ES2924183T3

ES2924183T3 - Composición que comprende catalasa, método de preparación y uso de la misma y método para eliminar células tumorales

Info

Publication number: ES2924183T3
Application number: ES18819947T
Authority: ES
Inventors: Zhuang Liu; Kai Yang; Yu Chao; Qi Zhao
Original assignee: Beijing Pharbers Genesis Pharm Tech Co Ltd
Current assignee: Beijing Pharbers Genesis Pharm Tech Co Ltd
Priority date: 2017-06-22
Filing date: 2018-06-19
Publication date: 2022-10-05
Anticipated expiration: 2038-06-19
Also published as: EP3643315A4; US12514936B2; WO2018233605A1; EP3643315A1; CN107213479A; US20220016276A1; CN107213479B; EP3643315B1; US20200384136A1; US11173220B2

Abstract

Se proporciona una composición que comprende catalasa, un método de preparación y su uso, y un método para matar células tumorales. La composición comprende un radionúclido marcado en una biomacromolécula, un alginato soluble y catalasa. La composición se puede inyectar en el tumor mediante un tratamiento intervencionista. Se forma un gel cuando un ión de alginato de la composición entra en el tumor y se encuentra con un ión de calcio, de modo que el radionúclido y la catalasa quedan confinados uniformemente en el tumor. La composición que comprende catalasa utiliza catalasa para descomponer el oxígeno disuelto generado a partir del peróxido de hidrógeno en el tumor para hacer avanzar el estado hipóxico de las células tumorales, y las células tumorales se destruyen con radiación después de que ha avanzado el estado hipóxico de las mismas y, por lo tanto, la invención tiene buenos resultados. perspectivas de aplicaciones en la terapia del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que comprende catalasa, método de preparación y uso de la misma y método para eliminar células tumorales

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de Patente China No. 201710467595.5, titulada “Composition Comprising Catalase and Use Thereof”, que se presentó ante la Oficina de Patentes de China el 22 de junio de 2017.

Campo

La presente divulgación se refiere al campo de la tecnología médica y, en particular, a una composición para preparar un agente antitumoral y el uso del mismo, y específicamente a una composición que comprende catalasa, un método de preparación y uso de la misma y un método para eliminar células tumorales.

Antecedentes

Los radionúclidos tienen diferentes efectos de enriquecimiento en diferentes tejidos de órganos. Por ejemplo, las células tiroideas tienen una afinidad especial por el yoduro. Después de la administración oral de una cierta cantidad de yodo-131, la mayoría de ellos pueden ser absorbidos por la glándula tiroides. Cuando el yodo-131 se descompone en xenón-131, se emiten rayos p (99%) y rayos ^y(1%). El primero tiene un rango efectivo de 3,63 mm y un rango promedio de 0,48 mm, que puede destruir selectivamente el epitelio acinar tiroideo sin afectar los tejidos adyacentes. Sin embargo, los efectos de enriquecimiento de los radionúclidos limitan su aplicación a otros tejidos. En la técnica anterior, la implantación mínimamente invasiva de partículas radiactivas es uno de los métodos ideales actualmente. El material radiactivo se coloca en un microportador, que después se implanta en la lesión bajo la guía de ultrasonido o CT en una cirugía mínimamente invasiva. Las células tumorales se eliminarán mediante la radiación emitida tras la descomposición de las partículas. De esta forma, las partículas portadoras permanecerán en el cuerpo del paciente de forma permanente, lo que tendrá efectos a largo plazo en el cuerpo del paciente. Además, este método de implantación tiene problemas tales como la distribución desigual y la mala cobertura, lo que dificulta lograr el efecto deseado.

Por otro lado, la hipoxia se encuentra en la mayoría de los tumores sólidos humanos debido al crecimiento desordenado de los tumores y la angiogénesis insuficiente. La capacidad de las células tumorales en estado hipóxico para resistir la radiación ionizante es varias veces mayor que la de las células tumorales oxigenadas normales debido a que se reduce el daño del DNA por los radicales de oxígeno. Por lo tanto, la radiación tiene un efecto letal limitado sobre las células tumorales hipóxicas, lo que da como resultado un efecto terapéutico no aparente de las partículas de radiación existentes.

Compendio

La presente divulgación proporciona una composición que comprende catalasa, un método de preparación y uso de la misma y un método para eliminar células tumorales. La composición puede aliviar la hipoxia en las células tumorales, aumentar la uniformidad de la distribución de partículas radiactivas y la capacidad de los rayos radiactivos para eliminar las células tumorales sin afectar los tejidos normales circundantes.

Para lograr al menos uno de los propósitos anteriores de la presente divulgación, la presente divulgación puede emplear las siguientes soluciones técnicas:

La divulgación proporciona una composición que comprende catalasa, que comprende catalasa, un alginato soluble y un radionúclido marcado en la catalasa.

Se forma un gel cuando los iones de alginato de la composición entran en el tumor y se encuentran con iones de calcio, y se adhieren al interior del tumor, de manera que la catalasa marcada con radionúclido queda uniformemente confinada dentro del tumor. La catalasa puede descomponer el peróxido de hidrógeno en el tumor para producir oxígeno disuelto, aliviando así la hipoxia en las células tumorales. Además, los rayos radiactivos pueden ionizar el oxígeno disuelto para generar radicales libres de oxígeno que pueden eliminar las células tumorales, aumentando así en gran medida el efecto destructor de los rayos radiactivos sobre las células tumorales.

