ES2925872T3 - Dispositivos de perfusión acústica - Google Patents

Abstract

Se describen dispositivos de perfusión acústica para separar células biológicas de otro material en una mezcla fluida. Los dispositivos incluyen un puerto de entrada, un puerto de salida y un puerto de recolección que están conectados a una cámara acústica. Un transductor ultrasónico crea una onda estacionaria acústica en la cámara acústica que permite recuperar un flujo continuo de fluido a través del puerto de recolección mientras mantiene las células biológicas dentro de la cámara acústica para regresar al biorreactor del que se extrae la mezcla de fluido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivos de perfusión acústica

La presente invención se refiere a un dispositivo de perfusión acústica según el preámbulo de la reivindicación 1 y a un método para separar células biológicas de una mezcla fluida haciendo fluir la mezcla fluida que contiene las células biológicas a través de un dispositivo de perfusión acústica según el preámbulo de la reivindicación 11.

Antecedentes

El campo de la biotecnología ha crecido enormemente en los últimos 20 años. Este crecimiento ha sido debido a muchos factores, algunos de los cuales incluyen las mejoras en los equipos disponibles para los biorreactores, la mayor comprensión de los sistemas biológicos y el mayor conocimiento en cuanto a las interacciones de los materiales (tales como, anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes) con los diversos sistemas del cuerpo humano.

Las mejoras en los equipos han permitido volúmenes mayores y costes menores para la producción de materiales obtenidos biológicamente, tales como proteínas recombinantes. Esto prevalece especialmente en el área de los productos farmacéuticos, donde el éxito de muchos tipos de farmacoterapias nuevas ha sido debido directamente a la capacidad de producir en serie estos materiales a través de métodos de fabricación basados en proteínas.

Uno de los componentes clave que se utiliza en los procesos de fabricación de productos farmacéuticos nuevos de base biológica es el biorreactor y los procesos complementarios asociados al mismo. Una de las áreas de crecimiento en el campo de los biorreactores se ha situado en los procesos de perfusión. Los procesos de perfusión se diferencian de los procesos por lotes alimentados por su menor coste de capital y su funcionamiento continuo (más que por lotes).

En los procesos por lotes alimentados, un cultivo se siembra en un biorreactor. La adición gradual de un volumen fresco de nutrientes seleccionados durante el ciclo de crecimiento se usa para mejorar la productividad y el crecimiento. El producto se recupera después de recolectar el cultivo. Los procesos de los biorreactores por lotes alimentados, discontinuos, han resultado atractivos por su simplicidad y también debido a la herencia de procesos de fermentación bien conocidos. No obstante, un biorreactor por lotes alimentados tiene unos costes altos de puesta en marcha, y, generalmente, tiene un volumen grande con el fin de obtener una cantidad rentable del producto al final del ciclo de crecimiento. Después de que se complete el lote, el biorreactor se debe limpiar y esterilizar, dando como resultado un tiempo de inactividad no productivo.

Los biorreactores de perfusión procesan una aportación continua de medios frescos que se alimentan al biorreactor al tiempo que se retiran constantemente subproductos inhibidores del crecimiento. Con los procesos de los biorreactores de perfusión se puede reducir o eliminar el tiempo de inactividad no productivo. Las densidades celulares que se alcanzan en un cultivo de perfusión (30-100 millones de células/mL) son típicamente mayores que las correspondientes para modos por lotes alimentados (5-25 millones de células/mL). Estas mejoras han llevado a una menor contaminación en la recolección y a mejores rendimientos sin un aumento significativo de los costes. No obstante, los biorreactores de perfusión requieren un dispositivo de retención celular para evitar la fuga del cultivo cuando se están retirando subproductos. Estos sistemas de retención celular añaden un nivel de complejidad al proceso de perfusión, requiriendo gestión, control y mantenimiento para un funcionamiento exitoso. Hasta la fecha, cuestiones operativas tales como funcionamientos defectuosos o averías de los equipos de retención celular han constituido un problema de los biorreactores de perfusión, lo cual ha limitado su atractivo en el pasado. En el documento US 2006/037916 A1, se divulga un método general para separar células arrastradas en un flujo de líquidos por medio de un transductor ultrasónico. El documento WO 2014/124 306 A1 presentado por el mismo solicitante que la presente solicitud divulga un dispositivo que comprende las características del preámbulo de la reivindicación 1 y un método del preámbulo de la reivindicación 11.

Breve descripción

Uno de los objetivos de la invención es proporcionar trayectos de flujo mejorados para el fluido que se va a tratar. Para alcanzar este objetivo y de acuerdo con la invención, se propone un dispositivo que comprende todas las características de la reivindicación 1 y un método que comprende todas las características de la reivindicación 11. Las reivindicaciones dependientes proponen formas de realización ventajosas de este dispositivo o este método.

La presente divulgación se refiere, en varias formas de realización, a dispositivos acústicos que se usan para biofabricación por perfusión, en donde no todas las formas de realización de estos dispositivos acústicos comprenden las características de la invención reivindicada en la presente. Más particularmente, los dispositivos se acoplan a un biorreactor asociado. Dentro del biorreactor, se producen biomoléculas, tales como proteínas recombinantes o anticuerpos monoclonales. A continuación, el dispositivo acústico se usa para separar estos productos deseables de las células de una manera continua, y las células se devuelven continuamente al biorreactor. En general, una mezcla fluida que contiene las células y los productos deseados se hacen pasar o fluir a través del dispositivo acústico y se separan en él mediante una(s) onda(s) estacionaria(s) multidimensional(es). En general, la mezcla fluida también contiene otros materiales, tales como restos celulares y residuos finos. La mezcla fluida se puede hacer fluir continuamente hacia el dispositivo, con una extracción continua de productos deseados. El dispositivo de perfusión acústica devuelve células viables sanas al biorreactor al tiempo que se recolectan productos deseados y los mismos se hacen fluir aguas abajo para un procesado posterior, por ejemplo, un filtrado adicional, cromatografía, etcétera. Adicionalmente, los medios de cultivo celular del biorreactor se clarifican en la medida en la que también se dejan pasar fragmentos celulares a la corriente de recolección y por lo tanto fuera de la mezcla fluida que se recicla hacia el biorreactor. Esto da como resultado un menor uso total de los medios de cultivo celular, que se corresponde con un ahorro previsto de los costes de hasta 20000 dólares por día para biorreactores grandes.

En varias formas de realización se divulgan dispositivos de perfusión acústica, que comprenden: una cámara acústica; un orificio de entrada, un trayecto de flujo de entrada que conduce del orificio de entrada a la cámara acústica; un orificio de salida para recircular fluido que fluye a través del dispositivo de vuelta a su origen (por ejemplo, un biorreactor), y un trayecto de flujo de salida que conduce de la cámara acústica al orificio de salida; por lo menos un orificio de recogida o recolección para recoger una corriente de producto de fluido que sale de la cámara acústica; y por lo menos un transductor ultrasónico en la cámara acústica por debajo del por lo menos un orificio de recolección, incluyendo el por lo menos un transductor ultrasónico un material piezoeléctrico excitado por una señal de voltaje para crear una onda estacionaria acústica que atraviesa un trayecto de flujo de recogida o recolección que conduce de la cámara acústica al por lo menos un orificio de recogida o recolección. La onda estacionaria acústica puede ser plana o multidimensional, o puede haber presencia de una combinación de dichas ondas dentro de la cámara acústica (generalmente de múltiples transductores). La onda estacionaria acústica puede considerarse como un “campo de fuerzas” que retiene células enteras, pero permite que materiales más pequeños, tales como las biomoléculas deseadas (por ejemplo, proteínas recombinantes y/o anticuerpos monoclonales) y fragmentos de células, pasen a su través y se extraigan del fluido que es devuelto al biorreactor.

En general, el orificio de salida está debajo del orificio de entrada, y en general está situado en un extremo inferior del dispositivo.

Como se ha mencionado anteriormente, el dispositivo puede tener uno o más orificios de recogida o recolección en la parte superior del dispositivo. En algunas formas de realización más específicas, el dispositivo puede tener un total de dos orificios de recolección espaciados entre sí en el extremo superior del dispositivo.

En formas de realización particulares, el orificio de entrada está en un primer extremo del dispositivo a una primera altura, el por lo menos un transductor ultrasónico está a una segunda altura por encima de la primera altura, y una pared inferior discurre desde el orificio de entrada al orificio de salida. El orificio de salida puede estar situado en un segundo extremo del dispositivo opuesto al primer extremo. La pared inferior puede ser cóncava, con respecto a una línea entre el orificio de entrada y el orificio de salida. El dispositivo puede incluir una pared superior por encima del trayecto de flujo de entrada. El orificio de entrada, el orificio de salida y el por lo menos un orificio de recolección están situados todos ellos en ocasiones en una pared frontal del dispositivo. La propia pared frontal puede ser plana (es decir, llana).

El dispositivo puede comprender, además, un reflector situado en la cámara acústica en oposición al por lo menos un transductor ultrasónico. Alternativamente, el dispositivo puede tener un total de dos transductores ultrasónicos situados en lados opuestos del trayecto de flujo de recolección a la misma altura y encarados entre sí, o se pueden situar transductores ultrasónicos adicionales en múltiples lados del trayecto de flujo de recogida/recolección. Se puede situar un reflector entre los dos transductores ultrasónicos. También puede haber una pluralidad de pares de transductor/reflector situados según resulte apropiado para formar una(s) onda(s) estacionaria(s) acústica(s) plana(s), multidimensional(es) o combinaciones de dichas ondas.

En formas de realización particulares, la onda estacionaria acústica da como resultado una fuerza de radiación acústica que tiene un componente de fuerza axial y un componente de fuerza lateral que son del mismo orden de magnitud.

En otras formas de realización del dispositivo que se divulga en la presente memoria, el trayecto de flujo de entrada conduce del orificio de entrada en sentido descendente hacia un extremo inferior del dispositivo y más allá del orificio de salida, y, a continuación, en sentido ascendente hacia la cámara acústica. En ocasiones, tanto el orificio de entrada como el por lo menos un orificio de recolección están situados en una pared superior del dispositivo, y el orificio de salida está situado en una pared frontal del dispositivo. Dicho por lo menos un transductor ultrasónico se puede montar en una pared posterior o una pared frontal del dispositivo. La pared inferior de esta cámara acústica puede ser una superficie plana inclinada. El reflector se puede realizar con un material transparente.

El trayecto de flujo de entrada se puede conformar para generar un trayecto de flujo tangencial por debajo de un campo acústico generado por la onda estacionaria acústica. Todavía en versiones adicionales que pueden verse en la presente, el trayecto de flujo de entrada entra en la cámara acústica por un primer lado del dispositivo, y el orificio de salida está situado (i) en el primer lado del dispositivo o (ii) en un segundo lado opuesto. El orificio de entrada puede estar situado en un lado frontal del dispositivo, y el por lo menos un orificio de recolección puede estar situado en una pared superior del dispositivo. Dicho por lo menos un transductor puede estar situado en un lado frontal o un lado posterior del dispositivo. En formas de realización más particulares, puede haber dos transductores, uno en el lado frontal y otro en el lado posterior. Todavía en otras formas de realización particulares, hay un transductor ultrasónico en el lado frontal o posterior, y un reflector situado en el lado posterior o frontal respectivo opuesto al transductor.

En formas de realización adicionales, el dispositivo de perfusión comprende, además, un trayecto de flujo de recirculación entre el orificio de entrada y el orificio de salida que no entra en la cámara acústica, y el trayecto de flujo de recirculación está situado por debajo de la cámara acústica. En algunas formas de realización particulares, el trayecto de flujo de entrada recorre un camino diferente al trayecto del flujo de salida. Todavía en otras formas de realización, el trayecto de flujo de entrada y el trayecto de flujo de salida recorren un camino común.

El dispositivo puede estar fijado a una pieza de montaje que tiene orificios para la fijación.

Se divulgan también métodos para separar células de una mezcla fluida que contiene las células. La mezcla fluida se hace fluir a través de un dispositivo de perfusión acústica de la estructura antes descrita, que tiene por lo menos un transductor ultrasónico. Dicho por lo menos un transductor ultrasónico se excita para crear la onda estacionaria acústica. Del orificio de salida se puede recoger un fluido enriquecido en células, y del por lo menos un orificio de recolección se puede recoger un fluido clarificado, empobrecido en células.

En formas de realización particulares, el caudal a través del trayecto de flujo de recogida / recolección es al menos un orden de magnitud menor que un caudal a través del trayecto de flujo de entrada. En formas de realización específicas, el caudal de la mezcla fluida que entra en el dispositivo a través del orificio de entrada es aproximadamente 1 litro por minuto y el caudal del fluido empobrecido en células y que sale del dispositivo a través del por lo menos un orificio de recogida/recolección es aproximadamente 10 mililitros por minuto. Alternativamente, la relación del caudal que entra a través del orificio de entrada con respecto al caudal que sale a través del por lo menos un orificio de recogida / recolección es tal que la onda estacionaria acústica no es superada por la masa principal de células, o, en otras palabras, de manera que no comienza a salir del dispositivo un volumen elevado de células a través del(de los) orificio(s) de recogida / recolección.

Los métodos pueden comprender, además, sacar la mezcla fluida a través del dispositivo usando una primera bomba fijada al por lo menos un orificio de recolección del dispositivo y una segunda bomba fijada al orificio de salida del dispositivo.

También se divulgan en la presente dispositivos de flujo adaptados para (i) recibir una mezcla fluyente que contiene un fluido principal y células; y (ii) usar una primera onda estacionaria acústica para drenar continuamente una corriente de fluido de recolección empobrecida en células a partir de la mezcla fluyente, cambiando así la concentración celular de la mezcla fluyente. Se puede generar una elevación de presión en la región de interfaz de aguas arriba de la onda estacionaria acústica, junto con una fuerza de radiación acústica que actúa sobre las partículas suspendidas entrantes. Este “efecto de interfaz”, que también puede denominarse “efecto de borde”, actúa como una barrera y está situado típicamente en la superficie delimitadora de aguas arriba del volumen de fluido que es ensonificado por el transductor (es decir, la mezcla de flujo debe atravesar la región de interfaz para entrar en el volumen de fluido ensonificado. La frecuencia de la onda estacionaria acústica se puede modificar de tal manera que se pueden retener materiales con diferentes factores de contraste o se puede permitir que los mismos pasen a través de la onda estacionaria acústica, o de tal manera que se retengan partículas de un intervalo de tamaño dado y se permita que partículas de un segundo intervalo dado fluyan a través de la onda estacionaria.

El dispositivo puede comprender, además, una cámara de flujo secundario en la que la corriente de fluido de recolección empobrecida en células pasa a través de una segunda onda estacionaria acústica que tiene una frecuencia diferente de, o igual a la primera onda estacionaria acústica. Por ejemplo, la segunda onda estacionaria acústica puede tener una frecuencia superior o inferior a la primera onda estacionaria acústica. La relación de la frecuencia de las dos ondas estacionarias es, en algunas formas de realización, por lo menos 2:1 (es decir, una de las frecuencias es por lo menos dos veces la otra frecuencia, por ejemplo, 3 MHz y 6 MHz).

En la presente memoria, también se divulgan unos dispositivos de flujo que comprenden: por lo menos una entrada para recibir una mezcla fluyente de un fluido principal y células, un transductor ultrasónico que produce una primera onda estacionaria acústica ultrasónica y usa una elevación de presión y una fuerza de radiación acústica generada en una región de interfaz de aguas arriba de la primera onda estacionaria acústica ultrasónica para separar la mezcla fluyente en una corriente de fluido principal de alta concentración celular y una corriente de fluido de recolección secundario; un orificio de salida para la corriente de fluido principal de alta concentración celular; y por lo menos un orificio de recogida para la corriente de fluido de recolección secundario. También puede haber presencia de un orificio de purga para extraer una mezcla concentrada de fluido/células. La mezcla fluida puede comprender partículas, tales como células de mamífero, bacterias, restos celulares, residuos finos, proteínas, exosomas, vesículas, virus y células de insecto.

El dispositivo puede comprender, además, una cámara de flujo secundario en la que la corriente de fluido de recolección secundario pasa a través de una segunda onda estacionaria acústica que tiene una frecuencia diferente de, o igual a, la primera onda estacionaria acústica ultrasónica.

Más adelante se describen de forma más particular estas y otras características no limitativas.

Breve descripción de los dibujos

La siguiente es una breve descripción de las figuras. Solo las figuras 43-46D, 48 y 49 se corresponden con formas de realización según la presente invención.

