ES2925550T3

ES2925550T3 - Trastornos neurodegenerativos

Info

Publication number: ES2925550T3
Application number: ES15807974T
Authority: ES
Inventors: Susan Adele Greenfield; Gwenael Pottiez; Sara Esther Garcia-Rates
Original assignee: Neuro Bio Ltd
Current assignee: Neuro Bio Ltd
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: RU2707191C2; JP6708646B2; GB201420986D0; KR20170104457A; US10729749B2; CN107001419A; BR112017011226A2; AU2015352182A1; GB2539161A; EP3224270B1; AU2015352182B2; EP4116415A1; WO2016083809A1; MX2017006692A; RU2017121836A; RU2017121836A3; KR102489620B1; CA2968933A1; EP3224270A1; CN114410606A

Abstract

La invención se refiere a nuevos péptidos, composiciones, terapias y métodos para tratar trastornos neurodegenerativos, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Trastornos neurodegenerativos

La invención se refiere a trastornos neurodegenerativos y, en particular, a nuevos péptidos, composiciones, terapias y métodos para tratar tales afecciones, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.

La enfermedad de Alzheimer afecta principalmente a hombres y mujeres mayores de 65 años y la probabilidad de que se les diagnostique la enfermedad aumenta sustancialmente con la edad. Dado que se espera que el porcentaje de adultos mayores de 65 años crezca en todo el mundo durante los próximos 40 años, se espera que la incidencia de la enfermedad de Alzheimer se duplique con creces, pasando de 21 millones de casos en 2010 a 53 millones en 2050 (estadísticas de www.alzheimersresearchuk.org y www.alz.org). Este aumento exponencial en el número esperado de pacientes que presentan la enfermedad de Alzheimer no solo representa un área importante de necesidad médica insatisfecha, sino que ofrece una importante oportunidad de mercado para la terapia y el diagnóstico, ya que actualmente no existe un método completamente efectivo para tratar la enfermedad.

No ha habido ningún fármaco nuevo para combatir específicamente la enfermedad de Alzheimer, ni la neurodegeneración en general, en los últimos 10 años. La razón es que aún no se ha identificado el mecanismo cerebral subyacente básico que, en consecuencia, podría ser un objetivo farmacéutico. El principal contendiente para explicar el proceso de neurodegeneración es la 'hipótesis amiloide', donde la muerte neuronal se atribuye a la ruptura de la membrana celular por depósitos tóxicos de amiloide, característicos de cerebro con Alzheimer Post mortem, y como resultado de la escisión anormal de la proteína precursora de amiloide. Sin embargo, esta 'hipótesis amiloide' no explica la copatología frecuentemente observada con las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, ni la selectividad característica de las células vulnerables a la degeneración a pesar de la ubicuidad potencial de amiloide en todas las células cerebrales, ni la ausencia de depósitos de amiloide en modelos animales de demencia, ni tampoco la aparición de amiloide en ciertas regiones del cerebro donde los déficits cognitivos no son evidentes. A pesar de la popularidad de la formación de amiloide como objetivo farmacéutico durante las últimas dos décadas, ningún tratamiento basado en esta teoría ha demostrado ser eficaz hasta el momento. Una posibilidad más probable es que una vez que el proceso neurodegenerativo esté en marcha, el amiloide se genere adicionalmente como un efecto secundario y menos específico.

Una pista para identificar el mecanismo primario de la neurodegeneración podría ser que solo varios grupos neuronales son principalmente vulnerables. Además, los diversos subgrupos de células propensos a la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y las enfermedades de las neuronas motoras, sin embargo, son adyacentes entre sí y forman un "centro" continuo que se extiende desde el tronco encefálico hasta el prosencéfalo y todos envían proyecciones difusas hacia arriba y hacia los centros cerebrales superiores. Por lo tanto, a pesar de su heterogeneidad en los transmisores, estos grupos neuronales se han denominado colectivamente neuronas 'Globales' para distinguirlas de los circuitos más familiares y localizados de células en la mayoría de las otras partes del cerebro, tal como el cerebelo, el tálamo, la corteza, etc. Estas neuronas Globales selectivamente vulnerables se identificaron previamente, aunque utilizando una terminología diferente ('núcleo isodendrítico') como fundamentales en la neurodegeneración hace varias décadas.

Los subgrupos de neuronas Globales tienen una característica específica en común que podría explicar la pregunta desconcertante y aún sin respuesta de por qué solo estas células sucumben a la muerte progresiva mientras que sus contrapartes en otras partes del cerebro, incluso cuando están dañadas por un accidente cerebrovascular, no lo hacen: conservan una robusta plasticidad durante la edad adulta, acompañada de una sensibilidad específica a las sustancias que ayudan y sostienen el crecimiento - los 'factores tróficos'. En el cerebro en desarrollo, los factores tróficos funcionan estimulando la afluencia de calcio, lo que desencadena una cascada de eventos dentro de la célula, lo que finalmente da como resultado una diferenciación y un crecimiento selectivos. Sin embargo, en dosis más altas o con exposiciones más prolongadas, la entrada sostenida de calcio puede ser tóxica para las neuronas. Más significativamente, otro factor determinante en si la afluencia de calcio desencadena o no efectos tróficos o tóxicos es la edad: a medida que las neuronas maduran, un antiguo nivel trófico de calcio intracelular se vuelve letal.

Los inventores han propuesto previamente que el proceso neurodegenerativo es de hecho un proceso de desarrollo activado de forma aberrante. En apoyo de esta hipótesis, se ha informado una hipertrofia de las neuronas "centrales" del tronco encefálico en los cerebros con Alzheimer (Bowser et al., 1997, Brain Pathol. 7: 723 - 30). Si se dañan grandes áreas de este centro, entonces se presentará más de una enfermedad neurodegenerativa, como ocurre en los casos frecuentemente vistos pero nunca explicados de copatología con las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. Curiosamente, todas las neuronas dentro del centro vulnerable de las neuronas Globales, a pesar de la heterogeneidad del transmisor, contienen la conocida enzima acetilcolinesterasa (AChE). Por la tanto, la AChE está presente en neuronas donde no podría realizar su función normal, ya que subgrupos de células como el locus coeruleus noradrenérgico, la sustancia negra dopaminérgica o los núcleos del rafe serotoninérgico, en ningún caso contienen el sustrato habitual, la acetilcolina. Otra desviación inesperada de su función enzimática normal es que la AChE en realidad se libera de las neuronas Globales, presumiblemente como una especie de mensajero intercelular por derecho propio. En general, la AChE ahora está ampliamente y bien establecida como una molécula de señalización que tiene actividad trófica en una variedad diversa de situaciones tanto en tejido neural como no neural.

Los inventores han demostrado previamente que la AChE, que actúa como un agente trófico independiente de su acción enzimática, desencadena de hecho la afluencia de calcio en las neuronas. Por lo tanto, es posible que dentro de las neuronas Globales, la AChE tenga una acción dual no clásica que se extiende a lo largo de un eje trófico-tóxico, de acuerdo con la cantidad, la duración de la disponibilidad y, lo que es más importante, la edad. Si las neuronas estándar se dañan en la edad adulta, como en un derrame cerebral, otras lo compensarán funcionalmente. Por el contrario, las neuronas Globales responderán recurriendo a sus recursos tróficos en un intento de regeneración. Pero debido a que la entrada posterior de calcio será letal en las células maduras más viejas, el daño resultante desencadenará nuevos intentos de compensación en un ciclo pernicioso que caracteriza a la neurodegeneración.

La acetilcolinesterasa (AChE) se expresa en diferentes etapas de desarrollo en varias formas, todas las cuales tienen una actividad enzimática idéntica, pero que tienen una composición molecular muy diferente. La 'cola' (T-AChE) se expresa en las sinapsis y los inventores identificaron previamente dos péptidos que podrían escindirse del extremo terminal C, uno denominado "T14", dentro del otro que se conoce como "T30", y que tienen una fuerte homología de secuencia con la región comparable de la p-amiloide. El péptido AChE del extremo terminal C "T14" ha sido identificado como la parte sobresaliente de la molécula de AChE responsable de su gama de acciones no hidrolíticas. El análogo peptídico sintético de 14 aminoácidos (es decir, "T14") y, posteriormente, la secuencia de aminoácidos más grande, más estable y más potente en la que está incrustado (es decir, "T30") muestran acciones comparables a las notificadas para AChE 'no colinérgica', donde el residuo inerte dentro de la secuencia T30 (es decir, "T15") no tiene efecto.

Los efectos agudos de T14 y T30 son que:-(i) modulan la afluencia de calcio en las neuronas en cortes de cerebro en escalas de tiempo de milisegundos a horas; (ii) comprometen la viabilidad celular en células PC 12 y también en cultivos organotípicos neuronales in vitro; (iii) modulan la liberación 'compensatoria' de AChE inducida por calcio de las neuronas y las células PC 12; (iv) activan las corrientes de calcio en ovocitos y neuronas en cortes de cerebro; (v) hacen sinergia con amiloide en efectos tóxicos; y (vi) participan en la producción de proteína precursora de amiloide y en la liberación del péptido amiloide beta (Ap). Los efectos crónicos de T14 y T30 son que:-(i) reducen el crecimiento neuronal; (ii) inducen la apoptosis; (iii) aumentan la liberación de AChE; (iv) se unen y modulan el receptor nicotínico a7; y (v) potencian la expresión del receptor a7 en la superficie celular durante 24 horas, proporcionando así un mecanismo de retroalimentación para una mayor toxicidad.

Dado que T14 y T30 son más selectivos que el p-amiloide para inducir toxicidad y también son sinérgicos con el amiloide que exacerba la toxicidad, se ha postulado que cualquier agente que bloquee los efectos tóxicos de T14 o T30 también reduciría el efecto tóxico subsiguiente y menos selectivo de amiloide. El inventor ha demostrado previamente que los péptidos T30 y T14 se unen a un sitio alostérico en el receptor nicotínico a7 para inducir un espectro de efectos tóxicos tróficos. Este receptor se expresa conjuntamente con AChE durante períodos críticos del desarrollo del cerebro y muestra una distribución muy paralela en el cerebro adulto, y es uno de los ionóforos de calcio más potentes del cerebro. También puede funcionar independientemente de la transmisión colinérgica, ya que la colina (derivada de la dieta) puede servir como ligando primario alternativo. Además, este receptor ya ha sido implicado en la enfermedad de Alzheimer como uno de los objetivos de la terapia actual galantamina (Reminyl (RTM)), además de estar relacionado con las acciones de amiloide.

