unidos 62/067,886, 23-Oct-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; solicitudes de los Estados Unidos 62/054,675, 24-Sep-14 y 62/181,002, 17-Jun-2015, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN NEURONAL CELLS/TISSUES; solicitud de los Estados Unidos 62/054,528, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN IMMUNE DISEASES OR DISORDERS; solicitud de los Estados Unidos 62/055,454, 25-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING CELL PENETRATION PEPTIDES (CPP); solicitud de los Estados Unidos 62/055,460, 25-Sep-14, MULTIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; solicitud de los Estados Unidos 62/087,475, 4-Dic-14 and 62/181,690, 18-Jun-2015, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; solicitud de los Estados Unidos 62/055,487, 25-Sep-14, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; solicitud de los Estados Unidos 62/087,546, 4-Dic-14 y 62/181,687, 18-Jun-2015, MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; y solicitud de los Estados Unidos 62/098,285, 30-Dic-14, CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS. Se hace mención a las solicitudes de los Estados Unidos 62/181,659, 18-Jun-2015 y 62/207,318, 19-Agosto-2015, ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS, ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS OF CAS9 ORTHOLOGS AND VARIANTS FOR SEQUENCE MANIPULATION. Se hace mención a las solicitudes de los Estados Unidos 62/181,663, 18-Jun-2015 y 62/245,264, 22-Oct-2015, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, solicitudes de los Estados Unidos 62/181,675, 18-Jun-2015, y documento de abogado n.° 46783.01.2128, presentado el 22-Oct-2015, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, solicitud de los Estados Unidos 62/232,067, 24-Sep- 2015, solicitud de los Estados Unidos 62/205,733, 16-Agosto-2015, solicitud de los Estados Unidos 62/201,542, 5-Agosto-2015, solicitud de los Estados Unidos 62/193,507, 16-Jul-2015, y solicitud de los Estados Unidos 62/181,739, 18-Jun-2015, cada una titulada NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS y de la solicitud de los Estados Unidos 62/245,270, 22-Oct-2015, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS. También se hace mención a la solicitud de los Estados Unidos 61/939,256, 12-Feb-2014, y el documento WO 2015/089473 (PCT/US2014/070152), 12-Dic-2014, cada uno titulado ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED GUIDE COMPOSITIONS WITH NEW ARCHITECTURES FOR SEQUENCE MANIPULATION. También se hace mención a la PCT/US2015/045504, 15-Agosto-2015, solicitud de los Estados Unidos 62/180,699, 17-Jun-2015, y a la solicitud de los Estados Unidos 62/038,358, 17-Agosto-2014, cada una titulada GENOME EDITING USING CAS9 NICKASES. Solicitud de patente europea EP3009511. Se hace referencia además a Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15; 339(6121): 819-23 (2013); RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. 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En ciertas realizaciones, el sistema o complejo CRISPR/Cas es un sistema CRISPR/Cas de clase 2. En ciertas realizaciones, dicho sistema o complejo CRISPR/Cas es un sistema o complejo CRISPR/Cas de tipo II, tipo V o tipo VI. El sistema CRISPR/Cas no requiere la generación de proteínas personalizadas para secuencias específicas, objetivo sino que una sola proteína Cas puede ser programada por una guía de ARN (ARNg) para reconocer un objetivo de ácido nucleico específico, en otras palabras, la proteína enzimática Cas puede ser reclutada para un locus objetivo de ácido nucleico específico (que puede comprender o consistir en ARN y/o ADN) de interés usando dicha guía corta de ARN.
En general, el sistema CRISPR/Cas o CRISPR es tal como se usa en este documento en los documentos anteriores se refiere colectivamente a las transcripciones y otros elementos involucrados en la expresión de o el direccionamiento de la actividad de los genes asociados a CRISPR ("Cas"), incluidas las secuencias que codifican un gen Cas y uno o más de, una secuencia tracr (CRISPR de activación trans) (por ejemplo, ARNtracr o un ARNtracr parcialmente activo), una secuencia compañera tracr (que abarca una "repetición directa" y una repetición directa parcial procesada por ARNtracr en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también conocida como "espadadora" en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), o "ARN(s)" como se usa ese término en este documento (por ejemplo, ARN(s) para guiar a Cas, tal como Cas9, por ejemplo, ARN CRISPR y, cuando corresponda, ARN transactivador (tracr) o un ARN guía único (ARNgu) (ARN quimérico)) u otras secuencias y transcripciones de un locus de CRISPR. En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia objetivo (también denominado protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la cual se diseña una secuencia guía para que tenga complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN.
En ciertas realizaciones, el ARNg es un ARN guía quimérico o un ARN guía único (ARNgu). En ciertas realizaciones, el ARNg comprende una secuencia guía y una secuencia compañera tracr (o repetición directa). En ciertas realizaciones, el ARNg comprende una secuencia guía, una secuencia compañera tracr (o repetición directa) y una secuencia tracr. En ciertas realizaciones, el sistema o complejo CRISPR/Cas como se describe en el presente documento no comprende y/o no depende de la presencia de una secuencia tracr (por ejemplo, si la proteína Cas es Cpf1).
Como se usa en el presente documento, el término "ARNcr" o "ARN guía" o "ARN guía único" o "ARNgu" o "uno o más componentes de ácido nucleico" de una proteína efectora del locus de CRISPR/Cas, según corresponda, comprende cualquier secuencia polinucleotídica que tenga complementariedad suficiente con una secuencia de ácido nucleico objetivo para hibridar con la secuencia de ácido nucleico objetivo y dirigir la unión específica de la secuencia de un complejo de direccionamiento de ácido nucleico a la secuencia de ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad, cuando se alinea de forma óptima utilizando un algoritmo de alineación adecuado, es aproximadamente o superior al 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 %, o más. El alineamiento óptimo se puede determinar con el uso de cualquier algoritmo adecuado para alinear secuencias, cuyos ejemplos no limitantes incluyen el algoritmo de Smith-Waterman, el algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmos basados en la transformada de Burrows-Wheeler (por ejemplo, el alineador de Burrows Wheeler), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponible en www.novocraft.com), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponible en soap.genomics.org.cn) y Maq (disponible en maq.sourceforge.net). La capacidad de una secuencia guía (dentro de un ARN guía dirigido a ácido nucleico) para dirigir la unión específica de secuencia de un complejo dirigido a ácido nucleico a una secuencia de ácido nucleico objetivo puede evaluarse mediante cualquier ensayo adecuado.
Se puede seleccionar una secuencia guía y, por lo tanto, un ARN guía dirigido a ácidos nucleicos para dirigirse a cualquier secuencia de ácido nucleico objetivo. La secuencia objetivo puede ser ADN. La secuencia objetivo puede ser ADN genómico. La secuencia objetivo puede ser ADN mitocondrial. La secuencia objetivo puede ser cualquier secuencia de ARN. En algunas realizaciones, la secuencia objetivo puede ser una secuencia dentro de una molécula
de ARN seleccionada del grupo que consiste en ARN mensajero (ARNm), pre-ARNm, ARN ribosomal (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), micro-ARN (miARN), ARN pequeño de interferencia (ARNpi), ARN nuclear pequeño (ARNnp), ARN nucleolar pequeño (ARNnop), ARN bicatenario (ARNbc), ARN no codificante (ARNnc), ARN largo no codificante (ARNInc) y ARN citoplasmático pequeño (ARNcp). En algunas realizaciones preferidas, la secuencia objetivo puede ser una secuencia dentro de una molécula de ARN seleccionada del grupo que consiste en ARNm, pre-ARNm y ARNr. En algunas realizaciones preferidas, la secuencia objetivo puede ser una secuencia dentro de una molécula de ARN seleccionada del grupo que consiste en ARNnc y ARNInc. En algunas realizaciones más preferidas, la secuencia objetivo puede ser una secuencia dentro de una molécula de ARNm o una molécula de pre-ARNm.
En ciertas realizaciones, el ARNg comprende un bucle de tallo, preferiblemente un bucle de tallo único. En ciertas realizaciones, la secuencia de repetición directa forma un bucle de tallo, preferiblemente un bucle de tallo único. En ciertas realizaciones, la longitud del espaciador del ARN guía es de 15 a 35 nt. En ciertas realizaciones, la longitud del espaciador del ARN guía es de al menos 15 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la longitud del espaciador es de 15 a 17 nt, por ejemplo, 15, 16 o 17 nt, de 17 a 20 nt, por ejemplo, 17, 18, 19 o 20 nt, de 20 a 24 nt, por ejemplo, 20, 21, 22, 23 o 24 nt, de 23 a 25 nt, por ejemplo, 23, 24 o 25 nt, de 24 a 27 nt, por ejemplo, 24, 25, 26 o 27 nt, de 27 a 30 nt, por ejemplo, 27, 28, 29 o 30 nt, de 30 a 35 nt, por ejemplo, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 nt, o 35 nt o más. En realizaciones particulares, el sistema CRISPR/Cas requiere un ARNtracr. La secuencia de "ARNtracr" o términos análogos incluye cualquier secuencia de polinucleótidos que tenga suficiente complementariedad con una secuencia de ARNcr para hibridar. En algunas realizaciones, el grado de complementariedad entre la secuencia de ARNtracr y la secuencia de ARNcr a lo largo de la más corta de las dos cuando se alinea de manera óptima es aproximadamente o más de aproximadamente 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97.5 %, 99 % o superior. En algunas realizaciones, la secuencia tracres aproximadamente o más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40 , 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia tracr y la secuencia de ARNg están contenidas en un solo transcrito, de modo que la hibridación entre los dos produce un transcrito que tiene una estructura secundaria, tal como una horquilla. En una realización de la invención, el transcrito o la secuencia polinucleotídica transcrita tiene al menos dos o más horquillas. En realizaciones preferidas, la transcripción tiene dos, tres, cuatro o cinco horquillas. En otra realización de la invención, el transcrito tiene como máximo cinco horquillas. En una estructura de horquilla, la parte de la secuencia 5' de la "N" final y secuencia arriba del bucle puede corresponder a la secuencia compañera tracr, y la parte de la secuencia 3' del bucle corresponde entonces a la secuencia tracr. En una estructura de horquilla, la parte de la secuencia 5' de la "N" final y secuencia arriba del bucle puede corresponder alternativamente a la secuencia tracr, y la parte de la secuencia 3' del bucle corresponde a la secuencia compañera tracr. En realizaciones alternativas, el sistema CRISPR/Cas no requiere un ARNtracr, como saben los expertos en la materia.
En ciertas realizaciones, el ARN guía (capaz de guiar a Cas a un locus objetivo) puede comprender (1) una secuencia guía capaz de hibridar con un locus objetivo y (2) una secuencia de repetición directa o compañera tracr (en orientación 5' a 3', o alternativamente en orientación 3' a 5', dependiendo del tipo de proteína Cas, como es conocido por el experto en la materia). En realizaciones particulares, la proteína CRISPR/Cas se caracteriza porque hace uso de un ARN guía que comprende una secuencia guía capaz de hibridar con un locus objetivo y una secuencia de repetición directa, y no requiere un ARNtracr. En realizaciones particulares, donde la proteína CRISPR/Cas se caracteriza porque hace uso de un ARNtracr, la secuencia guía, la compañera tracr y la secuencia tracr pueden residir en un solo ARN, es decir, un ARNgu (dispuesto en una orientación de 5' a 3' o alternativamente dispuesto en una orientación de 3' a 5'), o el ARN tracr puede ser un ARN diferente al ARN que contiene la guía y la secuencia compañera tracr. En estas realizaciones, la tracr se hibrida con la secuencia compañera tracr y dirige el complejo CRISPR/Cas a la secuencia objetivo.
Por lo general, en el contexto de un sistema endógeno dirigido a ácidos nucleicos, la formación de un complejo dirigido a ácidos nucleicos (que comprende un ARN guía hibridado con una secuencia objetivo y complejado con una o más proteínas efectoras dirigidas a ácidos nucleicos) da como resultado una modificación (tal como escisión) de una o ambas cadenas de ADN o ARN en o cerca (por ejemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 o más pares de bases) de la secuencia objetivo. Como se usa en el presente documento, el término "secuencia o secuencias asociadas con un locus de interés objetivo" se refiere a secuencias cercanas a la secuencia objetivo (por ejemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 20, 50 o más pares de bases de la secuencia objetivo, en el que la secuencia objetivo está comprendida dentro de un locus de interés objetivo). El experto conocerá los sitios de corte específicos para sistemas CRISPR/Cas seleccionados, en relación con la secuencia objetivo, que como se sabe en la técnica puede estar dentro de la secuencia objetivo o, alternativamente, 3' o 5' de la secuencia objetivo.
