ES2923015T3 - Fijación como objetivo de sinaptogirina-3 en el tratamiento de tauopatías - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a la identificación de sinaptogirina-3 como diana para tratar o inhibir la progresión de tauopatías o síntomas de tauopatías. En particular, se prevén inhibidores de sinaptogirina-3 para uso como medicamento en general, y para tratar o inhibir la progresión de tauopatías o síntomas de tauopatías. La invención se refiere además a métodos para la identificación o el cribado de inhibidores de sinaptogirina-3. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Fijación como objetivo de sinaptogirina-3 en el tratamiento de tauopatías
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a la identificación de sinaptogirina-3 como diana para tratar o inhibir la progresión de tauopatías o síntomas de tauopatías. En particular, se prevén inhibidores de sinaptogirina-3 para uso en el tratamiento o la inhibición de la progresión de tauopatías o síntomas de tauopatías.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La patología Tau está asociada con más de veinte enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (Wang y Mandelkow 2016). La hiperfosforilación o mutación de la proteína Tau asociada a los microtúbulos es común a todas estas enfermedades, denominadas colectivamente tauopatías, y las inclusiones filamentosas de Tau hiperfosforilada son patologías características de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías (Ballatore et al.
2007). La patología Tau no es simplemente un subproducto de otras vías patológicas, sino que es un mediador clave de la propia neurotoxicidad. En modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer familiar que modelan la producción excesiva de p-amiloide, la reducción de Tau endógena mejora la neurotoxicidad y los déficits cognitivos (Roberson et al. 2007). Además, las mutaciones en el locus MAPT que codifica Tau son las causantes de la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17) (Hutton et al. 1998), y las duplicaciones o haplotipos de Tau que tienen niveles elevados de expresión de Tau están fuertemente asociados con la demencia. (Caffrey y Wade-Martins 2007; Le Guennec et al. 2016). Estos datos respaldan a Tau como ejecutor de la toxicidad neuronal y la degeneración en enfermedades humanas.
En condiciones fisiológicas, Tau se expresa en neuronas y se une a microtúbulos axonales. Sin embargo, en condiciones patológicas, las mutaciones en Tau (en FTDP-17) o la fosforilación anormal de Tau (incluyendo la enfermedad de Alzheimer esporádica) disminuyen su afinidad de unión a microtúbulos (Hong et al. 1998; Wang y Mandelkow 2016), lo que conduce a su disociación de microtúbulos axonales y a la subsiguiente mala localización en las sinapsis (Spires-Jones y Hyman 2014; Tai et al. 2012; 2014). En pacientes con enfermedad de Alzheimer y modelos animales de tauopatía, la mala localización de Tau en los compartimientos sinápticos se correlaciona bien con el inicio de la disfunción sináptica y el deterioro cognitivo (DeKosky y Scheff 1990; Spires-Jones & Hyman 2014; Yoshiyama et al. 2007). Es importante destacar que los defectos sinápticos están asociados con formas solubles de Tau que preceden a la formación de ovillos de Tau en etapas tempranas de la enfermedad (Koss et al. 2016), de acuerdo con estudios que demuestran que Tau soluble es suficiente para impulsar la disfunción neuronal en ausencia de ovillos (Crimins et al. 2012; Polydoro et al. 2014; Rocher et al. 2010; Santacruz et al. 2005). Estos hallazgos destacan un papel clave de Tau soluble en la perturbación de la función sináptica en las primeras etapas de la enfermedad, lo que puede contribuir a la posterior pérdida de sinapsis y a la neurodegeneración. Sin embargo, los mecanismos por los cuales Tau afecta la función sináptica siguen estando poco explorados.
El trabajo anterior ha dilucidado las funciones de Tau patológica en la contribución a la disfunción post-sináptica debido a su mala localización en las espinas dendríticas y la interferencia con la organización del receptor de glutamato (Hoover et al. 2010; Ittner et al. 2010; Zhao et al. 2016). Sin embargo, además de su localización postsináptica, Tau patológica también está presente en los compartimientos presinápticos (Tai et al. 2014; 2012; Zhou et al. 2017), lo que sugiere que la función de Tau en la presinapsis también puede contribuir a la patogenia de la enfermedad. Una función presináptica de Tau también es pertinente, dado que se cree que la neurodegeneración comienza con la pérdida de terminales presinápticos y continúa retrógradamente en un proceso de retro-tinción (Yoshiyama et al. 2007), y en las neuronas de moscas y ratas Tau puede interferir con la liberación de neurotransmisores al asociarse con vesículas sinápticas en terminales presinápticas (Zhou et al. 2017). El documento WO2016151523A1 describe terapias mediadas por ARNi para enfermedades neurodegenerativas asociadas con anomalías de Tau.
Los niveles de fluidos corporales de sinaptogirina-1, sinaptogirina-3 o variantes de las mismas se han sugerido como biomarcadores para la enfermedad de Alzheimer (documento WO2007/140975).
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona la materia objeto que se establece en uno cualquiera y en todos los puntos (1) a (8) que figuran a continuación:
(1) Un inhibidor de sinaptogirina-3 para uso en el tratamiento o la inhibición de la progresión de un trastorno tauopático o para uso en el tratamiento o inhibición de un síntoma de un trastorno tauopático, en donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un gapmero, un ARNpi, un ARNhc, una nucleasa con dedos de zinc, una meganucleasa, una nucleasa efectora TAL, un efector CRISPR-Cas, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a sinaptogirina-3, un alfacuerpo, un nanocuerpo, un intracuerpo, un aptámero, una DARPin, un aficuerpo, una afitina, una anticalina y un monocuerpo.
(2) El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con (1), en donde la sinaptogirina-3 es una sinaptogirina-3 humana.
(3) El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con cualquiera de (1 )-(2), en donde el inhibidor reduce la expresión de sinaptogirina-3 o bloquea la unión de sinaptogirina-3 a la región N-terminal de la proteína Tau.
(4) El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con cualquiera de (1)-(3), en donde el anticuerpo o fragmento del mismo, el alfacuerpo, el nanocuerpo, el intracuerpo, el aptámero, la DARPin, el aficuerpo, la afitina, la anticalina o el monocuerpo se unen a al menos una región de sinaptogirina-3 expuesta intraneuronalmente.
(5) El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con (4), en donde la región de sinaptogirina-3 expuesta intraneuronalmente se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, y variantes de las mismas.
(6) El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con cualquiera de (1 )-(5), en donde el trastorno tauopático se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva (PSP), parálisis supranuclear progresiva-parkinsonismo (PSP-P), síndrome de Richardson, enfermedad argiofílica granulosa, degeneración corticobasal, enfermedad de Pick, demencia frontotemporal con parkinsonismo asociado con el cromosoma 17 (FTDP-17, por sus siglas en inglés), parkinsonismo post-encefalítico, complejo de la enfermedad de Parkinson de Guam, parkinsonismo guadalupeño, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, demencia pugilística, demencia británica familiar, demencia danesa familiar, distrofia miotónica, enfermedad de Hallevorden-Spatz, Niemann Pick tipo C, encefalopatía traumática crónica, demencia solo con ovillos, tauopatía de sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, panencefalitis esclerosante subaguda, retraso mental relacionado con SLC9A6, enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, degeneración del lóbulo frontotemporal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, encefalopatía traumática crónica, esclerosis lateral amiotrófica de Guam, esclerosis lateral amiotrófica y complejo parkinsonismo-demencia, angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica y gliosis subcortical progresiva.
(7) El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con cualquiera de (1 )-(5), en donde el síntoma del trastorno tauopático se selecciona del grupo de deterioro cognitivo leve, demencia, deterioro cognitivo, deterioro de la función motora, disfunción oculomotora y bulbar, disfunción sináptica, neurotoxicidad, degeneración neuronal, disfunción neuronal, pérdida de sinapsis y depósito de amiloide.
(8) El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con, en donde la disfunción sináptica es una disfunción presináptica.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1. Las pantallas genéticas y proteómicas directas integradas identifican sinaptogirina-3 como un interactuador físico y genético de Tau. (A-D) Se requieren interacciones proteína-proteína para la unión de Tau a SVs (siglas inglesas de vesículas sinápticas). (A) La tinción con Ponceau S de las fracciones tomadas durante la digestión con tripsina de SV demuestra la proteólisis de las proteínas SV por tripsina. (B) La inmunotransferencia de SVs tripsinizadas muestra la degradación proteolítica de las proteínas asociadas a SV Sinapsina (Syn) y Munc18, y la degradación de los dominios citoplasmáticos de las proteínas transmembrana SV SV2, Sinaptobrevina-2 (Syb) (epítopos citoplasmáticos) y Sinaptotagmina-1 (Syt) (epítopo intravesicular). (C) Inmunotransferencias representativas del ensayo de la co-sedimentación con Tau-His humana recombinante purificada y SVs no tratadas o tripsinizadas. La inmunotransferencia para Tau (anticuerpo anti-His) en el sedimento de SV evalúa la unión a SVs según se cuantifica en (D). El gráfico representa la media ± DE (n = 3 experimentos, test t de Student). (E-G) La unión de Tau a las SVs es mediada por interacciones con proteínas SV de la transmembrana. (E) La inmunotransferencia de SVs no tratadas o despojadas de carbonato confirma la separación de las proteínas Syn y Munc18 asociadas a SV, pero la retención de las proteínas SV transmembrana SV2, Syt y Syb (epítopos citoplasmáticos). (F) Inmunotransferencias representativas del ensayo de co-sedimentación que evalúan la unión de Tau a SVs no tratadas o despojadas de carbonato como se cuantifica en (G). El gráfico representa la media ± DE (n = 2 experimentos) (H-I) Identificación del interactuador SV de Tau por espectrometría de masas. (H) Flujo de trabajo experimental de co-IP de lisado de proteína SV con Tau humana recombinante purificada. (I) Resultados filtrados del análisis LC-MS/MS que muestran recuentos de péptidos sumados de 3 repeticiones. Las proteínas específicas del extremo N de Tau están en rojo. Véase la Tabla S2 para ver el conjunto de datos sin procesar no filtrados. (J-K) Pantalla de seguimiento in vivo de interactuadores candidatos en Drosophila. (J) Flujo de trabajo experimental para evaluar la unión de Tau a SVs en NMJs tras la pérdida de interactuadores candidatos identificados en (I). (K) La unión de Tau a SVs se cuantificó calculando el coeficiente de co-localización de Pearson de Tau inmunomarcado y el marcador SV CSP en NMJ (véase también la Figura 2). Larvas de Drosophila expresan UAS-TauP301L o UAS-TauP301L AN bajo el controlador D42-Gal4 específico para la neurona motora. El gráfico representa la media ± EMT (n > 8 NMJs por genotipo de > 4 animales por genotipo, ANOVA de una vía). Véanse también las Figuras 5 y 6.
Figura 2. Sinaptogirina de Drosophila media en la asociación de Tau con vesículas sinápticas in vivo e in vitro. Larvas de Drosophila expresan el mutante patológico UAS-Tau, UAS-Tau AN y/o UAS-syngr ARNhc bajo el control del promotor de la neurona motora D42-Ga14 en un fondo de tipo salvaje (WT ) o syngr+/- - (A) Imágenes confocales representativas de Tau inmunomarcado (anticuerpo DAKO) y SVs (anticuerpo CSP) en NMJs de Drosophila. Las flechas blancas indican botones presinápticos. Los botones marcados con flechas amarillas se muestran ampliados en (B). Las barras de escala son de 5 gm. (C) Cuantificación del coeficiente de co-localización de Pearson de Tau y CSP tras la pérdida heterocigótica o la reducción de Syngr en larvas que expresan mutantes patológicos de Tau. El gráfico representa la media ± EMT (n = 10-28 NMJs de > 6 animales por genotipo, ANOVA de una vía, cada condición en comparación con Tau solo para cada genotipo mutante respectivo). (D) Inmunotransferencias representativas que detectan la unión de Tau humana recombinante a SVs aisladas de cerebros de moscas WT o syngr KO en un ensayo de co-sedimentación como se cuantifica en (E). El gráfico representa la media ± DE (n = 4 experimentos, prueba t de Student). Véase también la Figura 6.
Figura 3. La reducción de sinaptogirina rescata los defectos inducidos por Tau en la movilidad de las vesículas sinápticas y la liberación de neurotransmisores en las uniones neuromusculares de Drosophila. (A-B) Ensayo FRAP para medir la movilidad de SV dentro de los botones presinápticos. Larvas de Drosophila expresan UAS-Syt-GFP y UAS-Tau bajo el control del controlador de neurona motora D42-Ga14 en un fondo WT o syngr+/- - (A) Imágenes representativas de la señal Syt-GFP antes y después del fotoblanqueo muestran la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo de un área pequeña (flecha) de fluorescencia Syt-GFP en el botón presináptico durante 60 s. El control es D42 > Syt-GFP solo. La barra de escala es de 5 gm. (B) Gráfico de recuperación de fluorescencia Syt-GFP a lo largo del tiempo ajustado a una curva exponencial doble. Las trazas se promedian de n = 10-15 botones de > 5 animales. (C-E) Registros electrofisiológicos de liberación de neurotransmisores en NMJs. (C) Gráfico de amplitudes de potencial de unión excitatoria promedio (EJP, por sus siglas en inglés) en respuesta a estimulación de 10 Hz a lo largo de 10 min desde el control (solo control D42, n = 8), D42 > Tau P301L (n = 12) o Tau P301L, syngr+/ -(n = 9) NMJs (1 NMJ por animal). Las amplitudes se agrupan en intervalos de 30 s y se normalizan al promedio de los primeros 15 s. El gráfico representa la media ± EMT. (D) Rastros representativos de datos sin procesar. (E) Amplitud EJP evocada relativa a los 600 s representada como puntos de datos individuales. El gráfico muestra la media ± SEM (ANOVA de una vía).
Figura 4. La reducción de sinaptogirina-3 rescata la disfunción presináptica en neuronas primarias del hipocampo de ratones transgénicos Tau. (A-C) Syngr3 media en la localización de Tau en grupos de vesículas presinápticas. (A) Imágenes confocales representativas de neuronas TauP301S (en DIV 17) transducidas con lentivirus que expresan RFP y codifican ARNhc aleatorios o Syngr3 reducida e inmunomarcada para TauP301S (anticuerpo hTau HT7), el marcador SV Sinapsina (Syn) y el marcador dendrítico MAP2. Las flechas blancas indican puntos Syn presinápticos a lo largo de los axones. La barra de escala es de 5 gm. (B) Cuantificación de la localización de TauP301S en SV (coeficiente de Pearson de Tau y Syn a lo largo de los axones). (C) Cuantificación de los niveles generales de Tau P301S (intensidad de hTau a lo largo de los axones). Los gráficos representan la media ± EMT (n = 85 axones/células de > 24 cubreobjetos por condición de 6 cultivos independientes, ANOVA de una vía). (D-F) La sinaptogirina-3 media en los defectos inducidos por Tau en la movilidad de las vesículas. Las neuronas de ratones de la camada no transgénicos (no Tg) o TauP301S se transdujeron con lentivirus que expresan Syph-GFP solo o en combinación con virus ARNhc aleatorios o Syngr3. (D) Imágenes representativas de la intensidad de fluorescencia Syph-GFP durante la estimulación sostenida de 30 Hz. Las flechas blancas indican puntos presinápticos Syph-GFP (grupos SV). La barra de escala es de 1 gm. (E-F) Gráficos que representan el cambio en la intensidad de fluorescencia de Syph-GFP en neuronas no Tg y TauP301S (E) o en neuronas TauP301S co-transducidas con virus ARNhc (F). Se tomaron imágenes de las neuronas en reposo durante 30 s y luego se estimularon a 30 Hz en una cámara de estimulación de campo durante 3 min. El cambio en la fluorescencia se calculó para > 20 puntos de > 3 axones por cubreobjetos y luego se promedió para dar n = 1 traza por cubreobjetos. Los gráficos representan la media ± EMT (n se indica a partir de > 5 cultivos independientes). Véase también la Figura 7. (G-I) La reducción de sinaptogirina-3 rescata los defectos inducidos por Tau en la liberación evocada de neurotransmisores. (G) Rastros representativos de registros de neuronas hipocampales autápticas en respuesta a 10 trenes de estimulación de alta frecuencia consecutivos (10 Hz durante 10 s con intervalo de 30 s) utilizando electrofisiología de pinzamiento de parche. (H-I) Con respecto a primeros eEPSCs relativos para cada tren representados en el número de tren a partir de registros de TauP301S y animales de la camada no Tg (H) o neuronas TauP301S transducidas con virus ARNhc (I). Los gráficos representan la media ± EMT (n se indica a partir de > 3 cultivos independientes). Véase también la Figura 7.
Figura 5. Las especies patológicas de Tau se acumulan en vesículas sinápticas aisladas de cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés). Relacionado con la Figura 1. (A) Esquema que representa el aislamiento de SVs de tejido cerebral humano post mortem. (B) Inmunotransferencias representativas de fracciones (20 gg de proteína de cada una de las fracciones) recogidas durante el aislamiento de SV de un sujeto de control sin demencia muestran un enriquecimiento de los marcadores de SV Sinaptotagmina-1 (Syt) y Sinapsina-1 (Syn), y agotamiento del marcador postsináptico PSD-95 y el marcador mitocondrial TOM20. (C) Inmunotransferencias representativas que detectan fosfo-Tau (pTau) utilizando anticuerpo PHF-1 (epítopo fosfo-Ser396/Ser404) o anticuerpo Tau total (DAKO) de fracciones subcelulares representativas (20 gg de proteína de cada una de las fracciones) recogidas durante el aislamiento de SV de cerebros de pacientes de AD en comparación con los cerebros de sujetos de control. La inmunotransferencia de Syt verifica el enriquecimiento de SVs en las fracciones de SV. Obsérvese la presencia de especies de pTau tanto monoméricas (alrededor de 50 kDa) como oligoméricas (> 100 kDa). (D) Inmunotransferencias representativas que comparan directamente la cantidad de pTau detectada con el anticuerpo PHF-1 o el anticuerpo AT8 (epítopo fosfo-Ser202/Thr205), o Tau total (anticuerpo DAKO) presente en homogeneizados totales o en fracciones SV de pacientes o controles con AD. GAPDH y Syt se utilizan como controles de carga para homogeneizados totales y fracciones SV, respectivamente. (E) Cuantificaciones de inmunotransferencias que comparan los niveles de pTau o Tau total en el control y el cerebro del paciente con AD en fracciones homogeneizadas totales o SV. Los gráficos representan la media ± EMT (n = 13 sujetos de control sin demencia, n = 15 pacientes con EA, test t de Student). Véase la Tabla S1 para obtener información sobre casos de pacientes.
