ES2923022T3

ES2923022T3 - Agentes que inhiben Ngly1 y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2923022T3
Application number: ES18748431T
Authority: ES
Inventors: Carolyn Ruth Bertozzi; Frederick Tomlin; Ulla Gerling-Driessen
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2022-09-22
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: JP2020505470A; US11141389B2; US20190365677A1; EP3576745B1; CA3051846A1; EP3576745A4; US20210401783A1; CN110402144A; EP3576745A1; WO2018144327A1

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento de células cancerosas, en un régimen que comprende poner en contacto las células cancerosas con un inhibidor de NGly1, opcionalmente en combinación con un inhibidor directo del proteasoma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes que inhiben NGlyl y métodos de uso de los mismos

Antecedentes

La vía de la ubiquitina-proteasoma tiene un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis celular normal, ya que es responsable de la degradación de las proteínas en las células eucariotas, incluidas las proteínas reguladoras que controlan la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la reparación del ADN. La alteración de la actividad del proteasoma produce la rápida acumulación de proteínas reguladoras incompatibles dentro de la célula, que inducen una cascada apoptótica que conduce a la detención del crecimiento y, finalmente, a la muerte celular. Dado que, en general, las células cancerosas tienen niveles más altos de actividad del proteasoma que las células normales y muestran una mayor sensibilidad a los efectos proapoptóticos de la inhibición del proteasoma, el proteasoma se ha convertido una potente diana en oncología.

El equilibrio entre la síntesis y la degradación de proteínas está muy bien regulado en las células normales sanas. La mayoría de las proteínas intracelulares se degradan a través del Sistema Ubiquitina-Proteasoma (SUP), en el que las proteínas se marcan con ubiquitina y luego son reconocidas por el complejo de proteasoma 26S, que las degrada en pequeños péptidos. El SUP es responsable de la degradación del 80-90 % de las proteínas intracelulares. Las proteínas destinadas a la degradación proteasómica son ubiquitinadas por una serie de enzimas, incluida la enzima activadora de la ubiquitina E1, la enzima conjugadora de la ubiquitina E2 y las ligasas de la ubiquitina E3, que permiten que las proteínas diana sean reconocidas por el proteosoma 26S (PM: 2400 kDa), un complejo de proteasas de múltiples subunidades que comprende el núcleo catalítico 20S (PM: 700 kDa) y una o dos partículas reguladoras 19S (PM: 700 kDa). El núcleo 20S está formado por dos conjuntos de anillos a idénticos y dos conjuntos de anillos p idénticos apilados de manera simétrica con los anillos a externos rodeando los anillos p internos (appa). Cada anillo a o p contiene siete subunidades diferentes, denominadas a1-a7 o p1-p7, respectivamente, entre las que principalmente p1, p2 y p5 poseen actividad proteolítica. La subunidad p1 es responsable de la actividad similar a la caspasa (o similar a la hidrolización del péptido peptidil-glutamilo/similar a PGPH) que se escinde preferentemente después de los restos ácidos (p. ej., aspartato y glutamato), la subunidad p2 tiene una actividad similar a la tripsina que se escinde preferentemente después de los restos básicos (p. ej., arginina y lisina), y la subunidad p5 tiene una actividad similar a la quimotripsina que se escinde preferentemente después de los restos hidrófobos (p. ej., tirosina y fenilalanina). La partícula reguladora 19S comprende una "tapa" y una "base", y se une a ambos eXtremos del proteasoma del núcleo 20S. La tapa del proteasoma 19S contiene nueve o más subunidades no ATPasa, que reconocen proteínas poliubiquitinadas, se unen a ellas y eliminan la cadena de poliubiquitina de las proteínas del sustrato mediante un proceso denominado desubiquitinación. En paralelo, la base 19S contiene seis subunidades ATPasa y cuatro no ATPasa responsables del despliegue de las proteínas del sustrato y la potenciación de su entrada en el proteasoma 20S.

La desregulación de la degradación de las proteínas desempeña un papel esencial en el crecimiento, desarrollo y supervivencia celulares del cáncer humano. Los niveles de ARNm proteasómico aumentan notablemente de manera constante en una variedad de estirpes de células hematopoyéticas humanas malignas en comparación con los linfocitos y monocitos periféricos de adultos sanos. Asimismo, el aumento de la actividad del proteasoma se asocia con enfermedades malignas, incluidas las del colon, la próstata y la leucemia. Las células oncógenas dependen más de la actividad proteasómica y, por lo tanto, son más sensibles a su bloqueo. De hecho, los investigadores descubrieron que muchos tipos de células tumorales que proliferan activamente son más sensibles a los inhibidores del proteasoma que las células no oncógenas. La inhibición farmacológica del proteasoma produce el cambio en el equilibrio de las proteínas proapotóticas y antiapoptóticas, incluida la acumulación de proteínas supresoras de tumores, generando la detención del ciclo celular y la apoptosis. En algunos tipos de células tumorales, los inhibidores del proteosoma presentan una capacidad inductora de la apoptosis más eficaz en comparación con los agentes citotóxicos convencionales. Se ha descubierto que la inhibición del proteosoma es una estrategia eficaz para la quimiosensibilización y la superación de la resistencia.

En particular, el tratamiento de las neoplasias hemáticas tales como el mieloma múltiple ha mejorado significativamente mediante el uso de los inhibidores del proteasoma. El bortezomib, un derivado del ácido dipeptidilborónico que se dirige de manera reversible al sitio activo similar a la quimotripsina de la subunidad p5 del proteasoma 20S, fue el primer inhibidor del proteasoma aprobado por la FDA (Food and Drug Administraron, Administración de Alimentos y Medicamentos estadounidense) para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, el mieloma múltiple (MM) y el linfoma de células del manto (LCM). La inhibición del proteasoma con bortezomib produce la supresión del crecimiento y la apoptosis de las células tumorales, inhibe la activación de NF-^kB en las células y el microambiente tumoral, bloquea la producción y la señalización intracelular de IL-6, detiene la producción y expresión de mediadores proangiogénicos, y resuelve los defectos de los reguladores apoptóticos tales como Bcl-2, desencadenando la apoptosis inducida por p53.

El bortezomib pudo de mejorar los tiempos de recaída para el MM, aunque con efectos secundarios tales como la neuropatía periférica y el malestar gastrointestinal. Adicionalmente, el aumento de la resistencia intrínseca y adquirida al bortezomib estimuló el desarrollo de inhibidores del proteosoma de segunda generación tales como la epoxicetona carfilzomib. En comparación con el bortezomib, el carfilzomib inhibe irreversiblemente el sitio activo similar a la quimotripsina con mayor selectividad y muestra una menor afinidad por las proteasas similares a la tripsina y la caspasa, y tiene una actividad mínima contra las enzimas no diana, tales como las serina proteasas. Adicionalmente, ha mostrado actividad contra estirpes celulares y células primarias de MM resistentes al bortezomib.

Aunque los inhibidores del proteosoma han mejorado el tratamiento del MM, las resistencias desarrolladas y los cortos períodos de respuesta requieren nuevas vías terapéuticas.

Sumario

Se proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer a través de la inhibición de las vías de factores de transcripción que participan en la expresión del proteasoma. En particular, se proporcionan composiciones y métodos de uso de las mismas para la inhibición de la N-glucanasa 1 (NGly1). La inhibición de NGly1 reduce la expresión del proteasoma. El inhibidor de NGly1 se puede utilizar como agente único o junto con un agente que inhiba directamente la actividad del proteasoma. La combinación de agentes puede proporcionar una mayor supervivencia global de un individuo que está recibido tratamiento para el cáncer. La combinación de agentes puede proporcionar un beneficio sinérgico en la eliminación de las células cancerosas en relación con la administración como agente único.

En algunas realizaciones, se proporcionan compuestos y formulaciones de los mismos de inhibidores de NGly1. En algunas realizaciones, el compuesto inhibe NGly1 y no inhibe la actividad de la caspasa. En algunas realizaciones, el inhibidor inhibe Ngly1 mecánicamente al inhibir el ataque nucleófilo de un resto de cisteína en el enlace amida entre la cadena lateral de asparagina de la proteína diana y el oligosacárido unido a N. En algunas realizaciones, se proporciona una formulación farmacéutica de un inhibidor de NGly1 con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la formulación se proporciona en una formulación de dosis unitarias, proporcionando una dosis eficaz para reducir la expresión del proteasoma en una célula diana. En algunas realizaciones, la formulación además comprende una dosis eficaz de un fármaco que inhibe directamente la actividad del proteasoma.

En algunas realizaciones, el inhibidor de NGly1 tiene una estructura de fórmula I.

donde R¹es H, alquilo, incluidos alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido, etc.;

R²es H, alquilo, incluidos alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido, etc.; y

R³es alquilo, incluidos alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido, un sustituyente aceptor de electrones o un grupo donante de electrones. En algunas realizaciones, se prueba la actividad de un inhibidor de NGly1 candidato basándose en la inhibición de la desglucosilación de un sustrato polipeptídico que comprende un sitio para la N-glucosilación. En algunas de dichas realizaciones, el análisis es un análisis fluorescente.

En otras realizaciones, se proporcionan métodos para tratar el cáncer, cánceres que incluyen, sin limitación, cánceres hemáticos, p. ej., leucemias, linfomas, mielomas, etc.; tumores sólidos que incluyen, sin limitación, carcinomas tales como adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas basocelulares, carcinomas de células renales; gliomas; sarcomas; melanomas. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple. En los métodos de la invención, las células cancerosas se ponen en contacto con una dosis eficaz de un inhibidor de NGly1, dosis que es eficaz para reducir la expresión del proteasoma en las células diana. En algunas realizaciones, las células cancerosas también se ponen en contacto con una dosis eficaz de un inhibidor directo del proteasoma, inhibidor que puede incluir, sin limitación, uno o más de bortezomib, carfilzomib, ixazomib, delanzomib, oprozomib, marizomib, IPSI-001, ONX-0914, PR-924, etc.

En algunas realizaciones, se administra una dosis eficaz de una combinación de agentes para tratar el cáncer, de (i) un inhibidor de NGly1; y (ii) un inhibidor directo del proteasoma. Los agentes de la combinación pueden administrarse de forma concomitante, es decir, cada agente se administra en el espacio de aproximadamente 45 días, 30 días, 15 días, 7 días, 3 días, 2 días, 1 día o de manera esencialmente simultánea con respecto al resto de agentes de la combinación. Un beneficio de la presente invención puede ser el uso de dosis más bajas del inhibidor del proteasoma en relación con la dosis necesaria como monoterapia, por ejemplo, para reducir los efectos secundarios, p. ej., la neuropatía periférica. La administración puede repetirse según sea necesario para agotar la población de células cancerosas. Un beneficio puede ser la reducción de la resistencia al inhibidor del proteasoma, de modo que la administración sea eficaz durante un período de tiempo más largo.

El contacto de una célula cancerosa se puede realizar in vivo, por ejemplo, con fines terapéuticos, e in vitro, p. ej., para análisis de cribado y similares. La politerapia puede ser sinérgica para potenciar la eliminación de las células tumorales en comparación con el uso de los agentes únicos. Además, la combinación puede proporcionar una mayor supervivencia global del individuo tratado.

Breve descripción de las figuras

La invención se entiende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Se hace hincapié en que, de acuerdo con la práctica común, las diversas características de los dibujos no están representadas a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características están aumentadas o reducidas de manera arbitraria por claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.

FIG. 1A-1D. NGly1 es necesaria para el procesamiento correcto de Nrf1. FIG. 1A Vía propuesta de activación de Nrf1 dependiente de LA des-N-glucosilación para el rebote proteasómico. FIG. 1B Estructuras químicas del carfilzomib, un inhibidor del proteasoma; Z-VAD-fmk, un inhibidor de NGly1 que también funciona como un inhibidor de la pancaspasa; Q-VD-OPh, un inhibidor de la pan-caspasa que no inhibe la NGly1. FIG. 1C Las células MEF NGly1'/_ muestran un procesamiento anómalo de Nrf1 en presencia del inhibidor del proteasoma carfilzomib. FIG.

1D La inhibición de NGly1 por Z-VAD-fmk hace que Nrf1 se procese incorrectamente en las células HEK con sobrexpresión de Nrf1. El inhibidor de la caspasa Q-VD-OPh muestra un procesamiento similar al de las células no tratadas.

FIG. 2A-2C. NGly1 es necesario para la activación y ubicación subcelular correcta de Nrf1. FIG. 2A En un análisis de indicador de luciferasa dependiente de Nrf1, las NEF NGly1'/_ mostraron una respuesta menor a la inhibición del proteasoma en comparación con las MEF WT (Wild Type, tipo natural). FIG. 2B La ubicación de Nrf1 está alterada en NGly1'/_ en comparación con el tipo natural: i) tipo natural sin tratar; ii) tipo natural en presencia de carfilzomib 20 nM; iii) NGly1'/_ sin tratar; iv) NGly1_/_ en presencia de carfilzomib 20 nM. FIG. 2C La ubicación de Nrf1 se altera en las células HEK con sobrexpresión de Nrf1 tratadas con Z-VAD-fmk: i) sin tratar; ii) tratadas con carfilzomib 10 nM; iii) tratadas con Z-VAD-fmk 100 pM; iv) tratadas con Z-VAD-fmk 100 pM y carfilzomib 10 nM; v) tratadas con Q-VD-Oph 50 nM; vi) tratadas con Q-VD-OPh 50 nM y carfilzomib 10 nM.

FIG. 3A-3C. NGly1'/_ o atenuación de NGly1 aumenta la sensibilidad de las células hacia los inhibidores del proteasoma. FIG. 3A La viabilidad de MEF NGly1'/_ es significativamente inferior a la de MEF WT después de 24 horas de incubación con carfilzomib, un inhibidor del proteasoma. FIG. 3B La atenuación de NGly1 o Nrf1 por ARNsg de dCas9 en K562 reduce la supervivencia durante el tratamiento con un inhibidor del proteasoma. FIG.

3C La DL⁵⁰del carfilzomib en células K562 se reduce ~2 veces con la eliminación de Nrf1 o NGly1.

FIG. 4A-4E. Un cribado dirigido de compuestos similares a los inhibidores de cisteína proteasa condujo al descubrimiento del nuevo inhibidor de NGly1 WRR139. FIG. 4A Esquema de la prueba de Cresswell para la detección de la inhibición de NGly1. FIG. 4^b Seis activos obtenidos del cribado de alto rendimiento. FIG. 4C Validación de los activos de la prueba de Cresswell. Solo se encontró que WRR139 inhibía NGly1 de manera dependiente de la dosis. FIG. 4D Actividad de las caspasas 3/7 en presencia de cantidades crecientes de WRR139.

FIG. 4E En presencia de WRR139, la RNasa B no es desglucosilada por NGly1 recombinante.

FIG. 5A-5C. La inhibición de NGly1 potencia el tratamiento del mieloma múltiple mediante la inhibición del proteasoma. FIG. 5A La supervivencia se reduce significativamente en las células U266 en presencia de WRR139.

FIG. 5B La supervivencia se reduce significativamente en las células H929 en presencia de WRR139. FIG. 5C La DL⁵⁰del tratamiento con carfilzomib se reduce en 2,6 y 2 veces, respectivamente en U266 y H929.