Por otro lado, el alginato soluble y la catalasa marcada con radionúclido pueden formar una estructura de gel uniformemente distribuida en forma de red según la estructura interna del tumor. La catalasa se confina en la estructura de gel formada a partir del alginato debido a su estructura física adecuada sin ser transportada por la sangre al área de tejido normal del paciente, reduciendo así la dosis total de radionúclidos y asegurando la intensidad de los rayos radiactivos en el área de la lesión. Además, el alginato se degrada gradualmente en unas pocas semanas en los organismos, sin dejar partículas.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, el alginato soluble incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en alginato de sodio, alginato de potasio, alginato de amonio y alginato de propilenglicol. Después de que el alginato soluble se disuelva en una solución, los iones de alginato en la solución se entrecruzarán con los iones de calcio para formar un gel similar a una red tridimensional. El alginato de sodio es un polisacárido natural que tiene la estabilidad, solubilidad y viscosidad requeridas para los adyuvantes de las preparaciones farmacéuticas.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, el alginato soluble es alginato de potasio, en el que los iones de potasio promueven la contracción de los vasos sanguíneos y reducen la fluidez del fluido inyectado en los tumores.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, el alginato soluble es una mezcla de alginato de sodio y alginato de potasio. La proporción en la mezcla se puede ajustar según las diferentes condiciones de los vasos sanguíneos en el tumor, ajustando así el grado de contracción de los vasos sanguíneos y ajustando el estado de distribución de la composición en los vasos sanguíneos.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, el radionúclido incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en yodo-131, yodo-125, fósforo-32, itrio-90, galio-67, indio-111, talio-201, paladio-203, bismuto-213, actinio-225, lutecio-177, renio-186, paladio-212 y renio-188. En el área de la lesión, los radionúclidos eliminan e inhiben las células tumorales utilizando su radiactividad.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, el radionúclido es yodo-131 o yodo-125.

El radionúclido se marca en la catalasa. La uniformidad de la distribución de la distancia relativa entre la radiación y el oxígeno disuelto generado por la catalasa se puede definir aún más marcando un radionúclido en la catalasa, de modo que no se produzca una distribución espacial no uniforme como resultado de las diferencias de peso molecular. De este modo, se incrementa la probabilidad de generación de radicales libres de oxígeno y sus efectos letales sobre las células tumorales.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, la concentración de la catalasa es de 5 mg/mL-10 mg/mL, la concentración del alginato es de 5 mg/mL-10 mg/mL y la dosis del radionúclido es de 200 Ci/mL-500 Ci/mL. El alginato a una concentración de 5 mg/mL a 10 mg/mL tiene una buena capacidad de gelificación, lo que permite que la composición se distribuya bien dentro del tumor. Si el alginato tiene una concentración inferior a 5 mg/mL, su capacidad de gelificación es insuficiente y es probable que la composición fluya fuera del tumor. Si el alginato tiene una concentración de más de 10 mg/mL, gelifica demasiado rápido, lo que hace que la composición permanezca en una determinada parte del tumor. Ambos casos afectan a la eficacia de la composición.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, la composición comprende además un agente inmunoestimulante.

Opcionalmente, en la composición que comprende catalasa, el agente inmunoestimulante incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en oligodesoxinucleótido CpG que es un adyuvante inmunológico, R837, agonistas de TLR7, agonistas de TLR8, agonistas de NLR, agonistas de STING, MPLA (Monofosforil Lípido A ), LPS, PGNs, R848, G100, SD-101, MGN1703, CMP-001, FLA, polyU, poly(dT), CL307, CL264, CL097, CL075, MEDI9197, MEDI5083, hipoxantina y MDP. La citoquina incluye IL-1, IL-1 a, IL-1p, IL-2, IL-2 superquina, IL-6, IL-7, IL-9, AM0010, IL-12, IL-15, superagonista de IL-15, a Lt -803, NIZ985, IL-16, IL-18, IL-21, denenicoquina, anticuerpo superagonista de IL-12, IFN-a, IFN-p, IFN-y, TNF-a, GM-GSF, RG7461, RG7813, M9241, etc. El agente inmunoestimulante puede usarse en combinación con anticuerpos frente a bloqueadores de puntos de control inmunitarios, tales como un anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (Anti-CTLA-4), Anti-PD-1, Anti-PD-L1, etc. y moléculas señalizadoras co-estimuladoras tales como Anti-TIM3, Anti-OX40, Anti-GITR, Anti-LAG-3, Anti-CD137, Anti-CD27, Anti-CD28, Anti-CD28H, Anti-CD39, Anti-CD40, Anti-CD47, Anti-CD48, Anti-CD70, Anti-CD73, Anti-CD96, Anti-CD160, Anti-CD200, Anti-CD244, etc. para producir la cantidad adecuada de antígenos para la inmunoterapia. La adición de un adyuvante inmunológico a la composición da como resultado una mejor producción de antígenos asociados a tumores. Después, el uso de un anticuerpo frente al bloqueador del punto de control inmunitario para la modulación de la respuesta inmunitaria facilita la eliminación de tumores distales o metástasis mediante la utilización del sistema autoinmunitario. Así, los tumores distales o las metástasis se tratan mientras se tratan los tumores in situ.

La presente divulgación proporciona un método para preparar una composición que comprende catalasa, que comprende mezclar una solución de alginato, un radionúclido y catalasa.

Ópticamente, la proporción de la cantidad de alginato, la catalasa y el radionúclido es de 5 mg-10 mg: 5 mg-10 mg: 200 Ci-500 Ci.