En algunas realizaciones, la proteína efectora dirigida a ácidos nucleicos no modificada puede tener actividad de escisión de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la nucleasa, tal como se describe en el presente documento, puede dirigir la escisión de una o ambas cadenas de ácido nucleico (ADN, ARN o híbridos, que pueden ser de una o dos cadenas) en la ubicación de o cerca de una secuencia objetivo, tal como dentro de la secuencia objetivo y/o dentro del complemento de la secuencia objetivo o en secuencias asociadas con la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la proteína efectora dirigida a ácidos nucleicos puede dirigir la escisión de una o ambas cadenas de ADN o ARN dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 o más pares de bases del primer o último nucleótido de una secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la escisión puede ser roma (por ejemplo, para Cas9, tal como SaCas9 o SpCas9). En algunas realizaciones, la escisión se puede escalonar (por ejemplo, para Cpf1), es decir, generar extremos cohesivos. En algunas realizaciones, la escisión es un corte
escalonado con una saliente 5'. En algunas realizaciones, la escisión es un corte escalonado con una saliente 5' de 1 a 5 nucleótidos, preferiblemente de 4 o 5 nucleótidos. En algunas realizaciones, el sitio de escisión está secuencia arriba del PAM. En algunas realizaciones, el sitio de escisión está secuencia abajo del PAM. En algunas realizaciones, la proteína efectora dirigida a ácidos nucleicos que puede estar mutada con respecto a una enzima correspondiente de tipo silvestre, de modo que la proteína efectora mutada dirigida a ácidos nucleicos carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de ADN o ARN de un polinucleótido objetivo que contiene una secuencia objetivo. Como ejemplo adicional, se pueden mutar dos o más dominios catalíticos de una proteína Cas (por ejemplo, RuvC I, RuvC II y RuvC III o el dominio HNH de una proteína Cas9) para producir una proteína Cas mutada que carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, se puede considerar que una proteína efectora dirigida a ácidos nucleicos carece sustancialmente de toda actividad de escisión de ADN y/o ARN cuando la actividad de escisión de la enzima mutada es de no más del 25 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0.1 %, 0.01 % o menos de la actividad de escisión del ácido nucleico de la forma no mutada de la enzima; un ejemplo puede ser cuando la actividad de escisión del ácido nucleico de la forma mutada es nula o insignificante en comparación con la forma no mutada. Como se usa en este documento, el término Cas "modificada" generalmente se refiere a una proteína Cas que tiene una o más modificaciones o mutaciones (incluyendo mutaciones puntuales, truncamientos, inserciones, eliminaciones, quimeras, proteínas de fusión, etc.) en comparación con la proteína Cas de tipo silvestre de la que se deriva. Por derivada se entiende que la enzima derivada se basa en gran medida, en el sentido de que tiene un alto grado de homología de secuencia con una enzima de tipo silvestre, pero que ha sido mutada (modificada) de alguna manera como se conoce en la técnica o como se describe en el presente documento.
En una realización particular, una proteína efectora mutada de direccionamiento de ácido nucleico basada en el sistema CRISPR como se describió anteriormente que carece de la capacidad de escindir una o ambas cadenas de ADN o ARN de un polinucleótido objetivo que contiene una secuencia objetivo puede fusionarse con otras herramientas como otras nucleasas, nickasas, recombinasas, transposasas, editores de bases o complejos moleculares que incluyen estas herramientas. Un "editor de bases", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína o un fragmento de la misma que tiene la misma actividad catalítica que la proteína de la que se deriva, dicha proteína o fragmento de la misma, sola o cuando se proporciona como complejo molecular, se denomina complejo de edición de bases en el presente documento, tiene la capacidad de mediar en una modificación de base dirigida, es decir, la conversión de una base de interés que da como resultado una mutación puntual de interés. Preferiblemente, al menos un editor de base en el contexto de la presente invención está enlazado temporal o permanentemente a al menos un efector específico del sitio, u opcionalmente a un componente de al menos un complejo efector específico del sitio (por ejemplo, dominio de reconocimiento de ADN del sistema CRISPR, dedos de zinc o efectores TAL). El enlace puede ser covalente y/o no covalente.
Múltiples publicaciones han demostrado la conversión dirigida de bases, principalmente citidina (C) en timina (T), utilizando una nickasa CRISPR/Cas9 o una nucleasa no funcional unida a un dominio de citidina desaminasa, polipéptido catalítico de edición de ARNm de apolipoproteína B (APOBEC1), por ejemplo, APOBEC derivado de rata. La desaminación de la citosina (C) es catalizada por las citidina desaminasas y da como resultado uracilo (U), que tiene las propiedades de apareamiento de bases de timina (T). La mayoría de las citidina desaminasas conocidas operan en el ARN, y los pocos ejemplos que se sabe que aceptan a Dn requieren ADN monocatenario (mc). Los estudios sobre el complejo de ADN objetivo dCas9 revelan que al menos nueve nucleótidos (nt) de la cadena de ADN desplazada se desaparean tras la formación del complejo 'R-bucle' de ARN-ADN guía de Cas9 (Jore et al., Nat. Struct. mol. Biol., 18, 529-536 (2011)). De hecho, en la estructura del complejo R-bucle de Cas9, los primeros 11 nt del protoespaciador en la cadena de ADN desplazada están desordenados, lo que sugiere que su movimiento no está muy restringido. También se ha especulado que las mutaciones inducidas por la nickasa Cas9 en las citosinas en la cadena que no es plantilla podrían surgir de su accesibilidad por las enzimas citosina desaminasas celulares. Se razonó que un subconjunto de este tramo de ADNmc en el R-bucle podría servir como sustrato eficaz para una citidina desaminasa unida a dCas9 para efectuar la conversión directa y programable de C a U en el ADN (Komor et al., citado anteriormente). Recientemente, Goudelli et al., ((2017). Programmable base editing of A^ T to G ^C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464) describieron editores de base de adenina (ABE) que median la conversión de A^T en G^C en el ADN genómico.
Cualquier complejo de edición de bases de acuerdo con la presente invención puede comprender por lo menos una citidina desaminasa, o un fragmento catalíticamente activo de la misma. Al menos un complejo de edición de bases puede comprender la citidina desaminasa, o un dominio de la misma en forma de un fragmento catalíticamente activo, como editor de bases.
En otra realización, al menos una primera modificación de base dirigida es una conversión de cualquier nucleótido C, A, T o G, a cualquier otro nucleótido. Cualquiera de los nucleótidos C, A, T o G puede intercambiarse de forma dirigida al sitio mediante la mediación de un editor de base, o un fragmento catalíticamente activo del mismo, a otro nucleótido. Por lo tanto, al menos un complejo de edición de bases puede comprender cualquier editor de bases, o un dominio editor de bases o un fragmento catalíticamente activo del mismo, que puede convertir un nucleótido de interés en cualquier otro nucleótido de interés de forma dirigida.
En ciertas realizaciones, la secuencia objetivo para CRISPR/Cas debe asociarse con un PAM (motivo adyacente al protoespaciador) o PFS (secuencia o sitio flanqueante del protoespaciador); es decir, una secuencia corta reconocida por el complejo CRISPR. Los requisitos precisos de secuencia y longitud para el PAM difieren de acuerdo con la
enzima CRISPR utilizada, pero los PAM suelen ser secuencias de 2 a 5 pares de bases adyacentes al protoespaciador (es decir, la secuencia objetivo). Se dan ejemplos de secuencias PAM en la sección de ejemplos a continuación, y el experto en la materia podrá identificar secuencias PAM adicionales para usar con una enzima CRISPR dada. Además, la modificación del dominio de interacción con PAM (PI) puede permitir la programación de la especificidad de PAM, mejorar la fidelidad del reconocimiento del sitio objetivo y aumentar la versatilidad de Cas, por ej., Cas9, plataforma de modificación del genoma. Las proteínas Cas, tales como las proteínas Cas9, pueden modificarse para alterar su especificidad PAM, por ejemplo, como se describe en Kleinstiver BP et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5. doi: 10.1038/nature14592. En algunas realizaciones, el método comprende permitir que un complejo CRISPR se una al polinucleótido objetivo para efectuar la escisión de dicho polinucleótido objetivo modificando así el polinucleótido objetivo, en el que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con una secuencia guía hibridada con una secuencia objetivo dentro de dicho polinucleótido objetivo, en el que dicha secuencia guía está unida a una secuencia compañera tracr que a su vez se hibrida con una secuencia tracr. El experto en la materia comprenderá que otras proteínas Cas pueden modificarse de manera análoga.
La proteína Cas a la que se hace referencia en el presente documento, tal como, sin limitación, la proteína Cas9, Cpf1 (Cas12a), C2c1 (Cas12b), C2c2 (Cas13a), C2c3, Cas13b, puede proceder de cualquier fuente adecuada y, por lo tanto, puede incluir diferentes ortólogos, procedentes de una variedad de organismos (procariotas), como está bien documentado en la técnica. En ciertas realizaciones, la proteína Cas es Cas9 (modificada), preferiblemente Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9) (modificada) o Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9) (modificada). En ciertas realizaciones, la proteína Cas es Cpf1 (modificada), preferiblemente Acidaminococcus sp., tal como Cpf1 de Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpfl) o Cpf1 de Lachnospiraceae bacterium, Lachnospiraceae bacterium MA2020 o Lachnospiraceae bacterium MD2006 (LbCpf1). En ciertas realizaciones, la proteína Cas es C2c2 (modificada), preferiblemente C2c2 Leptotrichia wadei (LwC2c2) o C2c2 de Listeria newyorkensis FSL M6-0635 (LbFSLC2c2). En ciertas realizaciones, la proteína Cas (modificada) es C2c1. En ciertas realizaciones, la proteína Cas (modificada) es C2c3. En ciertas realizaciones, la proteína Cas (modificada) es Cas13b.
En determinadas realizaciones, la modificación del ácido nucleico se efectúa mediante mutagénesis aleatoria. Las células u organismos pueden exponerse a mutágenos tales como radiación UV o productos químicos mutagénicos (tales como, por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS)), y luego se seleccionan los mutantes con las características deseadas. Los mutantes se pueden identificar, por ejemplo, mediante TILLING (focalización de lesiones locales inducidas en genomas). El método combina mutagénesis, tal como mutagénesis que usa un mutágeno químico tal como metanosulfonato de etilo (EMS) con una técnica de detección de ADN sensible que identifica mutaciones de una sola base/mutaciones puntuales en un gen objetivo. El método TILLING se basa en la formación de heterodúplex de ADN que se forman cuando múltiples alelos se amplifican mediante PCR y luego se calientan y enfrían lentamente. Se forma una "burbuja" en el desajuste de las dos cadenas de ADN, que luego es escindida por nucleasas de una sola cadena. Luego, los productos se separan por tamaño, tal como por HPLC. Véase también McCallum et al. "Targeted screening for induced mutations"; Nat Biotechnol. 2000 abril; 18 (4): 455-7 y McCallum et al. " Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics"; Plant Physiol. 2000 junio; 123 (2): 439-42.
