ES2925248T3 - Métodos para tratar una enfermedad o un trastorno oculares - Google Patents

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Abstract

La presente descripción proporciona métodos para tratar una enfermedad o trastorno ocular. Los métodos implican la administración directa en el ojo de un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para tratar una enfermedad o un trastorno oculares
Introducción
Los actuales fármacos polipeptídicos antiangiogénicos para pacientes con retinopatía diabética tienen corto tiempo de residencia en el humor vítreo del ojo. Con el fin de mantener las dosis biológicamente eficaces de fármaco para inhibir la neovascularización retiniana, se requiere que los pacientes reciban mensualmente inyecciones del fármaco, lo cual con frecuencia da como resultado bajo cumplimiento por parte del paciente y progresión de la enfermedad.
Altiok et al. (2016) Biomaterials 93:95 discute el efecto de los bioconjugados de ácido hialurónico multivalentes sobre la actividad de sFIt-1 in vitro.
Shahangian et al. (2015) Int. J. Biol. Macromol. 77:222-234 describe generar VHH para su uso en el bloqueo del sitio de unión al receptor de VEGF y competir con el VEGFR2.
Yu et al. (2015) Transí. Vis. Sci. & Technol. 4:5 presenta los resultados de un estudio de liberación in vivo de bevacizumab desde un hidrogel in situ basado en ácido hialurónico/dextrano tras la inyección intravítrea en el ojo de conejo.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o trastorno ocular. Los métodos implican la administración directa en el ojo de un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una representación esquemática de la síntesis del conjugado mvsFIt.
Las FIG. 2A-2C representan la inhibición de la angiogénesis corneal por sFlt y mvsFlt.
Las FIG. 3A-3B representan el tiempo de residencia de mvsFlt en el humor vítreo de rata.
Las FIG. 4A-4C representan la inhibición de la angiogénesis retiniana por mvsFlt.
Las FIG. 5A-5B proporcionan una representación esquemática de un mecanismo de acción del mvsFlt propuesto. La FIG. 6 representa el tiempo de residencia in vivo de dextrano con mayor peso molecular.
Las FIG. 7A-7D representan la síntesis de sFlt multivalente y los esquemas.
Las FIG. 8A-8D representan la caracterización de la eficacia de conjugación mvsFIt y el tamaño.
Las FIG. 9A-9B representan el efecto de los bioconjugados mvsFlt sobre las actividades dependientes de VEGF165 en ensayos ELISA de VEGF165 y de supervivencia de HUVEC dependiente de VEGF165.
Las FIG. 10A-10E representan el efecto de mvsFIt sobre la formación de tubo de HUVEC.
Las FIG. 11A-11B representan el efecto de mvsFIt sobre la migración de HUVEC conducida por VEGF165.
Las FIG. 12A-12C representan el efecto de la conjugación de sFIt con HyA sobre la movilidad y difusión de mvsFIt en geles de HyA.
Las FIG. 13A-13B representan los datos que muestran que la conjugación con HyA reduce la susceptibilidad a la degradación de proteasa por MMP-7.
Las FIG. 14A-14B representan la caracterización de un hidrogel de HyA.
Las FIG. 15A-15E representan los ajustes para los datos a partir de los datos de liberación del gel a la difusión de Fickian.
Las FIG. 16A-16C representan las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos biológicamente activos.
La FIG. 17 representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido biológicamente activo de sFIt ilustrativo. La FIG. 18 representa la secuencia de aminoácidos (SEQ Id NO:5) de un anticuerpo scFv anti-VEGF.
La FIG. 19 representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de un anticuerpo VHH anti-VEGF.
Las FIG. 20A-20C representan la unión de anticuerpos anti-VEGF no conjugados y conjugados a VEGF-A165. La FIG. 21 representa la semivida del anticuerpo VHH anti-VEGF multivalente conjugado en comparación con el anticuerpo VHH anti-VEGF no conjugado.
Las FIG. 22A-22B representan el tiempo de residencia in vivo y el porcentaje de proteína recuperada del anticuerpo VHH anti-VEGF multivalente conjugado y el anticuerpo VHH anti-VEGF no conjugado después de la inyección en los ojos de rata.
Las FIG. 23A-23B comparan la capacidad del anticuerpo VHH anti-VEGF multivalente conjugado y el anticuerpo VHH anti-VEGF multivalente conjugado con carboximetilcelulosa (CMC) de unirse a VEGF-A165 usando un ensayo ELISA.
Definiciones
Los términos "péptido", "polipéptido", y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente y polipéptidos que tienen cadenas principales peptídicas modificadas. El término "polipéptido" incluye proteínas de fusión, incluyendo, pero sin limitación, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin residuos de metionina en el extremo N; proteínas etiquetadas inmunológicamente; y similares. El término "polipéptido" incluye polipéptidos que comprenden uno o más de un resto de ácido graso, un resto de lípido, un resto de azúcar y un resto de hidrato de carbono. El término "polipéptidos" incluye polipéptidos modificados postraduccionalmente.
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" incluyen anticuerpos o inmunoglobulinas de cualquier isotipo, fragmentos de anticuerpos que conservan unión específica al antígeno, incluyendo, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fv, Fv monocatenario (scFv) y Fd, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de dominio único (VHH y v An R), y proteínas de fusión que comprenden una porción de unión a antígeno de un anticuerpo y una proteína que no sea un anticuerpo.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, por ejemplo, la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpo monocatenario; anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos camélidos o fragmentos "VHH" (véase, por ejemplo, Harmsen y De Haard (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:13); VNAR; y nanocuerpos; véase, por ejemplo, Wesolowski et al. (2009) Med. Microbiol. Immunol. 198:157); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, un nombre que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con antígeno y sigue siendo capaz de reticularse con el antígeno.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "sFv" comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl, lo que posibilita que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de los sFv, véase "Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas. 269-315 (1994)
Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes y se expresa como una constante de disociación (Kd). La afinidad puede ser al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1.000 veces mayor o más, que la afinidad de un anticuerpo por secuencias de aminoácidos no relacionadas. La afinidad de un anticuerpo por una proteína diana puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nanomolar (nM) a aproximadamente 0,1 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 picomolar (pM) o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 femtomolar (fM) o más. Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes a la disociación después de la dilución. Las expresiones "inmunorreactivo" y "se une preferentemente" se usan indistintamente en el presente documento con respecto a anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno.
El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido a, por ejemplo, interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas e iónicas y/o de enlace de hidrógeno, incluyendo interacciones tales como puentes de sal y puentes de agua. La afinidad inespecífica se referirá a una unión con una afinidad de menos de aproximadamente 10'7 M, por ejemplo, unión con una afinidad de 10'6 M, 10'5 M, 10'4 M, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "copolímero" describe un polímero que contiene más de un tipo de subunidad. El término abarca un polímero que incluye dos, tres, cuatro, cinco o seis tipos de subunidades.
Los términos "sujeto", "individuo" "hospedador", y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento para un miembro o miembros de cualquier especie de mamífero o no mamífero. Por tanto, los sujetos y pacientes incluyen, sin limitación, seres humanos, primates no humanos, cánidos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, porcinos (por ejemplo, cerdo)), aves, roedores (por ejemplo, ratas, ratones) y otros sujetos. Modelos de animales no humanos, particularmente mamíferos, por ejemplo, un primate no humano, un murino (por ejemplo, un ratón, una rata), lagomorfos, etc. pueden usarse para investigaciones experimentales.
"Tratar" o "tratamiento" de una afección o enfermedad incluye: (1) prevenir al menos un síntoma de la afección, es decir, hacer que un síntoma clínico no se desarrolle significativamente en un mamífero que pueda estar expuesto o predispuesto a la enfermedad pero que no haya experimentado o mostrado todavía los síntomas de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas, o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar una regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" significa la cantidad de un conjugado que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente, en combinación con otro agente, o solo en una o más dosis, para efectuar tal tratamiento para la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" puede variar dependiendo del conjugado, y dependiendo de uno u otros más factores, tales como la enfermedad y su gravedad, la edad, el peso, etc., del sujeto que se va a tratar.
La expresión "forma farmacéutica unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un conjugado, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable", "diluyente farmacéuticamente aceptable", "vehículo farmacéuticamente aceptable" y "adyuvante farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente, diluyente, vehículo y adyuvante que son útiles para preparar una composición farmacéutica que generalmente son seguros, no tóxicos y ni biológicamente ni de otro modo indeseables, e incluyen un excipiente, diluyente, vehículo y adyuvante que son aceptables para uso veterinario, así como para uso humano. "Un excipiente, diluyente, vehículo y adyuvante farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, incluye uno o más de uno de dicho excipiente, diluyente, vehículo y adyuvante.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno ocular en un individuo. El método generalmente implica la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad eficaz de un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible, donde la administración es directamente en el ojo, por ejemplo, la administración es administración intravítrea. Los métodos de tratamiento por sí mismo no forman parte de la invención reivindicada.
La vía de inyección intravítrea es el método más eficaz de administración de medicamentos a las estructuras en el ojo que están localizadas en la cámara posterior. Por lo tanto, es el método preferido para administrar fármacos que actúen sobre la retina. Sin embargo, cada inyección intravítrea conlleva un riesgo de provocar desprendimiento de retina como resultado de interferir con la integridad del ojo. La adición de volumen a la cámara posterior provoca un aumento en la presión intraocular, y existe riesgo asociado a la no adaptación del ojo al alivio de la presión añadida. También existe un riesgo de introducir una infección en el ojo. Todas estas complicaciones conllevan un riesgo de visión afectada, que debe considerarse frente a los posibles beneficios de la administración de un fármaco usando la vía intravítrea.
Por lo tanto, existe una fuerte motivación de mejorar el tiempo de residencia de los fármacos que están diseñados para ser inyectados de manera rutinaria en el humor vítreo por la vía intravítrea. Como alternativa, en algunos casos puede ser práctico modificar químicamente un fármaco existente con el fin de aumentar su tiempo de residencia dentro de la cámara posterior. Esta estrategia tiene el potencial de reducir la frecuencia de administración del fármaco y, como consecuencia, reducir el riesgo completo de complicación debido a la administración del fármaco con el tiempo. El aumento de la duración de la bioactividad también puede producir resultados terapéuticos aumentados para el fármaco.
El paciente puede preferir también un fármaco que presente mayor tiempo de residencia intravítrea en comparación con un medicamento que debe administrarse más frecuentemente para una función terapéutica equivalente. Aunque la inyección intravítrea se realiza bajo anestesia tópica y en general no se considera dolorosa, es una molestia para el paciente. Debe ser realizada por un médico y, por tanto, se requiere una visita al consultorio para cada administración del fármaco. Normalmente, hay irritación a corto plazo y visión borrosa debido al aumento del lagrimeo. También puede haber cambios a corto plazo a la apariencia del ojo en la proximidad del sitio de inyección. Por tanto, los pacientes probablemente presentarían una preferencia por una terapia equivalente que requiera menos inyecciones intravítreas.
La necesidad de inyecciones menos frecuentes también sería preferible desde la perspectiva del médico. Las inyecciones intravítreas deben ser realizadas por un oftalmólogo y, por tanto, este procedimiento puede ocupar una parte sustancial de su tiempo clínico. El número de pacientes que están recibiendo la terapia intravítrea en su práctica puede estar limitado por la frecuencia a la que cada paciente debe recibir las inyecciones intravítreas. Una inyección menos frecuente incrementaría el número de pacientes que son capaces de recibir el método de la terapia. También sería preferible un fármaco que actúe durante más tiempo para un dispositivo de administración de fármaco a largo plazo o de liberación prolongada ("depot"), ya que estos normalmente requieren un procedimiento de implantación mayor y acceso a una sala de intervenciones, que pueden compensar los beneficios de administración menos frecuente para el médico.
Un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible presenta una semivida en el humor intravenoso que es mayor que la semivida en el humor vítreo del polipéptido biológicamente activo no conjugado con el polímero biocompatible. La semivida aumentada del conjugado en el humor vítreo confiere determinadas ventajas, incluyendo, por ejemplo, reducción de la carga sobre el paciente; reducción del número y/o la frecuencia de administraciones; aumento de la seguridad; disminución de la incidencia de infección; aumento del cumplimiento por parte del paciente; y aumento de la eficacia. Asimismo, un conjugado como se describe en el presente documento permite el uso de polipéptidos para el tratamiento de trastornos oculares, dichos polipéptidos, en forma no conjugada, no se retendrían en el ojo durante un periodo de tiempo adecuado para la terapia.
En algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para inhibir la angiogénesis patológica en el ojo del individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis, es eficaz para inhibir la angiogénesis patológica en el ojo del individuo en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 %, o más del 80 %, en comparación con el grado de angiogénesis patológica en el ojo en ausencia del tratamiento con el conjugado, o antes del tratamiento con el conjugado.
En algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para reducir la presión intraocular en el ojo del individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis, es eficaz para reducir la presión intraocular en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 %, o más del 80 %, en comparación con la presión intraocular en el ojo en ausencia del tratamiento con el conjugado, o antes del tratamiento con el conjugado.
En algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para reducir el edema macular en el ojo del individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis, es eficaz para reducir el edema macular en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 %, o más del 80 %, en comparación con el nivel de edema macular en el ojo en ausencia del tratamiento con el conjugado, o antes del tratamiento con el conjugado.
En algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para aumentar la agudeza visual en el ojo del individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis, es eficaz para aumentar la agudeza visual en un ojo del individuo en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces, o más de 10 veces, en comparación con la agudeza visual en el ojo en ausencia del tratamiento con el conjugado, o antes del tratamiento con el conjugado.
En algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para inhibir la progresión de una enfermedad ocular en un individuo. Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis, es eficaz para inhibir la progresión de una enfermedad ocular en el individuo en al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o más, en comparación con la progresión en ausencia del tratamiento con el conjugado, o antes del tratamiento con el conjugado.
Por ejemplo, en algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis, es eficaz para inhibir la progresión de DMAE no exudativa a DMAE exudativa o para inhibir la progresión de DMAE no exudativa a una forma más grave. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para inhibir la progresión de DMAE temprana (AREDS 2) a DMAE intermedia (AREDS 3) o a DMAE avanzada (AREDS 4). En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para inhibir la progresión de DMAE intermedia (AREDS 3) a DMAE avanzada (AREDS 4).
En algunos casos, una cantidad eficaz de un conjugado es una cantidad que es eficaz para aumentar una actividad biológica de una célula retiniana, por ejemplo, donde la célula retiniana es un fotorreceptor, una célula ganglionar de la retina, una célula de Müller, una célula bipolar, una célula amacrina, una célula horizontal, o una célula del epitelio pigmentario de la retina.
Conjugados
Un conjugado de polipéptido-polímero (también denominado en el presente documento, por simplicidad, como "conjugado") adecuado para su uso en un método de tratamiento es de la fórmula:
X-(Y)n-Z
, donde X es un polipéptido biológicamente activo;
Y es un resto enlazador opcional, de modo que n es 0 o un número entero de 1 a 10; y
Z es un polímero biocompatible que comprende de aproximadamente 50 subunidades a 100.000 subunidades, y/o que tiene un peso molecular de 10 kDa a 500 kDa.
Un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible presenta una semivida en el humor vítreo que es al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces, o más de 1.000 veces, mayor que la semivida en el humor vítreo del polipéptido biológicamente activo no conjugado con el polímero biocompatible. Un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible presenta una semivida en el humor vítreo que es 5 veces a 10 veces mayor que la semivida en el humor vítreo del polipéptido biológicamente activo no conjugado con el polímero biocompatible.
En algunos casos, un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible presenta una semivida en el humor vítreo de 12 horas a 24 horas, de 1 día a 3 días, de 3 días a 7 días, de una semana a 2 semanas, de 2 semanas a 4 semanas o de 1 mes a 6 meses.
En algunos casos, un conjugado que comprende un polipéptido biológicamente activo y un polímero biocompatible presenta un tiempo de residencia terapéuticamente eficaz en el humor vítreo de 12 horas a 24 horas, de 1 día a 3 días, de 3 días a 7 días, de una semana a 2 semanas, de 2 semanas a 4 semanas, de 1 mes a 3 meses o de 3 meses a 6 meses.
La actividad biológica de un polipéptido conjugado con el sustrato polimérico se potencia con relación a la actividad del polipéptido en forma soluble, por ejemplo, en comparación con la actividad del polipéptido no conjugado al polímero. En algunos casos, la actividad biológica del polipéptido de un conjugado de polipéptido-polímero es de al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces, o más de 1.000 veces, mayor que la actividad biológica del polipéptido en forma soluble (no conjugada).
