ES2923018T3 - Métodos de purificación de ARN - Google Patents
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Abstract
Métodos para purificar el ARN de una muestra, que comprenden uno o más pasos de filtración de flujo tangencial, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de flujo continuo con perlas centrales o cualquier combinación de los mismos. Estas técnicas son útiles individualmente, pero muestran una eficacia muy alta cuando se usan en combinación o cuando se realizan en órdenes particulares. Los métodos pueden purificar el ARN de una manera muy eficaz sin comprometer indebidamente la potencia o la estabilidad, para proporcionar composiciones en las que el ARN se elimina sustancialmente de contaminantes. Además, se pueden realizar sin necesidad de disolventes orgánicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de purificación de ARN
SOLICITUD RELACIONADA
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/799.705, presentada el 15 de marzo de 2013.
CAMPO TÉCNICO
Esta invención se encuentra en el campo de la purificación de ARN, y en particular métodos para la purificación y formulación a gran escala de ARN grande a partir de muestras complejas tales como muestras obtenidas tras la transcripción in vitro de ARN, para uso farmacéutico, por ejemplo para su uso en la inmunización de animales.
ANTECEDENTES EN LA TÉCNICA
El ARN está emergiendo como un candidato innovador para una variedad de aplicaciones farmacéuticas, pero la purificación eficiente sigue suponiendo un reto. Esto se debe parcialmente a los diferentes tipos y combinaciones de contaminantes no deseados en una muestra que es necesario separar de una especie de ARN deseada para obtener una muestra de ARN puro. Tales contaminantes son normalmente componentes y subproductos de cualquier proceso anterior, por ejemplo, la fabricación de ARN. Cuando se usa transcripción in vitro para fabricar ARN grande, tras una transcripción exitosa, la muestra contiene normalmente las especies de a Rn deseadas junto con diversos contaminantes tales como especies de ARN no deseadas, proteínas, ADN o fragmentos del mismo, pirofosfatos y nucleótidos libres.
Las aplicaciones comerciales posteriores (por ejemplo, formulación y uso como composición farmacéutica y/o vacuna) plantean restricciones adicionales en cualquier método de purificación para ARN grande que requiera (i) un alto grado de pureza al tiempo que se conserva la estabilidad y funcionalidad del ARN; (ii) compatibilidad con cualquier requisito de formulación del ARN para la administración in vivo; y (iii) cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación. Además, con el fin de facilitar las aplicaciones industriales, cualquier método de purificación de ARN debe permitir una operación constante, eficiente en cuanto al coste y el tiempo (por ejemplo, purificación rápida, fácil, reproducible y de alto rendimiento a gran escala).
En la técnica se conocen métodos para la purificación de ARN grande. Pascolo etal. (2006) describen un método para la purificación de mRNA a partir de una muestra de reacción de transcripción in vitro a escala analítica (purificación de 25 gg de ARN en 20 gl de volumen de muestra). El método implica tratamiento con ADNasa seguido por precipitación del ARNm más largo con cloruro de litio. Sin embargo, los autores notifican que este método no proporciona ARN de alta pureza, ya que no elimina por completo contaminantes tales como ADN y proteína. Además, el método implica el uso de disolventes orgánicos y es laborioso y requiere mucho tiempo, ya que implica hasta 36 etapas que requieren manipulación manual extensa de la muestra en diferentes condiciones, incluida al menos una etapa de incubación durante la noche. Por tanto, aunque este procedimiento puede satisfacer los requisitos de purificación de ARN a escala de investigación y laboratorio, adolece de un bajo grado de pureza y reproducibilidad del ARN y no es adecuado para la purificación de ARN de calidad farmacéutica a escala comercial para su implementación en un proceso industrial.
El documento WO2008/077592 da a conocer un método para purificar ARN grande a escala preparativa con HPLC de fase inversa de apareamiento iónico usando una fase estacionaria inversa porosa. Se notifica que una ventaja particular del uso de la fase estacionaria porosa especificada es que pueden evitarse presiones excesivamente altas, lo que facilita una purificación preparativa del ARN. Sin embargo, el método implica el uso de disolventes orgánicos fuertes (por ejemplo, acetonitrilo) y altas temperaturas (78 °C) para la columna de separación, y una temperatura baja (12 °C) para el muestreador. No se ejemplifica la naturaleza del/de los contaminante(s) que puede(n) separarse con éxito de un ARN deseado usando el método, incluido cualquier requisito para etapas anteriores tales como el tratamiento con ADNasa. Adicionalmente, la separación cromatográfica de ARN basada en HPLC de fase inversa de apareamiento iónico o resina de intercambio iónico se basa en la carga total de la molécula y puede ser eficaz para la purificación de moléculas de ARN de hasta aproximadamente 4.000-5.000 bases. Sin embargo, la purificación de moléculas de ARN más grandes adolece de efectos de exclusión molecular y una mala recuperación. Además, se basa en la elución del ARN usando disolventes orgánicos, pero estos deben evitarse idealmente debido a posibles preocupaciones de seguridad sobre los residuos, los altos costes de compra, su impacto ambiental y los posibles efectos perjudiciales sobre la estabilidad y potencia del ARN.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos de purificación de ARN mejorados y adicionales, y en particular de aquellos que permitan una purificación eficiente en cuanto al coste y el tiempo de ARN grandes a escala industrial con alto rendimiento y pureza de calidad farmacéutica, al tiempo que se mantiene la estabilidad, potencia biológica y funcionalidad del ARN. Existe la necesidad particular de tales métodos cuando la muestra de partida es una muestra
biológica compleja, tales como las que se obtienen después de la transcripción in vitro de ARN grande.
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
Para abordar estas necesidades, la invención proporciona un método para purificar ARN a partir de una muestra, que comprende cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo. Este método puede purificar ARN de una manera altamente eficaz sin comprometer indebidamente la potencia o estabilidad, para proporcionar composiciones en las que el ARN se aclara sustancialmente de contaminantes. Además, puede realizarse sin la necesidad de disolventes orgánicos, y se prefiere que los métodos de la invención tengan lugar en condiciones acuosas. Una ventaja adicional de la invención es que usa componentes que son esencialmente desechables, lo que significa que pueden prepararse en una forma completamente limpia (en particular, forma libre de ARNasa), usarse solo una vez y luego desecharse, de modo que puede evitarse la contaminación de ejecución a ejecución arrastrada, lo que es particularmente útil cuando se evita la contaminación por ARNasa. Los métodos son también muy rápidos.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, las etapas mencionadas para la purificación de ARN pueden ir seguidas por una o más etapas de intercambio de tampón que comprenden, por ejemplo, filtración de flujo tangencial.
Por tanto, la invención proporciona un método para la purificación y formulación de ARN a partir de una muestra, en el que el método comprende una o más etapas de purificación de ARN y una o más etapas de intercambio de tampón. En una realización preferida, se usa un primer tampón en la etapa de cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo. Preferiblemente, el primer tampón es un tampón de purificación, más preferiblemente, el tampón de purificación comprende una sal, tal como cloruro de potasio o cloruro de sodio. Lo más preferiblemente, el tampón de purificación comprende cloruro de potasio a una concentración de entre 100-500 mM, por ejemplo, 250 mM.
Por ejemplo, el tampón de purificación puede comprender cloruro de potasio a una concentración de entre 0-500 mM, tal como aproximadamente 50 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 450 mM, aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 300 mM o desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 250 mM, etc.
Por ejemplo, pueden añadirse cloruro de sodio y/o cloruro de potasio a la muestra que contiene ARN a una concentración final de entre 0-500 mM, tal como aproximadamente 50 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 450 mM, aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 300 mM o desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 250 mM, etc.
Pueden añadirse cloruro de sodio y/o cloruro de potasio a la muestra que contiene ARN a una concentración final de entre 0-500 mM, tal como aproximadamente 50 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 450 mM, aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 300 mM, desde aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 250 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 300 mM o desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 250 mM, etc.
La invención también proporciona un método para purificar ARN a partir de una muestra (tal como el producto de una reacción de transcripción in vitro), en el que el ARN se purifica hasta al menos el 99 % de pureza (por ejemplo, >99,5 %,
>99,9% o incluso >99,95 %) en menos de 12 horas (por ejemplo <8 horas, <6 horas, <4 horas o <2 horas).
En los métodos de la invención, las etapas implicarán generalmente desechar materiales que no contienen ARN (o que no contienen la especie de ARN deseada) al tiempo que se mantienen materiales que contienen ARN (o la especie de ARN deseada). Por tanto, cuando una técnica divide un material de partida en fracciones, se retendrán las fracciones deseadas al tiempo que pueden desecharse las fracciones no deseadas; de manera similar, si una técnica retiene materiales no deseados, pero deja que el ARN deseado fluya de manera continua, se retendrá la fracción no retenida.
El ARN
Según la invención, se purifica un ARN deseado a partir de una muestra que contiene ARN. El ARN deseado de la invención puede ser bicatenario, pero es preferiblemente monocatenario. Cuando el ARN es monocatenario, tal como ARNm o un replicón de ARN autorreplicante, normalmente codifica una o más proteínas, y al menos una de estas es útil como imunógeno tal como se comenta a continuación, pero puede ser también cualquier proteína profiláctica o terapéutica no inmunogénica de interés (por ejemplo, como componente de un medicamento de terapia génica). El ARN deseado de la invención puede ser circular, pero es preferiblemente lineal.