Ópticamente, la solución de alginato, el radionúclido y la catalasa se mezclan mediante un método que comprende mezclar una solución de alginato con catalasa marcada con radionúclido.

Además, como una implementación, la catalasa marcada con radionúclido se prepara mediante un método que comprende mezclar un radionúclido, un agente oxidante y un medio de dispersión, y mezclar la mezcla obtenida con una biomacromolécula tal como catalasa y proteínas séricas, después agitar, dejar reposar, lavar y separar. El radionúclido se mezcla con el agente oxidante para la oxidación, lo que le da al radionúclido una mayor capacidad de sustitución electrofílica. El agente oxidante incluye cloramina-T, y el medio de dispersión incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en solución salina fisiológica y solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Como otra implementación, la catalasa marcada con radionúclido se prepara mediante un método que comprende mezclar catalasa con un agente quelante y después dializar para obtener catalasa quelada; mezclar un radionúclido con la catalasa quelada y un agente reductor, seguido de una purificación por ultrafiltración. En este método se usa un agente quelante de manera que un agente quelante capaz de quelar la radiactividad está presente en la catalasa, es decir, la catalasa se modifica en la superficie con un agente quelante capaz de marcar un radionúclido. A continuación, el radionúclido se quela con el agente quelante utilizando un agente reductor para obtener catalasa marcada con radionúclido. En la presente divulgación, el agente quelante incluye agentes quelantes basados en DTPA y basados en DOTA, y el agente reductor incluye borohidruro de sodio o borohidruro de potasio.

La presente divulgación proporciona el uso de la composición descrita anteriormente que comprende catalasa para la preparación de un agente antineoplásico.

Ópticamente, el uso comprende el uso de la composición en combinación con al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos, anti-PD-1 y anti-PD-L1. Se produce una cantidad adecuada de antígenos para la inmunoterapia, y los tumores distales o metástasis se eliminan utilizando el sistema autoinmunitario. Así, los tumores distales o las metástasis se tratan mientras se tratan los tumores in situ.

La presente divulgación también proporciona un método para eliminar células tumorales. La composición anterior se inyecta en un tumor por medio de un tratamiento intervencionista. Se forma una estructura de gel reticulado similar a una red según la estructura interna del tumor cuando los iones de alginato en la composición entran en el tumor y encuentran iones de calcio, y se adhieren al interior del tumor, de modo que los radionúclidos marcados en las biomacromoléculas y la catalasa están uniformemente recubiertas y confinadas dentro del tumor. La catalasa puede descomponer el peróxido de hidrógeno en el tumor para producir oxígeno disuelto, aliviando así la hipoxia en las células tumorales. Los rayos generados por los radionúclidos pueden eliminar las células tumorales en las que se ha aliviado la hipoxia.

Opcionalmente, antes del tratamiento intervencionista, se ajusta la concentración de calcio en sangre o en tumores y regiones de tejido circundante.

Las ventajas de la presente divulgación incluyen:

En la presente divulgación, se forma un gel a partir de iones de alginato e iones de calcio, y se adhiere al interior del tumor, de manera que la catalasa marcada con radionúclido se confina uniformemente dentro del tumor. La catalasa puede descomponer el peróxido de hidrógeno en el tumor para producir oxígeno disuelto, aliviando así la hipoxia en las células tumorales. Además, los rayos radiactivos pueden ionizar el oxígeno disuelto para generar radicales libres de oxígeno para eliminar las células tumorales, lo que aumenta en gran medida el efecto letal de los rayos radiactivos sobre las células tumorales. De ese modo, se resuelve el problema de la resistencia a la radiación de las células tumorales hipóxicas existentes en la técnica anterior.

La estructura de gel uniformemente distribuida en forma de red formada a partir de los iones de alginato y los iones de calcio define la uniformidad de la distribución de la distancia relativa entre los rayos radiactivos y el oxígeno disuelto generado por la catalasa, mejorando así los problemas en la técnica anterior que la distribución no uniforme y la cobertura deficiente de los radionúclidos que se han colocado en partículas transportadoras con anticipación se producirán después de ser implantados en el área de la lesión.

Además, la composición se puede usar en combinación con un anticuerpo frente al antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) para tratar tanto tumores in situ como tumores distales o metastásicos debido a que se pueden generar antígenos cuando se eliminan células tumorales.

Descripción de los dibujos

La presente divulgación se describe con más detalle a continuación junto con los dibujos y realizaciones adjuntos:

La Figura 1 es un gráfico que muestra la formación de imágenes para controlar el movimiento de radionúclidos en tumores de ratón dentro de las 48 h en el Ejemplo de Prueba 1;

La Figura 2 es un gráfico que muestra la formación de imágenes fotoacústicas para controlar la concentración de oxígeno en la sangre de tumores de ratón;

La Figura 3 es un gráfico que muestra la curva de crecimiento del tumor en el Ejemplo de Prueba 3;

La Figura 4 es un gráfico que muestra la curva de crecimiento del tumor en el Ejemplo de Prueba 4;

La Figura 5 es un gráfico que muestra la curva de supervivencia del ratón en el Ejemplo de Prueba 4;

La Figura 6 es un gráfico que muestra la curva de crecimiento del tumor in situ;

La Figura 7 es un gráfico que muestra la curva de crecimiento del tumor distal;

La Figura 8 es un gráfico que muestra el contenido de citoquinas relacionadas con el sistema inmunitario en ratones;

La Figura 9 es un gráfico que muestra secciones que muestran el comportamiento de permeación del alginato de sodio de diferentes concentraciones en tumores;

La Figura 10 es un gráfico que muestra la curva de crecimiento del tumor en el Ejemplo de Prueba 8;

La Figura 11 es un gráfico que muestra la curva de crecimiento del tumor en el Ejemplo de Prueba 9.