Descripción detallada de las realizaciones

Se proporcionan métodos para el agotamiento de las células cancerosas en un sujeto, donde las células cancerosas se ponen en contacto con una dosis eficaz de un inhibidor de NGly1, opcionalmente junto con un inhibidor directo del proteasoma. También se pueden proporcionar fármacos quimioterápicos adicionales. Los cánceres incluyen, sin limitación, cánceres hemáticos, p. ej., mieloma múltiple, linfoma de mastocitos, macroglobulinemia de Waldenstrom (MW); linfomas no Hodgkin tales como linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma cutáneo de linfocitos T, etc.; leucemias agudas tales como leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica aguda; leucemias crónicas tales como la leucemia mieloide crónica y la leucemia linfocítica crónica; etc.

Para facilitar la comprensión de la invención, se definen a continuación varios términos.

Antes de describir los presentes agentes activos y métodos, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, productos, aparatos y factores descritos, ya que dichos métodos, aparatos y formulaciones pueden, como es evidente, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cabe destacar que, como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/uno/una", "y" y "el" o "la", incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un fármaco candidato" se refiere a uno o mezclas de dichos candidatos, y la referencia a "el método" incluye la referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la materia, etc.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor afirmado o intermedio en este intervalo se incluye dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños que también se engloban dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera de los dos límites incluidos también se incluyen en la invención.

En la siguiente descripción, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión exhaustiva de la presente divulgación. Sin embargo, será evidente para un experto en la materia que la presente invención se puede poner en práctica sin uno o más de estos detalles específicos. En otros casos, no se han descrito características y procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia para evitar confusiones sobre la invención.

Generalmente, en la presente invención, se emplean métodos convencionales de síntesis de proteínas, el cultivo de células recombinantes y el aislamiento de proteínas, y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en las referencias, véase, p. ej., Maniatis, Fritsch y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); Sambrook, Russell y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2001); Harlow, Lane y Harlow, "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I", Cold Spring Harbor Laboratory (1998); y Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).

Definiciones

Inhibidor de NGly1. En el presente documento, se divulgan determinados inhibidores de NGly1; y otros inhibidores, incluido, sin limitación, Z-VAD-FMK (carbobenzoxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona) son conocidos en la técnica, o pueden determinarse a través de un análisis de cribado como se describe en el presente documento, en los ejemplos. En algunas realizaciones, el compuesto inhibe NGly1 y no inhibe la actividad de la caspasa. En algunas realizaciones, el inhibidor inhibe Ngly1 mecánicamente al inhibir el ataque nucleófilo de un resto de cisteína en el enlace amida entre la cadena lateral de asparagina de la proteína diana y el oligosacárido unido a N. En algunas realizaciones, se prueba la actividad de un inhibidor de NGly1 candidato basándose en la inhibición de la desglucosilación de un sustrato polipeptídico que comprende un sitio para la N-glucosilación. En algunas de dichas realizaciones, el análisis es un análisis fluorescente.

En algunas realizaciones, un inhibidor de NGly1 tiene una estructura de fórmula I.

donde R¹es H,

R³es alquilo, incluidos alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido, un sustituyente aceptor de electrones o un grupo donante de electrones.

En algunas realizaciones, un inhibidor de NGly1 tiene una estructura de Fórmula III, donde R¹y R²son como se han descrito anteriormente, y

R⁴es un grupo alquilo, incluidos metilo, etilo, propilo, isopropilo, etc.

R⁵es un grupo polar o no polar, incluidos, pero sin limitación, alquinilo, alquenilo, morfolino, amino, amido, sulfhidrilo, etc.

En algunas realizaciones, un inhibidor de NGly1 tiene una estructura de Fórmula IV, donde R⁴y R⁵son como se han descrito anteriormente, y

R6 es un sustituyente opcional en el anillo arilo en cualquier ubicación (orto, meta o para), cuyo sustituyente puede ser alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO²-alquilo, -SO²-alquilo sustituido, -SO²-arilo, -SO²-heteroarilo o heterociclo condensado;

Cualquiera de X¹, X²y X³son opcionalmente un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo o silicio, normalmente nitrógeno, oxígeno o azufre.

En algunas realizaciones, el inhibidor de NGlyl es una epoxicetona de Fórmula V

donde R⁷es una amina, amina sustituida, amida, amida sustituida, alquilo, incluidos los alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido, etc.

El cribado de fármacos se puede realizar utilizando un modelo in vitro, una célula o animal alterado genéticamente, o proteína NGlyl purificada para identificar inhibidores. Se puede utilizar una amplia variedad de análisis con este fin, incluidos los análisis de unión de proteína-proteína in vitro marcada, ensayos de cambio de movilidad electroforética, inmunoanálisis para unión de proteínas y similares. El término "agente", como se utiliza en el presente documento, describe cualquier molécula, p. ej., proteínas o productos farmacéuticos, con la capacidad de inhibir la función fisiológica de NGlyl. Generalmente, se procesa una pluralidad de mezclas de análisis en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de detección.

Los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de aproximadamente 2500 Dalton. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente puentes de hidrógeno, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden a menudo estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, incluidos los péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Los agentes candidatos se obtienen de una gran variedad de fuentes que incluyen bancos de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una gran variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. De forma alternativa, hay bancos de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales y se producen fácilmente. Adicionalmente, los bancos naturales o producidos sintéticamente y los compuestos se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden usarse para producir bancos combinatorios. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidación, etc. para producir análogos estructurales.

Cuando el análisis de cribado sea un análisis de unión o un análisis de actividad, una o más de las moléculas pueden estar unidas a un marcador, donde el marcador puede proporcionar directa o indirectamente una señal detectable. Varios marcadores incluyen radioisótopos, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, moléculas de unión específicas, partículas, p. ej., partículas magnéticas y similares. Las moléculas de unión específica incluyen pares, tañes como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de unión específicos, el miembro complementario normalmente se marcaría con una molécula que permita la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos.

Como ejemplo de un análisis adecuado, una proteína con un fenotipo detectable, incluida, sin limitación, una proteína fluorescente, se muta para plegarse incorrectamente y contener un sitio para la N-glucosilación. Después, la proteína solo se pliega correctamente tras la desglucosilación por NGly1. Por lo tanto, la inhibición de NGly1 produce una falta del fenotipo detectable. En una realización, la proteína plegada incorrectamente es una proteína fluorescente, tal como ddVenus.

Inhibidores del proteasoma. Los inhibidores directos del proteasoma se unen a un componente del proteasoma y bloquean de forma reversible o irreversible la actividad enzimática. Dichos inhibidores se conocen en la técnica y se utilizan clínicamente o están en proceso de ser probados en ensayos clínicos. Un experto en la materia entenderá que la clase de agentes se conoce en uso, y que los miembros específicos descritos a continuación son ilustrativos, pero no limitativos.

Los inhibidores directos del proteasoma incluyen bortezomib (BTZ; ácido [3-metil-1-(3-fenil-2-pirazin-2-ilcarbonilaminopropanoil)amino-butil]borónico), que es un derivado dipeptídico del ácido borónico que contiene ácido pirazinoico, fenilalanina y leucina con ácido borónico en su estructura. El BTZ es un inhibidor reversible del proteasoma 20S. El grupo de ácido borónico de BTZ se une y forma un complejo con el sitio activo del grupo hidroxilo de treonina en la subunidad p5, bloqueando la actividad similar a la quimotripsina del proteasoma. También se une a la subunidad p1 con menor afinidad, inhibiendo su actividad similar a la PGPH. Los estudios farmacodinámicos mostraron una inhibición dependiente de la dosis de la actividad del proteasoma por BTZ con dosis intravenosas que variaron de 0,13 y 2,0 mg/m2, produciéndose una inhibición máxima en el espacio de una hora después de la posología. Las indicaciones actualmente aprobadas incluyen mieloma múltiple y linfoma de mastocitos, y ha mostrado actividad contra la macroglobulinemia de Waldenstrom (MW); el linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG) y la leucemia mieloide aguda (LMA).

El BTZ se puede combinar con otras varias clases de fármacos utilizados en el tratamiento de las neoplasias hemáticas, incluidos los agentes alquilantes, las antraciclinas y los fármacos inmunomoduladores; por ejemplo, BTZ+DEX; BTZ melfalán DEX; BTZ DEX doxorrubicina pegilada; PAD; VDD; VTD; VMP; CyBorD, RVD; VTD-PACE; etc.

El carfilzomib (CFZ, también denominado PR-171, comercializado como Kyprolis®) es un inhibidor del proteosoma de la clase de las epoxicetonas peptídicas irreversibles. El resto a, p-epoxicetona interactúa tanto con el grupo hidroxilo como con el grupo a-amino libre de Thr1 en las subunidades p catalíticas del proteasoma, conduciendo a la formación del aducto de morfolino de manera irreversible. La unión irreversible de los inhibidores del proteosoma a base de epoxicetona conduce a una actividad más sostenida en comparación con el BTZ, ya que se requiere la síntesis de nuevas subunidades y el ensamblaje del proteasoma para restablecer la actividad del proteasoma. El CFZ inhibió la actividad del proteasoma en sangre y las CMSP de manera dependiente de la dosis, > 75 % de inhibición a 15 mg/m2 después de la primera dosis, y >90 % de inhibición después de cinco dosis. Las combinaciones incluyen, por ejemplo, CFZ, lenalidomida y DEX.

El ixazomib (MLN-9708) es un profármaco de éster borónico biodisponible por vía oral e inhibidor reversible del proteasoma. Actualmente se está probando en muchos ensayos clínicos en una amplia selección de indicaciones clínicas, incluidos el MM no tratado previamente, MM en recaída, tumores sólidos en estadio avanzado, leucemia linfoblástica, linfoma no Hodgkin y amiloidosis AL. El delanzomib (DLZ) es otro inhibidor del proteasoma de segunda generación, a base de boronato y de unión reversible, con biodisponibilidad tanto oral como intravenosa. El DLZ ha mostrado una actividad inhibidora del proteasoma similar a la de BTZ en estirpes celulares de tumores sólidos y hemáticos, así como en células primarias de pacientes con mieloma múltiple. El oprozomib (OPZ) es un inhibidor irreversible del proteasoma, a base de epoxicetona, peptídico biodisponible por vía oral que mostró una potencia similar a la del CFZ en los análisis de citotoxicidad. El marizomib es un inhibidor irreversible del proteosoma con una estructura principal de p-lactona. El grupo carbonilo de la p-lactona puede interactuar con el grupo hidroxilo de Thrl en subunidades p catalíticas, conduciendo a la formación de un aducto de éster de acilo. Este proceso es reversible, pero el aducto covalente solo se disocia a un ritmo muy lento. Además del enlace acil-éster, el marizomib también forma un anillo de tetrahidrofurano cíclico con el proteasoma, haciendo que la reacción sea irreversible.

El inhibidor específico del inmunoproteasoma 001 (IPSI-001) inhibe preferentemente la actividad del inmunoproteasoma 20Si (principalmente al unirse a la subunidad p 1i) sobre la actividad constitutiva del proteasoma 20S, suprimiendo potentemente la proliferación e induciendo la apoptosis en estirpes celulares de MM, así como en muestras de pacientes. ONX-0914 y PR-924 son inhibidores del inmunoproteasoma a base de epoxicetona peptídica, ambos capaces de inhibir selectiva e irreversiblemente la subunidad p5i. ONX-0914 es de 20 a 40 veces más selectivo hacia la subunidad p5i que las subunidades p5 y p1i.

En algunas realizaciones, cuando se combina con un inhibidor de Nglyl, la dosis de un inhibidor directo del proteasoma se reduce a un nivel que minimiza los efectos secundarios no deseados, p. ej., a una dosis que es hasta aproximadamente el 90 % de la dosis aprobada actualmente, hasta aproximadamente el 80 %, hasta aproximadamente el 70 %, hasta aproximadamente el 60 %, hasta aproximadamente el 50 %, hasta aproximadamente el 40 %, hasta aproximadamente el 30 %, hasta aproximadamente el 20 %, hasta aproximadamente el 10 %, hasta aproximadamente el 5 % de una dosis convencional. En algunas realizaciones, cuando se combina con un inhibidor de Nglyl, se reduce el número de dosis. Para algunos pacientes, los inhibidores del proteasoma provocan neuropatía periférica tóxica, que es uno de los efectos secundarios limitantes de estos tratamientos y que, por tanto, reduce su posible eficacia. Por ejemplo, la incidencia de la neuropatía inducida por el bortezomib es de aproximadamente el 30 60 %. Aunque los mecanismos neurotóxicos no se comprenden completamente, los estudios sugieren que la formación de agresomas, el estrés del retículo endoplásmico, la mitotoxicidad, la respuesta inflamatoria y el daño del ADN contribuyen a esta neurotoxicidad. En algunas realizaciones de la invención, se proporciona un método para tratar el cáncer con una combinación de un agente que inhibe la NGlyl y un inhibidor directo del proteasoma, donde la posología de los agentes en la combinación proporciona un tratamiento del cáncer con una reducción clínicamente significativa de los acontecimientos adversos neurológicos en relación con la posología requerida para un inhibidor directo del proteasoma en ausencia de un inhibidor de NGlyl.

En algunas realizaciones, se selecciona un individuo para el tratamiento con una combinación de un inhibidor de NGly1 y un inhibidor directo del proteosoma, donde el individuo fue tratado previamente con un inhibidor directo del proteosoma y se volvió resistente al inhibidor directo del proteosoma.

Un "paciente" para los fines de la presente invención incluye tanto seres humanos como otros animales, particularmente mamíferos, incluidos mascotas y animales de laboratorio, p. ej., ratones, ratas, conejos, etc. Por tanto, los métodos son aplicables tanto a la terapia humana como a aplicaciones veterinarias. En una realización, el paciente es un mamífero, preferentemente un primate. En otras realizaciones, el paciente es un ser humano.

Los términos "sujeto", "individuo", y "paciente" se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a un mamífero que se está evaluando para su tratamiento y/o en tratamiento. En una realización, el mamífero es un ser humano. Los términos "sujeto", "individuo", y "paciente" abarcan, sin limitación, individuos que tienen cáncer. Los sujetos pueden ser seres humanos, pero también incluyen otros mamíferos, particularmente los mamíferos útiles como modelos de laboratorio para enfermedades humanas, por ejemplo, ratón, rata, etc.

Los términos "cáncer", "neoplasia" y "tumor" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a células que presentan un crecimiento no regulado autónomo, de manera que presentan un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa de control de la proliferación celular. Las células de interés para la detección, el análisis o el tratamiento en la presente solicitud incluyen células precancerosas (p. ej., benignas), malignas, premetastásicas, metastásicas y no metastásicas. Se conocen cánceres de prácticamente todos los tejidos. La expresión "carga del cáncer" se refiere a la cantidad de células cancerosas o al volumen de cáncer de un sujeto. Por consiguiente, la reducción de la carga del cáncer se refiere a la reducción del número de células cancerosas o del volumen de cáncer en un sujeto. La expresión "célula cancerosa", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier célula que sea una célula cancerosa o que se obtenga de una célula cancerosa, p. ej., clon de una célula cancerosa.

Los expertos en la materia conocen muchos tipos de cánceres, entre los que se incluyen tumores sólidos tales como carcinomas, sarcomas, glioblastomas, melanomas, linfomas, mielomas, etc., y cánceres circulantes tales como leucemias. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer cervicouterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de cerebro.