En algunos casos, la actividad biológica del polipéptido de un conjugado de polipéptido-polímero adecuado es de al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces, o más de 1.000 veces, mayor que la actividad biológica del polipéptido cuando se conjuga con el polímero a una relación molar de 1:1.
En algunos casos, la actividad biológica del polipéptido de un conjugado de polipéptido-polímero adecuado es de al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces, o más de 1.000 veces, mayor que la actividad biológica del polipéptido cuando está presente en mezcla con el polímero.
En algunos casos, la concentración efectiva media (CE50) del polipéptido de un conjugado de polipéptido-polímero objetivo es de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces, o más de 1.000 veces, menor que la CE50 del polipéptido en forma soluble (forma no conjugada).
En algunos casos, la concentración inhibidora media (CE50) del polipéptido de un conjugado de polipéptido-polímero objetivo es de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces, o más de 1.000 veces, menor que la CI50 del polipéptido en forma soluble (forma no conjugada).
Si la actividad biológica del polipéptido de un conjugado de polipéptido-polímero se aumenta con respecto a la actividad biológica del polipéptido en forma soluble (no conjugada) se determina fácilmente usando uno o más ensayos apropiados para la actividad biológica.
La relación molar entre el polipéptido y el polímero puede variar de 5:1 a 100:1, por ejemplo, de 5:1 a 7:1, de 7:1 a 10:1, de 10:1 a 12:1, de 12:1 a 15:1, de 15:1 a 20:1, de 20:1 a 25:1, de 25:1 a 30:1, de 30:1 a 35:1, de 35:1 a 40:1, de 40:1 a 45:1, de 45:1 a 50:1, de 50:1 a 60:1, de 60:1 a 70:1, de 70:1 a 80:1, de 80:1 a 90:1 o de 90:1 a 100:1.
Por ejemplo, el polipéptido antiangiogénico de un conjugado de polipéptido-polímero inhibe la angiogénesis en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1.000 veces, o más de 1.000 veces, o más, en comparación con el grado de inhibición de la angiogénesis por el polipéptido antiangiogénico cuando está presente en mezcla con el polímero, cuando está en forma soluble (no conjugado) o cuando está conjugado con el polímero en una relación molar de 1:1.
Polímeros
Los polímeros adecuados con los que se conjuga un polipéptido biológicamente activo incluyen polímeros biocompatibles que comprenden de 50 a 100.000 subunidades, por ejemplo, de 50 subunidades a 100 subunidades, de 100 subunidades a 500 subunidades, de 500 subunidades a 1.000 subunidades, de 1.000 subunidades a 5.000 subunidades, de 5.000 subunidades a 10.000 subunidades, de 10.000 subunidades a 25.000 subunidades, de 25.000 subunidades a 50.000 subunidades o de 50.000 subunidades a 100.000 subunidades. En algunas realizaciones, el polímero lineal comprende más de 100.000 subunidades.
Los polímeros adecuados con los que se conjuga un polipéptido biológicamente activo incluyen polímeros biocompatibles que tienen un peso molecular mayor que 500 kDa. Los polímeros adecuados con los que se conjuga un polipéptido biológicamente activo incluyen polímeros biocompatibles que tienen un peso molecular de 500 kDa a 2 millones de Daltons (MDa). Por ejemplo, los polímeros adecuados con los que se conjuga un polipéptido biológicamente activo incluyen polímeros biocompatibles que tienen un peso molecular de 500 kDa a 750 kDa, de 750 kDa a 1 MDa, de 1 MDa a 1,5 MDa o de 1,5 MDa a 2 MDa.
El polímero biocompatible es ácido hialurónico o, cuando el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo específico para VEGF, carboximetilcelulosa.
Polipéptidos biológicamente activos
El tamaño del polipéptido oscila de 5 kDa a 250 kDa, por ejemplo, de 5 kDa a 10 kDa, de 10 kDa a 25 kDa, de 25 kDa a 50 kDa, de 50 kDa a 100 kDa, de 100 kDa a 250 kDa.
Los polipéptidos biológicamente activos que son adecuados para la inclusión en un conjugado como se describe en el presente documento son un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) soluble y un anticuerpo de unión a VEGF.
En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo es un polipéptido de la tirosina cinasa-1 soluble tipo fms (sFlt-1). En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo anti-VEGF cámelido de dominio único (VHH) (anticuerpo VHH anti-VEGF). En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo anti-VEGF de Fv monocatenario (anticuerpo scFv anti-VEGF).
Los polipéptidos biológicamente activos que son adecuados para la inclusión en un conjugado como se describe en el presente documento incluyen un anticuerpo específico para VEGF.
Los anticuerpos adecuados incluyen, pero sin limitación, bevacizumab y ranibizumab.
En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo es un polipéptido de la tirosina cinasa-1 soluble tipo fms (sFlt-1). En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de 100 aminoácidos (aa) a 200 aa, de 200 aa a 300 aa, de 300 aa a 400 aa, de 400 aa a 500 aa, de 500 aa a 600 aa, de 600 aa a 700 aa, o de 700 aa a 755 aa, de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 16A. En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 16B. En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 16C. En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 17. En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo comprende la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 17. Un sitio de escisión de enterocinasa (DDDDK; SEQ ID NO:7) y un tramo poly(His) (HHHHHH; SEQ ID NO:8) están presentes en el extremo carboxilo de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 17. En algunos casos, un polipéptido de sFIt no incluye un sitio de escisión de enterocinasa o un tramo poly(His).
En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo es un polipéptido de sFIt-1 que tiene una longitud de 150 aminoácidos a 200 aminoácidos, de 200 aminoácidos a 250 aminoácidos, de 250 aminoácidos a 300 aminoácidos, de 300 aminoácidos a 350 aminoácidos, o de 350 aminoácidos a 400 aminoácidos.
En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo scFv anti-VEGF. Se puede usar cualquier anticuerpo scFv anti-VEGF adecuado. En la FIG. 18 se proporciona un ejemplo no limitante de una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo scFv anti-VEGF. Un sitio de escisión de enterocinasa (DDDDK; SEQ ID NO:7) y un tramo poly(His) (HHHHHH; SEQ ID NO:8) están presentes en el extremo carboxilo del anticuerpo scFv anti-VEGF representado en la FIG. 18. En algunos casos, un anticuerpo scFv anti-VEGF no incluye un sitio de escisión de enterocinasa o un tramo poly(His).
En algunos casos, el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo anti-VEGF cámelido de dominio único (VHH). Se puede usar cualquier anticuerpo VHH anti-VEGF adecuado. En la FIG. 19 se proporciona un ejemplo no limitante de una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo VHH anti-VEGF. Un sitio de escisión de enterocinasa (DDDDK; SEQ ID NO:7) y un tramo poly(His) (HHHHHH; s Eq ID NO:8) están presentes en el extremo carboxilo del anticuerpo VHH anti-VEGF representado en la FiG. 19. En algunos casos, un anticuerpo VHH anti-VEGF no incluye un sitio de escisión de enterocinasa o un tramo poly(His).
Enlazadores
Como se ha señalado anteriormente, en algunos casos, un conjugado de polipéptido-polímero adecuado comprende un grupo enlazador que une el polipéptido al polímero. Los enlazadores adecuados incluyen enlazadores peptídicos y enlazadores no peptídicos.
Un péptido enlazador puede tener cualquiera de diversas secuencias de aminoácidos. Los ejemplos de enlazadores peptídicos tienen entre aproximadamente 6 y aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, o entre aproximadamente 6 y aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. Ejemplos de enlazadores incluyen enlazadores poli(glicina) (por ejemplo, (Gly)n, donde n es un número entero de 2 a aproximadamente 10); enlazadores que comprenden Gly y Ser; y similares.
Conjugación
Se pueden usar diversos métodos de conjugación y químicas para conjugar un polipéptido con un polímero. Se pueden usar varios reactivos de reticulación de longitud cero, homobifuncionales y heterobifuncionales. Los reactivos de reticulación de longitud cero incluyen conjugación directa de dos grupos químicos intrínsecos sin introducción de material extrínseco. Los agentes que catalizan la formación de un puente disulfuro pertenecen a esta categoría. Otro ejemplo son los reactivos que inducen la condensación de un grupo carboxilo y un grupo amino primario para formar un enlace amida, tales como carbodiimidas, cloroformiato de etilo, reactivo K de Woodward (5-fenilisoxazolio-3'-sulfonato de 2-etilo) y carbonildiimidazol. Los reactivos homo y heterobifuncionales contienen generalmente dos sitios idénticos o dos diferentes, respectivamente, que pueden ser reactivos con grupos amino, sulfhidrilo, guanidino, indol o no específicos.
En algunos casos, el polímero comprende un grupo amino-reactivo para reaccionar con un grupo amina primario en el polipéptido, o en un enlazador. Los grupos amino-reactivos incluyen, pero sin limitación, ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), imidoésteres, isocianatos, haluros de acilo, arilazidas, ésteres de p-nitrofenilo, aldehídos y cloruros de sulfonilo.
En algunos casos, el polímero comprende un grupo reactivo con sulfhidrilo, por ejemplo, para reaccionar con un residuo de cisteína en el polipéptido. Los grupos reactivos con sulfhidrilo adecuados incluyen, pero sin limitación, maleimidas, haluros de alquilo, disulfuros de piridilo y tioftalimidas.
En otros casos, se usan carbodiimidas solubles en tanto agua como disolventes orgánicos, como reactivos carboxilreactivos. Estos compuestos reaccionan con los grupos carboxilo libres formando una pseudourea que después se puede acoplar a las aminas disponibles, produciendo un enlace amida.
Como se ha señalado anteriormente, en algunos casos, un polipéptido se conjuga con un polímero usando un agente reticulante homobifuncional.
En algunos casos, el agente reticulante homobifuncional es reactivo con aminas primarias. Los agentes reticulantes homobifuncionales que son reactivos con aminas primarias incluyen ésteres de NHS, imidoésteres, isotiocianatos, isocianatos, haluros de acilo, arilazidas, ésteres de p-nitrofenilo, aldehídos y cloruros de sulfonilo.
Ejemplos no limitantes de ésteres de NHS homobifuncionales incluyen glutarato de disuccinimidilo (DSG), suberato de disuccinimidilo (DSS), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS), tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST), bis-2-(succinimidooxicarboniloxi)etilsulfona (BSOCOES), bis-2-(sulfosuccinimidooxicarboniloxi)etilsulfona (sulfo-BSOCOES), etilenglicolbis(succinimidilsuccinato) (EGS), etilenglicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato) (sulfo-EGS), ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP), y ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato (sulfo-DSP). Ejemplos no limitantes de imidoésteres homobifuncionales incluyen malonimidato de dimetilo (DMM), succinimidato de dimetilo (DMSC), adipimidato de dimetilo (DMA), pimelimidato de dimetilo (DMP), suberimidato de dimetilo (DMS), 3,3'-oxidipropionimidato de dimetilo (DODP), 3,3'-(metilenodioxi)dipropionimidato de dimetilo (DMDP), 3'-(dimetilenodioxi)dipropionimidato de dimetilo (DDDP), 3,3'-(tetrametilenodioxi)-dipropionimidato de dimetilo (DTDP) y 3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo (DTBP).
Ejemplos no limitantes de isotiocianatos homobifuncionales incluyen: p-fenilendiisotiocianato (DITC) y estilbeno de ácido 4,4'-diisotiociano-2,2'-disulfónico (DIDS). Ejemplos no limitantes de isocianatos homobifuncionales incluyen diisocianato de xileno, tolueno-2,4-diisocianato, tolueno-2-isocianato-4-isotiocianato, 3-metoxidifenilmetano-4,4'-diisocianato, 2,2'-dicarboxi-4,4'-azofenildiisocianato y hexametilenodiisocianato. Ejemplos no limitantes de arilhaluros homobifuncionales incluyen 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB) y 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenil-sulfona. Ejemplos no limitantes de reactivos de aldehído alifáticos homobifuncionales incluyen glioxal, malodialdehído y glutaraldehído. Ejemplos no limitantes de reactivos de acilación homobifuncionales incluyen ésteres de nitrofenilo de ácidos dicarboxílicos. Ejemplos no limitantes de cloruros de sulfonilo aromáticos homobifuncionales incluyen cloruro de fenol-2,4-disulfonilo y cloruro de a-naftol-2,4-disulfonilo. Ejemplos no limitantes de reactivos homobifuncionales aminoreactivos adicionales incluyen biscarbonato de eritritol, que reacciona con aminas para dar biscarbamatos.
En algunos casos, el agente reticulante homobifuncional es reactivo con grupos sulfhidrilo libres. Los agentes reticulantes homobifuncionales reactivos con grupos sulfhidrilo libres incluyen, por ejemplo, maleimidas, disulfuros de piridilo y haluros de alquilo.
Ejemplos no limitantes de maleimidas homobifuncionales incluyen bismaleimidohexano (BMH), N,N'-(1,3-fenileno)bismaleimida, N,N'-(1,2-fenileno)bismaleimida, azofenildimaleimida, y bis(N-maleimidometil) éter. Ejemplos no limitantes de disulfuros de piridilo homobifuncionales incluyen 1,4-di-3'-(2-piridilditio)propionamidobutano (DP-DPB). Ejemplos no limitantes de haluros de alquilo homobifuncionales incluyen 2,2'-dicarboxi-4,4'-diyodoacetamidoazobenceno, a, ácido a'-diiodo-p-xilenosulfónico, a, ácido a'-dibromo-p-xilenosulfónico, N,N'-bis(bbromoetil)benzilamina, N,N'-di(bromoacetil)fenilhidrazina y 1,2-di(bromoacetil)amino-3 -fenilpropano.
Como se ha señalado anteriormente, en algunos casos, un polipéptido se conjuga con un polímero usando un reactivo heterobifuncional. Los reactivos heterobifuncionales adecuados incluyen reactivos amino-reactivos que comprenden un resto de disulfuro de piridilo; reactivos amino-reactivos que comprenden un resto de maleimida; reactivos aminoreactivos que comprenden un resto de haluro de alquilo; y reactivos amino-reactivos que comprenden un resto de dihaluro de alquilo.
Ejemplos no limitantes de reactivos heterobifuncionales con un resto de disulfuro de piridilo y un éster de NHS aminoreactivo incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 6-3-(2-piridilditio)propionamidohexanoato de succinimidilo (LC-SPDP), 6-3-(2-piridilditio)propionamidohexanoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-LCSPDP), 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno (SMPT), divinil sulfona (DVS) y 6-a-metil-a-(2-piridilditio)toluamidohexanoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-LC-SMPT).
Ejemplos no limitantes de reactivos heterobifuncionales con un resto de maleimida y un éster de NHS amino-reactivo incluyen maleimidilacetato de succinimidilo (AMAS), 3-maleimidilpropionato de succinimidilo (BMPS), éster de N-gamma-maleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS), éster de N-gamma-maleimidobutiriloxisulfo succinimida (sulfo-GMBS), 6-maleimidilhexanoato de succinimidilo (EMCS), 3-maleimidilbenzoato de succinimidilo (SMB), mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB) y 4-(pmaleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMPB).
Ejemplos no limitantes de reactivos heterobifuncionales con un resto de haluro de alquilo y un éster de NHS aminoreactivo incluyen (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB), 4-yodoacetil)aminobenzoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SIAB), 6-(yodoacetil)aminohexanoato de succinimidilo (SIAX), 6-(6-((yodoacetil)-amino)hexanoilamino)hexanoato de succinimidilo (SIAXX), 6-(((4-(yodoacetil)-amino)-metil)-ciclohexano-1-carbonil)aminohexanoato de succinimidilo (SI-ACX), y 4((yodoacetil)-amino)metilciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SIAC).
Un ejemplo no limitante de un reactivo heterobifuncional que comprende un éster de NHS amino-reactivo y un resto dihaluro de alquilo es 2,3-dibromopropionato de N-hidroxisuccinimidilo (SDBP). Un ejemplo no limitante de un reactivo heterobifuncional que comprende un resto de haluro de alquilo y un resto de éster de p-nitrofenilo amino-reactivo incluyen yodoacetato de p-nitrofenilo (NPIA).