El ARN puede ser de cadena (-), pero es preferiblemente de cadena (+), de manera que puede traducirse por las células sin necesidad de ninguna etapa de replicación intermedia, tal como transcripción inversa. Los ARN de cadena preferidos son autorreplicantes, tal como se describe a continuación. Preferiblemente, el ARN no es un ARN viral natural.
El ARN puede ser ARN pequeño, medio o grande. El número de nucleótidos por hebra de un ARN pequeño es de desde 10-30 (por ejemplo, ARNip).
Cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo
Según la invención, puede purificarse ARN usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo. Por tanto, un método de la invención puede comprender una o más etapas de cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo. Los inventores han encontrado que esta técnica permite un proceso de purificación rápido, a escala industrial para obtener ARN puro con alto rendimiento, y es particularmente ventajosa para eliminar contaminantes proteicos de una especie de a Rn deseada, por ejemplo en una muestra de reacción de IVT. Los inventores han mostrado que pueden purificarse especies de ARN muy grandes que comprenden más de 3 megadaltons usando este método. Hasta donde mejor conocen los inventores, no existe ningún método de la técnica anterior que permita la purificación de tales especies de ARN grandes, en particular después de la IVT, usando cromatografía de perlas de núcleo o cualquier otro método. Sin embargo, este método no está limitado a la purificación de moléculas de ARN grandes, y pueden purificarse moléculas de ARN de cualquier tamaño (por ejemplo, ARN medios) con este método siempre que se seleccione el tamaño de poro de perla adecuado, tal como se describe a continuación.
Puede realizarse cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo usando un formato discontinuo o un formato de columna. Se prefiere un formato de columna. La columna comprende la fase estacionaria. El formato de columna puede incluir aplicar una muestra que contiene ARN a la columna, recoger la fracción no retenida y opcionalmente hacer pasar tampón de elución a través de la columna, y recoger los eluatos deseados o fracciones de los mismos. El método puede comprender etapas adicionales tales como etapas de lavado, por ejemplo, después de aplicar la muestra a la columna, se añade habitualmente un tampón de “persecución” a la columna. En la técnica se conocen configuraciones de cromatografía adecuadas, por ejemplo sistemas de cromatografía de líquidos tales como los sistemas de cromatografía de líquidos AKTA de GE Healthcare.
Después de aplicar la muestra que contiene ARN a la columna, su contenido puede desplazarse a través de la columna por la fuerza de la gravedad sola o puede aplicarse presión externa para aumentar la velocidad de su paso. Tras la aplicación de la muestra que contiene ARN a la columna, también puede administrarse un tampón a la columna, normalmente denominado “tampón de persecución” en la técnica, y hacerse pasar a través de la columna usando la fuerza de la gravedad sola o aplicando presión externa con el fin de aumentar la velocidad a la que los componentes de la muestra pasan a través de la columna. La velocidad de flujo puede establecerse como velocidad de flujo volumétrico (volumen de la fase móvil, por ejemplo, muestra y/o tampón de persecución, que pasa a través de la columna por tiempo unitario) o velocidad de flujo lineal (distancia del frente de fase móvil recorrida por tiempo unitario). En la técnica se conocen métodos para calcular la velocidad de flujo y convertirla de velocidad de flujo lineal a volumétrico.
Según la invención, el medio de cromatografía está compuesto por perlas que se componen de un material poroso (matriz), habitualmente formado a partir de un polímero. La matriz comprende al menos dos capas, por ejemplo una capa interna (núcleo) rodeada por una capa externa (corteza), pero la matriz también puede comprender una o más capas adicionales (intermedias) entre la capa interna y la capa externa.
Cada capa de la matriz puede funcionalizarse con al menos un ligando, o puede no funcionalizarse. Normalmente, las capas pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia de al menos un ligando.
Por ejemplo, el núcleo puede funcionalizarse con N ligandos diferentes, mientras que la corteza se funcionaliza con no más de N-1 de estos ligandos. N puede ser cualquier número entero positivo, por ejemplo 1. Por ejemplo, el núcleo puede funcionalizarse con un ligando mientras que la corteza se funcionaliza con uno o más ligandos diferentes, o puede no funcionalizarse con ningún ligando. En una realización preferida, el núcleo se funcionaliza con un ligando, mientras que la corteza no se funcionaliza con ningún ligando.
Preferiblemente, al menos un ligando es un ligando que tiene múltiples funcionalidades, por ejemplo, el ligando tanto es hidrófobo como está cargado positivamente. Por ejemplo, el ligando puede ser una mono-alquil (C1-C8)-amina, por ejemplo, el ligando puede ser octilamina (CH3(CH2)7NH2).
Por tanto, en una realización preferida de la invención, el núcleo se funcionaliza con un ligando, en el que el ligando tiene múltiples funcionalidades, por ejemplo, el ligando tanto es hidrófobo como está cargado positivamente, por ejemplo, el ligando puede ser una mono-alquil (C1-C8)-amina, por ejemplo, el ligando puede ser octilamina, y la carcasa no se funcionaliza con ningún ligando.
La matriz tiene un tamaño de poro definido y, de ese modo, impide que una proporción de moléculas entre en el núcleo basándose en el tamaño de las moléculas, que se recogen en la fracción no retenida de la columna (modo de flujo continuo). Las moléculas que son capaces de pasar a través de la matriz entran en el núcleo, donde pueden retenerse, normalmente al unirse a un ligando. Las moléculas retenidas pueden eluirse de las perlas usando un eluyente adecuado (modo de unir-eluir). Normalmente, el eluyente es una disolución que comprende hidróxido de sodio (NaOH) y un disolvente.
Los parámetros de la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo se seleccionarán de manera que pueda recuperarse selectivamente un ARN deseado a partir de una o más fracciones no retenidas, sin afectar significativamente a la integridad y/o potencia del ARN.
Preferiblemente, la matriz es una matriz porosa, por ejemplo agarosa, preferiblemente una agarosa altamente reticulada.
El tamaño de poro de la matriz se establece habitualmente en kDa y se refiere a la masa molecular promedio de la partícula más pequeña que es probable que rechace la matriz (también denominado MWCO). Alternativamente, el tamaño de poro de la matriz puede establecerse en gm y se refiere al diámetro de la partícula más pequeña que es probable que rechace la matriz, tal como se describió anteriormente para TFF. El tamaño de poro se selecciona de modo que el corte esté por debajo del tamaño del ARN pero por encima del tamaño de la proteína. Usando este método, pueden purificarse especies de ARN que SON más grandes que el corte molecular de las perlas. Más preferiblemente, la especie de ARN deseada es la molécula más grande en la muestra que va a purificarse. Por tanto, según esta invención, se recupera ARN de una o más de las fracciones no retenidas.
Los inventores han encontrado que, para la purificación de ARN grandes, es útil un tamaño de poro/MWCO de al menos 250 kDa, por ejemplo, al menos 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 600 kDa o al menos 700 kDa, etc. Se prefiere particularmente un corte de peso molecular de al menos aproximadamente 700 kDa. Generalmente, el MWCO se selecciona de manera que la razón del peso molecular de la molécula de ARN de interés con respecto al MWCO es de al menos 1,5:1 (por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1 o al menos 6:1) y/o de manera que la razón del peso molecular de la impureza más grande distinta de ARN con respecto al MWCO es de al menos 1:1,5 (por ejemplo, al menos 1:2, al menos 1:3, al menos 1:4, al menos 1:5 o al menos 1:6).
El diámetro promedio (tamaño de partícula) de las perlas se seleccionará de modo que permita una purificación de ARN eficaz con un tiempo de operación mínimo sin afectar significativamente a la integridad y/o potencia del ARN debido a las presiones excesivas requeridas para el rendimiento. Partículas más grandes y poros más grandes permiten el uso de menores presiones, pero la eficiencia de separación puede reducirse. Los inventores han encontrado que es preferible un tamaño de partícula de aproximadamente 50-100 gm, siendo más preferible un tamaño de partícula de aproximadamente 60-90 gm y siendo incluso más preferible un tamaño de partícula de aproximadamente 70-80 gm. Un tamaño de partícula de aproximadamente 85 gm es el más preferido.
Un medio de cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo a modo de ejemplo son las perlas Capto™ Core 700 de GE Healthcare.
Se recupera selectivamente ARN de la columna en la fracción no retenida. Se retienen proteínas y ácidos nucleicos cortos en las perlas. Pueden identificarse fracciones no retenidas que contienen ARN midiendo la absorción UV a 260 nm. La composición que comprende el ARN de interés recogida en la fracción no retenida está altamente
purificada en relación con la preparación antes de la etapa de cromatografía de perlas de núcleo. Pueden combinarse múltiples fracciones eluidas que contienen el ARN de interés antes del tratamiento adicional.