La figura 1 ilustra una única onda acústica estacionaria generada por un transductor ultrasónico y un reflector. La figura 2 es una ilustración que compara un sistema de biorreactor por lotes alimentados con un sistema de biorreactor de perfusión.

La figura 3 es una vista en sección transversal que muestra los diversos componentes de un biorreactor de tanque agitado.

La figura 4 es una vista en perspectiva de un dispositivo de perfusión acústica, que tiene dos orificios de recogida o recolección y un único transductor ultrasónico.

La figura 5 muestra un segundo dispositivo de perfusión acústica, con un único reflector situado entre dos transductores ultrasónicos.

La figura 6 es una vista esquemática que ilustra un biorreactor de perfusión acoplado con un dispositivo de perfusión acústica y un trayecto de reciclado.

La figura 7 es una vista frontal en sección transversal de un tercer dispositivo de perfusión acústica.

La figura 8 es una vista exterior en perspectiva del dispositivo de perfusión acústica de la figura 7.

La figura 9 es una vista frontal en sección transversal de un cuarto dispositivo de perfusión acústica.

La figura 10 es una vista en perspectiva del dispositivo de perfusión acústica de la figura 9.

La figura 11 es un diagrama en sección transversal de un transductor ultrasónico convencional.

La figura 12 es un diagrama en sección transversal de un transductor ultrasónico. Dentro del transductor hay presencia de un espacio de aire, y no hay presencia de ninguna capa de respaldo o placa de desgaste. La figura 13 es un diagrama en sección transversal de un transductor ultrasónico. Dentro del transductor hay presencia de un espacio de aire, y están presentes una capa de respaldo y una placa de desgaste.

La figura 14 es una gráfica de la amplitud de la impedancia eléctrica con respecto a la frecuencia para un transductor cuadrado excitado a diferentes frecuencias.

La figura 15 ilustra las configuraciones de líneas de captura para siete de las frecuencias de resonancia (mínimos de las amplitudes de la impedancia eléctrica) de la figura 14 desde la dirección ortogonal al flujo de fluido.

La figura 16 es una simulación por ordenador de la amplitud de la presión acústica (escala de la derecha en Pa) y el desplazamiento fuera de plano del transductor (escala de la izquierda en metros). El texto en la parte superior de la escala de la izquierda indica “x10-7”. El texto en la parte superior de la escala de la izquierda junto al triángulo que apunta hacia arriba indica “1.473x10"6”. El texto en la parte inferior de la escala de la izquierda junto al triángulo que apunta hacia abajo indica “1.4612x10-10”. El texto en la parte superior de la escala de la derecha indica “x106”. El texto en la parte superior de la escala de la derecha junto al triángulo que apunta hacia arriba indica “1.1129x106”. El texto en la parte inferior de la escala de la derecha junto al triángulo que apunta hacia abajo indica “7.357”. Los triángulos muestran los valores máximo y mínimo representados en esta figura para la escala dada. El eje horizontal es la posición dentro de la cámara a lo largo del eje X, en pulgadas, y el eje vertical es la ubicación dentro de la cámara a lo largo del eje Y, en pulgadas.

La figura 17 muestra el desplazamiento En el Plano y Fuera de Plano de un cristal en el que hay presencia de ondas compuestas.

La figura 18 es una vista de un primer dispositivo de perfusión acústica conectado fluídicamente a un biorreactor asociado, mostrando una pluralidad de mangueras que conectan fluídicamente los diversos orificios del dispositivo al biorreactor asociado y una bomba de flujo saliente que conecta fluídicamente el orificio de salida del dispositivo al biorreactor asociado.

La figura 19 es una vista de otro dispositivo de perfusión acústica de la figura 5, que muestra un reflector en la cámara acústica entre un primer y segundo transductores. En el dispositivo también hay presencia de una mezcla fluida y se muestran flechas que indican la dirección de flujo además de ondas que indican el campo acústico entre el reflector y el primer y segundo transductores.

La figura 20 es una gráfica que muestra la eficiencia de la extracción de células de una mezcla fluida para un experimento con dos velocidades diferentes de perfundido/alimentación.

La figura 21 es una gráfica que muestra la reducción de turbidez del flujo de recolección (al que también se hace referencia como perfundido) para un experimento.

La figura 22 es una gráfica que muestra la viabilidad celular para diversos caudales en relación con el experimento efectuado para las gráficas de las figuras 20-21.

La figura 23 es una gráfica que muestra la densidad celular total y la retención celular para diversos caudales y métodos de flujo en relación con otro experimento.

La figura 24 es una gráfica que muestra la viabilidad celular para diversos flujos en relación con el experimento efectuado para las gráficas de la figura 23.

La figura 25 es una gráfica que muestra la densidad celular total y la retención celular para diversas cantidades de transductores ultrasónicos en relación con otro experimento.

La figura 26 es una gráfica que muestra la viabilidad celular para diversas cantidades de transductores ultrasónicos en relación con el experimento efectuado para la gráfica de la figura 25.

La figura 27 es una imagen de otro dispositivo de perfusión acústica que se sometió a prueba.

La figura 28 es una gráfica que muestra el efecto del caudal perfundido o el voltaje del transductor sobre la retención celular.

La figura 29A es una imagen de microscopio de un Analizador Celular ViCell de las partículas de la corriente de alimentación que entra en el dispositivo. La corriente de alimentación es un fluido de biorreactor que contiene células CHO, proteína y fragmentos celulares. La figura 29B es una gráfica de la distribución del diámetro de las partículas del flujo alimentado, que muestra una distribución bimodal. En la figura 29B, el eje y es el contaje de partículas de 0 a 200 en intervalos de 10. El eje x es el diámetro de las partículas en micras de 6 a 50 en intervalos de 2. El número total de partículas es 5539, la media del tamaño de las partículas es 16.78 micras, la desviación estándar de 6.76 micras y la moda del tamaño de las partículas de 10.56 micras.

La figura 30A es una imagen de microscopio del perfundido (o flujo de recolección clarificado) que sale del dispositivo. La figura 30B es una gráfica de la distribución del diámetro de las partículas del perfundido, que muestra una distribución unimodal a tamaños mucho menores. En la figura 30B, el eje y es el contaje de partículas de 0 a 300 en intervalos de 20. El eje x es el diámetro de las partículas en micras de 6 a 50 en intervalos de 2. El número total de partículas es 2919, la media del tamaño de las partículas es 10.08 micras, la desviación estándar es de 3.75 micras y la moda del tamaño de las partículas de 8.99 micras.

La figura 31 es un modelo de CFD que muestra la distribución de la velocidad dentro del dispositivo de la figura 27. El texto en la parte superior de la escala indica “x10"2”. El texto en la parte superior de la escala junto al triángulo que apunta hacia arriba indica “0.678”. El texto en la parte inferior de la escala junto al triángulo que apunta hacia abajo indica “0”. Los triángulos muestran los valores máximo y mínimos representados en esta figura para la escala dada. La escala discurre de 0 a 5 m/s en intervalos de 0.5, con el negro indicando 5 en la parte superior de la escala, y el blanco indicando cero en la parte inferior de la escala.

La figura 32 es una vista frontal del dispositivo de la figura 27, que muestra los trayectos de flujo, el campo acústico y el efecto de interfaz acústica.

La figura 33 es una fotografía compuesta que muestra el dispositivo de perfusión acústica de la figura 27 en dos modos de funcionamiento. A la izquierda, el dispositivo está en modo de arranque o de sedimentación celular. A la derecha, el dispositivo está en modo de retención celular estable.

La figura 34 muestra la geometría de la simulación de un modelo del dispositivo acústico usado para retención celular. El modelo contiene dos fluidos, uno un fluido clarificado dentro del campo acústico, el otro un fluido de alta densidad celular a la izquierda del campo acústico, un transductor piezoeléctrico, un reflector de acero y una caja de aluminio. El primer fluido era agua dentro del campo acústico y el segundo fluido era una concentración al 15% de células CHO en solución de agua fuera (a la izquierda) del campo acústico. La línea continua azul en el modelo indica la línea de separación entre los dos fluidos.

Las figuras 35A, 35B y 35C son gráficas que muestran el desplazamiento del material piezoeléctrico, la caja de aluminio y el reflector de acero (escala de la izquierda); y la presión acústica en los dos fluidos (escala de la derecha) de la simulación del modelo de la figura 34 en varias frecuencias de funcionamiento. La figura 35A es a una frecuencia de 2.218 MHz. La figura 35B es a una frecuencia de 2.2465 MHz. La figura 35C es a una frecuencia de 2.3055 MHz. Para la totalidad de las tres gráficas, la escala de la izquierda se indica con texto en la parte superior de la escala que dice “x10-6” ó “x10-7”, y está en unidades de pulgadas. La escala de la derecha se indica con texto en la parte superior de la escala que dice “x106”, y está en unidades de Pascales. El eje y discurre de -0.8 a 1.6 en intervalos de 0.2. El eje x discurre de -0.5 a 1.5 en intervalos de 0.5.

La figura 36 es una gráfica que muestra la fuerza lateral promedio (N) y la fuerza lateral promedio normalizada con la potencia (N/W) que actúan sobre células CHO suspendidas a varias frecuencias de funcionamiento. La figura 37 es una imagen (vista superior) de un dispositivo de perfusión acústica de la presente divulgación. Las flechas indican el flujo hacia el orificio de entrada; el flujo fuera del orificio de salida; el flujo de fluido clarificado fuera de la parte superior del dispositivo y el flujo de concentrado fuera de la parte inferior del dispositivo.

La figura 38 es una imagen (vista lateral) del dispositivo de perfusión acústica de la figura 37.

La figura 39 es una gráfica de la retención celular con respecto al caudal de perfundido para el dispositivo de la figura 37.

La figura 40 es una ilustración de la técnica anterior que muestra una filtración de flujo directa (DFF) y una filtración de flujo tangencial (TFF).

La figura 41 es una imagen que ilustra un primer modo de funcionamiento durante la perfusión, en la que se capturan, conglomeran y separan células a partir de una corriente de recolección. El dispositivo se hace funcionar verticalmente, indicando una flecha la dirección de la gravedad.

La figura 42 es una imagen que ilustra un segundo modo de funcionamiento durante la perfusión, en el que se evita que entren células en un campo de ondas estacionarias acústicas mientras que se permite que partículas más pequeñas pasen a través del campo y hacia la corriente de recolección. El dispositivo se hace funcionar verticalmente, indicando una flecha la dirección de la gravedad.

La figura 43 es una vista en perspectiva de una forma de realización de un dispositivo de perfusión acústica de la presente divulgación. Esta forma de realización es acorde a la presente invención e incluye un trayecto de flujo de recirculación directo entre el orificio de entrada y el orificio de salida. Un paso de entrada y un paso de salida unen el trayecto de flujo de recirculación a la cámara acústica, y crean un flujo de barrido tangencial por debajo del campo acústico.

La figura 44 es una imagen en vista frontal del dispositivo de la figura 43. El paso de entrada y el paso de salida son claramente visibles, junto con la tubería de recirculación.

La figura 45 es una vista lateral esquemática del dispositivo de la figura 43.

La figura 46A y la figura 46B son una vista frontal esquemática del dispositivo de la figura 43, mostrando una estructura interna. Las figuras se duplican debido a la cantidad de numerales de referencia.

La figura 46C y la figura 46D son una vista frontal esquemática del dispositivo de la figura 43, mostrando una estructura interna alternativa, donde el paso de entrada y el paso de salida tienen una geometría de flujo diferente. Las figuras se duplican debido a la cantidad de numerales de referencia.

La figura 47 es una vista en perspectiva de una alternativa de un dispositivo de perfusión acústica. Este dispositivo incluye un trayecto de flujo de recirculación directo entre el orificio de entrada y el orificio de salida. Un único paso une el trayecto de flujo de recirculación a la cámara acústica, y actúa al mismo tiempo como paso de entrada y como paso de salida.

La figura 48 es una vista lateral esquemática del dispositivo de la figura 43.

La figura 49 es una vista frontal esquemática del dispositivo de la figura 43, que muestra la estructura interna.

La figura 50 es una gráfica de la retención celular con respecto al tiempo para el dispositivo de la figura 7. El eje y discurre del 90% al 100% en intervalos de 1%. El eje x discurre de 0 a 165 minutos en intervalos de 15 minutos. Se llevaron a cabo pruebas en dos días diferentes.

La figura 51 es una gráfica de la densidad celular del perfundido (millones de células/ml) con respecto al tiempo para el dispositivo de la figura 7. El eje y discurre de 0.00 a 3.50 en intervalos de 0.50. El eje x discurre de 0 a 165 minutos en intervalos de 15 minutos. Se llevaron a cabo pruebas en dos días diferentes.

La figura 52 es un modelo de CFD que muestra la distribución de la velocidad dentro del dispositivo de la figura 46A. El texto en la parte superior de la escala indica “x10-3”. La escala discurre de -5 a 5 m/s en intervalos de 1.

La figura 53 es un modelo de CFD que muestra la distribución de la velocidad dentro del dispositivo de la figura 46C con un caudal de 250 mL/min. El texto en la parte superior de la escala indica “x10-3”. La escala discurre de -5 a 5 m/s en intervalos de 1.

La figura 54 es un modelo de CFD que muestra la distribución de la velocidad dentro del dispositivo de la figura 46C con un caudal de 1000 mL/min. El texto en la parte superior de la escala indica “x10-3”. La escala discurre de -5 a 5 m/s en intervalos de 1.

La figura 55 es un modelo de CFD que muestra la distribución de la velocidad para otra estructura interna correspondiente al dispositivo de la figura 43. La escala discurre de -0.05 a 0.1 m/s en intervalos de 0.05. La figura 56 es un modelo de CFD que muestra la distribución de la velocidad para otra estructura interna correspondiente al dispositivo de la figura 43. La escala discurre de -0.1 a 0.15 m/s en intervalos de 0.05. La figura 57 es una gráfica de la retención celular con respecto al tiempo para el dispositivo de la figura 46A. El eje y discurre del 90% al 100% en intervalos de 1%. El eje x discurre de 0 a 100 minutos en intervalos de 10 minutos.

La figura 58 es una gráfica de la densidad celular del perfundido (millones de células/mL) con respecto al tiempo para el dispositivo de la figura 46A. El eje y discurre de 0.00 a 1.20 en intervalos de 0.20. El eje x discurre de 0 a 100 minutos en intervalos de 10 minutos.

La figura 59 es una gráfica de la retención celular con respecto al tiempo para el dispositivo de la figura 46A a dos frecuencias diferentes, 1 MHz y 2 MHz. Los círculos más oscuros son para 2 MHz. El eje y discurre de 0.00 a 1.00 en intervalos de 0.10. El eje x discurre de 0 a 300 minutos en intervalos de 50 minutos.

La figura 60 es una gráfica de la densidad celular del perfundido (millones de células/ml) con respecto al tiempo para el dispositivo de la figura 46A a dos frecuencias diferentes, 1 MHz y 2 MHz. Los círculos más oscuros son para 2 MHz. El eje y discurre de 0.00 a 25.00 en intervalos de 5.00. El eje x discurre de 0 a 300 minutos en intervalos de 50 minutos.

Descripción detallada

La presente divulgación se puede entender más fácilmente en referencia a la siguiente descripción detallada de formas de realización deseadas y los ejemplos incluidos en ella. En la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones que van a continuación, se hará referencia a una serie de términos que se definen de manera que tengan los siguientes significados.

Aunque, en aras de la claridad, en la siguiente descripción se usan términos específicos, estos términos están destinados a referirse únicamente a la estructura particular de las formas de realización seleccionadas para la ilustración en los dibujos, y no están destinados a definir o limitar el alcance de la divulgación. En los dibujos y la siguiente descripción de más adelante, debe entenderse que las designaciones numéricas equivalentes se refieren a componentes de función equivalente.

Las formas del singular “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen referentes plurales a no ser que el contexto dictamine claramente lo contrario.

El término “comprender” se usa en la presente de manera que requiere la presencia del componente nombrado y permite la presencia de otros componentes. El término “comprender” debe interpretarse de manera que incluye el término “consistir en”, el cual permite la presencia solamente del componente nombrado, junto con cualquier impureza que pudiera resultar de la fabricación del componente nombrado.

Debe entenderse que los valores numéricos incluyen valores numéricos que son iguales cuando se reducen al mismo número de cifras significativas y valores numéricos que difieren con respecto al valor mencionado en menos que el error experimental de la técnica de medición convencional del tipo descrito en la presente solicitud para determinar el valor.

