ES2925746T3 - Tejidos modificados que tienen componentes estructurales incorporados en los mismos, y procedimientos de fabricación y uso - Google Patents

Abstract

Esta divulgación describe tejidos diseñados por ingeniería que tienen componentes estructurales incrustados en ellos y métodos para fabricar y usar dichos tejidos diseñados por ingeniería que tienen componentes estructurales incrustados en ellos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tejidos modificados que tienen componentes estructurales incorporados en los mismos, y procedimientos de fabricación y uso

Campo técnico

La presente divulgación se refiere, en general, a tejidos modificados (o diseñados o de ingenería) que tienen componentes estructurales incorporados en los mismos, y a los procedimientos de fabricación y uso de dichos tejidos modificados que tienen componentes estructurales incorporados en los mismos.

Antecedentes

La sutura de tejido a un stent es necesaria para prácticamente todas las sustituciones de válvulas cardíacas transcatéter, pero la sutura de tejido a un stent es un proceso increíblemente tedioso, manual y que requiere mucho tiempo. Por ejemplo, la sutura de tejido a un stent puede requerir hasta una semana para que un profesional de la costura cree una válvula a partir del tejido animal procesado estándar de la industria, que suele ser el pericardio bovino. También se requieren procesos similares para producir válvulas venosas de reemplazo, así como ciertos injertos vasculares.

Además de reducir significativamente o eliminar el largo proceso de suturar el tejido a un stent, la presente divulgación proporciona un refuerzo estructural del tejido modificado.

El documento US 2014/180399 describe una válvula cardíaca que comprende unas hojuelas (o valvas) cardíacas. Dichas hojuelas comprenden un material de malla, preferentemente de nitinol. Se utiliza un material bioactivo para recubrir la válvula. Este material bioactivo puede ser un gel de fibrina en combinación con células y factores de crecimiento. El constructo se cultiva para que crezca una capa de células sobre el mismo.

Sumario

La presente invención está definida por las reivindicaciones independientes, mientras que las reivindicaciones dependientes se refieren a las realizaciones preferentes. Cualquier "forma de realización" o "ejemplo" que se divulgue en la descripción, pero que no esté cubierto por las reivindicaciones, debe considerarse que se presenta únicamente con fines ilustrativos. La presente divulgación proporciona tejidos descelularizados modificados que tienen componentes estructurales incorporados en los mismos. La presente divulgación también proporciona procedimientos de fabricación y procedimientos de uso de tejidos modificados que tienen componentes estructurales incorporados en los mismos.

En un aspecto, se proporciona un procedimiento para fabricar un tejido descelularizado modificado que incluye un componente estructural incorporado en el mismo, en el que una porción del componente estructural está incorporado en el tejido descelularizado modificado, y una porción del componente estructural no está incorporado en dicho tejido descelularizado modificado.

Dicho procedimiento generalmente incluye la combinación de fibrinógeno, trombina y células productoras de matriz (por ejemplo, fibroblastos, células musculares lisas y/o células intersticiales) para producir un hidrogel sembrado de células; formando el hidrogel sembrado de células sobre, en, alrededor, y/o dentro de un componente estructural. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además manipular, mecánicamente, el tubo en presencia de medio de cultivo para producir un tejido modificado. Según la invención reivindicada, el procedimiento incluye además la descelularización del injerto tubular modificado biológicamente. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además la recelularización o la modificación química del tejido modificado.

En otro aspecto, se proporciona un tejido descelularizado modificado que incluye una porción de un componente estructural incorporado en el mismo, en el que una porción del componente estructural no está incorporada en el tejido descelularizado modificado. De acuerdo con la invención reivindicada, el componente estructural está así parcialmente incorporado en el tejido modificado. Los componentes estructurales representativos incluyen, sin limitación, un stent, una lengüeta, una malla o una vaina. En algunas realizaciones, el tejido descelularizado modificado es un injerto vascular, una válvula cardíaca, una válvula venosa, un injerto arterio-venoso, un uréter, una uretra, un esófago, una tráquea, piel, tendones y ligamentos, trompas uterinas (por ejemplo, de Falopio) o una malla para hernia.