Puede añadirse una cantidad de una sal a la muestra que contiene ARN antes de que la muestra se haga pasar a través de la columna. Los inventores han encontrado que esto es particularmente ventajoso para la eliminación de las impurezas proteicas. Puede usarse cualquier sal adecuada a una concentración adecuada, por ejemplo a entre aproximadamente 150 mM y 500 mM.
Por ejemplo, puede añadirse una sal a la muestra que contiene ARN a una concentración final de entre 0-500 mM, tal como aproximadamente 50 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 125 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 450 mM, aproximadamente 500 mM, aproximadamente 600 mM, aproximadamente 700 mM, aproximadamente 750 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 550 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 550 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 550 mM, desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 500 mM, desde aproximadamente 150 mM hasta aproximadamente 400 mM, etc.
Los inventores han encontrado que una concentración de sal de entre aproximadamente 125 mM y 250 mM es particularmente ventajosa, dando como resultado una purificación de ARN con un alto rendimiento de ARN y una eliminación eficaz de proteínas. Alternativamente, cuando se requiere un alto rendimiento de ARN más que la eliminación de impurezas proteicas, por ejemplo, cuando se usa una muestra que está sustancialmente libre de proteína, puede usarse una concentración de sal de no más de 250 mM, o preferiblemente no más de 125 mM. Cuando se requiere un alto rendimiento de ARN y/o una alta eficiencia de eliminación de nucleótidos más que la eliminación de impurezas proteicas, por ejemplo, cuando se usa una muestra que está sustancialmente libre de proteína, pero contiene grandes cantidades de nucleótidos libres, se añade una concentración de no más de 250 mM, preferiblemente no más de 125 mM y lo más preferiblemente no se añade sal.
Una sal adecuada es normalmente una sal que minimiza los niveles de precipitación de ARN en comparación con sales menos preferidas cuando se usan a la misma concentración y pH. Los inventores han encontrado que, normalmente, son particularmente adecuados fosfato de potasio y/o cloruro de potasio, y se prefieren sobre fosfato de sodio y cloruro de sodio, porque las sales de potasio minimizan ventajosamente los niveles de precipitación de ARN en comparación con las sales de sodio cuando se usan a la misma concentración y pH. Generalmente, los inventores han encontrado que se prefiere el uso de cationes con cosmotropicidad creciente.
La muestra que contiene ARN puede diluirse antes de que la muestra se haga pasar a través de la columna. Por ejemplo, la muestra puede diluirse con un volumen de diluyente que corresponde a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 2 veces o aproximadamente 1 vez el volumen de la muestra. Una dilución de 1 vez significa que se añade a la muestra un volumen de un diluyente que es igual al volumen de la muestra. Puede usarse cualquier diluyente adecuado y será normalmente un tampón. Un diluyente adecuado es uno que no interfiere con ninguna etapa de purificación o intercambio de tampón posterior. Por ejemplo, el diluyente puede ser un tampón que es el mismo que el tampón de la muestra que contiene ARN (por ejemplo Tris 50 mM, pH 8,0).
La velocidad de flujo puede variarse para lograr una recuperación de ARN y/o eliminación de proteínas mejoradas. Una velocidad de flujo lineal de entre 200 y 500 cm/h es ventajosa cuando se desea una alta recuperación de ARN. Una velocidad de flujo de entre 50 y 300 cm/h es ventajosa cuando se desea un alto nivel de eliminación de proteínas. Normalmente, se usa una velocidad de flujo de entre 250 y 300 cm/h, preferiblemente de aproximadamente 275 cm/h para una recuperación y eliminación de proteínas optimizadas.
La adición de una sal, la dilución de la muestra y la variación de la velocidad de flujo, tal como se describió anteriormente, pueden combinarse de manera útil. Por ejemplo, puede diluirse la muestra que contiene ARN y puede añadirse una cantidad de una sal a la muestra antes de que la muestra se haga pasar a través de la columna. Un método particularmente ventajoso para la purificación de ARN grande con alta pureza, rendimiento y tiempos de operación cortos es uno en el que la muestra se diluye 4 veces antes de aplicar la muestra a la columna, la cromatografía se realiza a una velocidad de flujo lineal de 275 cm/h y se añade sal a la muestra y/o tampón de persecución a 250 mM (por ejemplo KCl o NaCl).
Cuando se usa cromatografía de perlas de núcleo según la invención, es particularmente útil para eliminar contaminantes proteicos de un ARN de interés. Se logran resultados particularmente buenos cuando la muestra que
contiene ARN que se aplica a la columna de cromatografía en una sola ejecución de purificación contiene no más de 5-15 mg de proteína total por ml de fase estacionaria (es decir, perlas de núcleo), por ejemplo, no más de 10 mg/ml o no más de 13 mg/ml. Estos valores son particularmente relevantes cuando la proteína total se compone de proteínas que son normalmente componentes de una reacción de transcripción in vitro, tal como polimerasa de T7, enzima de formación de caperuza, inhibidor de ARNasa y pirofosfatasa.
Cuando se realiza purificación a gran escala, pueden conectarse columnas de cromatografía entre si en serie para lograr una capacidad aumentada.
Los inventores han encontrado también que pueden lograrse niveles incluso superiores de pureza (por ejemplo, eliminando más eficazmente nucleótidos libres que quedan de la IVT) cuando una etapa de cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo va seguida por una etapa de TFF. La etapa de TFF puede usarse para realizar simultáneamente la purificación de ARN, en particular la eliminación de nucleótidos, y el intercambio de tampón usando un tampón de formulación durante el proceso de purificación/intercambio de tampón. El tampón de formulación es diferente del tampón de purificación usado en cualquier etapa anterior.
Características del aparato
Una ventaja de la invención es que usa componentes que son desechables. Por tanto, un método de la invención puede incluir una etapa en la que parte o todo el aparato en el que se realiza el método se desecha después de realizarse el método. Por ejemplo, puede desecharse cualquier columna de TFF, soporte de hidroxiapatita y/o columna de flujo continuo de perlas de núcleo, al igual que cualquier tubo y conector que se use para conectarlos. Estos componentes pueden desecharse como residuos biopeligrosos.
Por tanto, los métodos de la invención pueden usar componentes de aparatos desechables. Además, los métodos de la invención, en general, usarán componentes de aparatos que pueden descontaminarse fácilmente de ARNasa. Este requisito puede verse reflejado en los materiales, la forma, la configuración y las dimensiones de los componentes.
Métodos rápidos
Tal como se mencionó anteriormente, la invención proporciona un método para purificar ARN de una muestra, en el que el ARN se purifica hasta al menos el 99 % de pureza en menos de 12 horas.
De manera similar, la invención proporciona un método para purificar ARN a partir de una muestra que contiene ARN, ADN, pirofosfatos y nucleótidos libres (como precursores de ARN sin reaccionar y/o como producto de degradación de ARN o ADN), en el que el método proporciona material final en menos de 12 horas que está libre de ADN, pirofosfatos y nucleótidos libres.
La muestra que contiene ARN puede ser el producto de una reacción de IVT, y de ese modo contendrá los contaminantes típicos de la IVT comentados anteriormente.
El ARN puede prepararse hasta una alta pureza, por ejemplo >99,5 %, >99,9 % o incluso >99,95 %. Por tanto, al menos el 99 % o más de los componentes en el material purificado (distintos de agua y sales de tampón) son un ARN de interés.
El método puede completarse, para proporcionar el ARN purificado, en menos de 12 horas por ejemplo <8 horas, <6 horas, <4 horas o <2 horas.
El método puede usar cualquiera de las etapas (y combinaciones de las mismas) dadas a conocer en otra parte en el presente documento. El método se realiza idealmente usando condiciones acuosas en todo momento.
Composiciones farmacéuticas
El ARN purificado según esta invención es útil como componente en composiciones farmacéuticas, por ejemplo para su uso como vacuna en la inmunización de sujetos contra diversas enfermedades. Estas composiciones incluirán normalmente ARN y un portador farmacéuticamente aceptable. Está disponible una discusión detallada de portadores farmacéuticamente aceptables en Gennaro et al. Una composición farmacéutica de la invención puede incluir también uno o más componentes adicionales tales como inmunopotenciadores de molécula pequeña (por ejemplo, agonistas de TLR). Una composición farmacéutica de la invención puede incluir también un sistema de administración para el ARN, por ejemplo, un liposoma, una emulsión de aceite en agua o una micropartícula.
Una composición farmacéutica de la invención está de manera preferible sustancialmente libre de contaminantes que resultan de la fabricación y purificación de ARN. Cuando se usa IVT, tales contaminantes pueden incluir proteínas, por ejemplo, enzimas tales como polimerasa, en particular polimerasa de T7, y enzimas de formación de caperuza,
nucleótidos libres, y ADN de molde y/o fragmentos del mismo.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir el ARN en agua corriente (por ejemplo, agua para inyección) o en un tampón de formulación final, por ejemplo, un tampón fosfato, un tampón Tris, un tampón borato, un tampón succinato, un tampón histidina o un tampón citrato. Se incluirán normalmente sales de tampón en el intervalo de 5-20 mM.