Sin embargo, la eficacia de la galantamina ha resultado limitada, mientras que otros antagonistas de los receptores nicotínicos de acetilcolina a7 aún se encuentran en ensayos clínicos. La galantamina no solo tiene efectos no específicos sobre otros receptores, además de inhibir la AChE, sino que tiene una baja afinidad por el receptor nicotínico a7 (es decir, solo 10 pM) en comparación con la T30 y la T14, que tienen afinidades mucho más altas por el receptor nicotínico a7 (es decir, 5 nM). Por lo tanto, si, en un cerebro con Alzheimer, el equivalente endógeno del péptido T30 ya está ocupando el sitio del receptor respectivo, sería necesario administrar galantamina en dosis altas no fisiológicas con efectos secundarios inevitables y, lo que es más importante, eficacia cuestionable.

El documento WO02/42778 divulga el péptido de la SEQ ID No: 61 y sus composiciones, y apoya el uso de este péptido en terapia, en particular en trastornos neurodegenerativos.

Jean et al, Heterologous Amyloid Seeding: Revisiting the Role of Acetylcholinesterase in Alzheimer's Disease, PLOS ONE, vol. 2, núm. 7, 25 de julio de 2007 divulga secuencias que comprenden los péptidos HRWSSYMVHW, YMVHW y WKAEFHRWSS.

Los inventores han demostrado previamente que los polipéptidos cíclicos que comprenden una secuencia de aminoácidos derivada del extremo terminal C de la acetilcolinesterasa (AChE) inhiben selectivamente los efectos no clásicos de la AChE (es decir, los efectos de la AChE que son independientes de su actividad enzimática) y/o su péptido terminal in vitro, y por lo tanto se puede utilizar para tratar trastornos neurodegenerativos. Por ejemplo, se ha demostrado que el péptido cíclico denominado "NBP14", que se muestra en las Figuras 2 y 3, es particularmente activo, ya que actúa como un modulador alostérico del receptor nicotínico a7 que antagoniza los efectos de los péptidos AChE y Beta amiloide. Se demostró que protege a las células de la toxicidad de T14, T30 y p-amiloide lineales, y bloquea la liberación compensatoria de AChE inducida por la toxicidad de T14 y T30 lineales. Además, observaron que el NBP14 cíclico administrado solo no tiene efectos significativos sobre las concentraciones de Ca2+ en cortes de cerebro de rata, pero bloquea los efectos del p-amiloide.

Sin embargo, a pesar de la actividad exhibida por el NBP14 cíclico, debido a su tamaño, existen algunas preocupaciones sobre su capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, existe una necesidad continua de proporcionar medicamentos mejorados para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

Como se discutió en los Ejemplos, los inventores se basaron en su trabajo previo dirigiendo su atención a péptidos lineales pequeños (es decir, 4-14 aminoácidos de longitud) derivados del extremo terminal C de acetilcolinesterasa (AChE), o variantes cíclicas de los mismos. Se han producido una serie de péptidos y han descubierto que es sorprendentemente posible clasificar los péptidos lineales activos, que son útiles para tratar trastornos neurodegenerativos, y separarlos de los péptidos lineales inactivos, que no son útiles. Estos péptidos activos e inactivos se clasifican en función de su eficacia neuroprotectora contra T30 o amiloide, medida por una reducción en la pérdida de células y la liberación compensatoria concomitante de AChE, es decir, un coeficiente de valor que se determina calculando el porcentaje de acetilcolinesterasa liberada de células PC12 cultivadas en presencia del péptido lineal en comparación con el de las células PC12 en ausencia del péptido, y dividiendo este valor por el porcentaje de viabilidad de las células PC12 en presencia del péptido.

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53.

Por lo tanto, en esta divulgación, se proporciona un péptido, derivado o análogo del mismo que comprende o consiste en una secuencia de 5 a 8 aminoácidos que se derivan del extremo terminal C de la acetilcolinesterasa (AChE), o una variante cíclica o un truncamiento de la misma, donde el péptido, derivado o análogo del mismo tiene un coeficiente de valor, x, de 1.0 a 1.1, en el que

^ _ % de liberación de AChE

% de viabilidad de células PC12

donde el "% de liberación de AChE" es el porcentaje de acetilcolinesterasa liberada de una preparación de células PC12 cultivadas en presencia de un péptido tóxico seleccionado de T30 (SEQ ID No: 156) o Ap (SEQ ID No: 158), y el péptido, derivado o análogo del mismo, en comparación con la preparación de células PC12 cultivadas en ausencia de cualquier péptido, derivado o análogo del mismo (es decir, control), y el "% de viabilidad de células PC12" es el porcentaje de viabilidad de la preparación de células PC12 cultivadas en presencia del péptido tóxico seleccionado de T30 (SEQ ID No: 156) o Ap (SEQ ID No: 158), y el péptido, derivado o análogo del mismo, en comparación con el de una preparación de células PC12 cultivadas en ausencia de cualquier péptido, derivado o análogo del mismo (es decir, control).

Como se describe en los Ejemplos, los inventores han demostrado sorprendentemente que es posible separar los péptidos activos de los inactivos basándose en sus coeficientes de valor (X) que representan su eficacia protectora contra la toxicidad de T30 y Ap. El valor de control (es decir, la ausencia de péptido) es 1.0. El coeficiente de valor es una relación de dos parámetros biológicos, donde x = 1.0 a 1.1 significa que no es tóxico o protector, y donde x >1.1 significa toxicidad. El valor para T30 es x = 169-45/74-309 = 2.28, y para Beta Amiloide (Ap) x = 124-19/87-42= 1.42.

Las tablas 1 y 2 muestran los efectos de los péptidos lineales sobre la actividad de AChE y la viabilidad de las células PC12 frente a la toxicidad de T30 y Ap. Como puede verse, algunos péptidos son protectores mientras que otros no previenen la toxicidad. No se podría haber predicho que los péptidos de la invención superarían al equivalente endógeno del péptido T30 que ya ocupa el sitio del receptor respectivo. En consecuencia, el péptido del primer aspecto previene los efectos tóxicos previamente establecidos de los péptidos lineales T30 (y T14) y también del p-amiloide (A p). Otro criterio es que el péptido activo tenga una longitud de 5 - 8 aminoácidos, ya que se cree que los compuestos de mayor tamaño tienen menos probabilidades de acceder al cerebro desde la periferia, es decir, cruzar la barrera hematoencefálica. En consecuencia, el uso de los dos criterios (es decir, la longitud del aminoácido y la actividad neuroprotectora) permite el aislamiento de péptidos lineales neuroprotectores tanto por estructura como por función. Como tal, los inventores confían en su eficacia in vivo y creen que los péptidos de la invención tendrán una utilidad significativa para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos para estabilizar cualquier pérdida adicional de células.

En un segundo aspecto de la invención, se proporcionan uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos de acuerdo con el primer aspecto, para uso en terapia o diagnóstico.

En un tercer aspecto, se proporcionan uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos de acuerdo con el primer aspecto, para usar en el tratamiento, la mejora o la prevención de un trastorno neurodegenerativo.

En un cuarto aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un quinto aspecto, se proporciona un proceso para preparar la composición farmacéutica, proceso que comprende combinar una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID No: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, el uno o más péptidos, para usar de acuerdo con el tercer aspecto, se usan para tratar la enfermedad neurodegenerativa en una terapia de combinación.

En esta divulgación, se proporciona un método para tratar, mejorar o prevenir un trastorno neurodegenerativo en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos de acuerdo con el primer aspecto.

El trastorno neurodegenerativo que se trata es preferiblemente uno que se caracteriza por el daño o la muerte de las neuronas 'Globales'. Por ejemplo, el trastorno neurodegenerativo puede seleccionarse de un grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Parkinson; enfermedad de Huntington; enfermedad de neuronas motoras; espinocerebeloso tipo 1, tipo 2 y tipo 3; esclerosis lateral amiotrófica (ELA); esquizofrenia; demencia con cuerpos de Lewy; y demencia frontotemporal.

Preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo que se trata es la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de neuronas motoras. Lo más preferiblemente, el trastorno neurodegenerativo, que se trata con el péptido, derivado o análogo del mismo de acuerdo con el primer aspecto, es la enfermedad de Alzheimer.

El término "derivado o análogo del mismo" puede significar un péptido dentro del cual los residuos de aminoácidos se reemplazan por residuos (ya sean aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales o miméticos de aminoácidos) con cadenas laterales similares o propiedades de estructura peptídica. Además, los terminales de tales péptidos pueden estar protegidos por grupos protectores del extremo terminal N y C con propiedades similares a los grupos acetilo o amida.

Los derivados y análogos de péptidos de acuerdo con la divulgación también pueden incluir aquellos que aumentan la vida media del péptido in vivo. Por ejemplo, un derivado o análogo de los péptidos de la divulgación puede incluir derivados peptoides y retropeptoides de los péptidos, híbridos de péptido-peptoide y derivados de D-aminoácidos de los péptidos.

Los peptoides, o glicinas poli-N-sustituidas, son una clase de peptidomiméticos cuyas cadenas laterales están unidas al átomo de nitrógeno de la cadena principal del péptido, en lugar de a los carbonos alfa, como ocurre en los aminoácidos. Los derivados peptoides de los péptidos de la divulgación pueden diseñarse fácilmente a partir del conocimiento de la estructura del péptido. Los retropeptoides (en los que todos los aminoácidos se reemplazan por residuos peptoides en orden inverso) también son derivados adecuados de acuerdo con la divulgación. Se espera que un retropeptoide se una en la dirección opuesta en el surco de unión al ligando, en comparación con un péptido o un híbrido de peptoide-péptido que contiene un residuo de peptoide. Como resultado, las cadenas laterales de los residuos peptoides pueden apuntar en la misma dirección que las cadenas laterales del péptido original.

El término "derivado de" puede significar una secuencia de aminoácidos que es un derivado o una modificación de una secuencia de aminoácidos que está presente en, o forma, el extremo terminal C de AChE, y porciones del mismo, o una variante ciclada del mismo, tal como NBP-14.