Figura 6. Relacionado con las Figuras 1 y 2. (A-B) Aislamiento de vesículas sinápticas de cerebro de ratón. (A) Esquema que representa el proceso de aislamiento de SVs del cerebro de ratones. (B) La inmunotransferencia de las fracciones recogidas durante el aislamiento de SV (20 pg de proteína de cada una de las fracciones) demuestra que la fracción de SV (LP2) está enriquecida para los marcadores de SV sinaptofisina (Syph) y sinapsina (Syn) y está agotada del marcador post-sináptico PSD-95. (C) Purificación de Tau humana recombinante. Tinción con Coomassie coloidal (1 pg de proteína) de Tau humana de tipo salvaje (isoforma 0N4R) recombinante etiquetada con 8xHis de longitud completa (FL, aa 1 -383) o N-terminal truncada (AN, aa 113-383) purificada a partir de cultivos bacterianos. (D) Ensayo de co-flotación de Tau recombinante y liposomas. Tau y liposomas se incubaron juntos, luego se cubrieron con un cojín de sacarosa y se centrifugaron. Debido a su densidad, los liposomas ascienden a la fracción superior del cojín de sacarosa después de la centrifugación. Panel izquierdo: inmunotransferencia que muestra que Tau recombinante (anticuerpo anti-His) no asciende a la fracción superior junto con los liposomas en un ensayo de co-flotación, lo que indica una falta de unión. Cada una de las fracciones se cargó en volúmenes iguales. Panel derecho: la retención de Tau en la fracción inferior no se debe a la granulación de Tau (p. ej., debido a la agregación), ya que la Tau sola no se sedimenta en ausencia de un cojín de sacarosa. Las entradas son del 10 %. (E-F) Eficacia de reducción de ARNhc syngr de Drosophila. (E) Inmunotransferencia representativa de los niveles de Syngr en lisados de proteínas de cerebro de mosca adulta, como se cuantifica en (F). El nivel se normalizó al control de carga de actina. Se utilizaron moscas w1118 de tipo salvaje como controles. El ARNhc UAS-syngr es impulsado por el controlador pan-neuronal nSyb-Gal4. El gráfico representa la media ± DE (n = 3 experimentos, ANOVA de una vía). (G-H) Aislamiento de vesículas sinápticas del cerebro adulto de Drosophila. (G) Esquema que representa el proceso de aislamiento de SVs del cerebro adulto de Drosophila. (H) Inmunotransferencias de fracciones recogidas durante el aislamiento de SV (20 pg de proteína de cada una de las fracciones) demuestran que la fracción de SV está enriquecida para el marcador de SV proteína de cadena de cisteína (CSP, por sus siglas en inglés) y agotada del marcador post-sináptico Discos-grandes (Dlg, por sus siglas en inglés) y el marcador mitocondrial ATP sintasa.
Figura 7. Relacionado con Figura 4. (A-C) Tau P301S muestra la localización presináptica punteada en neuronas primarias de ratones transgénicos Tau. (A) Imágenes representativas de neuronas hipocampales primarias (en DIV17) de ratones Tau PS19 inmunomarcados para TauP301S (hTau), el marcador presináptico de SV VGlut1 y el marcador dendrítico MAP2. Obsérvese que el patrón de tinción puntiforme de hTau (anticuerpo HT7) en los axones distales (flechas amarillas), que se colocaliza con VGlut1. La barra de escala es de 15 pm. (B) Mayor aumento del segmento axonal representado en el recuadro en (A). Las flechas blancas indican puntos presinápticos VGlut1. La barra de escala es de 5 pm. (C) Gráfico de intensidades de fluorescencia relativas por posición a lo largo del axón representado en (B) que demuestra que la intensidad de hTau alcanza su punto máximo en las posiciones de VGlut1. (D-G) Validación de la reducción de sinaptogirina-3 utilizando lentivirus que codifican ARNhc de sinaptogirina-3. Las neuronas primarias se transdujeron en DIV5 con lentivirus que codifica RFP y ARNhc codificados o Syngr3, luego se fijaron en DIV11 y se inmunomarcaron para Sinaptogirina-3 (Syngr3) y Sinapsina (Syn). (D) Imágenes representativas de neuronas primarias transducidas con lentivirus que expresan RFP y codifican ARNhc aleatorios o Syngr3. La barra de escala es de 25 pm. (E) Cuantificación de los niveles de Syngr3. Las sinapsis se identificaron mediante el etiquetado Syn, y cada una de las sinapsis se midió para la intensidad Syngr3 y Syn. La intensidad de Syngr3 en cada punto se normalizó a la intensidad de Syn, y todos los puntos sinápticos se promediaron para dar el valor medio de intensidad de Syngr3 por célula. El gráfico representa la media ± EMT (n = 50 axones/células de > 12 cubreobjetos de 3 cultivos independientes, ANOVA de una vía). (F) La cuantificación del número de sinapsis a lo largo de los axones de las neuronas transducidas se midió como el número de puntas Syn por 50 pm de longitud de axón por axón/célula. (G) La cuantificación del área de sinapsis se midió como el área de cada punta Syn a lo largo de un axón que se promedió para dar el tamaño de sinapsis promedio para cada axón/célula. En (F) y (G) los gráficos representan la media ± EMT (n = 20 axones/células, ANOVA de una vía).
Figura 8. Representación esquemática del ensayo de luciferasa dividida. Tau y Syngr3 están acoplados a una de las dos subunidades de luciferasa (es decir, LgBit y SmBit). La complementación estructural genera una señal luminiscente.
Figura 9. Ensayo de luciferasa dividida que muestra la interacción directa entre Tau y Syngr3. La señal luminiscente normalizada generada por el par Tau-Syngr3 es significativamente mayor que la de las interacciones de control entre p53 y Syngr3 o Tau o la de las construcciones individuales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención está definida por las reivindicaciones.
En el trabajo que condujo a la presente invención, se demostró que especies de Tau hiperfosforiladas se acumulan en vesículas presinápticas aisladas del cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer, lo que sugiere que esta vía contribuye a la disfunción sináptica en la enfermedad humana. La disfunción sináptica temprana es una característica clave de las enfermedades neurodegenerativas asociadas con Tau, incluyendo la enfermedad de Alzheimer. Utilizando enfoques proteómicos y genéticos imparciales, se encontró que la proteína de vesícula sináptica transmembrana sinaptogirina-3 media en la asociación de Tau con vesículas sinápticas in vitro e in vivo. La reducción de los niveles de sinaptogirina de Drosophila o de sinaptogirina-3 murina en neuronas de modelos de tauopatía en moscas y ratones redujo la asociación de Tau con vesículas sinápticas y, posteriormente, rescató los defectos inducidos por Tau en la movilidad de vesículas y la liberación de neurotransmisores. Estos hallazgos identifican a sinaptogirina-3 como un nuevo interactuador de Tau, más específicamente como un interactuador de N-tau, que media en la disfunción sináptica asociada con Tau, lo que proporciona información importante sobre la biología de Tau y abre nuevas vías para abordar específicamente la disfunción presináptica temprana en diversas tauopatías, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, condiciones para las cuales sigue habiendo una gran necesidad insatisfecha de terapias.
La divulgación actual se refiere a un inhibidor de sinaptogirina-3 para uso en (un método para) tratar o inhibir la progresión de un trastorno tauopático o para uso en (un método para) tratar o inhibir un síntoma de un trastorno tauopático en el que el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un gapmero, un ARNpi, un ARNhc, una nucleasa con dedos de zinc, una meganucleasa, una nucleasa efectora TAL, un efector CRISPR-Cas, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a sinaptogirina-3, un alfacuerpo, un nanocuerpo, un intracuerpo, un aptámero, una DARPin, un aficuerpo, una afitina, una anticalina y un monocuerpo. En particular, el inhibidor de sinaptogirina-3 es un inhibidor de sinaptogirina-3 humana. En los métodos para tratar o inhibir la progresión de un trastorno tauopático o un síntoma de un trastorno tauopático, el inhibidor de sinaptogirina-3 se administra a un sujeto que lo necesita (un sujeto que sufre o muestra una tauopatía o síntoma de la misma) en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad suficiente para tratar o inhibir la progresión de un trastorno tauopático o un síntoma de un trastorno tauopático.
Con el fin de tratar, prevenir o inhibir (la progresión de) una enfermedad o un trastorno previsto, y en el método para tratar, prevenir o inhibir (la progresión de) una enfermedad o un trastorno previsto, se administra una cantidad eficaz del compuesto terapéutico a un sujeto que lo necesita. Una "cantidad eficaz" de una sustancia activa en una composición es la cantidad de dicha sustancia requerida y suficiente para provocar una respuesta adecuada en el tratamiento, la prevención, inhibición (progresión de) de la indicación médica prevista o fijada como objetivo. Estará claro para el experto en la materia que una respuesta de este tipo puede requerir administraciones sucesivas (en el tiempo) con la composición como parte de un esquema o programa de administración. La cantidad efectiva puede variar dependiendo de la naturaleza del compuesto, la vía de administración del compuesto (el cruce de la barrera hematoencefálica y la membrana celular son barreras potenciales a ser tomadas por inhibidores de sinaptogirina-3 como se describe en esta memoria), la salud y el estado físico del individuo a tratar, la edad del individuo a tratar (p. ej., la dosificación para lactantes puede ser inferior a la de los adultos) el grupo taxonómico del individuo a tratar (p. ej., ser humano, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema del individuo de responder eficazmente, el grado de respuesta deseada, la formulación de la sustancia activa, la evaluación del médico tratante y otros factores relevantes. La cantidad efectiva también puede variar dependiendo de si se utiliza en monoterapia o en terapia combinada. La determinación de una cantidad eficaz de un compuesto se obtiene generalmente a partir de pruebas preclínicas en un animal representativo o modelo in vitro (si está disponible) y/o de estudios de búsqueda de dosis en ensayos clínicos iniciales.
Inhibición de sinaptogirina-3
La inhibición de sinaptogirina-3 puede obtenerse al nivel de expresión (expresión génica y/o producción de proteínas) o al nivel funcional (interfiriendo con la función o estructura de la proteína) como se describe con más detalle más adelante. Como se demuestra en esta memoria (véase el Ejemplo 2.2; pérdida heterocigota de sinaptogirina-3), la inhibición parcial de sinaptogirina-3 es suficiente para restaurar la disfunción presináptica patológica inducida por Tau. Como tal, la inhibición de sinaptogirina-3 implica varios niveles posibles de inhibición, p. ej., al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o incluso el 100 % de inhibición. Al describir más adelante los diferentes procesos de inhibición, el gen o la proteína de la sinaptogirina-3 se denominarán gen diana o gen de interés, proteína de interés o, brevemente, diana de interés.
Un proceso de modulación de la expresión de un gen de interés se basa en oligonucleótidos antisentido (ASOs, por sus siglas en inglés) o variantes de los mismos, tales como gapmeros. Un oligonucleótido antisentido (ASO) es una cadena corta de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos que se hibrida con el ARNm complementario de una manera específica para la secuencia a través del apareamiento de bases de Watson-Crick. La formación del complejo ASO-ARNm finalmente da como resultado una regulación a la baja de la expresión de la proteína diana. Dependiendo de la secuencia diana, los ASOs pueden actuar de diferentes maneras. Si el ASO es captado por endocitosis celular y se hibrida con el ARNm diana en el citoplasma, la formación de un complejo ASO-ARNm puede inducir la activación de RNasa H (degradación selectiva del ARNm unido) o puede interferir estéricamente con el ensamblaje ribosomal. En caso de que el ASO pueda introducirse en el núcleo, la maduración del ARNm puede modularse mediante la inhibición de la formación del casquete 5', la inhibición del corte y empalme del ARNm o la activación de RNasaH (Chan et al. 2006, Clin Exp Pharmacol Physiol 33: 533-540; esta referencia también describe algo del software disponible para ayudar en el diseño de ASOs). Las modificaciones de los ASOs se pueden introducir en uno o más niveles: modificación del enlace fosfato (p. ej., introducción de uno o más enlaces fosfodiéster, fosforamidato o fosforotioato), modificación del azúcar (p. ej., introducción de uno o más LNA (siglas inglesas de ácidos nucleicos bloqueados), 2'-O-metilo, 2'-O-metoxi-etilo, 2'-fluoro, S-etilo restringido o triciclo-ADN y/o modificaciones no ribosa (p. ej., introducción de uno o más de fosforodiamidato, morfolinos o ácidos nucleicos peptídicos) Se ha demostrado que la introducción de modificaciones en 2' potencia la seguridad y las propiedades farmacológicas de los oligonucleótidos antisentido. Las estrategias antisentido que se basan en la degradación del ARNm por la RNasa H requieren la presencia de nucleótidos con un oxígeno en 2' libre, es decir, no todos los nucleótidos en la molécula antisentido deben estar modificados en 2'. La estrategia gapmero se ha desarrollado con este fin. Un oligonucleótido antisentido gapmero consiste en una región central de ADN (habitualmente un mínimo de 7 u 8 nucleótidos) con (habitualmente 2 o 3) núcleósidos modificados en 2’ que flanquean ambos extremos de la región central del ADN. Esto es suficiente para la protección contra exonucleasas, al tiempo que permite que RNAsaH actúe en la región del hueco (sin modificación en 2').
Después de llegar al sistema nervioso, la mayoría de los oligonucleótidos antisentido son absorbidos fácilmente por neuronas y glía. Los nucleótidos terapéuticos tienden a mostrar una semivida significativamente mayor en los tejidos neuronales en comparación con los tejidos periféricos (Whitesell et al. 1995, Proc Natl Acad Sci USA 90:4665-4669; Butler et al. 2005, Neuroscience 131:707-715). Las estrategias de antídoto están disponibles como se demuestra mediante la administración de un oligonucleótido totalmente complementario al oligonucleótido antisentido (Crosby et al. 2015, Nucleic Acid Ther 25:297-305).
Otro procedimiento para modular la expresión de un gen de interés se basa en el proceso natural de ARN interferencia. Se basa en ARN de doble cadena (ARNdc) que es cortado por una enzima denominada Dicer, dando como resultado moléculas de ARN pequeño de interferencia (ARNpi) de doble cadena que tienen una longitud de 20-25 nucleótidos. El ARNpi se une luego al complejo de silenciamiento inducido por a Rn celular (RISC, por sus siglas en inglés), separando las dos cadenas en la cadena pasajera y guía. Mientras se degrada la cadena pasajera, el RISC escinde el ARNm específicamente en un sitio indicado por la cadena guía. La destrucción del ARNm impide la producción de la proteína de interés y el gen se 'silencia'. Los ARNpi son ARNdc con colgantes de 2 nt en el extremo 3', mientras que los ARNhc son ARNdc que contienen una estructura de bucle que se procesa en ARNpi. Los ARNhc se introducen en los núcleos de células diana utilizando un vector (p. ej., bacteriano o viral) que, opcionalmente, puede integrarse de forma estable en el genoma. Además de verificar la falta de reactividad cruzada con genes no diana, los fabricantes de productos de ARNi proporcionan pautas para diseñar ARNpi/ARNhc. Las secuencias de ARNpi entre 19-29 nt son generalmente las más efectivas. Las secuencias de más de 30 nt pueden resultar en un silenciamiento inespecífico. Los sitios ideales para fijar como objetivo incluyen dinucleótidos AA y los 19 nt 3' de ellos en la secuencia de ARNm diana. Típicamente, los ARNpi con colgantes de dinucleótidos 3' dUdU o dTdT son más efectivos. Otros colgantes de dinucleótidos podrían mantener la actividad, pero deberían evitarse los colgantes GG. También se deben evitar los diseños de ARNpi con un tramo de 4-6 poli(T) (que actúa como una señal de terminación para ARN pol III), y se recomienda que el contenido de G/C esté entre 35-55 %. Los ARNhc deberían comprender secuencias sentido y antisentido (se recomienda que cada una tenga una longitud de 19-21 nt) separadas por una estructura de bucle y un colgante AAAA en 3'. Se sugiere que las estructuras de bucle efectivas tengan una longitud de 3-9 nt. Se sugiere seguir el orden sentido-bucle-antisentido al diseñar el casete de ARNhc y evitar los colgantes 5' en la construcción de ARNhc. Los ARNhc se transcriben habitualmente a partir de vectores, p. ej., impulsados por el promotor Pol III U6 o el promotor H1. Los vectores permiten la expresión de ARNhc inducible, p. ej., basándose en los sistemas inducibles Tet-on y Tet-off disponibles comercialmente, o en un promotor U6 modificado que es inducido por la hormona de insectos ecdisona. Se ha utilizado un sistema de recombinación Cre-Lox para lograr una expresión controlada en ratones. Los ARNhc sintéticos se pueden modificar químicamente para afectar a su actividad y estabilidad. El ADN plásmido o el ARNdc se pueden suministrar a una célula mediante transfección (transfección de lípidos, nanopartículas basadas en polímeros catiónicos, conjugación de lípidos o péptidos que penetran en las células) o electroporación. Los vectores virales incluyen vectores virales lentivirales, retrovirales, adenovirales y adeno-asociados.
Kumar et al. 2007 (Nature 448:39-43) demostró la captación de ARN pequeño de interferencia (ARNpi) en el cerebro después de acoplarse a un péptido de 29 aminoácidos derivado de la glicoproteína del virus de la rabia (RVG, por sus siglas en inglés) que se une específicamente al receptor de acetilcolina.
Las ribozimas (enzimas de ácido ribonucleico) son otro tipo de moléculas que pueden utilizarse para modular la expresión de un gen diana. Son moléculas de ARN capaces de catalizar reacciones bioquímicas específicas, en el contexto actual, capaces de escisión fijada como objetivo de secuencias de nucleótidos. Ejemplos de ribozimas incluyen la ribozima cabeza de martillo, la ribozima del satélite Varkud, Leadzyme y la ribozima de horquilla.
Además del uso de la tecnología de ARN inhibidor, la modulación de la expresión de un gen de interés puede lograrse a nivel de ADN tal como mediante terapia génica para inactivar o alterar el gen diana. Tal como se utiliza en esta memoria, una "inactivación de un gen" puede ser una reducción de un gen o el gen puede desactivarse mediante una mutación tal como una mutación puntual, una inserción, una deleción, un desplazamiento del marco o una mutación sin sentido mediante técnicas como descrito más adelante, incluyendo, pero sin limitarse a la transferencia de genes retrovirales. Otra forma en la que los genes pueden inactivarse es mediante el uso de nucleasas con dedos de zinc. Las nucleasas con dedos de zinc (ZFNs, por sus siglas en inglés) son enzimas de restricción artificiales generadas al fusionar un dominio de unión a ADN con dedos de zinc con un dominio de escisión de ADN. Los dominios con dedos de zinc se pueden diseñar para fijar como objetivo secuencias de ADN deseadas, lo que permite que las nucleasas con dedos de zinc fijen como objetivo una secuencia única dentro de un genoma complejo. Al aprovechar la maquinaria de reparación de ADN endógeno, estos reactivos se pueden utilizar para alterar con precisión los genomas de organismos superiores. Otras tecnologías para la personalización del genoma que se pueden utilizar para inactivar genes son las meganucleasas y las nucleasas efectoras TAL (TALENs, Cellectis bioresearch). Una TALEN se compone de un dominio de unión al ADN de TALE para el reconocimiento específico para la secuencia fusionado con el dominio catalítico de una endonucleasa que introduce roturas de doble cadena (DSB, por sus siglas en inglés). El dominio de unión al ADN de una TALEN es capaz de fijar como objetivo con alta precisión un sitio de reconocimiento grande (por ejemplo, de 17 pb). Las meganucleasas son endonucleasas de secuencia específica, "tijeras de ADN" que se producen de forma natural, que se originan a partir de una diversidad de organismos unicelulares tales como bacterias, levaduras, algas y algunas organelas vegetales. Las meganucleasas tienen sitios de reconocimiento largos de entre 12 y 30 pares de bases. El sitio de reconocimiento de las meganucleasas naturales se puede modificar con el fin de fijar como objetivo secuencias de ADN genómico nativo (tales como genes endógenos). Otra tecnología reciente de edición del genoma es el sistema CRISPR/Cas, que se puede utilizar para lograr la ingeniería del genoma guiada por ARN. La interferencia CRISPR es una técnica genética que permite el control específico para la secuencia de la expresión génica en células procariotas y eucariotas. Se basa en la vía CRISPR (repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente interespaciadas) derivada del sistema inmunitario bacteriano. Recientemente, se demostró que el sistema de edición CRISPR-Cas también se puede utilizar para fijar como objetivo el ARN. Se ha demostrado que el efector C2c2 CRISPR-Cas de Clase 2 tipo VI-A puede programarse para escindir dianas de ARN de cadena sencilla que portan protoespaciadores complementarios (Abudayyeh et al 2016 Science 353/science.aaf5573). C2c2 es una endoRNasa de efecto único que media en la escisión de ARNcs una vez que ha sido guiada por una única guía de ARNcr hacia el ARN diana.