Las composiciones de la invención pueden incluir quelantes de iones metálicos. Estos pueden prolongar la estabilidad del ARN eliminando iones que pueden acelerar la hidrólisis del fosfodiéster. Por tanto, una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc. Tales quelantes están normalmente presentes a entre 10 500 gM por ejemplo 0,1 mM. Una sal de citrato, tal como citrato de sodio, puede actuar también como quelante, al tiempo que proporciona también ventajosamente actividad tamponante.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para proporcionar tonicidad. Una concentración de 10±2 mg/ml de NaCl es típica, por ejemplo aproximadamente 9 mg/ml.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener un pH de entre 5,0 y 9,5, por ejemplo de entre 6,0 y 8,0.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservantes, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefieren composiciones libres de mercurio, y pueden prepararse vacunas libres de conservantes. Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferiblemente estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferiblemente apirógenas, conteniendo por ejemplo <1 UE (unidad de endotoxina, una medida convencional) por dosis, y preferiblemente <0,1 UE por dosis.
Las composiciones farmacéuticas de la invención están preferiblemente libres de gluten.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en forma de dosis unitaria. En algunas realizaciones, una dosis unitaria puede tener un volumen de entre 0,1-1,0 ml, por ejemplo, aproximadamente 0,5 ml.
Las composiciones pueden prepararse como inyectables, como o bien disoluciones o bien suspensiones. La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, mediante un inhalador, usando una pulverización fina. La composición puede prepararse para administración nasal, auricular u ocular, por ejemplo, como una pulverización o gotas. Son típicos inyectables para administración intramuscular.
Cuando una composición incluye un sistema de administración, este será habitualmente un liposoma (por ejemplo, véanse los documentos WO2012/006376, WO2012/030901, WO2012/031043, WO2012/031046 y WO2013/006825), una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, véanse los documentos WO2012/006380, WO2013/006834 y WO2013/006837) o una micropartícula (por ejemplo, véase el documento WO2012/006359). Un procedimiento de la invención puede incluir una etapa adicional de combinar una molécula de ARN purificado con un sistema de administración. De manera similar, la invención proporciona un método para preparar una composición farmacéutica, que comprende las etapas de: purificar un ARN usando un método de la invención; y combinar el ARN purificado con un sistema de administración, por ejemplo, con un liposoma o con una emulsión de aceite en agua.
Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de ARN, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por ‘cantidad inmunológicamente eficaz’, quiere decirse que la administración de esa cantidad a un individuo, o bien en una sola dosis o bien como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que va a tratarse, la edad, el grupo taxonómico del individuo que va a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación por el médico encargado de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad estará en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos de rutina. El contenido de ARN de las composiciones de la invención se expresará generalmente en cuanto a la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene <100 gg de ARN (por ejemplo, desde 10-100 gg, tal como aproximadamente 101 gg, 25 gg, 50 gg, 75 gg o 100 gg), pero puede observarse expresión a niveles mucho más bajos, por ejemplo, <1 gg/dosis, <100 ng/dosis, <10 ng/dosis, <1 ng/dosis, etc.
La invención también proporciona un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo puede usarse para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
Métodos de tratamiento y usos médicos
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse in vivo para provocar una respuesta inmunitaria contra un inmunógeno de interés.
Por tanto, la invención proporciona un método para generar una respuesta inmunitaria en un vertebrado que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la invención. La respuesta inmunitaria es preferiblemente protectora y preferiblemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El método puede generar una respuesta de refuerzo.
La invención también proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para generar una respuesta inmunitaria en un vertebrado.
La invención también proporciona el uso de una composición farmacéutica de la invención en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un vertebrado.
Al generar una respuesta inmunitaria en el vertebrado mediante estos usos y métodos, el vertebrado puede protegerse contra diversas enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, contra enfermedades bacterianas y/o virales tal como se comentó anteriormente. Las composiciones son inmunogénicas y más preferiblemente son composiciones de vacuna. Las vacunas según la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o bien terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas.
El vertebrado es preferiblemente un mamífero, tal como un ser humano o un mamífero veterinario grande (por ejemplo, caballos, ganado, venados, cabras, cerdos). Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferiblemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas según la invención pueden usarse para tratar tanto a niños como a adultos. Así, un paciente humano puede tener menos de 1 año de edad, menos de 5 años, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años o al menos 55 años. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años, >60 años y preferiblemente >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <5 años), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, personal militar y de las fuerzas armadas, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden usarse de manera más general en una población.
Las composiciones de la invención se administrarán generalmente a un paciente directamente. La administración directa puede lograrse mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica o al espacio intersticial de un tejido). Las vías alternativas de administración incluyen administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverización), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, auricular, pulmonar u otra mucosa. La administración intradérmica e intramuscular son dos vías preferidas. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente puede usarse una inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.
La invención puede usarse para generar inmunidad sistémica y/o mucosa, preferiblemente para generar una inmunidad sistémica y/o mucosa mejoradas.
La dosificación puede ser mediante un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de múltiples dosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, una sensibilización parenteral y un refuerzo mucoso, una sensibilización mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Normalmente, se administrarán múltiples dosis con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una realización, pueden administrarse múltiples dosis aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo a una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, tal como se usa a menudo en el Programa Ampliado de inmunizaciones (“PAI”) de la Organización Mundial de la Salud. En una realización alternativa, se administran dos dosis principales con aproximadamente dos meses de diferencia, por ejemplo aproximadamente 7, 8 o 9 semanas de diferencia, seguidas por una o más dosis de refuerzo de aproximadamente 6 meses a 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una realización adicional, se administran tres dosis primarias con aproximadamente dos meses de diferencia, por ejemplo aproximadamente 7, 8 o 9 semanas de diferencia, seguidas por una o más dosis de refuerzo de aproximadamente 6 meses a 1 año después de la tercera
dosis principal, por ejemplo aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses después de la tercera dosis primaria.
General
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. T ales técnicas se explican completamente en la bibliografía.
El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x±10 %.
La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.
Las referencias a carga, cationes, aniones, zwitteriones, etc., se toman a pH 7.
El término “rendimiento” en el contexto de esta invención representa la fracción de ARN contenida en la muestra después de la purificación en comparación con antes de la purificación. Normalmente, el rendimiento se expresa como % de rendimiento, calculado según la fórmula: [(cantidad de ARN tras la purificación/cantidad de ARN antes de la purificación) x 100]. Las cantidades de ARN en una muestra pueden medirse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando un tinte fluorescente específico de ARN tal como RiboGreen®.
El término “purificación” o “purificar” significa que un ARN deseado en una muestra se separa de los componentes no deseados. Por tanto, “purificación de ARN” se refiere a métodos para purificar un ARN de interés a partir de una composición que comprende el ARN de interés e impurezas. Por tanto, después de la purificación, el ARN está presente en una forma más pura que antes de la purificación. Esto significa que están presentes componentes no deseados en cantidades inferiores en relación con la cantidad de ARN deseado que antes de la purificación. Los constituyentes no deseados de muestras que contienen ARN que puede ser necesario separar del ARN deseado pueden incluir ADN, monofosfatos de desoxinucleósidos, trifosfatos de ribonucleósidos, especies de ARN no deseadas (por ejemplo, ARN que es más largo/más corto que un tamaño de ARN deseado o está fuera del intervalo de tamaño de ARN deseado o ARN bicatenario frente a a Rn monocatenario), desoxioligonucleótidos, proteínas (en particular, enzimas tales como ARN polimerasas, por ejemplo, polimerasa de T7, enzima de formación de caperuza de ARNm, pirofosfatasa, ADNasa, inhibidores de ARNasa), etc.
Las palabras “potencia” o “funcionalidad” describen la función biológica prevista de la molécula de ARN y el nivel al que se retiene esa función después de la purificación en comparación con antes de la purificación del ARN. Por ejemplo, si la potencia del ARN permanece sin cambios después de la purificación, entonces el grado de una función biológica particular del ARN no ha cambiado, por ejemplo, tal como se mide mediante el nivel de expresión in vivo de cualquier proteína codificada en relación con una cierta cantidad de ARN de entrada.
La palabra “estabilidad” se refiere al grado en que una molécula de ARN retiene su integridad estructural y resiste la degradación durante manipulaciones físicas o químicas. Por ejemplo, si la estabilidad del ARN permanece sin cambios después de la purificación, entonces el nivel de integridad estructural no ha cambiado, por ejemplo, medido analizando el tamaño promedio del ARN o la distribución del tamaño del ARN.
Los términos “preparativo”, “gran escala”, “escala comercial” y “escala industrial” en relación con un método de purificación de ARN significan que pueden purificarse grandes cantidades de ARN hasta una pureza de al menos el 90 %. Estas grandes cantidades son, por ejemplo, al menos 0,5 mg, 1 mg, 2,5 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg, 500 mg, o incluso al menos 1000 mg utilizando el método de la invención.
El término “fase estacionaria” se refiere a la fase no móvil contenida en un lecho cromatográfico.
El término “tamaño de partícula” se refiere al diámetro promedio de una partícula de fase estacionaria.