Descripción detallada

Las soluciones técnicas en las realizaciones de la presente divulgación se describirán clara y completamente a continuación para aclarar los objetivos de los ejemplos, las soluciones técnicas y las ventajas de la presente divulgación. Los ejemplos que no se indican con condiciones específicas se realizan según las condiciones convencionales o las condiciones recomendadas por el fabricante. Los reactivos o instrumentos a utilizar, que no están indicados con los fabricantes, son productos convencionales que están disponibles comercialmente.

La presente divulgación se describe en detalle a continuación con referencia a los ejemplos y los dibujos adjuntos. Sin embargo, los siguientes ejemplos no deben considerarse como limitaciones al alcance de la presente divulgación.

Ejemplo 1

Preparación de una solución de alginato de sodio: se pesaron 50 mg de alginato de sodio y se disolvieron en 10 ml de agua desionizada y se agitó completamente para disolver suficientemente el alginato de sodio para obtener una solución de alginato de sodio de 5 mg/ml.

Preparación de catalasa marcada con yodo-125: se mezclaron 550 pl de solución madre de yodo-125 y 100 pl de cloramina-T de 0,1 mg/ml, y se añadieron 500 pl de medio de dispersión, después la mezcla de yodo-125 y cloramina-T se añadió a 500 pl de catalasa de 5 mg/ml, se agitó y se mezcló en un agitador de vórtice durante 5 minutos, después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 15 minutos más tarde, la mezcla se transfirió a un tubo de ultrafiltración de 15 ml y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos, se lavó 3 veces con medio de dispersión, después se extrajo el sobrenadante y se midió la actividad con un medidor de actividad.

La solución de alginato de sodio y la catalasa marcada con yodo-125 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 5 mg/mL, la concentración de alginato de sodio era de 5 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 200 Ci/mL.

Ejemplo 2

Preparación de una solución de alginato de sodio: se pesaron 75 mg de alginato de sodio y se disolvieron en 10 ml de agua desionizada y se agitó completamente para disolver suficientemente el alginato de sodio para obtener una solución de alginato de sodio de 7,5 mg/ml.

La solución de alginato de sodio y la catalasa marcada con yodo-125 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 7,5 mg/mL, la concentración de alginato de sodio era de 7,5 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 350 Ci/mL.

Ejemplo 3

Preparación de una solución de alginato de sodio: se pesaron 100 mg de alginato de sodio y se disolvieron en 10 ml de agua desionizada y se agitó completamente para disolver suficientemente el alginato de sodio para obtener una solución de alginato de sodio de 10 mg/ml.

La solución de alginato de sodio y la catalasa marcada con yodo-125 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 10 mg/mL, la concentración de alginato de potasio era de 10 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 500 Ci/mL.

Ejemplo 4

Preparación de una solución de alginato de potasio: se pesaron 550 mg de alginato de potasio y se disolvieron en 10 ml de agua desionizada y se agitó completamente para disolver suficientemente el alginato de potasio para obtener una solución de alginato de potasio de 55 mg/ml.

Preparación de catalasa marcada con yodo-125: se mezclaron 550 pl de solución madre de yodo-125 y 100 pl de cloramina-T de 0,1 mg/ml, y se añadieron 500 pl de medio de dispersión, después la mezcla de yodo-125 y cloramina-T se añadió a 500 pl de catalasa de 5 mg/ml asa, se agitó y se mezcló en un agitador de vórtice durante 5 minutos, después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 15 minutos más tarde, la mezcla se transfirió a un tubo de ultrafiltración de 15 ml y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos, se lavó 3 veces con medio de dispersión, después se extrajo el sobrenadante y se midió la actividad con un medidor de actividad.

La solución de alginato de potasio y la catalasa marcada con yodo-125 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 5 mg/mL, la concentración de alginato de potasio era de 55 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 200 Ci/mL.

Ejemplo 5

Preparación de catalasa marcada con yodo-131: se mezclaron 50 pl de solución madre de yodo-131 y 100 pl de cloramina-T de 0,1 mg/ml, y se añadieron 500 pl de PBS o solución salina fisiológica, después la mezcla de yodo-131 y cloramina-T se añadió a 500 pl de catalasa de 5 mg/ml, se agitó y se mezcló en un agitador de vórtice durante 5 minutos, después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 15 minutos más tarde, la mezcla se transfirió a un tubo de ultrafiltración de 15 ml y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos, se lavó 3 veces con medio de dispersión, luego se extrajo el sobrenadante y se midió la actividad con un medidor de actividad.

La solución de alginato de sodio y la catalasa marcada con yodo-131 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 5 mg/mL, la concentración de alginato de potasio era de 7,5 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 200 Ci/mL.

Ejemplo 6

Preparación de una solución de alginato de potasio: se pesaron 100 mg de alginato de potasio y se disolvieron en 10 ml de agua desionizada y se agitó completamente para disolver suficientemente el alginato de potasio para obtener una solución de alginato de potasio de 10 mg/ml.