Todos los intervalos divulgados en la presente memoria incluyen el extremo mencionado y son combinables de manera independiente (por ejemplo, el intervalo “de 2 gramos a 10 gramos” incluye los extremos, 2 gramos y 10 gramos, y todos los valores intermedios). Los extremos de los intervalos y cualesquiera valores dados a conocer en la presente no se limitan al intervalo o valor preciso; son suficientemente imprecisos para incluir valores que se aproximan a estos intervalos y/o valores.

El modificador “aproximadamente” usado en relación con una cantidad incluye el valor mencionado y tiene el significado que dictamine el contexto. Cuando se usan en el contexto de un intervalo, el modificador “aproximadamente” debe considerarse también de manera que da a conocer el intervalo definido por los valores absolutos de los dos extremos. Por ejemplo, el intervalo “de aproximadamente 2 a aproximadamente 10” también da a conocer el intervalo “de 2 a 10”. El término “aproximadamente” puede referirse al 10% por encima o por debajo del número indicado. Por ejemplo, “aproximadamente el 10%” puede indicar un intervalo del 9% al 11%, y “aproximadamente 1” puede significar de 0.9 a 1.1.

Debe señalarse que muchos de los términos usados en la presente son términos relativos. Por ejemplo, los términos “superior” e “ inferior” son relativos mutuamente en cuanto a la posición, es decir, un componente superior está situado a una altura mayor que un componente inferior en una orientación dada, pero estos términos pueden cambiar si al dispositivo se la da la vuelta. Los términos “entrada” y “salida” son relativos a un fluido que fluye a través de ellas con respecto a una estructura dada, por ejemplo, un fluido fluye a través de la entrada hacia la estructura y fluye a través de la salida hacia fuera de la estructura. Los términos “aguas arriba” y “aguas abajo” son relativos a la dirección en la que fluye un fluido a través de varios componentes, es decir, el flujo fluye a través de un componente de aguas arriba antes de fluir a través del componente de aguas abajo. Debe señalarse que, en un bucle, un primer componente puede describirse tanto al mismo tiempo aguas arriba y aguas abajo de un segundo componente.

Los términos “horizontal” y “vertical” se usan para indicar una dirección con respecto a una referencia absoluta, es decir, el nivel del suelo. No obstante, no debe interpretarse que estos términos requieren estructuras para ser absolutamente paralelos o perpendiculares entre sí. Por ejemplo, una primera estructura vertical y una segunda estructura vertical no son necesariamente paralelas entre sí. Los términos “parte superior” y “parte inferior” o “base” se usan para referirse a superficies donde la parte superior está siempre a mayor altura que la parte inferior/base con respecto a una referencia absoluta, es decir, la superficie de la tierra. Los términos “en sentido ascendente” y “en sentido descendente” son también relativos a una referencia absoluta; en sentido ascendente es siempre en contra de la gravedad de la tierra.

La presente solicitud hace referencia a “el mismo orden de magnitud”. Dos números son del mismo orden de magnitud si el cociente del número mayor dividido por el número menor es un valor de por lo menos 1 e inferior a 10.

Los biorreactores son útiles para elaborar biomoléculas, tales como proteínas recombinantes o anticuerpos monoclonales. De manera muy general, se cultivan células en el recipiente de un biorreactor con medios con el fin de producir el producto deseado, y, a continuación, el producto deseado se recolecta por separación con respecto a las células y los medios en un dispositivo de perfusión acústica, tal como el dispositivo de la presente divulgación. El dispositivo de filtración acústica permite la extracción de algún producto deseado, una pequeña parte de los medios y fragmentos/restos celulares de tamaño menor que las células, reciclándose lo que queda de vuelta al biorreactor (en particular las células). El uso de cultivos de células de mamífero, incluidos ovario de hámster chino (CHO), células de hibridoma NS0, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de insecto y células humanas (por ejemplo, células T, células B, células madre, glóbulos rojos), y células vivas/biológicas en general ha demostrado ser una forma muy eficaz de producir/expresar las proteínas recombinantes y los anticuerpos monoclonales usados en diversas aplicaciones, tales como productos farmacéuticos o vacunas. Existen dos tipos generales de procesos en biorreactor: por lotes alimentados y de perfusión.

Aunque en la actualidad los reactores por lotes alimentados son lo habitual, debido principalmente a la familiaridad del proceso para muchos científicos y técnicos, la tecnología de perfusión está creciendo a un ritmo muy rápido. Muchos factores favorecen el uso de un proceso en un biorreactor de perfusión, principalmente debido a que es propicio para una producción continua. Los costes de capital y de puesta en marcha para los biorreactores de perfusión son menores, se requiere una capacidad menor de aguas arriba y aguas abajo, el rendimiento puede ser mayor, el proceso es continuo, y el proceso usa volúmenes menores y menos etapas de siembra que los métodos por lotes alimentados. Asimismo, los procesos de los biorreactores de perfusión se prestan mejor a desarrollos, variaciones a escala, optimizaciones, estudios de sensibilidad a parámetros y validaciones.

Un biorreactor de perfusión también se puede utilizar para generar células que se utilizarían en un proceso de terapia celular. En este tipo de biorreactor de perfusión, células biológicas, tales como células T CAR, células T Jurkat y similares, se cultivan en un biorreactor de perfusión. La onda estacionaria acústica usada en los dispositivos de perfusión de la presente divulgación se puede usar para separar células viables y no viables después del proceso de transfección. Esto permite una eficacia mejorada de la inoculación del paciente con esta terapia de células T ya que se usan únicamente células viables. Los fragmentos celulares y células no viables se filtran a través del proceso de perfusión, pasando estos materiales al flujo secundario y saliendo del biorreactor.

Los biorreactores de perfusión también se pueden usar para la producción de exosomas, microvesículas o vesículas por células. Los dispositivos de perfusión acústica se pueden usar entonces para recolectar los exosomas, u otros productos celulares deseados. De una manera similar, los biorreactores de perfusión se pueden usar para producir virus, tales como lentivirus, los cuales se usan en terapias celulares higiénicas para transfectar células. Los dispositivos de perfusión acústica se pueden usar entonces para recolectar el virus. En todos los casos, el dispositivo es un dispositivo de retención celular.

Desarrollos recientes en la tecnología de los biorreactores de perfusión favorecen también su uso. Los equipos de tecnología de control y de soporte general están mejorando para los biorreactores de perfusión, lo cual hace que aumente la robustez de los procesos de perfusión. Los procesos de perfusión ahora se pueden escalar para biorreactores que tengan un volumen de hasta 1000 litros (L). Sistemas mejorados de retención celular para biorreactores de perfusión dan como resultado una menor pérdida celular y mayores densidades celulares en comparación con lo observado previamente. Ahora, se pueden alcanzar densidades celulares superiores a 50 millones de células/mL, en comparación con las densidades celulares de lotes alimentados de en torno a 20 millones de células/mL. Menores tasas de contaminación e infección hacen que mejore la salida de los biorreactores de perfusión. Así, el resultado es que, para los procesos de perfusión, se han obtenido mayores concentraciones del producto en la recolección y mejores rendimientos sin un aumento significativo de los costes.

Los biorreactores de perfusión son particularmente atractivos debido a la producción continua de las biomoléculas a partir del cultivo celular que realice la expresión, y el menor tiempo de residencia de dichas biomoléculas en el proceso antes de la recolección. Las células diana se retienen mediante un proceso de filtración, tal como una filtración de flujo tangencial (TFF) o filtración de flujo tangencial alterna (ATF) al tiempo que las biomoléculas expresadas se extraen del biorreactor de perfusión. A continuación, las células se devuelven al biorreactor para garantizar que reciben la nutrición y el oxígeno con el fin de mantener la producción del cultivo celular total. En el proceso de un reactor de perfusión, las células continúan multiplicándose por lo que también es necesario purgar parte de la población del cultivo celular durante todo el proceso de producción por perfusión.

Los procesos de filtración TFF y ATF presentan varios problemas, tales como obturaciones/incrustaciones y pérdida de producto biomolecular (particularmente en densidades celulares elevadas), relacionados todos ellos directamente con la naturaleza de las membranas de fibra hueca usadas en la filtración. Por lo tanto, es deseable encontrar un nuevo proceso de filtración que no experimente obturaciones y minimice la pérdida del producto biomolecular deseado. Además, la TFF y la ATF retendrán todos los restos celulares y residuos finos dentro del biorreactor, lo cual no es deseable. Por lo tanto, puede resultar favorable un proceso capaz de diferenciar entre la retención celular al tiempo que permitiendo el paso de restos celulares y residuos finos.

Resumiendo, la presente divulgación se refiere a dispositivos de perfusión acústica capaces de generar una(s) onda(s) estacionaria(s) acústica(s) multidimensional(es) a partir de uno o más transductores piezoeléctricos, donde los transductores se excitan eléctricamente de tal manera que se mueven en un patrón de desplazamiento multimodal en vez de un modo de vibración de “pistón”. Con esta forma de generación de ondas estacionarias acústicas, se genera una fuerza de captura lateral mayor en comparación con si el transductor piezoeléctrico se excita en un modo de “pistón” donde se genera solamente una onda estacionaria grande. De este modo, con la misma potencia de entrada para un transductor piezoeléctrico, las ondas estacionarias acústicas multidimensionales pueden tener una fuerza de captura lateral mayor en comparación con una onda estacionaria acústica plana. La potencia de entrada es ajustable con vistas a un flujo controlado. Esto se puede usar para facilitar una purificación de fluido proteico correspondiente a una corriente de fluido proveniente de un biorreactor. Alternativamente, la onda estacionaria acústica también puede ser una onda estacionaria plana en la que el transductor piezoeléctrico se excita en el modo de pistón, generando una onda plana. La(s) onda(s) estacionaria(s) acústica(s) también puede(n) ser una combinación de ondas estacionarias acústicas planas y multidimensionales. Todas estas ondas estacionarias generan un “efecto de interfaz” tal que las células del biorreactor son retenidas y se permite que pasen a través del mismo el producto biomolecular expresado a partir de las células, los fragmentos celulares y pequeños restos.

La acustoforesis es un planteamiento de estado sólido, sin obturaciones, sin caídas de presión y de baja potencia para la separación de partículas a partir de dispersiones fluidas (es decir, se utiliza para lograr separaciones que se llevan a cabo más típicamente con filtros porosos, pero no presenta ninguna de las desventajas de los filtros). En particular, los dispositivos de perfusión acústica de la presente divulgación son adecuados para su uso con biorreactores a gran escala con vistas a separaciones en sistemas de flujo con caudales elevados. El dispositivo de perfusión acústica está diseñado para crear una onda estacionaria ultrasónica multidimensional de alta densidad que da como resultado una fuerza de radiación acústica que puede superar los efectos combinados del arrastre del fluido y la flotabilidad o gravedad en ciertos caudales. Como consecuencia, la fuerza de radiación actúa como filtro que evita que partículas buscadas (por ejemplo, células biológicas) atraviesen la onda estacionaria.

Como se ha explicado anteriormente, la capacidad de captura de una onda estacionaria se puede variar según se desee, por ejemplo, variando el caudal del fluido, la fuerza de radiación acústica y la forma del dispositivo de filtración acústica para maximizar la retención celular a través de la captura y la sedimentación. Esta tecnología ofrece una alternativa verde y sostenible para la separación de fases secundarias con una reducción significativa en los costes de energía. Se han demostrado excelentes eficiencias de separación de partículas para tamaños de estas últimas de un valor tan pequeño como una micra.

En general, la dispersión del campo acústico por las partículas da como resultado una fuerza de radiación acústica tridimensional, que actúa como campo de captura tridimensional. La fuerza de radiación acústica es proporcional al volumen de las partículas (por ejemplo, el cubo del radio) cuando la partícula es pequeña con respecto a la longitud de onda. Es proporcional a la frecuencia y al factor de contraste acústico. También varía a escala con la energía acústica (por ejemplo, el cuadrado de la amplitud de la presión acústica). Para la excitación armónica, la variación espacial sinusoidal de la fuerza es lo que excita las partículas a las posiciones estables dentro de las ondas estacionarias. Cuando la fuerza de radiación acústica ejercida sobre las partículas es mayor que el efecto combinado de la fuerza de arrastre del fluido y la fuerza de flotabilidad/gravedad, la partícula queda capturada dentro del campo de las ondas estacionarias acústicas. La acción de las fuerzas acústicas laterales y axiales sobre las partículas capturadas da como resultado la formación de conglomerados estrechamente compactados a través de la concentración, conglomeración, agrupamiento, aglomeración y/o coalescencia de partículas que, cuando alcanzan un tamaño crítico, se sedimentan continuamente a través de una gravedad potenciada para partículas más pesadas que el fluido hospedador o suben hacia fuera a través de una flotabilidad potenciada para partículas más ligeras que el fluido hospedador. Adicionalmente, en la aglomeración de las partículas colaboran fuerzas interpartícula secundarias, tales como las fuerzas de Bjerkness.

La mayoría de los tipos de células biológicas presentan una mayor densidad y una menor compresibilidad que el medio en el que están suspendidas, de manera que el factor de contraste acústico entre las células y el medio tiene un valor positivo. Como consecuencia, la fuerza de radiación acústica (ARF) axial impulsa las células hacia los nodos de presión de las ondas estacionarias. El componente axial de la fuerza de radiación acústica impulsa las células, con un factor de contraste positivo, a los nodos de presión, mientras que las células u otras partículas con un factor de contraste negativo son impulsadas hacia los antinodos de presión. El componente radial o lateral de la fuerza de radiación acústica es la fuerza que captura las células. El componente radial o lateral de la ARF es mayor que el efecto combinado de la fuerza de arrastre del fluido y la fuerza gravitacional. Para células pequeñas o emulsiones la fuerza de arrastre F^d se puede expresar como:

donde Uf y Up son la velocidad del fluido y de las células, Rp es el radio de las partículas, |jf y |jp son la viscosidad dinámica del fluido y las células, y = Fp/V-f es la relación de las viscosidades dinámicas. La fuerza de flotación Fb se expresa como:

Para que una célula quede capturada en la onda estacionaria ultrasónica multidimensional, el equilibrio de fuerzas sobre la célula debe ser cero, y, por lo tanto, puede hallarse una expresión para la fuerza de radiación acústica lateral Flrf, que viene dada por:

₁ F _LRF — ₁ F _D + _{T 1} F _{B .}

Para una célula de tamaño y propiedad del material conocidos, y para un caudal dado, esta ecuación se puede usar para estimar la magnitud de la fuerza de radiación acústica lateral.

Uno de los modelos teóricos que se usa para calcular la fuerza de radiación acústica se basa en la formulación desarrollada por Gorkov. La fuerza de radiación acústica principal F^a se define en función de un potencial de campo

donde el potencial de campo U se define como

y fi y f² son las contribuciones monopolar y dipolar definidas por

_ 2(A - l)

J l 2A 1 ’

donde p es la presión acústica, u es la velocidad de las partículas en el fluido, A es la relación de la densidad celular pp con respecto a la densidad del fluido pf, a es la relación de la velocidad del sonido en las células Cp con respecto a la velocidad del sonido en el fluido c, Vo es el volumen de la célula y < > indica promediado en el tiempo durante el periodo de la onda.

La teoría de Gorkov se limita a tamaños de partículas que son pequeños con respecto a la longitud de onda de los campos acústicos en el fluido y la partícula, y tampoco tiene en cuenta el efecto de la viscosidad del fluido y la partícula sobre la fuerza de radiación. Se han desarrollado modelos teóricos y numéricos adicionales para el cálculo de la fuerza de radiación acústica para una partícula sin ninguna restricción con respecto al tamaño de la partícula en relación con la longitud de onda. Estos modelos también incluyen el efecto de la viscosidad del fluido y las partículas, y, por lo tanto, son un cálculo más exacto de la fuerza de radiación acústica. Los modelos que se implementaron se basan en el trabajo teórico de Yurii Ilinskii y Evgenia Zabolotskaya según se describe en AIP Conference Proceedings [Actas de Congresos del AIP], vol. 1474-1, págs. 255-258 (2012). Se han desarrollado modelos internos adicionales para calcular fuerzas de captura acústicas para objetos de forma cilíndrica, tales como los “discos de hockey de partículas capturadas en la onda estacionaria, que se parecen mucho a un cilindro.