El término "truncamiento del mismo" puede significar que el péptido derivado de AChE se reduce de tamaño mediante la eliminación de aminoácidos. La reducción de aminoácidos puede lograrse eliminando residuos del extremo terminal C o N del péptido, o puede lograrse eliminando uno o más aminoácidos del núcleo del péptido.

En una realización, el péptido, derivado o análogo del mismo del primer aspecto puede ser cíclico o ciclado. Sin embargo, lo más preferido es que el péptido, derivado o análogo del mismo no sea cíclico o ciclado. Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo es lineal. Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo se purifica y/o aísla, es decir, no se encuentra en la naturaleza. Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo es al menos 95% puro, o al menos 99% puro, es decir, libre de impurezas.

La acetilcolinesterasa es una serina proteasa que hidroliza la acetilcolina, y será bien conocida por el experto en la materia. La forma principal de acetilcolinesterasa que se encuentra en el cerebro se conoce como acetilcolinesterasa con cola (T-AChE). Dado que la divulgación se refiere principalmente al tratamiento de trastornos neurodegenerativos, se prefiere que el péptido, derivado o análogo del mismo comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos derivada del extremo terminal C de la acetilcolinesterasa con cola (T-AChE), o una variante cíclica o truncamiento de la misma.

La secuencia de proteína de una realización de acetilcolinesterasa humana con cola (Gen Bank: AAA68151.1) tiene una longitud de 614 aminoácidos y se proporciona en el presente documento como la SEQ ID No: 157, de la siguiente manera:

1 mrppqcllht pslaspllll llwllgggvg aegredaell vtvrggrlrg irlktpggpv

61 saflgipfae ppmgprrflp pepkqpwsgv vdattfqsvc yqyvdtlypg fegtemwnpn

121 relsedclyl nvwtpyprpt sptpvlvwiy gggfysgass ldvydgrflv qaertvlvsm

181 nyrvgafgf1 alpgsreapg nvglldqrla lqwvqenvaa fggdptsvtl fgesagaasv

241 gmhllsppsr glfhravlqs gapngpwatv gmgearrrat qlahlvgcpp ggtggndtel

301 vaclrtrpaq vlvnhewhvl pqesvfrfsf vpvvdgdfls dtpealinag dfhglqvlvg

361 vvkdegsyfl vygapgfskd neslisraef lagvrvgvpq vsdlaaeaw lhytdwlhpe

421 dparlreals dvvgdhnvvc pvaqlagrla aqgarvyayv fehrastlsw plwmgvphgy

481 eiefifgipl dpsrnytaee kifaqrlmry wanfartgdp neprdpkapq wppytagaqq

541 yvsldlrple vrrglraqac afwnrflpkl lsatdtldea erqwkaefhr wssymvhwkn

601 qfdhyskqdr csdl

[SEQ ID No: 157]

Se apreciará que los primeros 31 residuos de aminoácidos de la SEQ ID No:157 se eliminan mientras se libera la proteína, dejando así una secuencia de 583 aminoácidos. En consecuencia, se prefiere que el péptido, derivado o análogo del mismo comprenda una secuencia de aminoácidos derivada del extremo terminal C de la acetilcolinesterasa, o una variante cíclica o un truncamiento de la misma, en donde la acetilcolinesterasa comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No: 157, o una variante funcional o fragmento de la misma. Preferiblemente, se excluyen los 31 aminoácidos en el extremo terminal N.

Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo de la misma comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de los últimos 300, 200, 100 o 50 aminoácidos que forman el extremo terminal C de la acetilcolinesterasa, o una variante cíclica o un truncamiento de la misma, lo más preferiblemente en donde la acetilcolinesterasa comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No:157. El péptido, derivado o análogo del mismo preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de los últimos 40 o 30 aminoácidos que forman el extremo terminal C de la acetilcolinesterasa, o una variante cíclica o un truncamiento de la misma.

Como se describe en los Ejemplos, y como se muestra gráficamente en la Figura 7, los inventores idearon un conjunto de criterios mediante los cuales se determinan los péptidos activos. El primer criterio utilizado para establecer los péptidos activos fue que el coeficiente de valor (x), que es una medida de la actividad de AChE y la viabilidad de las células PC12, es de 1.0 a 1.1. Otro criterio utilizado fue que el péptido activo tuviera una longitud de 5 -8 aminoácidos, ya que se cree que los compuestos de mayor tamaño tienen menos probabilidades de acceder al cerebro desde la periferia, es decir, cruzar la barrera hematoencefálica.

Otro criterio utilizado para determinar los péptidos activos se basó en el valor de unión teórico del péptido al sitio alostérico del receptor nicotínico a7. El valor de enlace teórico se puede calcular utilizando el algoritmo publicado por Trott y Olson (Ref: O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading, Journal of Computational Chemistry 31 (2010) 455 - 461). Por lo tanto, preferiblemente el péptido, derivado o análogo del mismo tiene una afinidad de unión teórica al sitio alostérico del receptor nicotínico a7 de menos de -7.0 kcal.mol-1, más preferiblemente menos de -7.1 kcal.mol-1, y lo más preferiblemente menos de -7.8 kcal.mol-1.

Un criterio final utilizado para determinar los péptidos activos es la cantidad de afluencia de calcio en las células PC12 provocada por el péptido. El valor de afluencia de calcio se puede calcular como se describe en la sección de métodos. El valor de calcio corresponde al resultado del experimento cuando se aplica T30 o Ap solo o junto con los péptidos pequeños. El valor de control para estos experimentos se basa en la afluencia de calcio inducida por acetilcolina sola. Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo tiene un valor de afluencia de calcio de menos de 120, y más preferiblemente un valor de 97-120.

Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo consta de una secuencia de 5 a 8 aminoácidos que se derivan del extremo terminal C de la acetilcolinesterasa (AChE), o una variante cíclica de la misma.

Por lo tanto, se prefiere especialmente que el péptido, derivado o análogo del mismo es de: (i) 5 - 8 aminoácidos de longitud; (ii) tenga un coeficiente de valor, x, de 1.0 a 1.1; (iii) tiene un valor de unión teórico del péptido al sitio alostérico del receptor nicotínico a7 de menos de -7.0; y tiene un valor de afluencia de calcio de menos de 120.

En un ejemplo más preferido, el péptido, derivado o análogo del mismo es de: (i) 5-8 aminoácidos de longitud; (ii) tiene un coeficiente de valor, x, de 1.0 a 1.1; (iii) tiene un valor de unión teórico del péptido al sitio alostérico del receptor nicotínico a7 inferior a -7.1 o inferior a -7.80; y tiene un valor de afluencia de calcio de 97 a 120.

Ventajosamente y preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo de la invención es protector frente a los efectos tóxicos del péptido T30 y/o Ap. Más preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo de la invención protege contra los efectos tóxicos del péptido T30 y Ap. Los parámetros de toxicidad se cuantifican como aumento de la acetilcolinesterasa, disminución de la viabilidad celular, aumento de la afluencia de calcio y disminución de la afinidad teórica por el receptor nicotínico a7. Los cambios en estos parámetros determinarán los efectos protectores de los péptidos.

El peso molecular del péptido, derivado o análogo del mismo de acuerdo con esta divulgación es preferiblemente inferior a 1000 Da, más preferiblemente inferior a 900 Da.

Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo comprende o consiste en 5 y 8 residuos de aminoácidos, o 5 y 7 aminoácidos, o 6 y 8 aminoácidos.

En un ejemplo preferido, el péptido, derivado o análogo del mismo comprende o consta de seis aminoácidos. Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No: 30, 32, 40 o 42.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 30 (es decir, "NBP-601") es: HWKAEF.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 32 (es decir, "NBP-603") es: KAEFHR.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 40 (es decir, "NBP-611") es: SYMVHW.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 42 (es decir, "NBP-613") es: MVHWKA.

Preferiblemente, la SEQ ID No: 40 protege contra los efectos tóxicos de Ap. Preferiblemente, la SEQ ID Nos: 30, 32 y 42 protegen contra los efectos tóxicos de T30.

En otro ejemplo preferido, el péptido, derivado o análogo del mismo comprende o consta de siete aminoácidos. Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No: 48, 51 o 53.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 48 (es decir, "NBP-705") es: EFHRWSS.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 51 (es decir, "NBP-708") es: RWSSYMV.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 53 (es decir, "NBP-710") es: SSYMVHW.

Preferiblemente, la SEQ ID No: 53 protege contra los efectos tóxicos de Ap. Preferiblemente, las SEQ ID Nos: 48 y 51 protegen contra los efectos tóxicos de T30.

En otro ejemplo preferido, el péptido, derivado o análogo del mismo comprende o consta de ocho aminoácidos. Preferiblemente, el péptido, derivado o análogo del mismo comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No: 61.

La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 61 (es decir, "NBP-804") es: AEFHRWSS.

Preferiblemente, la SEQ ID No: 61 protege contra los efectos tóxicos de T30.

Se entenderá que NBP-601, 603 y 804 se derivan todos del NBP-14 cíclico (SEQ ID No: 1), como se muestra en la Figura 3, en el que la alanina y la lisina terminales se ciclan juntas. NBP-601,603 y 804 son todos péptidos lineales e incluyen los aminoácidos alanina y lisina (es decir, que definen el punto en el que se liga NBP-14) conectados entre sí.

Se apreciará que Ap es actualmente el mecanismo de toxicidad más comúnmente aceptado para causar trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer. En consecuencia, se prefiere cualquier péptido, derivado o análogo del mismo de acuerdo con la invención que proteja contra la toxicidad de Ap y, por lo tanto, sea especialmente útil para tratar trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, el trabajo anterior del inventor sugiere que la toxicidad de T30 es de hecho la causa más probable de las enfermedades neurodegenerativas, y no la toxicidad de Ap. Por consiguiente, cualquier péptido de acuerdo con la invención que sea protector contra la toxicidad de T30 es el más preferido y es particularmente útil para tratar trastornos neurodegenerativos.

Los inventores realizaron experimentos de respuesta dependiente de la dosis para los péptidos lineales preferidos en PC12 contra T30 y amiloide (Ejemplo 6). También probaron el efecto de T30 en las respuestas evocadas en el prosencéfalo basal y examinaron si el NBP14 cíclico o cualquiera de las variantes lineales más cortas del primer aspecto pueden revertir cualquier cambio inducido por T30. Los ejemplos 6 y 7 muestran que NBP601, NBP603 y NBP613 protegen contra los efectos de T30. En consecuencia, estos péptidos son los más preferidos.