El ARN de interferencia (ARNi) es un proceso biológico en el que las moléculas de ARN inhiben la expresión o la traducción génica, al neutralizar las moléculas de ARNm específicas. Dos tipos de moléculas pequeñas de ácido ribonucleico (ARN), microARN (miARN) y ARN pequeño de interferencia (ARNpi), son fundamentales para el ARN de interferencia. Los ARN son los productos directos de los genes, y estos pequeños ARN pueden unirse a otras moléculas específicas de ARN mensajero (ARNm) y aumentar o disminuir su actividad, por ejemplo, evitando que un ARNm se traduzca en una proteína. La vía del ARNi se encuentra en muchos eucariotas, incluidos los animales, y la inicia la enzima Dicer, que escinde moléculas largas de ARN bicatenario (ARNbc) en fragmentos cortos de doble cadena de ARNpi de aproximadamente 21 nucleótidos (ARN pequeños de interferencia). Cada ARNpi se desenrolla en dos ARN monocatenarios (ARNmc), la cadena pasajera y la cadena guía. La cadena pasajera se degrada y la cadena guía se incorpora al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Los miARN maduros son estructuralmente similares a los ARNpi producidos a partir de ARNbc exógeno, pero antes de alcanzar la madurez, los miARN primero deben sufrir una modificación postranscripcional extensa. Un miARN se expresa a partir de un gen codificador de ARN mucho más largo como un transcrito primaria conocida como pri-miARN que se procesa, en el núcleo celular, en una estructura de bucle de tallo de 70 nucleótidos llamada pre-miARN por el complejo del microprocesador. Este complejo consta de una enzima RNasa III llamada Drosha y una proteína de unión a ARNbc DGCR8. La porción de ARNbc de este pre-miARN esta unida y es escindida por Dicer para producir la molécula de miARN madura que puede integrarse en el complejo RISC; por lo tanto, miARN y ARNpi comparten la misma maquinaria celular secuencia abajo. Un ARN corto de horquilla o ARN pequeño de horquilla (vector de ARNph/horquilla) es una molécula artificial de ARN con un giro de horquilla cerrado que se puede utilizar para silenciar la expresión del gen objetivo a través de ARN de interferencia. El resultado mejor estudiado es el silenciamiento génico postranscripcional, que ocurre cuando la cadena guía se empareja con una secuencia complementaria en una molécula de ARN mensajero e induce la escisión por Argonauta 2 (Ago2), el componente catalítico del RISC. Como se usa en el presente documento, una molécula de ARNi puede ser un ARNpi, un ARNph o un miARN. Se entenderá que las moléculas de ARNi se pueden aplicar como tales a/en la planta, o se pueden codificar mediante vectores apropiados, a partir de los cuales se expresa la molécula de ARNi. Los sistemas de administración y expresión de moléculas de ARNi, tales como ARNpi, ARNph o miARN son bien conocidos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, el término "homocigoto" se refiere a una célula o planta individual que tiene los mismos alelos en uno o más o todos los loci. Cuando el término se usa con referencia a un locus o gen específico, significa que al menos ese locus o gen tiene los mismos alelos. Como se usa en el presente documento, el término "homocigoto" significa una condición genética que existe cuando alelos idénticos residen en loci correspondientes en cromosomas homólogos. Como se usa en el presente documento, el término "heterocigoto" se refiere a una célula o planta individual que tiene diferentes alelos en uno o más o todos los loci. Cuando el término se usa con referencia a un locus o gen específico, significa al menos que ese locus o gen tiene alelos diferentes. Como se usa en el presente documento, el término "heterocigoto" significa una condición genética que existe cuando diferentes alelos residen en loci correspondientes en cromosomas homólogos. En ciertas realizaciones, el QTL y/o uno o más marcadores como se describe en el presente documento es/son homocigotos. En ciertas realizaciones, el QTL y/o uno o más marcadores como se describe en el presente documento son heterocigóticos. En ciertas realizaciones, el alelo de QTL y/o uno o más alelos de marcadores como se describe en el presente documento es/son homocigotos. En ciertas realizaciones, el alelo de QTL y/o uno o más alelos de marcadores como se describe en el presente documento son heterocigotos.
Un "marcador" es (medio para encontrar una posición en a) un mapa genético o físico, o bien vínculos entre marcadores y loci de rasgos (loci que afectan a los rasgos). La posición que detecta el marcador puede conocerse mediante la detección de alelos polimórficos y su mapeo genético, o bien por hibridación, emparejamiento de secuencias o amplificación de una secuencia que ha sido mapeada físicamente. Un marcador puede ser un marcador de ADN (detecta polimorfismos de ADN), una proteína (detecta la variación en un polipéptido codificado) o simplemente un fenotipo heredado (tal como el fenotipo 'céreo'). Se puede desarrollar un marcador de ADN a partir de una secuencia de nucleótidos genómicos o a partir de secuencias de nucleótidos expresadas (por ejemplo, a partir de un ARN empalmado o un ADNc). De acuerdo con la tecnología de marcadores de ADN, el marcador puede consistir en cebadores complementarios que flanquean el locus y/o sondas complementarias que se hibridan con alelos polimórficos en el locus. El término locus del marcador es el locus (gen, secuencia o nucleótido) que detecta el marcador. "Marcador" o "marcador molecular" o "locus marcador" también se puede utilizar para indicar una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos que es suficientemente única para caracterizar un locus específico en el genoma. Cualquier rasgo polimórfico detectable puede usarse como marcador siempre que se herede de manera diferencial y muestre un desequilibrio de ligamiento con un rasgo fenotípico de interés.
Los marcadores que detectan polimorfismos genéticos entre miembros de una población están bien establecidos en la técnica. Los marcadores se pueden definir por el tipo de polimorfismo que detectan y también por la tecnología de marcador utilizada para detectar el polimorfismo. Los tipos de marcadores incluyen, entre otros, por ejemplo, detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), detección de marcadores de isozimas, ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), polimorfismos de longitud de fragmento amplificado (AFLP), detección de repeticiones de secuencia simple (SSR), detección de secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, detección de replicación de secuencias autosostenida o detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Los SNP se pueden detectar, por ejemplo, mediante secuenciación de ADN, métodos de amplificación específicos de secuencia basados en PCR, detección de polimorfismos de polinucleótidos mediante hibridación específica de alelo (ASH), hibridación dinámica específica de alelo (DASH), balizas moleculares, hibridación de micromatrices, ensayos de ligasa de oligonucleótidos, endonucleasas Flap, endonucleasas 5', extensión de cebador, polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP) o electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE). La secuenciación del ADN, como la tecnología de pirosecuenciación, tiene la ventaja de poder detectar una serie de alelos SNP enlazados que constituyen un haplotipo. Los haplotipos tienden a ser más informativos (detectan un mayor nivel de polimorfismo) que los SNP.
Un "alelo marcador", alternativamente un "alelo de un locus marcador", puede referirse a una de una pluralidad de secuencias de nucleótidos polimórficas encontradas en un locus marcador en una población. Con respecto a un marcador de SNP, el alelo se refiere a la base de nucleótidos específica presente en ese locus de SNP en esa planta individual.
"Mapeo fino" se refiere a métodos mediante los cuales la posición de un QTL puede determinarse con mayor precisión (restringido) y mediante los cuales se reduce el tamaño del fragmento de introgresión que comprende el QTL. Por ejemplo, se pueden crear líneas casi isogénicas para el QTL (QTL-NIL), que contienen diferentes fragmentos superpuestos del fragmento de introgresión dentro de un ambiente genético uniforme del padre recurrente. Dichas líneas se pueden usar para mapear en qué fragmento se encuentra el QTL y para identificar una línea que tenga un fragmento de introgresión más corto que comprenda el QTL.
La "selección asistida por marcadores" (de MAS) es un proceso mediante el cual se seleccionan plantas individuales basándose en genotipos marcadores. La "contraselección asistida por marcadores" es un proceso mediante el cual se utilizan genotipos marcadores para identificar plantas que no se seleccionarán, lo que les permite eliminarlas de un programa de mejoramiento o plantación. La selección asistida por marcadores utiliza la presencia de marcadores moleculares, que están enlazados genéticamente a un locus particular o a una región cromosómica particular (por ejemplo, fragmento de introgresión, transgén, polimorfismo, mutación, etc.), para seleccionar plantas por la presencia del locus o región específicos (fragmento de introgresión, transgén, polimorfismo, mutación, etc.). Por ejemplo, un marcador molecular ligado genéticamente a un QTL de digestibilidad como se define en el presente documento puede usarse para detectar y/o seleccionar plantas que comprenden el QTL en el cromosoma 9. Cuanto más cercano sea el vínculo genético del marcador molecular con el locus (por ejemplo, alrededor de 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM,
1 cM, 0.5 cM o menos), es menos probable que el marcador se disocie del locus a través de la recombinación meiótica. Del mismo modo, cuanto más cerca estén enlazados dos marcadores entre sí (por ejemplo, dentro de 7 cM o 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM o menos), es menos probable que los dos marcadores se separen entre sí (y es más probable que se segreguen conjuntamente como una unidad). La "puntuación LOD" (logaritmo (base 10) de probabilidades) se refiere a una prueba estadística que se utiliza a menudo para el análisis de vínculos en poblaciones de animales y plantas. La puntuación LOD compara la probabilidad de obtener los datos de la prueba si los dos loci (loci de marcadores moleculares y/o un locus de rasgos fenotípicos) están realmente enlazados, con la probabilidad de observar los mismos datos por pura casualidad. Las puntuaciones LOD positivas favorecen la presencia de enlazamiento y una puntuación LOD superior a 3.0 se considera evidencia de enlazamiento. Una puntuación LOD de 3 indica una probabilidad de 1000 a 1 de que el enlace que se observa no se produjo por casualidad.
Un "haplotipo marcador" se refiere a una combinación de alelos en un locus marcador.
Un "locus marcador" es una ubicación cromosómica específica en el genoma de una especie en la que se puede encontrar un marcador específico. Se puede usar un locus marcador para rastrear la presencia de un segundo locus enlazado, por ejemplo, uno que afecta la expresión de un rasgo fenotípico. Por ejemplo, se puede usar un locus marcador para controlar la segregación de alelos en un locus ligado genética o físicamente.
Una "sonda marcadora" es una secuencia o molécula de ácido nucleico que puede usarse para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de locus marcador, mediante hibridación de ácidos nucleicos. Las sondas marcadoras que comprenden 30 o más nucleótidos contiguos del locus marcador ("toda o una parte" de la secuencia del locus marcador) pueden usarse para la hibridación de ácidos nucleicos. Alternativamente, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que sea capaz de distinguir (es decir, genotipar) el alelo particular que está presente en un locus marcador.
El término "marcador molecular" puede usarse para referirse a un marcador genético o un producto codificado del mismo (por ejemplo, una proteína) usado como punto de referencia cuando se identifica un locus enlazado. Un marcador puede derivarse de secuencias de nucleótidos genómicos o de secuencias de nucleótidos expresadas (por ejemplo, de un ARN empalmado, un ADNc, etc.), o de un polipéptido codificado. El término también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos complementarias o que flanquean las secuencias marcadoras, tales como ácidos nucleicos usados como sondas o pares de cebadores capaces de amplificar la secuencia marcadora. Una "sonda de marcador molecular" es una secuencia o molécula de ácido nucleico que puede usarse para identificar la presencia de un locus marcador, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de locus marcador. Alternativamente, en algunos aspectos, una sonda marcadora se refiere a una sonda de cualquier tipo que sea capaz de distinguir (es decir, genotipar) el alelo particular que está presente en un locus marcador. Los ácidos nucleicos son "complementarios" cuando se hibridan específicamente en solución, por ejemplo, de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Algunos de los marcadores descritos en el presente documento también se denominan marcadores de hibridación cuando se ubican en una región indel, como la región no colineal descrita en el presente documento. Esto se debe a que la región de inserción es, por definición, un polimorfismo frente a una planta sin la inserción. Por lo tanto, el marcador solo necesita indicar si la región indel está presente o ausente. Puede usarse cualquier tecnología de detección de marcador adecuada para identificar dicho marcador de hibridación, por ejemplo, la tecnología SNP se usa en los ejemplos proporcionados en este documento.
Los "marcadores genéticos" son ácidos nucleicos que son polimórficos en una población y cuyos alelos pueden detectarse y distinguirse mediante uno o más métodos analíticos, por ejemplo, RFLP, AFLP, isozima, SNP, SSR y similares. Los términos "marcador molecular" y "marcador genético" se usan indistintamente en este documento. El término también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos complementarias a las secuencias genómicas, tales como los ácidos nucleicos utilizados como sondas. Los marcadores correspondientes a polimorfismos genéticos entre miembros de una población pueden detectarse mediante métodos bien establecidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, métodos de amplificación específicos de secuencia basados en PCR, detección de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), detección de marcadores de isozimas, detección de polimorfismos de polinucleótidos mediante hibridación específica de alelo (ASH), detección de secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, detección de replicación de secuencia autosostenida, detección de repeticiones de secuencia simple (SSR), detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o detección de polimorfismos de longitud de fragmento amplificado (AFLP). También se conocen métodos bien establecidos para la detección de etiquetas de secuencia expresada (EST) y marcadores SSR derivados de secuencias EST y ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD).
Un "polimorfismo" es una variación en el ADN entre dos o más individuos dentro de una población. Un polimorfismo tiene preferiblemente una frecuencia de al menos el 1 % en una población. Un polimorfismo útil puede incluir un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), una repetición de secuencia simple (SSR) o un polimorfismo de inserción/eliminación, también denominado en el presente documento "indel". El término "indel" se refiere a una inserción o eliminación, en la que se puede hacer referencia a una línea que tiene un nucleótido o fragmento de ADN insertado en relación con una segunda línea, o se puede hacer referencia a la segunda línea como que tiene un nucleótido eliminado o un fragmento de ADN con respecto a la primera línea.
La "distancia física" entre loci (por ejemplo, entre marcadores moleculares y/o entre marcadores fenotípicos) en el mismo cromosoma es la distancia física real expresada en bases o pares de bases (pb), kilobases o kilopares de bases (kb) o megabases o mega pares de bases (Mb).