De manera deseable, el(los) transductor(es) ultrasónico(s) genera una onda estacionaria multidimensional en el fluido que ejerce una fuerza lateral sobre las partículas suspendidas para acompañar a la fuerza axial. Resultados típicos publicados en la bibliografía establecen que la fuerza lateral es dos órdenes de magnitud menor que la fuerza axial. Por contraposición, la tecnología dada a conocer en esta solicitud prevé que una fuerza lateral sea del mismo orden de magnitud que la fuerza axial. No obstante, en ciertas formas de realización descritas de manera adicional en la presente, el dispositivo usa tanto transductores que producen ondas estacionarias acústicas multidimensionales como transductores que producen ondas estacionarias acústicas planas. A efectos de esta divulgación, una onda estacionaria en la que la fuerza lateral no es del mismo orden de magnitud que la fuerza axial se considera una “onda estacionaria acústica plana”. El componente de fuerza lateral de la fuerza de radiación acústica (ARF) total generada por el(los) transductor(es) ultrasónico(s) de la presente divulgación es significativo y es suficiente para superar la fuerza de arrastre del fluido a velocidades lineales de hasta 1 cm/s, y para crear conglomerados estrechamente compactados, y es del mismo orden de magnitud que el componente de fuerza axial de la fuerza de radiación acústica total.

Puede resultar útil contraponer la tecnología de la presente divulgación con la de la tecnología de filtración anterior. La figura 40 muestra dos métodos de filtración de la técnica anterior. El lado izquierdo de la figura 40 ilustra una filtración de flujo directa (DFF). En la DFF, la corriente de alimentación 4005 completa de fluido y partículas se dirige hacia el filtro. El filtro 4010 retiene las partículas 4020 que son mayores que el tamaño del poro del filtro, mientras que las partículas más pequeñas 4030 y el fluido pasan a través del filtro. El lado derecho de la figura 40 ilustra una filtración de flujo tangencial (TFF). En la TFF, la corriente de alimentación no va dirigida hacia el filtro. En su lugar, la corriente de alimentación se dirige tangencialmente al filtro, de tal manera que una gran parte de la corriente de alimentación pasa tangencialmente sobre la superficie del filtro. Típicamente, esta corriente de alimentación se hace recircular para pasar por el filtro más de una vez. Una corriente de filtrado 4006 mucho más pequeña que contiene las partículas más pequeñas 4030 se saca a través de la membrana de filtro. Una de las ventajas de la TFF con respecto a la DFF es que la corriente tangencial reduce las obturaciones y las incrustaciones del filtro y la formación de una capa de gel que se asienta encima del filtro.

En los dispositivos de la presente divulgación, durante el arranque, el fluido ensonificado por la onda estacionaria acústica se clarifica mediante el proceso de captura de células y su transformación en conglomerados estrechamente compactados, de tal manera que tiene lugar una separación gravitatoria continua de los conglomerados de células. Puesto que existe una cantidad limitada de células nuevas que fluyen hacia este volumen, esto da como resultado una clarificación rápida del fluido sometido a la onda estacionaria acústica. Cuando se alcanza este estado, el sistema se puede describir de manera que incluye dos fluidos: un primer fluido que contiene el producto deseado y fragmentos/restos celulares pequeños (que han pasado a través de la onda estacionaria acústica), y un segundo fluido que contiene el fluido del biorreactor y todas las células (que son retenidas por la onda estacionaria acústica). Los dos fluidos pueden tener propiedades acústicas efectivas diferentes, tales como densidad y velocidad del sonido, con una interfaz bien definida entre estos dos fluidos. La onda estacionaria acústica es un campo acústico tridimensional que, en el caso de una excitación mediante un transductor rectangular, se puede describir de manera que ocupa un volumen de fluido en un prisma aproximadamente rectangular. Típicamente, dos de las caras opuestas son el transductor y el reflector, un par adyacente de caras opuestas son las paredes del dispositivo y el par opuesto final de caras, las caras del cubo de aguas arriba y aguas abajo, se extienden a través del fluido. Generalmente, la interfaz entre los dos fluidos está situada cerca de la cara de aguas arriba del campo de ondas estacionarias acústicas, generando una “barrera acústica o efecto de borde”. A esta posición se le hace referencia también como región de interfaz de aguas arriba. El primer fluido (es decir, el fluido que se ha clarificado y contiene el producto, algunas células y fragmentos celulares) está aguas abajo de la interfaz y representa el flujo de recolección y ocupa el volumen de fluido ensonificado por el campo de la onda estacionaria acústica. El segundo fluido (es decir, el fluido que contiene el fluido del biorreactor y la mayor parte de las células) está aguas arriba de la interfaz. Estos dos fluidos diferentes pueden verse en la foto de la derecha en la figura 33. Durante un funcionamiento con caudales mayores, la posición del efecto de interfaz se puede mover aguas abajo y se sitúa entonces dentro del volumen de fluido ensonificado por el transductor.

El campo de la onda estacionaria acústica ejerce una presión de radiación acústica (es decir, un aumento de presión) y una fuerza de radiación acústica sobre las células en la región de interfaz entre los dos fluidos, evitando así que las células de aguas arriba entren en el campo acústico. La aparición de la presión de radiación y la fuerza en la interfaz permite que el primer fluido que contiene el producto pase a través de la interfaz al tiempo que reteniendo las células en el fluido de aguas arriba. Las células que son retenidas por el efecto de la fuerza de radiación acústica en la interfaz entre los dos fluidos se pueden devolver continuamente al biorreactor para garantizar que reciben la nutrición y el oxígeno con el fin de mantener la producción del cultivo celular total.

El movimiento de circulación del campo del flujo por debajo de la interfaz transporta las células que son retenidas por el campo acústico de vuelta al biorreactor. El movimiento del flujo en circulación es impulsado por la corriente de recirculación principal y se puede optimizar con variaciones de la geometría de la cámara acústica con vistas a una eficiencia máxima del sistema. Esto se analizará de forma más detallada posteriormente con respecto a la figura 33.

Durante la perfusión, los dispositivos de perfusión acústica de la presente divulgación presentan múltiples modos posibles de funcionamiento. Uno de estos modos puede ser dominante en el dispositivo o los mismos se pueden producir simultáneamente dependiendo de la distribución de las células y el fluido dentro del dispositivo. En un primer modo de funcionamiento ilustrado en la figura 41 (Modo 1), el fluido que contiene células 4020 (color claro) entra en el campo de onda estacionaria acústica 4040, que se produce aquí entre el transductor 4008 y el reflector 4009. Una onda estacionaria acústica multidimensional captura las células en puntos específicos, empaqueta las células en conglomerados estrechamente compactados 4022 y separa continuamente los conglomerados a través de una sedimentación gravitatoria potenciada. Los conglomerados celulares se sedimentan, entran en el trayecto de flujo tangencial (indicado mediante la flecha 4001) y son redirigidos al biorreactor por la corriente de recirculación. Partículas más pequeñas 4030 (color más oscuro) no son capturadas por la onda estacionaria acústica y pasan a través de la misma para su recolección. La dirección del flujo de recolección se indica mediante la flecha 4002. La orientación de este dispositivo es significativa, y se indica también la dirección de la gravedad.

En la figura 42, se ilustra el segundo modo de funcionamiento (Modo 2), donde el sistema acusticoforético crea una fuerte barrera para células en la interfaz entre los dos fluidos y evita que en el campo acústico entren células. En este caso, se establece una barrera de células entre los dos fluidos a través del efecto de interfaz de la onda estacionaria acústica. Una primera corriente de fluido clarificado 4050 contiene las partículas más pequeñas/subproductos deseados 4030 dentro del campo de onda estacionaria acústica y la corriente de recolección. Una segunda corriente de fluido 4055 contiene las células retenidas 4020 aguas arriba del campo de onda estacionaria acústica. La dirección del flujo de recolección se indica mediante la flecha 4002. En este modo de funcionamiento, se materializa un efecto de interfaz acústica, según se indica mediante la línea discontinua 4007 (que representa la región de interfaz entre los dos fluidos, fluido clarificado aguas abajo y mezcla fluida y células en el lado de aguas arriba). De manera muy general, el efecto de interfaz acústica retiene las células y evita que las mismas entren en el campo acústico al tiempo que se permite que una parte de la corriente de fluido que contiene las biomoléculas producidas y fragmentos celulares pase a través de esta barrera. El trayecto de flujo tangencial por debajo de la interfaz acústica (flecha 4001) recoge las células retenidas y las hace fluir de vuelta a la corriente de recirculación principal y de vuelta al biorreactor. Esto también se describirá de forma adicional posteriormente con respecto a la figura 32. Nuevamente, se indica la dirección de la gravedad.

En aplicaciones de perfusión, la configuración del dispositivo acusticoforético es similar a la de la TFF. Una corriente de alimentación que contiene las células, restos celulares, residuos finos y producto, es decir, proteína, fluye desde el biorreactor hacia el sistema de perfusión. Una parte de la corriente fluye de una manera tangencial a lo largo de la región de interfaz inferior/de aguas arriba de la onda estacionaria acústica y se hace recircular de vuelta al biorreactor. Una parte más pequeña de la corriente de alimentación se recolecta, es decir, se desvía y fluye a través de la onda estacionaria acústica. En este caso, la onda estacionaria acústica funciona de manera muy similar al filtro de la TFF, evitando que las células entren en el campo acústico. La corriente de recolección contiene partículas más pequeñas, tales como restos celulares y residuos finos, así como el producto biomolecular deseado. Las células que son retenidas por la onda estacionaria acústica son transportadas por la corriente de recirculación de vuelta al biorreactor. La figura 32, que se describe de manera adicional en la presente, ilustra también un dispositivo de perfusión que usa una corriente de flujo tangencial.

Típicamente, las aplicaciones de perfusión conllevan altas densidades celulares, por ejemplo, > 50 millones de células/ml, y menores velocidades de recolección por contraposición a las aplicaciones de aceite/agua o clarificación celular. Las dos corrientes de fluido también tienen diferentes propiedades acústicas efectivas, es decir, velocidad del sonido y densidad de la mezcla de medios/células. A medida que aumente la densidad celular, también se hará más pronunciada la diferencia en las propiedades acústicas de las dos corrientes de fluido. El campo de onda estacionaria acústica ejercerá ahora una presión de radiación acústica, es decir, un aumento de presión, sobre la segunda corriente de fluido, enriquecida con células, así como fuerzas de radiación acústica sobre las células suspendidas en el fluido. Esta presión de radiación y fuerza de radiación actúan en la interfaz entre los dos fluidos que coincide con la superficie delimitadora de aguas arriba del campo acústico. Cuando este efecto de “ interfaz acústica” de la fuerza de radiación acústica es suficientemente fuerte, el mismo evitará que las células entren en el campo acústico. Igual de importante es un trayecto de flujo tangencial para recoger las células retenidas y transportarlas de vuelta al biorreactor.

Al efecto de interfaz acústica también se le puede hacer referencia como efecto de pared acústica y es el resultado de la interfaz del campo acústico que ejerce una fuerza lateral fuerte (es decir, en la dirección opuesta al flujo de recolección y perpendicular al eje de la onda estacionaria acústica) sobre las partículas suspendidas, no dejando así que las partículas de tamaño relativamente mayor entren en el campo acústico y permitiendo que solamente el fluido clarificado (es decir, el fluido que contiene el producto de tamaño menor) entre en el campo acústico, con lo cual se crea un dispositivo de retención celular de perfusión acústica. De esta manera, solamente puede fugarse el fluido clarificado y las células son retenidas por la fuerza de radiación. Esta fuerza nunca es positiva, lo cual significa que refrena siempre las células en la interfaz, es decir, la fuerza está actuando en la dirección del flujo de aguas arriba, no permitiendo que las células pasen a través de la interfaz acústica. Los múltiples picos en la curva de potencia (véase la descripción de la figura 37 más adelante) muestran la existencia de múltiples modos de funcionamiento que incluyen modos de resonancia plana y modos de funcionamiento multidimensionales, lo cual indica que este tipo de funcionamiento se puede generar a través de la utilización de ondas estacionarias planas y multidimensionales por igual. En sistemas con dimensiones de 1”x1” , existe una resonancia plana aproximadamente cada 30 kHz. La figura 37 muestra evidencia de picos adicionales que indican la existencia de los modos multidimensionales. Por unidad de potencia, estos modos pueden ser igual de efectivos o incluso más que los modos de resonancia plana. Como se ha explicado anteriormente, las células que son retenidas por la fuerza de radiación acústica pueden ser captadas a continuación por el movimiento de rozamiento del campo del flujo fluido (es decir, el flujo en recirculación por debajo de la interfaz), y pueden ser devueltas continuamente al biorreactor para garantizar que reciben la nutrición y el oxígeno con el fin de mantener la producción del cultivo celular total.

El fluido clarificado contiene tanto los productos deseados como fragmentos celulares, siendo todos ellos más pequeños que las células viables completas. De esta manera, los medios que se devuelven al biorreactor se clarifican en cuanto a fragmentos celulares. Los fragmentos celulares absorben medios sin producir producto deseado, lo cual hace que el proceso de perfusión sea menos eficiente. De este modo, se produce una ganancia en la eficiencia y un ahorro en los costes obtenidos al retirar estos fragmentos celulares con el uso de los dispositivos de perfusión acústica de la presente divulgación. Se puede obtener una clarificación adicional del fluido clarificado aguas abajo usando un segundo dispositivo o una cámara de flujo secundaria que contiene otro par de transductor-reflector que funciona a una frecuencia diferente. Esto captura, agrupa, conglomera o aglomera partículas que tienen un tamaño de aproximadamente 10 micras o menos y que pueden haber pasado a través de la onda estacionaria acústica original, de la misma manera que la descrita anteriormente. Se puede utilizar un tercer par de transductor-reflector que funcione a otra frecuencia, de 3 MHz a 20 MHz, o mayor, para capturar, agrupar, conglomerar o aglomerar y descartar los pequeños fragmentos y restos celulares que pasaron a través de la onda estacionaria acústica inicial y el “efecto de interfaz”. A continuación, este fluido triplemente clarificado que contiene las biomoléculas deseadas puede entrar directamente en un filtro estéril. Por ejemplo, el dispositivo de perfusión acústica original puede funcionar a frecuencias de hasta aproximadamente 4 MHz. Se contempla que la frecuencia de este segundo y tercer campos de onda estacionaria acústica estaría entre aproximadamente 6 MHz y aproximadamente 20 MHz, y posiblemente mayor, para capturar fragmentos celulares de menor dimensión.

Durante el arranque de un biorreactor con una baja densidad celular, por ejemplo, 2 millones de células/mL, domina el primer modo de funcionamiento descrito (figura 33, imagen de la izquierda). A medida que la densidad celular en el biorreactor aumenta con el tiempo, el modo de funcionamiento cambia gradualmente del modo 1 al modo 2, y ambos modos pueden coexistir al mismo tiempo.

Cuando se utiliza una onda estacionaria acústica para perfusión en un biorreactor con una densidad celular ya elevada, por ejemplo, 50 millones de células/mL, el dispositivo comienza típicamente en el primer modo de funcionamiento (figura 33, imagen de la izquierda), hasta que se clarifica el volumen de fluido dentro de la onda estacionaria acústica, momento en el cual el funcionamiento cambia gradualmente al segundo modo de funcionamiento descrito (figura 33, imagen de la derecha). En ocasiones, durante el funcionamiento, una inestabilidad, manifestada habitualmente en forma de una perturbación u oscilación de la interfaz entre los dos fluidos, se puede hacer suficientemente fuerte como para que células entren en el volumen de fluido dentro de la onda estacionaria acústica, momento en el cual, durante un breve periodo de tiempo, el dispositivo actúa en un modo de funcionamiento combinado, en el que ambos modos están activos (es decir, el efecto de interfaz evita que células entren en el campo acústico tal como se ha explicado anteriormente, al tiempo que el campo acústico clarifica las células que han entrado en el volumen de fluido dentro del campo de onda estacionaria acústica). Una vez que se han sedimentado los conglomerados celulares estrechamente compactados (es decir, una vez que el volumen de fluido dentro de la onda estacionaria acústica se ha clarificado suficientemente), el modo de funcionamiento es entonces de nuevo el correspondiente del segundo modo de funcionamiento descrito, a saber, el efecto de interfaz acústica. Es importante observar que el dispositivo puede funcionar en ambos modos de funcionamiento o en uno cualquiera de ellos, como se ha descrito anteriormente, sin conmutación externa. En otras palabras, las propiedades de las corrientes de fluido, por ejemplo, concentraciones celulares en las corrientes, y el campo acústico dictaminan qué modo domina.