Los cánceres hemáticos son de particular interés, es decir, cánceres de células de origen hemático tales como leucemias, linfomas y mielomas. Las leucemias agudas son leucemias que progresan rápidamente y se caracterizan por el reemplazo de la médula ósea normal por células blásticas de un clon que surge de la transformación maligna de una célula hematopoyética. Las leucemias agudas incluyen la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y la leucemia mielógena aguda (LMA). La LLA suele afectar al SNC, mientras que la leucemia monoblástica aguda afecta a las encías y la LMA a acumulaciones localizadas en cualquier sitio (sarcomas granulocíticos o cloromas).

La policitemia vera (PV) es un trastorno mieloproliferativo crónico idiopático caracterizado por un aumento en la concentración de Hb y la masa de GR (eritrocitosis). La PV se produce en aproximadamente 2,3/100.000 personas al año; siendo más frecuente en los varones (aproximadamente 1,4:1). El síndrome mielodisplásico (SMD) es un grupo de síndromes (preleucemia, anemias refractarias, leucemia mielocítica crónica de pH negativo, leucemia mielomonocítica crónica, metaplasia mieloide) comúnmente visto en pacientes mayores. Puede estar implicada la exposición a carcinógenos. El SMD se caracteriza por la proliferación clonal de células hematopoyéticas, incluidas las formas eritroides, mieloides y megacariocíticas. El clon del SMD es inestable y tiende a progresar a LMA.

Los linfomas no Hodgkin son un grupo heterogéneo de trastornos que implican la proliferación monoclonal maligna de células linfoides en sitios linforeticulares, incluidos los ganglios linfáticos, la médula ósea, el bazo, el hígado y el tracto Gl. En comparación con el linfoma de Hodgkin, existe una mayor probabilidad de que la enfermedad esté diseminada en el momento del diagnóstico. La mayoría (del 80 al 85 %) de los LNH surge de los linfocitos B; el resto surge de los linfocitos T o los linfocitos citolíticos naturales. Pueden participar células precursoras o células maduras. Existe una superposición entre la leucemia y el LNH, porque ambos implican la proliferación de linfocitos o sus precursores. Entre los linfomas, dentro de este grupo se encuentran: leucemia/linfoma linfoblástico B precursor; leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/linfoma microlinfocítico; leucemia prolinfocítica de linfocitos B; linfoma linfoplasmacítico; linfoma de linfocitos B de la zona marginal esplénica (± linfocitos vellosos); tricoleucemia; mieloma de células plasmáticas/plasmacitoma; linfoma de linfocitos B de la zona marginal extraganglionar del tipo MALT; linfoma de linfocitos B de la zona marginal ganglionar (± linfocitos B monocitoides); linfoma folicular; linfoma de células del manto; linfomas difusos de linfocitos B grandes; linfoma de Burkitt; linfoma/leucemia linfoblástica de linfocitos T precursores; leucemia prolinfocítica de linfocitos T; leucemia linfocítica granular de linfocitos T; leucemia agresiva de linfocitos NK; linfoma/leucemia de linfocitos T del adulto (VLTH 1 positivo); linfoma de linfocitos NK/T extraganglional, tipo nasal; linfoma de linfocitos T de tipo enteropatía; linfoma hepatoesplénico de linfocitos T ^y-6; linfoma subcutáneo de linfocitos T tipo paniculitis; micosis fungoide/síndrome de Sézary; linfoma anaplásico de células grandes, de linfocitos T/nulos, tipo cutáneo primario; linfoma anaplásico de células grandes, de linfocitos T/nulos, tipo sistémico primario; linfoma periférico de linfocitos T, no caracterizado de otra manera; linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T.

La leucemia crónica generalmente se manifiesta como leucocitosis anormal con o sin citopenia en una persona asintomática. Los hallazgos y el abordaje difieren significativamente entre la leucemia linfocítica crónica (LLC) y la leucemia mielocítica crónica (LMC). El tipo más común de leucemia en el mundo occidental, la LLC incluye linfocitos neoplásicos defectuosos de aspecto maduro (casi siempre linfocitos B) con una esperanza de vida anormalmente larga. La sangre periférica, la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos padecen infiltración leucémica.

El mieloma múltiple es un cáncer de las células plasmáticas que producen inmunoglobulina monoclonal e invaden y destruyen el tejido óseo adyacente. Las manifestaciones comunes incluyen dolor de huesos, insuficiencia renal, hipercalcemia, anemia e infecciones recurrentes. El diagnóstico requiere la demostración de la presencia de proteína M (a veces presente en la orina y no en el suero) y lesiones óseas líticas, proteinuria de cadena ligera o exceso de células plasmáticas en la médula. Por lo general, se necesita una biopsia de médula ósea. El tratamiento actual puede incluir quimioterapia convencional con la adición de bortezomib, lenalidomida, talidomida, corticosteroides y dosis altas de melfalán, seguida de trasplante autólogo de células madre de sangre periférica.

La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, un crecimiento celular anormal o incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anormales, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como ganglios linfáticos, etc.

Como se utilizan en el presente documento, las expresiones "recurrencia del cáncer" y "recurrencia del tumor", y las variantes gramaticales de las mismas, se refieren a un mayor crecimiento de células neoplásicas o cancerosas después del diagnóstico de cáncer. Particularmente, la recurrencia puede ocurrir cuando se produce un mayor crecimiento de células cancerosas en el tejido canceroso. La "diseminación del tumor", de forma similar, se produce cuando las células de un tumor se diseminan hacia el interior de tejidos y órganos locales o distantes; por lo tanto, la diseminación del tumor abarca la metástasis del tumor. La "invasión del tumor" se produce cuando el crecimiento del tumor se disemina localmente para comprometer la función de los tejidos afectados por compresión, destrucción o prevención de la función normal de los órganos.

Como se utiliza en el presente documento, el término "metástasis" se refiere al crecimiento de un tumor canceroso en un órgano o una parte del cuerpo, que no está directamente conectado al órgano del tumor canceroso original. Se entenderá que metástasis incluye micrometástasis, que es la presencia de una cantidad indetectable de células cancerosas en un órgano o parte del cuerpo que no está directamente conectada al órgano del tumor canceroso original. La metástasis también se puede definir como varias etapas de un proceso, tales como la salida de las células cancerosas del sitio del tumor original y la migración y/o invasión de las células cancerosas a otras partes del cuerpo.

El término "muestra" con respecto a un paciente engloba sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejido o células obtenidas de los mismos, y la progenie de las mismas. La definición también incluye muestras que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos; lavadas; o enriquecimiento en determinadas poblaciones celulares, tales como células cancerosas. La definición también incluye muestras que han sido enriquecidas en tipos particulares de moléculas, p. ej., ácidos nucleicos, polipéptidos, etc. La expresión "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero y similares. Una "muestra biológica" incluye una muestra obtenida de una célula cancerosa de un paciente, p. ej., una muestra que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos que se obtiene de una célula cancerosa de un paciente (p. ej., un lisado celular u otro extracto celular que comprende polinucleótidos y/o polipéptidos); y una muestra que comprende células cancerosas de un paciente. Una muestra biológica que comprende una célula cancerosa de un paciente también puede incluir células no cancerosas.

El término "diagnóstico" se utiliza en el presente documento para referirse a la identificación de un estado molecular o patológico, enfermedad o afección, tal como la identificación de un subtipo molecular de cáncer de mama, cáncer de próstata u otro tipo de cáncer.

El término "pronóstico" se utiliza en el presente documento para referirse a la predicción de la probabilidad de muerte o progresión atribuible al cáncer, que incluye la recurrencia, propagación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como el cáncer de ovario. El término "predicción" se utiliza en el presente documento para referirse al acto de predecir o estimar, basándose en la observación, experiencia o razonamiento científico. En un ejemplo, un médico puede predecir la probabilidad de que un paciente sobreviva, después de la extirpación quirúrgica de un tumor primario y/o quimioterapia durante un cierto período de tiempo sin recurrencia del cáncer.

Como se utilizan en el presente documento, los términos "tratamiento", "que trata", y similares, se refieren a la administración de un agente o a la realización de un procedimiento, con el fin de obtener un efecto. El efecto puede ser profiláctico en lo referente a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en lo referente a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o síntomas de la enfermedad. "Tratamiento", como se utiliza en el presente documento, puede incluir el tratamiento de un tumor en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) evitar que la enfermedad o un síntoma de una enfermedad aparezca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que aún no ha sido diagnosticado por tenerla (p. ej., incluidas las enfermedades que pueden asociarse con o estar provocadas por una enfermedad principal; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad. Una dosis eficaz para tratar el cáncer incluye el agotamiento o la reducción de células cancerosas viables debido a la actividad del agente para inducir la apoptosis u otras formas de muerte celular.

El tratamiento puede referirse a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora o prevención de un cáncer, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo, tal como atenuación; remisión; disminución de los síntomas o hacer que la enfermedad sea más tolerable para el paciente; ralentización de la tasa de degeneración o disminución; o hacer que el criterio de valoración de degeneración sea menos debilitante. El tratamiento o mejora de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluidos los resultados de un examen realizado por un médico. Por consiguiente, el término "tratar" incluye la administración de los compuestos o agentes de la presente invención para prevenir o retrasar, para aliviar o detener o inhibir el desarrollo de los síntomas o afecciones asociadas con el cáncer u otras enfermedades. La expresión "efecto terapéutico" se refiere a la reducción, eliminación o prevención de la enfermedad, síntomas de la enfermedad o efectos secundarios de la enfermedad en el sujeto.

"Junto con", "politerapia" y "productos combinados" se refieren, en determinadas realizaciones, a la administración concurrente a un paciente de un primer tratamiento y los compuestos como se utilizan en el presente documento. Cuando se administran combinados, cada componente se puede administrar al mismo tiempo o de manera secuencial en cualquier orden en distintos momentos en el tiempo. Por tanto, cada componente se puede administrar por separado pero lo suficientemente cerca en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico deseado.

"Administración concomitante" de uno o más fármacos terapéuticos contra el cáncer con una composición farmacéutica de la presente invención significa la administración con el agente en el momento en que ambos agentes tendrán un efecto terapéutico. Dicha administración concomitante puede implicar la administración concurrente (es decir, al mismo tiempo), anterior o posterior del fármaco con respecto a la administración de un compuesto de la invención. Un experto habitual en la materia no tendría dificultad para determinar el momento apropiado, el orden y las dosis de administración para los fármacos y las composiciones particulares de la presente invención.

Como se utilizan en el presente documento, los criterios de valoración para el tratamiento del cáncer tendrán un significado conocido en la técnica y utilizado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU.

La supervivencia global se define como el tiempo desde la aleatorización hasta la muerte por cualquier causa, y se mide en la población por intención de tratar. La supervivencia se considera el criterio de valoración del cáncer más fiable, y cuando se pueden realizar estudios para evaluar adecuadamente la supervivencia, suele ser el criterio de valoración preferido. Este criterio de valoración es preciso y fácil de medir, documentado por la fecha de la muerte. El sesgo no es un factor en la medición del criterio de valoración. La mejora de la supervivencia debe analizarse como un análisis de riesgo-beneficio para evaluar el beneficio clínico. La supervivencia global puede evaluarse en estudios controlados aleatorizados. La demostración de una mejora estadísticamente significativa en la supervivencia global se puede considerar clínicamente significativa si el perfil de toxicidad es aceptable y, a menudo, ha respaldado la aprobación de nuevos fármacos. Un beneficio de los métodos de la invención puede incluir una mayor supervivencia global de los pacientes.

Los criterios de valoración que se basan en evaluaciones de tumores incluyen la SSE, TRO, THP, SSP y el tiempo transcurrido hasta el fracaso terapéutico (TFT). La recopilación y el análisis de datos sobre estos criterios de valoración dependientes del tiempo se basan en evaluaciones, cálculos y estimaciones indirectos (p. ej., mediciones de los tumores). La supervivencia sin enfermedad (SSE) se define como el tiempo desde la aleatorización hasta la recurrencia del tumor o la muerte por cualquier causa. El uso más frecuente de este criterio de valoración es en el entorno adyuvante después de la cirugía definitiva o la radioterapia. La SSE también puede ser un criterio de valoración importante cuando un gran porcentaje de pacientes logra respuestas completas con quimioterapia.

Tasa de respuesta objetiva. La TRO se define como la proporción de pacientes con una reducción del tamaño del tumor de una cantidad predefinida y durante un período de tiempo mínimo. La duración de la respuesta generalmente se mide desde el momento de la respuesta inicial hasta la progresión documentada del tumor. Generalmente, la FDA ha definido la TRO como la suma de las respuestas parciales más las respuestas completas. Cuando se define de esta manera, la TRO es una medida directa de la actividad antitumoral del fármaco, que puede evaluarse en un estudio de un solo grupo.

Tiempo hasta la progresión y la supervivencia sin progresión. El THP y la SSP han servido como criterios principales de valoración para la aprobación de fármacos. El THP se define como el tiempo desde la aleatorización hasta la progresión objetiva del tumor; el THP no incluye las muertes. La SLP se define como el tiempo desde la aleatorización hasta la progresión objetiva del tumor o la muerte.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "se correlaciona", o "se correlaciona con", y las expresiones semejantes, se refieren a una asociación estadística entre casos de dos acontecimientos, donde los acontecimientos incluyen números, conjuntos de datos y similares. Por ejemplo, cuando los acontecimientos implican números, una correlación positiva (también denominada en el presente documento "correlación directa") significa que a medida que uno aumenta, el otro también aumenta. Una correlación negativa (también denominada en el presente documento como "correlación inversa") significa que a medida que uno aumenta, el otro disminuye.

"Unidad posológica" o "dosis unitaria" se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para el paciente que se va a tratar en particular. Cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto(s) activo(s) calculada para producir el(los) efecto(s) terapéutico(s) deseado(s) en asociación con el portador farmacéutico necesario. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención puede dictarse por (a) las características únicas del (los) compuesto(s) activo(s) y el(los) efecto(s) terapéutico(s) a conseguir y (b) por las limitaciones intrínsecas en la técnica de la composición de dicho(s) compuesto(s) activo(s).

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico en seres humanos. Dichos excipientes pueden ser un sólido, líquido, semisólido o, en caso de una composición en aerosol, gaseoso.

Por "sales y ésteres farmacéuticamente aceptables" se entiende las sales y los ésteres que son farmacéuticamente aceptables y que tienen las propiedades farmacológicas deseadas. Dichas sales incluyen las que pueden formarse cuando los protones ácidos presentes en los compuestos son capaces de reaccionar con bases inorgánicas u orgánicas. Las sales inorgánicas adecuadas incluyen las formadas con los metales alcalinos, p. ej., sodio y potasio, magnesio, calcio y aluminio. Las sales orgánicas adecuadas incluyen las formadas con bases orgánicas tales como bases de amina, p. ej., etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares. Dichas sales también incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácidos clorhídrico y bromhídrico) y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico y ácidos alcano y arenosulfónicos tales como ácido metanosulfónico y ácido bencenosulfónico). Los ésteres farmacéuticamente aceptables incluyen ésteres formados a partir de grupos carboxi, sulfoniloxi y fosfonoxi presentes en los compuestos, p. ej., ésteres de alquilo C¹-⁶. Cuando hay dos grupos ácidos presentes, una sal o un éster farmacéuticamente aceptable puede ser un mono-ácido-mono-sal o éster o una di-sal o éster; y de manera similar donde hay más de dos grupos ácidos presentes, algunos o todos de tales grupos pueden estar salificados o esterificados. Los compuestos nombrados en esta invención pueden estar presentes en forma no salificada o no esterificada, o en forma salificada y/o esterificada, y la denominación de tales compuestos está destinada a incluir tanto el compuesto original (no salificado y no esterificado) y sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables. Asimismo, determinados compuestos nombrados en esta invención pueden estar presentes en más de una forma estereoisomérica, y la denominación de dichos compuestos pretende incluir todos los estereoisómeros simples y todas las mezclas (ya sean racémicas o de otro tipo) de dichos estereoisómeros.