El término “tamaño de poro” se refiere al tamaño promedio de la partícula más pequeña que rechazará una fase estacionaria o que retendrá una membrana en el lado de la muestra. El tamaño se expresa normalmente en diámetro de partícula o masa molecular.
El término “gradiente de elución” significa que la composición del eluyente varía a lo largo de todo el proceso de elución de manera continua o por etapas. En cambio, la “elución isocrática” procede usando una composición de eluyente fija a lo largo de todo el proceso de elución.
Una “etapa” es diferente de otra etapa de purificación de ARN o intercambio de tampón cuando las etapas usan métodos diferentes (por ejemplo, filtración de flujo tangencial frente a cromatografía de hidroxiapatita) o cuando las etapas usan el mismo método, pero se realizan en diferentes condiciones (por ejemplo, usando un tampón diferente, una membrana diferente o una fase estacionaria diferente).
Cuando una segunda etapa se realiza “después de” o “tras” otra primera etapa, la segunda etapa puede realizarse inmediatamente después de la primera etapa anterior en el método, es decir, no se realiza ninguna otra etapa entre la primera etapa y la segunda etapa, aparte de etapas tales como dilución o almacenamiento que pueden tener lugar entre las dos etapas. Alternativamente, pueden realizarse otra(s) etapa(s) entre las etapas primera y segunda.
Cuando una primera etapa se realiza “antes de” o “precediendo” a otra segunda etapa, la primera etapa puede realizarse inmediatamente antes de la etapa posterior en el método, es decir, no se realizan otras etapas entre la primera etapa y la segunda etapa, aparte de etapas tales como dilución o almacenamiento que pueden tener lugar entre las dos etapas. Alternativamente, pueden realizarse otra(s) etapa(s) entre las etapas primera y segunda.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra el resultado de la purificación de ARN usando filtración de flujo tangencial y cromatografía de hidroxiapatita: muestra de reacción de transcripción in vitro - eliminación de proteína - muestra de reacción de transcripción in vitro antes de la purificación (carril 1), después de la filtración de flujo tangencial (carril 2), después de la cromatografía de hidroxiapatita (carril 3), después de la filtración de flujo tangencial (carril 4).
Las figuras 2A-2B muestran el resultado de la purificación de ARN usando cromatografía de hidroxiapatita. La figura 2A ilustra la serie de iones de Hofmeister en orden de su capacidad para precipitar con sales proteínas. La figura 2B muestra el análisis de dispersión de luz dinámica del tamaño de partícula de los agregados de ARN en diversos tampones de elución - eje x: concentración de sal en mM; eje y: radio de partícula en nm.
La figura 3A muestra el resultado de la purificación de ARN usando filtración de flujo tangencial y cromatografía de hidroxiapatita: muestra de reacción de transcripción in vitro - eliminación de proteínas - muestra de reacción de transcripción in vitro antes de la purificación (carril 1), después de la purificación de flujo tangencial (carril 2), después de la cromatografía de hidroxiapatita (carril 3). La figura 3B muestra el resultado de la purificación de ARN usando filtración de flujo tangencial y cromatografía de hidroxiapatita: muestra de reacción de transcripción in vitro -eliminación de ADN - ADN por mg de ARN presente en una muestra de reacción de transcripción in vitro antes de la purificación (primer punto de datos desde la izquierda), después de la filtración de flujo tangencial (segundo punto de datos), después de la cromatografía de hidroxiapatita (tercer punto de datos).
Las figuras 4A-4B muestran el resultado de la purificación de ARN usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo: muestra de reacción de transcripción in vitro - eliminación de proteínas - muestra de transcripción in vitro antes de la purificación (carril 1), fracción no retenida después de la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo (carril 2), eluato después de la limpieza de la columna en el sitio (carril 3).
La figura 5 muestra el resultado de la purificación de ARN usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo: muestra de reacción de transcripción in vitro - efecto de la sal en la muestra y el tampón de persecución sobre la eliminación de proteínas.
La figura 6A muestra el resultado de la cuantificación de ARN o ARN más nucleótidos. La figura 6B y la figura 6D muestran el resultado de la filtración de flujo tangencial frente a la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo - muestra de reacción de transcripción in vitro - eliminación de nucleótidos. La figura 6C muestra el resultado de la filtración de flujo tangencial frente a la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo frente a la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo y la cromatografía de hidroxiapatita frente a la filtración de flujo tangencial y la cromatografía de hidroxiapatita - muestra de reacción de transcripción in vitro - eliminación de proteínas.
Las figuras 7A-7G muestran el resultado de la purificación de ARN usando una combinación de métodos descritos en el presente documento: muestra de reacción de transcripción in vitro - efecto sobre la recuperación de ARN, eliminación de proteínas, eliminación de nucleótidos y eliminación de ADN. La figura 7A muestra la recuperación de ARN medido mediante cuantificación directa mediante ensayo RiboGreen® (dilución de la muestra de 10.000 veces). La figura 7B muestra la pureza de la muestra de ARN mediante ELISA cuantitativo (polimerasa de T7, las muestras en cursiva están por debajo del LOQ). El gráfico muestra T7 detectable, por debajo del LOQ para la mayoría de las muestras mediante ELISA. La figura 7C muestra la pureza de la muestra de ARN mediante ELISA cuantitativo (enzima de formación de caperuza, las muestras en cursiva están por debajo del LOQ, “0” es igual a por debajo del LOD). El gráfico muestra la enzima de formación de caperuza por debajo del LOD en la muestra P3, posterior a CC250 y P2 y P4, posterior a HTP. La figura 7D muestra la pureza de la muestra de ARN mediante SDS PAGE - tinción con plata (4 ug de ARN cargados por carril). La figura 7E muestra la eliminación de nucleótidos, expresada como la razón de la
cuantificación mediante DO / cuantificación mediante RiboGreen® (el eje Y se refiere a DO/RiboGreen®). La figura 7F muestra el arrastre de ADN de plásmido, usando ensayo de qPCR sobre el plásmido. ADN antes de la purificación: 1,0 ng/dosis. Después de la purificación: 0,6/0,7 ng/dosis. Se encontró la concentración más baja después de la cromatografía de HTP. Se usó el mismo cartucho de TFF en los 4 procesos/etapas: posible arrastre. No se usó control de fondo (tampón) en este experimento. La figura 7G muestra el nivel de contaminación con proteínas de E. coli, usando anticuerpos policlonales de avena frente a proteínas del huésped (E. coIi) (marcados con HRP) frente a E. coü. En este ensayo, el L.O.D. (límite de detección) es de 1 ng/banda, se cargaron 4 ug de ARN en cada carril. La figura muestra que los contaminantes del huésped están por debajo de 1 ng/proteína.
La figura 8 muestra el diseño de un enfoque experimental estadísticamente significativo para la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo - muestra de reacción de transcripción in vitro - optimización de parámetros -concentración de sal: de 0 mM (-1) a 500 mM (1); dilución de la muestra: sin dilución (1) a dilución de 4 veces (-1); velocidad de flujo (velocidad lineal): de 50 cm/h (-1) a 500 cm/h (1).
MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Ejemplo 1: Método para cuantificar el rendimiento de ARN y la eliminación de nucleótidos.
Se cuantificó el ARN en muestras usando un colorante fluorescente específico de ARN (RiboGreen®). Se compararon los niveles de ARN antes y después de la purificación para calcular el % de rendimiento de ARN. RiboGreen® no detecta nucleótidos libres.
Se encuentran nucleótidos libres en la reacción de transcripción in vitro (IVT) sin purificar e incluyen precursores sin reaccionar para el ARN (trifosfato de ribonucleósido) y productos de degradación de la digestión con ADNasa (monofosfato de desoxinucleósidos). Se desarrolló un método para medir los nucleótidos en presencia de ARN. Se midió ARN puro con RiboGreen® (figura 6A, 1a barra) y mediante densidad óptica (DO) a 260 nm, usando 40 como coeficiente de extinción aproximado convencional para el ARN (2a barra). Se añadió una mezcla de nucleótidos a la muestra de ARN puro en un exceso de diez veces con respecto al ARN en masa. Se midieron de nuevo las muestras resultantes con RiboGreen® (3a barra) y mediante DO (4a barra).
Los resultados muestran que la medición mediante RiboGreen®) no se ve afectada por la presencia de nucleótidos en la muestra, mientras que los valores de DO detectados reflejan la concentración total de ARN y nucleótidos en la muestra. La presencia de nucleótidos, como indicador de la eliminación de nucleótidos después de una etapa de purificación de ARN, se calculó como la razón de la medición de DO y la medición del ensayo RiboGreen®. Una razón de aproximadamente 1 indica ARN puro, es decir, eliminación de nucleótidos completa. Razones por encima de 1 indican la presencia de nucleótidos en la muestra.
Ejemplo 2: Purificación de ARN e intercambio de tampón usando filtración de flujo tangencial.