Los dispositivos de perfusión de onda(s) estacionaria(s) acústica(s) de la presente divulgación se hacen funcionar de manera diferente en comparación con usos previos de los filtros acústicos, descritos previamente en la bibliografía. Antes, la acustoforesis se aplicaba de tal manera que los materiales productores de proteínas, tales como las células de ovario de hámster chino (células CHO), el hospedador más común para la producción industrial de proteínas recombinantes terapéuticas, se capturaban dentro de una onda estacionaria ultrasónica plana (es decir, permanecen en una posición estacionaria). Se retenían células en un campo acústico haciendo que células individuales migrasen hacia los planos nodales de presión de la onda estacionaria acústica plana. Allí, como las células quedaban retenidas en la onda estacionaria, se producía también un rozamiento físico de los medios de cultivo celular al pasar por ese lugar en flujo, con lo cual se capturaban más células a medida que las mismas entraban en contacto con las células que ya habían quedado cogidas dentro de la onda estacionaria. A continuación, la onda estacionaria y el flujo de fluido de recolección se interrumpían intermitentemente para permitir que las células abandonasen la onda estacionaria y volviesen al biorreactor.

Por contraposición, en la presente divulgación, las ondas estacionarias ultrasónicas se usan como cortina o selector o “campo de fuerzas”. En lugar de simplemente capturar y retener las células biológicas dentro de la onda estacionaria, el fluido fluye a través del dispositivo de perfusión de tal manera que en primer lugar actúa sobre las células biológicas la gravedad, haciendo que las mismas se hundan. La onda estacionaria se crea cerca de la parte superior del dispositivo de filtración y actúa como un filtro para evitar que las células entren en el campo acústico y salgan a través de la parte superior del dispositivo de filtración (es decir, actuando de manera similar a un campo de fuerzas que retiene las células para que no entren en el campo acústico). De este modo, se crean dos corrientes de salida, una corriente de salida que retiene las células y sale a través de un orificio por la parte inferior del dispositivo, y otra corriente de salida que se empobrece en células y que sale a través de un orificio por la parte superior del dispositivo (comparándose entre sí la concentración celular en las dos corrientes de salida). En este modo de funcionamiento, no se produce casi ninguna dependencia con respecto a la conglomeración, agrupamiento o aglomeración de las células dentro del campo acústico, lo cual es particularmente ventajoso en ciertas aplicaciones ya que no se requiere ningún tiempo de retención de las células en el dispositivo de filtración acústica.

Descrito de otra manera, el dispositivo de perfusión acústica tiene dos corrientes de fluido que fluyen a velocidades diferentes. La corriente de fluido principal, que lleva el cultivo celular que materializa la expresión, medios de cultivo, producto y otros constituyentes del biorreactor, entra en el dispositivo y se desvía parcialmente en una corriente de fluido de menor flujo, menor volumen, secundaria. Esta corriente de fluido secundaria pasa a través de la onda estacionaria acústica multidimensional, donde la onda estacionaria acústica multidimensional (o en general el efecto de interfaz creado por la onda estacionaria acústica) retiene el cultivo celular principal y permite que pasen a través de ella las biomoléculas expresadas, los anticuerpos monoclonales y las proteínas recombinantes, junto con otras pequeñas partículas, tales como restos celulares submicrónicos y micrónicos, y que los mismos sean adicionalmente recogidos y procesados fuera / aguas abajo del biorreactor. A continuación, la corriente de fluido principal, que contiene el cultivo celular principal, se recicla de vuelta al biorreactor. Se puede considerar que la onda estacionaria acústica y su “efecto de interfaz” actúan como un filtro, evitando que células, y otras partículas o cuerpos, grandes salgan del biorreactor.

En otra de las aplicaciones, los dispositivos de perfusión acústica pueden actuar como un dispositivo de retención y un dispositivo de lavado celular para aplicaciones de terapia celular. En aplicaciones de cultivo celular continuas, tales como terapia celular autóloga y alógena, es necesario purificar, aislar y, a continuación, hacer proliferar células que se recolectan inicialmente con una densidad celular muy baja. En un biorreactor se siembra un número relativamente pequeño de células, y en el mismo el número de células se debe incrementar. Etapas de procesado adicionales, tales como concentración, lavado e intercambio de medios son todas ellas necesarias para diversas aplicaciones. Todas estas aplicaciones tienen en común la necesidad de continuamente hacer circular, adicionar y/o extraer medios al tiempo que reteniendo células en un biorreactor (el cual puede ser tradicional o de un solo uso) sin ningún efecto sobre su viabilidad. Los sistemas de retención celular acústica descritos en la presente trabajan sobre una variedad de velocidades de recirculación celular, retienen eficientemente células sobre una variedad de perfusiones (o velocidades de extracción celular) y se pueden ajustar para retener completamente o dejar pasar de manera selectiva cierto porcentaje de células a través del caudal del fluido, de la potencia de los transductores o de la manipulación de la frecuencia. La potencia y las velocidades del flujo se pueden monitorizar y usar en su totalidad como retroalimentación en un sistema de control automatizado. También se pueden usar trayectos de flujo especiales de tal manera que un pequeño volumen del flujo de fluido principal se “escabulla” y las biomoléculas expresadas se separen del cultivo celular principal.

Una de las ventajas de la acustoforesis es que la fuerza de radiación acústica no perjudica o afecta negativamente las células biológicas o el producto biomolecular deseado. Por otra parte, la perfusión es continua, de tal manera que el cultivo celular se mantiene viable y, a partir de él, se pueden recuperar continuamente productos deseados.

En un sistema de un biorreactor de perfusión, es deseable poder filtrar y separar las células biológicas viables con respecto a los materiales expresados que están en la corriente de fluido (es decir, medios de cultivo celular) y los restos celulares. Como se ha mencionado previamente, dichas células biológicas pueden incluir células de ovario de hámster chino (CHO), cuyo genoma celular se manipula para expresar biomoléculas grandes. Dichas biomoléculas pueden incluir proteínas recombinantes o anticuerpos monoclonales, y son el producto deseado que se debe recuperar.

Los dispositivos de perfusión acústica de la presente divulgación están diseñados para mantener una onda estacionaria acústica multidimensional de alta intensidad que puede actuar como filtro, permitiendo que pasen a través de él partículas más pequeñas (tales como proteínas recombinantes o restos celulares) al tiempo que excluyendo partículas mayores (tales como células viables). En general, el dispositivo es excitado por un oscilador y un amplificador (no mostrado), y el rendimiento del dispositivo se monitoriza y controla mediante un ordenador (no mostrado). En ocasiones, debido a la formación de corrientes por efecto acústico, puede que sea necesario modular la frecuencia o la amplitud del voltaje de la onda estacionaria. Esto se puede realizar mediante modulación en amplitud y/o mediante modulación en frecuencia. El ciclo de trabajo de la propagación de la onda estacionaria también se puede utilizar para obtener ciertos resultados (es decir, el haz acústico se puede activar e interrumpir en periodos de tiempo o a velocidades diferentes).

La figura 1 ilustra un sistema de una única onda estacionaria 100 que está compuesto por una placa reflectora 101 y un transductor ultrasónico 103 que se ajusta para resonar con el fin de formar una onda estacionaria 102. El transductor 103 aplica, típicamente, frecuencias de excitación en el intervalo de 100 kHz a 100 MHz. Entre el transductor 103 y el reflector 101 se crean una o más ondas estacionarias multidimensionales. Una onda estacionaria ideal es la suma de dos ondas en propagación que son iguales en cuanto a frecuencia a intensidad y que se desplazan en direcciones opuestas, es decir, desde el transductor al reflector y de vuelta. Las ondas en propagación interfieren constructivamente entre sí y, de este modo, generan la onda estacionaria. Se usa una línea discontinua 105 para indicar la amplitud cero de la onda. Un nodo es un punto en el que la onda tiene amplitud mínima, y se indica con el numeral de referencia 107. Un antinodo es un punto en el que la onda tiene amplitud máxima, y se indica con el numeral de referencia 109.

La figura 2 es un diagrama esquemático que compara un sistema de biorreactor por lotes alimentados 201 (lado izquierdo) con un sistema de biorreactor de perfusión 202 (lado derecho). Comenzando con el biorreactor por lotes alimentados a la izquierda, el biorreactor 210 incluye un recipiente de reacción 220. Los medios de cultivo celular se alimentan al recipiente de reacción a través de una entrada de alimentación 222. Se usa un agitador 225 para hacer circular los medios por todo el cultivo celular. En este caso, el agitador se representa en forma de un conjunto de paletas giratorias, aunque se contempla cualquier tipo de sistema que provoque circulación. El biorreactor permite el crecimiento de un cultivo de siembra a través de un ciclo de crecimiento/producción, tiempo durante el cual se acumularán en el biorreactor restos, residuos y células no utilizables, y también se producirá el producto deseado (por ejemplo, biomoléculas tales como anticuerpos monoclonales, proteínas recombinantes, hormonas, etcétera). Debido a esta acumulación, el recipiente de reacción de un proceso por lotes alimentados es típicamente mucho mayor que el correspondiente de un proceso de perfusión. A continuación, el producto deseado se recolecta al final del ciclo de producción. El recipiente de reacción 220 también incluye una salida 224 para extraer material.

Volviendo ahora al biorreactor de perfusión 202 en el lado derecho, de nuevo el biorreactor incluye un recipiente de reacción 220 con una entrada de alimentación 222 para los medios de cultivo celular. Se usa un agitador 225 para hacer circular los medios por todo el cultivo celular. Una salida 224 del recipiente de reacción está conectada fluídicamente a la entrada 232 de un dispositivo de perfusión acústica 230 de la presente divulgación, y alimenta continuamente el contenido del biorreactor (que contiene células y producto deseado) al dispositivo de filtración. El dispositivo de perfusión está situado aguas abajo del recipiente de reacción, y separa el producto deseado de las células. El dispositivo de perfusión acústica 230 tiene dos salidas independientes, una salida de producto 234 y una salida de reciclado 236. La salida de producto 234 conecta fluídicamente el dispositivo de perfusión acústica 230 a un recipiente de contención 240 aguas abajo del dispositivo de perfusión, que recibe el flujo del producto deseado (más medios) del dispositivo de perfusión. A partir de allí, puede producirse un procesado / purificación adicional para aislar / recuperar el producto deseado. Por ejemplo, más aguas abajo de este dispositivo de perfusión acústica puede haber filtros adicionales, tales como una ATF, una TFF, un filtro de profundidad, una centrífuga, etcétera. La salida de reciclado 236 conecta fluídicamente el dispositivo de perfusión acústica 230 de vuelta a una entrada de reciclado 226 del recipiente de reacción 220, y se usa para enviar las células y medios de cultivo celular de vuelta al recipiente de reacción con vistas a un crecimiento/producción continuado. Planteado de otra manera, existe un bucle de fluido entre el recipiente de reacción y el dispositivo de perfusión. El recipiente de reacción 220 en el sistema de biorreactor de perfusión 202 tiene una producción continua de producto y, por lo tanto, se puede hacer más pequeño. El proceso de filtración es crítico con respecto a la producción del biorreactor de perfusión. Un proceso de filtración deficiente permitirá solamente una baja producción y dará como resultado bajos rendimientos del producto deseado.

La figura 3 es una vista en sección transversal de un biorreactor genérico 300 que es útil para los sistemas de la presente divulgación. Como se ilustra en la presente, el biorreactor incluye un recipiente de reacción 320 que tiene un volumen interno 323. Una entrada de alimentación 322 en la parte superior del recipiente se usa para alimentar medios de cultivo celular al recipiente. Hay presencia de un agitador 325. En la parte inferior del recipiente se muestra una salida 324. Una camisa térmica 310 rodea el recipiente de reacción, y se usa para regular la temperatura de las células/medios. Un aireador 312 está situado en la parte inferior del recipiente para proporcionar gas al volumen interno. En la parte superior derecha del recipiente se muestran sensores 314. Se ilustra una bomba 316 para alimentar los medios de cultivo celular al recipiente, igual que otra bomba 318 para extraer el recipiente medios de cultivo celular.

Los sistemas de perfusión descritos anteriormente usan un dispositivo de perfusión acústica de la presente divulgación. El contenido del biorreactor se hace fluir continuamente a través del dispositivo de perfusión acústica para capturar los productos deseados.

La figura 4 es una primera forma de realización de un dispositivo de perfusión acústica 400 que se puede usar con los sistemas previamente descritos. El dispositivo incluye un orificio de entrada 410, un orificio de salida 430, un primer orificio de recogida 470, una pared inferior 420 y una cámara acústica 450. A la cámara acústica 450 también se le puede hacer referencia como celda de fluido.

El orificio de entrada 410 está situado en un primer extremo 412 del dispositivo. En general, el orificio de entrada 410 está conectado fluídicamente a un biorreactor asociado y actúa como entrada a través de la cual la mezcla fluida con células, residuos finos y producto se introducen en el dispositivo. Un trayecto de flujo de entrada 451 conduce desde el orificio de entrada 410 a la cámara acústica 450, que contiene un volumen interno. Puede haber presencia de una pared superior 411 por encima del trayecto de flujo de entrada que conduce del orificio de entrada a la cámara acústica, teniendo la pared superior una orientación sustancialmente horizontal. El trayecto de flujo de entrada tiene un área en sección transversal 452 (ilustrada mediante el cuadrado discontinuo).

El orificio de entrada 410 está situado a una primera altura 402 por encima del orificio de salida 430, que define un extremo inferior del dispositivo. Planteado de otra manera, el orificio de salida 430 está situado debajo de la cámara acústica 450 o debajo del orificio de entrada 410, o en el extremo inferior 416 del dispositivo. La colocación del orificio de salida 430 debajo del orificio de entrada 410 garantiza que el flujo de fluido a través del dispositivo sea empujado de manera pasiva por la gravedad hacia el orificio de salida 430, y que se cree una carga hidráulica dentro del dispositivo. Al orificio de salida 430 también se le puede hacer referencia como orificio de reciclado de fluido ya que el fluido hospedador se recicla o devuelve desde el dispositivo al biorreactor asociado a través del orificio de salida 430. Como se ilustra en la presente, el orificio de salida 430 está situado también en un segundo extremo 414 del dispositivo, opuesto al primer extremo 412. El primer extremo 412 y el segundo extremo 414 pueden considerarse como extremos opuestos de un eje x, mientras que el extremo inferior 416 y el extremo superior 418 pueden considerarse como extremos opuestos de un eje z.

El primer orificio de recogida 470 está situado por encima de la cámara acústica 450 en el extremo superior 418 del dispositivo, y está conectado fluídicamente a la cámara acústica. El dispositivo puede incluir orificios de recogida adicionales, tales como el segundo orificio de recogida 472, el cual está separado con respecto al primer orificio de recogida 470. El primer y segundo orificios de recogida 470, 472 se usan en general para recolectar y recuperar una parte de los subproductos biomoleculares deseados del dispositivo. Un trayecto de flujo de recogida o recolección 453 conduce desde la cámara acústica a los orificios de recogida 470, 472. El trayecto de flujo de recogida tiene un área en sección transversal 454 (ilustrada mediante el cuadrado discontinuo). En algunas formas de realización particulares, el área en sección transversal 454 del trayecto de flujo de recogida es mayor que el área en sección transversal 452 del trayecto de flujo de entrada. Este es uno de los métodos mediante los cuales el caudal de fluido a través de los orificios de recogida 470, 472 se puede reducir mucho más que el caudal de fluido entrante. Cuando se usan en biofabricación con perfusión, a los orificios de recogida también se les puede hacer referencia como orificios de perfusión o recolección. Puesto que se recolecta fluido empobrecido en células y enriquecido en cuanto a productos biomoleculares deseados, restos celulares y otros residuos finos, a los orificios de recogida también se les puede hacer referencia como orificios de recolección, y al trayecto de flujo de recogida también se le puede hacer referencia como trayecto de flujo de recolección.

En esta forma de realización, la pared inferior 420 discurre desde el orificio de entrada 410 al orificio de salida 430 del dispositivo. La forma exacta de la pared inferior 420 puede variar para obtener el flujo de fluido deseado. Como se ilustra en la presente, la pared inferior 420 se curva desde el orificio de entrada 410 al orificio de salida 430 del dispositivo. Con respecto a una línea entre el orificio de entrada 410 y el orificio de salida 430, ilustrada en forma de una línea discontinua 401, la pared inferior 420 tiene una curva cóncava. Un trayecto de flujo de salida 432 conduce desde la cámara acústica 450 al orificio de salida 430.