Las expresiones "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de las mismas, que se refieren a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se utilizan indistintamente y representan que los materiales pueden administrarse a un ser humano o sobre él sin la producción de efectos fisiológicos indeseables en un grado que prohibiría la administración de la composición.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad.

Además de los inhibidores del proteasoma, un paciente con cáncer también se puede tratar con modalidades de tratamiento adicionales, entre las que se incluyen la cirugía, radioterapia o quimioterapia. Los agentes quimioterápicos incluyen, sin limitación, agentes alquilantes, antraciclinas, fármacos inmunomoduladores, corticoesteroides, alcaloides de la vinca, taxanos, epipodofilotoxinas, antraciclinas, actinomicina, etc. Las antraciclinas incluyen clorhidrato de daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina, cerubidina), doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina y mitoxantrona. Los alquiloides de la vinca son una clase de fármacos derivados originalmente de la planta de la vinca e incluyen vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina. Los taxanos son diterpenos, entre los que se incluyen el paclitaxel y el docetaxel. Las epipodofilotoxinas son alcaloides naturales y sus derivados. Los derivados de epipodofilotoxina utilizados actualmente en el tratamiento del cáncer incluyen etopósido, tenipósido. Los alcaloides de quinolina incluyen camptotecina, SN-38, DX-8951f, topotecán, 9-aminocamptotequina, BN 80915, irinotecán, DB 67, BNP 1350, exatecán, lurtotecán, ST 1481 y CKD 602. Otros productos naturales incluyen azatioprina; brequinar; bisciclopéptidos de fenoxizona, por ejemplo, dactinomicina; glucopéptidos básicos, por ejemplo, bleomicina; glucósidos de antraquinona, p. ej., plicamicina (mitramicina); antracenodionas, por ejemplo, mitoxantrona; azirinopirrolo indoldionas, por ejemplo, mitomicina; inmunosupresores macrocíclicos, por ejemplo, ciclosporina, FK-506 (tacrolimus, prograf), rapamicina, etc.; y similares. Otros agentes quimioterápicos incluyen complejos metálicos, p. ej., cisplatino (cis-DDP), carboplatino, etc.; ureas, p. ej., hidroxiurea; e hidrazinas, p. ej., N-metilhidrazina. Los retinoides, p.ej., vitamina a, ácido 13-cis-retinoico, ácido trans-retinoico, isotretinoína, etc.; carotenoides, p. ej., betacaroteno, vitamina D, etc.

Otras politerapias incluyen la administración con anticuerpos específicos de células o anticuerpos inmunorreguladores tales como inhibidores de puntos de control, por ejemplo, anticuerpos selectivos de marcadores de células tumorales, radiación, cirugía y/o privación hormonal (Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE-UU., 96: 15074-9, 1999). Varios anticuerpos se encuentran actualmente en uso clínico para el tratamiento del cáncer, y otros se encuentran en diversas etapas de desarrollo clínico. Por ejemplo, anti-CD20 (rituximab); anti-CD52 (alemtuzumab); anti-CD22, etc. El alemtuzumab (Campath) se utiliza en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica; el gemtuzumab (Mylotarg) encuentra uso en el tratamiento de la leucemia mielógena aguda; el ibritumomab (Zevalin) encuentra uso en el tratamiento del linfoma no Hodgkin; el panitumumab (Vectibix) encuentra uso en el tratamiento del cáncer de colon. Los anticuerpos monoclonales que se han utilizado en tumores sólidos incluyen, sin limitación, edrecolomab y trastuzumab (herceptina). El edrecolomab se dirige al antígeno 17-1A que se observa en el cáncer de colon y recto. El trastuzumab se dirige al antígeno HER-2/neu. El cetuximab (Erbitux) se une al receptor EGF (EGFR) y se ha utilizado en el tratamiento de los carcinomas.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "que tiene la fórmula" o "que tiene la estructura" no pretende ser limitante, y se utiliza de la misma manera en la que se utiliza la expresión "que comprende". La expresión "seleccionado independientemente entre" se utiliza en el presente documento para indicar que los elementos enumerados, p. ej., los grupos R o similares, pueden ser idénticos o diferentes.

Como se utilizan en el presente documento, los términos "puede", "opcional", "opcionalmente", u "opcionalmente puede" significan que la circunstancia descrita a continuación puede darse o no, de modo que la descripción incluye casos en los que tiene lugar la circunstancia y casos en los que no. Por ejemplo, la expresión "opcionalmente sustituido" significa que un sustituyente distinto de hidrógeno puede o no estar presente en un átomo dado, y, por tanto, la descripción incluye estructuras en las que está presente un sustituyente distinto de hidrógeno y estructuras en las que no está presente un sustituyente distinto de hidrógeno.

El término "alquilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado ramificado o no ramificado (es decir, un monorradical) que normalmente, aunque no necesariamente, contiene de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, octilo, decilo y similares, así como grupos cicloalquilo tales como ciclopentilo, ciclohexilo y similares. Generalmente, aunque no necesariamente, los grupos alquilo del presente documento pueden contener de 1 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y dichos grupos pueden contener de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono. El término "alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. "Alquilo sustituido" se refiere a alquilo sustituido con uno o más grupos sustituyentes, y esto incluye los casos en donde se reemplazan dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono en un sustituyente alquilo, tal como en un grupo carbonilo (es decir, un grupo alquilo sustituido puede incluir un resto -C(=O)-). La expresión "alquilo que contiene heteroátomos" y el término "heteroalquilo" se refieren a un sustituyente alquilo en el que al menos un átomo de carbono se reemplaza por un heteroátomo, como se describe con más detalle a continuación. Si no se indica lo contrario, el término "alquilo" y la expresión "alquilo inferior" incluyen alquilo o alquilo inferior lineal, ramificado, cíclico, no sustituido, sustituido y/o que contiene heteroátomos, respectivamente.

El término "alquenilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo hidrocarbonado lineal, ramificado o cíclico de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono que contiene al menos un doble enlace, tal como etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-butenilo, isobutenilo, octenilo, decenilo, tetradecenilo, hexadecenilo, eicosenilo, tetracosenilo y similares. Generalmente, aunque de nuevo no necesariamente, los grupos alquenilo del presente documento pueden contener de 2 a aproximadamente 18 átomos de carbono y, por ejemplo, pueden contener de 2 a 12 átomos de carbono. La expresión "alquenilo inferior" se refiere a un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono. La expresión "alquenilo sustituido" se refiere a alquenilo sustituido con uno o más grupos sustituyentes, y la expresión "alquenilo que contiene heteroátomos" y el término "heteroalquenilo" se refieren a alquenilo en el que al menos un átomo de carbono está reemplazado por un heteroátomo. Si no se indica lo contrario, el término "alquenilo" y la expresión "alquenilo inferior" incluyen alquenilo y alquenilo inferior lineal, ramificado, cíclico, no sustituido, sustituido y/o que contiene heteroátomos, respectivamente.

El término "alquinilo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo hidrocarbonado lineal o ramificado de 2 a 24 átomos de carbono que contiene al menos un triple enlace, tal como etinilo, n-propinilo y similares. Generalmente, aunque de nuevo no necesariamente, los grupos alquinilo del presente documento pueden contener de 2 a aproximadamente 18 átomos de carbono, y dichos grupos pueden contener además de 2 a 12 átomos de carbono. La expresión "alquinilo inferior" se refiere a un grupo alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono. La expresión "alquinilo sustituido" se refiere a alquinilo sustituido con uno o más grupos sustituyentes, y la expresión "alquinilo que contiene heteroátomos" y el término "heteroalquinilo" se refieren a alquinilo en el que al menos un átomo de carbono está reemplazado por un heteroátomo. Si no se indica lo contrario, el término "alquinilo" y la expresión "alquinilo inferior" incluyen alquinilo y alquinilo inferior lineal, ramificado, no sustituido, sustituido y/o que contiene heteroátomos, respectivamente.

El término "alcoxi", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo unido a través de un solo enlace de éter terminal; es decir, un grupo "alcoxi" se puede representar como -O-alquilo, donde alquilo es como se ha definido anteriormente. Un grupo "alcoxi inferior" se refiere a un grupo alcoxi que contiene de 1 a 6 átomos de carbono e incluye, por ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, t-butiloxi, etc. Los sustituyentes identificados como "alcoxi C1-C6" o "alcoxi inferior" en el presente documento pueden, por ejemplo, contener de 1 a 3 átomos de carbono, y como ejemplo adicional, dichos sustituyentes pueden contener 1 o 2 átomos de carbono (es decir, metoxi y etoxi).

El término "arilo", como se utiliza en el presente documento, y a menos que se especifique lo contrario, generalmente se refiere a un sustituyente aromático, aunque no necesariamente, que contiene de 5 a 30 átomos de carbono y que contiene un solo anillo aromático o múltiples anillos aromáticos que están condensados entre sí, enlazados directamente o enlazados indirectamente (de manera que los diferentes anillos aromáticos estén enlazados a un grupo común como un resto metileno o etileno). Los grupos arilo pueden, por ejemplo, contener de 5 a 20 átomos de carbono, y como ejemplo adicional, los grupos arilo pueden contener de 5 a 12 átomos de carbono. Por ejemplo, los grupos arilo pueden contener un anillo aromático, o dos o más anillos aromáticos condensados o unidos (es decir, biarilo, arilo sustituido con arilo, etc.). Los ejemplos incluyen grupos fenilo, naftilo, bifenilo, difeniléter, difenilamina, benzofenona y similares. "Arilo sustituido" se refiere a un resto arilo sustituido con uno o más grupos sustituyentes, y la expresión "arilo que contiene heteroátomos" y el término "heteroarilo" se refieren a sustituyentes arilo, en los que al menos un átomo de carbono se reemplaza por un heteroátomo, como se describirá con más detalle a continuación. Se pretende que arilo incluya restos C3-C14 insaturados cíclicos, heterocíclicos, policíclicos y poliheterocíclicos estables, por ejemplo, pero sin limitación, fenilo, bifenilo, naftilo, piridilo, furilo, tiofenilo, imidazoilo, pirimidinilo y oxazoilo; que además puede estar sustituido con uno a cinco miembros seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi C¹-Ca, alquilo C-i-Ca ramificado o de cadena lineal, aciloxi, carbamoílo, amino, N-acilamino, nitro, halógeno, trifluorometilo, ciano y carboxilo (véase, por ejemplo, Katritzky, "Handbook of Heterocyclic Chemistry"). Si no se indica lo contrario, el término "arilo" incluye sustituyentes aromáticos no sustituidos, sustituidos y/o que contienen heteroátomos.

El término "aralquilo" se refiere a un grupo alquilo con un sustituyente arilo, y el término "alcarilo" se refiere a un grupo arilo con un sustituyente alquilo, en donde "alquilo" y "arilo" son como se han definido anteriormente. En general, en el presente documento, los grupos aralquilo y alcarilo contienen de 6 a 30 átomos de carbono. Los grupos aralquilo y alcarilo pueden, por ejemplo, contener de 6 a 20 átomos de carbono, y como ejemplo adicional, dichos grupos pueden contener de 6 a 12 átomos de carbono.

El término "alquileno", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo diradical. A menos que se indique de otra manera, dichos grupos incluyen cadenas hidrocarbonadas saturadas que contienen de 1 a 24 átomos de carbono, que pueden estar sustituidos o sin sustituir, pueden contener uno o más grupos alicíclicos y pueden contener heteroátomos. "Alquileno inferior" se refiere a enlaces alquileno que contienen de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos incluyen, metileno (--CH2-), etileno (--CH2CH2--), propileno (--CH2CH2CH2"), 2-metilpropileno (-CH2-CH(CH3)-CH2-), hexileno (-(CH2)6-) y similares.

De forma similar, el término "alquenileno", "alquinileno", "arileno", "aralquileno", y "alcarileno", como se utiliza en el presente documento, se refiere a grupos alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo y alcarilo de dos radicales, respectivamente.

El término "amino" se utiliza en el presente documento para referirse al grupo -NRR', en donde R y R' son independientemente sustituyentes hidrógeno o distintos de hidrógeno, incluyendo los sustituyentes distintos de hidrógeno, por ejemplo, alquilo, arilo, alquenilo, aralquilo, y sus variantes sustituidas y/o que contienen heteroátomos.

Los términos "halo" y "halógeno" se utilizan en el sentido convencional para referirse a un sustituyente cloro, bromo, flúor o yodo.

La expresión "que contiene heteroátomos" como en un "grupo alquilo que contiene heteroátomos" (también denominado grupo "heteroalquilo") o un "grupo arilo que contiene heteroátomos" (también denominado grupo "heteroarilo") se refiere a una molécula, un enlace o un sustituyente en el que uno o más átomos de carbono se reemplazan por un átomo distinto del carbono, p. ej., nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo o silicio, normalmente nitrógeno, oxígeno o azufre. De forma similar, el término "heteroalquilo" se refiere a un sustituyente alquilo que contiene heteroátomos, los términos "heterocíclico" o "heterociclo" se refieren a un sustituyente cíclico que contiene heteroátomos, los términos "heteroarilo" y "heteroaromático" se refieren respectivamente a sustituyentes "arilo" y "aromáticos" que contienen heteroátomos, y similares. Los ejemplos de grupos heteroalquilo incluyen alcoxiarilo, alquilo sustituido con alquilsulfanilo, aminoalquilo N-alquilado y similares. Los ejemplos de sustituyentes heteroarilo incluyen pirrolilo, pirrolidinilo, piridinilo, quinolinilo, indolilo, furilo, pirimidinilo, imidazolilo, 1,2,4-triazolilo, tetrazolilo, etc., y los ejemplos de grupos alicíclicos que contienen heteroátomos son pirrolidino, morfolino, piperazino, piperidino, tetrahidrofuranilo, etc.

Como se utilizan en el presente documento, los términos "heterociclo", "heterocíclico", "heterocicloalquilo", y "heterociclilo" se refieren a un grupo saturado o insaturado que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados, que incluyen sistemas de anillos condensados y espiro, y que tienen de 3 a 15 átomos en el anillo, incluyendo de 1 a 4 heteroátomos. Estos átomos de anillo se seleccionan entre el grupo que consiste en nitrógeno, azufre u oxígeno, en donde, en los sistemas de anillos condensados, uno o más de los anillos pueden ser cicloalquilo, arilo o heteroarilo, a condición de que el punto de unión sea a través del anillo no aromático. En determinadas realizaciones, el átomo o los átomos de nitrógeno y/o azufre del grupo heterocíclico se oxidan opcionalmente para proporcionar los restos N-óxido, -S(O)- o -SO²-.