En esta divulgación, se proporciona un péptido, derivado o análogo del mismo que consta de una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No: 30, 32, 40, 42, 48, 51, 53 o 61.

En esta divulgación, se proporcionan uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos de acuerdo con el quinto aspecto, para uso en terapia o diagnóstico.

En esta divulgación, se proporcionan uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos de acuerdo con el quinto aspecto, para usar en el tratamiento, la mejora o la prevención de un trastorno neurodegenerativo.

En esta divulgación, se proporciona un método para tratar, mejorar o prevenir un trastorno neurodegenerativo en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos de acuerdo con el quinto aspecto.

En un ejemplo preferido, se usa un único péptido, derivado o análogo del mismo para tratar la enfermedad neurodegenerativa. Sin embargo, con base en los resultados, en otro ejemplo, se usa más de un péptido, derivado o análogo del mismo para tratar la enfermedad neurodegenerativa, es decir, en una terapia de combinación. Por ejemplo, se puede usar una pluralidad de péptidos que se ha demostrado que protegen contra la toxicidad de Ap. Alternativamente, se puede usar preferiblemente una pluralidad de péptidos que han demostrado ser protectores contra la toxicidad de T30.

En una realización preferida, sin embargo, uno o más péptidos que protegen contra la toxicidad de T30 se usan en combinación con uno o más péptidos que protegen contra la toxicidad de Ap, es decir, la administración de dos péptidos, uno del grupo protector de T30 que se muestra en la Tabla 1 y uno del grupo protector de Ap que se muestra en la Tabla 2. Por ejemplo, NBP-601 (Se Q ID No: 30) se puede coadministrar con Nb P-710 (SEQ iD No: 53), o NBP-804 (SEQ ID No: 61) se puede coadministrar con NBP-611 (SEQ ID No: 40), y así sucesivamente.

Se apreciará que los péptidos de acuerdo con la invención pueden usarse en un medicamento que puede utilizarse en una monoterapia (es decir, el uso de uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos del primer aspecto), para tratar, mejorar o prevenir un trastorno neurodegenerativo, como la enfermedad de Alzheimer. Alternativamente, el péptido de acuerdo con la invención se puede usar como complemento o en combinación con terapias conocidas para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, como los inhibidores de la acetilcolinesterasa.

Los péptidos de acuerdo con la invención pueden combinarse en composiciones que tienen varias formas diferentes dependiendo, en particular, de la manera en que se va a utilizar la composición. Así, por ejemplo, la composición puede presentarse en forma de polvo, comprimido, cápsula, líquido, pomada, crema, gel, hidrogel, aerosol, atomizador, solución micelar, parche transdérmico, suspensión de liposomas o cualquier otra forma adecuada que pueda ser administrada a una persona o animal que necesita tratamiento. Se apreciará que el vehículo de los medicamentos de acuerdo con la invención debe ser bien tolerado por el sujeto al que se administra y preferiblemente permite la administración del péptido a través de la barrera hematoencefálica.

Se apreciará que la eficacia de cualquier tratamiento para los trastornos cerebrales depende de la capacidad del péptido terapéutico candidato para cruzar la barrera hematoencefálica (BBB). Sin embargo, es bien sabido que, durante la enfermedad de Alzheimer, la barrera hematoencefálica aumenta en permeabilidad lo que podría permitir que los péptidos de la invención alcancen el sistema nervioso central, de hecho, idealmente solo en los sitios de degeneración donde se necesita, es decir, donde la BBB está comprometida.

Se pueden aplicar dos estrategias principales para cruzar la BBB con péptidos de la invención, que incluyen: (1) uso de nanopartículas como transportadores para apuntar específicamente al cerebro y suministrar el compuesto activo. Este método se ha utilizado con éxito para administrar péptidos, proteínas y medicamentos contra el cáncer al cerebro; (2) uso de péptidos de carga. La adición de dicho péptido transportado específicamente a través de la BBB permite la transferencia de los péptidos de la invención de forma más fácil.

Los medicamentos que comprenden polipéptidos de acuerdo con la invención se pueden usar de varias maneras. Por ejemplo, puede ser necesaria la administración oral, en cuyo caso el polipéptido puede estar contenido dentro de una composición que puede, por ejemplo, ingerirse por vía oral en forma de comprimido, cápsula o líquido. Una opción alternativa para administrar los péptidos sería usar un aerosol nasal, ya que la administración de péptidos por medio de un aerosol nasal llega al cerebro de manera más rápida y eficiente que las formas de administración oral o intravenosa (vease http://memoryzine.com/2010/07/26/nose-sprays-cross-blood-brainbarrier-faster-and-safer/). Por lo tanto, las composiciones que comprenden polipéptidos de la invención pueden administrarse por inhalación (por ejemplo, por vía intranasal). Las composiciones también pueden formularse para uso tópico. Por ejemplo, se pueden aplicar cremas o ungüentos a la piel, por ejemplo, adyacente al cerebro.

Los polipéptidos de acuerdo con esta divulgación también pueden incorporarse dentro de un dispositivo de liberación lenta o retardada. Dichos dispositivos pueden, por ejemplo, insertarse sobre o debajo de la piel, y el medicamento puede liberarse durante semanas o incluso meses. El dispositivo puede estar ubicado al menos junto al sitio de tratamiento, por ejemplo, la cabeza. Dichos dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se requiere un tratamiento a largo plazo con polipéptidos usados de acuerdo con la invención y que normalmente requeriría una administración frecuente (por ejemplo, al menos una inyección diaria).

En una realización preferida, los medicamentos de acuerdo con la invención pueden administrarse a un sujeto mediante inyección en el torrente sanguíneo o directamente en un sitio que requiera tratamiento. Por ejemplo, el medicamento puede inyectarse al menos junto al cerebro. Las inyecciones pueden ser intravenosas (bolo o infusión) o subcutáneas (bolo o infusión) o intradérmicas (bolo o infusión).

Se apreciará que la cantidad del polipéptido que se requiere está determinada por su actividad biológica y biodisponibilidad, que a su vez depende del modo de administración, las propiedades fisicoquímicas del polipéptido y si se usa como monoterapia o en un terapia combinada. La frecuencia de administración también estará influenciada por la vida media del polipéptido dentro del sujeto que se está tratando. Las dosis óptimas a administrar pueden ser determinadas por los expertos en la técnica y variarán con el polipéptido particular en uso, la concentración de la composición farmacéutica, el modo de administración y el avance de la enfermedad neurodegenerativa. Factores adicionales que dependen del sujeto particular que se esté tratando darán como resultado la necesidad de ajustar las dosis, incluyendo la edad, el peso, el sexo, la dieta y el momento de la administración al sujeto.

En general, se puede usar una dosis diaria de entre 0.001 pg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal del polipéptido de acuerdo con la divulgación para tratar, mejorar o prevenir enfermedades neurodegenerativas, dependiendo del polipéptido que se use. Más preferiblemente, la dosis diaria está entre 0.01 pg/kg de peso corporal y 1 mg/kg de peso corporal, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 0.1 pg/kg y 10 pg/kg de peso corporal.

El polipéptido puede administrarse antes, durante o después del inicio de la enfermedad neurodegenerativa. Las dosis diarias pueden administrarse en una sola administración (por ejemplo, una sola inyección diaria o la inhalación de un aerosol nasal). Alternativamente, el polipéptido puede requerir la administración dos o más veces durante un día. Como ejemplo, los polipéptidos pueden administrarse como dos (o más dependiendo de la gravedad de la enfermedad neurodegenerativa que se esté tratando) dosis diarias de entre 0.07 pg y 700 mg (es decir, suponiendo un peso corporal de 70 kg). Un paciente que recibe tratamiento puede tomar una primera dosis al despertar y luego una segunda dosis por la noche (si está en un régimen de dos dosis) o a intervalos de 3 o 4 horas a partir de entonces. Alternativamente, se puede usar un dispositivo de liberación lenta para proporcionar dosis óptimas de polipéptido de acuerdo con la divulgación a un paciente sin necesidad de administrar dosis repetidas.

Procedimientos conocidos, como los empleados convencionalmente por la industria farmacéutica (por ejemplo, experimentación in vivo, ensayos clínicos, etc.), pueden usarse para formar formulaciones específicas del polipéptido de acuerdo con la invención y regímenes terapéuticos precisos (tales como dosis diarias de los agentes y la frecuencia de administración). Los inventores creen que son los primeros en sugerir una composición contra enfermedades neurodegenerativas, basada en el uso de un polipéptido de la invención.

Por lo tanto, en esta divulgación, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más péptidos, derivados o análogos de los mismos de acuerdo con el primer aspecto y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica de la invención es preferiblemente una composición contra la enfermedad neurodegenerativa, es decir, una formulación farmacéutica utilizada en la mejora, prevención o tratamiento terapéutico de un trastorno neurodegenerativo en un sujeto, tal como la enfermedad de Alzheimer.

La divulgación también proporciona un proceso para preparar la composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación, comprendiendo el proceso combinar una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido, derivado o análogo del mismo de acuerdo con la divulgación, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El péptido, derivado o análogo del mismo es preferiblemente NBP-601 (SEQ ID No: 30), NBP-603 (SEQ ID No: 32), NBP-613 (SEQ ID No: 42), NBP-705 (SEQ ID No: 48), NBP-708 (SEQ ID No: 51), NBP-804 (SEQ ID No: 61), NBP-611 (SEQ ID No: 40) o NBP-710 (SEQ ID No: 53).

Un "sujeto" puede ser un vertebrado, un mamífero o un animal doméstico. Por lo tanto, los medicamentos de acuerdo con la invención se pueden usar para tratar a cualquier mamífero, por ejemplo, ganado (por ejemplo, un caballo), mascotas, o se pueden usar en otras aplicaciones veterinarias. Sin embargo, lo más preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de péptido es cualquier cantidad que, cuando se administra a un sujeto, es la cantidad de agente activo que se necesita para tratar el trastorno neurodegenerativo o producir el efecto deseado.

Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente eficaz de péptido usada puede ser de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente de 800 mg, y preferiblemente de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 500 mg. Se prefiere que la cantidad de péptido sea una cantidad de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se hace referencia en el presente documento, es cualquier compuesto conocido o combinación de compuestos conocidos que los expertos en la técnica saben que es útil para formular composiciones farmacéuticas.

En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido y la composición puede estar en forma de polvo o comprimido. Un vehículo sólido farmacéuticamente aceptable puede incluir una o más sustancias que también pueden actuar como agentes saborizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, colorantes, rellenos, deslizantes, auxiliares de compresión, aglutinantes inertes, edulcorantes, conservantes, recubrimientos o agentes de desintegración de comprimidos. El vehículo también puede ser un material encapsulante. En polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que está mezclado con los agentes activos finamente divididos de acuerdo con la invención. En comprimidos, el principio activo puede mezclarse con un vehículo que tenga las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y compactarse en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferiblemente hasta el 99% de los principios activos. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico. En otra realización, el vehículo farmacéutico puede ser un gel y la composición puede estar en forma de crema o similar.

Sin embargo, el vehículo farmacéutico puede ser un líquido y la composición farmacéutica está en forma de solución. Los vehículos líquidos se utilizan en la preparación de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El principio activo de acuerdo con la invención puede disolverse o suspenderse en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes saborizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizadores u osmorreguladores. Los ejemplos adecuados de vehículos líquidos para administración oral y parenteral incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como los anteriores, por ejemplo, derivados de celulosa, preferiblemente solución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (incluidos alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles son útiles en composiciones en forma de líquido estéril para administración parenteral. El vehículo líquido para las composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas líquidas, que son soluciones o suspensiones estériles, se pueden utilizar, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intravenosa y particularmente subcutánea. El polipéptido se puede preparar como una composición sólida estéril que se puede disolver o suspender en el momento de la administración usando agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado.

El polipéptido y las composiciones de la invención se pueden administrar por vía oral en forma de una solución o suspensión estéril que contiene otros solutos o agentes de suspensión (por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para que la solución sea isotónica), sales biliares, goma arábiga, gelatina, monooleato de sorbitán, polisorbato 80 (ésteres de oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares. El polipéptido utilizado de acuerdo con la invención también se puede administrar por vía oral en forma de composición líquida o sólida. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas, tales como píldoras, cápsulas, gránulos, comprimidos y polvos, y formas líquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para la administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones y suspensiones estériles.

Se apreciará que la invención se extiende a cualquier ácido nucleico o péptido o variante, derivado o análogo del mismo, que comprende sustancialmente las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de cualquiera de las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento, incluidas variantes funcionales o fragmentos funcionales de las mismas. Los términos "sustancialmente la secuencia de aminoácidos/nucleótidos/péptidos", "variante funcional" y "fragmento funcional" pueden ser una secuencia que tiene al menos un 40 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos/nucleótidos/péptidos de cualquiera de los secuencias mencionadas en el presente documento, por ejemplo, 40% de identidad con la secuencia identificada como la SEQ ID NO: 1-157, y así sucesivamente.

Secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos con una identidad de secuencia superior al 65 %, más preferiblemente superior al 70 %, incluso más preferiblemente superior al 75 % y aún más preferiblemente superior al 80 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias mencionadas también están previstas. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos tiene al menos un 85 % de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos un 92 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 98 % de identidad y, lo más preferiblemente, al menos el 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento.

El técnico experto apreciará cómo calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos. Para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos, primero se debe preparar un alineamiento de las dos secuencias, seguido del cálculo del valor de identidad de la secuencia. El porcentaje de identidad para dos secuencias puede tomar diferentes valores dependiendo de:-(i) el método utilizado para alinear las secuencias, por ejemplo, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (implementado en diferentes programas) o alineación estructural a partir de la comparación tridimensional; y (ii) los parámetros utilizados por el método de alineación, por ejemplo, alineación local frente a global, la matriz de puntaje de pares utilizada (por ejemplo, BLOSUM62, PAM250, Gonnet, etc.) y la penalización por hueco, por ejemplo, forma funcional y constantes.

Una vez realizada la alineación, hay muchas formas diferentes de calcular el porcentaje de identidad entre las dos secuencias. Por ejemplo, se puede dividir el número de identidades por: (i) la longitud de la secuencia más corta; (ii) la longitud de la alineación; (iii) la longitud media de la secuencia; (iv) el número de posiciones sin huecos; o (iv) el número de posiciones equivalentes excluyendo los voladizos. Además, se apreciará que el porcentaje de identidad también depende fuertemente de la longitud. Por lo tanto, cuanto más corto sea un par de secuencias, mayor será la identidad de secuencia que se puede esperar que ocurra por casualidad.

Por lo tanto, se apreciará que el alineamiento preciso de secuencias de proteína o ADN es un proceso complejo. El popular programa de alineación múltiple ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673 - 4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876 - 4882) es una forma preferida de generar múltiples alineaciones de proteínas o ADN de acuerdo con la invención. Los parámetros adecuados para ClustalW pueden ser los siguientes: para alineaciones de ADN: Penalización por apertura de hueco = 15.0, penalización por extensión de hueco = 6.66 y matriz = identidad. Para alineaciones de proteínas: penalización por apertura de hueco = 10.0, penalización por extensión de hueco = 0.2 y matriz = Gonnet. Para alineaciones de ADN y proteínas: ENDGAP = -1 y GAPDIST = 4. Los expertos en la técnica sabrán que puede ser necesario variar estos y otros parámetros para un alineamiento de secuencia óptimo.

Preferiblemente, el cálculo de las identidades porcentuales entre dos secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos puede calcularse a partir de una alineación como (N/T)*100, donde N es el número de posiciones en las que las secuencias comparten un residuo idéntico y T es el número total de posiciones comparadas, incluidas los huecos pero excluyendo las salientes. Por lo tanto, un método más preferido para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias comprende (i) preparar un alineamiento de secuencias usando el programa ClustalW usando un conjunto adecuado de parámetros, por ejemplo, como se estableció anteriormente; y (ii) insertar los valores de N y T en la siguiente fórmula:- identidad de secuencia = (N/T)*100.

Los expertos en la técnica conocerán métodos alternativos para identificar secuencias similares. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar será codificada por una secuencia que se hibrida con secuencias de ADN o sus complementos en condiciones estrictas. Por condiciones estrictas, se entiende que el nucleótido se hibrida con el ADN o ARN unido al filtro en 3x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C seguido de al menos un lavado en 0.2x SSC/SDS al 0.1 % a aproximadamente 20 - 65 °C. Alternativamente, un polipéptido sustancialmente similar puede diferir en al menos 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 o 100 aminoácidos de las secuencias descritas en el presente documento.

Debido a la degeneración del código genético, está claro que cualquier secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento podría variarse o cambiarse sin afectar sustancialmente a la secuencia de la proteína codificada de ese modo, para proporcionar una variante funcional de la misma. Las variantes de nucleótidos adecuadas son aquellas que tienen una secuencia alterada por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Otras variantes adecuadas son aquellas que tienen secuencias de nucleótidos homólogas pero que comprenden la totalidad o partes de la secuencia, que se alteran mediante la sustitución de diferentes codones que codifican un aminoácido con una cadena lateral de propiedades biofísicas similares al aminoácido al que sustituye, para producir un cambio conservador. Por ejemplo, los aminoácidos hidrófobo no polares pequeños incluyen glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina y metionina. Los aminoácidos hidrófobos no polares grandes incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen serina, treonina, cisteína, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Por lo tanto, se apreciará qué aminoácidos se pueden reemplazar con un aminoácido que tenga propiedades biofísicas similares, y el técnico experto conocerá las secuencias de nucleótidos que codifican estos aminoácidos.

En otro aspecto, se proporciona un péptido, derivado o análogo del mismo que comprende una secuencia de 5 a 8 aminoácidos que se derivan del extremo terminal C de la acetilcolinesterasa (AChE), o un truncamiento de la misma, en donde el péptido, derivado o análogo de la misma tiene un valor de coeficiente x, de 1.0 a 1.1, donde

_ % de liberación de AChE

% de viabilidad de células PC12

donde "% de liberación de AChE" es el porcentaje de acetilcolinesterasa liberada de una preparación de células PC12 cultivadas en presencia del péptido, derivado o análogo del mismo en comparación con la preparación de células PC12 cultivadas en ausencia del péptido, derivado o análogo del mismo, y "% de viabilidad de células PC12" es el porcentaje de viabilidad de la preparación de células PC12 cultivadas en presencia del péptido, derivado o análogo del mismo en comparación con el de una preparación de células PC12 cultivadas en ausencia del péptido, derivado o análogo del mismo.

Todas las características descritas en este documento (incluidas las reivindicaciones, el resumen y los dibujos adjuntos), y/o todos las etapas de cualquier método o proceso así divulgado, pueden combinarse con cualquiera de los aspectos anteriores en cualquier combinación, excepto combinaciones en las que al menos algunas de tales características y/o etapas son mutuamente excluyentes.