Como se ilustra en la presente memoria, un primer transductor ultrasónico 460 está situado en una pared lateral 440 del dispositivo a una segunda altura 404 que está por encima de la primera altura 402 (es decir, más cerca del extremo superior 418 del dispositivo) y por debajo de los orificios de recogida 470, 472. Este volumen por encima de la cámara acústica 450 y por debajo de los orificios de recogida 470, 472 se identifica en la presente como zona de recolección o recogida 456. El primer transductor ultrasónico 460 incluye un material piezoeléctrico que se puede excitar mediante una señal de voltaje para crear una onda estacionaria multidimensional en la cámara acústica 450 cruzando el trayecto de flujo de recogida 453. De este modo, un campo de fuerzas de radiación acústica separa la cámara acústica 450 con respecto a los orificios de recogida 470, 472.

En la forma de realización de la figura 4, el dispositivo incluye un reflector 480 situado en una pared opuesta con respecto al primer transductor ultrasónico 460. El reflector está situado también a la segunda altura (es decir, la misma altura que el transductor). Juntos, el transductor 460 y el reflector 480 generan una onda estacionaria acústica multidimensional, según se ilustra en la figura 1.

El orificio de entrada 410, el orificio de salida 430 y los orificios de recogida 470, 472 están situados todos ellos, en esta forma de realización ilustrada, en una pared frontal 475 del dispositivo. Se contempla también que estos orificios puedan estar encarados en cualquier otra dirección, según se desee. La pared frontal 475 se ilustra aquí de manera que tiene una cara llana o plana, y tiene un grosor constante. No obstante, la forma de la pared frontal también puede variar si se desea, por ejemplo, para cambiar las áreas en sección transversal 452, 454. Finalmente, la pared posterior del dispositivo está fijada a una pieza de montaje 490, la cual contiene agujeros 492 para fijar el dispositivo de perfusión a una superficie con vistas a su funcionamiento.

En la práctica, la mezcla fluida que contiene células biológicas y moléculas más pequeñas entra en la cámara acústica 450 a través del orificio de entrada 410. Dentro de la cámara acústica, la gravedad actúa de manera que arrastra las células biológicas en sentido descendente hacia el orificio de salida 430. En la cámara acústica se produce un proceso de sedimentación pasiva, creando un fluido con una concentración relativamente alta de células biológicas en el extremo inferior 416 del dispositivo, y un fluido con una concentración relativamente menor de células biológicas en el extremo superior 418 del dispositivo. La gran mayoría de fluido entrante, y por lo tanto, la gran mayoría de la población celular no pasa nunca a través de la(s) onda(s) estacionaria(s) acústica(s). El fluido con la concentración alta de células biológicas se bombea de vuelta al biorreactor, y el fluido con la concentración relativamente baja de células biológicas (y que también contiene biomoléculas deseadas) se bombea hacia fuera y es recogido a través del(de los) orificio(s) de recogida 470, 472. La(s) onda(s) estacionaria(s) acústica(s) del dispositivo actúan de manera que evitan que cantidades significativas de células biológicas salgan a través del(de los) orificio(s) de recogida 470, 472.

En varias formas de realización, el caudal a través del trayecto de flujo de recogida o recolección 453 es al menos un orden de magnitud menor que el caudal a través del trayecto de flujo de entrada 451. En formas de realización más particulares, el caudal de la mezcla fluida que entra en el dispositivo a través del orificio de entrada es aproximadamente 1 litro por minuto (L/min) y el caudal de fluido empobrecido en células que sale del dispositivo a través del(de los) orificio(s) de recogida es aproximadamente 10 mililitros por minuto (mL/min). En algunas pruebas, biorreactores que tenían un tamaño de 2 litros a 10 litros se han sometido a prueba con soluciones que contenían hasta un 10% de levadura y hasta 50 millones de células/mL. El caudal a través del orificio de entrada ha sido desde aproximadamente 0.75 L/min a aproximadamente 3 L/min, siendo el caudal a través del trayecto de flujo de recogida (es decir, todos los orificios de recogida juntos) de aproximadamente 1 mL/min a aproximadamente 30 mL/min. Se ha alcanzado una tasa de recuperación celular del 95%.

Los dispositivos de perfusión acústica de la presente divulgación pueden filtrar densidad celulares muy altas, en torno a 100 millones de células por mL y, posiblemente, en el intervalo de aproximadamente 20 millones a aproximadamente 120 millones de células por mL, mientras que otras técnicas de filtración, tales como la ATF, únicamente pueden filtrar con densidades inferiores a 80 millones de células por mL. A diferencia de las membranas de fibra hueca, la(s) onda(s) estacionaria(s) acústica(s) también se puede(n) ajustar para permitir el paso de células si así se desea, así como el paso de residuos finos/restos. Esto puede servir como operación de limpieza para el biorreactor. Es posible un funcionamiento en estado estable, continuo, sin fluctuaciones de presión, y la corriente de producto no se acumula en el biorreactor o el dispositivo de filtración.

El dispositivo de perfusión acústica se puede realizar con materiales apropiados conocidos en la técnica. Dichos materiales incluyen polietileno de alta densidad (HDPE), otros plásticos, y potencialmente metales y vidrios. Se ha observado que es muy conveniente que el dispositivo sea transparente, de manera que se puedan confirmar visualmente el flujo de fluido y el funcionamiento del transductor ultrasónico.

La figura 5 muestra otro dispositivo de perfusión acústica 500. Esta alternativa es muy similar al dispositivo 400 representado en la figura 4. La diferencia principal es que el dispositivo de perfusión acústica 500 de la figura 5 tiene un primer transductor ultrasónico 460 en una pared lateral del dispositivo y un segundo transductor ultrasónico 562 en una pared lateral opuesta 440 del mismo en la zona de recogida 456. Planteado de otra manera, los dos transductores 460, 562 están situados en lados opuestos del trayecto de flujo de recogida 453. Con esta disposición, el reflector 580 está situado dentro de la zona de recogida 456 entre el primer y segundo transductores ultrasónicos 460, 562. Los transductores están orientados de manera que el reflector 580 y el primer y segundo transductores 460, 562 crean una(s) onda(s) estacionaria(s) multidimensional(es) en la celda de fluido 450 según se ha descrito anteriormente, o, planteado de otra manera, los transductores están encarados entre sí. También se ilustra la bomba de flujo saliente 592 fijada al orificio de salida 430 del dispositivo, que se usa para controlar el caudal de la mezcla fluida que fluye a través del dispositivo. Aquí no se ilustra la bomba fijada a los orificios de recogida (no visibles) del dispositivo de filtración 500.

Volviendo ahora a la figura 6, se muestra un sistema de procesado que incluye un biorreactor asociado 610 y un dispositivo de perfusión acústica 630 de la presente divulgación. El sistema está configurado para usarse como biorreactor de perfusión. El biorreactor 610 incluye un recipiente de reacción 620 que tiene una entrada de alimentación 622, una salida 624 y una entrada de reciclado 626. Mediante una tubería de adición 650 se adicionan medios frescos a la entrada de alimentación 622. Algunos reactores también incluirán un orificio de salida o purga (no mostrado aquí) para extraer o “purgar” células con el fin de mantener una densidad celular constante dentro de un reactor. El contenido del recipiente de reacción (numeral de referencia 605) se mezcla con un agitador 625. El producto deseado (por ejemplo, proteínas recombinantes) es producido continuamente mediante células situadas dentro del recipiente 620, y están presentes en los medios del biorreactor. El producto y las células en el biorreactor de perfusión se sacan del recipiente de reacción a través de la tubería 652, y entran en el dispositivo de perfusión acústica 630 a través del orificio de entrada 632. Allí, una parte del producto deseado se separa de las células. El producto deseado se puede sacar a través de un primer orificio de recogida 634 (el cual es un orificio de recuperación de producto) y una tubería 654 hacia un recipiente de contención 640, o, en el caso de un sistema de producción verdaderamente continuo, algún otro proceso de purificación de aguas abajo. Las células se devuelven al biorreactor de perfusión después de la separación, pasando del orificio de salida 636 (el cual es un orificio de reciclado de fluido) del dispositivo de perfusión acústica a través de la tubería 656 a la entrada de reciclado 626 del recipiente de reacción, los cuales forman un trayecto de reciclado. La(s) onda(s) estacionaria(s) multidimensional(es) del dispositivo de perfusión acústica se usan para crear una barrera de separación entre la celda de fluido del dispositivo y el orificio de recogida, de manera que, en el orificio de recogida 634, se recoge un número muy reducido de células biológicas.

La figura 7 y la figura 8 son unas vistas de otra alternativa de un dispositivo de perfusión acústica. La figura 7 es una vista frontal en sección transversal, y la figura 8 es una vista exterior en perspectiva. En especial, este dispositivo está diseñado específicamente de tal manera que se puede fabricar con técnicas de mecanización limpias, usando materiales de Clase VI (por ejemplo, HDPE de grado para dispositivos médicos), o incluso en forma de una pieza moldeada por inyección única o soldada. De esta manera, este dispositivo es un ejemplo de un dispositivo de un solo uso, el cual es estable a la radiación gamma. Los dispositivos se enjuagan para eliminar la biocarga y a continuación se irradian con rayos gamma (generalmente de 25-40 kGy) para esterilizar cualquier posible contaminación que pudiera destruir un cultivo celular sano, tal como el que está presente en un biorreactor de perfusión.

En referencia en primer lugar a la figura 7, en este dispositivo 700, el orificio de entrada 710 y el orificio de recogida 770 están situados ambos en el extremo superior 718 del dispositivo, o en la pared superior 776 del dispositivo. El orificio de salida 730 está situado en un extremo inferior 716 del dispositivo. Aquí, el orificio de entrada 710 y el orificio de salida 730 están ambos en un primer lado 712 del dispositivo. El trayecto de flujo de entrada 751 se presenta en forma de un canal 755 que discurre desde el orificio de entrada en sentido descendente hacia el extremo inferior y más allá del orificio de salida, estando separado el canal con respecto a la cámara acústica 750 (aquí, la separación se obtiene mediante una pared interna 756). El fluido fluirá en sentido descendente en el canal, a continuación, subirá hacia arriba en dirección a la cámara acústica 750. La pared inferior 720 de la cámara acústica es una superficie plana inclinada que tiene pendiente descendente en dirección al orificio de salida 730. La ubicación de los transductores ultrasónicos 760 se muestra aquí en forma de dos cuadrados, entre el extremo superior y el extremo inferior del dispositivo. El trayecto de flujo de recogida 753 está situado por encima de los transductores.

En referencia a continuación a la figura 8, el dispositivo 700 se muestra de manera que se ha formado dentro de una caja rectangular tridimensional 706. Puede observarse que el orificio de salida 730 en el extremo inferior 716 del dispositivo está situado en una pared frontal 775. Nuevamente, el orificio de recogida 770 y el orificio de entrada 710 están situados en una pared superior 776. En la pared frontal está presente una ventana de observación 708 realizada con un material transparente. A través de esa ventana de observación, puede verse que los transductores ultrasónicos están montados en la pared posterior 778 de la caja del dispositivo. La ventana de observación actúa como reflector para generar las ondas estacionarias acústicas multidimensionales.

La figura 9 y la figura 10 son vistas de todavía otra alternativa de un dispositivo de perfusión acústica. La figura 9 es una vista frontal en sección transversal, y la figura 10 es una vista en perspectiva.

En referencia en primer lugar a la figura 9, en este dispositivo 900, hay un orificio de entrada 910 presente en un lado frontal 975 del dispositivo a lo largo del primer lado 912 del dispositivo. Un orificio de salida 930 (que se observa mejor en la figura 10) está situado directamente en oposición y a la misma altura que el orificio de entrada 910, y está situado también en el primer lado 912. En este dispositivo, hay una corriente de fluido principal que fluye casi directamente desde el orificio de entrada 910 al orificio de salida 930, y el trayecto de flujo de entrada 951 desvía únicamente un pequeño flujo lateral hacia la cámara acústica 950 desde el primer lado 912 del dispositivo. Orificio de recogida 970 está situado en el extremo superior 918 del dispositivo, o en la pared superior 976 del dispositivo. Un orificio de salida secundario 980 está situado también en el primer lado 912 del dispositivo, prolongándose desde la primera pared lateral 979, y situado por debajo del orificio de entrada 910, y puede actuar como orificio de purga. La pared inferior 920 de la cámara acústica tiene forma de tipo pirámide estrechándose gradualmente en sentido descendente hasta un vértice. Una línea de drenaje 981 discurre desde la parte inferior de la cámara acústica 950 al orificio de salida secundario 980. Se contempla que aquí el orificio de salida secundario se pueda usar para capturar un pequeño flujo de células altamente concentradas, las cuales o bien se pueden descartar (purga celular) o bien se pueden devolver también de vuelta al biorreactor.

En referencia a continuación a la figura 10, la pared frontal 975 del dispositivo tiene un espacio rectangular 960, y la pared posterior 978 del dispositivo tiene un espacio rectangular 962. Se contempla que, en estos dos espacios rectangulares 960/962, puedan colocarse un transductor y un reflector en cualquier orientación, o que pudieran colocarse dos transductores en los dos espacios rectangulares. Tanto el orificio de entrada 910 como el orificio de salida 930 son visibles en esta vista. El orificio de entrada 910 está situado en el lado frontal del dispositivo, y el orificio de salida 930 está situado en el lado posterior del dispositivo (aunque esto podría invertirse si así se desease). El trayecto de flujo de clarificación 953 está situado por encima de los transductores. Aunque no se representa en este caso, en el segundo lado 914 del dispositivo podría fijarse una pieza similar a la de la figura 4.

Las figuras 43-45 son unas vistas de una forma de realización ejemplificativa de un dispositivo de perfusión acústica que comprende las características de la invención reivindicada en la presente memoria. La figura 43 es una vista en perspectiva, la figura 10 es una imagen que muestra una vista frontal y la figura 45 es una vista lateral. La figura 46A/B y la figura 46C/D son vistas frontales esquemáticas de posibles disposiciones interiores del dispositivo. La figura 46Ay la figura 46B son idénticas, y se usan debido a la gran cantidad de numerales de referencia. La figura 46C y la figura 46D son también idénticas.

En referencia a continuación a las figuras 43-45, en este dispositivo 4300, el orificio de entrada 4310 y el orificio de salida 4330 están situados ambos en el extremo inferior 4316 del dispositivo, y el orificio de recogida 4370 está situado en el extremo superior 4318 del dispositivo. El orificio de entrada 4310 está situado en un primer lado 4312 del dispositivo, y el orificio de salida 4330 está situado en un segundo lado 4314 del dispositivo. En la figura 43, el orificio de salida 4330 está fijado a una bomba 4305, que crea un flujo a través del dispositivo 4300. Una ventana de observación 4308 está presente en la pared frontal 4375 del dispositivo. La pared frontal 4375, la pared superior 4376, la pared posterior 4378 y la primera pared lateral 4379 son parte de la caja 4306 que rodea el interior del dispositivo.

En referencia a continuación a la figura 43 y a la figura 45, el transductor ultrasónico 4360 está situado en la pared posterior 4378 en el extremo superior 4318 del dispositivo. La ventana de observación 4308 actúa como reflector para generar las ondas estacionarias acústicas multidimensionales.

En esta forma de realización, una tubería de recirculación 4340 conecta el orificio de entrada 4310 directamente al orificio de salida 4330, y forma un trayecto de flujo de recirculación (flecha 4356) a través del cual se pueden hacer recircular continuamente medios de cultivo celular que contienen células y otros materiales a través del dispositivo de perfusión sin entrar en la cámara acústica 4350. La tubería de recirculación 4340 y el trayecto de flujo de recirculación 4356 están situados por debajo de la cámara acústica 4350.

Un paso de entrada 4380 y un paso de salida 4390 conectan la cámara acústica 4350 a la tubería de recirculación 4340, y separan una parte del flujo de medios de cultivo celular con respecto a la tubería de recirculación hacia la cámara acústica. La flecha 4351 indica el trayecto de flujo de entrada, y la flecha 4355 indica el trayecto de flujo de salida. Estos dos pasos son particularmente visibles en la figura 44. Planteado de otra manera, el trayecto de flujo de entrada discurre a través de un camino diferente que el trayecto de flujo de salida. Esto crea un flujo de recirculación secundario que es tangencial a la interfaz acústica, y permite una recirculación constante de células por debajo de esta interfaz acústica, discurriendo en la misma dirección neta que el trayecto de flujo de recirculación 4356.

La geometría del paso de entrada 4380 y el paso de salida 4390 puede afectar al perfil de flujo a través de la cámara acústica. La figura 46A y la figura 46C son vistas frontales que muestran dos estructuras internas diferentes que dan como resultado perfiles de flujo diferentes. En estas dos figuras, el orificio de entrada 4310 está a la derecha, y el orificio de salida 4330 está a la izquierda.