En otro aspecto, se proporciona una composición que incluye un componente estructural incorporado dentro de un tejido modificado descelularizado. Según la invención reivindicada, el componente estructural de dicha composición incluye típicamente un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo incluye un stent de válvula y el segundo extremo incluye una estructura tubular. Generalmente, la estructura tubular del componente estructural está incorporada en el tejido descelularizado modificado, mientras que el stent de válvula no está incorporado dentro de dicho tejido descelularizado modificado.

En algunas realizaciones, la estructura tubular del componente estructural incluye un alambre de hojuela de válvula. En algunas realizaciones, la composición incluye un manguito de sutura unido al segundo extremo del componente estructural. En algunas realizaciones, el componente estructural está realizado de nitinol.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios de la técnica a la que pertenecen los procedimientos y las composiciones de la materia. Aunque en la práctica o en las pruebas de los procedimientos y las composiciones de materia se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Descripción de los dibujos

La figura 1 es una fotografía que muestra una realización de un tejido modificado con una estructura de malla metálica incorporada.

La figura 2 es una fotografía que muestra una realización de un tejido modificado con dos componentes estructurales incorporados. La flecha de la izquierda muestra una variante de un tejido modificado con un stent incorporado, y la flecha de la derecha muestra una variante de un tejido modificado con una estructura de malla metálica incorporada.

La figura 3 es una fotografía que muestra una realización de un tejido modificado con una lengüeta incorporada. La figura 4A es una imagen de un tejido modificado teñido con tricromo para mostrar la matriz de colágeno que encapsula la estructura de la malla. El agujero del centro era la porción de la estructura que se retiró para la criosección.

La figura 4B es una fotografía del tejido modificado (color blanco) con la estructura de malla incorporada (oscura). La figura 5A es un esquema de un componente estructural de malla metálica incorporado en un tejido modificado con forma de tubo.

La figura 5B es un esquema de un componente estructural de malla metálica incorporado en un tejido modificado con forma de tubo, en el que un extremo del tejido modificado se ha anclado para formar una válvula modificada. La Figura 6A muestra una imagen de un alambre de nitinol y un stent de nitinol incorporado en un tejido modificado. La figura 6B es una imagen que muestra que, tras plegar la estructura de tejido modificado con alambre de nitinol en la endoprótesis, se forma una válvula aórtica de tres hojuelas con un diámetro interior de 24 mm. La imagen de la válvula después de coser la estructura plegada se muestra a la derecha.

La figura 6C es una imagen de una vista del extremo de la válvula de la figura 6B que se pliega hasta un diámetro de 8 mm (a partir de un diámetro inicial de 24 mm).

La figura 6D son imágenes que muestran el material tisular antes (izquierda) y después (derecha) del plegado, que no muestran ningún desgarro cualitativo, corte o desprendimiento del tejido de la estructura incorporada. La figura 7A es una imagen que muestra una vista lateral de un molde que tiene una cavidad tubular para colocar la endoprótesis de nitinol y canales cortados en el molde para las hojuelas.

La figura 7B es una imagen de una vista lateral de un stent incorporado en un tejido modificado.

La figura 7C es una imagen de una vista de arriba abajo que muestra dos hojuelas dentro del stent incorporado. La figura 7D es una imagen de una vista de extremo a extremo de las hojuelas en posición cerrada (izquierda) y abierta (derecha) dentro del stent incorporado.

La figura 8A es un gráfico que muestra una prueba de fallo de contrapresión de la válvula venosa de dos hojuelas modificada tisular (mostrada en la figura 7) en comparación con una válvula venosa ovina nativa.

La figura 8B es un gráfico que muestra los resultados de una prueba de flujo dinámico de la válvula venosa de dos hojuelas modificada tisular (mostrada en la figura 7) en comparación con una válvula venosa ovina nativa.