Los ejemplos de heterociclo y heteroarilo incluyen, pero sin limitación, azetidina, pirrol, imidazol, pirazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, dihidroindol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftilpiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, fenantrolina, isotiazol, fenazina, isoxazol, fenoxazina, fenotiazina, imidazolidina, imidazolina, piperidina, piperazina, indolina, ftalimida, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 4,5,6,7-tetrahidrobenzo[b]tiofeno, tiazol, tiazolidina, tiofeno, benzo[b]tiofeno, morfolinilo, tiomorfolinilo (también denominado tiamorfolinilo), 1,1-dioxotiomorfolinilo, piperidinilo, pirrolidina, tetrahidrofuranoílo y similares.

A menos que queden limitados de otro modo por la definición para el sustituyente heterocíclico, dichos grupos heterocíclicos pueden estar opcionalmente sustituidos con de 1 a 5 o de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados entre alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxilalquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO²-alquilo, -SO²-alquilo sustituido, -SO²-arilo, -SO²-heteroarilo y heterociclo condensado.

"Hidrocarbilo" se refiere a radicales hidrocarbilo univalentes que contienen de 1 a aproximadamente 30 átomos de carbono, incluido de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, incluido además de 1 a aproximadamente 18 átomos de carbono, e incluido además de aproximadamente 1 a 12 átomos de carbono, incluidas especies lineales, ramificadas, cíclicas, saturadas e insaturadas, tales como grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos arilo y similares. Un hidrocarbilo puede estar sustituido con uno o más grupos sustituyentes. La expresión "hidrocarbilo que contiene heteroátomos" se refiere a hidrocarbilo en el que al menos un átomo de carbono está reemplazado por un heteroátomo. A menos que se indique de otra manera, el término "hidrocarbilo" debe interpretarse como que incluye restos hidrocarbilo sustituidos y/o que contienen heteroátomos.

"Sustituido" como en "hidrocarbilo sustituido", "alquilo sustituido", "arilo sustituido", y similares, como se alude en algunas de las definiciones mencionadas anteriormente, significa que, en el hidrocarbilo, alquilo, arilo u otro resto, al menos un átomo de hidrógeno unido a un átomo de carbono (u otro) se reemplaza por uno o más sustituyentes distintos de hidrógeno. Los ejemplos de dichos sustituyentes incluyen, sin limitación, grupos funcionales y los restos hidrocarbilo alquilo C1-C24, (incluidos alquilo C1-C18, incluidos además alquilo C1-C12, e incluido además alquilo C1-C6), alquenilo C2-C24 (incluido alquenilo C2-C18, incluido además alquenilo C2-C12, e incluido además alquenilo C2-C6), alquinilo C2-C24 (incluido alquinilo C2-C18, incluido además alquinilo C2-C12, e incluido además alquinilo C2-C6), arilo C5-C30 (incluido arilo C5-C20 e incluido además arilo C5-C12) y aralquilo C6-C30 (incluido aralquilo C6-C20 e incluido además aralquilo C6-C12). Los restos hidrocarbilo mencionados anteriormente pueden sustituirse además por uno o más grupos funcionales o restos hidrocarbilo adicionales tales como los enumerados específicamente. A menos que se indique de otra manera, se ha de interpretar que cualquiera de los grupos descritos en el presente documento incluye restos sustituidos y/o que contienen heteroátomos, además de grupos no sustituidos.

La expresión "grupos funcionales" significa grupos químicos tales como halo, hidroxilo, sulfhidrilo, alcoxi C1-C24, alqueniloxi C2-C24, alquiniloxi C2-C24, ariloxi C5-C20, acilo (incluidos alquilcarbonilo C2-C24 (-CO-alquilo) y arilcarbonilo C6-C20 (-CO-arilo)), aciloxi (-O-acilo), alcoxicarbonilo C2-C24 (-(CO)-O-alquilo), ariloxicarbonilo C6-C20 (-(CO)-O-arilo), halocarbonilo (-Co )-X, donde X es halo), alquilcarbonato C2-C24 (-O-(CO)-O-alquilo), arilcarbonato C6-C20 (-O-(CO)-O-arilo), carboxi (-COOH), carboxilato (-cOo -), carbamoilo (-(c O)-NH2), alquilcarbamoilo C1-C24 monosustituido (-(CO)-NH(alquilo C1-C24)), alquilcarbamoilo disustituido (-(cO)-N(alquilo C1-C24)2), arilcarbamoilo monosustituido (-(CO)-NH-arilo), tiocarbamoilo (-(CS)-NH2), carbamido (-NH-(Co )-NH2), ciano (-CEN), isociano (-N+EC-), cianato (-O-CEN), isocianato (-O-N+EC-), isotiocianato (-S-CEN), azido (-N=N+=N-), formilo (-(CO)-H), tioformilo (-(CS)-H), amino (-NH2), amino sustituido con mono- y di-(alquilo C1-C24), amino sustituido con mono- y di-(arilo C5-C20), alquilamido C2-C24 (-NH-(CO)-alquilo), arilamido C5-C20 (-NH-(cO)-arilo), imino (-CR=NH, donde R = hidrógeno, alquilo C1-C24, arilo C5-C20, alcarilo C6-C20, aralquilo C6-C20, etc.), alquilimino (-cR=N(alquilo), donde R = hidrógeno, alquilo, arilo, alcarilo, etc.), arilimino (-CR=N(arilo), donde R = hidrógeno, alquilo, arilo, alcarilo, etc.), nitro (-NO2), nitroso (-NO), sulfo (-SO2-OH), sulfonato (-SO2-O-), alquilsulfanilo C1-C24 (-S-alquilo; también denominado "alquiltio"), arilsulfanilo (-S-arilo; también denominado "ariltio"), alquilsulfinilo C1-C24 (-(SO)-alquilo), arilsulfinilo C5-C20 (-(So)-arilo), alquilsulfonilo C1-C24 (-SO2-alquilo), arilsulfonilo C5-C20 (-SO2-arilo), fosfono (-P(O)(OH)2), fosfonato (-P(o)(O-)2), fosfinato (-P(O)(O-)), fosfo (-PO2) y fosfino (-PH2), fosfino sustituido con mono- y di-(alquilo C1-C24), fosfina sustituida con mono- y di-(arilo C5-C20). Adicionalmente, los grupos funcionales mencionados anteriormente pueden, si un grupo en particular lo permite, estar además sustituidos con uno o más grupos funcionales adicionales o con uno o más restos hidrocarbilo tales como los enumerados específicamente con anterioridad.

"Enlace" o "enlazador" como en "grupo de unión", "resto enlazador", etc., significa un resto radical bivalente que conecta dos grupos a través de enlaces covalentes. Los ejemplos de dichos grupos de enlace incluyen alquileno, alquenileno, alquinileno, arileno, alcarileno, aralquileno, y restos de enlace que contienen grupos funcionales que incluyen, sin limitación: amido (-NH-CO-), ureileno (-NH-CO-NH-), imida (-Co -NH-CO-), epoxi (-O-), epitio (-S-), epidioxi (-O-O-), carbonildioxi (-O-CO-O-), alquildioxi (-O-(CH2)n-O-), epoxiimino (-O-NH-), epimino (-NH-), carbonilo (-CO-), etc. Se puede utilizar cualquier orientación y/o conexión conveniente de los enlazadores a los grupos enlazados.

Cuando el término "sustituido" aparece antes de una lista de posibles grupos sustituidos, se pretende que el término se aplique a cada miembro de ese grupo. Por ejemplo, la expresión "alquilo y arilo sustituidos" debe interpretarse como "alquilo sustituido y arilo sustituido".

En determinadas realizaciones, un sustituyente puede contribuir a la isomería óptica y/o a la estereoisomería de un compuesto. Las sales, los solvatos, los hidratos y las formas de profármaco de un compuesto también son de interés. Todas estas formas están abarcadas por la presente divulgación. Por lo tanto, los compuestos descritos en el presente documento incluyen sales, solvatos, hidratos, profármacos y formas isoméricas de los mismos, incluidas las sales, los solvatos, los hidratos, los profármacos y los isómeros farmacéuticamente aceptables de los mismos. En determinadas realizaciones, un compuesto puede metabolizarse en un derivado farmacéuticamente activo.

Salvo que se indique lo contrario, la referencia a un átomo pretende incluir isótopos de ese átomo. Por ejemplo, la referencia a H pretende incluir 1H, 2H (es decir, D) y 3H (es decir, T), y la referencia a C pretende incluir 12C y todos los isótopos de carbono (tales como 13C).

MÉTODOS DE USO

Se proporcionan métodos para tratar o reducir el cáncer primario o metastásico a través de la inhibición de las vías del factor de transcripción implicadas en la expresión del proteasoma. En particular, se proporcionan composiciones y métodos de uso de las mismas para la inhibición de la N-glucanasa 1 (NGlyl). La inhibición de NGlyl reduce la expresión del proteasoma. El inhibidor de NGlyl se puede utilizar como agente único o junto con un agente que inhiba directamente la actividad del proteasoma. La combinación de agentes puede proporcionar una mayor supervivencia global de un individuo que está recibido tratamiento para el cáncer. La combinación de agentes puede proporcionar un beneficio sinérgico en la eliminación de las células cancerosas, en relación con la administración como agente único. Dichos métodos incluyen administrar a un sujeto que necesita tratamiento combinaciones adicionales con un fármaco quimioterápico, radioterapia, etc.

En algunas realizaciones, un inhibidor de NGlyl tiene una estructura I, II o III, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el compuesto inhibe NGly1 y no inhibe la actividad de la caspasa. En algunas realizaciones, el inhibidor inhibe Ngly1 mecánicamente al inhibir el ataque nucleófilo de un resto de cisteína en el enlace amida entre la cadena lateral de asparagina de la proteína diana y el oligosacárido unido a N. En algunas realizaciones, se proporciona una formulación farmacéutica de un inhibidor de NGly1 con un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la formulación se proporciona en una formulación de dosis unitarias, proporcionando una dosis eficaz para reducir la expresión del proteasoma en una célula diana.

Composiciones

Las dosis eficaces de un inhibidor de Ngly1 para el tratamiento del cáncer, solo o junto con una dosis eficaz de un inhibidor directo del proteasoma, varían dependiendo de muchos factores diferentes, entre los que se incluyen el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Por lo general, el paciente es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, p. ej., animales de compañía (tales como perros, gatos, caballos, etc., mamíferos de laboratorio tales como conejos, ratones, ratas, etc., y similares. Las dosis de tratamiento se pueden ajustar para optimizar la seguridad y la eficacia.

En algunas realizaciones, la dosis terapéutica de cada agente puede variar de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,001, de aproximadamente 0,01, de aproximadamente 0,1 mg/kg; a aproximadamente 100 mg/kg, a aproximadamente 50 mg/kg, a aproximadamente 25 mg/kg, a aproximadamente 10 mg/kg. Un ejemplo de pauta posológica puede proporcionar la administración una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada 3 días, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes, etc., así como pautas intermedias. Las entidades terapéuticas de la presente invención normalmente se administran en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis únicas pueden ser diarios, semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según se indique midiendo los niveles en sangre de la entidad terapéutica en el paciente. De forma alternativa, las entidades terapéuticas de la presente invención se pueden administrar como una formulación de liberación prolongada, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La posología y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente.

En aplicaciones profilácticas, se puede administrar una posología relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuentes durante un período de tiempo prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En otras aplicaciones terapéuticas, en ocasiones es necesaria una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine y preferentemente hasta que el paciente muestre un alivio parcial o completo de los síntomas de la enfermedad. Después de ello, se puede administrar al paciente una pauta profiláctica.

Aún en otras realizaciones, los métodos de la presente invención incluyen el tratamiento, la reducción o la prevención del crecimiento del tumor, la metástasis tumoral o la invasión tumoral de los cánceres. Para aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos se administran a un paciente susceptible o con riesgo de contraer una enfermedad en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retardar la aparición de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad.

Las composiciones para el tratamiento del cáncer pueden administrarse por vía parenteral, tópica, intravenosa, intratumoral, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal, medios intranasales o intramusculares. Una vía típica de administración es la intravenosa o intratumoral, aunque otras vías pueden ser igualmente eficaces.

Las composiciones se pueden preparar en forma de inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, tal como se ha explicado anteriormente. Langer, Science 249: 1527, 1990 y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Los agentes de la presente invención se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que se puede formular de tal forma que permita una liberación prolongada o pulsátil del principio activo. Las composiciones farmacéuticas generalmente se formulan como estériles, sustancialmente isotónicas y en total cumplimiento con todas las normas de las prácticas correctas de fabricación (PCF) de la Administración de Fármacos y Alimentos de Estados Unidos.

El término "aislado" significa que el material se extrae de su entorno original (p. ej., el entorno natural si es natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y seguir estando aislados en el sentido de que dicho vector o composición no forme parte de su entorno natural.

Por "sales y ésteres farmacéuticamente aceptables" se entiende las sales y los ésteres que son farmacéuticamente aceptables y que tienen las propiedades farmacológicas deseadas. Dichas sales incluyen las que pueden formarse cuando los protones ácidos presentes en los compuestos son capaces de reaccionar con bases inorgánicas u orgánicas. Las sales inorgánicas adecuadas incluyen las formadas con los metales alcalinos, p. ej., sodio y potasio, magnesio, calcio y aluminio. Las sales orgánicas adecuadas incluyen las formadas con bases orgánicas tales como bases de amina, p. ej., etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares. Dichas sales también incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácidos clorhídrico y bromhídrico) y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico y ácidos alcano y arenosulfónicos tales como ácido metanosulfónico y ácido bencenosulfónico). Los ésteres farmacéuticamente aceptables incluyen ésteres formados a partir de grupos carboxi, sulfoniloxi y fosfonoxi presentes en los compuestos, p. ej., ésteres de alquilo C^1-6. Cuando hay dos grupos ácidos presentes, una sal o un éster farmacéuticamente aceptable puede ser un mono-ácido-mono-sal o éster o una di-sal o éster; y de manera similar donde hay más de dos grupos ácidos presentes, algunos o todos de tales grupos pueden estar salificados o esterificados. Los compuestos nombrados en esta invención pueden estar presentes en forma no salificada o no esterificada, o en forma salificada y/o esterificada, y la denominación de tales compuestos está destinada a incluir tanto el compuesto original (no salificado y no esterificado) y sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables. Asimismo, determinados compuestos nombrados en esta invención pueden estar presentes en más de una forma estereoisomérica, y la denominación de dichos compuestos pretende incluir todos los estereoisómeros simples y todas las mezclas (ya sean racémicas o de otro tipo) de dichos estereoisómeros.

La toxicidad de los agentes combinados descritos en el presente documento se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, p. ej., determinando la DL⁵⁰(la dosis letal para el 50 % de la población) o la DL¹⁰⁰(la dosis letal para el 100 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo posológico que no es tóxico para su uso en seres humanos. La dosis de las proteínas descritas en el presente documento se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La posología puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la posología pueden ser elegidas por el médico individual a la vista del estado del paciente.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas farmacéuticas unitarias en función del método de administración. Por ejemplo, las formas farmacéuticas unitarias adecuadas para su administración por vía oral incluyen, pero sin limitación, polvo, comprimidos, pastillas, cápsulas y pastillas para chupar. Se reconoce que las composiciones de la invención, cuando se administran por vía oral, se deberían de proteger de la digestión. Esto normalmente se logra ya sea formando complejos con las moléculas con una composición que las haga resistentes a la hidrólisis ácida y enzimática, o empaquetando las moléculas en un portador resistente adecuado, tal como un liposoma o una barrera de protección. Los medios para proteger a los agentes de la digestión son bien conocidos en la técnica.