La "distancia genética" entre loci (por ejemplo, entre marcadores moleculares y/o entre marcadores fenotípicos) en el mismo cromosoma se mide por la frecuencia de entrecruzamiento o frecuencia de recombinación (RF) y se indica en centimorgans (cM). Un cM corresponde a una frecuencia de recombinación del 1 %. Si no se pueden encontrar recombinantes, la RF es cero y los loci están físicamente muy juntos o son idénticos. Cuanto más separados estén dos loci, mayor será la RF.
Un "mapa físico" del genoma es un mapa que muestra el orden lineal de puntos de referencia identificables (incluidos genes, marcadores, etc.) en el ADN cromosómico. Sin embargo, a diferencia de los mapas genéticos, las distancias entre puntos de referencia son absolutas (por ejemplo, medidas en pares de bases o fragmentos genéticos contiguos aislados y superpuestos) y no se basan en la recombinación genética (que puede variar en diferentes poblaciones).
Un alelo se correlaciona "negativamente" con un rasgo cuando está enlazado a él y cuando la presencia del alelo es un indicador de que un rasgo deseado o una forma de rasgo no ocurrirá en una planta que comprende el alelo. Un alelo se correlaciona "positivamente" con un rasgo cuando está enlazado a él y cuando la presencia del alelo es un indicador de que el rasgo deseado o la forma del rasgo ocurrirán en una planta que comprende el alelo.
Un centimorgan ("cM") es una unidad de medida de frecuencia de recombinación. Un cM es igual a un 1 % de probabilidad de que un marcador en un locus genético se separe de un marcador en un segundo locus debido al entrecruzamiento en una sola generación.
Como se usa en el presente documento, el término "intervalo cromosómico" designa un intervalo lineal contiguo de ADN genómico que reside en la planta en un solo cromosoma. Los elementos genéticos o genes ubicados en un solo intervalo cromosómico están físicamente enlazados. El tamaño de un intervalo cromosómico no está particularmente limitado. En algunos aspectos, los elementos genéticos ubicados dentro de un solo intervalo cromosómico están enlazados genéticamente, típicamente con una distancia de recombinación genética de, por ejemplo, menor o igual a 20 cM, o alternativamente, menor o igual a 10 cM. Es decir, dos elementos genéticos dentro de un solo intervalo cromosómico se recombinan con una frecuencia menor o igual al 20 % o al 10 %.
El término "estrechamente enlazado", en la presente solicitud, significa que la recombinación entre dos loci enlazados se produce con una frecuencia igual o inferior al 10 % (es decir, están separados en un mapa genético por no más de 10 cM). Dicho de otra manera, los loci estrechamente enlazados segregan conjuntamente al menos el 90 % del tiempo. Los loci marcadores son especialmente útiles con respecto al objeto de la divulgación actual cuando demuestran una probabilidad significativa de segregación conjunta (enlazamiento) con un rasgo deseado (por ejemplo, resistencia a la mancha gris de la hoja). Los loci estrechamente enlazados, como un locus marcador y un segundo locus, pueden mostrar una frecuencia de recombinación entre locus del 10 % o menos, preferiblemente aproximadamente 9 % o menos, aún más preferiblemente aproximadamente 8 % o menos, aún más preferiblemente aproximadamente 7 % o menos, aún más preferiblemente aproximadamente 6 % o menos, aún más preferiblemente aproximadamente 5 % o menos, aún más preferiblemente aproximadamente 4 % o menos, aún más preferiblemente aproximadamente 3 % o menos, y aún más preferiblemente aproximadamente 2 % o menos. En realizaciones altamente preferidas, los loci relevantes muestran una frecuencia de recombinación de aproximadamente 1 % o menos, por ejemplo, aproximadamente 0.75 % o menos, más preferiblemente aproximadamente 0.5 % o menos, o aún más preferiblemente aproximadamente 0.25 % o menos. Dos loci que están localizados en el mismo cromosoma y a tal distancia que la recombinación entre los dos loci se produce con una frecuencia inferior al 10 % (por ejemplo, aproximadamente 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.75 %, 0.5 %, 0.25 % o menos) también se dice que son "próximos" entre sí. En algunos casos, dos marcadores diferentes pueden tener las mismas coordenadas en el mapa genético. En ese caso, los dos marcadores están tan próximos entre sí que se produce una recombinación entre ellos con una frecuencia tan baja que es indetectable.
"Vinculación" se refiere a la tendencia de los alelos a segregarse juntos más a menudo de lo esperado por casualidad si su transmisión fuera independiente. Por lo general, el enlazamiento se refiere a alelos en el mismo cromosoma. La recombinación genética ocurre con una frecuencia aleatoria asumida en todo el genoma. Los mapas genéticos se construyen midiendo la frecuencia de recombinación entre pares de rasgos o marcadores. Cuanto más cerca estén los rasgos o marcadores entre sí en el cromosoma, menor será la frecuencia de recombinación y mayor el grado de enlazamiento. Se considera que los rasgos o marcadores están enlazados en este documento si generalmente se segregan conjuntamente. Una probabilidad de 1/100 de recombinación por generación se define como una distancia en el mapa genético de 1.0 centiMorgan (1.0 cM). El término "desequilibrio de enlazamiento" se refiere a una segregación no aleatoria de loci o rasgos genéticos (o ambos). En cualquier caso, el desequilibrio de enlazamiento implica que los loci relevantes están dentro de una proximidad física suficiente a lo largo de un cromosoma para que se segreguen juntos con una frecuencia mayor que la aleatoria (es decir, no aleatoria). Los marcadores que muestran desequilibrio de enlazamiento se consideran enlazados. Los loci enlazados se segregan conjuntamente más del 50 % del tiempo, por ejemplo, desde aproximadamente el 51 % hasta aproximadamente el 100 % del tiempo. En otras palabras, dos marcadores que se segregan conjuntamente tienen una frecuencia de recombinación inferior al 50 % (y, por definición, están separados por menos de 50 cM en el mismo grupo de enlazamiento). Como se usa en este
documento, el enlazamiento puede ser entre dos marcadores, o alternativamente entre un marcador y un locus que afecta un fenotipo. Un locus marcador puede estar "asociado con" (enlazado a) un rasgo. El grado de enlazamiento de un locus marcador y un locus que afecta a un rasgo fenotípico se mide, por ejemplo, como una probabilidad estadística de segregación conjunta de ese marcador molecular con el fenotipo (por ejemplo, una estadística F o puntuación LOD).
Como se usa en el presente documento, el término "identidad de secuencia" se refiere al grado de identidad entre cualquier secuencia de ácido nucleico dada y una secuencia de ácido nucleico objetivo. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones coincidentes en secuencias de ácido nucleico alineadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de nucleótidos alineados y multiplicando por 100. Una posición coincidente se refiere a una posición en la que aparecen nucleótidos idénticos en la misma posición en secuencias de ácido nucleico alineadas. El porcentaje de identidad de secuencia también se puede determinar para cualquier secuencia de aminoácidos. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia, una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos objetivo se compara con la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos identificada utilizando el programa BLAST 2 Sequences (BI2seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN y BLASTP. Esta versión independiente de BLASTZ se puede obtener del sitio web de Fish & Richardson (World Wide Web en fr.com/blast) o del sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica del gobierno de los Estados Unidos (World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov). Las instrucciones que explican cómo usar el programa BI2seq se pueden encontrar en el archivo Léame que acompaña a BLASTZ. BI2seq realiza una comparación entre dos secuencias utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP.
BLASTN se usa para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácidos nucleicos, las opciones se establecen de la siguiente manera: -i se establece en un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq l. txt); -j se establece en un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece en blastn; -o se establece en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se establece en -1; -r se establece en 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. El siguiente comando generará un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seql .txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q - 1 -r 2. Si la secuencia objetivo comparte homología con cualquier parte de la secuencia identificada, el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si la secuencia objetivo no comparte homología con ninguna parte de la secuencia identificada, el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas. Una vez alineada, se determina una longitud contando el número de nucleótidos consecutivos de la secuencia objetivo presentada en alineación con la secuencia de la secuencia identificada comenzando con cualquier posición coincidente y terminando con cualquier otra posición coincidente. Una posición coincidente es cualquier posición en la que se presenta un nucleótido idéntico tanto en la secuencia objetivo como en la identificada. Los huecos presentados en la secuencia objetivo no se cuentan porque los huecos no son nucleótidos. Asimismo, no se cuentan los huecos presentados en la secuencia identificada ya que se cuentan los nucleótidos de la secuencia objetivo, no los nucleótidos de la secuencia identificada. El porcentaje de identidad sobre una longitud particular se determina contando el número de posiciones coincidentes sobre esa longitud y dividiendo ese número por la longitud y luego multiplicando el valor resultante por 100. Por ejemplo, si (i) una secuencia objetivo de ácido nucleico de 500 bases se compara con una secuencia de ácido nucleico en cuestión, (ii) el programa BI2seq presenta 200 bases de la secuencia objetivo alineadas con una región de la secuencia en cuestión en la que la primera y la última bases de esa región de 200 bases son coincidencias, y (iii) el número de coincidencias sobre esas 200 bases alineadas es 180, entonces la secuencia objetivo de ácido nucleico de 500 bases contiene una longitud de 200 y una identidad de secuencia sobre esa longitud del 90 % (es decir, 180 / 200 x 100 = 90). Se apreciará que diferentes regiones dentro de una única secuencia objetivo de ácido nucleico que se alinea con una secuencia identificada pueden tener cada una su propio porcentaje de identidad. Se observa que el valor de identidad porcentual se redondea a la décima más cercana. Por ejemplo, 78.11, 78.12, 78.13 y 78.14 se redondean a 78.1, mientras que 78.15, 78.16, 78.17, 78.18 y 78.19 se redondean a 78.2. También se observa que el valor de longitud siempre será un número entero.
Una "secuencia de ácido nucleico aislada" o "ADN aislado" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ya no se encuentra en el entorno natural del que se aisló, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped bacteriana o en el genoma nuclear o plástido de una planta. Cuando se hace referencia a una "secuencia" en el presente documento, se entiende que se hace referencia a la molécula que tiene tal secuencia, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico. Una "célula huésped" o una "célula huésped recombinante" o "célula transformada" son términos que se refieren a una nueva célula individual (u organismo) que surge como resultado de la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico en dicha célula. La célula huésped es preferiblemente una célula vegetal o una célula bacteriana. La célula huésped puede contener el ácido nucleico como una molécula que se replica extracromosómicamente (episomal), o comprende el ácido nucleico integrado en el genoma nuclear o plástido de la célula huésped, o como cromosoma introducido, por ejemplo, minicromosoma.
Cuando se hace referencia a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ADN genómico) que tiene una "identidad de secuencia sustancial con" una secuencia de referencia o que tiene una identidad de secuencia de al menos el 60 %, por ejemplo, al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de referencia, en una realización dicha secuencia de nucleótidos se considera sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos dada y puede identificarse usando condiciones de hibridación
rigurosas. En otra realización, la secuencia de ácido nucleico comprende una o más mutaciones en comparación con la secuencia de nucleótidos dada, pero aún puede identificarse usando condiciones de hibridación rigurosas. Pueden usarse "condiciones de hibridación rigurosas" para identificar secuencias de nucleótidos, que son sustancialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos dada. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia objetivo se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Normalmente, se elegirán condiciones rigurosas en las que la concentración de sal sea de aproximadamente 0.02 molar a pH 7 y la temperatura sea de al menos 60 °C. Reducir la concentración de sal y/o aumentar la temperatura aumenta la rigurosidad. Las condiciones rigurosas para las hibridaciones de ARN-ADN (transferencias Northern que utilizan una sonda de, por ejemplo, 100 nt) son, por ejemplo, aquellas que incluyen al menos un lavado en 0.2X SSC a 63 °C durante 20 min, o condiciones equivalentes. Las condiciones rigurosas para la hibridación de ADN-ADN (transferencias Southern que utilizan una sonda de, por ejemplo, 100 nt) son, por ejemplo, aquellas que incluyen al menos un lavado (generalmente 2) en 0.2X SSC a una temperatura de al menos 50 °C, usualmente aproximadamente alrededor de 55 °C, durante 20 min, o condiciones equivalentes. Véase también Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001). Los ejemplos de condiciones de hibridación muy rigurosas son condiciones en las que principalmente solo se someten a hibridación aquellas moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia. Tales condiciones de hibridación altamente rigurosas son, por ejemplo: 4 x SSC a 65 °C y múltiples lavados posteriores en 0.1 x SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora. El término "condiciones de hibridación de alta rigurosidad" tal como se utiliza en este documento también puede significar: hibridación a 68 °C en fosfato de sodio 0.25 M, pH 7.2, SDS al 7 %, EDTA 1 mM y BSA al 1 % durante 16 horas y, posteriormente, lavar dos veces con 2 x SSC y SDS al 0.1 % a 68 °C. Preferiblemente, la hibridación tiene lugar en condiciones rigurosas. Condiciones de hibridación menos rigurosas son, por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 37 °C y posterior lavado múltiple en 1 x SSC a temperatura ambiente.