Composiciones, formulaciones, dosis y vías de administración
En algunos casos, el conjugado de polipéptido-polímero para su uso en un método de tratamiento de acuerdo con la invención es homogéneo, por ejemplo, todos los polipéptidos del conjugado de polipéptido-polímero comprenden la misma secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, en algunos casos, una composición que se va a administrar a un individuo comprende una pluralidad de (por ejemplo, copias múltiples de) un conjugado de polipéptido-polímero, donde cada molécula de conjugado de polipéptido-polímero comprende polipéptidos que tienen todos la misma secuencia de aminoácidos.
En algunos casos, una composición que comprende un conjugado de polipéptido-polímero comprende dos o más especies de un conjugado de polipéptido-polímero, por ejemplo, una composición comprende un primer conjugado de polipéptido-polímero, en donde el primer conjugado de polipéptido-polímero comprende polipéptidos de una primera secuencia de aminoácidos; y al menos un segundo conjugado de polipéptido-polímero, en donde el segundo conjugado de polipéptido-polímero comprende polipéptidos de una segunda secuencia de aminoácidos que es diferente de la primera secuencia de aminoácidos. En algunos casos, una composición comprende un tercer conjugado de polipéptido-polímero o adicional. Como ejemplo no limitante, un primer conjugado de polipéptido-polímero comprende un primer polipéptido que es un polipéptido antiangiogénico; y un segundo conjugado de polipéptidopolímero que comprende un segundo polipéptido que inhibe una ruta de señalización celular. Se pueden usar diversas otras combinaciones de los polipéptidos primero, segundo, etc. Se puede variar la relación del primer conjugado de polipéptido-polímero y el segundo conjugado de polipéptido-polímero en una composición, por ejemplo, de aproximadamente 0:001 a 103 a aproximadamente 103 a 0,001. De manera similar, cuando una composición objetivo comprende un primer, un segundo y un tercer conjugado de polipéptido-polímero, se pueden variar las relaciones del primer, segundo y tercer conjugado de polipéptido-polímero.
Una composición adecuada para su uso en un método de la presente divulgación puede comprender, además de un conjugado de polipéptido-polímero, uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCh, KCl, MgSO4, etc.; un agente tampón, por ejemplo, un tampón Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal de sodio de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; y similares.
Una composición adecuada para su uso en un método de la presente divulgación puede comprender un conjugado de polipéptido-polímero (como se ha descrito anteriormente) y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Vehículos excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Asimismo, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o agentes tampones del pH. Los métodos concretos de preparación de dichas formas farmacéuticas son conocidos, o resultarán evidentes, para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, Pa., 17a edición, 1985. La composición o formulación que se va a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad del agente adecuado para alcanzar el estado deseado en el sujeto que se está tratando. Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, excipientes o diluyentes, están fácilmente disponibles para el público. Además, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste del pH y tampones, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares, están fácilmente disponibles para el público.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "vehículo farmacéuticamente aceptable" y "excipiente farmacéuticamente aceptable" se usan indistintamente e incluyen cualquier material que, cuando se combina con un conjugado de polipéptido-polímero, no afecta sustancialmente a la actividad biológica del conjugado, no induce una respuesta inmune en un hospedador y no tiene ningún efecto fisiológico adverso sustancial sobre el hospedador. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los vehículos estándar tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir soluciones estériles, comprimidos que incluyen comprimidos recubiertos y cápsulas. Normalmente, tales vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, determinados tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, estearato de magnesio o calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos pueden también incluir aditivos aromatizantes y colorantes u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan mediante métodos convencionales bien conocidos.
Las composiciones se pueden formular para una manera de administración seleccionada, incluyendo, por ejemplo, intraocular, por ejemplo, administración intravítrea.
Una composición que comprende un conjugado puede incluir un vehículo acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina, solución salina tamponada con fosfato y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tampones, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares.
Una composición se puede esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales, o se puede esterilizar por filtración. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso tal cual, o liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con un vehículo acuoso estéril antes de la administración. La solución acuosa resultante puede estar envasada en una jeringuilla de vidrio. El pH de las preparaciones puede variar entre 3 y 11, por ejemplo, de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, o de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 8.
Dosis adecuadas de un conjugado, para su uso en un método de la presente divulgación, incluyen de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 10 mg, por ejemplo, de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 5 |jg, de aproximadamente 5 jg a aproximadamente 10 jg , de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 20 jg , de aproximadamente 20 jg a aproximadamente 25 jg , de aproximadamente 25 jg a aproximadamente 50 jg , de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 100 jg , de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 150 jg , de aproximadamente 150 jg a aproximadamente 250 jg , de aproximadamente 250 jg a aproximadamente 500 jg , de aproximadamente 500 jg a aproximadamente 750 jg , de aproximadamente 750 jg a aproximadamente 1 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 10 mg, por dosis. En algunos casos, dosis adecuadas de un conjugado, para su uso en un método de la presente divulgación, incluyen de 10 mg a 100 mg, por ejemplo, de 10 mg a 20 mg, de 20 mg a 25 mg, de 25 mg a 50 mg, de 50 mg a 75 mg o de 75 mg a 100 mg, por dosis.
En algunas realizaciones, se administran múltiples dosis de un conjugado. La frecuencia de administración de un conjugado puede variar dependiendo de cualquiera de diversos factores, por ejemplo, gravedad de los síntomas, etc. Por ejemplo, en algunos casos, un conjugado se administra una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, cada dos semanas (qow), una vez por semana (qw), dos veces por semana (biw), tres veces por semana (tiw), cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, cada dos días (qod), a diario (qd), dos veces al día (qid) o tres veces al día (tid). En algunas realizaciones, un conjugado se administra una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada 6 meses o una vez al año.
En algunos casos, una composición que comprende un conjugado se administra mediante una vía de administración intravítrea, transcleral, periocular, conjuntiva, subtenón, intracameral, subretiniana, subconjuntival, retrobulbar u intracanicular. En algunos casos, una composición que comprende un conjugado se administra por vía intravítrea. En algunos casos, la composición se administra por vía intravítrea o en proximidad estrecha al segmento posterior del ojo. En algunos casos, la composición se administra por vía intravítrea por inyección. En algunos casos, una composición que comprende un conjugado se administra por inyección intraocular.
Trastornos
Los trastornos oculares que se pueden tratar usando un conjugado para el uso de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, degeneración macular, neovascularización coroidea, edema macular, neovascularización de la retina, vitreorretinopatía proliferativa, glaucoma e inflamación ocular.
Las enfermedades oculares que se pueden tratar usando un conjugado para el uso de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, neuroretinopatía macular aguda; enfermedad de Behcet; neovascularización coroidea; uveítis diabética; histoplasmosis; degeneración macular, tal como la degeneración macular aguda, la degeneración macular asociada a la edad no exudativa y la degeneración macular asociada a la edad exudativa; edema, tal como el edema macular, el edema macular cistoide y el edema macular diabético; coroiditis multifocal; trauma ocular que afecta a un sitio o ubicación ocular posterior; tumores oculares; trastornos de la retina, tales como la oclusión venosa retiniana, retinopatía diabética (incluida la retinopatía diabética proliferativa y el edema macular diabético), vitreorretinopatía proliferativa (VRP), enfermedad oclusiva arterial retiniana, desprendimiento de retina, enfermedad retiniana uveítica; oftalmia del simpático; síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (VKH); efusión uveal; una afección ocular posterior causada o influenciada por un tratamiento con láser ocular; afecciones oculares posteriores causadas o influenciadas por una terapia fotodinámica; fotocoagulación, retinopatía por radiación; trastornos de la membrana epirretiniana; oclusión de una rama venosa de la retina; neuropatía óptica isquémica anterior; disfunción retiniana diabética no retinopatía; retinosquisis; retinitis pigmentosa; glaucoma; síndrome de Usher, distrofia de cono-bastón; enfermedad de Stargardt (Fundus flavimaculatus); degeneración macular hereditaria; degeneración coriorretiniana; amaurosis congénita de Leber; ceguera nocturna estacionaria congénita; coroideremia; síndrome de Bardet-Biedl; telangiectasia macular; neuropatía óptica hereditaria de Leber; retinopatía del prematuro; y trastornos de la visión del color, incluidos acromatopsia, protanopia, deuteranopia y tritanopia.
En algunos casos, la enfermedad ocular es glaucoma, retinitis pigmentaria, degeneración macular, retinosquisis, amaurosis congénita de Leber, retinopatía diabética, acromotopsia o ceguera del color.
SUJETOS ADECUADOS PARA TRATAMIENTO
Los sujetos adecuados para el tratamiento con un conjugado para el uso de la presente divulgación incluyen individuos que se les ha diagnosticado una enfermedad o trastorno ocular, por ejemplo, cualquier enfermedad o trastorno ocular anteriormente enumerado. Los sujetos adecuados para el tratamiento con un conjugado para el uso de la presente divulgación incluyen individuos que han sido tratados para una enfermedad o trastorno ocular, y que no han respondido al tratamiento.
Los individuos adecuados para el tratamiento con un conjugado para el uso de la presente divulgación incluyen individuos con agudeza visual reducida debido a una enfermedad o trastorno ocular. Los individuos adecuados para el tratamiento con un conjugado para el uso de la presente divulgación incluyen individuos con presión ocular anormalmente alta debido a una enfermedad o trastorno ocular. Los individuos adecuados para el tratamiento con un conjugado para el uso de la presente divulgación incluyen individuos con angiogénesis patológica en un ojo debido a una enfermedad o trastorno ocular.
La agudeza visual se puede medir usando, por ejemplo, una tabla de Snellen, una tabla de Bailey-Lovie, una tabla de progresión decimal, una prueba de agudeza visual de Freiburg, una medición del ángulo mínimo de resolución (MAR), etc. La metamorfopsia (distorsión visual) se puede medir usando una tabla de Amsler. La sensibilidad al contraste se puede medir usando una tabla de Pelli-Robson. Los estudios de diagnóstico incluyen, pero sin limitación, el examen oftalmológico estándar del fondo, el examen estéreo biomicroscópico de la mácula, la angiografía con fluoresceína del fondo intravenoso, fotografía del fondo, la videoangiografía con verde indocianina y la tomografía de coherencia óptica. Un sujeto que muestre una anomalía sobre uno o más de estos estudios de diagnóstico (por ejemplo, un sujeto que cae fuera de un intervalo que es considerado normal para un ojo sano) se puede tratar de acuerdo con la presente divulgación. Por ejemplo, los sujetos se pueden clasificar como que tiene DMAE temprana, intermedia o avanzada de acuerdo con el esquema de clasificación usado en el estudio de las enfermedades del ojo asociadas a la edad. Un sujeto que está dentro de cualquiera de las categorías descritas en el presente documento, se puede tratar de acuerdo con un método de la presente divulgación.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar la presenta invención y no se pretende que limiten el ámbito de la invención, que se define por las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Los conjugados multivalentes de sFIt inhiben la angiogénesis y mejoran la semivida in vivo
Para mejorar el tiempo de residencia intravítrea de fármacos anti-VEGF, se sintetizaron bioconjugados multivalentes de una proteína anti-VEGF. Los conjugados comprenden tirosina cinasa-1 tipo fms (sFlt) soluble que se injertan de manera covalente a las cadenas de ácido hialurónico (HyA). Los conjugados se denominan mvsFIt. Usando un ensayo de angiogénesis corneal de ratón, se demostró que la conjugación covalente con las cadenas de HyA no disminuye la bioactividad de sFIt y que mvsFIt es equivalente a sFIt en la inhibición de la angiogénesis corneal. En un modelo de humor vítreo de rata, se observó que mvsFIt había aumentado significativamente el tiempo de residencia intravítrea en comparación con sFIt no conjugada después de 2 días. Las semividas intravítreas calculadas para sFIt y mvsFIt eran de 3,3 y 35 horas, respectivamente. Por otra parte, se mostró que mvsFIt es más eficaz que la forma no conjugada en la inhibición de la neovascularización retiniana en un modelo de retinopatía inducida por oxígeno, un efecto que es lo más probable debido a la mayor semivida de mvsFIt en el humor vítreo. Considerados en conjunto, los resultados indican que la conjugación de sFIt con HyA no afecta a su afinidad para VEGF y esta conjugación mejora significativamente la semivida del fármaco. Estos resultados in vivo dan como resultado que la conjugación multivalente puede mejorar sustancialmente la semivida del fármaco y, por tanto, la eficacia de los fármacos actualmente disponibles que se usan en enfermedades tales como la retinopatía diabética, mejorando de este modo la calidad de vida del paciente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Expresión del receptor de Fit-1 soluble
La secuencia de sFIt para los primeros 3 dominios extracelulares tipo Ig de sFIt-1 [13] se clonó en el plásmido pFastBac1 (Life Technologies) y, a continuación, se transformó en DH10Bac E.coli, que se sembraron en placas antibióticas triples que contenían kanamicina (50 pg/ml, Sigma Aldrich), gentamicina (7 pg/ml, Sigma Aldrich), tetraciclina (10 |jg/ml, Sigma Aldrich), IPTG (40 |jg/ml, Sigma Aldrich) y Bluo-gal (100 |jg/ml, Thermo Fisher Scientific). Se aisló el bácmido que contenía el gen de sFIt de DH10Bac E.coli (Life Technologies) y se transfirió a células insectos SF9 para la producción vírica (proporcionadas por la "Tissue Culture Facility", UC Berkeley). A continuación, el virus se usó para infectar células de insecto High Five (proporcionadas por la "Tissue Culture Facility", UC Berkeley) para inducir la expresión de la proteína sFIt. Después de 3 días, la proteína se purificó del sobrenadante usando perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen Laboratories). La sFIt recombinante se eluyó de las perlas Ni-NTA usando un gradiente de imidazol (Sigma Aldrich) y, a continuación, se concentró y se intercambió el tampón con 10 % de glicerol/PBS usando dispositivos centrífugos de 15 ml Amicon Ultra (EMD Millipore). La solución proteica se filtró en estéril y la concentración se determinó mediante el ensayo de BCA (Thermo Fisher Scientific).
Síntesis del conjugado mvsFIt
La conjugación de sFIt con HyA se llevó a cabo de acuerdo con el esquema en la Figura 1 y como se ha descrito previamente [12,14-16]. Para preparar los intermediarios de HyA tiol-reactivos, se añadieron hidrazida de 3,3’-N-(ácido £-maIeimidocaproico) (EMCH, Pierce, 1,2 mg/ml), 1-hidroxibenzotriazol hidrato (HOBt, Sigma, 0,3 mg/ml) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, Pierce, 10 mg/ml) a una solución de 3 mg/ml de HyA de 650 kDa (Lifecore Biotechnology) en tampón de ácido 2-(N-morfoIino) etanosulfónico (MES) (Sigma) 0,1 M (pH 6,5) y se dejó reaccionar a 4 °C durante 4 h. A continuación, la solución se dializó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,0 que contenía glicerol al 10 %. La sFIt recombinante se trató con 2-iminotiolano en un exceso de 10 molar para crear grupos tioles para la conjugación con el grupo maleimida en EMCH. A continuación, el HyA-EMCH activado se añadió a sFIt a una relación molar de 1:10 (HyA con sFIt) y se dejó reaccionar a 4 °C durante la noche para sintetizar el conjugado mvsFIt final. El conjugado mvsFIt se dializó con Float-A-Lyzer G2 (Spectrum Labs) con corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa en PBS pH 7,0 exhaustivamente para eliminar la sFIt sin reaccionar. La concentración de mvsFIt se midió usando un ensayo de BCA.
Figura 1: Síntesis del esquema de mvsFIt. Los bioconjugados mvsFIt se sintetizaron usando una reacción en 3 etapas en la que se hizo reaccionar HyA con EDC y EMCH para crear un intermediario HyA-EMCH reactivo con tiol. A continuación, la sFIt se trató con 2-iminotiolano y se hizo reaccionar con el intermediario HyA-EMCH para la síntesis del bioconjugado mvsFIt final.