Como se indicó arriba, la inhibición de sinaptogirina-3 puede obtenerse a nivel funcional al interferir con la función o estructura de la proteína. La interferencia con la estructura, lo cual también puede dar como resultado la inhibición de la función, puede lograrse, por ejemplo, uniendo restos que protegen, p. ej., el sitio de unión en la proteína de interés para un ligando de interés. Ejemplos no limitantes son anticuerpos (monoclonales) o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, alfacuerpos, nanocuerpos, intracuerpos (anticuerpos que se unen y/o actúan sobre la diana intracelular; esto requiere, típicamente, la expresión del anticuerpo dentro de la célula diana, lo cual puede lograrse mediante terapia génica), aptámeros, DARPins, aficuerpos, afitinas, anticalinas, monocuerpos, fosfatasas (en caso de una diana fosforilada) y quinasas (en caso de diana fosforilable).
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier formato que se produce de forma natural de anticuerpo o proteína de unión a antígeno, cuya producción es inducida por un sistema inmunitario (inmunoglobulinas o IgGs). Está claro, sin embargo, que no todos los anticuerpos se producen de forma natural, ya que, p. ej., algunos antígenos son problemáticos en el sentido de que son poco o nada inmunogénicos, o no son reconocidos por el sistema inmunitario (p. ej., auto-antígenos); pueden requerirse trucos artificiales para obtener anticuerpos contra antígenos de este tipo (p. ej., ratones inactivados: p. ej ., Declercq et al. 1995, J Biol Chem 270:8397-8400 ; inmunización con ADN para, p. ej., antígenos transmembrana; p. ej. , Liu et al. 2016, Emerg Microbes Infect 5:e33). Anticuerpos "convencionales" comprenden dos cadenas pesadas enlazadas entre sí por enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras, estando una cadena ligera enlazada a cada una de las cadenas pesadas por enlaces disulfuro. Cada una de las cadenas pesadas tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un cierto número de dominios constantes (tres o cuatro dominios constantes, CH1, CH2, CH3 y CH4, dependiendo de la clase de anticuerpo). Cada una de las cadenas ligeras tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante (CL) en el otro extremo; cada uno de los dominios constantes de las cadenas ligeras se alinea con los primeros dominios constantes de las cadenas pesadas, y cada uno de los dominios variables de las cadenas ligeras se alinea con los dominios variables de las cadenas pesadas. Este tipo de anticuerpos existen en camellos, dromedarios y llamas junto con un tipo de anticuerpos que se producen de forma natural "no convencionales" que consisten en solo dos cadenas pesadas y, por lo tanto, carecen de cadenas ligeras. Existen otros anticuerpos que se producen de forma natural "no convencionales" en el suero de tiburones nodriza (Ginglymostomatidae) y tiburones wobbegong (Orectolobidae). Estos últimos anticuerpos se denominan nuevos receptores de antígenos Ig (IgNARs, por sus siglas en inglés). Son homodímeros con enlaces disulfuro que consisten en cinco dominios constantes (CNAR, por sus siglas en inglés) y un dominio variable (VNAR, por sus siglas en inglés). No existe una cadena ligera y los dominios variables individuales son independientes en solución y no parecen asociarse a través de una interfaz hidrófoba (Greenberg et al. 1995, Nature 374, 168-173; Nuttall et al. 2001, Mol Immunol 38, 313-326; Diaz et al. 2002, Immunogenetics 54, 501-512; Nuttall et al. 2003, Eur J Biochem 270, 3543-3554). Debido a la estructura de dímero de cadena pesada característica de los anticuerpos de camélidos y tiburones, a veces se les denomina "mini-anticuerpos de cadena pesada" (mnHCAbs, por sus siglas en inglés) o simplemente "mini-anticuerpos" (mnAbs, por sus siglas en inglés) (Holliger y Hudson 2005, Nature Biotechnol 23, 1126-1136). La región determinante de la complementariedad 3 (CDR3, por sus siglas en inglés) de los anticuerpos de camello y los anticuerpos de tiburón es habitualmente más larga (que comprende aproximadamente 16-21 aminoácidos y aproximadamente 16-27 aminoácidos, respectivamente) que la CDR3 de la región VH del ratón (que comprende aproximadamente 9 aminoácidos) (Muyldermans et al. 1994, Prot Eng 7, 1129-1135; Dooley y Flajnik 2005, Eur J Immunol 35, 936-945). Sin la cadena ligera, estos anticuerpos de cadena pesada se unen a sus antígenos mediante un solo dominio, el dominio variable de unión a antígeno de la inmunoglobulina de cadena pesada, a los que se alude como Vab (anticuerpos de camélido) o V-NAR (anticuerpos de tiburón). A este fragmento Vab de unión a antígeno intacto e independientemente funcional más pequeño se le alude como nano-anticuerpo o nanocuerpo (Muyldermans 2001, J Biotechnol 74, 277-302). Los dominios Vab y/o V-NAR multivalentes (etc. divalentes, trivalentes, tetravalentes y pentavalentes) pueden ser preferidos en algunos casos debido a su absorción y retención celular potencialmente más altas y pueden producirse mediante tecnología recombinante o por medios químicos, tal como se describe en el documento WO 2010/033913. Los dominios variables de las cadenas ligera y/o pesada están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas que se producen de forma natural tienen la misma estructura general: cuatro regiones marco (FR, por sus siglas en inglés) conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) (véase, p. ej., Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Las CDRs en una cadena ligera o pesada se mantienen muy próximas por las FRs y contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno. Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo como se describe más adelante, también puede ser parte de una molécula de unión a antígeno multivalente y/o multiespecífica. En Brinkmann y Kontermann 2017 (mAbs 9:182-212) se proporciona una descripción general de, p. ej., formatos biespecíficos disponibles (alrededor de 100).
La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier molécula que comprende uno o más fragmentos (habitualmente una o más CDRs) de un anticuerpo (el anticuerpo parental) de manera que se une al mismo antígeno al que se une el anticuerpo parental. Fragmentos de anticuerpos incluyen Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (tal como scFv), F(ab') 2, dominios VH variables únicos y dominios VL variables únicos (Holliger y Hudson 2005, Nature Biotechnol 23, 1126-1136), Vab y V-NAR. La expresión incluye, además, microanticuerpos, es decir, la unidad mínima de reconocimiento de un anticuerpo parental que comprende habitualmente solo una CDR (Heap et al. 2005, J Gen Virol 86, 1791-1800). Cualquiera de los fragmentos se puede incorporar en una molécula más grande multivalente y/o multiespecífica, p. ej., Fab 2 mono- o bi-específico, Fab 3 mono- o tri-específico, bis-scFv (mono- o bi-específico), diacuerpos (mono- o bi-específicos), triacuerpos (p. ej., monoespecíficos trivalentes), tetracuerpos (p. ej., monoespecíficos tetravalentes), minicuerpos y similares (Holliger y Hudson 2005, Nature Biotechnol 23, 1126-1136). Cualquiera de los fragmentos puede incorporarse además en, p. ej., dominios V-NAR de anticuerpos de tiburón o dominios VhH de anticuerpos de camélido (nanocuerpos). Todos estos están incluidos en la expresión "fragmento de anticuerpo".
Los alfacuerpos también se conocen como alfacuerpos penetrantes en células y son proteínas pequeñas de 10 kDa diseñadas para unirse a una diversidad de antígenos.
Se han seleccionado aptámeros frente a moléculas pequeñas, toxinas, péptidos, proteínas, virus, bacterias e incluso frente a células enteras. Los aptámeros de ADN/ARN/XNA son de cadena sencilla y típicamente tienen una longitud de alrededor de 15-60 nucleótidos, aunque se han seleccionado secuencias más largas de 220 nt; pueden contener nucleótidos no naturales (XNA) tal como se describe para el ARN antisentido. La FDA aprobó un aptámero de nucleótidos que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) para el tratamiento de la degeneración macular. Variantes de aptámeros de ARN son espiegelmeros y están compuestas en su totalidad por una cadena principal de ácido L-ribonucleico no natural. Un espiegelmero de la misma secuencia tiene las mismas propiedades de unión que el aptámero de ARN correspondiente, excepto que se une a la imagen especular de su molécula diana. Los aptámeros peptídicos consisten en uno (o más) dominios peptídicos variables cortos, unidos en ambos extremos a un armazón de proteína, p. ej., el armazón de afímero basado en el pliegue de la proteína cistatina. Una variación adicional se describe, p. ej., en el documento WO 2004/077062, en donde, p. ej., 2 bucles peptídicos están unidos a un armazón orgánico. Se ha demostrado que es posible la detección de presentación en fagos de péptidos de este tipo, p. ej., en el documento WO 2009/098450.
DARPins significa proteínas repetidas de anquirina diseñadas. Se han generado a nivel de ADN colecciones de DARPins con residuos de interacción diana potenciales aleatorios, con diversidades de más de 1012 variantes. A partir de estos, las DARPins se pueden seleccionar para unirse a una diana de elección con afinidad y especificidad picomolares. Las afitinas, o nanofitinas, son proteínas artificiales derivadas estructuralmente de la proteína de unión al ADN Sac7d, que se encuentra en Sulfolobus acidocaldarius. Al aleatorizar los aminoácidos en la superficie de unión de Sac7d y someter la colección de proteínas resultante a rondas de visualización de ribosomas, la afinidad se puede dirigir hacia diversos objetivos, tales como péptidos, proteínas, virus y bacterias.
Las anticalinas se derivan de lipocalinas humanas que son una familia de proteínas de unión natural y la mutación de aminoácidos en el sitio de unión permite cambiar la afinidad y la selectividad hacia un objetivo de interés. Tienen una mejor penetración en los tejidos que los anticuerpos y son estables a temperaturas de hasta 70 °C.
Los monocuerpos son proteínas de unión sintéticas que se construyen a partir del dominio de fibronectina de tipo III (FN3) como un armazón molecular.
En base a lo anterior, un inhibidor de sinaptogirina-3 para uso (en un método) de acuerdo con la presente divulgación se puede definir como aquellos inhibidores específicos de sinaptogirina-3 que incluyen los seleccionados del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un gapmero, un ARNpi, un ARNhc, un oligonucleótido antisentido, una nucleasa con dedos de zinc, una meganucleasa, una nucleasa efectora TAL, un efector CRISPR-Cas, un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a sinaptogirina-3, un alfacuerpo, un nanocuerpo, un intracuerpo, un aptámero, una DARPin, un aficuerpo, una afitina, una anticalina y un monocuerpo.
En esta memoria se describe un inhibidor de sinaptogirina-3 para uso (en un método) de acuerdo con la divulgación, en particular, un inhibidor específico para sinaptogirina-3, capaz de bloquear la unión de sinaptogirina-3 a la región N-terminal de proteína Tau.
En lo que antecede, “específico para sinaptogirina -3" se refiere al hecho de que el inhibidor actúa al nivel de sinaptogirina-3 y no al nivel de otra proteína u otro factor neurológico. La especificidad puede establecerse, p. ej., determinando la interacción física del inhibidor con sinaptogirina-3.
También se describe la sinaptogirina-3 a la que se hace referencia en el documento actual, que es un inhibidor de la unión entre sinaptogirina-3 y Tau, más particularmente la región N-terminal de Tau. Incluso más concretamente, dicho inhibidor bloquea la interacción entre la sinaptogirina-3 y la proteína Tau.
El inhibidor de sinaptogirina-3, que es capaz de inhibir o bloquear la interacción entre sinaptogirina-3 y la (región N-terminal de la) proteína Tau, podría actuar a nivel de sinaptogirina-3 y a nivel de otra proteína. Un ejemplo no limitativo de dicha otra proteína es la proteína Tau, más particularmente la región N-terminal de Tau. El inhibidor de sinaptogirina-3, que es capaz de inhibir o bloquear la interacción entre sinaptogirina-3 y la (región N-terminal de la) proteína Tau, también podría actuar a nivel de la (región N-terminal de la) proteína Tau y no al nivel de sinaptogirina-3.
Sinaptogirina-3 y fragmentos de la misma
En seres humanos, actualmente se han identificado 6 sinaptogirinas. La sinaptogirina-1 viene en tres isoformas (1a predominantemente expresada en neuronas del sistema nervioso central; 1b y 1c, no expresadas en el sistema nervioso central). La sinaptogirina-2 no se expresa en el cerebro, y la sinaptogirina-3 se expresa en el cerebro y la placenta (Kedra et al. 1998, Human Genet 103:131-141). La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la sinaptogirina-3 humana (número de acceso de GenBank 043761) se muestra a continuación:
MEGASFGAGRAGAALDPVSF ARRPQTLLRVASWVFSIAVF GPIVNEGYW TDSGPELRCV FNGNAGACRF GVALGLGAFLACAAFLLLDV RFQQISSVRD RRRAVLLDLG FSGLWSFLWF VGFCFLTNQW QRTAPGPATT QAGDAARAAI AFSFFSILSW VALTVKALQR FRLGTDMSLFATEQLSTGAS QAYPGYPVGS GVEGTETYQS PPFTETLDTS PKGYQVPAY (SEQ ID NO: 1 )
Están expuestas intraneuronalmente, pero en el exterior de la vesícula presináptica, los extremos N y C, así como el bucle entre las regiones transmembrana 2a y 3a; basado en las anotaciones del número de acceso de GenBank 043761, estas regiones se definen para la sinaptogirina-3 humana como:
Región N-terminal: aminoácidos 1-29, con la secuencia de aminoácidos
MEGASFGAGR AGAALDPVSF ARRPQTLLR (SEQ ID NO: 2);
Bucle que abarca la región 2a y 3a de transmembrana: aminoácidos 91 -104, con la secuencia de aminoácidos RFQQISSVRD RRRA (SEQ ID NO: 3);
Región C-terminal: aminoácidos 169-229, con la secuencia de aminoácidos
QRFRLGTDMS LFATEQLSTG ASQAYPGYPV GSGVEGTETY QSPPFTETLD TSPKGYQVPA Y (SEQ ID NO:4)
La delimitación de estas regiones puede variar dependiendo de la definición de las regiones de transmembrana: p. ej., Kedra et al. 1998 (Human Genet 103:131-141) las define de manera diferente, lo cual proporciona regiones expuestas intraneuronalmente ligeramente diferentes. Está claro que una variación de este tipo está dentro del alcance de la presente divulgación. También dentro del alcance de la divulgación están las variantes de las secuencias de aminoácidos que pueden existir debido a la variación alélica. Variaciones de este tipo se definen aquí como "variantes de las regiones expuestas intraneuronalmente de sinaptogirina-3", o como "variantes de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO:4".
La unión entre sinaptogirina-3 y (la secuencia N-terminal de) la proteína tau está en el corazón de la presente divulgación. En este contexto, fragmentos de sinaptogirina-3 se refieren a las regiones de sinaptogirina-3 expuestas intraneuronalmente como se comentó arriba. Sin embargo, aún no se ha dilucidado completamente cómo tau se une a sinaptogirina-3, pero se puede prever que esta unión implicará una o más de las regiones expuestas intraneuronalmente. En comparación con la sinaptogirina-1a humana (la única otra isoforma presente en el cerebro), estas regiones expuestas intraneuronalmente son notablemente diferentes: las regiones N-terminales comparten un 36 % de identidad, las regiones del bucle comparten un 59 % de identidad y las regiones C-terminales comparten solo el 21 % de identidad. Esto convierte a estas regiones en dianas excelentes para el diseño de moléculas que interactúan específicas para sinaptogirina-3, incluyendo los candidatos a fármacos.
En caso de que el inhibidor de sinaptogirina-3 sea un anticuerpo o fragmento del mismo, un alfacuerpo, un nanocuerpo, un intracuerpo, un aptámero, una DARPin, un aficuerpo, una afitina, una anticalina o un monocuerpo, también se describe en esta memoria que este tipo de inhibidor puede unirse a al menos una región expuesta intraneuronalmente de sinaptogirina-3. En particular, el inhibidor puede unirse a una o más (una, cualquier combinación de 2 o las 3) regiones expuestas intraneuronalmente de sinaptogirina-3 definidas por s Eq ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o variantes de las mismas (como se define arriba).
Trastornos tauopáticos
La vía que conduce de la proteína tau soluble y monomérica a la hiperfosforilada, insoluble y filamentosa está en el centro de muchas enfermedades neurodegenerativas humanas, denominadas colectivamente tauopatías (Spillantini y Goedert 2013, Lancet Neurol 12:609-622). Las tauopatías son un grupo diverso de trastornos que tienen en común su asociación con una acumulación importante de proteína tau intracelular. La proteína tau se expresa abundantemente en el sistema nervioso central. El grupo de las tauopatías está creciendo, ya que recientemente se han añadido la enfermedad de Huntington (Fernandez-Nogales et al. 2014, Nat Med 20:881-885) y la encefalopatía traumática crónica (CTE; McKee et al.2009, J Neuropathol Exp Neurol 68,709-735).
Existen diferentes clasificaciones de tauopatías. En un sistema de clasificación, los trastornos tauopáticos se dividen en patologías Tau predominantes, tauopatías asociadas con depósito de amiloide y tauopatías asociadas con otra patología (Williams et al. 2006, Intern Med J 36:652-660). Las patologías predominantes de Tau incluyen parálisis supranuclear progresiva (PSP), parálisis supranuclear progresiva-parkinsonismo (PSP-P), síndrome de Richardson, enfermedad argiofílica granulosa, degeneración corticobasal, enfermedad de Pick, demencia frontotemporal con parkinsonismo asociado con el cromosoma 17 (FTDP-17), parkinsonismo post-encefalítico, complejo de la enfermedad de Parkinson de Guam y parkinsonismo guadalupeño. Trastornos tauopáticos asociados con el depósito amiloide incluyen la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down, demencia pugilística, demencia británica familiar, demencia danesa familiar. Trastornos tauopáticos asociados con otra patología incluyen distrofia miotónica, enfermedad de Hallevorden-Spatz y Niemann Pick tipo C.
Otra clasificación se basa en el tipo de isoforma que se encuentra en los agregados, aunque pueden existir solapamientos: las tauopatías 4R incluyen parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal, demencia con predominio de ovillos y enfermedad argiofílica granulosa. Las tauopatías 3R incluyen la enfermedad de Pick, y las tauopatías 3R+4R incluyen la enfermedad de Alzheimer (Dickson et al. 2011, J Mol Neurosci 45:384-389; Murray et al. 2014, Alzheimer's Res Ther 6:1). La proteína tau se comenta en esta memoria con más detalle más adelante.