Las composiciones para la administración comprenderán comúnmente un anticuerpo u otro agente ablativo disuelto en un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente un portador acuoso. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, p. ej., solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de materia no deseada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias adyuvantes farmacéuticamente aceptables necesarias para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y tampón, agentes de ajuste de la toxicidad, y similares, p. ej., acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de principio activo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades, el peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente (p. ej., "Remington's Pharmaceutical Science" (15.° ed., 1980) y Goodman y Gillman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics" (Hardman et al., eds., 1996)).

También están dentro del alcance de la invención los kits que comprenden un inhibidor de Ngly1 e instrucciones de uso. El inhibidor de NGlyl se puede proporcionar en una formulación de dosis unitaria con un portador farmacéuticamente aceptable. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, p. ej., una dosis eficaz de un inhibidor directo del proteasoma, etc. Los kits incluyen normalmente un texto informativo que indica el uso pretendido de los contenidos del kit. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompaña al kit.

Las composiciones pueden administrarse para el tratamiento terapéutico. Las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para eliminar sustancialmente las células diana, como se ha descrito anteriormente. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz", que puede proporcionar una mejora en las tasas de supervivencia global. Se pueden administrar administraciones únicas o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosis y la frecuencia según lo requiera y tolere el paciente. La dosis particular requerida para un tratamiento dependerá de la afección y de los antecedentes del mamífero, así como de otros factores tales como la edad, el peso, el sexo, la vía de administración, la eficacia, etc.

Parte experimental

Ejemplo 1

Una posible limitación de la eficacia de los inhibidores del proteasoma se encuentra en el modo de acción del factor nuclear del factor de transcripción, el eritroide 2 de tipo 1 (NFE2L1, también denominado Nrf1). Nrf1 es un miembro de la familia de factores de transcripción bZIP "cap'n'collar" y es un regulador maestro de muchas vías metabólicas vitales, tales como el metabolismo de lípidos y aminoácidos, la transactivación de enzimas antioxidantes, la formación de hueso y el mantenimiento de la proteostasis. Es importante destacar que Nrf1 es el único regulador de la expresión génica de la subunidad proteasómica. Por tanto, Nrf1 es esencial para la viabilidad y la supervivencia celular.

Una característica única de Nrf1 es su propia regulación compleja. Poco común para los factores de transcripción, Nrf1 contiene múltiples sitios de N-glucosilación, y su activación procede a través de la vía de degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD, Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation). Comenzando su permanencia como una proteína plegada incorrectamente y N-glucosilada en el RE, Nrf1 se retrotransloca desde el RE hasta el citosol, donde es des-N-glucosilada y procesada proteolíticamente parcialmente por el homólogo 2 inducible por daños en el ADN de la aspartil proteasa 1 (DDI2). La forma p110 ahora activa de Nrf1 es capaz de translocarse en el núcleo y activar la expresión génica de la subunidad proteasómica.

En condiciones de proteostasis normal, Nrf1 se dirige de manera continua para la degradación proteasómica por retrotranslocación a través del complejo VCP/p97. La proteína se mantiene así a niveles bajos en condiciones basales. Sin embargo, en condiciones de un proteasoma afectado, tal como el tratamiento con inhibidores del proteasoma, Nrf1 des-N-glucosilado se acumula y ejerce sus funciones nucleares, incluidas la transactivación de genes de subunidades proteasómicas. Por tanto, se cree que Nrf1 media una respuesta de "recuperación" que mantiene los proteosomas a niveles que mantienen la proteostasis. Este modo de acción puede contrarrestar la inhibición eficaz del proteasoma por moléculas pequeñas en el tratamiento del cáncer. La inhibición de Nrf1 podría mejorar significativamente la eficacia de los inhibidores del proteasoma de molécula pequeña. Nrf1 por sí mismo no es una diana viable para los inhibidores, debido a su complejo procesamiento y constante degradación. Interferir en la vía de activación de Nrf1, sin embargo, proporciona un enfoque prometedor para potenciar la inhibición del proteasoma para el tratamiento del cáncer.

Es probable que la des-N-glucosilación de Nrf1 sea importante para su función. El análisis de la secuencia de la proteína muestra una arquitectura de dominios compleja que comprende un dominio "NST" N-glucosilado con posibles 7 N-glucositos que está flanqueado por ambos lados por dominios ácidos (AD1 y 2). Se ha especulado que la desglucosilación del dominio NST, con conversión concomitante de Asn a restos ácidos de Asp, crearía un dominio de transactivación funcional (TAD, TransActivating Domain) necesario para la activación de la transcripción. De hecho, la mutación de los posibles N-glucositos de Nrf1 de Asn a Asp mejoró su capacidad para activar la transcripción utilizando una construcción de gen indicador de luciferasa.

Esta observación, junto con el hallazgo de que la activación de Nrf1 implica el procesamiento de una especie de PM 120 a una especie desglucosilada de PM 110 tras la inhibición del proteasoma, sugirió que se requiere actividad de des-N-glucosilación para una función óptima de Nrf1.

La enzima responsable de la eliminación de N-glucanos en el citosol es la N-Glucanasa1 (NGly1). En el presente documento, se muestra que NGly1, participa en el procesamiento de Nrf1 y, en particular, es importante para su activación. NGly1 es una potente diana para los inhibidores de moléculas pequeñas, que puede prevenir la activación de Nrf1 y, por lo tanto, potenciar los tratamientos contra el cáncer basados en inhibidores del proteasoma al interrumpir las vías de rebote del proteasoma de Nrf1. Una combinación de inhibidores de NGly1 e inhibidores del proteasoma proporciona una estrategia más eficaz para el tratamiento del cáncer que los inhibidores del proteasoma solos.

Resultados y análisis:

se propone que NGly1 desempeña un papel central en el procesamiento y la activación del factor de transcripción Nrf1. La Figura 1A ilustra una vía de activación de Nrf1 propuesta que incluye la etapa necesaria de des-N-glucosilación por la enzima NGly1. Se investigó Nrf1 en presencia y ausencia de NGly1. Se trataron fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, Mouse Embryonic Fibroblasts) derivados de ratones NGly1'/_ (Tadashi Suzuki, Riken, Japón) con el inhibidor del proteasoma carfilzomib (Figura 1B) y se compararon con MEF WT que se trataron en las mismas condiciones. El análisis de inmunotransferencia reveló un procesamiento anormal de Nrf1 en células NGly1'/_ después del tratamiento con carfilzomib (Figura 1C).

En un segundo intento, se utilizaron células HEK con sobrexpresión de Nrf1 y se aplicó la molécula pequeña Z-VAD-fmk (Figura 1B) para inhibir NGly1 antes de tratar las células con carfilzomib. Se ha demostrado que Z-VAD-fmk también inhibe las caspasas, por lo tanto, se usó el potente inhibidor de pan-caspasa Q-VD-OPh, que no actúa sobre NGly1, como molécula de control. Las células tratadas con Z-VAD-fmk mostraron un procesamiento anormal de Nrf1, especialmente en presencia de carfilzomib. La mayor abundancia de la banda de p120 indica la existencia de la forma N-glucosilada de Nrf1 como especie principal en las células tratadas con Z-VAD-fmk. En cambio, las células tratadas con Q-VD-OPh mostraron un procesamiento similar de Nrf1 en comparación con las células no tratadas, con Nrf1 des-N-glucolisado (banda de p110) como la especie predominante después de la incubación con carfilzomib (Figura 1C). Por tanto, el procesamiento incorrecto de Nrf1 que se observó en las células tratadas con Z-VAD-fmk resulta de la inhibición de NGly1 y no de la inhibición de caspasa. Ambos experimentos revelan que se requiere NGly1 funcional para la des-N-glucosilación y, por lo tanto, el procesamiento correcto de Nfr1.

Sabiendo que NGly1 participa en el procesamiento de Nfr1, se determinó si se requiere la des-N-glucosilación para activar el factor de transcripción y, por lo tanto, la producción de subunidades proteasómicas. Según la teoría, la forma activa (p110) de Nrf1 que se transloca en el núcleo y activa los genes del proteasoma, se produce tras la eliminación de los N-glucanos. Mediante una construcción en la que se insertaron tres copias del elemento de respuesta antioxidante (ARE, Antioxidant Respond Element) del gen humano PSMA4 en dirección 5' de un promotor SV40 que impulsa la expresión de luciferasa de luciérnaga en un análisis de indicador de luciferasa doble, donde se utilizaron plásmidos que expresan luciferasa de Renilla como control interno de transfección, se comparó la actividad del indicador en MEF NGIy1'/_ y MEF WT después del tratamiento con carfilzomib. Las células WT mostraron un aumento en la actividad de PSM después de 12 horas de incubación con carfilzomib mientras que las células NGIy1'/_ no mostraron respuesta al tratamiento con inhibidores del proteasoma (Figura 2A).

Se concluye que las células NGIy1'/_ carecen de la forma activa de Nrf1 y, por lo tanto, no pueden responder con una reacción de rebote a la inhibición del proteasoma. Se realizó el mismo experimento en células HEK con sobreexpresión de Nrf1 en las que Z-VAD-fmk inhibió a NGly1 antes de la incubación con carfilzomib. El inhibidor de caspasa QVD-OPh sirvió como control para descartar que el efecto observado se debiera a la inhibición de la caspasa. Solo las células incubadas con Z-VAD-fmk no mostraron una mayor actividad indicadora, lo que indica que faltaba Nrf1 activo en esas células debido a la inhibición de NGly1 (Figura 2B).

Además, se utilizó microscopía confocal para visualizar la localización de Nrf1 en MEF y Nrf1 con sobrexpresión de células HEK antes y después del tratamiento con carfilzomib (Figura 2B y C). En ausencia de carfilzomib, los MEF WT y NGIy1'/_ muestran Nrf1 (en blanco) en baja abundancia y principalmente en el citosol (Figura 2B). Después de tratar las células con carfilzomib durante varias horas, los MEF Wt muestran Nrf1 en el núcleo, mientras que los MEF N G Iy l /_ solo muestran una mayor abundancia de Nrf1 en el citosol. Se observó el mismo efecto en las células HEK con sobrexpresión de Nrf1 (Figura 2C), pero aún más intensamente, debido a la mayor abundancia de Nrf1 en esas células. Las células no tratadas muestran Nrf1 principalmente en el citosol alrededor del RE. Después de la incubación con carfilzomib, la mayoría de Nrf1 se observó en el núcleo. Las células tratadas con Z-VAD-fmk antes de la incubación con carfilzomib mostraron una gran abundancia de Nrf1 en el citosol. La incubación con la molécula de control QVD-OPh dio resultados similares a los de las células no tratadas, lo que confirma que el efecto observado en las células tratadas con Z-VAD-fmk es el resultado de la inhibición de NGlyl en lugar de la de la caspasa. Estos resultados muestran claramente el vínculo entre NGlyl y Nrf1. Teniendo en cuenta todos los resultados, se concluye que es necesario el funcionamiento de NGlyl para activar a Nrf1.

Con la prueba de que Nrf1 se procesa incorrectamente con NGlyl que no funciona, se busca determinar un vínculo entre NGlyl y el proteasoma. Para confirmar que la falta de NGlyl aumentaría la susceptibilidad a la inhibición del proteasoma debido a la falta de Nrf1 funcional como principal regulador de la producción de subunidades del proteasoma, se compararon células MEF NGly1'/_ con MEF WT con cantidades crecientes de carfilzomib (Figura 3A). Después de 24 horas de incubación, las células NGly1'/_ resultaron tener una sensibilidad mayor al doble al tratamiento con carfilzomib a dosis que variaban de 5 a 100 nM. El mismo efecto se pudo observar a las 4 h, aunque en menor medida. El período de latencia para la activación del rebote de la subunidad proteasómica, que se ha demostrado que es de aproximadamente 8 horas, podría explicar la disminución del efecto de la KO (Knock-Out, desactivación) de NGly1 en los primeros momentos.

Para tener en cuenta la posibilidad de que una pequeña cantidad de NGlyl sea tan funcional en la célula como la cantidad normal, las células K562 se trataron con dCAS9 y un ARNsg correspondiente a Nrf1, NGlyl, o una secuencia de control, a continuación, se midió la supervivencia en presencia de concentraciones crecientes de carfilzomib (Figura 3b). Sin ARNsg o con un ARNsg de control, la DL⁵⁰de carfilzomib resultó ser 40 nM (Figura 3c). En las desactivaciones en dCAS9 de Nrf1 o NGlyl (sgNrf1-A, sgNrf1-B y sgNGlyl), la DL⁵⁰se desplazó eficazmente hacia abajo en aproximadamente el doble hasta 20 nM para cada caso. Esto implica que la atenuación de NGlyl tiene un efecto muy similar a la atenuación de Nrf1, y que las células que carecen de la cantidad normal de estas proteínas se ven más afectadas a la inhibición del proteasoma.

Teniendo en cuenta el efecto de la KO o atenuación de NGly1 para la potenciación del inhibidor del proteasoma, se espera encontrar el mismo efecto mediante el uso de una molécula pequeña inhibidora de NGly1. Los intentos de utilizar Z-VAD-fmk para potenciar la inhibición del proteasoma en estirpes celulares de mieloma múltiple no tuvieron éxito, posiblemente debido a su actividad como un potente inhibidor de la pancaspasa.

Para rectificar este problema, los presentes inventores se propusieron encontrar un nuevo inhibidor de NGly1. El mecanismo de NGly1 es el ataque nucleófilo de un resto de cisteína en el enlace amida entre la cadena lateral de asparagina de la proteína diana y el oligosacárido unido a N. Este mecanismo, similar al carácter cisteína proteasa de las caspasas, explica la reactividad cruzada del grupo electrófilo fluorometilcetona de Z-VAD-fmk entre las caspasas y NGly1. Los presentes inventores propusieron que este mecanismo nucleófilo a base de azufre podría utilizarse para realizar un cribado específico de un pequeño banco de compuestos diseñados para reaccionar con cisteína proteasas.

El análisis utilizado fue una versión modificada del análisis fluorimétrico descrito por primera vez por el laboratorio Cresswell en 2011. Preparada por el laboratorio Steinmetz, se utilizó una estirpe celular K562 transfectada de forma estable. Mutada para plegarse incorrectamente y contener un sitio para la N-glucosilación, la ddVenus expresada solo se plegaría correctamente y, por lo tanto, emitiría fluorescencia, tras la desglucosilación por NGly1 y la conversión simultánea del resto de asparagina glucosilada en ácido aspártico (Figura 4A). Por lo tanto, la inhibición de NGly1 no activaría la fluorescencia en este análisis. Con este método, se cribó un banco de aproximadamente 600 compuestos similares a los inhibidores de las cisteína proteasas. Se encontraron seis activos, la totalidad de los cuales era estructuras derivadas de péptidos con una ojiva electrófila que consistía en vinilsulfona o epoxicetona (Figura 4B). Se utilizaron existencias de estos compuestos para validar su eficacia en el análisis de Cresswell, y el compuesto WRR139 fue el único compuesto que redujo eficazmente la fluorescencia con una CI⁵⁰de 5,5 pM (Figura 4C). A efectos de comparación, Se encontró que Z-VAD-fmk tiene una CI⁵⁰de 4,4 pM en el mismo análisis.