Ensayo de la angiogénesis corneal
Todos los experimentos se realizaron con ratones FVB/n miembros de la camada machos y hembras de 7 a 12 semanas de tipo silvestre. Los ratones se mantuvieron en condiciones sin patógeno en la instalación protectora de UCSF y se condujeron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el "UCSF Institutional Animal Care and Use Committee" (IACUC). Todos los experimentos fueron aprobados por el IACUC de UCSF antes del trabajo. Los ratones se anestesiaron mediante inhalación de isofluorano (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), 10mg/kg de carprofreno (Sigma, St. Louis, MO), y mediante aplicación tópica de proparacaína al 0,5 % (Bausch & Lomb, Rochester, NY) colocados en la córnea. Se creó una quemadura alcalina aplicando un papel de filtro de 2,5 mm de diámetro empapado en NaOH 0,1 N (Sigma Aldrich) durante 30 segundos a la córnea central seguido de aclarado con 250 j l de PBS. Después del tratamiento de la quemadura química, se añadió proparacaína al 0,5 % tópica a la córnea para la anestesia. A los ratones se les administró inyecciones subconjutivas de 5 j l con sFIt (150 jg/ml), mvsFIt (150 jg/m l) o PBS el día 1 y el día 3 después de la quemadura. Diez días después del tratamiento, los ojos se enuclearon y las córneas se diseccionaron y se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche a 4 °C. Las córneas se sometieron a bloqueo con BSA al 3 % y se tiñeron con DAPI, anticuerpo primario de conejo anti-CD31 de ratón (Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpo secundario de cabra anti-Alexa Fluor 488 de conejo (Life Technologies) para la visualización y la cuantificación de los vasos sanguíneos. Las córneas se cortaron en cuadrantes y se montaron en plano sobre portaobjetos de vidrio usando el medio de montaje Fluoromount (Sigma Aldrich). Se realizaron imágenes con un escáner de portaobjetos automatizado, Zeiss Axioscan Z1 (Zeiss Instruments). La cobertura de vaso sanguíneo corneal se cuantificó usando el programa informático NIH ImageJ comparando el área corneal total con el área vascularizada corneal.
Determinación del tiempo de residencia intravítreo de mvsFIt
Todos los experimentos del tiempo de residencia se realizaron sobre ratas Brown Norway de 8 semanas de "Charles River Laboratories" y se trataron de acuerdo con los protocolos aprobados por el "Institutional Animal Care and Use Committee" en UC Berkeley. Todos los experimentos fueron aprobados por el IACUC de UC Berkeley antes del trabajo. Las ratas se anestesiaron usando una mezcla de ketamina y xilazina (50 mg y 10 mg/kg de peso corporal, respectivamente) para el procedimiento quirúrgico. Los ojos se inyectaron por vía intravítrea 1 mm por debajo del limbo con 5 j l de PBS, sFIt o mvsFIt a 1 mg/ml usando una jeringuilla Hamilton de calibre 30 y se monitorizaron diariamente las señales de inflamación. Esta concentración se seleccionó para maximizar la fluorescencia en el humor vítreo y permanecer en el límite de detección del fluorómetro después de 48 horas. Las ratas se sacrificaron por asfixia con CO2 en grupos a las 0, 4, 12, 24 y 48 horas después de la inyección y los ojos se enuclearon inmediatamente y se colocaron en hielo seco. A continuación, se extrajo el humor vítreo congelado del ojo y se sumergió en 100 j l de tampón RIPA. Después de agitar en hielo durante 2 horas, cada muestra del humor vítreo se homogeneizó con un Tissue Tearor (Bio Spec Products, Inc.) y la fluorescencia se midió usando un fluorómetro (Molecular Devices). La cuantificación se llevó a cabo normalizando la fluorescencia de las muestras del humor vitreo a las 0 horas de las lecturas de fluorescencia del humor vítreo dentro de su respectivo grupo. Las semividas de sFIt y mvsFIt se calcularon de acuerdo con la Ec. 1:
Figure imgf000014_0001
donde Ctes la concentración en el tiempo t, Co es la concentración inicial y k es la constante de eliminación dada por la Ec. 2:
Figure imgf000014_0002
donde ti /2 es la semivida del fármaco. Los valores usados para calcular tv2 se basaron en los datos del momento 48 horas.
Modelo de angiogénesis de rata OIR
Se obtuvieron ratas Brown Norway preñadas de "Charles River Laboratories". Todos los experimentos animales se realizaron en cumplimento con la declaración ARVO para el uso de animales en investigación oftalmológica y de la visión, y aprobada por el "University of Oklahoma Institutional Animal Care and Use Committee". Las crías recién nacidas se asignaron a grupos de tratamiento con PBS, sFIt o mvsFIt. La luz se cicló en un calendario de 12 horas encendida, 12 horas apagada y la temperatura ambiente se mantuvo a aproximadamente 21 °C. Las crías de rata se expusieron a hiperoxia (O2 al 75 %) a partir del día 7 postnatal (P7) a P12. Las ratas tratadas con oxígeno se guardaron en una incubadora conectada a un Oxycler Modelo A4 (Redfield, NY) con oxígeno y nitrógeno, que permitía el ajuste de la concentración de oxígeno hasta el 75/0±2 %. Las ratas se colocaron en la cámara de oxígeno con la suficiente comida y agua para mantenerlas durante 5 días. En P12, los animales de volvieron al aire ambiente y se administraron inyecciones intravítreas con 2 pl por ojo de PBS, sFIt o mvsFIt a 150 pg/ml. Las ratas en P17 se anestesiaron y se perfundió FITC-dextrano de alto peso molecular (2 x 106; Sigma-Aldrich, St. Louis MO) como se describe por Smith et al [17]. Las retinas se diseccionaron y se montaron en plano y se hicieron imágenes de la vasculatura usando un microscopio de fluorescencia (CKX41; Olympus). La cobertura vascular en P17 se cuantificó usando NIH ImageJ comparando el área retiniana total con el área de vascularización.
Análisis estadístico
Los valores se expresan como medias ± desviaciones típicas (SD). El análisis estadístico se realizó con las pruebas t de dos colas para comparar los valores medios. También se usaron ANOVA unidireccional (con el análisis post-hoc de Tukey) y bidireccional (con prueba posterior de Bonferroni) para comparar los grupos de tratamiento en las medidas cuantitativas cuando fuera apropiado (Prism, programa informático GraphPad ). Un valor P de menos de 0,05 se consideraba estadísticamente significativo.
RESULTADOS
sFIt y mvsFIt inhiben igualmente la angiogénesis corneal
Se usó el modelo de angiogénesis corneal basado en lesión química para determinar si la conjugación de sFIt con HyA reducía la bioactividad de mvsFIt en comparación con sFIt in vivo. Diez días después de la lesión corneal, todos los ratones tratados con sFIt y mvsFIt mostraron perfiles inhibidores similares de angiogénesis corneal (Fig 2). Las córneas tratadas con PBS tenían un 28,8±11,5 % de cobertura de vaso sanguíneo a diferencia de las córneas tratadas con sFIt y mvsFIt, que tenían un 12,8±3,8 % y un 15,8±7,1 % de cobertura vascular, respectivamente.
Fig. 2A-2C: sFIt y mvsFIt inhiben igualmente la angiogénesis corneal. A) Esquema que representa métodos utilizados para llevar a cabo el modelo de quemadura corneal. Los ratones se trataron dos veces con 5 pl de PBS, sFIt o mvsFIt el día 1 y 3 tras la quemadura química. B) Imágenes representativas de los ojos tratados con PBS, sFIt y mvsFIt. Tinción CD31 positiva (verde) de los vasos sanguíneos de la córnea. C) Cuantificación de la angiogénesis corneal el día 10 tras el tratamiento. El ANOVA unidireccional da un valor p **<0,01 (n.s. - no significativo); *p <0,05; **p<0,01). Las barras de escala corresponden a 20 pm.
mvsFIt tiene tiempo de residencia en el humor vítreo significativamente mayor
Se confirmó que el humor vítreo de ratas Brown Norway se podría usar para determinar el tiempo de residencia intravítreo de moléculas de diferentes tamaños usando dextranos fluorescentemente etiquetados de varios tamaños (FIG. 6). Las diferencias en el tiempo de residencia entre sFIt y mvsFIt eran inmediatamente aparentes comenzando a las 4 horas cuando solo un 18,2±7,3 % de sFIt permanecía en comparación con el 105,8±9,8 % de mvsFIt (Fig 3).
A las 12 horas, solo un 2,6±1,9 % de sFIt permanecía detectable en comparación con el 62,9±14,1 % de mvsFIt. A los 2 días después de la inyección, la sFIt era casi indetectable (1,2±0,5%) mientras que un 66,2±28,6 % de mvsFIt permanecía en el humor vítreo. La semivida de sFIt en el humor vítreo se calculó usando la Ec. 1 y la Ec. 2 y era de 3,3 horas en comparación con las 35 horas para mvsFIt.
Fig. 3A-3B: mvsFIt tiene mayor tiempo de residencia en el humor vítreo de rata. A) Esquema que representa los métodos usados para determinar la semivida de sFIt y mvsFIt fluorescentemente etiquetados en el humor vítreo de rata. El humor vítreo se inyectó con 5 pl de sFIt o mvsFIt etiquetados con Alexa Fluor 488. Después de 0, 4, 12, 24 y 48 horas, las ratas se sacrificaron y sus ojos se enuclearon y se congelaron para el análisis. A continuación, se extirpó el humor vítreo, se sumergió en tampón RIPA y se homogeneizó para las posteriores medidas de fluorescencia. B) La conjugación con HyA mejora significativamente el tiempo de residencia de sFIt en el humor vítreo después de 48 horas en comparación con sFIt. Los resultados se expresan como media ± SD (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,0oi). * indica una diferencia entre el mvsFIt y la sFIt en el momento dado. El ANOVA da un valor p ***<0,001.
FIG. 6: El dextrano de mayor peso molecular presenta mayor tiempo de residencia in vivo. El experimento de validación que demuestra el efecto del tamaño sobre la retención de los dextranos fluorescentemente etiquetados. El dextrano de 2 MDa (línea continua) tiene tiempo de residencia significativamente mejorado por encima del de 40 kDa (línea discontinua) durante 48 horas. La semivida de los dextranos de 40 kDa y 2 MDa es de 3,2 y 5 horas, respectivamente. * indica una diferencia entre el dextrano de 40 kDa y 2 MDa en el momento dado. El ANOVA bidireccional da un valor p * <0,05 (** corresponde a un valor P de menos de 0,01).
mvsFIt es un inhibidor más potente de la neovascularización retiniana
Se usó un modelo OIR del ensayo de angiogénesis retiniana para examinar el efecto de la conjugación de sFIt con HyA sobre la inhibición de la angiogénesis retiniana. Este modelo a corto plazo permitió el examen indirecto del efecto de la semivida de mvsFIt sobre la inhibición de la angiogénesis prolongada. La cobertura neovascular se calculó comparando el área de la cobertura vascular con el área retiniana total. Después de 5 días de tratamiento, la cobertura vascular retiniana de los ojos inyectados con PBS era de un 84,3±3,8 % y de las retinas tratadas con inyecciones intravítreas de sFIt era de un 85,4±6,1 %. En cambio, las retinas de ratas tratadas con inyecciones intravítreas de mvsFIt eran significativamente menores y tenían un 72,9±3,4 % de cobertura vascular retiniana (Fig 4).
Fig. 4A-4C: mvsFIt inhibe la angiogénesis retiniana. A) Esquema que muestra los métodos usados para llevar a cabo el modelo OIR. Las crías de rata recién nacidas se guardaron en condiciones de normoxia (oxígeno al 21 %, aire ambiente) desde el día postnatal (P) 0 a 7 para permitir el desarrollo de la vasculatura retiniana normal y, a continuación, se transfirieron a condiciones de hiperoxia de P7 a P12, que induce la pérdida de vasos. En P13, las crías se transfirieron de nuevo a condiciones de normoxia y se trataron con 2 pl de PBS, sFIt o mvsFIt y se sacrificaron en P17. B) Imágenes representativas de las retinas tratadas con PBS, sFIt y mvsFIt. La tinción verde indica células CD31+. La barra de escala corresponde a 250 pm. Los recuadros con líneas discontinuas aumentan esa parte del tejido (la barra de escala corresponde a 100 pm). C) Vascularización retiniana cuantificada después de 5 días de tratamiento. El porcentaje de vascularización retiniana se calculó comparando el área de vascularización con el área retiniana total en la imagen. El ANOVA unidireccional da un valor p **<0,001 (n.s - no significativo; **p<0,01).
En el momento de la inyección, tanto sFIt como mvsFIt tienen concentraciones similares en el humor vítreo (Fig 5A).
Con el paso del tiempo, sFIt es lo suficientemente pequeña para ser aclarada del humor vítreo dejando concentraciones mucho más pequeñas del fármaco (Fig 5b , parte superior). Esto permite un aumento en la concentración de VEGF intravítrea, que induce la angiogénesis. En cambio, mvsFIt tiene un tiempo de residencia intravítrea mucho mayor y, por tanto, es capaz de actuar como una esponja para VEGF con el paso del tiempo (Fig 5B, parte inferior), por lo que inhibe la angiogénesis y mantiene el nivel basal de la vascularización en la retina.
Fig. 5A-5B: Esquema que demuestra el mecanismo propuesto de acción del mvsFIt. A) sFIt (rojo, no conjugada) y mvsFIt (cadena de HyA azul conjugada con rojo) se inyectan en una retina diabética cuando hay una alta concentración de VEGF (círculos verdes). B) Después de un tiempo dado, t, se ha aclarado la mayoría de la sFIt del humor vítreo y, por tanto, VEGF es capaz de inducir el crecimiento de los vasos sanguíneos. mvsFIt tiene un tiempo de residencia mayor en el humor vítreo y es capaz de unirse e inhibir VEGF durante periodos de tiempo mucho más largos, lo que conduce a la inhibición prolongada de la angiogénesis retiniana.
Bibliografía
1. Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res. Clin. Pract. 2010;87(1):4-14.
2. Antonetti DA, Klein R, Gardner TW. Diabetic retinopathy. N. Engl. J. Med. 29 de marzo de 2012;366(13): 1227­ 39.
3. Engerman RL. Perspectives in Diabetes Pathogenesis of Diabetic Retinopathy. Diabetes. 1989;38:1203-6. 4. Fong, D.S., Aiello, L., Gardner, T. W., King, G.L., Blankenship, G., Cavallerano, J.D., Ferris, F.L., Klein R. Retinopathy in Diabetes. Diabetes Care. Enero de 2004;1(27):S84-7).
5. Boulton M, Foreman D, Williams G, McLeod D. VEGF localisation in diabetic retinopathy. Br. J. Ophthalmol. Mayo de 1998;82(5):561-8.
6. Miller JW, Le Couter J, Strauss EC, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor a in intraocular vascular disease. Ophthalmology. Elsevier Inc.; enero de 2013;120(1):106-14.
7. Witmer A. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Prog. Retin Eye Res. Enero de 2003;22(1):1-29.
8. Stewart MW, Rosenfeld PJ, Penha FM, Wang F, Yehoshua Z, Bueno-López E, et al. Pharmacokinetic rationale for dosing every 2 weeks versus 4 weeks with intravitreal ranibizumab, bevacizumab, and aflibercept (vascular endothelial growth factor Trap-eye). Retina. 2012;32(3):434-57.
9. Pagliarini S, Beatty S, Lipkova B, Pérez-Salvador García E, Reynders S, Gekkieva M, et al. A 2-year, phase IV, multicentre, observational study of ranibizumab 0.5 mg in patients with neovascular age-related macular degeneration in routine clinical practice: The EPICOHORT study. J. Ophthalmol. 2014;2014:1-9.
10. Cohen SY, Mimoun G, Oubraham H, Zourdani A, Malbrel C, Quere S, et al. Changes in visual acuity in patients with wet age-related macular degeneration treated with intravitreal ranibizumab in daily clinical practice: the LUMIERE study. Retina. 2013;33(3):474-81.
11. Tanaka K, Yamaguchi S, Sawano A, Shibuya M. Characterization of the extracellular domain in vascular endothelial growth factor receptor-1 (Flt-1 tyrosine kinase). JpnJCancer Res. 1997;88(9):867-76.
12. Altiok EI, Santiago-Ortíz JL, Zbinden A, Jha AK, Bhatnagar D, Jackson WM, et al. Multivalent Hyaluronic Acid Bioconjugates Improve sFlt Activity In Vitro. (bajo Rev. 2015;
13. Ma L, Wang X, Zhang Z, Zhou X, Chen A, Yao L. Identification of the ligand-binding domain of human vascularendothelial-growth-factor receptor Flt-1. Biotechnol Appl. Biochem. 2001;34:199-204.
14. Han BW, Layman H, Rode NA, Conway A, Schaffer D V., Boudreau N, et al. Multivalent conjugates of sonic hedgehog accelerate diabetic wound healing. Tissue Eng. Part A. 2015;21:2366-78.
15. Conway A, Vazin T, Spelke DP, Rode NA, Healy KE, Kane RS, et al. Multivalent ligands control stem cell behaviour in vitro and in vivo. Nat Nanotechnol. Nature Publishing Group; 20 de octubre de 2013;8(octubre):831-8.