Como se usa en el presente documento, F35H (entrada de enzima ExPASy EC 1.14.13.88) se refiere al gen o proteína flavonoide 3',5'-hidroxilasa. F35H también se conoce como F3'5'H, F3',5'H, flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450 o flavanona, NADPH:oxígeno oxidorreductasa. F35H cataliza la siguiente reacción: flavanona 2 NADP 2 O(2) <=> 3',5'-dihidroxiflavanona 2 NADP(+) 2 H(2)O.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección de la presencia de un alelo de QTL (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) asociado con una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad mejorada del rastrojo, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad una enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se refiere a una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b) o c) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica; y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3;
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar el material genético a partir de al menos una célula de la planta o parte de la planta, y la detección en dicho material genético de la presencia de un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad mejorada del rastrojo, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H tal (como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección de la presencia de un alelo de QTL (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) asociado con una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, y seleccionar una planta de maíz o parte de una planta de maíz en la que el alelo de QTL está presente.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, detectando en dicho material genético la presencia de un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, y seleccionar una planta de maíz o parte de una planta de maíz en laque el alelo de QTL está presente.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección de la presencia de un alelo de QTL (ta como en el material genético aislado de la planta o parte de la planta) que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se refiere a una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b) o c) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica; y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3;
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, y la detección en dicho material genético de la presencia de un alelo de QTL que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína f 35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada ) o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección de la presencia de un alelo de QTL (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que
conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, y seleccionar una planta o parte de la planta en la que está presente el alelo de QTL.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, detectar en dicho material genético la presencia de un alelo de QTL que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene una mutación que conduce a la expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, y seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz en la que está presente el alelo de QTL.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en el cromosoma 9 y comprende y/o está flanqueado por los alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en el cromosoma 9 y comprende el alelo marcador (molecular) de ma61134xxx.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en un intervalo cromosómico que comprende y/o está flanqueado por los alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en un intervalo cromosómico que comprende el alelo marcador de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en los que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección (tal como como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) la presencia de una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35h ) del citocromo P450 y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35h que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se refiere a una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b) o c) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica; y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3;
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, y detectar en dicho material genético la presencia de una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) de la presencia de una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/ o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35h no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, y seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz en el que está presente la mutación en dicho F35H.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, detectar en dicho material genético la presencia de una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35h ) del citocromo P450 y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación, preferiblemente una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción, y seleccionar una planta de maíz o parte de una planta de maíz en la que está presente una mutación en dicho F35H.
En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende opcionalmente (tal como en material aislado de la planta o parte de la planta) analizar el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, y la detección de la expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H o para una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida;
en el que la digestibilidad mejorada se refiere a una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b) o c) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica; y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3;
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material de al menos una célula de la planta o parte de la planta, y opcionalmente analizar el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 en dicho material, y/o detectar la expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H o para una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida en dicho material.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende analizar (tal como en material aislado de la planta o parte de la planta) el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, y seleccionar una planta o parte de una planta de maíz en la que se reduce o elimina la expresión del ARNm y/o proteína F35H o la actividad enzimática de F35H o se reduce la actividad enzimática de F35H.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material de al menos una célula de la planta o parte de la
planta, analizar el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 en dicho material y/o detectar la expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H o para una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida en dicho material, y seleccionar una planta o parte de la planta en la que se reduce o elimina la expresión del ARNm y/o la proteína F35H o la actividad enzimática de F35H o se reduce la actividad enzimática de F35H.
En ciertas realizaciones, si el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) del F35H, en particular el F35H de tipo silvestre o nativo, está alterado, entonces la planta o parte de la planta tiene una digestibilidad mejorada. En ciertas realizaciones, si el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) del F35H, en particular el F35H de tipo silvestre o nativo, está alterado en comparación con un nivel de expresión de referencia, entonces la planta o parte de la planta tiene una digestibilidad mejorada. En ciertas realizaciones, si el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) del F35H, en particular el F35H de tipo silvestre o nativo, está alterado en comparación con el nivel de expresión de referencia en una planta o parte de la planta de referencia, entonces la planta o parte de la planta tiene digestibilidad mejorada. En ciertas realizaciones, la planta de referencia (o parte de la planta) es la línea endogámica de maíz PH207, como se describe en "Draft Assembly of Elite Inbred Line PH207 Provides Insights into Genomic and Transcriptome Diversity in Maize", Hirsch et al., Plant Cell. 2016 Nov; 28(11): 2700-2714. Publicada en línea el 1 de noviembre de 2016. doi: 10.1105/tpc.16.00353, o una planta de maíz que comprende el alelo de QTL que comprende la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre o nativa (no mutada) de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 (por ejemplo, derivada de PH207), preferiblemente la planta de referencia (o parte de la planta) se deriva de una línea casi isogénica.
Como se usa en el presente documento, los niveles de expresión alterados (proteína y/o ARNm) se refieren a niveles de expresión disminuidos de aproximadamente al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 30 %, más preferiblemente al menos un 50 %, tal como al menos un 20 %, 40 %, 60 %, 80 % o más, tal como al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o más.
En realizaciones particulares, si el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) del F35H, en particular el F35H de tipo silvestre o nativo, se reduce o la expresión está (sustancialmente) ausente o eliminada, entonces la planta de maíz o parte de una planta de maíz tiene digestibilidad mejorada. En ciertas realizaciones, si el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) del F35H, en particular el F35H de tipo silvestre o nativo, se reduce o la expresión está (sustancialmente) ausente o eliminada en comparación con un nivel de expresión de referencia, entonces la planta de maíz o parte de una planta de maíz tiene digestibilidad mejorada. En ciertas realizaciones, si el nivel de expresión (proteína y/o ARNm) del F35H, en particular el F35H de tipo silvestre o nativo, se reduce o la expresión está (sustancialmente) ausente o eliminada en comparación con el nivel de expresión de referencia en una planta de maíz o parte de una planta de maíz de referencia, entonces la planta de maíz o la parte de una planta de maíz tiene una digestibilidad mejorada. En ciertas realizaciones, la planta de referencia (o parte de la planta) es la línea endogámica de maíz PH207, como se describe en "Draft Assembly of Elite Inbred Line PH207 Provides Insights into Genomic and Transcriptome Diversity in Maize", Hirsch et al., Plant Cell. 2016 Nov; 28(11): 2700-2714. Publicada en línea el 1 de noviembre de 2016. doi: 10.1105/tpc.16.00353, o una planta de maíz que comprende el alelo de QTL que comprende la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre o nativa (no mutada) de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 (por ejemplo, derivada de PH207), preferiblemente la planta de referencia (o parte de la planta) se deriva de una línea casi isogénica.
Como se usa en el presente documento, los niveles de expresión reducidos (proteína y/o ARNm) se refieren a niveles de expresión reducidos de aproximadamente al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 30 %, más preferiblemente al menos un 50 %, tal como al menos un 20 %, 40 %, 60 %, 80 % o más, tal como al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o más. La expresión está (sustancialmente) ausente o eliminada si los niveles de expresión se reducen al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %. En ciertas realizaciones, la expresión está (sustancialmente) ausente, si no se puede detectar ninguna proteína y/o ARNm, en particular la proteína y/o ARNm de tipo silvestre o nativo, tal como mediante métodos de detección estándar, que incluyen, por ejemplo, PCR (cuantitativa), transferencia Northern, transferencia Western, ELISA, etc.
En un aspecto, la invención se refiere al método anterior para identificar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende detectar (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) la presencia de uno o más alelos marcadores (moleculares) asociados con una digestibilidad mejorada, siendo dicho alelo marcador (molecular) el alelo marcador molecular ma61134xxx, y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en los que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, y la detección en dicho material genético de la presencia de uno o más alelos marcadores (moleculares) asociados con una digestibilidad mejorada, siendo dicho alelo marcador (molecular) el alelo marcador molecular ma61134xxx, y /o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en los que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta o una parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) la presencia de uno o más alelos marcadores (moleculares) asociados con una mejor digestibilidad, siendo dicho alelo marcador (molecular) el alelo marcador molecular ma61134xxx, y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en los que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada, y seleccionar una planta de maíz o parte de una planta de maíz en el que están presenten uno o más alelos marcadores (moleculares).
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, detectar en dicho material genético la presencia de uno o más alelos marcadores (moleculares) asociados con una digestibilidad mejorada, siendo dicho alelo marcador (molecular) el alelo marcador molecular ma61134xxx, y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en los que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada, y seleccionar una planta de maíz o parte de una planta de maíz en la que uno o más alelos marcadores (moleculares) están presentes.
En un aspecto, la invención se refiere al método anterior para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) para detectar la presencia del alelo marcador molecular ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, y detectar en dicho material genético la presencia del alelo marcador molecular ma61134xxx, y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende la detección (tal como en material genético aislado de la planta o parte de la planta) para detectar la presencia del alelo marcador molecular ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada, y seleccionando una planta de maíz o una parte de una planta de maíz en la que está presente uno o más alelos marcadores (moleculares).
En una realización, la invención se refiere a un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, o para seleccionar una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, que comprende aislar material genético de al menos una célula de la planta o parte de la planta, detectar en dicho material genético la presencia del alelo marcador molecular de ma61134xxx, y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada, y seleccionar una planta o parte de la planta en la que está presente uno o más alelos marcadores (moleculares).
Se entenderá que en los métodos descritos anteriormente, cuando está presente el alelo de QTL o el alelo marcador (molecular), entonces se identifica que la planta o parte de la planta tiene una digestibilidad mejorada.
Los métodos para detectar la presencia de un alelo de QTL o un alelo marcador (molecular) como se describe en el presente documento son conocidos en la técnica. Sin limitación, la detección puede abarcar o comprender secuenciación, métodos basados en hibridación (tales como hibridación (dinámica) específica de alelo, balizas moleculares, micromatrices de SNP), métodos basados en enzimas (tales como PCR, KASP (PCR competitiva específica de alelo), RFLP, ALFP, RAPD, endonucleasa Flap, extensión del cebador, 5'-nucleasa, ensayo de ligadura de oligonucleótidos), métodos de amplificación posterior basados en las propiedades físicas del ADN (tal como polimorfismo de conformación de cadena sencilla, electroforesis en gel con gradiente de temperatura, cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante, fusión de alta resolución de todo el amplicón, uso de proteínas de unión a errores de emparejamiento de ADN, SNPlex, ensayo de nucleasa de Surveyor), etc.
En la presente solicitud se describe un método, tal como un método para generar/producir una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o una digestibilidad mejorada de una planta o parte de una planta, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo, que comprende introducir o introgresar en el genoma de una planta o parte de una planta un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada y que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450 que tiene una mutación.
La presente solicitud divulga además un método, tal como un método para generar/producir una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta o parte de una planta, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo, que comprende introducir o introgresar en el genoma de una planta o parte de una planta un alelo de QTL que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450 que tiene una mutación. Dicha mutación puede conducir a una expresión alterada del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o la mutación conduce a una proteína F35H que tiene actividad enzimática alterada tras la traducción, más preferiblemente la mutación conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de dicho gen y/o la proteína F35H, para eliminar o inactivar de dicho gen o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción o una proteína F35H que tiene actividad enzimática aumentada tras la traducción.