Se produjo un replicón de ARN de 10 kb a través de transcripción in vitro y formación de caperuza con enzimas, molde, sustancia y tampones completamente definidos químicamente. Se usó un sistema de filtración de flujo tangencial KrosFlo Research Ili (Spectrum Laboratories) para tanto la purificación de ARN como el intercambio de tampón en un solo sistema cerrado. Se sometieron a prueba diversos parámetros para lograr resultados óptimos tal como se indica a continuación: química de la membrana, tamaño de poro de la membrana, área de la membrana, presión transmembrana, tasa de cizalladura (velocidad del material retenido), volumen de tampón, capacidad del tampón, pH del tampón, concentración de sal en la muestra y la presencia de EDTA en el tampón.
Se realizaron cuatro ejecuciones de consistencia usando las condiciones optimizadas y demostraron que el método de filtración de flujo tangencial purifica el ARN con una alta recuperación (>95 %), pureza tal como se mide por la eliminación de proteínas (>90 % de la ARN polimerasa de T7 eliminada, tal como se cuantifica por ELISA; 5 ng de polimerasa de T7 por 75 pg de ARN después de la purificación; se eliminó >95 % de la enzima de formación de caperuza de vaccinia, tal como se cuantificó por ELISA) y tal como se midió por la eliminación de nucleótidos (se eliminó > 99,9 % de los nucleótidos libres, tal como se cuantificó usando el ensayo del ejemplo 1), potencia (ningún cambio en la potencia después de la purificación) y estabilidad (el ARN es estable después de la purificación). La operación como un solo sistema cerrado evita la contaminación con agentes exógenos tales como ARNasa. El método es rápido (aproximadamente 70 minutos en total) y fácil de hacer funcionar.
Tal como se muestra en las figuras 6B y 6D y la figura 7E, el método es particularmente útil para eliminar nucleótidos libres de la muestra. Tal como se muestra en la figura 5 (carril 11), la figura 6C y las figuras 7B, 7C y 7D, también se eliminan eficazmente impurezas proteicas de la muestra.
Ejemplo 3: Purificación de ARN usando cromatografía de hidroxiapatita.
Para someter a prueba si la cromatografía de hidroxiapatita podría ser útil para la purificación de ARN grande, se cargaron 80 pg de ARN de 10 kb (replicón) purificado con cloruro de litio de una reacción de transcripción in vitro sobre una columna de hidroxiapatita y se eluyeron con un gradiente lineal de fosfato compuesto por proporciones variables de tampón A (tampón fosfato 10 mM, pH 6,8) y tampón B (tampón fosfato 500 mM, pH 6,8). Se encontró que el ARNm puede unirse y recuperarse eficazmente de una columna de hidroxiapatita. El rendimiento/recuperación de ARN se midió cargando cantidades idénticas de ARNm purificado con cloruro de litio de una reacción de transcripción in vitro sobre una columna de hidroxiapatita o se alimentaron al sistema de cromatografía sin pasar por la columna. Se calculó el área bajo los picos de elución y se usó la razón como indicador del rendimiento de ARN después del paso a través de la columna en comparación con la purificación sin paso a través de la columna (1401,25 mAu/ml frente a 1934,76 mAu/ml). El rendimiento de ARN se calculó como el 72 %. Se cargó ARN de 10 kb purificado con cloruro de litio (replicón) de una reacción de transcripción in vitro sobre una columna de hidroxiapatita y se eluyó usando tampón fosfato. Las fracciones recogidas 4, 5 y 6 se cargaron sobre un gel de ARN desnaturalizante, confirmando que la lectura de densidad óptica está asociada con el ARN.
Para someter a prueba si puede separarse más eficazmente ARN de contaminantes tales como proteínas o ADN no digerido usando cromatografía de hidroxiapatita, se analizó la dinámica de elución del ARN purificado en presencia de
diversas cantidades de una sal (cloruro de sodio 0-1000 mM) en el tampón de elución. Se añadió cloruro de sodio a ambos tampones de elución A y B para tener una concentración constante a lo largo de todo el gradiente de fosfato. El desplazamiento hacia la derecha del pico de elución de ARN muestra que se requiere una concentración creciente de fosfato para la elución de ARN con concentraciones crecientes de sal. Esto permite la configuración de diferentes condiciones para separar adicionalmente ARN de proteínas u otras impurezas. Por tanto, puede aprovecharse la adición de sal al tampón de elución de fosfato para optimizar el fraccionamiento del ARN a partir de impurezas. Se encontró que el rendimiento de ARNm está inversamente relacionado con la concentración de cloruro de sodio en el tampón de elución.
Para someter a prueba si puede separarse más eficazmente ARN de ADN (molde no digerido), se sometieron 100 pg de ADN puro o ARN puro a cromatografía con hidroxiapatita usando los mismos parámetros. Se usó un gradiente continuo de tampón de elución de fosfato de potasio. Se determinó el efecto de las condiciones de elución sobre la separación de ADN de ARN. Se encontró que el ADN se eluye a concentraciones de fosfato más altas que el ARN (desplazamiento hacia la derecha del pico de elución). Por tanto, los inventores idearon un método de elución por etapas mediante el cual la concentración de fosfato en el tampón de elución aumenta por etapas, en lugar de continuamente. Por tanto, el ARN puede eluirse selectivamente eligiendo una concentración de fosfato en el tampón de elución a la que se eluye el a Rn pero no el ADN ni otros contaminantes. Entonces se realizó una ejecución de prueba en la que se mezclaron cantidades iguales de ARN y ADN purificados hasta una cantidad total de 200 pg en disolución y se sometieron a cromatografía de hidroxiapatita usando un gradiente de elución por etapas de tampón A y B.
En una elución en gradiente, la elución del ARN se produjo a una conductividad del tampón de alrededor de 21,04 mS/cm. La elución del ADN se produjo alrededor de 30,52 mS/cm. Esto demuestra que, en presencia de una mezcla de ARN/ADN, una concentración de aproximadamente 180 mM de fosfato de potasio (o cualquier concentración de fosfato de potasio que dé como resultado un valor de conductividad por encima de 21,04 mS/cm y por debajo de 30,52 mS/cm) eluye selectivamente ARN y no ADN. Entonces, se realizó una ejecución de prueba en la que se analizó el ADN purificado en las mismas condiciones descritas anteriormente. No se observó elución por debajo de aproximadamente 180 mM (~18 % de B) de fosfato de potasio. Los resultados muestran que pueden separarse eficazmente ARN y ADN con una elución por etapas. La elución del ADN puede lograrse con tampón B al 38 %, fosfato de potasio aproximadamente 380 mM (o cualquier concentración de fosfato de potasio que dé como resultado un valor de conductividad por encima de 30,52 mS/cm). Usando filtración de flujo tangencial y cromatografía de hidroxiapatita (muestra de reacción de transcripción in vitro), se optimizaron las condiciones de elución para separar ADN de ARN.
Al comparar diversos tampones fosfato útiles para la elución de ARN durante la cromatografía de hidroxiapatita, se encontró que un tampón fosfato de potasio funciona mejor que un fosfato de sodio para mantener el ARN en disolución y es un mejor candidato para la elución de la columna de hidroxiapatita. Los experimentos de dispersión de luz dinámica (figura 2) mostraron que una concentración creciente de fosfato de sodio en el tampón de elución durante la cromatografía de hidroxiapatita conduce a un tamaño de partícula aparente cada vez mayor del ARN eluido, probablemente debido a la precipitación del ARN inducida por la sal (“precipitación con sales”). Este efecto se reduce cuando se usa fosfato de potasio en lugar de fosfato de sodio a la misma concentración, con concentraciones de hasta 500 mM. Se sometió a prueba un tampón fosfato de potasio para la elución de ARN de una columna de hidroxiapatita y funcionó de manera comparable a un tampón fosfato de sodio en cuanto a pureza y recuperación de ARN para este proceso. Por tanto, el fosfato de potasio se identifica como la sal de elección para la purificación de ARN mediante cromatografía de hidroxiapatita.
A continuación, se analizó una reacción de transcripción in vitro no purificada que contenía 100 pg de un replicón de ARN de 10 kb usando cromatografía de hidroxiapatita. Las fracciones recogidas 1,2 y 3 se cargaron sobre un gel de ARN desnaturalizante. No era visible ARN sobre el gel. Las fracciones B9 (correspondiente a la fracción que precede directamente a la fracción 2) y C1 (correspondiente a la fracción 3) se analizaron mediante HPLC de fase inversa. El tiempo de elución se comparó con patrones de nucleótidos, confirmando que los picos de elución observados a DO 260 usando una muestra de reacción de transcripción in vitro no purificada estaban compuestos principalmente por nucleótidos libres de la reacción de transcripción in vitro.
Ejemplo 4: Purificación de ARN usando filtración de flujo tangencial y cromatografía de hidroxiapatita.
Se sometió a prueba una combinación de filtración de flujo tangencial seguida por cromatografía de hidroxiapatita para lograr una eficiencia mejorada de la purificación de ARN de una muestra de reacción de transcripción in vitro, y en particular para la eliminación de nucleótidos antes de que la muestra se use en la cromatografía de hidroxiapatita. Se usó una reacción de transcripción in vitro no purificada que contenía un producto de replicón de ARN de 10 kb como muestra de partida. Las figuras 3A y 3B muestran que una combinación de métodos de este tipo permite la eliminación eficaz de nucleótidos en la etapa de filtración de flujo tangencial y de ADN (reducido hasta 5,93 ng de ADN por mg de ARN purificado) y proteína (reducida hasta niveles por debajo de la detección) en la etapa de cromatografía de hidroxiapatita, permitiendo la recuperación de ARN puro (>80 %) después de la etapa de cromatografía de
hidroxiapatita (se usó un gradiente de elución por etapas tal como se describió en el ejemplo 3 para la elución). Esto es particularmente útil, ya que la digestión del molde de ADN puede omitirse del procedimiento general de purificación de ARN, lo que conduce a tiempos de operación más rápidos.