Descripción detallada

Se proporciona en la presente memoria un tejido descelularizado modificado que tiene uno o más componentes estructurales incorporados dentro del tejido modificado. El proceso se basa en la formación de un hidrogel que contiene células sobre, en, alrededor y/o dentro de uno o más componentes estructurales. En condiciones de cultivo adecuadas y en presencia de, por ejemplo, trombina, las células remodelan el hidrogel en tejido, que se forma sobre, alrededor y/o dentro del componente o componentes estructurales, incorporando así el componente o componentes estructurales en el tejido modificado. La forma de incorporar el componente estructural dentro del tejido modificado y la manera en que se obtiene el tejido modificado (por ejemplo, mediante la remodelación de un hidrogel sembrado de células) da lugar a una serie de características únicas. Según la invención reivindicada, el componente estructural está parcialmente alojado o incorporado en o dentro del tejido modificado. Si se desea, el resultado puede ser un componente estructural o una porción del mismo que esté integrado o entrelazado en el tejido modificado o una porción del mismo.

Tejidos modificados

El uso de hidrogeles en la modificación de tejidos es conocido. Véase, por ejemplo, La patente US n° 6.666.886 y publicación US n.° 2014/0058496). Normalmente, el fibrinógeno (o una alternativa adecuada como un fibrinógeno modificado), la trombina y las células capaces de producir matrices de tejido (por ejemplo, fibroblastos, células musculares lisas, células intersticiales) se combinan en una solución de hidrogel, y el hidrogel resultante sembrado de células se moldea (o se vierte, se conforma, se deposita, se forma o se imprime) en la forma deseada y para acomodar e incorporar adecuadamente el componente estructural en el mismo. La forma del componente estructural determinará la medida en que el hidrogel sembrado de células puede ser moldeado (o fundido, conformado, depositado, formado o impreso) sobre, en, alrededor y/o dentro del componente estructural. En condiciones de cultivo adecuadas, el hidrogel sembrado de células es remodelado en una matriz extracelular por las células, lo que mantiene la forma original y da lugar a que uno o más componentes estructurales se incorporen en el tejido modificado. De acuerdo con la forma en que se produce el tejido modificado, el tejido modificado resultante, cuando se examina en una sección transversal, es uniforme y carece de capas.

Las soluciones de hidrogeles se refieren generalmente a soluciones acuosas que contienen cadenas poliméricas hidrófilas que pueden incluir polímeros naturales o sintéticos. Los hidrogeles representativos incluyen, por ejemplo, la agarosa, la metilcelulosa, el hialuronano y sus combinaciones. La cantidad de hidrogel utilizada en una composición descrita en el presente documento puede oscilar entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 80% (por ejemplo, entre aproximadamente el 2% y aproximadamente el 75%, entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 75%, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 70%, entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 60%, entre aproximadamente el 40% y aproximadamente el 50%, o entre aproximadamente el 50%). La presencia y la cantidad real de uno o más hidrogeles dependerán de las características deseadas del hidrogel sembrado de células o del injerto tubular modificado biológicamente producido posteriormente (por ejemplo, suavidad o dureza, flexibilidad, absorbencia).

Las células utilizadas en la presente memoria (es decir, en el hidrogel sembrado de células) son aquellas que son capaces de convertir el fibrinógeno, en presencia de trombina, en matriz extracelular. Los fibroblastos son capaces de formar matrices tisulares y pueden utilizarse en un hidrogel como el descrito en el presente documento, al igual que cualquier número de células que sean capaces de producir matrices tisulares o que ayuden a la producción de matrices tisulares (por ejemplo, células musculares lisas, células intersticiales). Las células utilizadas para sembrar un hidrogel pueden ser de un solo tipo celular (por ejemplo, fibroblastos o células musculares lisas o células intersticiales) o las células utilizadas para sembrar un hidrogel pueden ser una multitud de tipos celulares (por ejemplo, fibroblastos y células musculares lisas, o fibroblastos y células intersticiales, o células musculares lisas y células intersticiales). Además, las células pueden proceder de cualquier organismo (por ejemplo, humano, primate, roedor) y de cualquier tejido (por ejemplo, dermis, pulmón, tejido conectivo, riñón). Se apreciará que las células pueden añadirse al hidrogel antes de que se le dé la forma adecuada al gel o después de que se le haya dado la forma adecuada al gel sobre, en, alrededor y/o dentro del componente estructural.