Tauopatías adicionales incluyen demencia solo con ovillos, tauopatía de sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, panencefalitis esclerosante subaguda, retraso mental relacionado con SLC9A6, enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, degeneración del lóbulo frontotemporal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, encefalopatía traumática crónica, esclerosis lateral amiotrófica de Guam, esclerosis lateral amiotrófica y complejo parkinsonismo-demencia, angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica y gliosis subcortical progresiva (Murray et al. 2014, Alzheimer's Res Ther 6:1; Spillantini y Goedert 2013, Lancet Neurol 12:609-622).
Síntomas de trastornos tauopáticos incluyen síntomas clínicos o patológicos, tales como deterioro cognitivo leve, demencia, deterioro cognitivo (p. ej., apatía, deterioro en el pensamiento abstracto), deterioro de la función motora (que provoca, p. ej., inestabilidad postural, temblor o distonía), disfunción oculomotora y bulbar. Los criterios para diagnosticar la demencia se describen, p. ej., en el Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM) o en la International Classification of Disease (ICD) y están sujetos a actualizaciones periódicas. El tipo de síntomas clínicos depende de qué región del cerebro afectada por la tauopatía y explica por qué la enfermedad de Alzheimer es principalmente una enfermedad demencial y por qué la enfermedad de Parkinson afecta principalmente al movimiento. La propagación temporoespacial estereotipada de las inclusiones de tau crea un patrón consistente de lesiones cerebrales en al menos la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad argiofílica granulosa. La propagación puede producirse en parte de una manera transináptica (Spillantini y Goedert 2013, Lancet Neurol 12:609-622; Liu et al. 2012, PloS One 7:e31802). Los síntomas moleculares de trastornos tauopáticos incluyen disfunción sináptica (en particular, disfunción pre-sináptica), neurotoxicidad, degeneración neuronal, disfunción neuronal, pérdida de sinapsis y depósito de amiloide.
El inhibidor de sinaptogirina-3 como se describe antes en esta memoria es, por lo tanto, aplicable para su uso en (un método para) tratar o inhibir la progresión de un trastorno tauopático, en donde el trastorno tauopático se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva (PSP), parálisis supranuclear progresiva-parkinsonismo (PSP-P), síndrome de Richardson, enfermedad argiofílica granulosa, degeneración corticobasal, enfermedad de Pick, demencia frontotemporal con parkinsonismo asociado con el cromosoma 17 (FTDP-17), parkinsonismo postencefalítico, complejo de la enfermedad de Parkinson de Guam, parkinsonismo guadalupeño, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, demencia pugilística, demencia familiar británica, demencia familiar danesa, distrofia miotónica, enfermedad de Hallevorden-Spatz, enfermedad de Niemann Pick tipo C, encefalopatía traumática crónica, demencia solo con ovillos, tauopatía de sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, panencefalitis esclerosante subaguda, retraso mental relacionado con SLC9A6, enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, degeneración del lóbulo frontotemporal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, encefalopatía traumática crónica, esclerosis lateral amiotrófica de Guam, esclerosis lateral amiotrófica y complejo parkinsonismo-demencia, angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica y gliosis subcortical progresiva.
El inhibidor de sinaptogirina-3 como se describe arriba en esta memoria también es aplicable para uso en (un método para) tratar o inhibir la progresión de un síntoma de trastorno tauopático seleccionado del grupo de deterioro cognitivo leve, demencia, deterioro cognitivo, deterioro de la capacidad motora funcional, disfunción oculomotora y bulbar, disfunción sináptica, neurotoxicidad, degeneración neuronal, disfunción neuronal, pérdida de sinapsis y depósito de amiloide. En particular, en relación con la disfunción sináptica se trata de la disfunción pre-sináptica.
"Tratamiento" se refiere a cualquier tasa de reducción o retraso del progreso de la enfermedad o trastorno en comparación con el progreso o el progreso esperado de la enfermedad o trastorno cuando no se trata. Más deseable, el tratamiento da como resultado ningún/cero progreso de la enfermedad o trastorno (es decir, "inhibición" o "inhibición de la progresión") o incluso cualquier tasa de regresión de la enfermedad o trastorno ya desarrollado.
Las tauopatías son, en general, trastornos progresivos, y la progresión puede implicar la propagación de la proteína tau patológica (Asai et al. 2015, Nat Neurosci 18:1584-1593; deCalignon et al. 2012, Neuron 73:685-697).
Diagnóstico de los trastornos tauopáticos
La formación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) en sí misma permite la determinación radiológica de la atrofia del cerebro. Signos atróficos del mesencéfalo, tales como la silueta del colibrí o de pingüino, son, por ejemplo, indicadores de PSP. La determinación del contenido de proteína tau en el líquido cefalorraquídeo (CSF, por sus siglas en inglés) también puede servir como indicador de tauopatías. Se encontró, p. ej., que la relación entre las formas tau de 33 kDa/55 kDa en el CSF estaba reducida en pacientes con PSP (Borroni et al. 2008, Neurology 71:1796-1803).
Recientemente, se han puesto a disposición técnicas de la neurodegeneración de formación de imágenes in vivo. Técnicas de este tipo pueden apoyar claramente el diagnóstico clínico de enfermedades neurodegenerativas en general y de tauopatías en particular. El diagnóstico in vivo de las taupatías se beneficia de la existencia de ligandos de formación de imágenes Tau detectables mediante tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés), e incluye los radiotrazadores 2-(1-(6-((2-[18 F]fluoroetilo) (metil) amino)- 2-naftil)etilideno) malononitrilo ([18 F]FDDNP), 2-(4-aminofenil)-6-(2-([18 F]fluoroetoxi))quinolona ([18 F]THK523) y [18 F] T807 y [18F] T808 (Murray et al.
2014, Alzheimer's Res Ther 6:1). Además, la MRI se puede utilizar para detectar tauopatías, y la PET con fluorodesoxiglucosa (FDG, agente 18F) es indicativa de actividad sináptica (Murray et al. 2014, Alzheimer's Res Ther 6:1). Beta amiloide, que puede detectarse in vivo, p. ej., mediante el uso de florbetapir (u otros marcadores de amiloide) en combinación con PET, demostró ser un biomarcador preciso para al menos la enfermedad de Alzheimer (Clark et al. 2011, J Am Med Assoc 305:275 -283) y la técnica florbetapir-PET recibió la aprobación de la FDA en 2012. La disponibilidad de técnicas de detección de tauopatía in vivo es un apoyo adicional para seleccionar sujetos que pueden beneficiarse de las terapias inhibidoras de sinaptogirina-3 como se describe en esta memoria.
Administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica
La barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) es una capa protectora de células estrechamente unidas que recubre los vasos sanguíneos del cerebro, lo que evita la entrada de sustancias nocivas (p. ej., toxinas, agentes infecciosos) y restringe la entrada de moléculas solubles (no lipídicas) que no son reconocidas por soportes de transporte específicos en el cerebro. Esto plantea un desafío en el suministro de fármacos tales como los inhibidores de sinaptogirina-3 descritos en esta memoria, al sistema nervioso central/cerebro, ya que los fármacos transportados por la sangre no necesariamente atravesarán la barrera hematoencefálica. Aunque la BBB a menudo se ve afectada/descompuesta hasta cierto punto en el caso de un trastorno tauopático, puede ser necesario confiar en un medio para mejorar la permeación de la BBB para que un fármaco candidato que trata un trastorno tauopático pueda penetrar en las células del cerebro afectadas. En la actualidad, hay varias opciones disponibles para la administración de fármacos a través de la BBB (Peschillo et al. 2016, J Neurointervent Surg 8:1078-1082; Miller y O'Callaghan 2017, Metabolism 69:S3-S7; Drapeau y Fortin 2015, Current Cancer Drug Targets 15:752-768).
Los fármacos se pueden inyectar directamente en el cerebro (estrategia invasiva) o se pueden dirigir al cerebro después de la interrupción de la BBB con un agente farmacológico (estrategia farmacológica). Medios invasivos de interrupción de la BBB están asociados con el riesgo de hemorragia, infección o daño al tejido cerebral normal y enfermo a causa de la aguja o el catéter. El depósito directo del fármaco puede mejorarse mediante la técnica de suministro potenciado por convección. El suministro a más largo plazo de una proteína terapéutica (p. ej., un factor neurotrófico o un factor de crecimiento nervioso, o un inhibidor proteico de la sinaptogirina-3 como se describe en esta memoria) puede lograrse mediante la implantación de células madre modificadas genéticamente, mediante vectores virales recombinantes, mediante bombas osmóticas o mediante la incorporación del fármaco terapéutico en un polímero (liberación lenta; puede implantarse localmente).
La alteración farmacológica de la BBB tiene el inconveniente de no ser selectiva y puede estar asociada con efectos no deseados sobre la presión sanguínea y el equilibrio de fluidos del cuerpo. Esto se elude mediante la administración fijada como objetivo o selectiva del agente disruptor farmacológico de la BBB. Como ejemplo, se demostró la infusión cerebral intra-arterial de un anticuerpo (bevacizumab) en un tumor cerebral después de la interrupción osmótica de la BBB con manitol (Boockvar et al. 2011, J Neurosurg 114:624-632); otros agentes capaces de interrumpir farmacológicamente la BBB incluyen bradiquinina y leucotrieno C4 (p. ej., mediante infusión intracarotídea; Nakano et al. 1996, Cancer Res 56:4027-4031).
La transcitosis de la BBB y la inhibición del flujo de salida son otras estrategias para aumentar la absorción cerebral de fármacos suministrados a través de la sangre. Utilizar transferrina o anticuerpos de receptor de transferrina como soporte de un fármaco es un ejemplo de explotación de un proceso de transcitosis de la BBB natural (Friden et al.
1996, J Pharmacol Exp Ther 278: 1491-1498). La explotación de la transcitosis de la BBB para el suministro de fármacos también se conoce como la estrategia del caballo de Troya molecular. Otro mecanismo subyacente a la BBB, las bombas de expulsión o los transportadores de cassettes de unión a ATP (ABC, por sus siglas en inglés) (tales como la proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP/ABCG2) y la glicoproteína P (Pgp/MDR1/ABCB1)) pueden bloquearse con el fin de aumentar la absorción de compuestos (p. ej., Carcaboso et al. 2010, Cancer Res 70:4499-4508). Los fármacos terapéuticos pueden cargarse alternativamente en liposomas para potenciar su cruce de la BBB, un enfoque también conocido como estrategia de caballo de Troya liposomal.
Especialmente en el campo del tratamiento de trastornos cognitivos y neurodegenerativos ha habido bastante interés en la administración intranasal de fármacos (p. ej., Muhs et al. 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104:9810-9815; Kao et al. 2000, Pharm Res 17:978-984; Hanson y Frey 2008, BMC Neurosci 9 (Supl3): 55). Esta estrategia se basa en los nervios trigémino y olfatorio que inervan el epitelio nasal, representando conexiones directas entre el entorno externo y el cerebro.
Una vía más reciente y prometedora para suministrar fármacos terapéuticos al cerebro consiste en la interrupción (transitoria) de la BBB por medio de ultrasonidos, más particularmente ultrasonidos enfocados (FUS; Miller et al. 2017, Metabolism 69: S3-S7). Además de ser no invasiva, esta técnica tiene, a menudo en combinación con la formación de imágenes en tiempo real, la ventaja de fijar como objetivo con precisión una zona enferma del cerebro. Los fármacos terapéuticos pueden administrarse, p. ej., en microburbujas, p. ej., estabilizados por una albúmina u otra proteína, un lípido o un polímero. Los fármacos terapéuticos pueden administrarse alternativamente, o junto con microburbujas, por cualquier otro método y, posteriormente, los FUS pueden potenciar la absorción local de cualquier compuesto presente en la sangre (p. ej., Nance et al. 2014, J Control Release 189:123-132). Solo un ejemplo es el del suministro asistido por FUS de anticuerpos dirigidos contra el péptido beta amiloide tóxico con demostración de patología reducida en ratones (Jordao et al. 2010, PloS One 5:e10549). Las microburbujas con una carga de fármaco terapéutico también pueden inducirse a estallar (efecto hipertérmico) en la vecindad de las células diana por medio de los FUS, y cuando son impulsadas, p. ej., por un promotor del gen de la proteína de choque térmico, puede inducirse la expresión temporal localizada de una proteína terapéutica por hipertermia ultrasónica (p. ej., Lee Titsworth et al. 2014, Anticancer Res 34:565-574). Alternativas para que los ultrasonidos induzcan el efecto de hipertermia son las microondas, la termoterapia intersticial inducida por láser y las nanopartículas magnéticas (p. ej., Lee Titsworth et al. 2014, Anticancer Res 34:565-574).
Administración intracelular de fármacos
Además de la necesidad de cruzar la BBB, los fármacos que fijan como objetivo trastornos del sistema nervioso central, tales como los inhibidores de sinaptogirina-3 descritos en esta memoria, también pueden necesitar cruzar la barrera celular. Una solución a este problema es el uso de proteínas o péptidos de penetración celular (CPPs, por sus siglas en inglés). Péptidos de este tipo permiten la translocación del fármaco de interés acoplado a ellos a través de la membrana plasmática. Los CPPs se denominan alternativamente dominios de transducción de proteínas (TPDs, por sus siglas en inglés), habitualmente comprenden 30 o menos (p. ej., de 5 a 30 o de 5 a 20) aminoácidos y, habitualmente, son ricos en residuos de carácter básico y se derivan de CPPs que se producen de forma natural (habitualmente de más de 20 aminoácidos), o son el resultado del modelado o diseño. Una selección no limitativa de CPPs incluye el péptido TAT (derivado de la proteína Tat del VIH-1), penetratina (derivada de Drosophila Antennapedia-Antp), pVEC (derivado de la cadherina endotelial vascular murina), péptidos basados en secuencias de señales o secuencias de translocación de membrana, péptido anfipático modelo (MAP, por sus siglas en inglés), transportano, MPG, poliargininas; se puede encontrar más información sobre estos péptidos en Torchilin 2008 (Adv Drug Deliv Rev 60:548-558 ) y las referencias citadas allí. El CPP comúnmente utilizado es el dominio de transducción de TAT denominado TATp, definido por la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 5). El péptido MAP se define por la secuencia de aminoácidos KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 6), y el péptido de penetratina por RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 7). El péptido TAT se utilizó, por ejemplo, para mezclar un fragmento tau en células neuronales (Zhou et al. 2017).
Los CPPs se pueden acoplar a soportes tales como nanopartículas, liposomas, micelas o, en general, cualquier partícula hidrofóbica. El acoplamiento puede ser por absorción o enlace químico tal como, por ejemplo, a través de un espaciador entre el CPP y el soporte. Para aumentar la especificidad de la diana, un anticuerpo que se une a un antígeno específico para la diana puede acoplarse al soporte (Torchilin 2008, Adv Drug Deliv Rev 60:548-558) Los CPPs ya se han utilizado para suministrar cargas útiles tan diversas como ADN plasmídico, oligonucleótidos, ARNpi, ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por sus siglas en inglés), proteínas y péptidos, moléculas pequeñas y nanopartículas dentro de la célula (Stalmans et al. 2013, PloS One 8: e71752).
Métodos para identificar inhibidores de sinaptogirina-3
También se describen en esta memoria, pero no están cubiertos por la invención reivindicada, métodos para identificar inhibidores de sinaptogirina-3. Los compuestos testados para identificar inhibidores de sinaptogirina-3 no se detectan necesariamente con antelación en cuanto a su especificidad hacia la sinaptogirina-3 (p. ej., mediante el uso de un ensayo de unión). Cuando no se detectan previamente, los inhibidores de sinaptogirina-3 candidatos deben someterse a una evaluación adicional con el fin de identificar compuestos específicos para sinaptogirina-3.
Aunque no está cubierto por la invención reivindicada, en esta memoria se describen métodos para identificar o detectar inhibidores de sinaptogirina-3 que inhiben la sinaptogirina-3 a nivel funcional (y por lo tanto no a nivel genético o nivel de expresión).
Un método in vitro para identificar un inhibidor de sinaptogirina-3 es un método que comprende las etapas de:
i) proporcionar sinaptogirina-3, o un fragmento de sinaptogirina-3 que comprende una o más de las regiones expuestas intraneuronalmente de sinatogirina-3;
ii) proporcionar proteína Tau, o un fragmento de Tau que comprende la región N-terminal;
iii) proporcionar un compuesto que sea candidato para ser un inhibidor de sinaptogirina-3;
iv) poner en contacto la sinaptogirina-3 o un fragmento de la misma proporcionado en i) con la proteína Tau o un fragmento de la misma proporcionado en ii) en presencia o ausencia del compuesto proporcionado en iii); v) identificar a partir de iv) un compuesto que, en comparación con condiciones idénticas, pero por la ausencia del compuesto, reduce la unión de la proteína Tau o fragmento de la misma a sinaptogirina-3 o fragmento de la misma; y vi) identificar, a partir de v), como inhibidor de sinaptogirina-3 un compuesto que se une específicamente a la sinaptogirina-3 o fragmento de la misma.
Una variante del método in vitro para identificar un inhibidor de sinaptogirina-3 es un método que comprende las etapas de:
i) proporcionar sinaptogirina-3, o un fragmento de sinaptogirina-3 que comprende una o más de las regiones expuestas intraneuronalmente de sinatogirina-3;
ii) proporcionar proteína Tau, o un fragmento de Tau que comprende la región N-terminal;
iii) proporcionar un compuesto específico para sinaptogirina-3 que es un candidato para ser un inhibidor de sinaptogirina-3;
iv) poner en contacto la sinaptogirina-3 o un fragmento de la misma proporcionado en i) con la proteína Tau o un fragmento de la misma proporcionado en ii) en presencia o ausencia del compuesto proporcionado en iii); v) identificar como inhibidor de sinaptogirina-3, a partir de iv), un compuesto que, en comparación con condiciones idénticas, pero en ausencia del compuesto, reduce la unión de la proteína Tau o fragmento de la misma a sinaptogirina-3 o fragmento de la misma.
También se describen, pero no forman parte de la invención reivindicada, los métodos in vitro arriba descritos, en los que la sinaptogirina-3 o un fragmento de la misma se puede proporcionar, p. ej., en vesículas sinápticas aisladas, en partículas similares a virus, en liposomas o en baculovirus. (Hamakubo et al. 2014, Biochim Biophys Acta 1844:1920-1924). La proteína tau o fragmento de la misma se puede inmovilizar en un soporte sólido tal como un soporte magnético. Alternativamente, la vesícula sináptica, la partícula similar a un virus o el liposoma que funciona como soporte de la sinaptogirina-3 o fragmento de la misma se inmoviliza sobre un soporte sólido. En una alternativa adicional, la sinaptogirina-3 o un fragmento de la misma y la proteína Tau o un fragmento de la misma se proporcionan en una célula neuronal.