La figura 1 confirma además la eficacia de la eliminación de proteínas usando una etapa de cromatografía de hidroxiapatita, mostrando que el nivel de impurezas de proteínas se reduce hasta por debajo del nivel de detección usando tinción con plata (se cargaron 4 gg de ARN purificado por carril). Se usó una etapa adicional opcional de filtración de flujo tangencial para intercambiar el tampón fosfato en el que se eluye el ARN purificado después de la cromatografía de hidroxiapatita a un tampón citrato adecuado para aplicaciones posteriores.
La figura 6C (carril “TFF0HTP0” frente a carril “Entrada”) también confirma la utilidad de un método de purificación de ARN que combina filtración de flujo tangencial seguida por cromatografía de hidroxiapatita para eliminar impurezas proteicas de una muestra que contiene ARN.
Ejemplo 5: Purificación de ARN mediante cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo.
Se sometió a prueba la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo para la purificación de ARN. Se usó una reacción de transcripción in vitro sin purificar (en Tris 50 mM, pH 8,0) que contenía un producto de replicón de ARN de 10 kb como muestra de partida. Se usó inicialmente una columna HiScreen Capto™ Core 700 (código de producto: 17-5481-15) en un sistema de FPLC GE AKTAa Explorer 100. La muestra se diluyó en un tampón de Tris 50 mM, pH 8,0, hasta una concentración final de ARN de 600 ng/gl (volumen final: 8,5 ml, que contenía 5,1 mg de ARN). La muestra se inyectó en la columna y se persiguió con tampón Tris (50 mM) hasta que se completó la elución de la muestra. El flujo se fijó a 1 ml/min (correspondiente a 125 cm/h). La limpieza en el sitio (CIP) y la regeneración de la columna se realizaron según las instrucciones del fabricante. Se encontró que puede recuperarse ARN en la fracción no retenida de la columna (por ejemplo, muestra de reacción de transcripción in vitro, 5,1 mg de ARN, el ARN se eluyó en la fracción no retenida). Las figuras 4A y 4B muestran que se recupera ARN de la fracción no retenida de la columna a un alto nivel de rendimiento (figura 4B, carril 2 frente a carril 1) y contiene niveles más bajos de impurezas proteicas en comparación con antes de la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo (figura 4A, carril 2 frente a carril 1).
Para someter a prueba el efecto de la presencia de sal sobre la eliminación de impurezas proteicas usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo, se sometieron a prueba concentraciones crecientes de cloruro de sodio o fosfato de sodio añadidos a la muestra durante la purificación y en el tampón de persecución. Las condiciones cromatográficas para estas purificaciones fueron equivalentes a las especificadas anteriormente. Se analizaron fracciones no retenidas que contenían una cantidad igual de ARN purificado (5 gg) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con plata. La figura 5 muestra que una concentración creciente de sal se correlaciona positivamente con el nivel de eliminación de contaminantes proteínicos. Se añadió sal a la muestra y al tampón de persecución. Las flechas indican dos contaminantes proteicos (polimerasa de T7 y subunidad grande de la enzima de formación de caperuza). La muestra de control en el extremo derecho es después de la purificación de una reacción de transcripción in vitro usando solo filtración de flujo tangencial. En conclusión, una concentración de sal creciente facilita la eliminación del arrastre de proteínas, lo que conduce a una masa de proteína final que está por debajo del nivel de detección usando un gel de poliacrilamida teñido con plata y 5 gg de a Rn .
Se optimizaron adicionalmente las condiciones para la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo, en particular se variaron la concentración de sal (0-500 mM), la velocidad de flujo (50-500 cm/h) y la dilución de la muestra (dilución de 4 veces a sin diluir; antes de la aplicación a la columna) y se evaluaron para determinar su efecto sobre el nivel de rendimiento de ARN (recuperación), la eliminación de proteínas (polimerasa de T7 y/o enzima de formación de caperuza) y la eliminación de nucleótidos después de la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo y la presión de la precolumna y el tiempo de operación del método de la cromatografía. La figura 8 muestra el diseño de un enfoque experimental estadísticamente significativo. Se indican los intervalos de valores para las variables sometidas a prueba y los parámetros de salida que se evaluaron. Detalles del modelo: diseños de superficie de respuesta, diseños compuestos centrales, inscritos. La muestra de partida era una muestra de reacción de transcripción in vitro sin purificar que contenía el ARN de interés. El arrastre de proteína se evaluó mediante una SDS PAGE teñida con plata del material de fracción no retenida y se cuantificó mediante densitometría de las bandas proteicas. La eliminación de nucleótidos y el rendimiento de ARN se cuantificaron tal como se describió en el ejemplo 1.
La tabla 1 muestra los valores de salida: rendimiento de ARN (recuperación), eliminación de proteínas (polimerasa de T7 y enzima de formación de caperuza), valores de DO260 nm, tiempo de operación y presión de la precolumna después de una cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo microesferas ejecutada en diferentes condiciones (muestras A-T).
Los parámetros de salida eliminación de polimerasa de T7 y eliminación de enzima de formación de caperuza en las muestras A-T se cuantificaron mediante resolución de la fracción no retenida de la cromatografía de perlas de núcleo usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con plata, seguido por cuantificación usando densitometría de las bandas proteicas. Se usó una muestra de transcripción in vitro sin purificar como control. Los resultados se analizaron adicionalmente según las condiciones de cromatografía: efecto de la concentración de sal y la dilución de la muestra sobre la recuperación de ARN, eliminación de polimerasa de T7 (cuantificación en unidades relativas) y eliminación de enzima de formación de caperuza (cuantificación en unidades relativas); efecto de la velocidad de flujo y la dilución de la muestra sobre la recuperación de ARN, eliminación de polimerasa de T7 y eliminación de enzima de formación de caperuza; efecto de la velocidad de flujo y la concentración de sal sobre la recuperación de ARN, eliminación de polimerasa de T7 y eliminación de enzima de formación de caperuza.
Usando una reacción de transcripción in vitro sin purificar como muestra de partida, se determinó el volumen de muestra máximo por volumen de columna (CV) al que la proteína se elimina suficientemente usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo. Se determinó el efecto de la razón volumen de muestra con respecto a volumen de columna sobre la eliminación de proteína. Las muestras se diluyeron hasta una razón de muestra/CV máxima de 10:1 (CV: 1 ml; DI: 0,7 cm; altura: 2,5 cm, L. vel.: 250 cm/h; flujo: 1,6 ml/min; tiempo de contacto: 36 segundos) o 64:1 (CV: 0,137 ml; DI: 0,5 cm; altura: 0,7 cm, L. vel.: 250 cm/h; flujo: 0,82 ml/min; tiempo de contacto: 10 segundos) y se añadió cloruro de potasio hasta una concentración final de 250 mM. Se analizó la fracción no retenida de cada ejecución mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con plata. Se encontró que se producía avance de la proteína cuando la razón de muestra-CV excedía aproximadamente 10:1, en las condiciones usadas. En conclusión, una razón de muestra/CV de hasta 10 purificó eficazmente ARN de impurezas proteicas en la condición experimental usada (por ejemplo, la reacción de IVT de 10 ml puede diluirse hasta 40 ml y purificarse eficazmente con una columna de 1 ml).
Además, se compararon diversas composiciones de tampones de muestra y/o persecución para su uso en la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo con respecto al grado de precipitación de ARN observada en estos tampones, medido usando dispersión de luz dinámica y un tamaño de partícula aparente creciente como indicador de precipitación de ARN. La tabla 2 resume los resultados de la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo: análisis mediante dispersión de luz dinámica del tamaño de partícula de los agregados de ARN en presencia de diversas sales. La segunda columna se refiere a la concentración de sal en mM. Los números de las columnas 3-7 son el radio de partícula en nm. La tabla muestra que tampón fosfato de potasio (pH 6,5) y tampón cloruro de potasio (pH 8,0) son buenos candidatos para una purificación optimizada de la fracción no retenida.
Tabla 2
Ejemplo 6: Purificación de ARN usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo y filtración de flujo tangencial.
Usando una reacción de transcripción in vitro sin purificar como muestra de partida que contenía un producto de replicón de ARN de 10 kb, se comparó la eliminación de nucleótidos y proteínas usando o bien filtración de flujo tangencial o bien cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo (usando concentraciones de cloruro de potasio de 0, 250 o 500 mM en la muestra). Las figuras 6B y 6D muestran que la filtración de flujo tangencial elimina eficazmente impurezas de nucleótidos. La figura 6C muestra que la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo elimina eficazmente impurezas proteicas en presencia de cloruro de potasio. Por tanto, cuando se desea eliminar impurezas de nucleótidos y proteicas, se desea que la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo vaya seguida por una filtración de flujo tangencial.