Además del método descrito para generar/producir una planta o parte de una planta y/o para mejorar la digestibilidad de una planta o parte de una planta, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo, el alelo de q Tl está ubicado en el cromosoma 9 y comprende y/o está flanqueado por alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, y/o el alelo de QTL está ubicado en el cromosoma 9 y comprende el alelo marcador (molecular) de ma61134xxx, y/o el alelo de QTL está ubicado en un intervalo cromosómico que comprende y/o está flanqueado por los alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y
ma61125s01, y/o el alelo de QTL está ubicado en un intervalo cromosómico que comprende el alelo marcador de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por alelos marcadores de ma610 70s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
Además, se divulga un método, tal como un método para generar/producir una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta o parte de una planta, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo, que comprende introducir en el genoma de una planta o parte de una planta un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada y que comprende el alelo marcador de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso para un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
Alternativamente, la presente solicitud describe un método, tal como un método para generar/producir una planta o parte de una planta que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta o parte de una planta, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo, que comprende introducir en el genoma de una planta o parte de una planta un alelo de QTL que comprende el alelo marcador de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En un aspecto, la invención se refiere a un método, tal como un método para generar/producir una planta de maíz o una parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta o parte de una planta, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo, que comprende introducir o introgresar en el genoma de una planta de maíz o parte de una planta de maíz una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En un aspecto, la invención se refiere a un método, tal como un método para generar/producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, preferiblemente la digestibilidad del rastrojo, que comprende introducir en el genoma de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, en particular en una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450, una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En un aspecto, la invención se refiere a un método, tal como un método para generar/producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, preferiblemente la digestibilidad del rastrojo, que comprende alterar un gen endógeno que codifica un gen de flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450, preferiblemente eliminar un gen endógeno que codifica un gen de flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En un aspecto, la invención se refiere a un método, tal como un método para generar/producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, preferiblemente la digestibilidad del rastrojo, que comprende reducir la expresión del ARNm del gen que codifica un gen de flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H codificada, preferiblemente la inactivación de la expresión del ARNm del gen que codifica un gen de flavonoide 3'5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H codificada;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En un aspecto, la invención se refiere a un método, tal como un método para generar/producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo
mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, preferiblemente la digestibilidad del rastrojo, que comprende eliminar o reducir o inhibir la expresión del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450 y/o la proteína F35H, reduciendo la actividad enzimática de un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 o inhibiendo la proteína F35H, o aumentando la actividad enzimática de un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un método, tal como un método para generar/producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad, preferiblemente la digestibilidad del rastrojo, de una planta o parte de la planta, que comprende
A. introducir en una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno de la planta o parte de la planta que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450 una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de dicho gen y/o de la proteína F35H, para una eliminación o inactivación de dicho gen o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción; o
B. introducir en el genoma de la planta o parte de la planta un primer ADN bicatenario y un segundo ADN bicatenario, en el que las secuencias de nucleótidos de las cadenas codificantes del primer y segundo ADN son complementos inversos entre sí, de modo que un transcrito del primer ADN y un transcrito del segundo ADN son capaces de hibridarse para formar un ARN bicatenario, en el que la cadena codificante del primer o segundo ADN comprende:
a. al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8; o
b. una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 % , al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8; o
C. un ARN bicatenario, en el que una cadena corresponde a:
a. al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 % , al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8, en la que T se reemplaza por U; o
b. una secuencia de nucleótidos que es complementaria con al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 % , al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8, en la que T se reemplaza por U; o
D. introducir en la planta o la parte de la planta un sistema CRISPR/Cas específico de ARN, tal como un sistema CRISPR/Cas13a, dirigido contra o direccionado a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H o, en el genoma de la planta o parte de la planta una o más secuencias de polinucleótidos que codifican (y expresan o son capaces de expresar) dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN; o
E. introducir en la planta o parte de la planta un compuesto químico o un anticuerpo que altere (o sea capaz de alterar) la actividad enzimática de la proteína F35H al interactuar con dicha F35H, preferiblemente reduciendo (o siendo capaz de reducir) la actividad enzimática de la proteína F35H o inhibiendo (o siendo capaz de inhibir) la actividad enzimática de la proteína F35H o aumentando (o siendo capaz de aumentar) la actividad enzimática de la proteína F35H al interactuar con dicha F35H.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un método, tal como un método para generar/producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, y/o para mejorar la digestibilidad, preferiblemente la digestibilidad del rastrojo, de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, que comprende regenerar una planta a partir de las planta o partes de las planta modificadas anteriormente mencionadas.
En un aspecto, la invención se refiere a una planta de maíz o parte de una planta de maíz que comprende un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas;
en el que la planta de maíz o parte de la planta de maíz no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.
En ciertas realizaciones, la mutación conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de dicho gen y/o la proteína F35H, a una eliminación o inactivación de dicho gen o una mutación que conduce a una proteína F35h no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida o aumentada tras la traducción. La inactivación o eliminación de F35H puede efectuarse, por ejemplo, mediante cualquiera de los métodos de mutagénesis descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en el cromosoma 9 y comprende y/o está flanqueado por los alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y mal6983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en el cromosoma 9 y comprende el alelo marcador de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en un intervalo cromosómico que comprende y/o está flanqueado por los alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL está ubicado en un intervalo cromosómico que comprende el alelo marcador de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador
directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En un aspecto, la invención se refiere a una planta de maíz o parte de una planta de maíz que comprende una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas;
en el que la planta de maíz o parte de una planta de maíz no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.
En una realización determinada, la invención se refiere a una planta de maíz o parte de una planta de maíz que comprende el alelo marcador de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, preferiblemente en el que uno o más alelos marcadores moleculares son detectables por un ácido polinucleico, tal como un ácido polinucleico específico del alelo (marcador molecular), adecuado para la hibridación como cebador directo y cebador inverso con un locus en el intervalo cromosómico que se segrega conjuntamente con la digestibilidad mejorada.
En un aspecto, la invención se refiere a una planta de maíz o parte de una planta de maíz que comprende
A. un gen que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción, más preferiblemente una mutación que conduce a una eliminación o inactivación de dicho gen, o que ha reducido o eliminado la expresión del ARNm y/o la proteína de un gen de F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción o una proteína F35H que tiene actividad enzimática aumentada tras la traducción; o
B. un primer ADN bicatenario (establemente integrado) y un segundo ADN bicatenario (establemente integrado), en el que las secuencias de nucleótidos de las cadenas codificantes del primer y segundo ADN son complementos inversos entre sí, de modo que un transcrito del primer ADN y un transcrito del segundo ADN son capaces de hibridarse para formar un ARN bicatenario, en el que la cadena codificante del primer o segundo ADN comprende:
a. al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 % , al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8, o
b. una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 % , al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8; o
C. un ARN bicatenario, en el que una cadena corresponde a:
a. al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 % , al menos un 96 %, al
menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8, en la que T se reemplaza por U; o
b. una secuencia de nucleótidos que es complementaria de al menos 19 nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8 o de una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad, preferiblemente al menos un 70 % o al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, al menos un 92 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8, en la que T se reemplaza por U; o
D. un sistema CRISPR/Cas específico de ARN, tal como un sistema CRISPR/Cas13a, dirigido contra o direccionado a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican (y expresan o son capaces de expresar) dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN; o
E. un compuesto químico o un anticuerpo que altera (o es capaz de alterar) la actividad enzimática de la proteína F35H al interactuar con dicho F35H, preferiblemente reduciendo (o siendo capaz de reducir) la actividad enzimática de la proteína F35H o inhibiendo (o siendo capaz de inhibir) la proteína F35H al interactuar con dicho F35H o aumentar (o ser capaz de aumentar) la proteína F35H al interactuar con dicho F35H;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas;
en el que la planta de maíz o parte de una planta de maíz no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.
En ciertas realizaciones, la planta no es una variedad de planta.
Además, en la presente solicitud se divulga un método para obtener, generar o producir una planta o parte de una planta, tal como una planta o parte de una planta de maíz o sorgo o caña de azúcar, preferiblemente una planta de maíz o parte de una planta de maíz, que comprende (a) proporcionar una primera planta que tiene un alelo de QTL, tal como un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada como se describe en este documento en otro lugar, opcionalmente en el que dicho alelo de QTL está ubicado en un intervalo cromosómico, preferiblemente en el cromosoma 9, que comprende y está flanqueado por los alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, (b) cruzar dicha primera planta con una segunda planta, tal como una segunda planta que no tenga dicho alelo de QTL, (c) seleccionar plantas de la progenie que tengan dicho alelo de QTL, y opcionalmente (d) cosechar dicha parte de la planta de dicha progenie.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL comprende uno o más de los alelos marcadores como se describe en este documento en otra parte.
En ciertas realizaciones, el alelo de QTL comprende un gen F35H mutado como se describe en este documento en otra parte.
Además, se divulga un método para obtener o generar o producir una planta o parte de una planta, tal como una planta o parte de una planta de maíz o sorgo o caña de azúcar, preferiblemente una planta o parte de una planta de maíz, que comprende (a) proporcionar una primera planta que tiene un alelo marcador (molecular), tal como un alelo marcador (molecular) asociado con una digestibilidad mejorada como se describe en este documento en otro lugar, opcionalmente en el que dicho alelo marcador (molecular) está ubicado en un intervalo cromosómico, preferiblemente en el cromosoma 9, que comprende y está flanqueado por alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01; (b) cruzar dicha primera planta con una segunda planta, tal como una segunda planta que no tenga dicho alelo marcador (molecular), (c) seleccionar plantas de la progenie que tengan dicho alelo marcador (molecular), y opcionalmente (d) cosechar dicha parte de la planta de dicha progenie.
Además, se describe un método para obtener, generar o producir una planta o parte de una planta, tal como una planta o parte de una planta de maíz, sorgo o caña de azúcar, que comprende (a) proporcionar una primera planta que tiene un gen F35H mutado o una primera planta en la que la expresión del ARNm y/o la proteína de un gen F35H está alterada, tal como se describe en este documento en otro lugar, preferiblemente reducida o (sustancialmente) eliminada o ausente, tal como se describe en este documento en otro lugar, opcionalmente en el que dicho gen F35H mutado está ubicado en un intervalo cromosómico, preferiblemente en el cromosoma 9, que comprende y está flanqueado por los alelos marcadores (moleculares) de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01, (b) cruzar dicha primera planta con una segunda planta, tal como una segunda planta que no tiene dicho gen F35H mutado, (c) seleccionar plantas de la progenie que tienen dicho gen F35H mutado, y opcionalmente (d) cosechar dicha parte de la planta de dicha progenie.
En los métodos divulgados anteriormente para obtener o generar o producir una planta o parte de una planta, el alelo de QTL, el alelo marcador y/o la mutación de F35H en la primera planta está presente en un estado homocigoto, y/o el alelo de QTL, el alelo marcador y/o o la mutación de F35H en la primera planta está presente en un estado heterocigoto, y/o el alelo de QTL, el alelo marcador y/o la mutación de F35H en la segunda planta está presente en un estado heterocigoto, y/o el alelo de QTL, el alelo marcador, y/o la mutación de F35H en la segunda planta no está presente, y/o se selecciona la progenie en la que el alelo de QTL, el alelo marcador y/o F35H mutado está presente en un estado homocigoto, y/o se selecciona la progenie en la que el alelo de QTL, el alelo marcador y/o el F35H mutado está presente en un estado heterocigoto.
En ciertas realizaciones, los métodos para obtener plantas o partes de plantas como se describe en el presente documento de acuerdo con la invención, tales como los métodos para obtener plantas o partes de plantas que tienen digestibilidad mejorada, involucran o comprenden transgénesis y/o edición de genes y/o edición de bases, tales como la inclusión de CRISPR/Cas, TALEN, ZFN, meganucleasas; mutagénesis (inducida), que puede o no ser una mutagénesis aleatoria, tal como TILLING. En ciertas realizaciones, los métodos para obtener plantas o partes de plantas como se describe en el presente documento de acuerdo con la invención, tales como los métodos para obtener plantas o partes de plantas que tienen una digestibilidad mejorada, implican o comprenden aplicaciones de ARNi, que pueden o no ser, comprender o implican aplicaciones transgénicas. Por ejemplo, las aplicaciones no transgénicas pueden implicar, por ejemplo, la aplicación de componentes de ARNi tales como ARNip bicatenario a plantas o superficies de plantas, como por ejemplo un aerosol. No se requiere una integración estable en el genoma de la planta.
En ciertas realizaciones, los métodos para obtener plantas o partes de plantas como se describe en el presente documento de acuerdo con la invención, tales como los métodos para obtener plantas o partes de plantas que tienen una digestibilidad mejorada, no implican ni comprenden transgénesis, edición de genes, edición de bases y/o mutagénesis.
El experto en la materia entenderá que el producto del gen F35H de tipo silvestre o no mutado es un producto del gen funcional que tiene actividad enzimática, como se define en este documento en otra parte. El experto en la materia comprenderá además que las variaciones de secuencia descritas anteriormente para el F35H de tipo silvestre no incluyen cambios de marco o mutaciones sin sentido.