Para detectar la inhibición directa de NGlyl por WRR139, se observó el cambio de masa de la ARNasa B expuesta a NGlyl recombinante mediante electroforesis en gel. En presencia de NGlyl, La ARNasa B se convirtió completamente de su banda glucosilada en pXXX a una proteína desglucosilada en pXXX (Figura 4E). En presencia de Z-VAD-fmk o WRR139, solo queda la banda original, sin conversión a la forma desglucosilada.

Los presentes inventores también estaban interesados en ver si esta molécula también sería activa en las caspasas, al igual que el inhibidor de NGlyl conocido Z-VAD-fmk. Para confirmar que WRR139 tampoco no inhibió las caspasas 3/7 en el intervalo en el que inhibe NGlyl, se probó un intervalo de concentraciones para la inhibición contra caspasas 3/7 (Figura 4d). No se observó inhibición de las caspasas 3/7 hasta que se alcanzó una concentración de aproximadamente 10 pM. Adicionalmente, la actividad relativa no se redujo por debajo del intervalo observado mediante la inducción de la apoptosis.

Teniendo un inhibidor de NGly1 que no inhibía la apoptosis, se probó si la inhibición de moléculas pequeñas de NGly1 podría potenciar la inhibición del proteasoma en estirpes celulares de MM. En las estirpes celulares U266 y H929, la inhibición conjunta con WRR139 y carfilzomib disminuyó significativamente la supervivencia celular después de 24 horas en comparación con carfilzomib solo (Figuras 5a y 5b). Esta reducción de la supervivencia representó un aumento de 2,6 y 2 veces de destrucción en U266 y H929, respectivamente (Figura 5c). Estos resultados demuestran que la desactivación de Nrf1 mediante la inhibición de NGlyl potencia la eficacia de los inhibidores del proteasoma. Resulta interesante que la estirpe celular U266 se considera una estirpe celular resistente a la inhibición del proteasoma en comparación con otras estirpes de MM, tales como H929. El mayor aumento de la eficacia del tratamiento combinado en células consideradas resistentes a la inhibición del proteasoma proporciona una politerapia útil.

Resumiendo, los presentes inventores han investigado nuevas vías para potenciar la eficacia de los inhibidores del proteosoma que se aplican actualmente como tratamiento para ciertos tipos de cáncer, tales como el mieloma múltiple. Mostraron que la desactivación del principal regulador de las subunidades del proteasoma, el factor de transcripción Nrf1, puede producir una mayor potencia de los inhibidores del proteasoma de molécula pequeña. Dado que Nrf1 por sí mismo es una diana pobre para los inhibidores, se inhibió una enzima que participaba en el procesamiento de Nrf1, es decir, NGlyl.

En experimentos iniciales, investigando el procesamiento, la activación y la ubicación de Nrf1, pudieron probar el vínculo entre NGlyl y Nrf1, y demostrar que se requiere la des-N-glucosilación por esta enzima para producir la forma activa de Nrf1. Una mayor sensibilidad de las células carentes de NGlyl hacia los inhibidores del proteasoma y una activación reducida de los genes del proteasoma en comparación con las células WT revelaron el vínculo entre NGly1 y el proteasoma y, por consiguiente, una reacción de rebote reducida en las células con NGlyl no funcional. Basándose en estos hallazgos, se rastreó un banco de compuestos similares a inhibidores de cisteína proteasas utilizando un análisis de fluorescencia de ddVenus que mostraría actividad tras la desglucosilación, con el fin de encontrar moléculas que inhibieran a NGlyl, se identificaron seis estructuras derivadas de péptidos con una ojiva electrófila que consistía en vinilsulfona o epoxicetona como compuestos activos y se investigaron más a fondo. WRR139 mostró la mayor eficacia en la inhibición de NGly1 en células K562 con una CI⁵⁰superior a la del inhibidor de NGly1 existente Z-VAD-fmk, que además también inhibe las caspasas. La inhibición de NGly1 se validó aún más mediante un ensayo de cambio de movilidad en gel usando ARNasa B expuesta a la enzima recombinante purificada en presencia o ausencia de WRR139. Adicionalmente, los presentes inventores encontraron que las caspasas 3/7 no se inhibieron en el intervalo de concentración de WRR139 que se requiere para inhibir de manera eficaz a NGly1. Las caspasas fueron resultados positivos a concentraciones significativamente superiores. Teniendo en cuenta que la inhibición de la caspasa evita la apoptosis en las células, este resultado muestra claramente el beneficio de WRR139 en comparación con Z-VAD-fmk.

Por último, utilizaron dos estirpes de células de mieloma múltiple para probar si la combinación del presente inhibidor de NGly1 WRR139 y el inhibidor del proteasoma carfilzomib podía potenciar la eficacia en comparación con la inhibición del proteasoma sola. Los resultados preliminares que mostraron una supervivencia celular significativamente reducida para la inhibición conjunta de ambos compuestos en comparación con el solo el carfilzomib confirmaron la teoría inicial de los presentes inventores. Resulta interesante que esta estrategia también mostró éxito para la estirpe celular de MM que es resistente a la inhibición del proteasoma. Los presentes inventores creen que su enfoque y los hallazgos analizados en el presente documento tienen un gran potencial para el tratamiento del mieloma múltiple recidivante, así como para otros tipos de cáncer.

Materiales y métodos

Cultivo celular. Se cultivaron MEF primarios derivados de animales con desactivación e inmortalizados mediante SV40 (un amable obsequio de Tadashi Suzuki, RIKEN, Japón) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Dulbecco’s modified Eagle’s médium) complementado con suero bovino fetal al 10% (Clontech Laboratories), penicilina y estreptomicina (Fisher Scientific) a 37 °C en CO²al 5 %.

Se obtuvieron células HEK con sobrexpresión de Nrf-3xFlag (RDB-2867; un amable obsequio de Senthil Radhakrishnan, Virginia Commonwealth University) clonando la región codificante de Fluman Nrf1 junto con una secuencia 3*Flag C-terminal en pcDNA3.1+ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero fetal bovino al 10 % (Clontech Laboratories), penicilina y estreptomicina (Fisher Scientific) a 37 °C en CO²al 5 %.

Las células K562 se cultivaron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM, Iscove's Modified Dulbecco's Medium) complementado con suero fetal bovino al 10 % (Clontech Laboratories), penicilina y estreptomicina (Fisher Scientific) a 37 °C en CO²al 5 %.

Las células U266 se cultivaron en RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 15 % (Clontech Laboratories), penicilina y estreptomicina (Fisher Scientific) a 37 °C en CO²al 5 %.

Las células H929 se cultivaron en RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % (Clontech Laboratories), penicilina y estreptomicina (Fisher Scientific) y BME p-mercaptoetanol (BME) 50 mM a 37 °C en CO²al 5 %.

Análisis de inmunotransferencia. Las células se lisaron en tampón RIPA (Tris 50 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, NP40 al 1 %, desoxicolato de Na al 1 %, SDS al 0,1 % y EDTA 1 mM) complementado con un cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Pierce). Para detectar Nrf1, se utilizó un anticuerpo monoclonal de conejo generado contra el extremo N (D5B10, Cell Signaling). Se realizaron otras inmunotransferencias con anticuerpos específicos para el marcador Flag (Sigma-Aldrich) y actina p (Cell Signaling).

Ensayos de luciferasa. La construcción 3xPSMA4-ARE-Luc (RDB-2415; un amable obsequio de Senthil Radhakrishnan, Virginia Commonwealth University) se ha descrito anteriormente. Brevemente, se hibridó un oligonucleótido (5'-cgagccgtgggcacga TGACTCTGCA ccgcctcctctgagccgtgggcacga TGACTCTGCA ccgcctcctctgagccgtgggcacga TGACTCTGCA ccgcctcctctg-3') (SEQ ID NO: 10) que contenía tres copias de un supuesto ARE (mostrado en mayúsculas) derivado del primer intrón del gen PSMA4 humano con su oligonucleótido del complemento inverso correspondiente y se clonó en el vector promotor de pGL3 (Promega). El indicador del promotor se generó insertando esta construcción en dirección 5' de un promotor SV40 mínimo, impulsando la expresión de una luciferasa de luciérnaga.

Las células se transfectaron transitoriamente con construcciones de la luciferasa de luciérnaga (indicadores promotores) y de Renilla (pRL-TK; Promega) junto con el plásmido efector según sea necesario. Las células se trataron con compuestos o vehículo de control durante 12 horas. Posteriormente, las células se lisaron en los ensayos de luciferasa que se realizaron utilizando el sistema de análisis de indicador de luciferasa doble (E1910; Promega) según las instrucciones del fabricante. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó con respecto a la actividad de luciferasa de Renilla para todos los experimentos.

Ensayos de viabilidad celular. Se trataron las células en placas de 96 pocillos con inhibidores del proteosoma a concentraciones que variaban de 1 a 100 pg/ml durante 4 o 24 h, respectivamente. Se obtuvo el reactivo WST-1 de Roche (Alemania) y se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La lectura se realizó midiendo la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas Spectra max®i3x (VWR, Australia).

Inmunofluorescencia seguida de generación de imágenes confocales. Se cultivaron MEF y células HEK con sobrexpresión de Nrf-3xFlag hasta un 80 % de confluencia en cubreobjetos. Las células se trataron con inhibidores de NGLy1, de caspasa y del proteasoma como se indica, y se dejó que se recuperaran en medios nuevos durante una hora antes de que las células se fijaran con metanol al 100 % enfriado con hielo. Las células se trataron con un anticuerpo monoclonal de conejo primario producido contra el extremo N de Nrf1 (D5B10, Cell Signaling) y un anticuerpo policlonal secundario Alexa Fluor®647 AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (Jackson Immuno Research). Después de lavar con PBS, los cubreobjetos se trataron con ProLong®Diamond Antifade Mountant (P3697, Thermo Fischer) que contenía 49,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción de ADN nuclear, se colocaron en portaobjetos y se desecaron durante la noche. Después de ello, se examinó la ubicación subcelular de Nrf1 (canal rojo lejano) mediante imágenes confocales utilizando un Nikon Eclipse Ti y un aumento x60. Las imágenes se analizaron utilizando el software de análisis Imaris (versión). Barra =10 mm.

Cribado de ~600 compuestos con la prueba de Cresswell. Los cribados se realizaron en placas transparentes de 96 pocillos con fondo en V. Las placas se prepararon con control negativo, 2 pl de DMSO (A l), y control positivo, 1 pl de DMSO 1 pl de Z-VAD-fmk 10 mM (conc. final de Z-VAD-fmk 100 pM; A12-H12). Los pocillos A2-A11 contenían 1 pl de DMSO, los pocillos restantes contenían 1 pl de soluciones madre 1 mM de compuestos del banco.

Se añadieron a la placa 100 pl de células K562 ddVenus suspendidas a razón de 1 x 106 células/ml. Los pocillos A1-A12 contenían células en medios de crecimiento. Los pocillos restantes contenían células en medio de crecimiento complementado con carfilzomib 100 pM.

Las placas se incubaron durante 6 horas a 37 °C con CO²al 5 % y posteriormente se analizaron por citometría de flujo automatizado utilizando un (detalles del instrumento), con puntos de corte a 50 pl y 50.000 acontecimientos. Se representó gráficamente la media de fluorescencia en FL1 para cada pocillo.

Los pocillos que mostraron una disminución de la fluorescencia de 3 desviaciones típicas por debajo de la media del control positivo (fluorescencia máxima) se identificaron en los activos. El factor Z para el análisis varió de 0,38 a 0,85.

Supervivencia celular con inhibidor del proteasoma. Los experimentos de supervivencia celular utilizando el análisis Cell Titer-Glo 2.0 se realizaron en placas de 96 pocillos de fondo plano de color blanco opaco. Las células (1,0-2,0 x 104 en 100 pl de medio nuevo) se trataron en las condiciones deseadas y se incubaron durante 24 o 48 h antes de añadir 100 pl de reactivo de análisis. La viabilidad se calculó como señal porcentual en comparación con las células tratadas con vehículo. Los cálculos del análisis de regresión y CI⁵⁰se realizaron con GraphPad Prism 7.0.

U266 e H929: se sembraron células U266 o H929 a una densidad de 0,1 millones de células/ml en medio RPMI (100 pl por pocillo). Al día siguiente, se añadieron carfilzomib, DMSO o WRR139 en DMSO a las concentraciones finales mostradas para una concentración final máxima del 1 % de DMSO (v/v). Después de 48 h de incubación a 37 °C con CO²al 5 %, la placa se recuperó y se trató con el análisis Cell Titer-Glo 2.0. Después de 10 minutos de incubación, la placa se analizó midiendo la luminiscencia utilizando un lector de placas Spectra max®i3x (VWR, Australia).

K562: se sembraron células K562 (tipo natural o NGLY1'/_) a una densidad de 0,2 millones de células/ml en medio RPMI, 100 pl por pocillo. Al día siguiente, se añadió carfilzomib o DMSO a las concentraciones finales mostradas para una concentración final máxima del 0,2 % de DMSO (v/v). Después de 24 h de incubación a 37 °C con CO²al 5 %, la placa se recuperó y se trató con el análisis Cell Titer-Glo 2.0. Después de 10 minutos de incubación, la placa se analizó midiendo la luminiscencia utilizando un lector de placas Spectra max®i3x (VWR, Australia).

Ensayo de inhibición de caspasa 3/7. Se suspendió 1 millón de células U266 en 10 ml de RPMI con 15 % de SAB PS y se sembraron en una placa de 96 pocillos de paredes blancas y fondo plano (100 pl por pocillo). La placa se incubó a 37 °C durante toda la noche. Al día siguiente, se trataron las células con estaurosporina (inductor de apoptosis, concentración final 1 pM), WRR139 o Z-VAD-fmk (a las concentraciones finales que se muestran) o DMSO hasta una concentración final del 2 % de DMSO (v/v) respectivamente. La placa se incubó durante 8 horas a 37 °C. El reactivo del kit Caspase-Glo (datos de la compañía) se preparó según las instrucciones del fabricante y tras equilibrar hasta 23 °C, se añadieron 100 ml del reactivo a cada pocillo. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 60 minutos y, posteriormente, se analizó midiendo la luminiscencia utilizando un lector de placas Spectra max®i3x (VWR, Australia). La inhibición de la caspasa se calculó restando el fondo (señal de medios que no contenían células) y comparándolo con la señal de células con apoptosis inducida (solo estaurosporina).

Generación de estirpes celulares k562 con atenuación mediada por CRISPRi: la estirpe celular K562 CRISPRi que expresa de forma estable dCas9-KRAB1 y el sistema lentivírico de tercera generación se obtuvieron del grupo de Jonathan Weissman (Universidad de California, San Francisco). La generación de las estirpes celulares K562 con atenuación basada en CRISPRi se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento publicado. En primer lugar, se clonaron secuencias de protoespaciadores con las puntuaciones de actividad CRISPRi predichas más altas informadas por Horlbeck et al. en el plásmido de transferencia lentivírico que expresa ARNsg descrito anteriormente.

Se utilizó una construcción de ARNsg dirigida a la levadura GAL4-UAS como control negativo, como se ha descrito previamente. El lentivirus se generó en células HEK293T utilizando un sistema de plásmido lentivírico de tercera generación.