Considerando, en primer lugar, la figura 46A y la figura 46B, se muestra la cámara acústica 4350, mostrándose el transductor ultrasónico 4360 con una línea discontinua. La cámara acústica 4350 incluye una primera pared lateral 4362 y una segunda pared lateral 4364. El paso de entrada 4380 también tiene una primera pared 4381 y una segunda pared 4382, extendiéndose la primera pared 4381 más allá de la primera pared lateral 4362, o más cerca del orificio de entrada 4310. El área inferior en sección transversal del paso de entrada (adyacente a la tubería de recirculación 4340) se indica mediante el numeral de referencia 4384, y el área superior en sección transversal del paso de entrada (adyacente a la cámara acústica 4350) se indica mediante el numeral de referencia 4383. En formas de realización, el área superior en sección transversal del paso de entrada es mayor que el área inferior en sección transversal del paso de entrada.

El paso de salida 4390 tiene también una primera pared 4391 y una segunda pared 4392. La primera pared 4391 y la segunda pared 4392 se estrechan progresivamente en aproximación mutua desde la cámara acústica 4350 a la tubería de recirculación 4340. El área inferior en sección transversal del paso de salida (adyacente a la tubería de recirculación 4340) se indica mediante el numeral de referencia 4394, y el área superior en sección transversal del paso de salida (adyacente a la cámara acústica 4350) se indica mediante el numeral de referencia 4393. En formas de realización, el área superior en sección transversal del paso de salida es mayor que el área inferior en sección transversal del paso de salida.

Cabe señalar que el área superior en sección transversal 4393 del paso de salida es mayor que el área superior en sección transversal 4383 del paso de salida. El área inferior en sección transversal 4394 del paso de salida es también menor que el área inferior en sección transversal 4384 del paso de salida. De manera deseable, esto fomenta que la dirección correspondiente a células y otros materiales mayores entre en la cámara acústica 4350, y maximiza su oportunidad de salir de la cámara acústica en la misma dirección que el flujo de recirculación principal.

A continuación, considerando la figura 46C y la figura 46D, la primera pared 4381 del paso de entrada 4380 está esencialmente alineada con la primera pared lateral 4362. La segunda pared 4382 es vertical igual que la primera pared lateral, y a continuación se ensancha por la parte superior. El área superior en sección transversal 4383 del paso de entrada es mayor que el área inferior en sección transversal 4384 del paso de entrada. La primera pared 4391 del paso de salida 4390 se estrecha progresivamente en sentido descendente, y a continuación se hace vertical. La segunda pared 4392 se estrecha progresivamente hacia dentro desde la segunda pared lateral 4364 hasta la tubería de recirculación 4340. Nuevamente, el área superior en sección transversal 4393 del paso de salida es mayor que el área inferior en sección transversal 4394 del paso de salida. En la figura 46C, el área superior en sección transversal 4393 del paso de salida sigue siendo mayor que el área superior en sección transversal 4383 del paso de entrada. El área inferior en sección transversal 4394 del paso de salida puede ser aproximadamente igual o menor que el área inferior en sección transversal 4384 del paso de entrada.

Las figuras 47-49 son unas vistas de todavía otra forma de realización ejemplificativa de un dispositivo de perfusión acústica. La figura 47 es una vista en perspectiva, la figura 48 es una vista lateral. La figura 49 es una vista esquemática frontal de la disposición interior del dispositivo.

En referencia a continuación a las figuras 47-49, en este dispositivo 4700, el orificio de entrada 4710 y el orificio de salida 4730 están situados ambos en el extremo inferior 4716 del dispositivo, y el orificio de recogida 4770 está situado en el extremo superior 4718 del dispositivo. El orificio de entrada 4710 está situado en la pared frontal 4775 del dispositivo, y el orificio de salida 4730 está situado en la pared posterior 4778 del dispositivo. En la figura 47, el orificio de salida 4730 está fijado a una bomba 4705, la cual crea flujo a través del dispositivo 4700. En la pared frontal 4775 del dispositivo hay presente una ventana de observación 4708. La pared frontal 4775, la pared superior 4776 y la pared posterior 4778 son parte de la caja 4706 que rodea el interior del dispositivo.

En referencia a continuación a la figura 47 y la figura 48, el transductor ultrasónico 4760 está situado en la pared posterior 4778 en el extremo superior 4718 del dispositivo. La ventana de observación 4708 actúa como reflector para generar las ondas estacionarias acústicas multidimensionales.

Nuevamente, una tubería de recirculación 4740 conecta el orificio de entrada 4710 directamente al orificio de salida 4730, y forma un trayecto de flujo de recirculación (flecha 4756) a través del cual se pueden hacer recircular continuamente medios de cultivo celular que contienen células y otros materiales a través del dispositivo de perfusión sin entrar en la cámara acústica 4750. La tubería de recirculación 4740 y el trayecto de flujo de recirculación 4756 están situados por debajo de la cámara acústica 4750.

Esta forma de realización difiere con respecto a la de la figura 43 en que solamente un único paso 4772 conecta la cámara acústica 4750 a la tubería de recirculación 4740, en lugar de los dos pasos independientes (4380, 4390) de la figura 43. En referencia a continuación a la figura 49, la flecha 4751 indica el trayecto de flujo de entrada, y la flecha 4755 indica el trayecto de flujo de salida, discurriendo ambos a través del paso único. Esto sigue dando como resultado un flujo de recirculación secundario que es tangencial a la interfaz acústica, y permite una recirculación constante de células debajo de esta interfaz acústica, que discurren en la misma dirección neta que el trayecto de flujo de recirculación 4756.

A continuación, puede resultar útil describir el(los) transductor(es) ultrasónico(s) usado(s) en el dispositivo de filtración acústica de manera más detallada. La figura 11 es un diagrama en sección transversal de un transductor ultrasónico convencional. Este transductor tiene una placa de desgaste 50 en un extremo inferior, una capa de epoxi 52, un elemento piezoeléctrico cerámico 54 (realizado, por ejemplo, con Titanato Circonato de Plomo (PZT)), una capa de epoxi 56 y una capa de respaldo 58. A cada lado del elemento piezoeléctrico cerámico, hay un electrodo: un electrodo positivo 61 y un electrodo negativo 63. La capa de epoxi 56 fija la capa de respaldo 58 al elemento piezoeléctrico 54. El conjunto completo está contenido en una caja 60 la cual se puede realizar, por ejemplo, con aluminio. La caja se usa como electrodo de tierra. Un adaptador eléctrico 62 proporciona conexión para cables de manera que pasen a través de la caja y se conecten a conductores (no mostrados) que se fijan al elemento piezoeléctrico 54. Típicamente, se diseñan capas de respaldo de manera que añadan amortiguamiento y creen un transductor de banda ancha con desplazamiento uniforme sobre una banda amplia de frecuencia y las mismas están diseñadas para suprimir la excitación de modos propios de vibración particulares del elemento piezoeléctrico. Las placas de desgaste se diseñan habitualmente en forma de transformadores de impedancia para adaptarse mejor a la impedancia característica del medio hacia el cual radia el transductor.

La figura 12 es una vista en sección transversal de un transductor ultrasónico 81 de la presente divulgación, el cual se usa en el dispositivo de filtración acústica de la presente divulgación. El transductor 81 tiene forma de cuadrado, y tiene una caja de aluminio 82. La caja de aluminio tiene un extremo superior y un extremo inferior. La caja del transductor también puede estar compuesta por plástico, tal como HDPE de grado médico u otros metales. El elemento piezoeléctrico es una masa de cerámica de perovskita, consistiendo cada una de ellas en un ion metálico tetravalente, pequeño, habitualmente titanio o circonio, en una retícula de iones metálicos divalentes, de mayor tamaño, habitualmente plomo o bario, e iones O2-. Como ejemplo, un elemento piezoeléctrico de PZT (titanato circonato de plomo) 86 define el extremo inferior del transductor, y queda expuesto desde el exterior del extremo inferior de la caja. El elemento piezoeléctrico se sustenta en su perímetro mediante una capa elástica pequeña 98, por ejemplo, epoxi, silicona o un material similar, situada entre el elemento piezoeléctrico y la caja. Planteado de otra manera, no hay presencia de ninguna placa de desgaste o material de respaldo. No obstante, en algunas formas de realización, hay una capa de plástico u otro material que separa el elemento piezoeléctrico con respecto al fluido en el que se está generando la onda estacionaria acústica. El elemento / cristal piezoeléctrico tiene una superficie exterior (que está expuesta) y también una superficie interior.

Los tornillos 88 fijan una placa superior de aluminio 82a de la caja al cuerpo 82b de la caja por medio de roscas. La placa superior incluye un conector 84 para alimentar el transductor. La superficie superior del elemento piezoeléctrico de PZT 86 está conectada a un electrodo positivo 90 y a un electrodo negativo 92, los cuales están separados por un material aislante 94. Los electrodos se pueden realizar a partir de cualquier material conductor, tal como plata o níquel. Se proporciona alimentación eléctrica al elemento piezoeléctrico de PZT 86 a través de los electrodos del elemento piezoeléctrico. Obsérvese que el elemento piezoeléctrico 86 no tiene ninguna capa de respaldo o capa de epoxi. Planteado de otra manera, hay un volumen interior o un espacio de aire 87 en el transductor entre la placa superior de aluminio 82a y el elemento piezoeléctrico 86 (es decir, el espacio de aire está completamente vacío). En algunas formas de realización, como se observa en la figura 13, se puede proporcionar un respaldo mínimo 58 y/o una placa de desgaste 50.

El diseño del transductor puede afectar al rendimiento del sistema. Un transductor típico es una estructura estratificada con el elemento piezoeléctrico cerámico unido a una capa de respaldo y a una placa de desgaste. Puesto que el transductor se carga con la elevada impedancia mecánica que presenta la onda estacionaria, los tradicionales métodos de fabricación y directrices de diseño para placas de desgaste, por ejemplo, grosor de media longitud de onda para aplicaciones de ondas estacionarias o grosor de un cuarto de longitud de onda para aplicaciones de radiación, pueden no resultar apropiados. Al contrario, en una de las formas de realización de la presente divulgación en los transductores no hay ninguna placa de desgaste o respaldo, permitiendo que el elemento piezoeléctrico vibre en uno de sus modos propios con un alto factor Q, o en una combinación de varios modos propios. El elemento/disco piezoeléctrico cerámico en vibración está expuesto directamente al fluido que fluye a través de la celda de fluido.

La eliminación del respaldo (por ejemplo, haciendo que el dorso del elemento piezoeléctrico sea aire) permite también que el elemento piezoeléctrico cerámico vibre con modos de vibración de orden superior y con poca amortiguación (por ejemplo, desplazamiento modal de orden superior). En un transductor que tenga un elemento piezoeléctrico con un respaldo, el elemento piezoeléctrico vibra con un desplazamiento más uniforme, como un pistón. La eliminación del respaldo permite que el elemento piezoeléctrico vibre en un modo de desplazamiento no uniforme. Cuanto mayor sea el orden de la forma nodal del elemento piezoeléctrico, más líneas nodales tendrá el elemento piezoeléctrico. El desplazamiento modal de orden superior del elemento piezoeléctrico crea más líneas de captura, aunque la correlación de una línea de captura con un nodo no es necesariamente de uno a uno, y la excitación del elemento piezoeléctrico a una frecuencia mayor no producirá necesariamente más líneas de captura.

Se contempla que, en algunos dispositivos de filtración acústica, el elemento piezoeléctrico pueda tener un respaldo que afecte mínimamente al factor Q del elemento piezoeléctrico (por ejemplo, menos del 5%). El respaldo se puede realizar con un material de manera sustancial acústicamente transparente, tal como madera de balsa, espuma o corcho, que permita que el elemento piezoeléctrico vibre en una forma modal de orden superior y mantenga un alto factor Q al tiempo que proporcionando todavía cierto soporte mecánico para el elemento piezoeléctrico. La capa de respaldo puede ser un sólido, o puede ser una retícula que tenga agujeros a través de la capa, de tal manera que la retícula siga los nodos del elemento piezoeléctrico que está vibrando en un modo de vibración de orden superior particular, proporcionando soporte en posiciones de los nodos al tiempo que permitiendo el reposo del elemento piezoeléctrico para vibrar libremente. El objetivo de la tarea de la retícula o del material acústicamente transparente es proporcionar soporte sin reducir el factor Q del elemento piezoeléctrico o interferir con la excitación de una forma modal particular.

La colocación del elemento piezoeléctrico en contacto directo con el fluido contribuye también al elevado factor Q evitando los efectos de amortiguación y absorción de energía de la capa de epoxi y la capa de desgaste. Otras formas de realización del(de los) transductor(es) pueden tener placas de desgaste o una superficie de desgaste para evitar que el PZT, que contiene plomo, entre en contacto con el fluido hospedador. Esto puede ser deseable, por ejemplo, en aplicaciones biológicas tales como separación de sangre, perfusión biofarmacéutica o filtración, por lotes alimentados, de células de mamífero. Dichas aplicaciones podrían usar una capa de desgaste, tal como cromo, níquel electrolítico o níquel no electrolítico. También podría usarse deposición química de vapor para aplicar una capa de poli(p-xilileno) (por ejemplo, Parylene) u otro polímero. Como superficie de desgaste también son utilizables recubrimientos orgánicos y biocompatibles, tales como silicona o poliuretano. También se pueden usar películas delgadas, tales como una película de PEEK, como cubierta de la superficie del transductor expuesta al fluido con la ventaja de ser un material biocompatible. En una de las formas de realización, la película de PEEK se pega a la cara del piezomaterial usando adhesivo sensible a la presión (PSA). Asimismo, pueden usarse otras películas.

Para aplicaciones tales como separación por emulsión de aceite/agua y otras, tales como perfusión, el transductor ultrasónico tiene una frecuencia de resonancia nominal de 2 MHz. Cada transductor puede consumir aproximadamente 28 W de potencia para la captura de gotitas con un caudal de 3 GPM. Esto se traduce en un coste de energía de 0.25 kW h/m3. Esto es una indicación del coste de energía tan bajo de esta tecnología. De manera deseable, cada transductor se alimenta y controla mediante su propio amplificador. En otras alternativas, el transductor ultrasónico usa un elemento piezoeléctrico cuadrado, por ejemplo, con dimensiones de 1”x1” . Alternativamente, el transductor ultrasónico puede usar un elemento piezoeléctrico rectangular, por ejemplo, con dimensiones de 1”x2.5” . La disipación de potencia por transductor fue de 10 W por área en sección transversal de transductor de 1”x1” y por pulgada de extensión de la onda estacionaria acústica con el fin de obtener suficientes fuerzas de captura acústica. Para una extensión de 4'' de un sistema de escala intermedia, cada transductor cuadrado de 1”x1” consume 40 W. El transductor rectangular más grande de 1''x 2.5'' usa 100 W en un sistema de escala intermedia. La matriz de tres transductores cuadrados de 1''x1'' consumiría un total de 120 W y la matriz de dos transductores de 1''x2.5'' consumiría aproximadamente 200 W. Matrices de transductores con una separación pequeña representan posibles formas de realización alternativas de la tecnología. El tamaño, la forma, el número y la posición de los transductores se pueden cambiar según se desee para generar patrones deseados de ondas estacionarias acústicas multidimensionales.

El tamaño, la forma y el grosor del transductor determinan el desplazamiento del transductor a diferentes frecuencias de excitación, lo cual a su vez afecta a la eficiencia de la separación. Típicamente, el transductor se hace funcionar a frecuencias cerca de la frecuencia de resonancia en grosor (mitad de longitud de onda). Típicamente, gradientes en el desplazamiento del transductor dan como resultado más posiciones de captura para las células/biomoléculas. Desplazamientos modales de orden superior generan ondas estacionarias acústicas tridimensionales con gradientes fuertes en el campo acústico en todas las direcciones, creando así fuerzas de radiación acústica igualmente fuertes en todas las direcciones, lo cual conduce a múltiples líneas de captura, donde el número de las líneas de captura está en correlación con la forma modal particular del transductor.

Para investigar el efecto del perfil de desplazamiento del transductor sobre la fuerza de captura acústica y las eficiencias de separación, se repitió un experimento 10 veces usando un transductor cuadrado de 1''x1'', con todas las condiciones idénticas excepto para la frecuencia de excitación. Como frecuencias de excitación se usaron diez frecuencias de resonancia acústica consecutivas, indicadas con los números dentro de un círculo 1-9 y la letra A en la figura 14. Las condiciones fueron duración del experimento de 30 minutos, una concentración de aceite de 1000 ppm correspondiente a gotitas de aceite SAE-30 de aproximadamente 5 micras, un caudal de 500 ml/min y una potencia aplicada de 20 W. Se usaron gotitas de aceite debido a que el aceite es menos denso que el agua, y puede separarse de esta última usando acustoforesis.