Aunque no está cubierto por la invención reivindicada, el presente documento también describe un método para identificar un inhibidor de la interacción o unión entre Sinaptogirina-3 y Tau, que comprende expresar Sinaptogirina-3 y Tau en una célula, en el que la interacción o unión entre Sinaptogirina-3 y Tau genera una señal mensurable y en el que un compuesto se identifica como un inhibidor de la interacción o unión entre Sinaptogirina-3 y Tau cuando dicha señal mensurable es más pequeña (o menor) en presencia de dicho compuesto que en ausencia de dicho compuesto. Un ejemplo no limitante de medir la interacción o unión entre Sinaptogirina-3 y Tau es mediante el uso de luminiscencia como se explica en el Ejemplo 2.4 del presente documento. Sinaptogirina-3 y Tau pueden expresarse en células, particularmente en células humanas, más particularmente en células HEK. Dicha señal mensurable de la interacción o unión Syngr-3/Tau es de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces menor (o inferior) en presencia de dicho compuesto que en ausencia de dicho compuesto.
"Vesículas sinápticas", tal como se describe en esta memoria, se refieren a pequeñas vesículas secretoras que contienen un neurotransmisor, y son orgánulos presentes de forma natural en abundancia de un tamaño uniforme dentro de un axón cerca de la membrana presináptica. Las vesículas tienen un diámetro de aproximadamente 40 nm y albergan una serie de proteínas y fosfolípidos. En un contexto fisiológico, cuando un impulso nervioso desciende por el axón de una neurona y llega a la terminal del axón, estimula las vesículas sinápticas en la terminal para descargar neurotransmisores. Después de la fusión con la membrana, una vesícula sináptica libera su contenido en la hendidura sináptica (Dillon y Goda 2005, Annu Rev Neurosci 28: 25-55). Se ha descrito la producción de partículas similares a virus como soportes de proteínas transmembranales (p. ej., Zemanova et al. 2004, Biochemistry 43:9021-9028; Eyckerman et al. 2016, Nat Commun 7:11416).
En los métodos anteriores, la unión de la sinaptogirina-3 o fragmento de la misma a la proteína Tau o fragmento de la misma puede determinarse mediante cualquier método de detección adecuado, incluyendo detección luminiscente, fluorescente, inmunológica o radiológica, co-sedimentación, co-inmunoprecipitación o microscopía electrónica (véanse, p. ej., métodos como se describe en Zhou et al. 2017, o como se describen en los Ejemplos de esta memoria).
La "unión reductora" se obtiene cuando la unión de sinaptogirina-3 o un fragmento de la misma a la proteína Tau o un fragmento de la misma es de al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o incluso un 100 % más débil en comparación con la unión normal (100 %) de la sinaptogirina-3 o fragmento de la misma a la proteína Tau o fragmento de la misma en ausencia de cualquier inhibidor.
Una opción es seleccionar colecciones de compuestos (que comprenden al menos dos compuestos diferentes). Las colecciones de compuestos son una gran colección de compuestos almacenados que se utilizan para la detección de alto rendimiento. Los compuestos de una colección de compuestos no pueden tener relación entre sí o, alternativamente, tener una característica común. Por ejemplo, una colección de compuestos hipotéticos puede contener todos los compuestos conocidos que se sabe que se unen a una región de unión específica. Como entenderá un experto en la técnica, los métodos de detección no se limitan a los tipos de colecciones de compuestos detectados. Para la detección de alto rendimiento, se pueden utilizar colecciones de compuestos. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a colecciones de compuestos naturales, colecciones de compuestos alostéricos, colecciones de péptidos, colecciones de fragmentos de anticuerpos, colecciones de compuestos sintéticos, colecciones químicas combinatorias, etc. Los métodos de detección de alto rendimiento implican proporcionar una colección que contiene un gran número de compuestos (compuestos candidatos) que tienen potencialmente la actividad deseada. A continuación, dichas colecciones se detectan en uno o más ensayos, como se describe en esta memoria, para identificar aquellos miembros de la colección que muestran la actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos de éxito" convencionales o pueden utilizarse por sí mismos como agentes terapéuticos reales o potenciales.
En relación con estos y otros métodos para identificar inhibidores de sinaptogirina-3, "sinaptogirina-3 o fragmento de la misma" se ha descrito arriba; "proteína tau o fragmento de tau que comprende la región N-terminal" se describe a continuación.
Proteína tau y fragmentos de la misma
La proteína tau humana en el cerebro es una colección de 6 isoformas generadas mediante corte y empalme alternativo. Las 6 isoformas carecen o contienen un número diferente de inserciones casi amino-terminales ("N": 0N, 1N o 2N) y carecen o contienen "R2", una de las 4 repeticiones en el dominio de unión a microtúbulos. Esto produce las 6 variantes, desde la más larga (nombre de corte y empalme 2N4R; 441 aminoácidos) hasta la variante más corta (nombre de corte y empalme 0N3R; 352 aminoácidos), con 4 variantes intermedias (1N4R: 412 aminoácidos; 0N4R: 383 aminoácidos; 2N3R: 410 aminoácidos; 1N3R: 381 aminoácidos) (p. ej., Wang y Mandelkow 2016).
Tal como se muestra en esta memoria, la secuencia N-terminal de la proteína tau es de importancia a la vista de su interacción con la sinaptogirina-3. En el contexto de la presente divulgación, los fragmentos de tau se refieren a fragmentos que comprenden al menos la parte N-terminal de tau. Sin embargo, aún no se ha dilucidado completamente qué parte del extremo N de tau se requiere para unirse a la sinaptogirina-3, por lo que solo a modo de ejemplo, la secuencia de aminoácidos N-terminal (más particularmente los 112 aminoácidos N-terminales) de la isoforma humana tau 0NxR (en donde x= 3 o 4) se representa a continuación, así como la misma secuencia en la que se inserta la repetición N1 (1 NxR), o en la que se insertan las repeticiones N1 y N2 (2NxR).
Isoforma de tau humana 0NxR, N-terminal 112 aminoácidos (Goedert et al. 1989, EMBO J 8:393-399)
M A E PR Q EFE V MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD A G L K A E E A G I G D T PS L E D E A AGHVTQARMV
SK SK D G TGSD DKKAKGADGK T K IA T P R G A A PPGQKGQANA T R (S E Q ID N O : 8)
Isoforma 1 NxR de tau humana, 112 aminoácidos N-terminales de la isoforma 0NxR que contiene la inserción N1 amino-terminal (subrayado; Goedert et al. 1989, Neuron 3:519-526)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP
TAEAEEAGIG DTPSLEDEAA GHVTQAKMVS K3KDGTG3DD KKAKGADGKT KIATPRGAAP PGQKGQANAT
R (SEQ ID NO:9)
Isoforma 2NxR de tau humana, N-terminal 112 aminoácidos de la isoforma 0NxR que contiene las inserciones amino-terminales N1 y N2 (Goedert et al. 1989, Neuron 3:519-526)
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP
TAEDVTAPLV DEGAPGKQAAAQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG HVTQARMVSK 3KDGTGSDDK
KAKGADGKTK IATPRGAAE'P GQKGQANATR (SEQ IDNO:10)
Aunque no están cubiertos por la invención reivindicada, los métodos en esta memoria descritos para identificar o seleccionar inhibidores de sinaptogirina-3 inhiben la sinaptogirina-3 a nivel genético o nivel de expresión (y, por tanto, no a nivel funcional). Métodos de este tipo pueden comprender las etapas de:
i) proporcionar células que expresan sinaptogirina-3 o un fragmento de sinaptogirina-3 que comprende una o más de las regiones expuestas intraneuronalmente de sinaptogirina-3;
ii) proporcionar un compuesto específico de sinaptogirina-3 que sea candidato para ser un inhibidor de la expresión de sinaptogirina-3;
iii) administrar un compuesto proporcionado en ii) a las células proporcionadas en i); y
iv) identificar como inhibidor de sinaptogirina-3, de iii), un compuesto proporcionado en ii), es decir, en comparación con condiciones idénticas, pero por la ausencia del compuesto, reduce la expresión de sinaptogirina-3 o fragmento de la misma.
Las células que expresan sinaptogirina-3 o fragmentos de la misma pueden ser células neuronales o células madre de origen no embriogénico (p. ej., derivadas de blastómeros individuales como se describe por Chung et al. 2008, Cell Stem Cell 2:113-118, o células partenogenéticas ovocitos no fertilizados activados).
La "expresión reductora" se obtiene cuando la expresión de sinaptogirina-3 o fragmento de la misma es de al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o incluso un 100 % más débil en comparación con la expresión normal (100 %) de la sinaptogirina-3 o fragmento de la misma en ausencia de cualquier inhibidor.
Otras Definiciones
La presente invención se describe con respecto a realizaciones particulares y con referencia a determinados dibujos, pero la invención no se limita a ellos, sino únicamente a las reivindicaciones. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no se interpretará como una limitación del alcance. Los dibujos descritos son solo esquemáticos y no limitativos. En los dibujos, el tamaño de algunos de los elementos puede estar exagerado y no estar dibujado a escala con fines ilustrativos. Cuando se utiliza la expresión "que comprende" en la presente descripción y reivindicaciones, la misma no excluye otros elementos o etapas. Cuando se utiliza un artículo indefinido o definido cuando se hace referencia a un sustantivo en singular, p. ej., "un" o "una", "el" o “la”, esto incluye un plural de ese sustantivo a menos que se indique específicamente otra cosa. Además, los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos así utilizados son intercambiables bajo las circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en esta memoria son capaces de funcionar en secuencias distintas a las descritas o ilustradas en esta memoria. A menos que se defina específicamente en esta memoria, todos los términos y expresiones utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica de la presente invención. Los profesionales están particularmente dirigidos a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, Nueva York (2012); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 100), John Wiley & Sons, Nueva York (2012), para definiciones y términos de la técnica. No debe interpretarse que las definiciones proporcionadas en esta memoria tengan un alcance inferior al entendido por una persona con experiencia ordinaria en la técnica.
La expresión "definido por SEQ ID NO:X", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una secuencia biológica que consiste en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos dada en SEQ ID NO:X. Por ejemplo, un antígeno definido en/por SEQ ID NO:X consiste en la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:X. Un ejemplo adicional es una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:X, que se refiere a una secuencia de aminoácidos más larga que la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:X, pero que comprende completamente la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:X (en donde la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:X puede ubicarse en el extremo N o C en la secuencia de aminoácidos más larga, o puede estar incrustada en la secuencia de aminoácidos más larga), o en una secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO:X.
EJEMPLOS
1. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
1.1. Aislamiento de vesículas sinápticas de cerebro humano, de ratón y de mosca
El uso de muestras de tejido humano se ajustaba a las directrices éticas nacionales e institucionales y fue aprobado por el Comité de Ética del Banco de Cerebros de Edimburgo y el Comité de Ética de Investigación Médica de la Oficina Central Académica y Clínica para Investigación y Desarrollo. La información de casos para todas las muestras de pacientes utilizadas en este estudio se incluye en la Tabla S1. Todos los experimentos con animales se realizaron con permiso ético y bajo las pautas del comité de ética animal de KU Leuven. El aislamiento de vesículas sinápticas brutas (fracción LP2) de cerebro de mamífero o cerebro de mosca adulta de Drosophila se realizó de acuerdo con los protocolos (Ahmed et al., 2013) y (Depner et al., 2014), respectivamente, con modificaciones. Para velocidades y tiempos de centrifugación de fraccionamiento detallados, véanse los esquemas respectivos presentados en las Figuras 5 y 6. Todas las etapas de los experimentos de fraccionamiento se llevaron a cabo en hielo o a 4 °C. Se guardaron partes alícuotas de gránulos en diversas etapas durante el fraccionamiento y se lisaron en tampón RIPA (NaCI 150 mM, IGEPAL CA-630/NP-40 al 1,0 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 %, Tris 50 mM, pH 8,0, Sigma) que contenían inhibidores de proteasa y fosfatasa y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. Brevemente, tejido cerebral congelado (humano) o fresco (ratón) se cortó en cubos de 5 mm2 y se homogeneizó en tampón sacarosa (sacarosa 320 mM, HEPES 4 mM pH 7,4, cóctel inhibidor de proteasa completo 1X (Roche), cóctel inhibidor de fosfatasa PhosStop 1X (Roche) a un volumen de 9 mL por 1 g de muestra de cerebro humano o 3 mL por cerebro de ratón de seis semanas de edad (cepa C57BL/6). Para cerebros de mosca, 5 mL de cabezas de mosca tamizadas y recogidas se molieron en un mortero enfriado con nitrógeno líquido con una maja hasta obtener un polvo fino y se resuspendieron en 15 mL de tampón sacarosa por cada 5 mL de cabezas de moscas adultas La homogeneización se realizó utilizando 10 golpes a 600 pm (cerebro humano y de ratón) o 900 rpm (cerebro de mosca) en un homogeneizador de vidrio Teflon. Después de la granulación de restos celulares y núcleos, se aislaron los sinaptosomas y se lavaron una vez mediante resuspensión en 10 mL de tampón sacarosa y se volvieron a sedimentar. Los sinaptosomas se lisaron hipotónicamente mediante la resuspensión del sedimento de sinaptosomas en 10 volúmenes de agua tamponada con HEPES (HEPES 5 mM pH 7,4, cóctel inhibidor de proteasa 1X, cóctel inhibidor de fosfatasa 1x y pepstatina A (Roche, muestras de moscas) y se incubaron durante 30 min a 4 °C con rotación. Para los cerebros de mosca, la suspensión de choque osmótico se homogeneizó utilizando 3 golpes a 2000 rpm. Después del choque osmótico, una etapa de centrifugación de 25000 x g eliminó las mitocondrias y los restos grandes de la membrana sináptica; finalmente, las vesículas sinápticas se recogieron del sobrenadante por centrifugación a 165.000 x g durante 2 h. El precipitado de vesículas sinápticas en bruto resultante (LP2/SV) se resuspendió en tampón de resuspensión SV (HEPES 5 mM, pH 7,4, glicina 300 mM) y se congeló en partes alícuotas a -80 °C. Las vesículas se cuantificaron de acuerdo con el contenido de proteínas utilizando el reactivo Bradford Quick Start (Bio-Rad). La pureza de la fracción LP2/SV se verificó mediante inmunotransferencia de 20 pg de proteína de los gránulos de fraccionamiento (lisados en tampón RIPA) o 20 pg de suspensión de vesículas para marcadores de vesículas sinápticas o contaminantes.
1.2 SDS-PAGE e inmunotransferencia
Para la desnaturalización de las muestras de proteínas, se añadió a las muestras dodecilsulfato de litio 4X (LDS, Invitrogen) hasta una concentración final de 1X complementado con p-mercaptoetanol al 1 % y se desnaturalizó durante 10 min a 70­ 80 °C. Las muestras de proteína se separaron en NuPAGE al 10 %, minigeles de poliacrilamida Bis-Tris al 12 % o 4-12 % en tampón MOPS (Invitrogen), o midigeles Bis-Tris Criterion TGX al 4-15 % de proteína en tampón Tris-Glicina-SDS (Bio-Rad). Para la tinción con Coomassie coloidal, los geles se tiñeron con solución de tinción PageBlue (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la inmunotransferencia, los geles de proteína se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia TransBlot Turbo (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en TBS-T (solución salina tamponada con Tris 1x Tween-20 al 0,05 %) con leche en polvo al 5 % (p/v) durante 30-60 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se diluyeron en tampón de bloqueo (véase la Tabla 1 que figura más adelante) y se incubaron con membranas durante 1-2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C, seguido de 4 x 10 min de lavado en TBS-T. Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Jackson Immunoresearch) se diluyeron 1:10.000 en tampón de bloqueo y se incubaron con membranas durante 1 h a temperatura ambiente, luego se lavaron durante 6 x 10 min en TBS-T. Las inmunotransferencias se desarrollaron utilizando el kit de quimioluminiscencia potenciado Western Lightning Plus (Perkin Elmer) y se tomaron imágenes en un sistema de imágenes Fuji Film. El análisis de densitometría se realizó utilizando Image Studio Lite.
Tabla 1. Anticuerpos utilizados en este estudio. Se dan diluciones utilizadas para inmunotransferencia (IB) o inmunohistoquímica (IHC).
Figure imgf000018_0001
1.3. Purificación de Tau humana recombinante.
La purificación de Tau humana recombinante soluble a partir de bacterias se describió previamente (Zhou et al., 2017). Las secuencias de ADNc que codifican Tau humana de longitud completa (isoforma ON4R, 383 aa) o AN_Tau (aa 113­ 383) se clonaron detrás de una etiqueta GST N-terminal y una secuencia de escisión de proteasa PreScission en el plásmido pGEX-6P-1 y se siguieron con una etiqueta 8x-His C-terminal (insertada en el cebador de amplificación inversa). Los plásmidos de secuencia verificada se transformaron en bacterias Rosetta (Novagen) y se mantuvieron en un medio que contenía ampicilina y cloranfenicol. Los precultivos durante la noche se diluyeron 1:10 en medio LB, se incubaron durante 2 h a 37 °C hasta la fase exponencial y luego se indujo la expresión mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 0,4 mM. La expresión se llevó a cabo durante 2 h a 37 °C, seguida de la sedimentación de las células (5000 x g durante 15 min); los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para la purificación, todas las etapas se llevaron a cabo en hielo o a 4 °C. Se resuspendió un sedimento celular de 50 mL en 1,5 mL de tampón de lisis (1X PBS complementado con un cóctel de inhibidor de proteasa 1X, lisozima, benzonasa, Triton-X-100 al 1 % y glicerol al 10 %) y se incubó durante 30 min a 4 °C con mezcladura. Los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 16000 x g durante 20 min, luego se incubaron con 150 |jL de Glutathione Sepharose 4B lavada (GE Healthcare) durante 2 h a 4 °C. Las perlas de Glutathione Sepharose se lavaron 3 veces con PBS complementado con NaCl 250 mM y 2 veces con tampón de escisión de proteasa PreScission (Tris-HCl 20 mM pH 7,0, NaCI 50 mM, EDTA 0,5 mM, DTT 1 mM, Tween-20 al 0,01 %). Las perlas se incubaron durante la noche a 4 °C con proteasa PreScission etiquetada con GST (GE Healthcare) en tampón de escisión para eliminar la etiqueta N-terminal de GST y liberar Tau de las perlas de Sepharose. A la mañana siguiente, el sobrenadante se incubó durante 1 h con 75 |jL de Glutathione Sepharose recién lavada para eliminar cualquier proteasa no unida o Tau no escindido. A continuación, Tau-8xHis escindida se purificó frente a la etiqueta His C-terminal mediante incubación con 50 uL de resina Ni-NTA (Bio-Rad) durante 45 min, luego se lavó 3 veces en tampón de lavado His (NaH2PO450 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) y se eluyó mediante incubación con tampón de elución His durante 15 min (el mismo tampón con imidazol 250 mM). La Tau purificada se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon con un corte de peso molecular de 10 kDa (Millipore) y se cuantificó utilizando el reactivo Bradford Quick Start. Utilizando este método, la purificación de un sedimento celular de 50 mL produce aproximadamente 8 |jg de Tau soluble con una pureza > 95 %. Para todos los experimentos, Tau siempre se purificó recientemente y se utilizó inmediatamente después de terminar la purificación.