El tamaño y la forma de un tejido modificado, tal como se describe en el presente documento, dependerán totalmente de su uso previsto y/o del uso previsto del componente estructural. Como se muestra en el presente documento, un tejido modificado puede tener una forma tubular con una longitud y un diámetro(s) deseados, pero un tejido modificado también puede ser plano o curvado según sea necesario. Típicamente, un tejido modificado como el descrito en el presente documento incluye un primer extremo y un segundo extremo, y, cuando se moldea (o se moldea, conforma, deposita, forma o imprime) en una forma tubular, una superficie exterior e interior (o anular), que define un eje longitudinal.

Durante la remodelación del hidrogel sembrado de células en una matriz extracelular y, en última instancia, en el tejido modificado, el hidrogel y/o la matriz extracelular pueden manipularse mecánicamente (o "acondicionarse") en cualquier número de formas, incluyendo, sin limitación, la manipulación mecánica (por ejemplo, cultivo estático, estiramiento circunferencial, estiramiento longitudinal, inflado/distensión), estimulación eléctrica (por ejemplo, estimulación de campo, corriente alterna o continua), y/o manipulación biológica con moléculas/compuestos como factores de crecimiento y citoquinas. Normalmente, la manipulación del gel/matriz es cíclica o periódica.

Según la invención reivindicada, una vez que la remodelación está completa o casi completa, el tejido modificado se descelulariza (por ejemplo, para eliminar las células formadoras de la matriz). La descelularización es conocida en la técnica y puede realizarse utilizando un número de procedimientos diferentes. Véase, por ejemplo, los documentos WO 2007/025233, WO 2010/120539, los artículos de Ott et al. (2008, Nat. Med., 14:213-21), Baptista et al. (2009, Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc., 2009:6526-9) o Crapo et al. (2011, Biomaterials, 32:3233-43). El tejido descelularizado mediante diseño puede ser recelularizado con uno o más tipos celulares deseados. El tipo o tipos de células utilizados para la recelularización dependerán de su uso previsto. Las células utilizadas en el proceso de recelularización pueden ser células madre (por ejemplo, células madre embrionarias (ESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre mesenquimales (MSC) o células madre derivadas de adultos), o las células utilizadas en el proceso de recelularización pueden ser células no madre (por ejemplo, uno o más tipos de células en alguna etapa de diferenciación). Simplemente a modo de ejemplo, las células no madre incluyen, sin limitación, células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, células musculares lisas, y/o cualquier célula específica de un tejido u órgano (por ejemplo, hígado, corazón, pulmón, hueso, riñón, páncreas). En algunos casos, los tejidos descelularizados modificados pueden implantarse y recelularse de forma natural in vivo.

Alternativa o adicionalmente, el tejido modificado (es decir, el tejido modificado descelularizado) puede ser modificado química o físicamente. Las modificaciones químicas del tejido modificado incluyen, por ejemplo, la reticulación de la matriz mediante agentes químicos (por ejemplo, glutaraldehído) o enzimas (por ejemplo, transglutaminasa), o la conjugación de proteínas (por ejemplo, heparina) o péptidos mediante enzimas o a través de dominios de alta afinidad de proteínas de fusión. Las modificaciones físicas (por ejemplo, para la reticulación de la matriz) incluyen, sin limitación, la deshidratación, el calentamiento y/o la irradiación UV.

Los tejidos modificados fabricados con hidrogeles y las células apropiadas poseen una serie de características beneficiosas, tales como, sin limitación, la alineación circunferencial de las fibras (para las estructuras tubulares, lo que da como resultado en una mayor rigidez a la tracción en la dirección circunferencial que en la dirección longitudinal) y una alta presión de ruptura (por ejemplo, al menos 4,60 atm, al menos 5,26 atm, o más de 5,26 atm, sin ruptura).

Componentes estructurales

Un componente estructural como el descrito en el presente documento puede adoptar esencialmente cualquier forma deseada. Como se muestra en la presente memoria en varias realizaciones, los componentes estructurales pueden ser una estructura de malla (véase la figura 1), un stent (véase la parte derecha de la figura 2, la figura 6A, la figura 7B y la figura 7C), una lengüeta (véase la figura 3) o un alambre de hojuela (véase la parte izquierda de la figura 2, la figura 6A y la figura 6B). Aunque no forma parte de la invención reivindicada, la adición de un componente estructural que está totalmente incorporado dentro del tejido modificado (véase, por ejemplo, la figura 7C) puede permitir una fácil sutura a otro objeto (por ejemplo, un stent), o a una vaina, y aumentar la fuerza y la integridad del producto global resultante.