Como se usa en el presente documento, el F35H mutado o la mutación en el F35H puede comprender o puede referirse a cualquier tipo de mutación de F35H. En determinadas realizaciones, la mutación altera la expresión de la proteína y/o el ARNm de F35H de tipo silvestre o nativo. En determinadas realizaciones, la mutación reduce o elimina la expresión de la proteína y/o el ARNm F35H (de tipo silvestre o nativo), como se describe en otra parte del presente documento. Las mutaciones pueden afectar la transcripción y/o la traducción. Las mutaciones pueden ocurrir en exones o intrones. Pueden producirse mutaciones en elementos reguladores, tales como promotores, potenciadores, terminadores, aislantes, etc. Pueden producirse mutaciones en secuencias codificantes. Pueden producirse mutaciones en los sitios de señal de empalme, tal como los sitios donantes o aceptores de empalme. Las mutaciones pueden ser mutaciones de cambio de marco. Las mutaciones pueden ser mutaciones sin sentido. Las mutaciones pueden ser por inserción o eliminación de uno o más nucleótidos. Las mutaciones pueden ser mutaciones no conservadoras (en las que uno o más aminoácidos de tipo silvestre se sustituyen por uno o más aminoácidos de tipo no silvestre). Las mutaciones pueden afectar o alterar la función de la proteína F35H, tal como la actividad enzimática. Las mutaciones pueden reducir o (sustancialmente) eliminar la función de la proteína F35H, tal como la actividad enzimática. Función reducida, tal como actividad enzimática reducida, puede referirse a una reducción de aproximadamente al menos 10 %, preferiblemente al menos 30 %, más preferiblemente al menos 50 %, tal como al menos 20 %, 40 %, 60 %, 80 % o más, tal como al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o más. La función (sustancialmente) eliminada, tal como la actividad enzimática (sustancialmente) eliminada, puede referirse a una reducción de al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 95 %. Las mutaciones pueden ser mutaciones negativas dominantes. En ciertas realizaciones, las mutaciones se evalúan con referencia a la línea endogámica de maíz PH207, como se define en este documento en otra parte.
En ciertas realizaciones, la mutación de F35H es una inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia codificante. En ciertas realizaciones, la mutación de F35H es una mutación sin sentido. En ciertas realizaciones, la mutación de F35H da como resultado una expresión alterada del gen F35H. En ciertas realizaciones, la mutación de F35H da como resultado la eliminación del gen F35H o la inactivación del ARNm y/o la proteína F35H. En ciertas realizaciones, la
mutación da como resultado un cambio de marco de la secuencia codificante de F35H. En ciertas realizaciones, la mutación da como resultado una secuencia de proteína alterada codificada por el gen F35H.
En ciertas realizaciones, la mutación de F35H es una inserción, preferiblemente en un exón, preferiblemente una inserción en el primer exón, de uno o más nucleótidos, preferiblemente una inserción de cambio de marco. En ciertas realizaciones, la inserción es de 187 nucleótidos o aproximadamente 187 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la inserción está entre la posición 97 y 98 del gen F35H representado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. El experto en la materia es capaz de determinar la posición correspondiente en homólogos u ortólogos de F35H. En ciertas realizaciones, la inserción comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10. En ciertas realizaciones, el F35H mutado comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11.
La expresión del ARNm y/o la proteína F35H puede reducirse o eliminarse mutando el propio gen F35H (incluido el elemento codificador, no codificante y regulador). Los métodos para introducir mutaciones se describen en este documento en otra parte. Alternativamente, la expresión del ARNm y/o la proteína F35H puede reducirse o eliminarse (específicamente) interfiriendo con la transcripción y/o traducción, tal como para disminuir o eliminar la transcripción o traducción de ARNm y/o proteína. Alternativamente, la expresión del ARNm y/o la proteína F35H puede reducirse o eliminarse (específicamente) interfiriendo con la estabilidad del ARNm y/o la proteína, tal como para reducir la estabilidad del ARNm y/o la proteína. Por ejemplo, la (estabilidad) del ARNm puede reducirse por medio de ARNi, como se describe en este documento en otra parte. También se puede usar miARN para afectar la (estabilidad) del ARNm. En determinadas realizaciones, una expresión reducida de F35H que se consigue reduciendo la estabilidad del ARNm o de la proteína también se incluye en el término F35H "mutado". En ciertas realizaciones, una expresión reducida de F35H que se logra reduciendo la estabilidad del ARNm o de la proteína no se incluye en el término F35H "mutado".
En ciertas realizaciones, los alelos marcadores (moleculares) que están asociados con una digestibilidad mejorada como se describe en el presente documento se definen como sigue:
ma61134xxx es una inserción de uno o más nucleótidos entre la posición 134254381 y 134254382 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, preferiblemente una inserción como se establece en la SEQ ID NO: 12; y/o
ma61070s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 121588825 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o T, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 13; y/o
ma30168s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 139452428 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 14; y/o
ma50827s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 127454426 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en SEQ ID NO: 15; y/o
ma16983s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 137363784 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en SEQ ID NO: 16; y/o
ma17117s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 132038900 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 17; y/o
ma61125s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 135947973 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 18;
preferiblemente cuando PH207 se refiere a línea endogámica de Zea mays como se describe en " "Draft Assembly of Elite Inbred Line PH207 Provides Insights into Genomic and Transcriptome Diversity in Maize", Hirsch et al., Plant Cell.
2016 Nov; 28(11): 2700-2714. Publicado el 1 de noviembre de 2016. doi: 10.1105/tpc.16.00353.
En ciertas realizaciones, la inserción asociada con el alelo marcador de ma61134xxx es una inserción de cambio de marco. En ciertas realizaciones, la inserción asociada con el alelo marcador de ma61134xxx es una inserción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10 En ciertas realizaciones, el alelo marcador de ma61134xxx comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos (contigua) de la SEQ ID NO: 12
En ciertas realizaciones, el alelo marcador de ma61070s01 comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos (contigua) de la SEQ ID NO: 13
En ciertas realizaciones, el alelo marcador de ma30168s02 comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos (contigua) de la SEQ ID NO: 14
En ciertas realizaciones, el alelo marcador de ma50827s01 comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos (contigua) de la SEQ ID NO: 15.
En ciertas realizaciones, el alelo marcador de ma16983s02 comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos (contigua) de la SEQ ID NO: 16.
En ciertas realizaciones, el alelo marcador de ma17117s01 comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos (contigua) de la SEQ ID NO: 17
En ciertas realizaciones, el alelo marcador de 61125s01 comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos (contigua) de la SEQ ID NO: 18
En un aspecto, la invención se refiere al uso de uno o más de los marcadores (moleculares) descritos en el presente documento para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada. En un aspecto, la invención se refiere al uso de uno o más de los marcadores (moleculares) descritos en el presente documento que pueden detectar al menos un alelo marcador de diagnóstico para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada. En un aspecto, la invención se refiere a la detección de uno o más de los alelos marcadores (moleculares) descritos en el presente documento para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada.
Los alelos marcadores de la invención, como se describe en el presente documento, pueden ser alelos marcadores de diagnóstico que se pueden utilizar para identificar o seleccionar plantas de maíz o partes de plantas de maíz que tienen una digestibilidad mejorada, preferiblemente una digestibilidad de rastrojo mejorada.
Además, la presente solicitud divulga un ácido polinucleico (aislado) que comprende un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente, o el complemento o el complemento inverso de un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente. Tal ácido polinucleico que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos o al menos 20 nucleótidos contiguos de un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente, o el complemento o el complemento inverso de un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente, y/o tal ácido polinucleico que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos o al menos 20 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18, o el complemento o el complemento inverso de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18, y/o el ácido polinucleico es capaz de discriminar entre un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente y un alelo marcador no molecular, tal como para hibridar específicamente con un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente, y/o el ácido polinucleico es capaz de hibridarse con un fragmento de nucleótido único o una sección de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18, o el complemento o el complemento inverso de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18. Se entenderá que una sección o fragmento único se refiere preferiblemente a una sección o fragmento que comprende el SNP o los respectivos alelos marcadores como se describió anteriormente (tal como los alelos marcadores de ma61070s01, ma30168s02, ma50827s01, ma16983s02, ma17117s01 o ma61125s01), o una sección o fragmento que comprende la unión 5' o 3' del inserto de un alelo marcador como se describió anteriormente o una sección o fracción comprendida dentro del inserto de un alelo marcador como se describió anteriormente (tal como el alelo marcador de ma61134xxx). Además, se describe que el ácido polinucleico o el complemento o el complemento inverso del mismo no hibrida (sustancialmente) ni se une al ADN (genómico) que se origina en la línea endogámica de maíz PH207, y/o la secuencia del ácido polinucleico o el complemento o el complemento inverso del mismo no se produce o no está presente en la línea endogámica de maíz PH207.
La presente solicitud divulga un ácido polinucleico capaz de hibridarse específicamente con un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente, o el complemento del mismo, o el complemento inverso del mismo.
Tal ácido polinucleico se hibrida específicamente con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NOs: 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18, o el complemento o el complemento inverso del mismo, y/o el ácido polinucleico es un cebador, y/o el ácido polinucleico es una sonda, y/o el ácido polinucleico es un ácido polinucleico específico del alelo, tal como un cebador o sonda específico de alelo, y/o el ácido polinucleico comprende al menos 15 nucleótidos, como tal 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleótidos, como al menos 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos, tal como al menos 100, 200, 300 o 500 nucleótidos.
Se entenderá que "hibridar específicamente" significa que el ácido polinucleico se hibrida con el alelo marcador (molecular) (tal como en condiciones de hibridación rigurosas, como se define en este documento en otra parte), pero no se hibrida (sustancialmente) con un ácido polinucleico que no comprende el alelo marcador o es (sustancialmente) incapaz de usarse como cebador de PCR. Por ejemplo, en una lectura adecuada, la señal de hibridación con el alelo marcador o la amplificación por PCR del alelo marcador es al menos 5 veces, preferiblemente al menos 10 veces más fuerte o más que la señal de hibridación con un alelo no marcador, o cualquier otra secuencia.
Además, la presente solicitud divulga un kit que comprende dichos ácidos polinucleicos, tales como cebadores (que comprenden cebadores directos y/o inversos) y/o sondas. El kit puede comprender además instrucciones de uso.
Se entenderá que en realizaciones relacionadas con un conjunto de cebadores directos e inversos, solo uno de ambos cebadores (directo o inverso) puede necesitar ser capaz de discriminar entre un alelo marcador (molecular) como se describió anteriormente y un alelo no marcador, y por lo tanto puede ser único. El otro cebador puede o no ser capaz de discriminar entre un alelo marcador (molecular) de la invención y un alelo no marcador y, por lo tanto, puede ser único.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir material vegetal ensilado o alimento para animales que tiene una digestibilidad mejorada, que comprende (a) cultivar la planta de acuerdo con la presente invención, (b) cosechar la planta o partes de la planta, (c) opcionalmente, trocear y/o triturar la planta, y (c) ensilar la planta, opcionalmente añadiendo un estimulante tal como un inoculante bacteriano, un azúcar y una enzima. Además, la invención se refiere a un material vegetal ensilado o alimento animal producido por dicho método.
En la presente solicitud, se divulga también un método para producir biogás o bioetanol, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar la planta o las partes de la planta de acuerdo con la presente invención o el material vegetal ensilado de acuerdo con la presente invención, y (b) producir biogás o bioetanol a partir de la planta o del material vegetal ensilado.
Los aspectos y realizaciones de la invención se apoyan además en los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se llevó a cabo un experimento de QTL sobre la digestibilidad del rastrojo en dos poblaciones de DH (haploide doble). En ambas poblaciones se identificó un QTL con fuerte efecto en la misma posición cromosómica en el cromosoma 9 (Fig. 1). La región de QTL parece no contener ninguno de los genes caracterizados conocidos del metabolismo de la lignina.
El análisis de marcadores usando genotipado de SNP de alta densidad con una matriz de SNP no mostró polimorfismos entre la línea que alberga el alelo positivo del QTL y otras líneas disponibles comercialmente. Aprovechando este efecto, se llevó a cabo un experimento de captura de secuencias utilizando una línea portadora de QTL y una línea de control. Como en ese momento, la única secuencia de referencia genómica era AGPv02, se desarrollaron sondas para la captura de secuencias sobre esta referencia. El análisis de datos resultó ser muy difícil debido a la alta repetitividad de la región y en parte a la baja similitud entre la región en B73 (AGPv02) y el alelo de QTL. A partir de este experimento, se desarrolló un marcador, ma60405s01, que mostraba un polimorfismo entre las dos líneas en la región de QTL.
Con el fin de identificar otros marcadores preferiblemente polimórficos, se realizó una secuenciación del genoma completo (WGS) de una línea portadora de QTL. Se seleccionaron estructuras que cubrían el objetivo y se compararon con el genoma de referencia de PH207 ("Draft Assembly of Elite Inbred Line PH207 Provides Insights into Genomic and Transcriptome Diversity in Maize", Hirsch et al., Plant Cell. Nov de 2016; 28(11): 2700-2714. Publicado en línea el 1 de nov de 2016. doi: 10.1105/tpc.16.00353). Se pudieron identificar tres marcadores polimórficos más (ma61126d01, ma61134xxx y ma61125s01, véase la Fig. 2). Sus alelos específicos de QTL son únicos y no se pueden detectar en ninguna línea kWs utilizada para el mejoramiento de maíz para ensilaje.