1.4. Ensayos de unión de vesículas sinápticas in vitro.
La capacidad de Tau recombinante purificada para unirse a vesículas sinápticas aisladas in vitro se evaluó utilizando un ensayo de sedimentación de vesículas (Piccoli et al., 2014; Zhou et al., 2017). En este ensayo, se incubaron 500 ng de Tau-8xHis recién purificada junto con 20 |jg (de acuerdo con la proteína) de vesículas sinápticas aisladas en 100 |jL de tampón de unión SV (HEp Es 4 mM pH 7,4, Tris-HCI 5 mM pH 7,4, glicina 220 mM, NaCl 30 mM, cóctel inhibidor de proteasa 1X) durante 2 h a 4 °C con rotación. La reacción de unión de 100 |jL se diluyó luego en 600 |jL de tampón de unión para evitar que los tubos se rompieran durante la centrifugación. Las vesículas se sedimentaron mediante ultracentrifugación a 165000 x g durante 1 h, y el sedimento se resuspendió y desnaturalizó en tampón de muestra 1X LDS. La presencia de Tau co-sedimentándose junto con vesículas sinápticas (detectada mediante inmunotransferencia del sedimento de vesículas con anticuerpo anti-His) indica unión.
La proteólisis limitada de vesículas sinápticas incubando 75 |jg de vesículas sinápticas junto con 50 |jL de tripsina tratada con TPCK acoplada a sefarosa (Thermo Fisher) durante 3 h a 37 °C. Después de 3 h, la proteólisis se detuvo mediante la adición de un cóctel inhibidor de proteasa 1X, PMSF 1 mM y 0,5 mg/mL de inhibidor de tripsina de soja (Sigma) y la tripsina conjugada con sefarosa se eliminó mediante centrifugación a 3000 x g para eliminar la suspensión de sefarosa. Como control, las vesículas no tratadas se incubaron a 37 °C durante 3 h, pero en ausencia de tripsina.
Para eliminar las proteínas asociadas a las vesículas sinápticas periféricas, las vesículas se despojaron de carbonato (Brose et al., 1995). Las vesículas sinápticas aisladas se diluyeron en tampón que contenía Na2COs 100 mM pH 11 e inhibidores de proteasa 1x y se incubaron a 4 °C durante 30 min. Las vesículas se sedimentaron mediante ultracentrifugación a 165000 x g durante 1 h y luego se resuspendieron en tampón neutro (HEPES 5 mM, pH 7,4, glicina 300 mM). Como control, las vesículas no despojadas se manipularon de la misma manera excepto que se diluyeron en tampón neutro en lugar de tampón carbonato. Se introdujeron volúmenes iguales de vesículas sin tratar o despojadas de carbonato en la reacción de unión.
1.5. Ensayo de flotación de liposomas.
El ensayo de flotación de liposomas se basa en un protocolo descrito previamente (Bigay et al., 2005). Para generar pequeños liposomas libres de proteínas, se secaron 0,25 mg de extracto lipídico de la fracción Folch de cerebro bovino (Avanti Lipids) bajo una corriente de nitrógeno y se secaron durante la noche en una cámara de vacío. Se generaron liposomas de 30-60 nm de diámetro añadiendo 250 |jL de tampón de unión SV calentado a la película lipídica y tratando con ultrasonidos durante 5 min en un baño a 37 °C. La microscopía electrónica verificó el diámetro uniforme de 30-60 nm de los liposomas. Se mezclaron 64 |jg de liposomas junto con 1,5 |jg de Tau recién purificada en 150 |jL de tampón de unión SV y se incubaron juntos durante 1 h a 4 °C. Después de 1 h, la densidad de la reacción de unión se ajustó a sacarosa al 30 % (p/v) mediante la adición de 100 |jL de una solución de sacarosa al 75 %. La reacción de unión de 250 |jL en sacarosa al 30 % se superpuso con una capa intermedia de 200 |jL de sacarosa al 25 % y una capa superior de 50 |jL de tampón SV (sin sacarosa). El gradiente se centrifugó a 240 000 x g durante 1 h a 4 °C y luego se recogieron fracciones de 30 pL de las capas inferior, media o superior, se desnaturalizaron con LDS y se sometieron a inmunotransferencia para Tau con anticuerpos anti-His. Debido a su densidad, los liposomas ascienden a la fracción libre de sacarosa superior durante la centrifugación, junto con las proteínas unidas a ellos. Por lo tanto, la inmunotransferencia de la proteína presente en la fracción superior indica la unión a los liposomas.
1.6. Identificación de interactuadores de proteínas de vesículas sinápticas por espectrometría de masas.
Vesículas sinápticas aisladas de cerebros de ratón (fracción LP2/SV) se lisaron en Triton-X-100 al 2 % en tampón de resuspensión SV (HEPES 5 mM, pH 7,4, glicina 300 mM) durante 1 h a 4 °C, seguido de limpieza de restos de membrana y vesículas intactas por centrifugación a 165.000 x g durante 1 h. El lisado de SV se diluyó en tampón de unión de SV hasta una concentración final de Triton-X-100 al 0,6 % y se complementó con inhibidores de proteasa recientes y NaCl hasta una concentración final de 100 mM. Para la co-inmunoprecipitación, se unieron 2 pg de TauFL -8xHis o TauñN -8xHis purificada a 25 pL de Protein G Dynabeads lavadas (Invitrogen) utilizando 1 pg de anticuerpo IgG anti-His de ratón (Thermo Fisher, clon 4A12E4) durante 2 h a 4 °C. Las perlas se lavaron dos veces y luego se incubaron con lisado SV (330 pg de proteína por reacción, Triton-X-100 al 0,6 %, NaCl 100 mM) en tampón SV con BSA al 1 % e inhibidores de proteasa recientes durante la noche a 4 °C con rotación. Como control negativo, los autores de la invención incubaron el lisado de SV junto con Dynabeads que contenían solo el anticuerpo IgG anti-His. Después de la incubación durante la noche, las perlas se lavaron tres veces con tampón SV Triton-X-100 al 0,6 % y tres veces con tampón SV para eliminar los detergentes. Las muestras se procesaron inmediatamente para espectrometría de masas. Los complejos de proteína Tau intactos se procesaron utilizando digestión en perlas mediante incubación durante la noche con 0,2 mg/mL de tripsina en tampón que contenía bicarbonato de amonio 50 mM a 37 °C. La mezcla de péptidos resultante se secó en un SpeedVac y el sedimento de péptidos se resuspendió en disolvente de carga (acetonitrilo al 2 %, ácido trifluoroacético al 0,1 %). 1/10 de cada una de las muestras se analizó por triplicado mediante LC-MS/MS mediante una separación de 30 min en un gradiente de disolvente del 2 al 50 % (80 % de acetonitrilo, 19,9 % de agua y 0,1 % de ácido fórmico) acoplado a un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap XL. Los espectros de péptidos se buscaron con el software Mascot Daemon frente a una base de datos de proteínas de Mus musculus para identificar proteínas. El conjunto de datos de espectrometría de masas sin filtrar se muestra en la Tabla S2. Las proteínas identificadas se compararon con listas completas de proteínas de vesículas sinápticas (Burré et al., 2006; Takamori et al., 2006) y se clasificaron como proteínas SV transmembrana, proteínas SV periféricas o proteínas no SV (probables contaminantes). En la Figura 11 se muestra una lista filtrada de proteínas específicas para SV identificadas ausentes en el control negativo. Los experimentos de espectrometría de masas se realizaron en el Centro de Experiencia en Proteómica VIB (Universidad de Gante, Bélgica).
1.7. Poblaciones y genética de Drosophila
Poblaciones de moscas Drosophila melanogaster se manipularon utilizando protocolos estándares. Todos los cruces experimentales relacionados con el sistema de expresión bipartito UAS/Gal4 se mantuvieron a 25 °C para inducir la expresión del transgén.
Los experimentos en la unión neuromuscular (NMJ) utilizaron el controlador D42-Gal4 específico para motoneuronas. Anteriormente, los autores de la invención describieron la generación y caracterización de variantes de Tau 0N4R (383 aa) mutantes clínicos de tipo salvaje o FTDP-17 (P301L, V337M, R406W) o mutantes AN_Tau truncados en el extremo N en el locus 68A4 en el cromosoma III (Zhou et al., 2017). Todas las moscas transgénicas se mantuvieron en el fondo de la cepa w1118. El controlador D42-Ga14 se recombinó junto con los genes UAS-Tau en el cromosoma III y, cuando fue necesario, se combinó adicionalmente con el alelo de pérdida de función syngr1 en el cromosoma II (para dar syngr+/-heterocigótico) o UAS- Sinaptotagmina- eGFP en el cromosoma II. Las moscas Syngr KO (alelo de pérdida de función syngr1, fondo w1118) fueron generadas y donadas previamente por el laboratorio J. Troy Littleton (R.J. Stevens et al., 2012). Los cruces de control se realizaron con la cepa w1118 de tipo salvaje para mantener la consistencia del fondo genético. El material UAS-Sinaptotagmina-eGFP se obtuvo de Bloomington Stock Center (material 6925) y el material UAS-syngr ARNhc es HMS01724 del proyecto Drosophila Transgenic ARNi (TRIP, Bloomington material 38274). Otros alelos y materiales de pérdida de función/desactivación utilizados en la selección genética del interactuador SV incluyen sytAD4 (DiAntonio et al., 1993), synj 2 (Verstreken et al., 2003), UAS-rph ARNhc (TRIP JF01970, Bloomington material 25950), sh/12-12B (Kasprowicz et al., 2014) y pnutXP (Bloomington material 5687).
1.8. Inmunohistoquímica de larvas de Drosophila
Para la inmunohistoquímica en las NMJs (siglas inglesas de uniones neuromusculares) de larvas de Drosophila, se diseccionaron larvas errantes de tercer estadio en tampón HL3 recién preparado (NaCI 110 mM, KCI 5 mM, NaHCO310 mM, HEPES 5 mM, sacarosa 30 mM, trehalosa 5 mM, trehalosa 10 mM MgCl2, pH 7,4) en placas recubiertas con Sylgard y luego se fijaron en HL3 formaldehído al 3,7 % durante 20 min a temperatura ambiente. Filetes de larvas se transfirieron a tubos de microcentrífuga, se lavaron con PBS y se permeabilizaron con PBS Triton-X-100 al 0,4 % durante 1 h a temperatura ambiente y luego se bloquearon durante 1 h en tampón de bloqueo (PBS BSA al 1 % Triton-X-100 al 0,4 %). La incubación del anticuerpo primario se realizó durante la noche (dilución 1:1000, véase la tabla de anticuerpos) en tampón de bloqueo. Después de la incubación durante la noche, las larvas se lavaron 3 x 20 min (PBS Triton-X-100 al 0,4 %) y luego se incubaron durante 2 h con anticuerpos Alexa-Fluor-488 o -555 (Invitrogen) diluidos 1:1000 en tampón de bloqueo, seguido nuevamente por lavado 3 x 20 min. Las larvas se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando medio de montaje VectaShield Antifade (Vector Laboratories). Las imágenes de las NMJ en los segmentos A2/A3 de los músculos larvarios 12/13 se adquirieron con un microscopio de barrido láser confocal Nikon A1R mediante la adquisición de pilas Z a través de toda la NMJ en intervalos de profundidad de 0,2 pm con una abertura de agujero de alfiler de unidad Airy 1,0. Todas las imágenes de NMJ que se muestran son proyecciones máximas de apilamientos Z.
Para cuantificar la asociación entre Tau y vesículas sinápticas marcadas con CSP in vivo en NMJs de Drosophila, se utilizó el complemento "Prueba de colocación" en el software ImageJ. Cada uno de los botones en un NMJ se rodeó individualmente como un ROI, y se seleccionó la posición Z en donde CSP era el más ancho/más periférico alrededor del botón. Luego se ejecutó el complemento "Prueba de colocalización" (Imagen J) para medir el solapamiento entre los canales Tau (anticuerpo DAKO) y CSP utilizando 75 iteraciones, aleatorización de Fay y midiendo solo en la sección Z individual. El valor de R(obs) se tomó como el coeficiente de Pearson para ese botón. Se realizó el mismo análisis para cada uno de los botones en un NMJ y se promedió para dar n = 1 punto de datos. Obsérvese que la gran área del botón ocupada por vesículas sinápticas marcadas con CSP da lugar a un alto coeficiente de Pearson de fondo y, por lo tanto, Tau AN (que carece del dominio de unión de vesículas sinápticas N-terminal) sirve como control para la pérdida de unión de vesículas sinápticas en experimentos que representan la cuantificación de los coeficientes de Pearson.
1.9. Ensayo FRAP de movilidad de vesículas sinápticas en NMJs larvales de Drosophila
El uso de un ensayo de recuperación de fluorescencia después del ensayo de fotoblanqueo (FRAP) para evaluar la movilidad de vesículas sinápticas se ha descrito previamente (Seabrooke et al., 2010; Zhou et al., 2017). Se cruzaron moscas que expresaban UAS-Sinaptotagmina-GFP y UAS-Tau bajo el control del promotor D42-Ga14 con moscas WT (cepa w1118) o Syngr KO para dar un fondo Syngr -/+. Las larvas de tercer estadio se diseccionaron en tampón HL3 reciente y se sujetaron a placas recubiertas con Sylgard. La fluorescencia de sinaptotagmina-GFP se visualizó en un microscopio láser confocal Nikon A1R con un objetivo de inmersión en agua 60x 1.0 NA sumergido en tampón HL3. Las imágenes se adquirieron a 1,12 ps/px, estenopeica 1 unidad aireada, resolución 512 x 512 px utilizando la línea láser de 488 nm y filtros apropiados para fluorescencia GFP. Todos los registros se realizaron a partir de botones en los segmentos A2/A3 de los músculos 12/13. Después de la adquisición de una línea de base previa al blanqueo, se fotoblanqueó un punto pequeño (24 x 30 px) en la periferia del botón utilizando una potencia láser del 95 % de líneas láser de 405 nm y 488 nm (9 iteraciones). La formación de imágenes en la configuración de adquisición normal se continuó a intervalos de 1 s durante 60 s. La intensidad del punto blanqueado, representada como porcentaje de la fluorescencia inicial, se normalizó a un botón de referencia no blanqueado y se midió utilizando el software de análisis de Nikon (NIS-Elements AR 4.5), y la traza se ajustó a una curva exponencial doble en el software GraphPad Prism. 7. Se adquirieron trazas de FRAP de 2-4 botones por larva.
1.10. Electrofisiología en NMJs larvales de Drosophila.
Para la electrofisiología, se cruzaron moscas que expresaban D42 > UAS-Tau P301L (recombinadas en el cromosoma III) con moscas WT o syngr KO para dar un fondo syngr+ /~. Los axones que inervan las NMJs en los segmentos A2/A3 de los músculos larvarios en 12/13 se cortaron y utilizaron para registros de tensión intracelular utilizando electrodos afilados (resistencia de ~ 20 MQ, umbral de estimulación 2X). Los potenciales de unión excitatoria (EJPs, por sus siglas en inglés) de NMJ se registraron en respuesta a una estimulación de 10 Hz con un amplificador Axoclamp 900A y se digitalizaron con un dispositivo Digi-data 1440A, y se registraron en el software pClamp (versión 10.2, Molecular Devices). Las amplitudes máximas de los EJPs se agruparon cada 30 s y se normalizaron a la amplitud medida en respuesta a los primeros 15 estímulos.
1.11. Cultivo neuronal primario del hipocampo de ratones transgénicos Tau
La generación y caracterización del modelo de ratón Tau PS19 se ha descrito previamente (Yoshiyama et al., 2007). Para cultivos neuronales primarios, machos Tau PS19 hemicigóticos sobre un fondo C57BL/6 se aparearon con ratones hembra C57BL/6 de tipo salvaje de una colonia no relacionada. Los embriones se recogieron el día E17.5 y los cerebros se aislaron y diseccionaron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés) para obtener los hipocampos. Trozos de hipocampo se incubaron con tripsina al 0,25 % y 0,1 mg/ml de DNasa en HBSS durante 15 min a 37 °C, seguido de tres lavados en HBSS antes de la resuspensión en m Em precalentado que contenía suero de caballo al 10 % (v/v), D-glucosa 33 mM y 1X Pen-Strep (Invitrogen). Los trozos de hipocampo se trituraron suavemente con pipetas Pasteur de vidrio de tamaño decreciente para obtener una suspensión unicelular. Las neuronas se colocaron en placas a una densidad de ~55.000 células por cubreobjetos de vidrio de 18 mm (lavado con ácido nítrico y recubierto con 0,1 mg/mL de polilisina y 1 pg/mL de laminina). 2-4 h después de la siembra, el medio se reemplazó por medio NB-B27 (medio neurobasal complemento 1x B27, Glutamax 0,5 mM, Pen-Strep 0,2x, Invitrogen). Las neuronas se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.1/3 del medio se reemplazó por medio reciente cada 7 días.
Las neuronas del hipocampo de cada uno de los embriones independientes se cultivaron individualmente y se genotiparon utilizando los cebadores 5'-GGGGACACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCTCC-3' (directo; SEQ ID NO: 11) y 5'-TCCCCCAGCCTAGACCACGAGAAT-3' (inverso; SEQ ID NO: 12) que proporciona un producto de PCR específico para el transgén hTau P301S a 350 pb. Un par de cebadores de control interno (directo 5'-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3', SeQ ID NO: 13; inverso 5'-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3', SEQ ID NO: 14), que da un producto de PCR a 170 pb, se utilizó como un control positivo. El ADN de las colas embrionarias se preparó y procesó para el genotipado utilizando el kit KAPA Mouse Genotyping HotStart (KAPA Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los ensayos funcionales, se utilizaron neuronas de hermanos de camada no transgénicos como controles en comparación con neuronas hemicigotas para el transgén TauP301S.
1.12. Preparación de lentivirus y transducción de neuronas primarias.
Vectores aleatorios y reducidos syngr3: Origene produjo plásmidos de transferencia que codifican RFP (promotor CMV) y ARNhc aleatorios o syngr3 anti-ratón/rata (promotor U6) en el plásmido pRFP -CB-shLenti. La secuencia de fijación de objetivo de sh Syngr3 A es 5'-GTTCGTAGGCTTCTGTTTCCTCACCAATC-3' (SEQ ID NO: 15) y la secuencia de fijación de objetivo de sh Syngr3 B es 5'-GAGCCTGCCGCTTCGGCGTCGTACTAGGT-3' (SEQ ID NO: 16). La secuencia codificada es 5'-GCACTACCAGAGCTAACTCAGATAGTACT-3' (SEQ ID NO: 17). La secuencia del bucle es 5'-TCAAGAG-3' (SEQ ID NO:18).
Vector de sinaptofisina-eGFP: la secuencia de ADNc que codifica la sinaptofisina de rata (307 aa) se clonó cadena arriba de una etiqueta de fusión de eGFP C-terminal (238 aa) en un plásmido de transferencia lentiviral de segunda generación bajo el control de la sinapsinina de rata de 1,1 kb. 1 fragmento de promotor.
Plásmidos de transferencia, plásmido de empaquetamiento psPAX2 y el plásmido de envoltura pMD2.G (Addgene) se propagaron en células TOP10 (Invitrogen) y el ADN del plásmido se purificó para la transfección utilizando un kit Plasmid Plus Midi (Qiagen). Se transfectaron 1,3 x 107 células HEK 293T (50-70 % de confluencia) en un matraz T175 con 1 pg de pMD2.G, 9 pg de psPAX2 y 10 pg de plásmido de transferencia con Lipofectamine-2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en DMEM suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) al 2 %. 6 h después del inicio de la transfección, el medio se reemplazó por 15 mL de DMEM reciente FBS al 10 %. El medio acondicionado que contenía partículas lentivirales se recogió 48 h después del final de la transducción, se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 pm y se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon con un corte del peso molecular de 100 kDa hasta un volumen final de 1 mL, luego se dividió en partes alícuotas, se ultracongeló y almacenó a -80 °C hasta su uso. El título viral se testó empíricamente; en general, se utilizaron 10-20 |jL de medio concentrado que contiene lentivirus (15 mL de un matraz T175 concentrado a 1 mL) para transducir ~ 55.000 neuronas en un cubreobjetos de 18 mm en una placa de 12 pocillos.