16. Wall ST, Saha K, Ashton RS, Kam KR, Schaffer D V, Healy KE. Multivalency of Sonic hedgehog conjugated to linear polymer chains modulates protein potency. Bioconjug. Chem. Abril de 2008;19(4):806-12.
17. Smith LEH, Wesolowski E, McLellan A, Kostyk SK, D'Amato R, Sullivan R, et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investig. Ophthalmol Vis. Sci. 1994;35(1):101-11.
18. Ito T-K, Ishii G, Saito S, Yano K, Hoshino A, Suzuki T, et al. Degradation of soluble VEGF receptor-1 by MMP-7 allows VEGF access to endothelial cells. Blood. 2009;113(10):2363-9.
19. Chan MF, Li J, Bertrand A, Casbon A-J, Lin JH, Maltseva I, et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. J. Cell Sci. 2013;126(Pt 17):3948-60.
20. Staton CA, Reed MWR, Brown NJ. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp- Pathol. 2009;90(3):195-221.
21. Gaudana R, Ananthula HK, Parenky A, Mitra AK. Ocular drug delivery. AAPS J. Septiembre de 2010;12(3):348-60.
22. Hornof M, Toropainen E, Urtti A. Cell culture models of the ocular barriers. Eur. J. Pharm. Biopharm.
2005;60(2):207-25.
23. Urtti A, Salminen L. Minimizing Systemic Absorption of Topically Administered Ophtalmic Drugs. Surv. Ophtalmol. 1993;37(6):435-56.
24. Abrishami M, Zarei-Ghanavati S, Soroush D, Rouhbakhsh M, Jaafari MR, Malaekeh-Nikouei B. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated bevacizumab (avastin) for intravitreal administration. Retina. 2009;29(5):699-703.
25. Drolet DW, Nelson J, Tucker CE, Zack PM, Nixon K, Bolin R, et al. Pharmacokinetics and safety of an antivascular endothelial growth factor aptamer (NX1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys. Pharm. Res. 2000;17(12):1503-10.
26. Nicholson BP, Schachat AP. A review of clinical trials of anti-VEGF agents for diabetic retinopathy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. Julio de 2010;248(7):915-30.
27. Ricci B. Oxygen-induced retinopathy in the rat model. Doc. Ophthalmol. 1990;74(3):171-7.
28. Akula JD, Favazza TL, Mocko JA, Benador IY, Asturias AL, Kleinman MS, et al. The anatomy of the rat eye with oxygen-induced retinopathy. Doc. Ophthalmol. 2010;120(1):41-50.
29. Tan LE, Orilla W, Hughes PM, Tsai S, Burke JA, Wilson CG. Effects of vitreous liquefaction on the intravitreal distribution of sodium fluorescein, fluorescein dextran, and fluorescent microparticles. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.
2011;52(2):1111-8.
30. Maurice D. Review: practical issues in intravitreal drug delivery. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Agosto de 2001;17(4):393-401.
31. Bakri SJ, Snyder MR, Reid JM, Pulido JS, Ezzat MK, Singh RJ. Pharmacokinetics of intravitreal ranibizumab (Lucentis). Ophthalmology. Diciembre de 2007;114(12):2179--82.
32. Gaudreault J, Fei D, Rusit J, Suboc P, Shiu V. Preclinical pharmacokinetics of Ranibizumab (rhuFabV2) after a single intravitreal administration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. Febrero de 2005;46(2):726-33.
33. Lee SS, Robinson MR. Novel drug delivery systems for retinal diseases. A review. Ophthalmic Res. Enero de 2009;41(3):124-35.
34. Bakri SJ, Snyder MR, Reid JM, Pulido JS, Singh RJ. Pharmacokinetics of intravitreal bevacizumab (Avastin). Ophthalmology. Mayo de 2007;114(5):855-9.
35. Moradi A, Sepah YJ, Sadiq MA, Nasir H, Kherani S, Sophie R, et al. Vascular endothelial growth factor trapeye (Aflibercept) for the management of diabetic macular edema. World J. Diabetes. 2013;4(6):303-9.
36. Stewart MW. What are the half-lives of ranibizumab and aflibercept (VEGF Trap-eye) in human eyes? Calculations with a mathematical model. Eye Reports. 9 de jun de 2011; 1(1):5-7.
37. Kane FE, Burdan J, Cutino A, Green k E. Iluvien: a new sustained delivery technology for posterior eye disease. Expert. Opin. Drug Deliv. 2008;5(9):1039-46.
38. Boyer DS, Yoon YH, Belfort R, Bandello F, Maturi RK, Augustin AJ, et al. Three-Year, Randomized, Sham-Controlled Trial of Dexamethasone Intravitreal Implant in Patients with Diabetic Macular Edema. Ophthalmology.
2014;
39. Mohammad DA, Sweet B V, Elner SG. Retisert: is the new advance in treatment of uveitis a good one? Ann. Pharmacother. 2007;41(3):449-54.
40. Bochot A, Fattal E. Liposomes for intravitreal drug delivery: a state of the art. J. Control Release. Elsevier B.V.; 20 de julio de 2012;161(2):628-34.
41. Sahoo SK, Dilnawaz F, Krishnakumar S. Nanotechnology in ocular drug delivery. Drug Discov. Today. Febrero de 2008; 13(3-4):144--51.
42. Veronese f M. Peptide and protein PEGylation. Biomaterials. Marzo de 2001; 22 (5):405-17.
43. Fishburn SC. The pharmacology of PEGylation: Balancing PD with PK to generate novel therapeutics. J. Pharm. Sci. 2010;97(10):4167-83.
44. Ng EWM, Shima DT, Calias P, Cunningham ET, Guyer DR, Adamis AP. Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease. Nat Rev Drug Discov. Febrero de 2006; 5 (2): 123-32.
45. Necas J, Bartosikova L, Brauner P, Kolar J. Hyaluronic acid (hyaluronan): a review. Vet. Med.
2008;2008(8):397-411.
Ejemplo 2: Los bioconjugados de ácido hialurónico multivalentes mejoran la actividad de sFIt in vitro
Materiales y métodos
Expresión del receptor de Fit-1 soluble
La secuencia de sFIt para los primeros 3 dominios extracelulares tipo Ig de sFIt-1 [15] se clonó en el plásmido pFastBac1 (Life Technologies) y, a continuación, se transformó en DH10Bac E.coli, que se sembraron en placas antibióticas triples que contenían kanamicina (50 pg/ml), gentamicina (7 pg/ml, Sigma Aldrich), tetraciclina (10 pg/ml, Sigma Aldrich), IPTG (40 pg/ml, Sigma Aldrich) y Bluo-gal (100 pg/ml, Thermo Fisher Scientific). Se aisló el bácmido que contenía el gen de sFIt de DH10Bac E.coli (Life Technologies) y se transfirió a células insectos SF9 para la producción vírica (proporcionadas por la "Tissue Culture Facility", UC Berkeley). A continuación, el virus se usó para infectar células de insecto High Five (proporcionadas por la "Tissue Culture Facility", UC Berkeley) para inducir la expresión de la proteína sFIt. Después de 3 días, la proteína se purificó del sobrenadante usando perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen Laboratories). La sFIt recombinante se eluyó de las perlas Ni-NTA usando un gradiente de imidazol y, a continuación, se concentró y se intercambió el tampón con 10 % de glicerol/PBS usando dispositivos centrífugos de 15 ml Amicon Ultra (EMD Millipore). La solución proteica se filtró en estéril y la concentración se determinó usando el ensayo de BCA (Thermo Fisher Scientific).
Síntesis del conjugado mvsFIt
La conjugación de sFIt con HyA se llevó a cabo de acuerdo con el esquema en la Figura 1A, como se ha descrito previamente [16-18]. Para preparar los intermediarios de HyA tiol-reactivos, se añadieron hidrazida de 3,3'-N-(ácido £-maIeimidocaproico) (EMCH, Thermo Fisher Scientific, 1,2 mg/ml), 1-hidroxibenzotriazol hidrato (HOBt, Sigma Aldrich, 0,3 mg/ml) y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, Thermo Fisher Scientific, 10 mg/ml) a una solución de 3 mg/ml de HyA (Lifecore Biotechnology) de diferentes pesos moleculares en tampón de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) (Sigma Aldrich) 0,1 M (pH 6,5) y se dejaron reaccionar a 4 °C durante 4 horas. A continuación, la solución se dializó en PBS pH 7,0 que contenía glicerol al 10 %. La sFIt recombinante se trató con 2-iminotiolano en un exceso de 10 molar para crear grupos tioles para la conjugación con el grupo maleimida en EMCH. A continuación, se añadió sFIt a HyA-EMCH activado en relaciones molares de 10:1 y 30:1 entre sFIt y HyA para crear los bioconjugados mvsFIt y se dejaron reaccionar a 4 °C durante la noche. Las reacciones de mvsFIt se dializaron exhaustivamente usando tubos de diálisis de Float-A-Lyzer G2 (Spectrum Labs) de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa en PBS pH 7,0 para eliminar el sFIt sin reaccionar. El ensayo de BCA se usó para medir las concentraciones proteicas de los bioconjugados mvsFIt. Los conjugados se definieron con relaciones de alimentación molar entre sFIt y HyA de 10:1 como mvsFIt con baja relación de conjugación (LCR) y relaciones de alimentación molar de 30:1 como mvsFIt con alta relación de conjugación (HCR).
Caracterización por SEC-MALS de mvsFIt
La conjugación proteica se caracterizó usando cromatografía de exclusión por tamaños con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS) como se ha descrito previamente [19]. Resumiendo, los ajustes de SEC-MALS consistían en una HPLC 1100 Agilent con un detector de dispersión de luz láser multiángulo DAWN-HELEOS II e interferómetro refractivo relativo Optilab (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA). El cambio de índice refractivo se midió diferencialmente con láser de 690 nm y la absorbancia de UV se midió con el detector de matriz de diodos a 280 nm. Se usaron columnas Shodex OH pak SB-804 para la separación (Phenomenex Inc.). Antes del análisis, los conjugados mvsFIt se filtraron en estéril a través de un filtro de 0,45 |jm y se inyectaron 200 |jl a una concentración de HyA entre 0,2-0,5 mg/ml. Los valores dn/dc se determinaron usando SeC-MALS y eran de 0,1447 y 0,185 para HyA-EMCH y sFIt, respectivamente. Los coeficientes de extinción de UV usados para HyA-EMCH y sFIt también se determinaron sobre SEC-MALS y eran de 0,022 y 0,894, respectivamente. El análisis de los datos se llevó a cabo usando el programa informático Astra (Wyatt Technologies).
Análisis de SDS-PAGE de mvsFIt
Las muestras se prepararon con tampón de carga de tinte 5X SDS, 2-mercaptoetanol y se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C. Los geles con gradiente del 4-20 % Mini-Protean TGX prefabricados (Bio-Rad Laboratories) se corrieron durante 90 minutos a 110 volts. A continuación, los geles se tiñeron con tinte Coomassie Bio-Safe (Bio-Rad Laboratories) durante 2 horas y, a continuación, se realizaron imágenes usando un sistema de imagen molecular ChemiDoc XRS+ BioRad. Las intensidades de la proteína en el gel de apilamiento y gradiente se analizaron usando ImageJ para determinar la cantidad de proteína que se conjugó frente a proteína no conjugada libre que no se dializó fuera de la solución tras la reacción de conjugación.
Caracterización del tamaño de DLS de mvsFIt
Se usó un sistema de goniómetro Brookhaven y de dispersión de luz láser (BI-200SM, Brookhaven Instruments Corporation) para determinar el diámetro hidrodinámico de los bioconjugados mvsFIt. Cada muestra se filtró a 0,45 jm y se cargó en una cubeta de 150 j l (BI-SVC, Brookhaven). La adquisición de datos se realizó a 90 grados con un láser de 637 nm durante 2 minutos. El análisis de datos se llevó a cabo con el programa informático BIC Dynamic light Scattering (Brookhaven) usando el procesador de señal BI-9000AT. La intensidad del tamaño de partícula promedio se obtuvo usando un método de análisis de mínimos cuadrados no negativos (NNLS).
ELISA de la competición de unión
Los conjugados mvsFIt se analizaron usando un ELISA tipo sandwich de VEGF165 Quantikine (R&D Systems) para examinar el efecto de la conjugación de HyA con sFIt sobre la inhibición de VEGF165. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumiendo, VEGF165.se añadió a PBS con varias concentraciones de sFIt o mvsFIt. Se detectó el VEGF165 libre que se unió a los anticuerpos de captura sobre la superficie de la placa usando un anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante y se cuantificó usando un espectrofotómetro a 450 nm.
Ensayo de supervivencia celular endotelial de HUVEC
Las células endoteliales de la vena del cordón umbilical humanas (HUVEC) se adquirieron de ATCC y se cultivaron en medios EBM-2 (Lonza) en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Con el fin de examinar el efecto de la conjugación con HyA sobre la capacidad de sFIt de unirse e inhibir la actividad de VEGF165 in vitro, se llevó a cabo un ensayo de supervivencia con HUVEC cultivadas en presencia de VEGF165 y conjugados mvsFIt. Se añadieron HUVEC a placas de 96 pocillos recubiertas con gelatina al 0,2 % a 10.000 células/pocillo en medios M199. Las células se cultivaron en FBS al 2 % y 20 ng/ml de VEGF165 (R&D Systems) en presencia de sFIt o mvsFIt. Setenta y dos (72) horas después de sembrar en placa, se aspiraron los medios y las células se lavaron con PBS antes de congelar para el análisis con CyQuant (Life Technologies). El número celular total por pocillo se determinó leyendo la fluorescencia a 480 nm de excitación y 520 nm de emisión usando un fluorómetro (Molecular Devices).
Ensayo de formación de tubo de HUVEC
Los ensayos de formación de tubo de HUVEC se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos recubiertas con 80 j l de Matrigel (Corning, NY) y se incubaron a 37 °C durante 1 hora para permitir que ocurriera la gelificación. Las HUVEC se sometieron a tripsinización y se resuspendieron en M199 con FBS al 2 % y 20 ng/ml de VEGF165 y se trataron con conjugados LCR mvsFIt. Se realizaron imágenes de los pocillos 18 horas después de la siembra en placa y se cuantificó la formación de tubo usando el programa informático ImageJ.
Ensayo de migración de HUVEC
Los pocillos de una placa de 12 pocillos se recubrieron con gelatina al 0,2 %. Las HUVEC se añadieron a 150.000 células/pocillo en EBM-2 y se dejó que se unieran y se extendieran durante la noche. Usando una punta de pipeta de 1 ml, se rasparon cruces en la capa confluente de HUVEC. A continuación, los pocillos se lavaron con PBS en exceso para eliminar los restos celulares y los medios se reemplazaron con medios que contenían VEGF165 y mvsFlt. Se realizaron imágenes de los raspados a 0 y 24 horas después de raspar y el área sin células se cuantificó usando el programa informático ImageJ y T-scratch (CSE Laboratory software, ETH Zurich). El porcentaje de herida abierta se calculó comparando el área abierta de raspado a las 24 horas con el área abierta de raspado a las 0 horas.
Retención de mvsFIt en geles de HyA reticulados
Para modelar la estructura química y de red del humor vitreo, se sintetizaron hidrogeles de HyA acrilados (AcHyA) como se ha descrito previamente [20,21]. Resumiendo, se añadió dihidazida de ácido adípico (ADH, Sigma Aldrich) en un exceso de 30 molar con HyA en agua desionizada (DI). Se disolvieron EDC (3 mmol) y HOBt (3 mmol) en DMSO/agua y se añadió a la solución de HyA. La solución se dejó reaccionar durante 24 horas y, a continuación, se dializó exhaustivamente frente a agua DI. El HyA-ADH se precipitó en etanol al 100 % y se hizo reaccionar con acriloxisuccinimida para generar grupos acrilato sobre el HyA. El AcHyA resultante se dializó exhaustivamente y se liofilizó para el almacenamiento. La presencia de grupos acrilato injertados sobre las cadenas de HyA se confirmó usando H1-NMR.