Ejemplo 7: Purificación de ARN usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo y cromatografía de hidroxiapatita.
La presencia de sales adicionales tales como cloruro de potasio en la muestra y/o el tampón de persecución a veces puede no ser deseada. Usando una reacción de transcripción in vitro sin purificar como muestra de partida que contenía un replicón de ARN de 10 kb, se comparó la eliminación de proteínas usando cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo (sin sal adicional, es decir, cloruro de potasio 0 mM) sola o seguida por cromatografía de hidroxiapatita (también sin sal adicional, es decir, cloruro de sodio 0 mM). La figura 6C (carril “CC0HTP0” frente a carril “CC0”) muestra que puede lograrse una eliminación eficaz de proteínas, incluso en ausencia de sal adicional, cuando
la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo va seguida por cromatografía de hidroxiapatita.
Ejemplo 8: Combinaciones de métodos para la purificación de ARN y el intercambio de tampón.
Se diseñaron cuatro corrientes de proceso diferentes (P1-P4) para la purificación de ARN (tabla 3) y se compararon con respecto a la recuperación/rendimiento y pureza de ARN (figuras 6A-6G).
Tabla 3
Se usó una reacción in vitro que contenía un replicón de ARN de interés de 10 kb como muestra de partida.
La pureza del ARN estaba relacionada con el nivel de proteína (polimerasa de T7, enzima de formación de caperuza, inhibidor de ARNasa, pirofosfatasa, proteínas de E. coli arrastradas de la amplificación del molde de ADN), ADN de plásmido y nucleótido después de cada etapa. La recuperación de ARN y los niveles de nucleótidos se midieron usando los métodos del ejemplo 1. Los niveles de proteína se midieron usando ELISA o electroforesis en gel de poliacrilamida, seguido por tinción con plata o detección basada en anticuerpos (inmunotransferencia de tipo Western). Los niveles de ADN se midieron por PCR cuantitativa.
Puede usarse una etapa de filtración de flujo tangencial para intercambiar tampón, pero cuando esto da como resultado una pureza aumentada, también es una etapa de purificación.
Con fines de comparación, se realizó una etapa de digestión de ADN usando ADNasa para todos los procesos después de la IVT y antes de aplicar la muestra al sistema de cromatografía/filtración. Sin embargo, ha de indicarse que esta etapa no es obligatoria, por ejemplo, cuando se usa cromatografía de hidroxiapatita.
Las figuras 7A-7G muestran que se observa arrastre de proteína (enzima T7 y de formación de caperuza) solo con el proceso 1. La cromatografía de hidroxiapatita y la cromatografía de perlas de núcleo pueden eliminar el arrastre de proteínas eficazmente. Se detectan trazas después de la purificación, por debajo del nivel de detección del ensayo ELISA. La purificación de la fracción no retenida de perlas de núcleo seguida por filtración de flujo tangencial es más fácil de hacer funcionar que la cromatografía de hidroxiapatita. El rendimiento de ARN fue: P1: 74,8 %, P2: 37,3 %, P3: 76,2 %, P4: 60,7 % (la recuperación de ARN se resume en la tabla 4). La eliminación de nucleótidos fue completa en todos los procesos en el producto final. El tiempo de proceso oscila entre 45 minutos y 84 minutos para todos los procesos. La concentración de ADN en el producto final fue de 0,6 ng de ADN por 75 pg de ARN. El nivel de contaminación de proteínas de E. coli estaba por debajo del nivel de detección del método de inmunotransferencia de tipo Western usado. El tamaño de partícula aparente del ARN tal como se midió por dispersión de luz dinámica en el producto final fue de 40-45 nm de radio para todos los procesos.
Tabla 4
Etapa: Recuperación en la etapa Recuperación global
1 - TFF250 13,8
P1
2 - TFFfb 543,4 74,8
1 - TFF0 81,9
P2 2 - HTP0 77,0 63,0
3 - TFFfb 59,2 37,3
1 - CC250 88,7
P3
2 - TFFfb 85,9 76,2
1 - CC0 90,1
P4 2 - HTP0 88,8 79,9
3 - TFFfb 75,9 60,7
Ejemplo 9: Purificación de ARN a gran escala
Se usó una combinación de filtración de flujo tangencial seguida por cromatografía de hidroxiapatita para la purificación preparativa de ARN de una muestra de reacción de transcripción in vitro. Se usó una reacción de transcripción in vitro sin purificar que contenía 6 mg de un producto de replicón con caperuza de ARN de 10 kb como muestra de partida. Se realizó filtración de flujo tangencial usando Tris 10 mM pH 8,0. Se retuvo la fracción que contenía ARN. Se añadió cloruro de potasio a la muestra a una concentración final de 500 mM y se aplicó la muestra a la columna de hidroxiapatita (hidroxiapatita cerámica CHT™ de tipo II, tamaño de partícula de 40 pm, Biorad, en una columna GE Hi Scale 26, 20 cm de altura, 100 ml; ejecutada en un sistema GE AKTA explorer 100; flujo 10 ml/min; velocidad lineal 300 cm/h). Los tampones de elución fueron tampón A (fosfato de potasio 10 mM, pH 6,5) y tampón B (fosfato de potasio 1 M, pH 6,5). El ARN se eluyó selectivamente con tampón B al 18 % (fosfato de potasio 180 mM). Los resultados demuestran que este método logra una purificación de ARN preparativa a gran escala con alto rendimiento y pureza.
Se usó una combinación de cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo seguida por TFF para la purificación de ARN preparativa de una muestra de reacción de transcripción in vitro. Se usó una reacción de transcripción in vitro sin purificar que contenía 120 mg de un producto de replicón de ARN con caperuza de 10 kb como muestra de partida. La muestra se diluyó 4 veces, luego se añadió opcionalmente cloruro de potasio hasta 250 o 500 mM y se aplicó la muestra a una columna de flujo continuo de perlas de núcleo usando perlas Capto™Core 700. La cromatografía se realizó a una velocidad de flujo lineal de 275 cm/h (25 ml/min volumétrico) con un tiempo de contacto de 2,21’. Entonces, se purificó adicionalmente la fracción no retenida que contenía ARN, se concentró 2 veces y se intercambió el tampón al tampón de formulación final (procedimiento todo en uno) usando TFF (módulo de fibra hueca, corte de 500 kDa, mPES).
Se sometió a prueba el proceso con 100 ml de ARN de IVT con caperuza (aproximadamente 120 mg), usando una columna Captocore de 50 ml (Captocore 700, 2,6 cm de diámetro interno, 10 cm de altura, ejecución en las condiciones descritas anteriormente, flujo de 25 ml/min) y un cartucho de TFF de 790 cm2 (mismas condiciones, flujo de 200 ml/min). El material final tenía características comparables al proceso de menor escala en cuanto a actividad, pureza y rendimiento. Incluso en experimentos preliminares, el proceso tuvo un rendimiento de aproximadamente el 80 % por etapa, dando una recuperación del 65 % globalmente, y se completó en 70’ (12 minutos para la etapa de Captocore, 58 minutos para TFF).
La siguiente tabla muestra parámetros de proceso adecuados para cuatro columnas disponibles que pueden manejar volúmenes de muestra de 10 a 1000 ml:
GE HiScreen 10 275 2,21 0,77 0,47 10,13 4,71 2,12 40 2,1 19 GE HiScale 26/20 100 275 2,21 2,60 5,31 10,13 53,75 1,86 400 24,3 16 GE HiScale 26/20 200 275 2,21 2,60 5,31 10,13 53,75 3,72 800 24,3 33 Espectra/Chrom 50/100 1000 275 2,21 5,00 19,63 10,13 198,78 5,03 4000 89,9 44
La tabla muestra la velocidad de flujo como una velocidad lineal, lo que significa que los diámetros internos de las columnas son irrelevantes para definir el método. La velocidad lineal puede mantenerse constante en los procesos de escala aumentada. El diámetro diferente de la columna se usa para calcular la velocidad de flujo en ml/min, para mantener constante la velocidad lineal y, por tanto, mantener el mismo tiempo de contacto (es decir, el tiempo que la muestra permanece en la columna).
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Claims (6)
1. Método para eliminar contaminantes proteicos de una especie de ARNm monocatenario deseada que tiene una caperuza en 5’ a partir de una muestra que contiene ARN, comprendiendo dicho método una etapa de cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo, en el que dicha muestra que contiene ARN comprende una muestra de reacción de transcripción in vitro.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la cromatografía de flujo continuo de perlas de núcleo se lleva a cabo usando un medio de cromatografía que comprende una matriz porosa que tiene un corte de peso molecular de al menos 250 kDa.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARN es un ARNm modificado.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARN comprende una secuencia lineal de al menos 2.000 nucleótidos.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se añade una sal a la muestra que contiene ARN hasta una concentración final de entre 0-500 mM.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además una etapa de purificación previa de la fabricación de ARN mediante transcripción de ARN in vitro.
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