Los componentes estructurales que son adecuados para su uso en el presente documento pueden estar realizados de materiales conocidos en la técnica. Básicamente, se puede utilizar cualquier material que no provoque una respuesta inmunitaria en el sujeto. Por ejemplo, cualquiera de los materiales que se utilizan para fabricar stents puede utilizarse en un componente estructural como el descrito en el presente documento. Dichos materiales incluyen, sin limitación, metales o aleaciones (por ejemplo, aleaciones con memoria de forma como, por ejemplo, nitinol), plásticos, cerámicas, tejidos y combinaciones de los mismos.

Un componente estructural como el descrito en el presente documento puede incluir un primer extremo y un segundo extremo y, cuando el componente estructural incluye una forma tubular, una región exterior e interior, o anular, que define un eje longitudinal. En algunos casos, el primer extremo del componente estructural puede estar incorporado dentro del primer extremo de un tejido modificado; en algunos casos, un primer componente estructural puede estar incorporado dentro del primer extremo de un tejido modificado y un segundo componente estructural puede estar incorporado dentro del segundo extremo del tejido modificado. En algunos casos que no están de acuerdo con la invención reivindicada, la totalidad de un componente estructural puede estar incorporado dentro del tejido modificado (véanse, por ejemplo, las figuras 1, 7B y 7C), mientras que en algunos casos que están de acuerdo con la invención reivindicada, sólo una porción del componente estructural está incorporada dentro del tejido modificado (véanse, por ejemplo, las figuras 2 y 6A).

Como se describe en el presente documento, un tejido modificado puede contener uno o más componentes estructurales incorporados en el mismo. Véase, por ejemplo, la figura 2, que muestra un stent incorporado en el extremo izquierdo y una estructura de malla incorporada en el extremo derecho. También como se describe en el presente documento, el componente o componentes estructurales pueden proporcionar una o más de una funcionalidad. Por ejemplo, la figura 2 muestra un tejido modificado en el que los componentes estructurales incorporados funcionan como un stent y como un medio para fijar el tejido modificado al tejido existente. Cabe señalar que, aunque el stent y la malla metálica mostrados en la figura 2 sean componentes estructurales separados, ambas funcionalidades podrían modificarse en un único componente estructural.

Procedimientos de utilización

Un tejido modificado descelularizado que tiene un componente estructural parcialmente incorporado en el mismo puede ser implantado en un sujeto.

De manera similar, un tejido modificado descelularizado que tiene un componente estructural parcialmente incorporado en el mismo puede ser recelularizado, y el tejido modificado recelularizado resultante que tiene un componente estructural parcialmente incorporado en el mismo puede ser implantado en un sujeto.

Cuando la forma del tejido modificado que tiene un componente estructural incorporado en el mismo incluye una forma tubular, los tejidos modificado que tienen un componente estructural incorporado en el mismo, tal como se describe en el presente documento, pueden utilizarse para sustituir cualquier porción de la vasculatura (por ejemplo, un injerto vascular modificado tisular, una válvula cardíaca modificada tisular, una válvula venosa modificada tisular, un injerto arterio-venoso modificado tisular) u otras estructuras tubulares (por ejemplo, un uréter modificado tisular, una uretra modificada tisular, una trompa uterina (por ejemplo, de Falopio) modificada tisular), un esófago modificado tisular, una tráquea modificada tisular). Sin embargo, ni el tejido modificado ni el componente estructural incorporado en el mismo están limitados a una forma tubular y, por tanto, pueden utilizarse para prácticamente cualquier aplicación que implique un tejido biológico (por ejemplo, tendones y ligamentos modificados tisulares, piel modificada tisular, malla de hernia modificada tisular (para reparación)).