El mapeo fino del QTL ha reducido la región primero a 16.7 MB y en la última etapa hasta aprox. 719 kb en la referencia PH207 (véase la Fig. 3 y la Tabla 1). La Figura 3 muestra dos familias de recombinantes derivados de los cruces de la línea QTL (B) con una línea que no porta el QTL (A). El DNDF indicado es la media de todos los miembros de la familia con o sin QTL respectivamente. El marcador que mejor se asocia con el fenotipo en los últimos recombinantes es ma61134xxx. Representa una inserción de 187 pb en un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa del citocromo P450 (llamado F35H, véase la Fig. 4). Esta inserción provoca un alargamiento del extremo terminal N de la proteína y un codón de terminación temprano que probablemente conduce a la eliminación del gen. El gen correspondiente de AGPv02 se expresa en hojas y tallo. Se encuentra al comienzo del metabolismo de los flavonoides tomando recursos de la ruta metabólica de la lignina.
Tabla 1: Lista de marcadores para QTL de ensilaje o el gen como tal.
Dentro de la región de 133,4-135,9 MB del cromosoma 9 en PH207, se comprobaron todos los demás genes hipotéticos derivados de la anotación interna del fabricante de PH207 en busca de polimorfismo entre la línea de QTL y PH207. De más de 100 genes, solo el descrito mostró un polimorfismo. 79 genes eran idénticos. El resto fue en su mayoría repetitivo o solo parcialmente representado en el ensamblaje de la línea de QTL.
El marcador capilar ma61134xxx podría convertirse en un par de marcadores KASP dominantes y en un marcador KASP codominante, los tres están disponibles para uso rutinario.
El marcador de diagnóstico más importante ma61134xxx está dirigido a la inserción en el gen causante. La inserción está presente en el genotipo que porta el QTL de ensilaje y está ausente en la línea de referencia PH207. En PH207 la siguiente secuencia no está presente en el gen (SEQ ID NO: 10):
CTTCTGCCCAGAAGCGGGCCCAGACATTTGAGATTGGGTATTCAAAAATTCAAAAGATTAAAGA
A T T T A G T G T T C T A A C G C T A T T T T A T G C A A T A C A T T A T T G A C A A A T T A G T G T T C T A A C A C T A T A G
ATCACCAAAAACATGGGTATTCAATGAATACCCATGAAACCCCCCTGGGCCCGCCCATG
El experto en la materia es capaz de diseñar marcadores para sistemas de marcadores conocidos que permitan detectar la presencia o ausencia de la inserción.
Además, un experto en la técnica también puede encontrar marcadores para sistemas de marcadores conocidos que son adecuados para el análisis adicional de la región de QTL para ensilaje, así como marcadores con valor de diagnóstico que se basan, por ejemplo, en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o InDels (véase el ejemplo de la Tabla 2).
Tabla 2: Alelos marcadores en la línea de QTL
En conclusión, la presente invención describe la identificación de un haplotipo marcador que abarca 3,8 MB de PH207 (véase la Fig. 2) y describe el genotipo de la línea de QTL en la región objetivo: El conjunto de marcadores identificados durante el mapeo (véase las tablas 1 y 2) se puede usar para integrar el QTL positivo en cualquier ambiente genético relevante. Lo más importante es el marcador de diagnóstico para la inserción, que es la mutación funcional. Sin embargo, el uso de marcadores fuera del gen en la región flanqueante estrechamente ligada al gen también puede usarse para identificar el genotipo de la línea de QTL. El haplotipo único de marcadores (vease la Fig. 2) se puede usar para aplicaciones asistidas por marcadores, es decir, para la introgresión de rasgos a través de retrocruzamiento o mejoramiento progresivo y para monitorizar la presencia del haplotipo único de ensilaje. Además, los marcadores desarrollados pueden utilizarse para aumentar la variación genética en esta región cromosómica y mantener el alelo ventajoso del ensilaje. Además se describe la identificación de un gen para el objetivo: El conocimiento del gen y la inserción encontrada (mutación funcional) se puede utilizar para aumentar la variabilidad genética en este locus mediante labranza o edición del genoma o modificación genética para mejorar aún más el efecto.
Claims (15)
1. Un método para identificar una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada que comprende
a) detección de la presencia de un alelo de QTL, tal como un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H (tal como una mutación por inactivación o eliminación), o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, o
b) detección de la expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H o una proteína F35H no funcional (por ejemplo, proteína F35H truncada) o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida, o
c) detección de la presencia de una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción;
en el que la digestibilidad mejorada se refiere a una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b) o c) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica; y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3;
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el método comprende la detección de la presencia del alelo marcador molecular de ma61134xxx y/o uno o más alelos marcadores moleculares ubicados en un intervalo cromosómico en el cromosoma 9 flanqueado por los alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por los alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01;
en el que ma61134xxx es una inserción de uno o más nucleótidos entre la posición 134254381 y 134254382 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, preferiblemente una inserción como se establece en la SEQ ID NO: 12; y
ma61070s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 121588825 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o T, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 13; y
ma30168s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 139452428 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la s Eq ID NO: 14; y
ma50827s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 127454426 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 15; y
ma16983s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 137363784 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la s Eq ID NO: 16; y
ma17117s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 132038900 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la s Eq ID NO: 17; y
ma61125s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 135947973 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 18.
3. Una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada que comprende
a) un alelo de QTL asociado con una digestibilidad mejorada, comprendiendo dicho alelo de QTL una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce
a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción; o
b) una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción; o
c) una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H o que tiene actividad enzimática reducida; o
d) una molécula de ARNi dirigida contra, que se dirige a, o que hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína F35H, o que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una molécula de a Rní dirigida contra, que se dirige a, o que hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína F35H; o e) un sistema CRISPR/Cas específico de ARN dirigido contra o que se dirige a una secuencia de nucleótidos que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN;
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2; (v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas;
en el que la planta de maíz o parte de la planta de maíz no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.
4. La planta de maíz o parte de la planta de maíz de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha planta de maíz comprende el alelo marcador de ma61134xxx;
en la que ma61134xxx es una inserción de uno o más nucleótidos entre la posición 134254381 y 134254382 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, preferiblemente una inserción como se establece en la SEQ ID NO: 12.
5. La planta de maíz o parte de la planta de maíz de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en la que dicha planta de maíz comprende dicho alelo de QTL, dichos alelos marcadores, teniendo dicha secuencia de nucleótidos del gen que codifica el flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 que tiene la mutación, dicha molécula de ARNi o dicha secuencia polinucleotídica que codifica la molécula de ARNi, dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN y/o dicha una o más secuencias polinucleotídicas que codifican el sistema CRISPR/Cas específico de ARN como transgén o como (gen) endógeno editado.
6. Un método para mejorar la digestibilidad de una planta de maíz o parte de una planta de maíz, que comprende la introducción a través de una integración estable o transitoria por medio de transformación, inserción usando tecnología de edición de genes o modificación usando mutagénesis aleatoria o dirigida en el genoma de la planta o parte de la planta
(a) una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o de la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción, o
comprendiendo dicho método
(b) reducir la expresión del ARNm de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 y/o la proteína F35H, o reducir la actividad enzimática de un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450; en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a) o b) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6 (b), que comprende
(a) introducir en una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno que codifica el flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, o
(b) introducir en la planta o parte de la planta una molécula de ARNi dirigida contra, que se dirige a, o que hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una secuencia de polinucleótidos que codifica una molécula de ARNi dirigida contra, que se dirige a, o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o
(c) introducir en la planta o parte de la planta un sistema CRISPR/Cas específico de ARN dirigido contra o que se dirige a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN, o
(d) introducir en la planta o parte de la planta un compuesto químico o un anticuerpo que reduzca o inhiba la actividad enzimática de la proteína F35H tras la interacción con dicha F35H.
8. Un método para producir una planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene una digestibilidad mejorada, que comprende
(a) introducir mediante integración estable o transitoria mediante transformación, inserción usando tecnología de edición de genes o modificación mediante mutagénesis aleatoria o dirigida en el genoma de una planta o parte de una planta una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica un flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450, que tiene una mutación que conduce a una expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene actividad enzimática reducida tras la traducción, o
(b) introducir mediante modificación utilizando mutagénesis aleatoria o dirigida en una secuencia de nucleótidos de un gen endógeno que codifica el flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F35H) del citocromo P450 una mutación que conduce a la expresión reducida o ausente del ARNm del gen y/o la proteína F35H, o una mutación que conduce a una proteína F35H no funcional o una proteína F35H que tiene una actividad enzimática reducida tras la traducción, o
(c) introducir a través de integración estable o transitoria por medio de transformación o inserción utilizando tecnología de edición de genes en la planta o la parte de la planta una molécula de ARNi, dirigida contra, que se dirige a, o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una secuencia de polinucleótidos que codifica una molécula de ARNi dirigida contra, que se dirige a, o que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o
(d) introducir mediante integración estable o transitoria por medio de transformación o inserción utilizando tecnología de edición de genes en la planta o la parte de la planta un sistema CRISPR/Cas específico de ARN, dirigido contra, o que se dirige a, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína F35H, o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican dicho sistema CRISPR/Cas específico de ARN, o
(e) introducir en la planta o parte de la planta un compuesto químico o un anticuerpo que reduzca la actividad enzimática de la proteína F35H o inhibir la proteína F35H; y
(f) opcionalmente, regenerar una planta a partir de la parte de la planta de cualquiera de (a) a (e);
en el que la digestibilidad mejorada se relaciona con una mayor digestibilidad de la planta de maíz o parte de una planta de maíz que tiene la característica de a), b), c), d) o e) en comparación con una planta de maíz o parte de una planta de maíz que no tiene tal característica, y
en el que el F35H no mutado se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 4 o 7;
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene el ADNc de la SEQ ID NO: 2, 5 u 8;
(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9;
(iv) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7 u 8;
(v) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 3, 6 o 9; y
(vi) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (i), (ii) o (iii) en condiciones de hibridación rigurosas.
9. Una planta de maíz o parte de una planta de maíz producida o producible por el método de acuerdo con la reivindicación 8.
10. El método, planta o parte de la planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha planta es una planta de maíz, en el que el QTL está ubicado en el cromosoma 9 y comprende y/o está flanqueado por alelos marcadores de ma61070s01 y ma30168s02, preferiblemente por alelos marcadores de ma50827s01 y ma16983s02, más preferiblemente por los alelos marcadores de ma17117s01 y ma61125s01;
en el que ma61070s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 121588825 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o T, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en Se Q ID NO: 13; y
ma30168s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 139452428 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en SEQ ID NO: 14; y
ma50827s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 127454426 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 15; y
ma16983s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 137363784 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la s Eq ID NO: 16; y
ma17117s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 132038900 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 17; y
ma61125s01 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 135947973 del cromosoma 9 con referencia a la línea PH207, en el que dicho nucleótido es A o G, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 18.
11. El método, planta o parte de la planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mutación es una mutación de cambio de marco o una mutación sin sentido, da como resultado una expresión reducida o ausente de la secuencia de nucleótidos o una actividad enzimática reducida de la proteína codificada, da como resultado una secuencia de proteína alterada codificada por la secuencia de nucleótidos, o es una inserción, eliminación o sustitución de al menos un nucleótido en una región codificante, en una señal de empalme o en un elemento regulador.
12. Uso del ácido polinucleico que hibrida específicamente con cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO: 10, 12, 13. 14, 15, 16, 17 o 18, o el complemento o el complemento inverso del mismo, o un ácido polinucleico específico del alelo, para la identificación de una planta o parte de una planta con digestibilidad mejorada o para la selección de una planta o parte de la planta que tiene una digestibilidad mejorada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, preferiblemente en el método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
13. Un método para producir un material vegetal ensilado o alimento para animales que tiene una digestibilidad mejorada, que comprende
(a) cultivar la planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 y 9, o una planta identificada o identificable mediante el método de las reivindicaciones 1 o 2, o una progenie de la misma que tenga la digestibilidad mejorada como se define en la reivindicación 1,
(b) cosechar la planta o una parte de ella, y
(c) ensilar la planta o una parte de la misma de (b).
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la parte en la etapa (b) y (c) es rastrojo.
15. Un material vegetal ensilado o alimento para animales producido por el método de la reivindicación 13 o 14.
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