Preparación de catalasa marcada con yodo-131: se mezclaron 50 pl de solución madre de yodo-131 y 100 pl de cloramina-T de 0,1 mg/ml, y se añadieron 500 pl de PBS o solución salina fisiológica, después la mezcla de yodo-131 y cloramina-T se añadió a 500 pl de catalasa de 5 mg/ml, se agitó y se mezcló en un agitador de vórtice durante 5 minutos, después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 15 minutos más tarde, la mezcla se transfirió a un tubo de ultrafiltración de 15 ml y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos, se lavó 3 veces con medio de dispersión, después se extrajo el sobrenadante y se midió la actividad con un medidor de actividad.

La solución de alginato de potasio y la catalasa marcada con yodo-131 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 10 mg/mL, la concentración de alginato de potasio era de 10 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 500 Ci/mL.

Ejemplo 7

1 ml de catalasa (50 mg/ml) se mezcló con 1 ml de NHS-DTPA (1 pg/ml) durante una hora y después se dializó frente a agua durante un día usando una bolsa de diálisis con un peso molecular de corte de 3000 para obtener DTPA-catalasa.

Preparación de catalasa marcada con tecnecio-99: se mezcló y agitó tecnecio-99 (200 pci) con DTPA-catalasa y 1 pg de borohidruro de sodio durante 10 minutos y se purificó por ultrafiltración para obtener catalasa marcada con tecnecio-99.

La solución de alginato de sodio y la catalasa marcada con tecnecio-99 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 5 mg/mL, la concentración de alginato de sodio era de 5 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 200 Ci/mL.

Ejemplo 8

2 ml de catalasa (50 mg/ml) se mezcló con 1 mL de NHS-DTPA (1 pg/ml) durante una hora y después se dializó frente a agua durante un día usando una bolsa de diálisis con un peso molecular de corte de 3000 para obtener DTPA-catalasa.

Preparación de catalasa marcada con renio-188: se mezcló y agitó renio-188 (500 pci) con DTPA-catalasa y 1 pg de borohidruro de sodio durante 10 minutos y se purificó por ultrafiltración para obtener catalasa marcada con renio-188.

La solución de alginato de sodio y la catalasa marcada con renio-188 se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 10 mg/mL, la concentración de alginato de sodio era de 10 mg/mL y la dosis de radionúclido era de 500 Ci/mL.

Ejemplo comparativo 1

Preparación de yodo-131 ionizado combinado con alginato de sodio: 50 pl de la solución madre de yodo-131 se mezclaron con una solución de alginato de sodio de 5 mg/ml.

Ejemplo comparativo 2

Preparación de albúmina sérica humana marcada con yodo-131: se mezclaron 50 pl de solución madre de yodo-131 y 100 pl de cloramina-T de 0,1 mg/ml, y se añadieron 500 pl de medio de dispersión, después la mezcla de yodo-131 y cloramina-T se añadió a 500 pl de albúmina sérica humana de 5 mg/ml, se agitó y se mezcló en un agitador de vórtice durante 5 minutos, después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 15 minutos más tarde, la mezcla se transfirió a un tubo de ultrafiltración de 15 ml y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos, se lavó 3 veces con medio de dispersión, luego se extrajo el sobrenadante y se midió la actividad con un medidor de actividad.

La solución de alginato de sodio, la albúmina sérica humana marcada con yodo-131 y la solución de catalasa se mezclaron uniformemente para obtener una composición que comprendía catalasa, en la que la concentración de catalasa era de 5 mg/mL, la concentración de alginato era de 5 mg/mL y la dosis de radionúclido fue de 200 Ci/mL.

Ejemplo de prueba 1

La Figura 1 es un gráfico que muestra la formación de imágenes para controlar el movimiento de los radionúclidos en tumores de ratón dentro de las 48 h. Se realizaron una serie de experimentos en ratones para verificar que el gel de alginato puede confinar el radionúclido marcado en la bio-macromolécula dentro del tumor.

En donde la concentración de alginato de sodio fue de 5 mg/mL, la concentración de catalasa fue de 5 mg/mL y la dosis de yodo 131 fue de 200 Ci/mL. El medio de dispersión fue una solución de PBS y se inyectaron 50 pl en cada ratón. 6 ratones con cáncer de mama se dividieron en 6 grupos y se inyectaron intratumoralmente con:

A: yodo-131 ionizado;

B: albúmina sérica humana marcada con yodo-131;

C: la catalasa marcada con yodo-131 del Ejemplo 6;

D: el yodo-131 ionizado combinado con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo Comparativo 1

E: la albúmina sérica humana marcada con yodo-131 combinado con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo Comparativo 2

F: la catalasa marcada con yodo-131 combinada con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo 6.

El movimiento de la composición inyectada se observó con un Small Animal Radionuclide Imager a las 0, 4, 12, 24 y 48 h después de la inyección intratumoral. El movimiento del alginato de sodio y la catalasa marcada con yodo 131 se controló en tiempo real utilizando los rayos radiactivos emitidos por el núclido de yodo 131 después de la inyección directa en tumores de ratón. Como puede verse en la Figura 1, en el grupo de control sin alginato de sodio, la composición se había filtrado sustancialmente del tumor y había sido metabolizada del ratón por vía intravenosa 24 horas después de la inyección. Sin embargo, el alginato de sodio retuvo eficazmente las bio-macromoléculas marcadas con yodo-131 dentro del tumor. Por lo tanto, se indicó que se formó un gel cuando se inyectó el alginato de sodio en el tumor y se encontraron trazas de iones de calcio en el tumor, y el gel recubrió eficazmente las biomacromoléculas y las confinó dentro del tumor.