En algunos casos, cuando la forma del tejido modificado que tiene un componente estructural incorporado en el mismo incluye una forma tubular, se puede crear una válvula modificada anclada el tejido en un extremo de la porción de tejido modificado en dos puntos (para una válvula de dos hojuelas), tres puntos (para una válvula de tres hojuelas) o cuatro puntos (para una válvula de cuatro hojuelas). El anclaje puede lograrse utilizando, por ejemplo, una o más suturas a través o alrededor del componente incorporado para fijar el tejido a una endoprótesis circundante. Véase, por ejemplo, la figura 6B.

De acuerdo con la presente invención, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bioquímica y ADN recombinante dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican ampliamente en la literatura. La invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos deben considerarse como ejemplos de referencia que se incluyen sólo con fines ilustrativos, ya que no revelan un tejido descelularizado modificado que comprenda un componente estructural que esté sólo parcialmente incorporado en el mismo.

Ejemplos de referencia

Ejemplo 1-Tejido modificado con una malla estructural incorporada

La figura 1 muestra una realización de un tejido modificado que tiene un componente de malla incorporado. En la realización mostrada en la figura 1 se utilizó una malla de aluminio (McMaster Carr), que se enrolló en forma de tubo y se ataron los dos extremos largos con suturas de seda (Fine Science Tools) para formar una estructura tubular de 6 mm de diámetro. La estructura tubular de aluminio se insertó posteriormente alrededor de una varilla de vidrio (McMaster Carr) con un diámetro de 4 mm, dejando una cavidad de 1 mm alrededor de la circunferencia. A continuación, se introdujo en una carcasa de vidrio con un diámetro interior de 8 mm (McMaster Carr). Se inyectó una mezcla a base de fibrinógeno compuesta por 4 mg/ml de fibrinógeno (Sigma), 1 millón de células de fibroblastos dérmicos neonatales (Lonza) y 0,8 unidades/ml de trombina (Sigma) en la cavidad formada por la varilla de vidrio y la carcasa y con la malla de aluminio suspendida en medio. Una vez que el fibrinógeno formó un gel de fibrina debido a la acción enzimática de la trombina, se retiró la cubierta exterior de vidrio y el tubo interior de vidrio, dejando una malla tubular de aluminio incorporada dentro de un gel de fibrina formado.

A continuación, la estructura se cultivó en un frasco de policarbonato (Nelgene) lleno de 50 ml de medio DMEM (Gibco) con 10% de suero bovino fetal (HyClone) complementado con insulina (Sigma) y ácido ascórbico (Sigma). La imagen muestra la estructura resultante el tercer día. La estructura se cultivó durante 18 días más para un total de 21 días de cultivo en medios. A continuación, se cortó la muestra con unas tijeras y se tomó la imagen para demostrar que la estructura de aluminio estaba incorporada dentro del tejido modificado (figura 4B). Se retiró el aluminio y se fijó el tejido en paraformaldehído al 4%. El tejido fijado se crioseccionó y se tiñó con la tinción de tricromo (dejando atrás el agujero visible en la figura 4A). Los núcleos de las células de fibroblastos se tiñeron de negro y el colágeno producido por las células se tiñó de verde. La fibrina original, que se había teñido de rojo, no fue visible, lo que indica que el gel de fibrina original fue completamente degradado por las células al formar el tejido colágeno.

Ejemplo 2-Tejido modificado con una forma de alambre de nitinol y un stent de nitinol incorporado en el mismo