Para una mejor comprensión de la invención, y para mostrar cómo se pueden llevar a cabo las realizaciones de la misma, ahora se hará referencia, a modo de ejemplo, a las figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1a muestra la unión del polipéptido cíclico NBP-14 (denominado en este documento como la SEQ ID No: 1) que se une al receptor nicotínico a7, y la Figura 1b muestra una vista ampliada de la estructura tridimensional del NBP-14 cíclico;

La Figura 2 muestra la secuencia de NBP-14 con los residuos terminales de Alanina (A) y Lisina (K) formando los sitios de ciclación;

La Figura 3 muestra el péptido cíclico NBP-14 en el que los residuos terminales de alanina y lisina están unidos entre sí;

La Figura 4a-4k son tablas que muestran varios ejemplos del péptido lineal de acuerdo con la divulgación. Los péptidos se dividen en grupos respectivos de péptidos que tienen cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce aminoácidos;

La Figura 5 es una representación gráfica de la afinidad teórica de los péptidos que componen varios ejemplos de los péptidos lineales de la divulgación con el sitio objetivo del receptor nicotínico a7;

La Figura 6 muestra los datos y los gráficos correspondientes que muestran la relación entre la liberación de acetilcolinesterasa, la afluencia de iones de calcio y la viabilidad celular. La Figura 6a muestra la relación entre la liberación de acetilcolinesterasa y la afluencia de iones de calcio (la correlación es de 0.210), la Figura 6b muestra la relación entre la afluencia de iones de calcio y la viabilidad celular (la correlación es de 0.026) y la Figura 6c muestra la relación entre la liberación de acetilcolinesterasa y la viabilidad celular (la correlación es -0.550);

La Figura 7 es un diagrama de flujo que muestra los cuatro filtros o criterios utilizados en la determinación de péptidos activos de acuerdo con la invención. El criterio 1 implica la correlación entre la liberación de AChE de las células PC12 y la viabilidad de las células PC12; el criterio 2 implica la afinidad de unión teórica de los péptidos restantes tras la aplicación del criterio 1; el criterio 3 implica la afluencia de iones de calcio en las células PC12 provocada por los péptidos que quedan después de la aplicación del criterio 2; y el criterio 4 implica el tamaño del péptido, es decir, excluye los péptidos que quedan después de la aplicación del criterio 3 con más de 8 aminoácidos;

La Figura 8 son gráficos que muestran los efectos dependientes de la dosis sobre la potenciación del calcio de la variante lineal NBP-601 o Nb P-603 frente a T30;

La Figura 9 son gráficos que muestran el efecto dependiente de la dosis sobre la potenciación del calcio de la variante lineal NBP-613 frente a T30

La Figura 10 es una imagen (panel superior) y una representación esquemática coincidente (panel inferior) de cortes coronales de cerebro de rata que contienen un complejo de bandas diagonales (núcleo septal medial (MS), banda diagonal del miembro ventral (VDB), banda diagonal del miembro horizontal (HDB); subregiones cerebrales que constituyen parte del prosencéfalo basal. Las estrellas rojas indican la ubicación aproximada de la estimulación para los experimentos electrofisiológicos y de imágenes de colorantes sensibles al voltaje (VSDI);

La Figura 11 muestra una serie temporal promediada de VSDI que muestra la cantidad de fluorescencia (dF/Fo) emitida dentro de la región de interés (ROI) durante las condiciones de perfusión de línea base (traza azul), T30 (2 pM; traza verde) y T30 (2 pM) y NBP14 (4 pM; traza roja). El perfil de respuesta en el prosencéfalo basal muestra una respuesta trifásica, siendo la fase 1 la respuesta del pico inicial (0-15 ms después de la estimulación inicial), la fase 2 es el breve período de inactividad que se observa directamente después de la respuesta pico (15-25 ms después de la estimulación inicial), y la fase 3 se ve como una actividad de rebote de larga latencia (recurrente) inmediatamente después de la fase 2 (25 ms más después de la estimulación). Los datos se adquirieron sumando ( ! ) de la fluorescencia emitida entre 0 y 280 ms después de la estimulación inicial;

La Figura 12 muestra gráficos de datos sin procesar compilados (n = 14) que muestran puntos de datos individuales de amplitud de pico máxima (fase 1) para la línea base (azul), T30 (verde) y T30 y NBP14 (rojo) - panel superior izquierdo; puntos de datos individuales de respuestas de fluorescencia sumadas (!dF/Fo) - panel inferior izquierdo. Los mismos datos que muestran tendencias específicas del experimento en la amplitud de respuesta pico (panel superior derecho) y la fluorescencia sumada (panel inferior derecho). Unidades del eje Y para paneles superiores: fluorescencia registrada, dF/Fo; paneles inferiores: suma de fluorescencia registrada (0 ^ 280 ms después del estímulo), !dF/Fo;

La Figura 13 muestra los valores individuales de la actividad de latencia prolongada sumada tomados del grupo de datos sin procesar (que se muestra en la Figura 12, paneles inferiores) que muestran experimentos de ejemplo en los que T30 indujo una disminución en la actividad de la red neuronal del prosencéfalo basal general (panel superior), así como en los que T30 indujo un aumento de la actividad de la red (panel inferior). En ambos casos, el cambio en la actividad de la red muestra al menos un 50 % de cambio en la respuesta (aumento/disminución) desde el nivel de referencia. En ambos casos, la perfusión conjunta de T30 con NBP14 (tercera condición) siempre revirtió el cambio inducido por la perfusión de T30 hacia el nivel de actividad inicial;

La Figura 14 es un gráfico que muestra los puntos de datos individuales de la fluorescencia emitida sumada durante la respuesta inicial (eje x) frente al cambio inducido por la perfusión T30 (respuesta T30 - respuesta inicial; eje y). Se puede observar una correlación en la que cuanto mayor es el nivel de respuesta de línea base, mayor es el cambio inducido por T30; p = 0.007;

La Figura 15 es un gráfico que muestra los puntos de datos individuales de cambio inducido en la fluorescencia emitida sumada durante la perfusión de T30 (respuesta de T30 - respuesta de línea base; eje x) frente al cambio inducido por la adición de NBP14 al perfundido (respuesta de T30 y NBP14 - respuesta de T30; eje y). Se puede observar una correlación donde cuanto mayor sea el cambio inducido por T30, mayor es la reversión de ese efecto con la adición de NBP14; p=0.015, lo que indica que NBP14 es un bloqueador eficaz de la acción de T30;

La Figura 16 muestra una serie temporal promediada de VSDI que muestra la cantidad de fluorescencia (dF/Fo) emitida dentro de la región de interés (ROI) durante las condiciones de perfusión iniciales (trazo azul), T30 (2 pM; trazo verde) y T30 (2 pM) y NBP-603 (4 pM; trazo rojo). Los datos se adquirieron sumando ( !) la fluorescencia emitida entre 0 y 280 ms después de la estimulación inicial;

La Figura 17 muestra gráficos de datos sin procesar compilados (n=5) que muestran puntos de datos individuales de amplitud de pico máxima (fase 1) para la línea base (azul), T30 (verde) y T30 y NBP-603 (rojo) - panel superior izquierdo; puntos de datos individuales de respuestas de fluorescencia sumadas (!dF/Fo) - panel inferior izquierdo. Los mismos datos que muestran tendencias específicas del experimento en la amplitud de respuesta pico (panel superior derecho) y la fluorescencia sumada (panel inferior derecho). Unidades del eje Y para paneles superiores: fluorescencia registrada, dF/Fo; paneles inferiores: suma de fluorescencia registrada (0. 280 ms después del estímulo), !dF/Fo;

La Figura 18 es un gráfico que muestra los puntos de datos individuales de la fluorescencia emitida sumada durante la respuesta inicial (eje x) frente al cambio inducido por la perfusión T30 (respuesta T30 - respuesta inicial; eje y). Debido al bajo número de puntos de datos y la alta variabilidad entre ellos, se encuentra una tendencia a la baja (tal como observa arriba); p > 0.05;

La Figura 19 es un gráfico que muestra puntos de datos individuales de cambio inducido en la fluorescencia emitida sumada durante la perfusión de T30 (respuesta de T30 - respuesta inicial; eje x) representado frente al cambio inducido por la adición de NBP-603 al perfundido (respuesta de T30 y NBP-603 - respuesta de T30; eje y). Puede observarse una correlación donde cuanto más positivo es el cambio inducido por la perfusión de T30, mayor es la inversión de los efectos una vez que se añade NBP-603 al perfundido; p = 0.024;

La Figura 20 muestra la unión del péptido lineal NBP-601 (denominado en el presente documento como la SEQ ID No: 30) que se une al receptor nicotínico a7, a7-nAChR); y

La Figura 21 muestra la estructura química del NBP-14 cíclico.

Ejemplos

Materiales y métodos

Cultivos de células PC12

Las células PC12 son una línea celular clonada de feocromocitoma derivada de la médula suprarrenal (Greene y Tischler, 1976, Proc Natl Acad Sci USA 73: 2424 - 2428; Mizrachi et al., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 6161 -6165). Son fáciles de cultivar y fácilmente accesibles para manipulaciones experimentales. Dado que las células de cromafina se derivan de la cresta neural pero están ubicadas en el centro de un órgano periférico accesible (la médula suprarrenal), se ha descrito que ofrecen una "ventana" al cerebro (Bornstein et al., 2012, Mol Psychiatry 17: 354 - 358). Estas células sirven como un poderoso, aunque novedoso, modelo in vitro para estudiar el proceso primario aún desconocido de la neurodegeneración y las razones por las que son útiles para este proyecto son las siguientes: la médula suprarrenal en los pacientes de Alzheimer muestra varias características patológicas que recuerdan a las que se observan en el SNC, por ejemplo, numerosas inclusiones similares a cuerpos de Lewy, ovillos neurofibrilares y filamentos helicoidales emparejados, así como la expresión de la proteína precursora de amiloide (APP) (Takeda et al., 1994, Neurosci Lett 168: 57-60). Además Appleyard y Macdonald (1991, Lancet 338: 1085 - 1086) demostraron una reducción selectiva solo en la forma soluble (es decir, liberable) de AChE de la glándula suprarrenal en AD, quizás debido a su mayor secreción en el plasma, donde está elevada en pacientes con AD (Atack et al., 1985, J Neurol Sci 70: 1-12; Berson et al., 2008, Brain 131: 109-119).

Las células PC12 de tipo silvestre fueron proporcionadas por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El cultivo o preparación de células PC12 se sembró de forma rutinaria en placas de 100 mm (Corning) recubiertas con colágeno (2 pg/cm2) y se mantuvieron en medio de crecimiento con medio esencial mínimo Eagle (MEM) suplementado con suero de caballo (HS) al 10% inactivado por calor y suero bovino fetal al 5% (FBS), HEPES 10 mM, L-Glutamina 2 mM y solución de penicilina/estreptomicina 1:400. Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 y el medio se reemplazó cada 2 días. Para la división, las células se desalojaron de la placa utilizando una pipeta con medio, y una parte de estas se volvió a sembrar en placas nuevas de cultivo. Las células se usaron entre los pases 12 y 25.

Preparación de p-amiloide

Se prepararon fibrillas de p-amiloide (1 - 42) como lo describe el proveedor (Abcam, Cambridge, RU)). Se disolvió 1 mg de p-amiloide (1 - 42) en 1 mL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) al 100 %. Esta solución se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución se sonicó durante 10 min y luego se secó en un secador de vacío rápido (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, RU) y se almacenó a -80 °C. Para los experimentos, las muestras se diluyeron en DMSO al 100 % y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente para garantizar la formación de fibrillas.