Para preparar hidrogeles de AcHyA al 1 %, se disolvió 8 mg de AcHyA en 800 pl de tampón trietanolamina (TEOA; 0,3 M, pH 8). Se añadieron o bien 5 pg de sFIt etiquetada con 5-SDP éster Alexa Fluor 488 (Life Technologies), LCR mvsFIt de 650 kDa o albúmina sérica bovina (BSA) en volúmenes de 50 pl a la solución de AcHyA antes de la reticulación. Se disolvió el agente reticulante de PEG de 5 kDa tiolado (Laysan Bio, Inc.) en 100 pl de tampón TEOA y se añadió a AcHyA disuelto. Insertos de cultivo celular con poros de 4 pm de tamaño (Millipore Corporation, Billerica, MN) se añadieron a pocillos de una placa de 24 pocillos y se añadieron 70 pl de gel que contenía sFIt, mvsFIt o BSA a cada inserto. Se dejó que los geles se reticularan a 37 °C durante 1 hora antes de añadir 150 pl de PBS a los pocillos y sumergir los hidrogeles. Para determinar las cinéticas de liberación, el sobrenadante del pocillo se recogió y se reemplazó completamente a los 0, 1, 2, 3, 7, 10 y 14 días. Las muestras se leyeron con un fluorómetro para detectar la sFIt fluorescentemente etiquetada, el mvsFIt y la BSA en el sobrenadante.
Medición de la capacidad de difusión por recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueo (FRAP)
Las medidas de FRAP se realizaron sobre hidrogeles de AcHyA al 1 % que contenían sFIt marcada con FITC y LCR mvsFIt de 650 kDa. La intensidad de fluorescencia total de los hidrogeles se adquirió usando un microscopio de barrido por láser Zeiss LSM710 (Carl Zeiss, Jena, Alemania) con un objetivo de aumento 20X y un conjunto de láser de argón a 488 nm con potencia del 50 %. El fotoblanqueo se realizó exponiendo un punto de 100x100-pm en el campo de visión a la luz de láser de alta intensidad. El área se monitorizó por 15 imágenes de barrido preblanqueo a intensidad de láser baja (2 %), a continuación, se blanquearon hasta un 75 % de la intensidad de fluorescencia de inicio a una potencia de láser del 100 %. Se recogieron un total de aproximadamente 300 barridos de imágenes de menos de 1 segundo para cada muestra. La fracción móvil de las moléculas de sFIt y mvsFIt fluorescentes dentro del hidrogel se determinó comparando la fluorescencia en la región blanqueada después de la recuperación completa (F«) con la fluorescencia antes del blanqueo (Finicial) y justo después del blanqueo (F0). La fracción móvil R se definió de acuerdo con la ecuación (1):
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Degradación enzimática con MMP-7
Previamente se ha mostrado que la metaloproteinasa de matriz-7 (MMP-7) degrada específicamente sFIt [22]. Para determinar si la conjugación con HyA protegía mvsFIt de la degradación, se trataron sFIt y mvsFIt con varias cantidades de MMP-7 (EMD Millipore). sFIt y mvsFIt se incubaron con metaloproteinasa de matriz-7 (MMP-7) durante 12 horas a 37 °C mientras se agitaba a relaciones molares altas (relación molar de 1:1 MMP-7:sFIt), medias (1:2) y bajas (1:4) entre MMP-7 y sFIt. A continuación, sFIt y mvsFIt tratados con enzima se cargaron en geles con gradiente del 4-20 % Mini-Protean TGX prefabricados (Bio-Rad Laboratories) y se corrieron a 110 volts durante 90 minutos. A continuación, los geles se tiñeron usando un kit de tinción con plata (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El grado de degradación enzimática se valoró cuantificando la cantidad total de la proteína que permanece en el gel tras el tratamiento con MMP-7. Cada pocillo se normalizó a su respectivo pocillo sin MMP-7 y la intensidad de fondo se restó de acuerdo con el pocillo blanco entre los grupos sobre el gel.
Análisis estadístico
Todos los experimentos cuantitativos se realizaron por triplicado. Los valores se expresan como medias ± desviaciones típicas (SD). Se usó un ANOVA unidireccional con análisis post-hoc de Tukey para comparar los grupos de tratamiento en las medidas cuantitativas cuando era apropiado y se usó p<0,05 para evaluar la significación estadística.
RESULTADOS
El objetivo general de este estudio era sintetizar bioconjugados de proteína y polímero para aumentar el tiempo de residencia de los fármacos anti-VEGF en el humor vítreo para su uso en el tratamiento de pacientes con Dr . A diferencia de los fármacos actualmente usados para el tratamiento de DR que tienen semividas cortas, se desarrollaron bioconjugados proteicos multivalentes grandes con afinidad no alterada para VEG F-^y buena estabilidad enzimática, con bioconjugados que muestran difusión y movilidad retardada en un modelo in vitro del humor vítreo.
Figuras 7A-7D. Síntesis y esquemas de sFIt multivalente. A) Los bioconjugados mvsFIt se sintetizaron usando una reacción en 3 etapas en las que se hizo reaccionar HyA con EDC y EMCH para crear un intermediario de HyA-EMCH reactivo con cisteína. A continuación, la sFIt se trató con 2-iminotiolano y, a continuación, se hizo reaccionar con el intermediario HyA-EMCH para la síntesis del producto final. B) Esquema de la conjugación proteica con HyA y la posterior unión a VEGF165. La relación a:b representa la valencia de las moléculas de sFIt (a) unidas covalentemente a una cadena única de HyA (b). C) Esquema de los conjugados mvsFIt con baja relación de conjugación (LCR) que se sintetizan haciendo reaccionar 10 moléculas de sFIt con 1 cadena de HyA. Esta reacción tiene una eficacia de conjugación del 61 % determinada por SEC-MALS (véase la Tabla 1). C) Esquema de los conjugados mvsFIt de alta relación de conjugación (HCR) que se sintetizan haciendo reaccionar 30 moléculas de sFIt con 1 cadena de HyA (mismo peso molecular de HyA que en (C)). Esta reacción tiene una eficacia de conjugación del 52 % determinada por SEC-MALS (véase la Tabla 1).
Las síntesis de los conjugados mvsFIt se llevó a cabo de acuerdo con los esquemas mostrados en la Figura 7A-7D. mvsFIt se creó a relaciones de conjugación bajas (LCR, Figura 7C) y altas (HCR, Figura 7D) con el fin de determinar si una determinada valencia proporcionaría un efecto aumentado sobre la unión de VEGF. sFIt se conjugó con éxito con HyA a diferentes pesos moleculares de HyA y valencias, que eran significativamente mayores que los de la sFIt en su forma no conjugada (Figura 8A-8D). Los pesos moleculares de los componentes de proteína y polímero de los conjugados se caracterizaron usando SEC-MALS como se muestra en la Tabla 1 y la Figura 8A. Los conjugados con relaciones de alimentación de 10:1 (denominados de baja relación de conjugación, LCR) entre sFIt y HyA tenían una conjugación promedio de un 61,2±12,5 % mientras que los conjugados con relaciones de alimentación entre sFIt y HyA de 30:1 (denominados de alta relación de conjugación, HCR) tenían eficiencias de conjugación promedio del 51,8±4,1 %. El SDS-PAGE de sFIt no unida presentó una banda de proteína a los 50 kDa predichos. Por el contrario, los bioconjugados mvsFIt solo migraron dentro de la parte de apilamiento del gel, lo que indica movilidad inhibida como resultado de la unión covalente al conjugado multivalente mucho mayor (Figura 8B). El análisis del gel usando ImageJ indicó que un 76,4±6,7 % promedio de sFIt en los bioconjugados mvsFIt estaba unida covalentemente mientras que el resto de la sFIt detectada presumiblemente estaba interactuando no específicamente con la cadena de ácido hialurónico en la solución y así no se podría eliminar por diálisis
(Figura 8C).
Tabla 1: Análisis SEC-MALS de todos los conu ados mvsFIt.
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Todos los conjugados mvsFIt se caracterizaron también por DLS para determinar el diámetro hidrodinámico del conjugado en la solución, ya que el tamaño del fármaco es un factor crítico que determina su movilidad a través de los hidrogeles biológicos tales como el humor vítreo. La sFIt no conjugada tenía un diámetro de 22,6 nm±3,1 nm mientras que los conjugados mvsFIt preparados con HyA de pesos moleculares de 300 kDa, 650 kDa y 1 MDa tenían diámetros de 123,9±23,1 nm, 236,3±38,7 nm, y 223±13,9 nm, respectivamente (Figura 8D). El tamaño de los conjugados mvsFIt era dependiente del peso molecular de HyA para los conjugados de 300 y 650 kDa; sin embargo, no había diferencia significativa entre los conjugados de 650 kDa y 1 MDA (Figura 8D). Cabe destacar que, los conjugados HCR de peso molecular de 300 y 650 kDa tenían diámetros inferiores que sus respectivos conjugados LCR, lo cual podría deberse a la carga positiva aumentada de sFIt en la cadena principal de HyA negativamente cargada con unión de sFIt creciente provocando que el conjugado se pliegue alrededor de sí mismo más apretadamente.
Figura 8A-8D. Caracterización de la eficacia y el tamaño de la conjugación de mvsFIt. A) Cromatograma de SEC-MALS que representa la fracción de peso acumulativo frente a la masa molar de bioconjugados LCR y HCR de 650 kDa. La línea de puntos, la línea discontinua y la línea continua representan la masa molar total de todas la proteína sFIt covalentemente unidas, el peso molecular de HyA y la masa molar del bioconjugado total (todo dado como g/mol), respectivamente. B) Gel con gradiente de SDS-PAGe del 4-20 % de sFIt y mvsFIt. Las bandas de proteína en el gel de apilamiento indican la conjugación con éxito de la proteína a HyA. Las bandas de proteína dentro del gel representan la proporción de proteína que no se unió covalentemente, pero permaneció en la solución después de la diálisis. C) Intensidades de la banda de proteína cuantificadas del gel de s DS-PAGE. El porcentaje de sFIt unida se determinó dividiendo la intensidad de la proteína en el gel de apilamiento entre la intensidad de proteína total dentro del respectivo pocillo. La sFIt libre se determinó dividiendo la intensidad de la proteína en el gel de separación entre la intensidad de proteína total dentro del respectivo pocilio. D) Análisis de la dispersión dinámica de luz de los conjugados. sFIt era significativamente menor que todos los bioconjugados mvsFIt (***p<0,001). En el caso de los bioconjugados mvsFIt de 300 y 650 kDa, el LCR mvsFIt era significativamente mayor que su respectivo conjugado HCR (**p<0,01). Los valores se dan como ±SD.
Figura 9A-9B. Todos los bioconjugados mvsFIt conservan su capacidad de inhibir las actividades dependientes de VEGF 165 en los ensayos ELISA de VEGF 165 y de supervivencia de HUVEC dependiente de VEGF 165 . A) Inhibición dependiente de dosis de la unión de VEGF165 para un anticuerpo de captura por bioconjugados mvsFIt. La inhibición era independiente de si la sFIt estaba unida a HyA o libre en solución. No hubo diferencias significativas entre ninguno de los grupos (Tabla 2). B) Inhibición dependiente de la dosis de la supervivencia de HUVEC con mvsFIt a diferentes pesos moleculares y valencias proteicas en presencia de VEGF165. La inhibición era independiente de si la sFIt estaba unida a HyA o libre en solución (Tabla 2). Los valores se dan como media ±SD.
Tabla 2: Valores de CI 50 de los ensayos ELISA y de supervivencia de HUVEC que examinan la inhibición por parte de mvsF t de VEGF1
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Se emplearon diferentes ensayos para determinar si la conjugación de sFIt con HyA afectaba la afinidad de sFIt por VEGF165 y alteraba la función celular dependiente de VEGF165. Usando un ELISA específico a VEGF165 se observó una respuesta dependiente de la dosis; la respuesta indicó que la conjugación de sFIt con HyA no alteraba la capacidad de mvsFIt de unirse a VEGF165 (Figura 9A). Los resultados de ELISA indicaron que el valor de CI50 de sFIt era de 3,8±2,4 ng/ml y el valor de CI50 de los diferentes conjugados mvsFIt era de 3,4±1,1 ng/ml promedio (Tabla 2).
Figura 10A-10E. mvsFIt inhibe la formación de tubo de HUVEC. A) Imágenes representativas de la formación de tubo de HUVEC inhibida sobre Matrigel (BD Biosciences) cuando se trataron con 1 pg/ml de todos los bioconjugados LCR mvsFIt. Las células se sembraron a 20.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos sobre 100 pl de matrigel y se realizaron imágenes a las 18 horas. Barra de escala = 500 pm. B-E) Cuantificación del número total de tubos por pocillo (B), longitud promedio del tubo (C), número total de nódulos (puntos de ramificación, D) y longitud total del tubo por pocillo (E) (***p<0,001).
En los ensayos de supervivencia con HUVEC, mvsFIt demostró una disminución dependiente de la dosis en la supervivencia, y el efecto era independiente de la conjugación con HyA igual que los resultados de ELISA (Figura 9B, Tabla 2). Estos resultados indican que la conjugación covalente de sFIt con HyA no reduce la capacidad de sFIt de unirse a VEGF. Esto es extremadamente prometedor debido al hecho de que otras tecnologías de conjugación tales como la PEGilación, previamente han informado que la conjugación reduce significativamente la bioactividad de la proteína [23,24].
Para estudios posteriores, solo se estudiaron los conjugados LCR de diferentes pesos moleculares, puesto que todos los conjugados funcionaron igualmente bien cuando se examinó la actividad inhibidora de VEGF165 in vitro en ensayos ELISA y de supervivencia. Los ensayos de formación de tubo y de migración in vitro permitieron el examen del efecto de los conjugados mvsFIt in vitro sobre dos procesos adicionales implicados en la angiogénesis in vivo, la organización dentro de los tubos y la migración celular. Igual que los datos de supervivencia, sFIt y mvsFIt tenían los mismos perfiles de inhibición de VEGF165 en estos dos ensayos cuando la adición de sFIt y mvsFIt inhibía igualmente la organización dentro de los tubos (Figura 10A-10E) y el cierre de las heridas (Figura 11A-11B). Considerados en conjunto, el ELISA y los ensayos de angiogénesis in vitro indicaron que la conjugación de sFIt con HyA no afectaba la capacidad de sFIt de unirse a VEGF165 y que todos los conjugados mvsFIt conservaban su capacidad de inhibir las funciones celulares endoteliales mediadas por la señalización de VEGF165.
Figura 11A-11B. mvsFlt inhibe la migración de HUVEC conducida por VEGF 165. Imágenes representativas de la inhibición de la migración de HUVEC con bioconjugados LCR mvsFIt de diferentes pesos moleculares. Se dejó que HUVEC crecieran hasta la confluencia en placas de 12 pocillos antes de realizar un raspado y se trataron con 20 ng/ml de VEGF165 en presencia de 200 ng/ml de mvsFIt. Las células se tiñeron con verde CellTracker (Life Technologies) antes de la siembra. Barra de escala = 20 pm. B) Migración de HUVEC cuantificada tras el tratamiento con LCR mvsFIt que muestra el porcentaje de área de herida abierta calculada comparando el área de herida abierta a las 24 horas con el área de herida abierta en el tiempo 0 (***p<0,001).
Se usaron geles de HyA reticulados [20,21] para examinar cómo la conjugación de sFIt con HyA afecta a la difusión.
Este hidrogel se eligió como un sistema modelo para el estudio del humor vitreo in vitro basado principalmente en la similitud de composición con el humor vítreo con respecto al alto contenido de HyA. La rigidez del hidrogel de HyA (Figura 14A) era mayor que los informes publicados que examinan la rigidez del humor vítreo bovino y porcino [25], lo que sugiere que las predicciones del aclaramiento de fármaco del humor vítreo usando este modelo puede no ser suficiente para estimular las tasas concretas in vivo. Sin embargo, se anticipa que la difusión de sFIt y mvsFIt a través de estos geles será instructivo para predecir los beneficios de la conjugación con HyA dadas la similitudes de composición del modelo con el humor vítreo. Se usaron diferentes modelos para caracterizar el tamaño de malla de los hidrogeles de HyA (Tabla 3). Los experimentos preliminares que analizan la difusión dependiente del tamaño usando dextranos fluorescentemente etiquetados de 40 kDa y 2 MDa (Life Technologies) se usaron para confirmar que este sistema hidrogel sería apropiado para examinar la difusión dependiente del peso molecular y el tamaño (Figura 14B). Usando este sistema, se analizaron las cinéticas de liberación de sFIt y todos los bioconjugados LCR mvsFIt de los geles de HyA. Se esperaba que el efecto principal de los bioconjugados mvsFIt fuera las disminuciones dependiente del tamaño en la movilidad. Solo se analizaron conjugados de diferentes tamaños, mientras que se mantenía la valencia constante. Después de 14 días, solo un 30,8±1,9% de la sFIt permanecía en el gel en comparación con un 38,3 %±2,2 %, 63,8±0,5 % y 62,8 % ±0,4 % de los conjugados LCR de 300 kDa, 650 kDa y 1 MDa, respectivamente (Figura 12A). En comparación, el 100% de la BSA se liberó después de 24 horas, una diferencia probablemente debida a los puntos isoeléctricos significativamente diferentes (5,4 para BSA [26] y 9,5 para sFlt [27]) y afinidad proteica muy baja para HyA en lugar del tamaño de proteína puesto que BSA y sFIt tienen pesos moleculares similares.