Para la infección lentivírica, primero se sembraron las células K562 a una densidad de 0,1 millones/ml en una placa de 24 pocillos durante la noche. Al día siguiente, se añadió a cada pocillo un lentivirus portador de un vector ARNsg individual. La placa se centrifugó a 1000 x g a 33 °C durante treinta minutos y luego se devolvió a las condiciones normales de incubación del cultivo celular. Dos días después de la infección, se añadió puromicina a una concentración final de 1,25pg/ml, y la selección continuó durante 4 días. Todos los experimentos realizados en las células transducidas con ARNsg se llevaron a cabo con no más de diez pases después de la selección de puromicina. Para determinar el nivel de atenuación génica, se recogieron 0,2 millones de células de cada estirpe celular K562 y se extrajo el ARN con el kit Quick-RNA™ MicroPrep (Zymo Research, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transcribieron de forma inversa 200 ng del ARN extraído a ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc ProtoScript® II First Strand (New England Biolabs, MA, EE.UU.) con el cebador Oligo d(T)23 VN suministrado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR cuantitativas se prepararon utilizando la mezcla maestra de PCR SYBR® Green (Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch™ (Bio-Rad, CA, EE.UU.).

Secuencia de protoespaciadores de cada construcción de ARNsg:

NFE2L1 (Nrf1): 5'-GAAGCTCCGGCGCCGAGAGT-3' (SEQ ID NO: 1)

NGLY1: 5'-GTGAGGCGCCTGCTCAGTGT-3' (SEQ ID NO: 2)

GAL4-4: 5'-GAACGACTAGTTAGGCGTGTA-3' (SEQ ID NO: 3)

Secuencias de cebadores para la PCR cuantitativa:

GAPDH:

DIRECTO: 5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3' (SEQ ID NO: 4)

INVERSO: 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3' (SEQ ID NO: 5)

NFE2L1:

DIRECTO: 5'-AGTGGCAAGATCTCATGTCC-3' (SEQ ID NO: 6)

INVERSO: 5'-GCTGAAGAGTAAGAAGTCCTGG-3' (SEQ ID NO: 7)

NGLY1:

DIRECTO: 5'-AATATCTGGGTCAGTGGCTTG-3' (SEQ ID NO: 8)

INVERSO: 5'-CATTTTCCACACGCCATTCTC-3' (SEQ ID NO: 9)

Sensibilidad a carfilzomib de estirpes celulares k562 con atenuación mediada por CRISPRi. Se utilizó carfilzomib disuelto en DMSO a una concentración de 10 mM recién preparado o almacenado a -80 °C durante no más de un mes sin ciclos repetidos de congelación y descongelación. Se sembraron células K562 a una densidad de 0,2 millones de células/ml en 100 pl de medio RPMI en cada pocillo de una placa de 96 pocillos durante 18 horas antes del tratamiento. Al día siguiente, se añadió carfilzomib o DMSO diluidos en serie a las células con una concentración final de DMSO del 0,1 % (v/v) en cada pocillo. Tras 48 horas de incubación a 37 °C, se recuperó la placa y se tiñó con un kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD® a base de calceína (Thermo Fisher Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se contaron las células en un citómetro de flujo Accuri C6 (BD Biosciences, CA, EE.UU.). Se recogió un total de 10.000 acontecimientos para cada pocillo. La viabilidad se calculó como el porcentaje de células con calceína de cada muestra tratada con carfilzomib, normalizado con el del control de vehículo tratado con DMSO.

Síntesis

Compuesto 2:

Parte experimental: Se disolvió Boc-homofenilalanina 1 (500 mg, 1,78 mmol) en 8 ml de DMF. A esta solución, se añadieron HATU (741 mg, 3,56 mmol) y DIPEA (929 pl, 5,34 mmol) por orden. La mezcla resultante se agitó durante 30 minutos antes de la adición de isopentilamina (412 pl, 3,56 mmol). La solución se volvió rápidamente amarilla y la mezcla se dejó en agitación durante 14 h. La mezcla se diluyó con EtOAc (30 ml), se lavó con agua (2 x 20 ml), solución sat. de NaCl NaHCO³(2 x 20 ml) y salmuera (20 ml). Se recogió la capa orgánica, se desecó sobre MgSO⁴y se filtró. La solución amarilla transparente se concentró a presión reducida y el residuo amarillo se purificó mediante cromatografía en columna (hexanos/EtOAc a 2:1). El producto 2 se aisló en forma de una espuma incolora, transparente (365 mg, rendimiento del 58 %). RMN de 1H (300 MHz, cloroformo-d) 87,30-7,12 (m, 6H), 6,78 (s, 1H), 5,59 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,26-4,14 (m, 1H), 3,22 (s, 2H), 2,74-2,62 (m, 2H), 2,01-1,90 (m, 1H), 1,62 (dt, J = 13,2, 6,7 Hz, 1H), 1,47 (s, 14H), 1,12 (s, 1H), 0,91 (d, J = 6,6 Hz, 6H). RMN de 13C (126 MHz, CDCla) 5 172,18; 156,10; 141,36; 128,70; 128,62; 126,29; 80,10; 77,63; 77,37; 77,12; 54,42; 38,61; 38,01; 34,67; 32,18; 28,61; 26,02; 22,72; 22,67.

EMAR (IEN) m/z: calculada. Rf: 0,47 (hexanos/EtOAc 2:1).

Compuesto 3:

Parte experimental: se disolvió el compuesto 2 (360 mg, 1,03 mmol) en DCM (10 ml) con agitación y se añadió TFA (10 ml) a la solución. Se agitó la mezcla hasta la completa desaparición del material de partida según la CCF (hexanos/EtOAc 2:1, ~20 min). Se eliminó el disolvente a presión reducida, y el residuo se disolvió en DCM (20 ml) y se lavó con NaHCO³saturado (3 x 15 ml). Las capas acuosas combinadas se volvieron a extraer con DCM (2 x 20 ml). La capa orgánica combinada se desecó sobre MgSO⁴, se filtró y se concentró a presión reducida. Se encontró que el aceite amarillo resultante era el compuesto 3, y se utilizó sin mayor purificación (247,9 mg, 97%). RMN de 1H (400 MHz, cloroformo-d) 87,29 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,24-7,13 (m, 4H), 3,37 (dd, J = 8,4, 3,9 Hz, 1H), 3,27 (c, J = 6,8 Hz, 2H), 2,78-2,67 (m, 2H), 2,26-2,13 (m, 1H), 1,88-1,75 (m, 1H), 1,60 (s, 4H), 1,40 (c, J = 7,5 Hz, 2H), 0,92 (d, J = 6,6 Hz, 6H).

Compuesto

Parte experimental: se disolvió el compuesto 3 (50 mg, 0,20 mmol) en DMF (2,0 ml), y a esto se le añadieron ácido acrílico (13,7 ^l, 0,20 mmol) y DIPEA (l04 ^l, 0,60 mmol) con agitación. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadió COMU (86 mg, 0,20 mmol). Se rellenó el matraz con N²y se dejó en agitación durante 1 h. En este momento, la mezcla se calentó hasta la temperatura ambiente y se agitó durante otras 3 horas. La mezcla se diluyó con EtOAc (10 ml) y se lavó con HCl 1 N (10 ml), NaHCO³sat. ^{( 2}x 10 ml) y salmuera (10 ml). La capa orgánica se desecó (MgSO⁴), se filtró y el disolvente se retiró a presión reducida. El residuo amarillo se purificó mediante cromatografía en columna (hexanos/EtOAc 2:1 a 3:2 a 1:1). El producto 4 se aisló en forma de un polvo blanco (34,3 mg, 57 %). RMN de 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 57,23 (dd, J = 13,5, 6,5 Hz, 1H), 7,14 (dd, J = 19,9, 6,8 Hz, 4H), 6,85 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,32-6,11 (m, 2H), 5,64 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,63 (c, J = 7,3 Hz, 1H), 3,34-3,26 (m, 1H), 3,19 (dt, J = 13,1,6,5 Hz, 1H), 2,67 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 2,16 (dc, J = 14,6, 8,1 Hz, 1H), 2,04 (dt, J = 13,9, 7,2 Hz, 1H), 1,60 (dt, J = 13,2, 6,8 Hz, 1H), 1,39 (c, J = 7,2 Hz, 2H), 0,89 (d, J = 6,6 Hz, 5H). RMN de 13C (101 MHz, CDCh) 5 171,73; 165,75; 141,20; 130,78; 128,70; 128,58; 127,11; 126,30; 77,59; 77,27; 76,95; 53,29; 38,48; 38,16; 34,60; 32,11; 26,05; 22,70; 22,61. EMAR (IEN) m/z: calculada. Rf 0,4 (hexanos/EtoAc 1:1).

WRR139:

Parte experimental:

Adición: se disolvió N-clorosuccinimida (32,3 mg, 0,242 mmol) en DCM (3 ml) y se añadió lentamente con agitación p-metilbencenotiol (28,6 mg, 0,231 mmol). La solución se volvió naranja y se formó un precipitado. La mezcla se dejó en agitación durante 30 minutos. Se disolvió el compuesto 4 por separado en DCM (0,25 ml) y se añadió lentamente. La mezcla de reacción se agitó durante 14 h, luego se diluyó con d Cm (10 ml), se lavó con agua (10 ml) y, finalmente, con salmuera (10 ml). La fase orgánica se desecó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo en bruto se utilizó en la siguiente etapa sin purificación.

Oxidación: se disolvió el residuo en bruto obtenido de la adición en DCM (4 ml) y la solución se enfrió a 0 °C. El mCPBA (113 mg, 0,508 mmol) se añadió lentamente y la reacción se dejó calentar hasta la t.a. y se agitó. La reacción se controló por CCF (se puede ver el sulfóxido intermedio durante esta transformación, muy polar), y después de 1 h, se añadió un segundo equivalente de mCPBA (113 mg, 0,508 mmol) debido a la conversión incompleta. La mezcla de reacción se agitó durante 1 h antes de inactivarse con tiosulfato de sodio sat. (5 ml). La mezcla se diluyó con DCM (10 ml), y la capa orgánica se separó y se lavó con NaHCO3 sat. (10 ml) y salmuera (10 ml). La fase orgánica se desecó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida. Después de un desecado completo al alto vacío, el residuo blanco grueso se utilizó directamente en la siguiente etapa sin purificación.

Eliminación: se disolvió el residuo en bruto de la oxidación en DCM (3,2 ml) y se enfrió hasta 0 °C. A esta solución, se le añadió gota a gota DBU (50 ^l, 0,33 mmol) y la mezcla se dejó calentar hasta la t.a. Después de agitar durante 15 min, la mezcla se diluyó con d Cm (10 ml), se lavó con HCl 1 N (10 ml), agua (10 ml) y, finalmente, con salmuera (10 ml). La capa orgánica se desecó sobre MgSO⁴, se filtró y se concentró a presión reducida. El material en bruto resultante se purificó utilizando un Biotage Isolera Prime con dos columnas (SiO2, 10-80 % de EtOAc en hexanos, a continuación, 0-8 % de MeOH en DCM). Se obtuvo un residuo blanco (8,9 mg, 8,4 % en tres etapas). RMN de 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 57,77 (dt, J = 8,3, 1,9 Hz, 2H), 7,61-7,48 (m, 1H), 7,37-7,28 (m, 3H), 7,28-7,20 (m, 2H), 7,17 (dt, J = 9,1, 4,8 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,02 (dt, J = 14,7; 2,0 Hz, 1H), 6,15 (d, J = ^{6 , 6}Hz, 1H), 4,50 (c, J = 7,0 Hz, 1H), 3,27 (ddd, J = 40,4; 13,6; 6,7 Hz, 2H), 2,64 (s, 2H), 2,43 (s, 3H), 2,15 (dd, J = 14,2; 7,1 Hz, 1H), 2,00 (dc, J = 14,7; 7,4 Hz, 1H), 1,57 (dc, J = 13,5, 6,7 Hz, 1H), 1,43-1,32 (m, 2H), 0,88 (dd, J = 6,5; 1,8 Hz, ⁶H). RMN de 13C (126 MHz, CDCla) ⁸171,16, 162,51, 145,54, 141,05, 140,65, 136,03, 133,67, 133,18, 130,37, 130,06, 128,83, 128,69, 128,57, 128,55, 126,52, 77,54, 77,28, 77,03, 53,61, 38,40, 38,34, 34,43, 32,02, 26,03, 22,68, 22,61, 21,96. EMAR (IEN) m/z: calculada. Rf 0,32 (MeOH al 3 % en DCM).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un inhibidor de NGlyl para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el inhibidor de NGly1 es eficaz para reducir la expresión de un proteasoma de células cancerosas, además, en donde se reduce el número de células cancerosas viables, opcionalmente, en donde la composición además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende una dosis eficaz de un inhibidor directo del proteasoma.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el inhibidor directo del proteasoma es uno o más de bortezomib, carfilzomib, ixazomib, delanzomib, oprozomib, marizomib, IPSI-001, ONX-0914 y PR-924.

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde:

(a) la combinación proporciona un efecto sinérgico en relación con la administración de cualquier agente como agente único; y/o

(b) la dosis eficaz de inhibidor directo del proteosoma es menor que la dosis eficaz en ausencia del inhibidor de NGly1; y/o

(c) el período de tiempo durante el que el inhibidor directo del proteasoma es eficaz es mayor que el período de tiempo durante el que es eficaz en ausencia del inhibidor de NGly¹.

5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el cáncer es un cáncer hemático.

⁶. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el cáncer hemático es mieloma múltiple.

7. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el inhibidor de Ngly1 no inhibe la actividad de la caspasa.

⁸. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el inhibidor de NGly1 inhibe Ngly1 mecánicamente al inhibir el ataque nucleófilo de un resto de cisteína en el enlace amida entre la cadena lateral de asparagina de la proteína diana y el oligosacárido unido a N.

9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el inhibidor de NGly1 tiene una estructura de Fórmula I:

donde R¹es H, alquilo, incluidos alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido;

R²es H, alquilo, incluidos alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido; y

10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el inhibidor de NGly1 tiene una estructura de Fórmula III:

R⁴es un grupo alquilo, incluidos, p. ej., metilo, etilo, propilo, isopropilo;

R⁵es un grupo polar o no polar, incluidos, pero sin limitación, alquinilo, alquenilo, morfolino, amino, amido, sulfhidrilo.

11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el inhibidor de NGlyl tiene una estructura de Fórmula IV:

R6 es un sustituyente opcional en el anillo arilo en cualquier ubicación (orto, meta o para), cuyo sustituyente puede ser alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiaminoacilo, azido, ciano, halógeno, hidroxilo, oxo, tioceto, carboxilo, carboxialquilo, tioariloxi, tioheteroariloxi, tioheterociclooxi, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterociclilo, heterociclooxi, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO²-alquilo, -SO²-alquilo sustituido, -SO²-arilo, -SO²-heteroarilo o heterociclo condensado;

cualquiera de X¹, X²y X³son opcionalmente un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo o silicio.

12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el inhibidor de NGly1 es:

13. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el inhibidor de NGly1 es una epoxicetona de Fórmula V

donde R⁷es una amina, amina sustituida, amida, amida sustituida, alquilo, incluidos alquilos ramificados, alquilos sustituidos, arilo, alcarilo, arilo sustituido, alcarilo sustituido, etc.

14. Un kit que comprende una composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.