Ejemplo de prueba 2

La Figura 2 es un gráfico que muestra la formación de imágenes fotoacústicas para controlar la concentración de oxígeno en la sangre de tumores de ratón. La leyenda superior es una leyenda de formación de imágenes fotoacústicas y la leyenda inferior es una leyenda de formación de imágenes por ultrasonido. Se verificó adicionalmente la capacidad de la composición que comprende catalasa para aliviar la hipoxia en los modelos de tumor 4T1 de ratón. A 4 ratones con cáncer de mama se les inyectó por vía intratumoral con albúmina sérica humana, catalasa, albúmina sérica humana combinada con alginato de sodio y catalasa combinada con alginato de sodio, respectivamente. Se utilizó fotoacústica para controlar la concentración de oxígeno en la sangre de los tumores. La parte gris de la figura mostraba la forma del tumor detectado mediante la formación de imágenes por ultrasonido y la parte blanca mostraba la distribución del oxígeno disuelto. Puede verse en la Figura 2 que la combinación de alginato de sodio y catalasa aliviaba la hipoxia tumoral durante mucho tiempo. Debido a la presencia del gel de alginato de sodio, la catalasa se fijó bien dentro del tumor, obteniendo así un efecto de alivio de la hipoxia a largo plazo.

Ejemplo de prueba 3

Los ratones con cáncer de mama se dividieron en 2 grupos con 5 ratones en cada grupo y se sometieron a tratamientos experimentales paralelos. A los 2 grupos de ratones se les inyectó intratumoralmente solución salina fisiológica y un compuesto de catalasa y alginato de sodio, respectivamente. Después de la inyección intratumoral, la longitud y el ancho del tumor se midieron con un pie de rey cada dos días y el volumen del tumor se calculó como (largo * (ancho x ancho)) 2. La Figura 3 es un gráfico que muestra las curvas de crecimiento del tumor y las curvas de supervivencia del ratón. Puede verse que el compuesto de catalasa y alginato de sodio no tuvo ningún efecto letal sobre los tejidos tumorales a la concentración de prueba.

Ejemplo de prueba 4

La Figura 4 y la Figura 5 eran gráficos que mostraban las curvas de crecimiento del tumor de ratones y las curvas de supervivencia de ratones, respectivamente.

Los ratones con cáncer de mama se dividieron en 5 grupos con 5 ratones en cada grupo y se sometieron a tratamientos experimentales paralelos. Los 5 grupos de ratones se inyectaron por vía intratumoral con solución salina fisiológica, albúmina sérica humana marcada con yodo-131, catalasa marcada con yodo-131, la albúmina sérica humana marcada con yodo-131 combinada con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo Comparativo 2 y la catalasa marcada con yodo-131 combinada con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo 6 respectivamente. Después de la inyección intratumoral, la longitud y el ancho del tumor se midieron con un pie de rey cada dos días, y el volumen del tumor se calculó como (largo * (ancho * ancho)) 2. Se puede ver desde las curvas de crecimiento del tumor y las curvas de supervivencia del ratón (Figura 3 y Figura 4) que el sistema mejoró la capacidad terapéutica del yodo-131, mostrando un buen efecto terapéutico. Además, los ratones en grupo experimental que usaron una combinación de alginato de sodio y catalasa sobrevivieron durante más tiempo. En donde "control" representó un grupo de control en el que se inyectó solución salina fisiológica sola y no se mostró ningún efecto terapéutico; "1311-HAS" representaba albúmina sérica humana marcada con yodo 131 solo, en la que solo se mostró el efecto terapéutico del yodo 131; "1311-Cat" representó catalasa marcada con yodo 131, en la que se mostró el efecto terapéutico del yodo 131 después del alivio de la hipoxia; "131I-HSA/ALG" representó albúmina sérica humana marcada con yodo 131 combinado con alginato de sodio; y finalmente, "131I-Cat/ALG" representaba catalasa marcada con yodo 131 combinado con alginato de sodio.

Ejemplo de prueba 5

La Figura 6 y la Figura 7 eran gráficos que mostraban las curvas de crecimiento del tumor in situ y las curvas de crecimiento del tumor distal de ratones, respectivamente.

Los ratones con tumores inoculados con cáncer de colon de ratón en ambos lados de las nalgas se dividieron en 5 grupos con 5 ratones en cada grupo y se sometieron a un tratamiento que implicaba inmunoterapia combinada. Los 5 grupos de ratones fueron inyectados intratumoralmente respectivamente con

A solución salina fisiológica;

B la catalasa marcada con yodo 131 combinada con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo 6;

C la catalasa marcada con yodo 131 combinada con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo 6 en combinación con un anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos. Específicamente, la catalasa marcada con yodo 131 mezclada con alginato de sodio se inyectó en el tumor in situ, y el anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos se administró por vía intravenosa en el cuerpo.

D una composición de catalasa marcada con yodo 131 combinado con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo 6 y oligonucleótido CpG. En el momento de la inyección, la catalasa marcada con yodo 131 combinada con alginato de sodio se mezcló directamente con la composición de oligonucleótidos CpG y se inyectó in situ en el tumor.

E una composición de catalasa marcada con yodo 131 combinada con alginato de sodio como se proporciona en el Ejemplo 6 y oligonucleótido CpG en combinación con un anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos. La inyección se realizó de la siguiente manera: la catalasa marcada con yodo 131 combinada con alginato de sodio se mezcló directamente con la composición de oligonucleótidos CpG y se inyectó in situ en el tumor, y el anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos se administró por vía intravenosa en el cuerpo.