Tabla 3: Mc cálculos del tamaño de malla basados en los datos de hinchamiento reoló icos.
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Figura 12A-12C. La conjugación de sFIt con HyA disminuye la movilidad y la difusión de mvsFIt en geles de HyA. A) Los bioconjugados LCR mvsFIt etiquetados con Alexa Fluor 488 de 650 kDa y 1 MDa encapsulados en hidrogeles de HyA al 1 % se difundían fuera significativamente más lentamente que sFIt no conjugada y mvsFIt de 300 kDa después del día 1 (*p<0,05) y persistían hasta el último momento, día 14 (***p<0,001). B) Imágenes confocales representativas que corresponden al experimento de FRAP de LCR mvsFIt de 650 kDa etiquetado con FITC. Finicial representa mvsFIt en el gel antes del blanqueo. F0 es la medida de fluorescencia inmediatamente después del 75 % de fotoblanqueo; F~ corresponde a la recuperación máxima de fluorescencia al final del experimento. C) Recuperación de fluorescencia normalizada [f(t)] de sFIt marcada con FITC y LCR mvsFIt de 650 kDa después del fotoblanqueo.
Figura 14A-14B. Caracterización del hidrogel de HyA. (A) Propiedades reológicas del hidrogel de HyA al 1 %. (B) El dextrano de 40 kDa fluorescentemente etiquetado encapsulado en hidrogeles de HyA se difundió fuera significativamente más rápidamente que el dextrano de 2 MDa después de 7 días (***p<0,001).
Para evaluar si la difusión a través del gel era Fickian, las curvas en la Figura 12A se ajustaron usando la ecuación (2) como se describe por Ritger et al. [32]:
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El exponente difusional, n, es indicativo de si la difusión es Fickian y si n es igual a 0,5, el transporte es Fickian. El valor n para la liberación de BSA, sFIt y mvsFIt se determinó que era 0,3-0,4 (Fig. 15A-E), indicando que la difusión a través del gel no es Fickian. La b Sa se agotó del gel a través de una rápida liberación debido al tamaño extremadamente pequeño de la proteína y a la muy baja afinidad al hidrogel de HyA debido a la repulsión de la carga, conduciendo a no difusión Fickian. La sFIt y los conjugados mvsFIt se liberan más lentamente en comparación debido en parte a la afinidad iónica con el hidrogel de HyA y al tamaño. Aunque la sFIt y la BSA son iguales en tamaño (50 kDa y 66 kDa, respectivamente), la sFIt tiene una interacción iónica mucho más fuerte con la matriz, lo que ralentiza su difusión del gel, dando como resultado también no difusión Fickian debido a esta fuerte afinidad. El conjugado mvsFIt de 300 kDa es lo suficiente pequeño en tamaño (<150 nm, véase la Fig. 8D) en relación con el hidrogel estimado ^(Tabla 3) para liberarse tan rápidamente como sFIt. Los dos conjugados más grandes tenían un diámetro cercano al tamaño de malla (>225 nm) y estaban significativamente impedidos en su liberación debido al tamaño, dando como resultado la liberación del gel que permitía el mecanismo de reptación de la difusión [33].
Basándose en los datos de los estudios de liberación de sFIt, solo se estudió el bioconjugado LCR de 650 kDa, usando FRAP, puesto que este conjugado mostraba la diferencia más alta en la retención en gel en comparación con sFIt no conjugada. La fracción móvil de la sFIt en el gel era de un 73,8±4,4 % mientras que la fracción móvil del mvsFIt dentro del gel era de un 48,3±3,0 %, lo que indica que una parte significativa del bioconjugado mvsFIt era lo suficientemente grande para llegar a estar inmóvil dentro del gel debido a la similitud de tamaño entre el mvsFIt y el tamaño de malla del gel de HyA. Los datos experimentales en la Figura 12C se ajustaron de acuerdo con Soumpasis [34] para obtener los tiempos de difusión característicos. Cabe destacar que, el tiempo de difusión característico para mvsFIt (94,8±19,5 s) era significativamente más rápido que para sFIt (176±18,1 s). La diferencia puede ser debida a la protección iónica de la sFIt cargada positivamente por el ácido hialurónico cargado negativamente dentro del conjugado multivalente, que reduce la afinidad general del conjugado para el gel permitiendo una difusión más rápida. En cambio, la sFIt no conjugada permanece cargada altamente de manera positiva dando como resultado afinidad iónica más fuerte dentro del gel de HyA que ralentiza su tiempo de difusión característico. El mvsFIt en el hidrogel también recuperó la fluorescencia a un grado significativamente menor, un 85,3±0,8 %, en comparación con sFIt, que recuperó hasta un 91,6 %±2,4 %. Aunque el conjugado mvsFIt presentaba difusión más rápida, un porcentaje mucho más pequeño del bioconjugado mvsFIt es realmente móvil y el tamaño significativamente limitó la recuperación de la fluorescencia total, resultados que están también soportados por los datos de liberación del gel en la Figura 12A. Llega a ser evidente que aunque mvsFIt pueda difundirse más rápido como se muestra por FRAP en la Figura 12B,C una porción mucho más pequeña de esta muestra es capaz de moverse debido al tamaño y, por tanto, mucho menos del mismo se libera en función del tiempo como se evidencia por los datos de liberación del gel en la Figura 12A. Considerados en conjunto, se anticipa que el efecto del tamaño será el determinante más fuerte del tiempo de residencia de mvsFIt in vivo.
Figura 13A-13B. La conjugación con HyA reduce la susceptibilidad a la degradación de proteasa por MMP-7.
A) Gel con gradiente Sd S-PAGE del 4-20 % de sFIt y mvsFIt (650 kDa LCR) tras 12 horas de tratamiento con MMP-7 a relaciones molares altas, medias y bajas entre MMP-7 y sFIt, que corresponden a relaciones molares de 1:1, 1:2 y 1:4 entre MMP-7 y sFIt. La intensidad de banda se normalizó al tratamiento sin MMP-7 dentro de cada grupo y el fondo se restó de cada muestra usando el pocillo blanco. B) Cuantificación del gel con gradiente del 4-20 % de sFIt y mvsFIt tratado con MMP-7 a relaciones molares altas, medias y bajas entre sFIt y MMP-7 durante 12 horas (*p<0,05; **p<0,01).
Figura 15A-15E. Ajustes para los datos a partir de los datos de liberación del gel para examinar la difusión Fickian. (A-E) Gráficos de los ajustes realizados con la ecuación (2) de Ritger et al. [13] para determinar el exponente difusional, n, y la constante para las características del sistema de red macromolecular y el fármaco, k.
El efecto de la conjugación de sFIt con HyA sobre la degradación de proteasa de la proteína sFIt se estudió usando MMP-7, una proteasa que se ha mostrado que degrada específicamente sFIt [22]. Se encontró que la conjugación de sFIt con HyA protegía la degradación de sFIt en todas las relaciones molares entre MMP-7 y sFIt (Figura 13A). A concentraciones altas de proteasa (relación molar de 1:1 entre MMP-7 y sFIt), solo un 6,8±6,6 % de la sFIt permaneció detectable en comparación con el 34,8±1,8 % de mvsFIt (Figura 13B). La disminución de la relación entre MMP-7 y sFIt de 1:1 a 1:4 aún dio como resultado degradación significativa de sFIt y protección frente a la degradación de la forma conjugada, donde la sFIt detectable aumentó hasta un 34±2,7 % en comparación con el mvsFIt detectable a un 74,8±4,9 % (Figura 3B). Se cree que el efecto protector de HyA conserva la estabilidad de mvsFIt y la biodisponibilidad in vivo, ayudando en el efecto antiangiogénico prolongado de bioconjugados mvsFIt.
Bibliografía
[1] R. Fong, D.S., Aiello, L., Gardner, T. W., King, G.L., Blankenship, G., Cavallerano, J.D., Ferris, F.L., Klein, Retinopathy in Diabetes, Diabetes Care. 27 (2004) S84-87. doi:10.2337/diacare.27.2007.S84.
[2] M. Boulton, D. Foreman, G. Williams, D. McLeod, VEGF localisation in diabetic retinopathy., Br. J. Ophthalmol.
82 (1998) 561-8. doi:10.1136/bjo.82.5.561.
[3] J.W. Miller, J. Le Couter, E.C. Strauss, N. Ferrara, Vascular endothelial growth factor a in intraocular vascular disease., Ophthalmology. 120 (2013) 106-14. doi:10.1016/j.ophtha.2012.07.038.
[4] A. Witmer, Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease, Prog. Retin. Eye Res. 22 (2003) 1 -29. doi:10.1016/S1350-9462(02)00043-5.
[5] D. a Antonetti, R. Klein, T.W. Gardner, Diabetic retinopathy., N. Engl. J. Med. 366 (2012) 1227-39. doi:10.1056/NEJMra1005073.
[6] J.G.F. Dowler, Laser management of diabetic retinopathy., J. R. Soc. Med. 96 (2003) 277-279. doi:10.1258/jrsm.96.6.277.
[7] K. a M. Solaiman, M.M. Diab, S. a Dabour, Repeated intravitreal bevacizumab injection with and without macular grid photocoagulation for treatment of diffuse diabetic macular edema., Retina. 33 (2013) 1623-9. doi:10.1097/IAE.0b013e318285c99d.
[8] P.L. Lip, F. Belgore, A.D. Blann, M.W. Hope-Ross, J.M. Gibson, G.Y.H. Lip, Plasma VEGF and soluble VEGF receptor FLT-1 in proliferative retinopathy: Relationship to endothelial dysfunction and laser treatment, Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (2000) 2115-2119.
[9] Q.D. Nguyen, D. M. Brown, D. M. Marcus, D.S. Boyer, S. Patel, L. Feiner, et al., Ranibizumab for diabetic macular edema: Results from 2 phase iii randomized trials: RISE and RIDE, Ophthalmology. 119 (2012) 789-801. doi:10.1016/j.ophtha.2011.12.039.
[10] D.R.C.R. Network, A Phase II Randomized Clinical Trial of Intravitreal Bevacizumab for Diabetic Macular Edema, Ophthalmology. 114 (2007) 1860-1867. doi:10.1016/j.ophtha.2007.05.062.
[11] D. V. Do, Q.D. Nguyen, D. Boyer, U. Schmidt-Erfurth, D. M. Brown, R. Vitti, et al., One-year outcomes of the da VINCI study of VEg F trap-eye in eyes with diabetic macular edema, Ophthalmology. 119 (2012) 1658-1665. doi:10.1016/j.ophtha.2012.02.010.
[12] S. Pagliarini, S. Beatty, B. Lipkova, E. Pérez-Salvador García, S. Reynders, M. Gekkieva, et al., A 2-year, phase IV, multicentre, observational study of ranibizumab 0.5 mg in patients with neovascular age-related macular degeneration in routine clinical practice: The EPICOHORT study, J. Ophthalmol. 2014 (2014). doi:10.1155/2014/857148.
[13] S.Y. Cohen, G. Mimoun, H. Oubraham, A. Zourdani, C. Malbrel, S. Quere, et al., Changes in visual acuity in patients with wet age-related macular degeneration treated with intravitreal ranibizumab in daily clinical practice: the LUMIERE study, RETINA. 33 (2013) 474-481. doi:10.1097/IAE.0b013e31827b6324.
[14] J.E. Scott, The chemical morphology of the vitreous., Eye (Lond). 6 (Pt 6) (1992) 553-5. doi:10.1038/eye.1992.120.
[15] L. Ma, X. Wang, Z. Zhang, X. Zhou, a Chen, L. Yao, Identification of the ligand-binding domain of human vascular-endothelial-growth-factor receptor Flt-1., Biotechnol. Appl. Biochem. 34 (2001) 199-204. doi:10.1042/BA20010043.
[16] S.T. Wall, K. Saha, R.S. Ashton, K.R. Kam, D. V Schaffer, K.E. Healy, Multivalency of Sonic hedgehog conjugated to linear polymer chains modulates protein potency., Bioconjug. Chem. 19 (2008) 806-12. doi:10.1021/bc700265k.
[17] A. Conway, T. Vazin, D.P. Spelke, N. a Rode, K.E. Healy, R.S. Kane, et al., Multivalent ligands control stem cell behaviour in vitro and in vivo., Nat. Nanotechnol. (2013) 1-8. doi:10.1038/nnano.2013.205.
[18] B.W. Han, H. Layman, N.A. Rode, A. Conway, D. V Schaffer, N. Boudreau, et al., Multivalent conjugates of sonic hedgehog accelerate diabetic wound healing., Tissue Eng. Part A. 21 (2015) 2366-2378. doi:10.1089/ten.TEA.2014.0281.
[19] J.F. Pollock, R.S. Ashton, N. a Rode, D. V Schaffer, K.E. Healy, Molecular characterization of multivalent bioconjugates by size-exclusion chromatography with multiangle laser light scattering., Bioconjug. Chem. 23 (2012) 1794-801. doi:10.1021/bc3000595.
[20] A.K. Jha, A. Mathur, F.L. Svedlund, J. Ye, Y. Yeghiazarians, K.E. Healy, Molecular Weight and Concentration of Heparin in Hyaluronic Acid-based Matrices Modulates Growth Factor Retention Kinetics and Stem Cell Fate, J. Control. Release. 209 (2015) 308-316. doi:10.1016/j.jconrel.2015.04.034.
[21] A. Jha, K. Tharp, J. Ye, J. Santiago-Ortíz, W. Jackson, A. Stahl, et al., Growth factor sequestering and presenting hydrogels promote survival and engraftment of transplanted stem cells, Biomaterials. 47 (2015) 1-12. doi:10.1016/j.biomaterials.2014.12.043.
[22] T.-K. Ito, G. Ishii, S. Saito, K. Yano, A. Hoshino, T. Suzuki, et al., Degradation of soluble VEGF receptor-1 by MMP-7 allows VEGF access to endothelial cells., Blood. 113 (2009) 2363-9. doi:10.1182/blood-2008-08-172742.
[23] F.M. Veronese, Peptide and protein PEGylation, Biomaterials. 22 (2001) 405-417. doi:10.1016/S0142-9612(00)00193-9.
[24] S.C. Fishburn, The pharmacology of PEGylation: Balancing PD with PK to generate novel therapeutics, J. Pharm. Sci. 97 (2010) 4167-4183. doi:10.1002/jps.
[25] C.S. Nickerson, J. Park, J. a Kornfield, H. Karageozian, Rheological properties of the vitreous and the role of hyaluronic acid., J. Biomech. 41 (2008) 1840-6. doi:10.1016/jjbiomech2008.04.015.
[26] J. Lu, T. Su, R. Thomas, Structural Conformation of Bovine Serum Albumin Layers at the Air-Water Interface Studied by Neutron Reflection., J. Colloid Interface Sci. 213 (1999) 426-437. doi:10.1006/jcis.1999.6157.
[27] R. Thadhani, T. Kisner, H. Hagmann, V. Bossung, S. Noack, W. Schaarschmidt, et al., Pilot Study of Extracorporeal Removal of Soluble Fms-Like Tyrosine Kinase 1 in Preeclampsia, Circulation. 124 (2011) 940-950. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.111.034793.
[28] N. a. Peppas, E.W. Merrill, Crosslinked poly(vinyl alcohol) hydrogels as swollen elastic networks., J. Appl. Polym. Sci. 21 (1977) 1763-1770. doi:10.1002/app.1977.070210704.
[29] J.E. Mark, B. Erman, Rubberlike Elasticity: A Molecular Primer, 1a ed., John Wiley & Sons, Toronto, 1988.
[30] K.Y. Lee, J. A.Rowley, P. Eiselt, E.M. Moy, K.H. Bouhadir, D.J. Mooney, Controlling mechanical and swelling properties of alginate hydrogels independently by cross-linker type and cross-linking density, Macromolecules. 33 (2000) 4291-4294. doi:10.1021/ma9921347.