Ensayo de viabilidad celular

Se utilizó un Kit 8 de recuento celular (CCK-8) como una mejora de la técnica SRB utilizada anteriormente. Mediante la utilización de la sal de tetrazolio altamente soluble en agua WST-8, CCK-8 produce un colorante de formazán soluble en agua tras la reducción en presencia de un portador de electrones. WST-8 es reducido por deshidrogenasas en las células para producir un producto de color amarillo (formazán), que es soluble en el medio de cultivo de tejidos. La cantidad de colorante de formazán generado por la actividad de las deshidrogenasas en las células es directamente proporcional al número de células vivas. Las células PC12 se sembraron en 200 pL de medio de cultivo completo el día antes del experimento en placas de 96 pocillos. Los tratamientos con T30 o Ap solos o junto con NBP-14 o los péptidos más pequeños se agregan y se incuban durante 1 hora en la incubadora. Posteriormente, se retiran 100 pL de medio de cultivo y se añaden 10 pL de solución de CCK-8 (Kit 8 de recuento celular). La placa se incuba durante 2 horas en la incubadora y luego se coloca en el lector de placas de absorbancia. La absorbancia debe medirse a 450 nm.

Ensayo de actividad de acetilcolinesterasa

La actividad de AChE se midió usando el reactivo de Ellman que mide la presencia de grupos tiol como resultado de la actividad de AChE. Las células se sembraron en placas el día anterior al experimento como para el ensayo de viabilidad celular. Las células se trataron con T30 o Ap (5 pM) solos o combinados con NBP-14 o los péptidos pequeños (0.5 pM). Después del tratamiento, se recolectó el sobrenadante (perfundido) de cada tratamiento y se agregaron 25 pL de cada condición a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano, seguido de la adición de 175 pL de reactivo de Ellman (solución A: KH2PO4139 mM y K2HPO479.66 mM, pH 7.0; solución B (sustrato): yoduro de acetiltiocolina 11.5 mM; solución C (reactivo): 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) 8 mM y NaHCO315 mM). El reactivo de Ellman se preparó como una mezcla de las 3 soluciones en una proporción de 33(A):3(B):4(C). Se tomaron medidas de absorbancia a intervalos regulares (3, 10, 30 y 60 minutos) en experimentos a 405 nm.

Fluorometría de calcio

Las células PC12 se sembraron en 200 pL de medio de cultivo completo el día antes del experimento en placas de 96 pocillos. El día del experimento, se prepara la solución Fluo-8 (Abcam) (de acuerdo con el protocolo del proveedor). Posteriormente, se retiran 100 pL de medio de cultivo y se añaden 100 pL de solución Fluo-8. Los tratamientos con T30 o Ap junto con NBP-14 o péptidos pequeños se agregan y se incuban durante 30 minutos en la incubadora y 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de 1 hora, la placa se coloca en el lector de placas de fluorescencia (Fluostar). Antes de leer la fluorescencia, se prepara acetilcolina (ACh) 100 pM y se coloca en el inyector Fluostar. Para cada pocillo, la lectura estará formada por una fluorescencia basal seguida de una inyección de acetilcolina que inducirá un aumento de calcio a través de los receptores nicotínicos. Luego se evalúan los efectos de los péptidos.

Metodología VSDI:

Preparación de cortes de cerebro y registros ex vivo

Se prepararon cortes coronales de cerebro de rata de acuerdo con el procedimiento descrito en (Badin et al., 2013), pero esta vez contenían prosencéfalo basal (+0.70 y -0.26 milímetros (mm) de bregma (Paxinos y Watson, 1998). Luego se realizó una imagen óptica usando tintes sensibles al voltaje como se describió previamente (Badin et al., 2013, Neuropharmacology. 73C:10 -18).

Análisis de datos y estadísticas (VSDI)

Los datos de VSDI se registraron en imágenes bidimensionales de 4 * 4 mm, equivalentes a 100 * 100 píxeles - cada píxel tiene 40 * 40 micrómetros (pm), de las cuales se extrajeron los datos críticos. Los datos de VSDI no se recopilaron a lo largo del proceso experimental, sino que, de hecho, se registraron en períodos de tiempo discretos de 15 minutos de duración. El intervalo entre estímulos (ISI) entre estimulaciones fue de 28 segundos y, por lo tanto, cada época de registro consistió en 32 estímulos sucesivos. Luego, los datos de las 32 estimulaciones se promediaron en un solo archivo para cada condición experimental y se analizaron utilizando una caja de herramientas de análisis de datos de VSDI especialmente diseñada para MatLab (Bourgeois et al., 2014, PLoS One. 9:e108686). En resumen, esta caja de herramientas permitió la selección de una geometría de región de interés (ROI) fija que podría aplicarse a cada corte, para extraer y combinar los datos de una ROI idéntica en todos los sectores y condiciones experimentales. La ROI se seleccionó a lo largo de la superficie pial de la región septal de cortes para abarcar el núcleo septal medial (MS), el extremo ventral de la banda diagonal (VDB) y el extremo horizontal de la banda diagonal (HDB). Los datos de VSDI, tomados de la ROI, luego se graficaron como una única serie de tiempo promediada (Figura 11). Sin embargo, para cuantificar los datos de VSDI, se calculó el área bajo la curva (cambio fraccional de fluorescencia sumado, Figura 11 - 22) entre el momento de la estimulación (t = 0) y 280 ms después de eso; este método de cuantificación tiene en cuenta todos los componentes de la respuesta inmediata y de latencia más prolongada. Todas las pruebas estadísticas (análisis de varianza unidireccional - ANOVA - a menos que se indique lo contrario) se realizaron con GraphPad Prism 6 (v6.05; GraphPad Software Inc., CA, USA), se encontró que todos los datos estaban distribuidos normalmente (datos no mostrados). Para todas las pruebas estadísticas, se consideró significativo p<0.05; los datos se expresan como la media ± SEM.

Fármacos y reactivos

Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) proporcionó MEM, sueros de cultivo, antibióticos, colágeno, el Kit-8 de recuento celular y tampones reactivos. T30, el péptido AChE y T14 cíclico fueron sintetizados por Genosphere Biotechnologies (Francia). Amiloide beta y Fluo-8 fueron proporcionados por Abcam (Cambridge, RU). Los péptidos pequeños se sintetizaron usando técnicas rutinarias de síntesis de péptidos. Las reservas de péptidos se diluyeron en agua destilada.

Análisis de datos

En cada una de las diferentes técnicas, el análisis estadístico se realizó con el promedio de los valores porcentuales de 12 o más experimentos. Las comparaciones entre múltiples grupos de tratamiento y el mismo control se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y pruebas post-hoc de Tukey utilizando GraphPAD Instat (software GraphPAD, San Diego, CA). Estas pruebas comparan las medias de cada tratamiento con las medias de cualquier otro tratamiento; es decir, se aplica simultáneamente al conjunto de todas las comparaciones por pares e identifica dónde la diferencia entre dos medias es mayor de lo que se esperaría que permitiera el error estándar. La significancia estadística se tomó en un valor P < 0.05. Los gráficos se trazaron usando GraphPAD Prism 6 (software GraphPAD, San Diego, CA).

Ejemplo 1: T14 cíclico (es decir, "NBP14")

La acetilcolinesterasa con 'cola' (T-AChE) se expresa en las sinapsis y los inventores identificaron previamente dos péptidos que podrían escindirse de su extremo terminal C, uno denominado "T14" (14 aminoácidos de largo), dentro del otro que se conoce como "T30" (30 aminoácidos de largo), y ambos tienen una fuerte homología de secuencia con la región comparable de p-amiloide.

La secuencia de aminoácidos del péptido lineal, T14, es AEFHRWSSYMVHWK [SEQ ID No: 1].

La secuencia de aminoácidos del péptido lineal, T30, es KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL [SEQ ID No: 156].

El péptido AChE del extremo terminal C "T14"' ha sido identificado como la parte sobresaliente de la molécula de AChE responsable de su gama de acciones no hidrolíticas. El análogo peptídico sintético de 14 aminoácidos (es decir, "T14") y, posteriormente, la secuencia de aminoácidos más grande, más estable y más potente en la que está incrustado (es decir, "T30") muestran acciones comparables a las reportadas para AChE 'no colinérgica'.

Con referencia primero a las Figuras 1a y 20, se muestra la unión de un péptido T14 cíclico de 14 aminoácidos de longitud (es decir, "NBP-14") al sitio alostérico en el receptor nicotínico a7 para competir por la unión con los péptidos lineales T14 y T30 y también para antagonizar el p-amiloide. El péptido cíclico, NBP-14, se basa en la secuencia de aminoácidos de T14, es decir, AEFHRWSSYMVHWK [SEQ ID No: 1], pero se ha ciclado a través de los residuos terminales de alanina (A) y lisina (K). La Figura 1b muestra una vista ampliada de la estructura tridimensional de NBP-14 cíclica que se encuentra en el bolsillo de unión del receptor nicotínico a7.

Con referencia ahora a la Figura 2, se muestra la secuencia de NBP-14 con los residuos de alanina (A) y lisina (K) terminales que forman los sitios de ciclación, y la Figura 3 muestra el péptido NBP-14 cíclico en el que los residuos de alanina y la lisina terminales están unidos entre sí. La ciclación se puede lograr por varios medios diferentes. Por ejemplo, Genosphere Biotechnologies (Francia) realizó la ciclación de T14 transformando el péptido lineal en una lactama del extremo N terminal al extremo C terminal. La ciclación de T14 para crear NBP14 cíclico une ambos extremos, es decir, HWK-AEF.

Los inventores han demostrado previamente que el NBP-14 cíclico inhibe selectivamente los efectos no clásicos de AChE (es decir, los efectos de AChE que son independientes de su actividad enzimática) y/o su péptido terminal in vitro, y se puede utilizar para tratar trastornos neurodegenerativos. NBP14 actúa como un verdadero antagonista del receptor nicotínico a7 y se ha demostrado que protege a las células de la toxicidad lineal de T14, T30 y p-amiloide.

También bloquea la liberación compensatoria de AChE inducida por la toxicidad de T14 y T30 lineales. Además, cuando se administra solo, el NBP14 cíclico no tiene efectos significativos sobre las concentraciones de Ca2+ en cortes de cerebro de rata, pero bloquea los efectos de p-amiloide.