La figura 2 muestra una realización de un tejido modificado con una forma de alambre de Nitinol incorporada y un stent de nitinol. En la realización mostrada en la figura 2 se utilizó una forma de alambre de nitinol con un diámetro de 0,254 mm, que se formó en una forma de corona con tres picos y tres valles con un diámetro interior de 24 mm, y luego se fijó por calor a 54°C durante 40 minutos para fijar la forma del nitinol. Además, se formó un stent de nitinol expandiendo un tubo de nitinol y cortando con láser los agujeros para formar una malla con agujeros en forma de diamante y con un diámetro interior de 24 mm. Las dos estructuras de nitinol se enfundaron sobre una varilla de vidrio (McMaster Carr) de 22 mm de diámetro. La varilla de vidrio y las estructuras de nitinol se colocaron en un tubo de policarbonato con un diámetro interior de 28 mm (McMaster Car). A continuación, se inyectó una suspensión celular compuesta por 4 mg/ml de fibrinógeno (Sigma), 1 millón de células de fibroblastos dérmicos (Coreal) y 0,8 unidades/ml de trombina (Sigma) en la cavidad formada por la varilla y la carcasa de vidrio y con la forma de alambre de nitinol y el stent suspendidos en medio. Una vez que el fibrinógeno formó gel de fibrina debido a la acción enzimática de la trombina, se retiró la cubierta exterior de policarbonato, dejando atrás las estructuras de nitinol incorporadas dentro de un tubo de gel de fibrina formado alrededor de la varilla de vidrio interior. Se colocó en un frasco de policarbonato (Nelgene) lleno de 250 ml de medio DMEM (Gibco) con 10% de suero bovino fetal (HyClone) complementado con insulina (Sigma) y ácido ascórbico (Sigma). La imagen muestra la estructura en el día 7 después de la fabricación. La estructura se cultivó durante 28 días más para un total de 35 días.

Ejemplo 3-Tejido modificado con una lengüeta de nylon incorporada en el mismo

La figura 3 muestra una realización de un tejido modificado con una lengüeta de nylon incorporada. La realización mostrada en la figura 3 utilizaba una lengüeta de nylon cortada con láser que tenía una forma ovalada y tres agujeros perforados en la región central de la lengüeta. En general, la lengüeta tenía 3 mm de longitud y 1,5 mm de anchura. Cada uno de los tres orificios tenía un diámetro de 0,4 mm. Se suspendieron tres lengüetas en una cavidad formada por una varilla interior de vidrio (McMaster Carr) con un diámetro de 24 mm y una carcasa exterior de policarbonato (McMaster Car) con un diámetro interior de 28 mm. A continuación, se inyectó en la cavidad formada por la varilla de vidrio y la carcasa una mezcla a base de fibrinógeno que contenía 4 mg/ml de fibrinógeno (Sigma), 1 millón de células de fibroblastos dérmicos (Coreal) y 0,8 unidades/ml de trombina (Sigma). Una vez que el fibrinógeno se formó en un gel de fibrina en presencia del catalizador de trombina, se retiró la cubierta exterior de policarbonato, dejando atrás las lengüetas de nylon incorporadas dentro de un gel de fibrina formado. La varilla de vidrio interior se mantuvo para la estabilidad de las estructuras y toda la estructura se colocó en un frasco de policarbonato (Nelgene) lleno de 250 ml de medio DMEM (Gibco) con 10% de suero bovino fetal (HyClone) complementado con insulina (Sigma) y ácido ascórbico (Sigma). La imagen muestra la estructura en el día 7 después de la fabricación. La estructura se cultivó durante 28 días más para un total de 35 días de cultivo en medios.

Ejemplo 4-Tejido modificado con un stent valvular y una forma de alambre incorporada en el mismo

Se incorporó un stent de válvula de nitinol y una forma de alambre en el tejido modificado colocando un stent de nitinol cortado con láser y un alambre de nitinol formado con calor en un molde tubular (figura 6A). El molde se llenó con una solución de hidrogel que contenía fibrinógeno, trombina y fibroblastos dérmicos.

Una vez formado el gel, la estructura de nitinol incorporada se retiró del molde y se cultivó en medios de cultivo celular durante 7 semanas.

El producto final fue una matriz extracelular producida por células que contenía una estructura de nitinol incorporada en la misma, como se muestra en la figura 6B. La válvula se formó invirtiendo la forma de alambre dentro del lumen del marco de nitinol incorporado (figura 6C). Para evaluar la integración entre el stent de nitinol y la matriz extracelular producida por las células circundantes, el stent se plegó desde un diámetro de unos 24 mm hasta un diámetro de unos 8 mm (figura 6D). Después de ser plegado durante 15 minutos, se retiró el stent y se evaluó la estructura para ver si había daños cualitativos. No se observó ningún desgarro, desprendimiento o corte del tejido tras el pliegue del stent de nitinol incorporado en el tejido modificado (figura 6D, derecha).