Se transdujeron neuronas hipocampales primarias en DIV4 o DIV5. Se retiró la mitad del medio de cultivo y se trasladó a una placa nueva, a la que se añadió otra mitad de medio NB-B27 reciente. Se añadieron 10-20 pL de cada uno de los lentivirus a cada uno de los cubreobjetos y se dejó durante 6 h para infectar las neuronas. Después de 6 h, el medio que contenía lentivirus se eliminó por completo y se reemplazó por la mezcla NB-B27 mitad acondicionada/mitad reciente. El medio no se cambió de nuevo durante 7 días después de la transducción.
1.13. Inmunohistoquímica de cultivos neuronales.
Neuronas DIV 17 se lavaron una vez con PBS (con MgCl2 y CaCk) y se fijaron (paraformaldehído al 4 % sacarosa al 4 % en PBS) durante 25 min a temperatura ambiente. Las neuronas se permeabilizaron y bloquearon mediante incubación con suero de cabra al 5 %, BSA al 2 %, T riton-X-100 al 0,3 % en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se incubaron con anticuerpo primario (véanse las diluciones en la tabla) durante la noche a 4 °C en PBS con suero de cabra al 2 %, BSA al 2 % y Triton-X-100 al 0,1 %. Al día siguiente, los cubreobjetos se lavaron 3 x 5 min en PBS y luego se incubaron con anticuerpos secundarios Pacific Blue, Alexa-Fluor-488, -555 o -647 (Invitrogen) diluidos 1:500 en PBS con suero de cabra al 2 %, BSA al 2 % y Triton-X-100 al 0,1 % durante 2 h a temperatura ambiente. Después de 3 lavados de 5 min en PBS, los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje VectaShield Antifade (Vector Laboratories). Las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal Nikon A1R con una abertura estenopeica de 1 unidad Airy. Todas las imágenes de las neuronas primarias que se muestran son secciones ópticas individuales (0,2 jm de profundidad). La cuantificación de la localización presináptica de Tau en las neuronas del hipocampo se midió como el coeficiente de colocalización de Pearson entre hTauP301S (anticuerpo HT7) y el marcador de vesículas sinápticas Synapsin. Se seleccionaron segmentos de axón completos de aproximadamente 20 pm como ROIs. Los segmentos de axón distal (al menos a 60 pm de distancia del cuerpo celular) se eligieron aleatoriamente utilizando los canales Synapsin y RFP de manera imparcial. Luego, se ejecutó el complemento "Prueba de colocalización" en ImageJ en las imágenes adquiridas para medir el solapamiento entre los dos canales utilizando 75 iteraciones y la aleatorización de Fay. El valor de R(obs) se tomó como coeficiente de Pearson.
La cuantificación de los niveles de hTauP301S (anticuerpo HT7) en axones (utilizando las mismas imágenes que para la localización presináptica) se realizó en ImageJ midiendo la densidad integrada de fluorescencia a lo largo de segmentos de axones (aproximadamente 20 pm), seleccionados como ROIs. La cuantificación de los niveles de siaptogirina-3 se realizó midiendo la densidad integrada de sinaptogirina-3 en los puntos presinápticos marcados con sinapsina. La intensidad relativa de 5-10 puntos por axón/célula se normalizó a la señal de Sinapsina y luego se promedió para dar n = 1 punto de datos por célula. La cuantificación del tamaño de la sinapsis se realizó cuantificando el área de puntos de Sinapsina en ImageJ. La cuantificación del número de sinapsis se contó manualmente en función de la longitud del segmento del axón.
1.14. Ensayo de estimulación de campo y movilidad de vesículas sinápticas en neuronas primarias
El ensayo de dispersión de vesículas se basa en un protocolo descrito previamente (Wang et al., 2014). Los cubreobjetos que contenían neuronas del hipocampo DIV17 transducidas en DIV4-5 con lentivirus que expresan sinaptofisina-eGFP y, cuando se indique, lentivirus que codifican ARNhc aleatorio o anti-syngr3, se extrajeron de su medio y se bañaron durante 5 min en tampón de registro (HEPES 25 mM, pH 7,4), NaCI 119 mM, kC i 2,5 mM, CaCl22 mM, MgCl22 mM, glucosa 30 mM) complementado con D-APV 50 pM (Abcam) y CNQX 10 pM (Sigma) para detener la actividad de la red en curso. Los cubreobjetos se transfirieron a una cámara de estimulación de campo RC-49MFSH (Warner Instruments) y el cubreobjetos se selló alrededor de los bordes con aceite. Se conectaron electrodos de alambre de platino a cada uno de los lados de la cámara de registro a la unidad aisladora de estímulo. Se añadió tampón de registro para cubrir los electrodos y se sumergió en la cámara un objetivo de inmersión en agua 60X 1,0 NA. La formación de imágenes en vivo se realizó en un microscopio confocal Nikon A1R vertical, utilizando una abertura estenopeica de 5 unidades Airy en intervalos de 1 s utilizando una potencia de láser del 0,5-1,0 % en la línea láser de 488 nm con adquisiciones en intervalos de 1 s. Se registró la fluorescencia durante 30 s para garantizar que no hubiera fotoblanqueo o pérdida de enfoque antes de que comenzara la estimulación. A partir de los 30 s, las neuronas se estimularon durante 180 s administrando pulsos de 1 ms a intervalos de 33,3 ms (30 Hz) utilizando un Accupulser A310 (World Precision Instruments) conectado a un Stimulus Isolator A365 (World Precision Instruments) ajustado a 50 mA y modo unipolar. Para cada uno de los registros, se cuantificó el cambio en la intensidad de la fluorescencia de los puntos de sinaptofisina-GFP (la tü se ajustó al 100 %) de 20-40 sinapsis (todos los puntos claros a la vista para cada uno de los cubreobjetos se seleccionaron como ROIs individuales utilizando el software de análisis de Nikon) de 2-5 axones a la vista y promediados para dar n=1 traza promediada por cubreobjetos.
1.15. Electrofisiología de neuronas hipocampales autápticas.
Previamente se ha descrito el establecimiento de cultivos neuronales autápticos (Bekkers y C.F. Stevens, 1991; Burgalossi et al., 2012). Cubreobjetos de vidrio se estamparon en rejilla con poli-lisina y laminina, y se secaron. Los astrocitos primarios disociados del córtex de las crías de ratón P0 NMRI (Charles River) se cultivaron hasta una confluencia del 60-70 % en un matraz que contenía DMEM FBS al 10 %, se dividieron y se sembraron 25000 astrocitos por cubreobjetos de vidrio de 32 mm en una placa de 6 pocillos y se dejó formar islas de micropuntos en DMEM FBS al 10 % durante 4 días. Luego se cambió el medio por medio NB-B27 modificado (medio neurobasal complemento 1 x B27, Glutamax 0,5 mM, D-glucosa 12 mM, p-mercaptoetanol 25 pm, Pen-Strep 0,2x, Invitrogen) y se sembraron 2.500 neuronas del hipocampo directamente en las islas. Cuando se indicó, las neuronas se transdujeron con lentivirus en DIV5 durante 6 horas, seguido de un único cambio de medio de medio volumen.
Se realizó electrofisiología de pinzamiento de voltaje de célula completa en neuronas DIV17-19. Todas las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente y solo se utilizaron islas con neuronas individuales para el registro. La solución de pipeta intracelular contenía KCI 136 mM, HEPES 18 mM, Na-ATP 4 mM, MgCl24,6 mM, K2-ATP 4 mM, fosfato de creatina 15 mM, EGTA 1 mM y fosfocreatina quinasa 50 U/mL (300 mOsm, pH 7,30). La solución extracelular utilizada durante los registros contenía NaCl 140 mM, KCl 2,4 mM, CaCl24 mM, MgCl24 mM, HEPES 10 mM, glucosa 10 mM (300 mOsm, pH 7,30). Las neuronas se pinzaron con un voltaje de célula completa a 70 mV utilizando un amplificador doble EPC-10 (HEKA Elektronik, Lambrecht/Pfalz, Alemania) bajo el control del software Patchmaster v2 x 32 (HEKA Elektronik). Las corrientes se registraron a 20 Hz y se filtraron en paso bajo a 3 kHz cuando se almacenaron. Las pipetas se extrajeron utilizando un Sutter P-1000 y la resistencia osciló entre 3 y 5 MQ. La resistencia en serie se compensó al 75-85 %. Las céliulas con resistencias en serie superiores a 15 MQ se excluyeron del análisis. La liberación glutamatérgica espontánea (mEPSC) se registró a 70 mV. La liberación evocada se indujo utilizando una despolarización breve del soma celular (de 70 a 0 mV durante 1 ms) para iniciar la liberación glutamatérgica dependiente del potencial de acción (eEPSC).
1.16. Análisis estadístico.
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 7. En los casos en los que se muestran las cuantificaciones, en cada una de las leyendas se define la representación gráfica y las barras de error, junto con la definición de n y qué prueba estadística se realizó. Las barras de error representan la desviación estándar (DE) o el error estándar de la media (EMT), como se indica. En todos los casos, la significancia estadística se definió de la siguiente manera: ns -no significativa (p > 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Para comparaciones múltiples utilizando ANOVA de una vía, se utilizó la prueba de comparación múltiple de Dunnett para comparar cada una de las condiciones con un solo grupo de control.
2. RESULTADOS
2.1. Sinaptogirina-3 es un interactuador físico y genético de Tau
La localización de Tau hiperfosforilada patológica en terminales presinápticos de cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer se describió previamente (Tai et al. 2014; 2012; Zhou et al. 2017), y trabajos recientes demostraron que Tau localizada presinápticamente se une a vesículas sinápticas (SV) de moscas y roedores a través de su dominio N-terminal (Zhou et al. 2017). Para evaluar la posible relevancia de la asociación de Tau con SVs en enfermedades humanas, se fraccionó bioquímicamente tejido cerebral post mortem de pacientes con enfermedad de Alzheimer o controles no dementes para aislar SVs (Figuras 5A-B, Tabla S1). Mediante el examen de una cohorte de 15 pacientes, se detectó el enriquecimiento de especies Tau hiperfosforiladas en las fracciones SV del cerebro del paciente con enfermedad de Alzheimer utilizando anticuerpos que reconocen los epítopos fosfo-Tau asociados a la enfermedad (Figuras 5C-E). Estos datos sugieren la asociación de Tau con SVs en la enfermedad de Alzheimer, lo que justifica una exploración adicional de esta vía como un contribuyente potencial a la disfunción sináptica inducida por Tau en la enfermedad humana.
En primer lugar, se determinó el mecanismo de unión de Tau a SVs para identificar nuevas dianas para interrumpir esta interacción. Las SVs están compuestas por la membrana de la vesícula, proteínas SV transmembrana integrales y proteínas asociadas a SV periféricas (Takamori et al. 2006). Primero se evaluó si las interacciones proteína-proteína o las interacciones de los lípidos de la membrana median en la asociación de Tau con las SVs. SVs se aislaron del cerebro de ratones (Figuras 6A-B) y se realizó una proteólisis limitada mediante incubación con tripsina, que degrada todas las proteínas periféricas asociadas a SV y los dominios citoplásmicos de las proteínas SV transmembrana, pero deja intacta la bicapa lipídica de la membrana (Figuras 1A-B). A continuación, las SVs sin tratar o tripsinizadas se incubaron con Tau humana recombinante purificada de bacterias (Figura 6C). Después de la incubación con Tau, las SVs se sedimentan mediante ultracentrifugación y la unión de Tau a las SVs se evalúa mediante inmunotransferencia para Tau en el sedimento de SV. En este ensayo de co-sedimentación, Tau se une a las SVs no tratadas, pero esta unión se pierde en gran medida tras la proteolisis de las proteínas SV (Figuras 1C-D), lo que indica que las proteínas SV son necesarias para la unión de Tau a las SVs. De acuerdo con esto, no se detectó la unión de Tau a liposomas libres de proteínas sintéticas que son similares en tamaño y composición lipídica a las SVs (Figura 6D). Por lo tanto, las interacciones proteína-proteína son la base de la unión de Tau a las SVs.
Para delimitar adicionalmente si Tau se une a las SVs a través de la interacción con proteínas SV transmembrana o proteínas asociadas a SV periféricas, se realizó la extracción de carbonato de las SVs. Esta manipulación elimina las proteínas asociadas a SV periféricas, pero deja intactas las proteínas SV transmembrana (Figura 1E). Cuando se introduce en el ensayo de sedimentación, Tau se une igualmente bien a las SVs no tratadas y despojadas de carbonato (Figuras 1F-G), lo que indica que las proteínas periféricas asociadas a SV son prescindibles para la unión. Juntos, estos datos indican que Tau se une a las SVs a través de la interacción con proteínas SV transmembrana. Luego se utilizó un enfoque de proteómica directa imparcial para identificar las proteínas SV transmembrana que se unen a Tau (Figura 1H). La lisis con alto contenido de detergente de las SVs aisladas para solubilizar las proteínas de SV fue seguida de una reacción de coinmunoprecipitación (co-IP) utilizando Tau FL-His recombinante purificado o TauñN -His como cebo (Figura 6C), seguido de análisis de espectrometría de masas para identificar proteínas unidas. El dominio N-terminal de Tau es necesario para unirse a las SVs (Zhou et al.2017) y, por lo tanto, el interactuador de Tau en las SVs debe unirse a Tau de longitud completa (TauFL)m pero no a Tau truncada en el extremo N (TauñN). Utilizando este enfoque, se identificaron 8 proteínas SV como interactuadores potenciales de Tau (Figura 11, Tabla S2), pero solo una proteína era transmembrana y específica para el extremo N de Tau: Sinaptogirina-3 (Syngr3).
Syngr3 es el único candidato que cumple los criterios como interactuador potencial de Tau in vitro; no obstante, se testó si homólogos de Drosophila de cualquiera de las 8 proteínas SV identificadas en el enfoque de proteómica muestran una interacción genética con Tau in vivo mediante la realización de una detección genética de moscas. En esta detección, las moscas que expresan FTDP-17 mutante clínico TauP301L se cruzaron con alelos de pérdida de función o construcciones de ARNhc para los homólogos de Drosophila de estos 8 interactuadores candidatos, y la colocalización de Tau con SV se midió como una lectura de la asociación Tau-SV in vivo (Figura 1J, véase también más adelante). En larvas de Drosophila de tercer estadio que expresan Tau humana que portan mutaciones clínicas de FTDP-17 (P301L, V337M o R406W) en neuronas motoras, la Tau mutante se disocia de los microtúbulos axonales y se reubica en los botones de la unión neuromuscular (NMJ) presináptica. En los botones, Tau se colocaliza con SV que se organizan en un patrón similar a un anillo en la periferia del botón (Figuras 2A-B), que es cuantificable mediante el coeficiente de colocalización de Pearson entre Tau y SVs inmunomarcadas con anticuerpos proteína de cadena anti-cisteína (CSP). TauP301L mostró un patrón difuso cuando se redujo el nivel de expresión de Sinaptogirina (Syngr, el único homólogo de Drosophila de Syngr3 (Stevens et al. 2012)), pero no cualquier otro interactuador candidato (Figuras 1K, 2A-B). De manera similar, otros dos mutantes patogénicos de FTDP-17 Tau también muestran una localización difusa en los botones cuando se reduce la expresión de Syngr (Figura 2C). Tanto la pérdida heterocigótica (reducción del 50 %) como la eliminación mediada por ARNhc (reducción del 90 %, Figuras 6E-F) de Syngr fueron eficaces para provocar la disociación de Tau de las SVs en una medida similar a la deleción genética del dominio de unión de la SV N-terminal de Tau (expresión de TauñN) (Figuras 1K, 2A-C), lo que indica que la pérdida parcial de Syngr es suficiente para reducir la unión de Tau-SV in vivo.
Para testar si se requiere Syngr para la interacción física directa de Tau con SVs, se aislaron SVs de cerebros de moscas adultas de tipo salvaje (WT) o inactivadas syngr cero (KO) (Figuras 6G-H). En el ensayo de co-sedimentación, la Tau humana recombinante se une a las SV WT, pero la unión a las SVs KO syngr se reduce considerablemente (Figuras 2D-E). Estos resultados complementan los hallazgos en NMJs in vivo en donde la reducción de Syngr provocó la localización difusa de Tau patógena (Figuras 2A-C). En conjunto, estos datos indican que la interacción física entre Tau y Syngr es el principal mecanismo que subyace a la unión de Tau a SV.
2.2. La reducción de Sinaptogirina rescata la disfunción presináptica inducida por Tau en Drosophila
Cuando Tau se une a las SVs, éstas se vuelven reticuladas y menos móviles, lo que provoca defectos en el reclutamiento de un número suficiente de vesículas para mantener la liberación de neurotransmisores durante la actividad sostenida (Zhou et al. 2017). Aquí se demostró que Syngr media en la asociación de Tau con SVs y, por lo tanto, se evaluó si la reducción de Syngr es suficiente para rescatar los defectos presinápticos inducidos por Tau. Como lectura de la reticulación de SV, se examinó la movilidad de las SVs en las NMJs larvales mediante la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP, por sus siglas en inglés). En larvas que expresan el marcador de SV vivo Sinaptotagmina-GFP (Syt-GFP), el fotoblanqueo de una pequeña zona de las SVs dentro de un botón presináptico agota esas vesículas de fluorescencia Syt-GFP y, por lo tanto, la recuperación de la señal de fluorescencia con el tiempo en esa zona refleja la movilidad de otras SVs que se difunden (Seabrooke et al. 2010). En comparación con los controles, se reduce la movilidad de SV en los botones presinápticos de las larvas que expresan tres mutantes de Tau patogénicos independientes, lo que indica la reticulación de SV inducida por Tau (Figuras 3A-B). En particular, la pérdida heterocigota de Syngr es suficiente para restaurar la movilidad de SV a los niveles de control en los tres fondos Tau mutantes (Figuras 3A-B). Esta movilidad incrementada de las vesículas era específica para Tau, ya que las larvas syngr +A solas no diferían en la movilidad de SV en comparación con los controles (Figura 3B). Por lo tanto, la unión dependiente de Syngr de Tau a SVs afecta directamente a la movilidad de SV en las terminales presinápticas.
Para testar si la reducción de Syngr también es suficiente para mejorar los defectos inducidos por Tau en la neurotransmisión durante la actividad sostenida, se registraron los potenciales de unión excitatoria (EJPs, por sus siglas en inglés) en las NMJs larvales en respuesta a la estimulación de 10 Hz durante 10 minutos. Las larvas que expresan TauP301L exhiben amplitudes de EJP progresivamente más bajas durante este paradigma de estimulación; sin embargo, este defecto se recupera de nuevo a los niveles de control tras la reducción de Syngr (syngr+'~) (Figuras 3C-E).Tomados en conjunto, estos datos respaldan la hipótesis de que Tau patógena localizada presinápticamente se une y reticula directamente las SVs a través de Syngr, lo que evita el reclutamiento de vesículas para su liberación y, en última instancia, atenúa la liberación de neurotransmisores durante la actividad sostenida.