Después de la inyección intratumoral en el tumor in situ, la longitud y el ancho del tumor in situ y el tumor distal se midieron con un pie de rey cada dos días, y el volumen del tumor se calculó como (largo x (ancho x ancho) ) 2. Como se puede ver en las curvas de crecimiento del tumor in situ y las curvas de crecimiento del tumor distal (Figura 5 y Figura 6), se realizó una radioterapia interna mediante la catalasa marcada con yodo-131 combinada con alginato de sodio de manera efectiva y casi se eliminó por completo los tumores in situ, lo que dio como resultados la generación de antígenos relacionados. Por lo tanto, cuando la composición se usó en combinación con un nucleótido inmunoestimulante y un anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos, los tumores distales se inhibieron de manera efectiva, logrando así un tratamiento completo del cáncer.

Ejemplo de prueba 6

Después de 20 días de tratamiento, se recogió sangre de los globos oculares de los ratones y los tumores de los ratones se recogieron por disección. La sangre recogida se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1,5 h y luego se centrifugó a 3000 rpm durante 20 minutos para separar el suero. Las citoquinas relacionadas con el sistema inmunitario en suero y tumores se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

Como puede verse en la Figura 8, en comparación con los cuatro grupos de control A, B, C y D, porque a los ratones del grupo experimental clave se les inyectó intratumoralmente una composición de alginato de sodio, catalasa marcada con yodo-131 y un oligonucleótido adyuvante inmunológico y se administró por vía intravenosa con antígeno 4 asociado a linfocitos T anti-citotóxicos, los tumores in situ fueron eliminados mediante la radioterapia interna y se generó una gran cantidad de antígenos relacionados. Además, los factores inmunitarios relacionados, tales como las células T citotóxicas, aumentaron y las células T reguladoras se redujeron en ratones como resultado de la combinación con un adyuvante inmunológico y un agente inmunoestimulante, lo que indica que los linfocitos con propiedades destructoras de tumores aumentaron y los linfocitos que protegían los tumores se redujeron en ratones. La detección adicional de citoquinas en tumores distales reveló que el interferón gamma aumentó en consecuencia, lo que también indicó que los linfocitos que destruyen tumores dentro de los tumores aumentaron, y que el factor de necrosis tumoral alfa aumentó, lo que indicó que los tumores distales estaban severamente necróticos por desafío con linfocitos. Esta serie de fenómenos indicó que el uso combinado de un adyuvante inmunológico y un agente inmunoestimulante aumentó significativamente los linfocitos que eliminan tumores en ratones después de la eliminación de tumores in situ con radioterapia interna, y estos linfocitos reconocieron y atacaron las células tumorales distales en ratones y los hizo necróticos, lo que explica de manera convincente el buen efecto de la radioterapia interna combinada con la inmunoterapia.

Ejemplo de prueba 7

Se siguió investigando el comportamiento de penetración de diferentes concentraciones de alginato de sodio en tumores de ratón. La catalasa se marcó con colorante de fluoresceína de la siguiente manera: se añadieron 10 pl de colorante de fluoresceína a 1 ml de catalasa de 5 mg/ml, después se añadieron 10 mg de clorhidrato de 1-etil-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, se agitó durante 12 horas, después se transfirió 1,1 ml de la solución de reacción a una bolsa de diálisis que tenía un peso molecular de corte de 14800 y se dializó frente a agua durante dos días, y el agua se cambió cada 12 horas. Después de la diálisis, se obtuvo catalasa marcada con colorante de fluoresceína. La catalasa se mezcló con diferentes concentraciones de alginato de sodio (1, 5, 10 y 20 mg/ml) y se inyectó por vía intratumoral en tumores de ratones portadores de tumores. Los tumores se recogieron a las 4 horas y a las 72 horas, respectivamente, y se tiñeron las secciones del tumor. Como puede verse en la Figura 9, el alginato de sodio a una concentración de 5 mg/ml tenía una capacidad de gelificación adecuada y permitía que la composición se extendiera bien dentro del tumor, en comparación con una concentración de menos de 5 mg/ml que tenía una capacidad de gelificación insuficiente y provocó que la composición saliera del tumor a las 72 horas, y que a una concentración de más de 10 mg/ml gelificase demasiado rápido y provocó que la composición permaneciera en una parte determinada del tumor. En resumen, se puede concluir que 5-10 mg/ml fue la concentración óptima de alginato de sodio. La concentración de iones de calcio en ratones está en el intervalo de 1.5*10-3~1.8*10-3M, y la concentración en el cuerpo humano está en el intervalo de 1.5*10-3~1.8*10-3M también, por lo que la concentración de alginato de sodio para el cuerpo humano también es de 5 a 10 mg/ml.

Ejemplo de prueba 8

La Figura 10 era un gráfico que mostraba la curva de crecimiento tumoral de ratones.

Los ratones con cáncer de mama se dividieron en 3 grupos con 5 ratones en cada grupo y se sometieron a tratamientos experimentales paralelos. A los 3 grupos de ratones se les inyectó por vía intraturmoral una composición de catalasa marcada por diferentes dosis de yodo 131 y alginato de sodio, en donde la dosis de yodo 131 fue de 10, 20 y 50 microcurios respectivamente. Después de la inyección intratumoral, la longitud y el ancho del tumor se midieron con un pie de rey cada dos días, y el volumen del tumor se calculó como (largo * (ancho * ancho)) 2. Se puede ver de la curva de crecimiento del tumor (Figura 10) que el efecto de trasplante de tumor de la composición se alivió gradualmente a medida que aumentaba la dosis de yodo 131, y 50 pCi de yodo 131 eliminaron completamente los tumores en ratones.