Ejemplo 5-Tejido modificado con un stent vascular incorporado

Se incorporaron stents vasculares de nitinol de pequeño diámetro (14 mm de diámetro interno (ID)) en tejido modificado colocando el stent de nitinol en un molde tubular de plástico con canales para las hojuelas (figura 7A). El molde se llenó con una solución de gelificación que contenía fibrinógeno, trombina y fibroblastos dérmicos. Una vez formado el gel, el stent de nitinol incorporado se cultivó en medios de cultivo celular durante 7 semanas. El producto final fue una matriz extracelular producida por células que contenían un stent de nitinol como pared luminal con hojuelas (dos) en el lumen central, como se muestra en las figura 7B y 7C. Las imágenes del extremo de la válvula durante la apertura y el cierre se muestran en la figura 7D.

Ejemplo-6 Prueba de rendimiento de la válvula

La figura 8 muestra los resultados de las pruebas de rendimiento de la válvula venosa modificado tisular bihojuela mostrada en la figura 7. Se evaluó el rendimiento hemodinámico de la válvula mediante su montaje en un duplicador de pulsos (sistema ViVitro). La figura 8A muestra los resultados de una prueba de fracaso, en la que la contrapresión de la válvula modificada fue comparable a la de una válvula de vena ovina nativa. La figura 8B muestra los resultados de una prueba de flujo dinámico, que muestra fases cíclicas de flujo y no flujo a medida que el gradiente de presión se invierte, y un gradiente de presión sistólica de sólo 0,0012-0,0026 atm.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de fabricación de un tejido descelularizado modificado que comprende una porción de un componente estructural incorporado en el mismo, que comprende:

combinar células productoras de matriz con un hidrogel para producir un hidrogel sembrado de células, en el que el hidrogel comprende fibrinógeno y trombina;

formar el hidrogel sembrado de células sobre, en, alrededor, y/o dentro de una porción de un componente estructural; y

cultivar y descelularizar el hidrogel sembrado de células en condiciones apropiadas para producir un tejido descelularizado modificado que comprende una porción del componente estructural incorporado en el mismo, en el que una porción del componente estructural no está incorporada en el tejido descelularizado modificado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células productoras de matriz son fibroblastos, células musculares lisas o células intersticiales.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el componente estructural es un stent, una lengüeta, una malla o una vaina, en el que opcionalmente el componente estructural está comprendido de metal o aleación, plástico, cerámica, tejido o una combinación de los mismos.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además manipular mecánicamente el hidrogel en la etapa de cultivo para producir el tejido descelularizado modificado.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además la recelularización o la modificación química del tejido descelularizado modificado.

6. Un tejido descelularizado modificado que comprende una porción de un componente estructural incorporado en el mismo, en el que una porción del componente estructural no está incorporada en el tejido descelularizado modificado, obtenido por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El tejido descelularizado modificado de la reivindicación 6, en el que opcionalmente el componente estructural es un stent, una lengüeta, una malla o una vaina, en el que opcionalmente el componente estructural está comprendido de metal o aleación, plástico, cerámica, tejido o una combinación de los mismos.

8. El tejido descelularizado modificado de cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que el tejido descelularizado modificado se selecciona del grupo que consiste en un injerto vascular, una válvula cardíaca, una válvula venosa, un injerto arterio-venoso, un uréter, una uretra, un esófago, una tráquea, piel, tendones y ligamentos, trompa uterina (por ejemplo, de Falopio) y malla de hernia.

9. El tejido descelularizado modificado de la reivindicación 6,

en el que el componente estructural comprende un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo comprende un stent de válvula y el segundo extremo comprende una estructura tubular;

en el que la estructura tubular del componente estructural está incorporada en el tejido descelularizado modificado y

en el que el stent de válvula no está incorporado en el tejido descelularizado modificado.

10. El tejido descelularizado modificado de la reivindicación 9, en el que la estructura tubular del componente estructural comprende un alambre de hojuela de válvula.

11. El tejido descelularizado modificado de la reivindicación 9 o 10, que comprende un manguito de sutura unido al segundo extremo del componente estructural.

12. El tejido descelularizado modificado de las reivindicaciones 9-11, en el que el componente estructural está comprendido de nitinol.