[31] J. Baier Leach, K. A Bivens, C.W. Patrick Jr., C.E. Schmidt, Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: Natural, biodegradable tissue engineering scaffolds, Biotechnol. Bioeng. 82 (2003) 578-589. doi:10.1002/bit.10605.
[32] P.L. Ritger, N. A Peppas, A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-Fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs, J. Control. Release. 5 (1987) 23-36. doi:10.1016/0168-3659(87)90035-6.
[33] P.G. De Gennes, Conjectures on the transport of a melt through a gel, Macromolecules. 19 (1986) 1245-1249. doi:10.1021/ma00158a051.
[34] D.M. Soumpasis, Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments, Biophys. J. 41 (1983) 95-97. doi:10.1016/S0006-3495(83)84410-5.
[35] R. Gaudana, H.K. Ananthula, A. Parenky, A.K. Mitra, Ocular drug delivery., AAPS J. 12 (2010) 348-60. doi:10.1208/s12248-010-9183-3.
[36] S.S. Lee, M.R. Robinson, Novel drug delivery systems for retinal diseases. A review., Ophthalmic Res. 41 (2009) 124-35. doi:10.1159/000209665.
[37] H.F. Edelhauser, C.L. Rowe-Rendleman, M.R. Robinson, D. G. Dawson, G.J. Chader, H.E. Grossniklaus, et al., Ophthalmic drug delivery systems for the treatment of retinal diseases: basic research to clinical applications., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2010) 5403-5420. doi:10.1167/iovs.10-5392.
[38] E.M. Del Amo, A. Urtti, Current and future ophthalmic drug delivery systems. A shift to the posterior segment., Drug Discov. Today. 13 (2008) 135-43. doi:10.1016/j.drudis.2007.11.002.
[39] T.R. Thrimawithana, S. Young, C.R. Bunt, C. Green, R.G. Alany, Drug delivery to the posterior segment of the eye., Drug Discov. Today. 16 (2011) 270-7. doi:10.1016/j.drudis.2010.12.004.
[40] S.K. Sahoo, F. Dilnawaz, S. Krishnakumar, Nanotechnology in ocular drug delivery., Drug Discov. Today. 13 (2008) 144-51. doi:10.1016/j.drudis.2007.10.021.
[41] D. Maurice, Review: practical issues in intravitreal drug delivery., J. Ocul. Pharmacol. Ther. 17 (2001) 393-401. doi:10.1089/108076801753162807.
[42] R.D. Jager, L.P. Aiello, S.C. Patel, E.T. Cunningham, Risks of intravitreous injection: a comprehensive review., Retina. 24 (2004) 676-698. doi:10.1097/00006982-200410000-00002.
[43] E.J. Oh, J.S. Choi, H. Kim, C. K. Joo, S.K. Hahn, Anti-Fltl peptide - Hyaluronate conjugate for the treatment of retinal neovascularization and diabetic retinopathy, Biomaterials. 32 (2011) 3115-3123. doi:10.1016/j.biomaterials.2011.01.003.
[44] A. Bochot, E. Fattal, Liposomes for intravitreal drug delivery: a state of the art., J. Control. Release. 161 (2012) 628-34. doi:10.1016/j.jconrel.2012.01.019.
[45] T. Yasukawa, Y. Ogura, Y. Tabata, H. Kimura, P. Wiedemann, Y. Honda, Drug delivery systems for vitreoretinal diseases., Prog. Retin. Eye Res. 23 (2004) 253-81. doi:10.1016/j.preteyeres.2004.02.003.
[46] F.M. Veronese, G. Pasut, PEGilación, successful approach to drug delivery, Drug Discov. Today. 10 (2005) 1451-1458.
[47] E.W.M. Ng, D.T. Shima, P. Calias, E.T. Cunningham, D.R. Guyer, A.P. Adamis, Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease., Nat. Rev. Drug Discov. 5 (2006) 123-32. doi:10.1038/nrd1955.
[48] P. Bishop, The biochemical structure of mammalian vitreous, Eye. 10 (1996) 664-670. doi:10.1038/eye.1996.159.
[49] D. Park, Y. Kim, H. Kim, K. Kim, Y.-S. Lee, J. Choe, et al., Hyaluronic acid promotes angiogenesis by inducing RHAMM-TGFp receptor interaction via CD44-PKC8, Mol. Cells. 33 (2012) 563-574. doi:10.1007/s10059-012-2294-1.
[50] U. Laurent, P. Tornquist, K. Granath, K. Lilja-Englind, D. Ytterberg, Molecular weight and concentration of hyaluronan in vitreous humour from diabetic patients, Acta Ophthalmol. 68 (1990) 109-112. doi:10.1111/j.1755-3768.1990.tb01972.x.
[51] G.A. Lutty, D.C. Thompson, J.Y. Gallup, R.J. Mello, A. Patz, A. Fenselau, Vitreous: An Inhibitor of Retinal Extract-Induced Neovascularization, Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (1983) 52-56.
Ejemplo 3: Generación de conjugados multivalentes con VHH anti-VEGF o con anti-VEGF de fragmento variable monocatenario (scFv) (scFv anti-VEGF)
Se generaron dos conjugados multivalentes a partir de dos formatos de anticuerpo anti-VEGF diferentes: un anticuerpo anti-VEGF de fragmento variable monocatenario (scFv) y un anticuerpo anti-VEGF camélido de dominio único (VHH).
Fig. 20A-C: La capacidad de cada conjugado anticuerpo de unirse a 500 pg de VEGF-A165 humano se comparó con el correspondiente anticuerpo no conjugado usando un ensayo ELISA. Ambos conjugados multivalentes se prepararon con ácido hialurónico (HyA) de 860 kDa. Las valencias del anticuerpo scFv anti-VEGF y VHH anti-VEGF eran de 31 y 28, respectivamente. Los datos se ajustaron usando una curva logística de cuatro parámetros y se usó para calcular la CI50 para cada tratamiento. La FIG. 20A muestra el porcentaje de VEGF no unido para el anticuerpo scFv anti-VEGF no conjugado y el anticuerpo scFv anti-VEGF multivalente conjugado. La FIG. 20B muestra el porcentaje de VEGF no unido para el anticuerpo VHH anti-VEGF no conjugado y el anticuerpo VHH anti-VEGF multivalente conjugado. La FlG. 20C muestra los valores de CI50 para los anticuerpos conjugados de FIG. 20A-B en comparación con los anticuerpos no conjugados de FIG. 20A-B. La conjugación multivalente no tenía un efecto sustancial sobre los valores de CI50 para los conjugados en comparación con el anticuerpo no conjugado, como se resume en la FIG.20C.
Ejemplo 4: Los conjugados VHH anti-VEGF multivalentes (mvAnti-VEGF) preparados con HyA muestran semivida aumentada in vitro e in vivo
Las tasas de difusión del anticuerpo VHH anti-VEGF no conjugado y el anticuerpo anti-VEGF VHH multivalente (28 VHH por HyA de 860 kDa) se compararon etiquetando fluorescentemente las proteínas y atrapándolas dentro de un hidrogel de PEG con HyA al 1% hecho de componentes disponibles en el mercado (BioTIme). Se estimó la tasa de hinchamiento y el peso molecular medio entre las reticulaciones. El diámetro de malla promedio del hidrogel se estimó que era de aproximadamente 80 nm.
FIG. 21: La concentración de proteína no conjugada y el conjugado de proteína liberado de los hidrogeles se midió cada 2-3 días y los datos se ajustaron a una curva de deterioro exponencial para estimar su semivida de difusión. La semivida de los conjugados de anticuerpo VHH anti-VEGF era aproximadamente 4 veces mayor que la del anticuerpo VHH anti-VEGF no conjugado. Los resultados mostrados en la FIG. 21 son la media de tres experimentos independientemente repetidos.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado para su uso en un método para tratar una enfermedad o un trastorno oculares en un individuo, comprendiendo dicho conjugado:
a) un polipéptido biológicamente activo que tiene un peso molecular de 5 kDa a 250 kDa, en donde el polipéptido biológicamente activo es un inhibidor de la angiogénesis; y
b) un polímero biocompatible que tiene un peso molecular de 500 kDa a 2 MDa,
en donde el polipéptido se une covalentemente al polímero directamente o por un enlazador, en donde la relación molar entre el polipéptido biológicamente activo y el polímero es al menos de aproximadamente 10:1, en donde el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de dicho conjugado mediante administración intravítrea; y en donde:
i) el polipéptido biológicamente activo es un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) soluble, y el polímero es ácido hialurónico; o
ii) el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo específico para VEGF, y el polímero es carboximetilcelulosa; o
ii) el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo específico para VEGF, y el polímero es ácido hialurónico.
2. El conjugado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la relación molar entre el polipéptido biológicamente activo y el polímero es:
i) de 10:1 a 25:1; o
ii) de 25:1 a 50:1.
3. El conjugado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido hialurónico tiene un peso molecular de 600 kDa a 700 kDa, o de 750 kDa a 1 MDa.
4. El conjugado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde, la relación molar entre el receptor de VEGF y el ácido hialurónico es de 20:1.
5. El conjugado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el individuo es un ser humano.
6. El conjugado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la enfermedad ocular es degeneración macular, neovascularización coroidea, neovascularización de la retina, vitreorretinopatía proliferativa, glaucoma o inflamación ocular.
7. El conjugado para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en el método el conjugado se administra una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada 6 meses o una vez al año.
8. El conjugado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde
a) el polipéptido biológicamente activo es un anticuerpo VHH anti-VEGF; y
b) el polímero biocompatible comprende ácido hialurónico que tiene un peso molecular de aproximadamente 860 kDa,
en donde el polipéptido se une covalentemente al polímero por medio de un enlazador, y
en donde la relación molar entre el polipéptido biológicamente activo y el polímero es de 24:1 a 45:1.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101694405B1 (ko) 2008-03-28 2017-01-23 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 폴리펩티드―중합체 접합체 및 그의 사용 방법
RU2763916C2 (ru) 2015-09-23 2022-01-11 Дженентек, Инк. Оптимизированные варианты анти-vegf антител
KR102944785B1 (ko) 2015-12-09 2026-03-30 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 안구 질환 또는 장애의 치료 방법
KR102799807B1 (ko) 2015-12-30 2025-04-24 코디악 사이언시스 인코포레이티드 항체 및 이의 접합체
SG10202107829YA (en) 2017-03-22 2021-08-30 Genentech Inc Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
CA3130653A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Valitor, Inc. Multivalent peptide conjugates for sustained intra-articular treatment of joint inflammation
EP3810082A1 (en) * 2018-06-19 2021-04-28 Cella Therapeutics, LLC Sustained-release drug delivery systems comprising an intraocular pressure lowering agent, a cnp compound, an npr-b compound, a tie-2 agonist, or neurotrophic agent for use for treating glaucoma or ocular hypertension
US20220227855A1 (en) * 2019-04-25 2022-07-21 The University Of Massachusetts Compositions and methods for treatment of angiogenesis related diseases
CN118718181A (zh) 2019-06-05 2024-10-01 里珍纳龙药品有限公司 用于精确剂量递送的装置及方法
AU2020300527B2 (en) * 2019-07-01 2026-02-05 Valitor, Inc. Hydrophilic linkers for multivalent peptide conjugates
CA3157509A1 (en) * 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
JP2025534252A (ja) * 2022-09-14 2025-10-15 尋済生物科技（北京）有限公司 抗ｖｅｇｆａ抗体またはその抗原結合フラグメント、およびその使用
EP4574846A4 (en) * 2022-09-14 2026-02-18 Quaerite Biopharm Res Beijing Co Ltd Anti-Vegfa Fusion Protein, its Preparation Process and Use
CN115671036A (zh) * 2022-11-15 2023-02-03 上海交通大学医学院附属第九人民医院 用于治疗眼底和眼内疾病的凝胶药物
USD1120314S1 (en) 2022-11-30 2026-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dose delivery device

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5162218A (en) 1988-11-18 1992-11-10 The Regents Of The University Of California Conjugated polypeptides and methods for their preparation
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US6781030B1 (en) 1998-11-02 2004-08-24 Trustee Of Tufts College, Ballou Hall Methods for cloning mammals using telophase oocytes
EP1025861A1 (de) 1999-02-04 2000-08-09 Roche Diagnostics GmbH Pharmazeutische Zusammensetzung von hydrophob modifizierten Hedgehog-Proteinen und deren Verwendung
JP2003502292A (ja) 1999-06-01 2003-01-21 バイオジェン インコーポレイテッド ヘッジホッグタンパク質のポリマー結合体及び利用
US20030236214A1 (en) 1999-06-09 2003-12-25 Wolff Jon A. Charge reversal of polyion complexes and treatment of peripheral occlusive disease
US9522217B2 (en) 2000-03-15 2016-12-20 Orbusneich Medical, Inc. Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same
US20040248801A1 (en) 2000-03-21 2004-12-09 Kiessling Laura L. Methods and reagents for regulation of cellular responses in biological systems
US20030003048A1 (en) 2001-04-26 2003-01-02 Chun Li Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
WO2003033521A1 (en) 2001-10-16 2003-04-24 Massachusetts Institute Of Technology Inppressor trna system in mammalian cells for the introduction of unnatural amino acids in polypeptides.
US20070026518A1 (en) 2005-03-29 2007-02-01 The Regents Of The University Of California Controlling stem cell destiny with tunable matrices
MXPA05000186A (es) * 2002-07-03 2005-08-17 Pericor Science Inc Composiciones de acido hialuronico y metodos de uso.
US20040116348A1 (en) 2002-09-23 2004-06-17 Ying Chau Polymer-linker-drug conjugates for targeted drug delivery
CA2521784C (en) 2003-04-08 2012-03-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
JP4949038B2 (ja) 2003-12-01 2012-06-06 ダコ デンマーク アクティーゼルスカブ 免疫組織化学的検出のための方法および組成物
WO2005110489A2 (en) 2004-04-13 2005-11-24 (Osi) Eyetech, Inc. Nucleic acid aptamers conjugated to high molecular weight steric groups
US8591885B2 (en) 2004-04-30 2013-11-26 Allergan, Inc. Carbonic anhydrase inhibitor sustained release intraocular drug delivery systems
WO2009013563A2 (en) * 2006-11-13 2009-01-29 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Use of lipid conjugates in the treatment of diseases or disorders of the eye
CA2705785A1 (en) * 2006-11-14 2008-05-22 Saul Yedgar Use of lipid conjugates in the treatment of diseases or disorders of the eye
US11078262B2 (en) 2007-04-30 2021-08-03 Allergan, Inc. High viscosity macromolecular compositions for treating ocular conditions
WO2009048280A2 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Postech Academy-Industry Foundation Long acting hyaluronic acid - peptide conjugate
KR101694405B1 (ko) 2008-03-28 2017-01-23 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 폴리펩티드―중합체 접합체 및 그의 사용 방법
WO2010053140A1 (ja) 2008-11-05 2010-05-14 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物
IT1399351B1 (it) 2009-06-16 2013-04-16 Fidia Farmaceutici Procedimento per la sintesi di coniugati di glicosamminoglicani (gag) con molecole biologicamente attive, coniugati polimerici e usi relativi
US20120282211A1 (en) 2009-11-24 2012-11-08 Carnegie Mellon University Antibodies and conjugates for modulators of angiogenesis
CN108314733A (zh) 2010-07-16 2018-07-24 埃博灵克斯股份有限公司 修饰的单结构域抗原结合分子及其应用
KR101309566B1 (ko) 2010-12-10 2013-09-17 포항공과대학교 산학협력단 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
IN2014CN04251A (es) 2011-11-09 2015-07-17 Ascend Biopharmaceuticals Ltd
WO2015009787A1 (en) 2013-07-19 2015-01-22 The Johns Hopkins University Biomaterials comprising hyaluronic acid binding peptides and extracellular matrix binding peptides for hyaluronic acid retention and tissue engineering applications
RU2763916C2 (ru) 2015-09-23 2022-01-11 Дженентек, Инк. Оптимизированные варианты анти-vegf антител
HK1259021A1 (zh) 2015-10-07 2019-11-22 基因泰克公司 用於預測治療劑-聚合物綴合物的玻璃體半衰期的系統和方法
KR102944785B1 (ko) 2015-12-09 2026-03-30 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 안구 질환 또는 장애의 치료 방법
CA3056248A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
CA3130653A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Valitor, Inc. Multivalent peptide conjugates for sustained intra-articular treatment of joint inflammation
AU2020300527B2 (en) 2019-07-01 2026-02-05 Valitor, Inc. Hydrophilic linkers for multivalent peptide conjugates

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