Ejemplo 2 - Producción de una matriz de péptidos lineales derivados de NBP14 cíclico

Con base en sus sorprendentes observaciones previas con NBP-14 discutidas en el Ejemplo 1, los inventores prepararon una serie de péptidos lineales (4-14 aminoácidos de longitud) basados en la secuencia de NBP14 en la que cada secuencia de péptido lineal comienza o termina en cualquier posición de aminoácido a lo largo de la secuencia de NBP14. La matriz de péptidos lineales se muestra en la tabla grande que abarca las Figuras 4a - 4k (identificados como las SEQ ID Nos: 2 -155).

La tabla de la Figura 4a enumera 14 péptidos lineales (SEQ ID Nos: 2 - 15 ) cada uno de los cuales tiene cuatro aminoácidos de longitud. Cada péptido lineal recibe un nombre, por ejemplo, NBP-401, que significa que es el primer péptido con cuatro aminoácidos, y NBP-402, que es el segundo péptido con cuatro aminoácidos, y así sucesivamente. La tabla de la Figura 4b enumera 14 péptidos lineales (SEQ ID Nos: 16 - 29) cada uno de los cuales tiene una longitud de cinco aminoácidos. Cada péptido lineal de esta tabla recibe un nombre, por ejemplo, NBP-501, que significa que es el primer péptido con cinco aminoácidos, y NBP-502, que es el segundo péptido con cinco aminoácidos, y así sucesivamente. La Figura 4c enumera los 14 péptidos de seis aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 30-43), la Figura 4d enumera los 14, péptidos de 7 aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 44 - 57), la Figura 4e enumera los 14 péptidos de ocho aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 58 - 71), la Figura 4f enumera los 14 péptidos de nueve aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 72 - 85), la Figura 4g enumera los 14 péptidos de diez aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 86 - 99), la Figura 4h enumera los 14 péptidos de once aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 100 - 113), la Figura 4i enumera 14 los péptidos de doce aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 114 -127), la Figura 4j enumera los 14 péptidos de trece aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 128 - 141), y la Figura 4k enumera los 14 péptidos de catorce aminoácidos de longitud (SEQ ID Nos: 142 - 155).

Cada uno de los péptidos lineales se sintetizó y luego se analizaron sus actividades como se indica a continuación.

Ejemplo 3 - Efecto de pequeños péptidos lineales derivados de NBP-14 sobre la toxicidad de T30 o Ap y viabilidad celular

Cada uno de los péptidos lineales pequeños derivados de NBP-14 (SEQ ID Nos: 2-155) se analizó con tres sistemas in vitro contra el péptido lineal T30 tóxico [SEQ ID No: 156] y beta amiloide de tipo silvestre (1 - 42) (Ap) (SEQ ID No: 158), es decir (i) liberación de AChE de células PC12, (ii) viabilidad de células PC12; y (iii) afluencia de calcio en las células PC12.

La secuencia de aminoácidos de parte de p-amiloide (Ap) se proporciona en este documento como la SEQ ID No: 158, como sigue: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA [SEQ ID No: 158].

A continuación, se determinó el efecto protector o tóxico de cada péptido lineal frente a T30 y/o Ap en función de una serie de cuatro filtros o criterios, como se resume en la Figura 7:-

1. liberación de AChE frente a la viabilidad de células PC12 (para la que existe una correlación negativa significativa);

2. Unión in silico al sitio alostérico del receptor nicotínico a7;

3. Entrada de calcio en las células PC12; y

4. Tamaño del péptido.

Filtro 1: liberación de AChE frente a viabilidad de células PC12

Inicialmente, debido a su correlación, los inventores combinaron los ensayos (i) y (ii) utilizando la siguiente ecuación para obtener un "coeficiente de valor (X)" que indica el efecto protector o tóxico de cada péptido lineal contra T30 y/o Ap. Los inventores determinaron el coeficiente de VALOR (X), que se calcula como:

Coeficiente de valor (X) = (% de liberación de AChE)/(% de viabilidad celular)

donde "% de liberación de AChE" es el porcentaje de acetilcolinesterasa liberada de una preparación de células PC12 cultivadas en presencia de un péptido tóxico seleccionado de T30 (SEQ ID No: 156) o Ap (SEQ ID No: 158), y el péptido, derivado o análogo del mismo, en comparación con la preparación de células PC12 cultivadas en ausencia de cualquier péptido, derivado o análogo del mismo (es decir, control), y "% de viabilidad de células PC12" es el porcentaje de viabilidad de la preparación de células PC12 cultivadas en presencia del péptido tóxico seleccionado de T30 (SEQ ID No: 156) o Ap (S^eQ ID No: 158), y el péptido, derivado o análogo del mismo, en comparación con el de una preparación de células PC12 cultivadas en ausencia de cualquier péptido, derivado o análogo del mismo (es decir, control).

Como se describe a continuación, los inventores han demostrado sorprendentemente que es posible separar los péptidos activos de los inactivos basándose en sus coeficientes de valor (X) que representan su eficacia protectora contra la toxicidad de T30 y Ap.

El control (es decir, la ausencia de cualquier péptido) tiene un valor de 1. Como se describe en la sección de métodos, el valor del control se obtiene de las células no tratadas, el valor tóxico de las células tratadas con T30 o Ap y el valor protector de las células tratadas con NBP-14 junto con T30 o Ap. El valor para T30 es x = 169.45/74.309 = 2.28 y para Beta amiloide (Ap) x = 124.19/87.42= 1.42.

Por lo tanto, un péptido con un coeficiente de valor (X) inferior a 1.0 y superior a 1.1 es tóxico, mientras que cualquier péptido con un coeficiente de valor de 1.0 a 1.1 se consideró activo y, por lo tanto, protector. Las Tablas 1 y 2 muestran el efecto de los péptidos lineales (a una concentración de 0.5 |jM) sobre la actividad de AChE y la viabilidad de las células PC12 frente a la toxicidad de T30 y Ap (a una concentración de 5 j M). La columna "Valor" muestra el efecto protector de cada péptido.

Los inventores han demostrado que los dos parámetros, la actividad de AChE en el perfundido y la viabilidad de las células PC12, están muy estrechamente relacionados con un coeficiente de correlación de -0.55 (n = 10), que es significativo al nivel de P <0.05 (véase la Figura 6c). Esta métrica inicial de liberación de AChE contra la viabilidad celular produjo 55 péptidos exitosos que protegían contra T30 (n = 23 péptidos como se muestra en la Tabla 1) o Ap (n = 32 péptidos como se muestra en la Tabla 2).

Tabla 1 - Efectos de los péptidos lineales derivados de NBP-14 sobre la toxicidad de T30

Tabla 2 - Efectos de péptidos lineales derivados de NBP-14 sobre la toxicidad de Ap

Filtro 2 - Unión in silico

A continuación, los inventores examinaron la afinidad de unión teórica in silico de los péptidos activos al sitio alostérico del receptor nicotínico a7, y los valores también se muestran en las Tablas 1 y 2. El análisis in silico se realizó utilizando el software Autodock Vina publicado en el Journal of Computational Chemistry (O. Trott, AJ Olson AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading, Journal of Computational Chemistry 31 (2010) 455-461). El análisis se realizó de acuerdo con lo recomendado por los autores. El análisis de resultados y la comparación se realizaron manualmente comparando los aminoácidos unidos al receptor y las distancias entre aminoácidos.

Se encontró que una afinidad teórica de unión inferior a -7.0 correspondía a una mayor afinidad entre el péptido y el sitio alostérico del receptor nicotínico a7. Por lo tanto, el número total de péptidos activos se redujo de 55 de acuerdo con el filtro 1 a 28 péptidos después del filtro 2.

Filtro 3 - Entrada de calcio

Los inventores también investigaron la relación entre la viabilidad celular y el tercer parámetro (iii) discutido anteriormente, es decir, la afluencia de calcio en las células PC12. Sin embargo, encontraron que estos parámetros, que tienen escalas de tiempo muy diferentes, no están vinculados y tienen un coeficiente de correlación de solo 0.026 (n = 10), como se muestra en la Figura 6b. Los inventores también investigaron la relación entre la actividad de AChE y la afluencia de calcio en las células PC12. Sin embargo, encontraron que estos parámetros, nuevamente en diferentes escalas de tiempo, tampoco están vinculados y tienen un coeficiente de correlación de solo 0.21 (n = 10), como se muestra en la Figura 6a.

En consecuencia, los inventores plantean la hipótesis de que la liberación de AChE es muy probablemente una "compensación" directa debida a la muerte celular eventual, y no causada por la entrada inmediata no específica de calcio, sino por una cascada intracelular más lenta.

Los valores de afluencia de calcio para los 28 péptidos producidos por el filtro 2 también se muestran en las Tablas 1 y 2. Los inventores encontraron que un valor de afluencia de calcio de 97 a 120 correspondía a péptidos activos. Por

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53.

2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Un proceso para elaborar la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, comprendiendo el proceso combinar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53, para uso en terapia o diagnóstico.

5. Uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 30, 32, 40, 42, 48, 51 o 53, para uso en el tratamiento, mejora o prevención de un trastorno neurodegenerativo.

6. Uno o más péptidos para usar de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el trastorno neurodegenerativo que se trata es uno que se caracteriza por el daño o la muerte de las neuronas 'Globales'.

7. Uno o más péptidos para usar de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde el trastorno neurodegenerativo se selecciona de un grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer; Enfermedad de Parkinson; Enfermedad de Huntington; enfermedad de las neuronas motoras; espinocerebeloso tipo 1, tipo 2 y tipo 3; esclerosis lateral amiotrófica (ELA); esquizofrenia; demencia con cuerpos de Lewy; y demencia frontotemporal.

8. Uno o más péptidos para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 - 7, en donde el trastorno neurodegenerativo que se trata es la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de las neuronas motoras.

9. Uno o más péptidos para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 - 8, en donde el trastorno neurodegenerativo que se trata es la enfermedad de Alzheimer.

10. Uno o más péptidos para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 - 9, en donde se usa más de un péptido para tratar la enfermedad neurodegenerativa en una terapia de combinación.

11. Uno o más péptidos para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde uno o más péptidos que protegen contra la toxicidad de T30 se usan en combinación con uno o más péptidos que protegen contra la toxicidad de Ap.