2.3. Sinaptogirina-3 media en la disfunción presináptica en las neuronas del hipocampo de un ratón con tauopatía modelo
El genoma de los mamíferos codifica cuatro sinaptogirinas que están lejanamente relacionadas con sinaptofisina y sinaptoporina, y comparten una topología común de cuatro dominios transmembrana con colas N- y C-terminales expuestas al citoplasma (Kedra et al. 1998). Solo las sinaptogirinas-1 y -3 son específicas para las neuronas y están presentes en las vesículas sinápticas (Belizaire et al. 2004). La detección proteómica arriba descrita solo identificó a Syngr3 como un interactuador de Tau y, por lo tanto, se testó si la reducción de Syngr3 es suficiente para mejorar la disfunción sináptica en las neuronas de un modelo de ratón transgénico bien establecido de Tauopatía. Ratones Tau PS19 expresan el mutante clínico humano FTDP-17 TauP301S y muestran características relevantes para la enfermedad de disfunción sináptica, pérdida de sinapsis y neurodegeneración durante el envejecimiento (Yoshiyama et al. 2007). En primer lugar, se evaluó si TauP301S mutante de FTDP-17 se localiza en terminales presinápticos en neuronas del hipocampo de ratón. Se estableció un cultivo neuronal primario a partir del hipocampo de embriones de ratón transgénico E18 Tau PS19, se les permitió madurar durante 17 días en cultivo y luego se evaluó la localización de TauP301S mediante inmunohistoquímica junto con los marcadores presinápticos VGlut1 o Sinapsina y el marcador dendrítico MAP2. En los axones distales, se observó una tinción punteada de TauP301S a lo largo del axón que se colocaliza con el marcador presináptico VGlut1 (Figuras 7A-C). Por lo tanto, de acuerdo con el modelo de mosca, el mutante patogénico Tau se localiza en los terminales presinápticos en las neuronas del hipocampo de ratones Tau PS19, recuperando este evento patogénico clave que también se observa en enfermedades esporádicas como la enfermedad de Alzheimer. Posteriormente se evaluó si la reducción del nivel de expresión de Syngr3 altera esta localización presináptica punteada de Tau. Se produjeron lentivirus que codifican RFP, así como secuencias de horquilla cortas que fijan como objetivo a syngr3 , y se validaron dos construcciones de ARNhc independientes que dieron como resultado una reducción de más del 95 % de los niveles de Syngr3, pero que obviamente no afectaron a la viabilidad neuronal, la morfología o la formación de sinapsis (Figuras 7D-G) . En neuronas transducidas con virus de control aleatorio, TauP301S mantuvo su localización punteada a lo largo del axón, mostrando una estrecha localización en grupos de vesículas presinápticas marcadas con sinapsina en el axón, negativo para el marcador dendrítico MAP2 (Figura 4A). Por el contrario, la reducción de ARNhc mediada por virus de Syngr3 dio como resultado un patrón de tinción más difuso de TauP301S a lo largo del axón, y TauP301S ya no estaba estrechamente asociado con los grupos SV (Figura 4A). Como una medida de la asociación de Tau con los grupos de vesículas presinápticas, se cuantificó la colocalización de TauP301S con el marcador SV Sinapsina a lo largo de los axones, lo que reveló una reducción significativa en la asociación de TauP301S con los grupos de SV presinápticos tras la reducción de Syngr3 (Figura 4B), mientras que los niveles generales de Tau no se ven afectados (Figura 4C). Por lo tanto, Syngr3 recluta TauP301S en sitios de grupos de vesículas presinápticas en neuronas del hipocampo de ratón, lo que sugiere una asociación dependiente de Syngr3 de Tau con SV.
Se determinó, además, si la asociación dependiente de Syngr3 de Tau con SVs conduce a una movilidad reducida de SV en las neuronas del hipocampo utilizando un ensayo de dispersión de SV. En las sinapsis centrales de los mamíferos, las SVs se asientan en grupos compactos a lo largo del axón, que se vuelven más móviles y difusos durante la actividad neuronal (Sankaranarayanan y Ryan 2000). Por lo tanto, la medición del cambio en la intensidad de la fluorescencia de un marcador SV vivo para evaluar la difusión de vesículas durante la estimulación neuronal puede servir como una medida de la movilidad de las vesículas (Wang et al. 2014). Las neuronas del hipocampo se transdujeron con lentivirus que expresan el marcador SV vivo Sinaptofisina-GFP (Syph-GFP). Se utilizó la formación de imágenes en vivo para registrar los cambios en la intensidad de fluorescencia de Syph-GFP, que disminuyó en respuesta a la estimulación de 30 Hz, lo que refleja la movilización de vesículas dependiente de la actividad (Figura 4D). En comparación con las neuronas de compañeros de camada no transgénicos (No Tg), las neuronas de ratones transgénicos TauP301S mostraron un cambio reducido en la fluorescencia Syph-GFP durante la estimulación de 30 Hz (Figuras 4D-E), indicativo de movilidad SV deteriorada. Al reducir los niveles de Syngr3 en las neuronas TauP301S por transducción con el virus de reducción de Syngr3, la movilidad de la SV se restauró a los niveles de control (Figuras 4D y 4F). Por lo tanto, la unión de Tau a SV dependiente de Syngr3 subyace a los defectos inducidos por Tau en la movilidad de vesículas presinápticas.
Finalmente, se determinó si los defectos mediados por Syngr3 inducidos por Tau estaban funcionalmente relacionados con defectos en la neurotransmisión realizando electrofisiología en cultivos autápticos de neuronas del hipocampo. Los registros de pinzamiento de voltaje de células enteras de neuronas DIV17-19 no mostraron diferencias obvias en los parámetros de liberación basal en neuronas de ratones TauP301S en comparación con compañeros de camada No Tg. Sin embargo, la medición de la liberación en respuesta a series de estimulación repetidas de 10 Hz reveló que las neuronas TauP301S no podían mantener la eficacia de liberación evocada tan bien como las neuronas No Tg (Figuras 4G-H). Por el contrario, la reducción de los niveles de Syngr3 en las neuronas TauP301S por transducción con el virus de reducción de Syngr3 restableció la liberación de neurotransmisores evocados a un intervalo similar al de los controles No Tg (Figuras 4G, 4I). Estos datos respaldan firmemente el modelo de SVs reticuladas a Tau a través de Syngr3 y haciendo que una parte del conjunto de SV no pueda ser reclutada para su liberación, lo que en última instancia reduce la liberación de neurotransmisores durante la estimulación sostenida.
Tomados en conjunto, estos datos identifican a Syngr3 como un interactuador novedoso de Tau que media en los déficits de liberación sináptica en modelos de tauopatía en moscas y ratones actuando como el receptor de Tau en SVs presinápticas. Al fijar como objetivo a Syngr3, una proteína SV exclusivamente presináptica, la función presináptica de Tau se desvinculó genéticamente de otras posibles funciones patológicas y reveló que la inhibición específica de la unión Tau-SV dependiente de Syngr3 mejora los defectos en la función presináptica y la liberación de neurotransmisores.
2.4. La proteína Tau y sinaptogirina-3 interactúan directamente
Para verificar si Tau y Syngr-3 interactúan directamente, se utilizó un ensayo de luciferasa dividida, más precisamente, los autores de la invención hicieron uso de la tecnología binaria NanoLuc (NanoBiT®). Brevemente, en este ensayo de indicador de la división, las proteínas diana que interactúan entre sí se fusionan con una de las dos subunidades de luciferasa. Dichas subunidades interactúan solo débilmente entre sí, por lo que el ensamblaje de la luciferasa está impulsado por la afinidad/interacción de las proteínas diana a las que se unen las subunidades de luciferasa. Tras la complementación estructural, se forma una luciferasa activa y brillante (Figura 8). Un enfoque de este tipo permite la cuantificación precisa de la interacción Tau-Syngr3 en condiciones fisiológicas relevantes para el entorno celular.
Los autores de la invención han diseñado varias construcciones que comprenden Tau o Syngr3 (así como p53 como control) fusionadas con la subunidad grande (LgBit) o la subunidad pequeña (SmBit) de luciferasa. Las construcciones se expresaron en células HEK-293T y se determinó la luminiscencia utilizando un lector de placas multimodo estándar. Se detectó una fuerte señal de luminiscencia para la interacción Tau-Syngr3 en contraste con los controles (Figura 9). Estos datos están en línea con los anteriores e ilustran una interacción directa entre Tau y Syngr3.
2.5 Detección de inhibidores de la interacción Tau-Syngr3
Además de la inhibición genética de sinaptogirina-3 utilizando, por ejemplo, ARNhc, gapmeros o efectores Crispr-Cas, el presente documento también describe una detección para encontrar moléculas pequeñas que bloquean la unión o interacción entre sinaptogirina-3 y la proteína Tau.
El enfoque de luciferasa dividida anterior se realiza en 384 pocillos para que sea compatible con una detección de compuestos a gran escala. Los compuestos se seleccionan en base a su capacidad de disminuir la señal de luminiscencia y, por lo tanto, el nivel de interacción Tau-Syngr3. Los compuestos identificados se seleccionan además en función de su selectividad testando la posibilidad de fijar como objetivo proteínas relacionadas, tales como Syngr1.
3. DISCUSIÓN
Se piensa que la disfunción sináptica es una etapa patogénica temprana e importante en la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas asociadas con Tau. Si bien numerosas líneas de evidencia posicionan a Tau como un ejecutor principal de la disfunción sináptica, los mecanismos precisos que subyacen a la patología sináptica inducida por Tau siguen siendo esquivos. Tau puede actuar postsinápticamente, en donde afecta a la organización del receptor de glutamato (Hoover et al. 2010; Ittner et al. 2010), así como presinápticamente, en donde agrupa SVs a través de redes de actina F (Zhou et al. 2017). Aquí, se definió que la unión de Tau a la proteína transmembrana SV Syngr3 media en los defectos inducidos por Tau en la movilidad presináptica de SV, evitando el reclutamiento de SV en la liberación y reduciendo la neurotransmisión. Dado que Syngr3 está presente exclusivamente en las vesículas presinápticas, estos hallazgos presentan a Syngr3 como un nuevo interactuador de Tau implicado en la patogénesis de Tau en la presinapsis. Este trabajo abre nuevas vías para abordar específicamente la función presináptica de Tau tanto para evaluar selectivamente la contribución de esta vía a la progresión de la enfermedad en modelos animales, como para futuros enfoques terapéuticos que fijan como objetivo la disfunción sináptica en la enfermedad de Alzheimer y Tauopatías relacionadas.
El mecanismo de unión de Tau-SV se validó como relevante para la enfermedad al encontrar que las especies patológicas de Tau se asocian con SVs aisladas de cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Se utilizaron ensayos in vitro de la unión de Tau humana recombinante a SVs de ratón aisladas para definir mecánicamente que Tau se une a SVs a través de interacciones proteína-proteína con proteínas SV transmembrana. Utilizando un enfoque de proteómica directa, se identificaron ocho interactuadores SV candidatos, pero solo Syngr3 era transmembrana y específico para el dominio de unión SV N-terminal de Tau. De acuerdo con esto, al probar la interacción genética de los ocho candidatos con Tau en moscas, solo el homólogo de Syngr3 redujo la asociación de Tau con SV in vivo. La identificación de otros interactuadores candidatos puede deberse a interacciones secundarias con otros dominios de Tau y podría tener pequeñas contribuciones a la unión de SV. No obstante, este trabajo encontró que la interacción entre el extremo N de Tau y Syngr3 es el mecanismo predominante por el cual Tau se asocia con las SVs, y la reducción de Syngr3 sola fue suficiente para reducir los déficits presinápticos asociados en las neuronas.
El genoma de mamíferos codifica cuatro Sinaptogirinas, pero solo Syngr1 y Syngr3 son específicas para neuronas y están presentes en las SVs (Belizaire et al. 2004; Kedra et al. 1998). Si bien se ha descrito un papel redundante de Syngr1 y Sinaptofisina en la plasticidad sináptica (Janz et al. 1999), no se conoce función fisiológica alguna de Syngr3. Sin embargo, estudios preliminares de los autores de la invención indican la seguridad potencial de fijar como objetivo a Syngr3: > 95 % de reducción de Sinaptogirina-3 en neuronas de ratón obviamente no afectó el desarrollo de neuronas o sinapsis, y rescató los defectos presinápticos inducidos por Tau sin inducir una toxicidad adicional en los parámetros que midieron. Además, las moscas Drosophila syngrcero KO son viables, sanas y no muestran defectos evidentes en la función presináptica (Stevens et al. 2012). Es importante destacar que, en el modelo de mosca de los autores de la invención, una reducción del 50 % (pérdida de heterocigotos) ya era suficiente para rescatar los defectos funcionales, lo que sugiere que solo una reducción leve de Syngr3 puede ser eficaz para llevar los niveles de unión de Tau-SV por debajo de un umbral patogénico, probablemente porque muchas proteínas SV no esenciales están presentes en un bajo número de copias, es decir, 1-2 por SV (Takamori et al. 2006). Por lo tanto, la inhibición de la interacción Syngr3-Tau puede ser una vía terapéutica relativamente segura a seguir.
Finalmente, varias observaciones hacen que Syngr3 sea interesante como un interactuador Tau potencialmente relevante para la enfermedad. En primer lugar, mientras se expresa en todo el cerebro, la expresión de Syngr3 se enriquece en el hipocampo (Belizaire et al. 2004), una región particularmente vulnerable a la disfunción neuronal en modelos de ratón con enfermedad de Alzheimer y tauopatía (Braak & Braak 1991; Yoshiyama et al. 2007). En segundo lugar, los niveles de Syngr3 son 4 veces más altos en las SVs glutamatérgicas en comparación con las SVs GABAérgicas (Bragina et al. 2010), de acuerdo con un informe reciente que demuestra que la patología temprana de Tau afecta preferentemente a las neuronas excitatorias (Fu et al. 2017). En tercer lugar, Syngr3 también está presente en los exosomas (Gallart-Palau et al. 2016), que se ha propuesto como un mecanismo de transferencia de célula a célula de especies patológicas de Tau que también depende de la sinapsis y la actividad (Calafate et al. 2015; Thompson et al. 2016; Wu et al., 2016). Si bien estas conexiones son solo especulativas, sitúan, no obstante, a Syngr3 como un interactuador interesante y potencialmente relevante de Tau que justifica una investigación adicional. Es importante destacar que se cree que las perturbaciones en la función sináptica asociadas con Tau impulsan la progresión de la enfermedad, pero la contribución del papel presináptico de Tau nunca se ha probado experimentalmente debido a la falta de un enfoque específico. Por lo tanto, la identificación de Syngr3, una proteína SV exclusivamente presináptica, proporciona una nueva forma de evaluar la contribución del papel presináptico de Tau a la disfunción sináptica global, independientemente de otras vías tales como la agregación de Tau o la localización de Tau en postsinapsis.
En resumen, los autores de la invención descubrieron la interacción de Tau con la proteína SV Syngr3 como el mecanismo principal de la unión de Tau a las vesículas presinápticas, una etapa clave que conduce a un agrupamiento excesivo de SV inducido por Tau, lo que da como resultado una movilidad de SV restringida y, en última instancia, una neurotransmisión atenuada. Syngr3 es, por lo tanto, un nuevo culpable en la patogénesis de Tau, lo que abre una nueva vía para la orientación específica de la sinaptotoxicidad de Tau en las fases tempranas de la disfunción sináptica y cognitiva en la enfermedad de Alzheimer y las tauopatías relacionadas.
Tabla S1. Datos de pacientes para muestras de cerebro humano relacionadas con la Figura 5.
Todas las muestras se recogieron del hipocampo post mortem de pacientes de control no dementes (ND) o pacientes diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer (AD) y se fraccionaron bioquímicamente de acuerdo con el esquema representado en la Figura 5A.
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Tabla S2. Conjunto completo de datos de espectrometría de masas de co-IP de TauFL y TauAN con lisado de vesículas sinápticas. Relacionado con la Figura 1. Las proteínas identificadas se compararon con conjuntos de datos anteriores que definían el proteoma de la vesícula sináptica, y las proteínas se clasificaron como proteínas SV transmembrana, proteínas asociadas a SV u otras (contaminantes). Los recuentos espectrales se dan a partir de tres réplicas técnicas.
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de sinaptogirina-3 para uso en el tratamiento o la inhibición de la progresión de un trastorno tauopático o para uso en el tratamiento o inhibición de un síntoma de un trastorno tauopático, en donde el inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido antisentido, un gapmero, un ARNpi, un ARNhc, una nucleasa con dedos de zinc, una meganucleasa, una nucleasa efectora TAL, un efector CRISPR-Cas, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a sinaptogirina-3, un alfacuerpo, un nanocuerpo, un intracuerpo, un aptámero, un DARPin, un aficuerpo, una afitina, una anticalina y un monocuerpo.
2. El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la sinaptogirina-3 es sinaptogirina-3 humana.
3. El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor reduce la expresión de sinaptogirina-3 o bloquea la unión de sinaptogirina-3 a la región N-terminal de la proteína Tau.
4. El inhibidor de sinaptogirina-3 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo, el alfacuerpo, el nanocuerpo, el intracuerpo, el aptámero, la DARPin, el aficuerpo, la afitina, la anticalina o el monocuerpo se une a al menos una región de sinaptogirina-3 expuesta intraneuronalmente.
5. El inhibidor de sinaptogirina-3 para uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la región de sinaptogirina-3 expuesta intraneuronalmente se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y variantes de las mismas. .
6. El inhibidor de sinaptogirina-3 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el trastorno tauopático se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva (PSP), parálisis supranuclear progresiva-parkinsonismo (PSP-P), síndrome de Richardson, enfermedad argiofílica granulosa, degeneración corticobasal, enfermedad de Pick, demencia frontotemporal con parkinsonismo asociado con el cromosoma 17 (FTDP-17), parkinsonismo post-encefalítico, complejo de la enfermedad de Parkinson de Guam, parkinsonismo guadalupeño, enfermedad de Huntington, síndrome de Down, demencia pugilística, demencia británica familiar, demencia danesa familiar, distrofia miotónica, enfermedad de Hallevorden-Spatz, Niemann Pick tipo C, encefalopatía traumática crónica, demencia solo con ovillos, tauopatía de sustancia blanca con inclusiones gliales globulares, panencefalitis esclerosante subaguda, retraso mental relacionado con SLC9A6, enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, degeneración del lóbulo frontotemporal, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, encefalopatía traumática crónica, esclerosis lateral amiotrófica de Guam, esclerosis lateral amiotrófica y complejo parkinsonismo-demencia, angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica y gliosis subcortical progresiva.
7. El inhibidor de sinaptogirina-3 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el síntoma del trastorno tauopático se selecciona del grupo de deterioro cognitivo leve, demencia, deterioro cognitivo, deterioro de la función motora, disfunción oculomotora y bulbar, disfunción sináptica, neurotoxicidad, degeneración neuronal, disfunción neuronal, pérdida de sinapsis y depósito de amiloide.
8. El inhibidor de sinaptogirina-3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la disfunción sináptica es una disfunción presináptica.
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