Ejemplo de prueba 9

La Figura 11 era un gráfico que mostraba la curva de crecimiento tumoral de ratones.

Los ratones con cáncer de mama se dividieron en 3 grupos con 5 ratones en cada grupo y se sometieron a tratamientos experimentales paralelos. A los 3 grupos de ratones se les inyectó por vía intratumoral una composición de catalasa marcada por diferentes dosis de yodo 125 y alginato de sodio, en donde la dosis de yodo 125 fue de 10, 20 y 50 microcurios respectivamente. Después de la inyección intratumoral, la longitud y el ancho del tumor se midieron con un pie de rey cada dos días, y el volumen del tumor se calculó como (largo * (ancho * ancho)) 2. Se puede ver de la curva de crecimiento del tumor (Figura 11) que el efecto de trasplante de tumor de la composición aumentó gradualmente a medida que aumentaba la dosis de yodo 125, y 50 pCi de yodo 125 tenían el mejor efecto terapéutico.

Aplicabilidad industrial

La presente divulgación proporciona una composición que comprende catalasa, un método de preparación y uso de la misma y un método para eliminar células tumorales. La composición utiliza catalasa para descomponer el peróxido de hidrógeno en el tumor para producir oxígeno disuelto, aliviando así la hipoxia en las células tumorales; resolviendo los problemas de la técnica anterior que implican la resistencia a la radiación de las células tumorales hipóxicas; aumentando la uniformidad de la distribución de partículas radiactivas y la capacidad de los rayos radiactivos para eliminar células tumorales; mejorando los problemas de la técnica anterior que la distribución no uniforme y la mala cobertura de los radionúclidos que se han colocado en partículas portadoras por adelantado se producirán después de implantarse en el área de la lesión, sin afectar a los tejidos normales circundantes. La composición tiene buenas perspectivas para aplicaciones de terapia de tumores.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende catalasa, un alginato soluble y un radionúclido marcado en la catalasa.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que el alginato soluble incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en alginato de sodio, alginato de potasio, alginato de amonio y alginato de propilenglicol.

3. La composición según la reivindicación 2, en la que el alginato soluble es una mezcla de alginato de sodio y alginato de potasio.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que el radionúclido incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en yodo-131, yodo-125, fósforo-32, itrio-90, galio-67, indio-111, talio-201, paladio-203, bismuto-213, actinio-225, lutecio-177, renio-186, paladio-212 y renio-188.

5. La composición según la reivindicación 1, en la que el radionúclido es yodo-131 o yodo-125.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la concentración de la catalasa es de 5 mg/mL-10 mg/mL, la concentración del alginato es de 5 mg/mL-10 mg/mL y la dosis del radionúclido es 200 Ci/mL-500 Ci/mL.

7. La composición según la reivindicación 1, en la que la composición comprende además un agente inmunoestimulante.

8. La composición según la reivindicación 7, en la que el agente inmunoestimulante incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en oligodesoxinucleótido CpG que es un adyuvante inmunológico, R837, agonistas de TLR7, agonistas de TLR8, agonistas de NLR, agonistas de STING, MPLA (monofosforil lípido A ), LPS, PGNs, R848, G100, SD-101, MGN1703, CMP-001, FLA, polyU, poly(dT), CL307, CL264, CL097, CL075, MEDI9197, MEDI5083, hipoxantina y MDP.

9. Un método para preparar una composición que comprende catalasa, que comprende mezclar una solución de alginato con una catalasa marcada con radionúclido.

10. El método según la reivindicación 9, en el que la proporción de la cantidad de alginato, catalasa y radionúclido es de 5 mg-10 mg: 5 mg-10 mg: 200 Ci-500 Ci.

11. El método según la reivindicación 9, en el que la catalasa marcada con radionúclido se prepara mediante un método que comprende mezclar el radionúclido con un agente oxidante y preferiblemente, la catalasa marcada con radionúclido se prepara mediante un método que comprende mezclar la catalasa con un agente quelante, mezclar la mezcla obtenida con el radionúclido y un agente reductor y purificar.

12. El uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un agente antineoplásico;

preferiblemente, la composición se usa en combinación con al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo frente al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos, anti-PD-1 y anti-PD-L1.

13. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en un método para eliminar células tumorales, dicho método

que comprende inyectar la composición en un tumor por medio de un tratamiento intervencionista, en el que se forma una estructura de gel reticulado similar a una red según la estructura interna del tumor cuando los iones de alginato en la composición entran en el tumor y se encuentran con iones de calcio, y se adhieren al interior del tumor, de modo que los radionúclidos marcados en bio-macromoléculas y la catalasa están uniformemente recubiertos y confinados dentro del tumor; y en donde la catalasa descompone el peróxido de hidrógeno en el tumor para producir oxígeno disuelto para aliviar la hipoxia en las células tumorales; y los rayos generados por los radionúclidos eliminan las células tumorales en las que se ha aliviado la hipoxia;

preferiblemente, la concentración de calcio en sangre o en tumores y regiones de tejido circundante se ajusta antes del tratamiento intervencionista.