La figura 14 muestra la amplitud medida de la impedancia eléctrica de un transductor cuadrado en función de la frecuencia en las proximidades de la resonancia de 2.2 MHz del transductor. Los mínimos en la impedancia eléctrica del transductor se corresponden con resonancias acústicas de la columna de agua y representan posibles frecuencias para el funcionamiento. Existen resonancias adicionales en otras frecuencias en las que se excitan ondas estacionarias multidimensionales. Un modelado numérico ha indicado que el perfil de desplazamiento del transductor varía significativamente en estas frecuencias de resonancia acústicas, y por lo tanto afecta directamente a la onda estacionaria acústica y a la fuerza de captura resultante. Puesto que el transductor funciona cerca de su resonancia en grosor, los desplazamientos de las superficies de los electrodos están esencialmente fuera de fase. El desplazamiento típico de los electrodos de los transductores no es uniforme y varía en función de la frecuencia de excitación. Como ejemplo, en una frecuencia de excitación con una única línea de gotitas de aceite capturadas, el desplazamiento tiene un único máximo en la parte central del electrodo y mínimos cerca de los bordes del transductor. En otra frecuencia de excitación, el perfil del transductor tiene múltiples máximos que derivan en múltiples líneas capturadas de gotitas de aceite. Patrones de desplazamiento del transductor de orden superior dan como resultado mayores fuerzas de captura y múltiples líneas de captura estables para las gotitas de aceite capturadas.

A medida que la emulsión de aceite-agua pasaba por el transductor, se observaron y se caracterizaron las líneas de captura de las gotitas de aceite. La caracterización implicó la observación y el patrón del número de líneas de captura que atraviesan el canal de fluido, según se muestra en la figura 15, para siete de las diez frecuencias de resonancia identificadas en la figura 14. Perfiles de desplazamiento diferentes del transductor pueden producir diferentes (más) líneas de captura en las ondas estacionarias, mientras que más gradientes en el perfil de desplazamiento en general crean fuerzas de captura mayores y más líneas de captura.

La figura 16 es un modelo numérico que muestra un campo de presión que se corresponde con el patrón de 9 líneas de captura. El modelo numérico es un modelo bidimensional; y por lo tanto se observan solamente tres líneas de captura. En la tercera dimensión perpendicular al plano de la página existen dos conjuntos más de tres líneas de captura.

La fuerza lateral de la fuerza de radiación acústica generada por el transductor se puede aumentar excitando el transductor en formas modales de orden superior, en contraposición a una forma de vibración en la que el cristal se mueve efectivamente como un pistón que tiene un desplazamiento uniforme. La presión acústica es proporcional al voltaje de excitación del transductor. La potencia eléctrica es proporcional al cuadrado del voltaje. Típicamente, el transductor es una placa piezoeléctrica delgada, con campo eléctrico en el eje z y desplazamiento principal en el eje z. Típicamente, el transductor se acopla en un lado con aire (es decir, el espacio de aire dentro del transductor) y en el otro lado con la mezcla fluida de los medios de cultivo celular. Los tipos de ondas generadas en la placa se conocen como ondas compuestas. Uno de los subconjuntos de ondas compuestas en la placa piezoeléctrica es similar a las ondas de Lamb simétricas con fugas (a las que se hace referencia también como de compresión o de extensión). La naturaleza piezoeléctrica de la placa da como resultado típicamente la excitación de ondas de Lamb simétricas. Las ondas son con fugas debido a que radian hacia la capa de agua, lo cual da como resultado la generación de las ondas estacionarias acústicas en la capa de agua. Existen ondas de Lamb en placas delgadas de extensión infinita con condiciones libres de esfuerzos en sus superficies. Debido a que los transductores de esta forma de realización son finitos en cuanto a su naturaleza, los desplazamientos modales reales son más complicados.

La figura 17 muestra la variación típica del desplazamiento en el plano (desplazamiento en x) y el desplazamiento fuera de plano (desplazamiento en y) a través del grosor de la placa, siendo el desplazamiento en el plano una función par a través del grosor de la placa y siendo el desplazamiento fuera de plano una función impar. Debido al tamaño finito de la placa, los componentes del desplazamiento varían a lo largo de la anchura y la longitud de la placa. En general, un modo (m, n) es un modo de desplazamiento del transductor en el que hay m ondulaciones en el desplazamiento del transductor en la dirección de la anchura y n ondulaciones en la dirección de la longitud, y con la variación de grosor que se describe en la figura 17. El número máximo de m y n es una función de la dimensión del cristal y la frecuencia de excitación. Existen modos tridimensionales adicionales que no son de la forma (m,n).

Los transductores se excitan de manera que el elemento piezoeléctrico vibre en modos de orden superior de la fórmula general (m, n), donde m y n son independientemente 1 ó mayores. En general, los transductores vibrarán en modos de orden superior a (2,2). Los modos de orden superior producirán más nodos y antinodos, resultantes en ondas estacionarias tridimensionales en la capa de agua, caracterizadas por gradientes fuertes en el campo acústico en todas las direcciones, no solamente en la dirección de las ondas estacionarias, sino también en las direcciones laterales. Como consecuencia, los gradientes acústicos dan como resultado fuerzas de captura de mayor intensidad en la dirección lateral.

En formas de realización, la señal de voltaje que excita al transductor puede tener una forma de onda sinusoidal, cuadrada, de dientes de sierra, de impulsos o triangular; y puede tener una frecuencia de 500 kHz a 10 MHz. La señal de voltaje se puede excitar con una modulación por anchura de impulsos, la cual produce cualquier forma de onda deseada. La señal de voltaje también puede tener capacidad de inicio/parada de modulación en amplitud o frecuencia para eliminar la formación de corrientes.

Los transductores se usan para crear un campo de presión que genera fuerzas de radiación acústica del mismo orden de magnitud tanto ortogonales a la dirección de la onda estacionaria como en la dirección de la onda estacionaria. Cuando las fuerzas son aproximadamente del mismo orden de magnitud, las partículas de tamaño 0.1 micra a 300 micras se moverán más eficazmente hacia las “ líneas de captura”, de manera que las partículas no pasarán a través del campo de presión y continuarán saliendo a través de los orificios de recogida del dispositivo de filtración. Por el contrario, las partículas permanecerán dentro de la cámara acústica para ser recicladas de vuelta al biorreactor.

En aplicaciones biológicas, se contempla que todas las partes del sistema (es decir, el biorreactor, el dispositivo de filtración acústica, tubos que conectan fluídicamente los mismos, etcétera) se puedan separar entre sí y que sean desechables. La evitación de centrífugas y filtros permite una mejor separación de las células CHO sin reducir la viabilidad de las mismas. Los transductores también se pueden excitar para crear cambios rápidos de presión con el fin de evitar o despejar bloqueos debidos a la aglomeración de células CHO. La frecuencia de los transductores también se puede variar para obtener una eficacia óptima para una potencia dada.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar los dispositivos, componentes y métodos de la presente divulgación. Los ejemplos son meramente ilustrativos y no están destinados a limitar la divulgación a los materiales, condiciones o parámetros de proceso expuestos en los mismos.

Ejemplos

Ejemplo 1

La figura 18 muestra una configuración experimental para un dispositivo de perfusión acústica según se ha descrito de manera detallada anteriormente. Este dispositivo de perfusión acústica es muy similar al ilustrado en la figura 5, excepto que la pared inferior no es curvada, sino que discurre en cambio horizontalmente a partir del primer extremo y a continuación se sitúa en ángulo directamente hacia el orificio de salida. Hay conectados tubos al orificio de entrada, al orificio de salida y a los dos orificios de recogida. También hay una bomba conectada de manera visible fluídicamente al orificio de salida.

La figura 19 es una imagen de otro dispositivo de perfusión acústica de la presente divulgación, similar a la forma de realización mostrada en la figura 5, con dos transductores ultrasónicos y una pared inferior cóncava que va desde el orificio de entrada al orificio de salida en el extremo inferior del dispositivo. En el dispositivo también hay presencia de una mezcla fluida que contiene células. En esta imagen, se crean ondas estacionarias acústicas en la zona de recogida entre el reflector y el primer y segundo transductores según se ha descrito anteriormente. El campo acústico generado de este modo se indica mediante ondas y el numeral de referencia 1664. El patrón de flujo de la mezcla fluida a través del dispositivo desde el orificio de entrada al orificio de salida se muestra con una flecha (numeral de referencia 1610) que indica la dirección de flujo de fluido al dispositivo y flechas (numeral de referencia 1630) que indican la dirección del flujo de fluido a través del dispositivo hacia el orificio de salida. Finalmente, el patrón de flujo general del producto deseado fuera del dispositivo a través del primer y segundo orificios de recogida se muestra con flechas (numeral de referencia 1670) que indican la dirección del flujo.

La separación acusticoforética se ha sometido a prueba usando el dispositivo de perfusión acústica de la figura 19 y los métodos de separación de la presente divulgación sobre diferentes líneas de células de ovario de hámster chino (CHO). Las figuras 20-28 muestran diversos resultados de prueba variando diferentes parámetros y midiendo valores diferentes con el uso de un Analizador de Viabilidad Celular Beckman Coulter.

Los caudales de perfusión con el dispositivo de filtración acústica fueron de aproximadamente 2 mL/min a aproximadamente 10 mL/min, o los caudales fueron de aproximadamente 1 VVD a aproximadamente 5 VVD para un biorreactor con volumen de trabajo de 2.7 L. VVD se refiere al “volumen de recipientes por día”, o cuántas veces se somete a un ciclo el volumen del recipiente del biorreactor a través del dispositivo de filtración acústica en un día. El caudal de perfusión (Qp) se recogió a través de los orificios de perfusión. Por contraposición, los caudales de alimentación (Qf) fueron de aproximadamente 40 mL/min a aproximadamente 200 mL/min.

La solución de alimentación tenía una densidad de células CHO de partida de 50x106 células/mL. El tamaño del reactor era de 2.7 L y el volumen de alimentación del fluido hospedador era de 1.5 L. En total, se llevó a cabo una serie de siete pruebas (T1-T7) para estudiar el efecto de la variación del VVD y la distribución del flujo en un reactor de volumen 2.7 L. Los parámetros correspondientes a las pruebas se muestran en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1: Resultados del sistema para un reactor de 2.7 L y un volumen de alimentación de 1.5 L

Los resultados incluyeron una eficiencia de clarificación celular de entre 89-93% con un voltaje DC de 47 V, independientemente del caudal según se muestra en la figura 20. Cabe señalar que el voltaje DC para T1 se fijó a 60 V, mientras que para las pruebas T2-T7 el voltaje DC se redujo a una cantidad fija de 45 V. Se estima que la amplitud del voltaje del transductor es aproximadamente la mitad de estos valores.

Los resultados incluyeron además una reducción de turbidez del perfundido del 90-94% en comparación con la alimentación, según se muestra en la figura 21. Esta figura muestra la turbidez de la alimentación, el fluido recirculado (Qc) y el perfundido (Qp). La alimentación entró en el orificio de entrada, el fluido recirculado salió del orificio de salida y se hizo recircular, y el perfundido salió del orificio de perfusión del dispositivo de filtración acústica. Cabe señalar que las mediciones de turbidez para las pruebas T1 y T2 dieron como un resultado un error de hardware, con lo que se presentan únicamente las pruebas T3-T7, que equivalían a una turbidez del 6-10% en la corriente de perfusión con respecto a la corriente de alimentación, independientemente del caudal.

La figura 22 se generó con un Analizador de Viabilidad Celular Beckman Coulter y reveló una viabilidad celular para cada caudal que se situaba dentro del error del instrumento (es decir, ± 6%), con el control situándose entre el 79-84% en todas las pruebas.

Se llevaron a cabo pruebas adicionales usando una solución designada como “Línea CHO A”. La solución tenía una densidad celular de partida de 50x10® células/mL, una turbidez de 2,400 NTU y una viabilidad celular de aproximadamente el 80%. Solución se separó usando un dispositivo de la presente divulgación en un sistema que tenía un tamaño de reactor de 2.7 L. El volumen del fluido de alimentación estaba entre 1.5 L y 2.0 L. Los caudales perfundidos oscilaban de 2 mL/min a 10 mL/min, o de 1 a 5 VVD. Se llevó a cabo una serie de seis pruebas para estudiar el efecto de variación del VVD y la distribución del flujo sobre el rendimiento de filtración acústica para el reactor de volumen 2.7 L. Los parámetros correspondientes a las pruebas se muestran en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2: Resultados del sistema para un reactor de 2.7 L y un volumen de alimentación de 1.5 L - 2.0 L

La figura 23 muestra la densidad celular total medida del flujo de alimentación, el flujo de recirculación y el flujo perfundido. La retención celular del biorreactor para las pruebas muestra una eficiencia de perfusión de aproximadamente el 90%. La figura 24 muestra la viabilidad celular medida para las pruebas, no revelando ningún cambio significativo en la viabilidad a lo largo de las pruebas.

A continuación, se llevaron a cabo pruebas adicionales usando una solución designada como “Línea CHO B”. La solución tenía una densidad celular de partida de 75x10® células/mL, una turbidez de 2,300 NTU y una viabilidad celular de aproximadamente el 80%. La solución se separó usando un dispositivo de la presente divulgación en un sistema que tenía un tamaño de reactor de 2.7 L. Se llevaron a cabo cuatro pruebas (T1-T4). Dos de las pruebas (T1, T3) usaron un dispositivo que tenía un único transductor. Las otras dos pruebas (T2, T4) usaron un dispositivo que tenía dos transductores en serie (de tal manera que el fluido discurría a través de ambas ondas estacionarias). Los parámetros correspondientes a las pruebas se muestran en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3: Resultados del sistema para un reactor de 2.7 L y un volumen de alimentación de 1.5 L- 2.0 L

La figura 25 muestra la densidad celular total medida de los flujos de alimentación, recirculación y perfusión. La retención celular del biorreactor para las pruebas muestra una eficiencia de perfusión superior al 90%. Resultados evidenciaron además una eficiencia mayor en aproximadamente un 3-5% cuando se usaban dos transductores en lugar de un único transductor. La figura 2® muestra la viabilidad celular medida para las pruebas, no revelando

2®

ningún cambio significativo en la viabilidad a lo largo de las pruebas. Hablando en términos prácticos, el funcionamiento con un bajo VVD ofrece una serie de ventajas, tales como la reducción de costes en los medios.

Ejemplo 2

La figura 27 muestra otra configuración experimental para un dispositivo de perfusión acústica similar al ilustrado en la figura 8. Se conectan tubos al orificio de entrada, al orificio de salida y al orificio de recogida.

El dispositivo se sometió a prueba con un voltaje del transductor de 40 V de pico a pico, un caudal perfundido de 15-30 mL/min y un caudal de recirculación de 2 L/min. Se tomaron muestras cada 45-60 minutos, y se determinó la tasa de retención celular. La figura 28 muestra los resultados. El eje y es la retención, expresada en términos de porcentaje (calculado al comparar el contaje de células de salida con el contaje de células de entrada, o del biorreactor/cultivo). El eje x es tanto el voltaje DC aplicado (en V) como el caudal de perfundido, o recolección (en mL/min); es meramente una coincidencia que el intervalo de valores numéricos para V y mL/min sea el mismo. La eficiencia de retención celular permaneció por encima del 95% para caudales perfundidos de hasta 20 mL/min, y permaneció por encima del 90% hasta aproximadamente 25 mL/min. La figura 33 es una imagen compuesta que muestra el dispositivo en un modo de arranque o sedimentación celular (izquierda) y en un modo de retención celular de estado estable (derecha).

A continuación, se llevaron a cabo experimentos para determinar qué factores afectarían a la retención celular. El caudal perfundido se varió, igual que se hizo variar el voltaje del transductor. Cuando se hizo variar el caudal perfundido, el voltaje del transductor se mantuvo a 40 V de pico a pico y el caudal de recirculación se mantuvo en 2 L/min. Cuando se hizo variar el voltaje del transductor, el caudal perfundido se mantuvo a 20 mL/min y el caudal de recirculación se mantuvo en 2 L/min. Los resultados indicaron que, para esta forma de realización particular, era óptimo un caudal perfundido de aproximadamente 15 mL/min a aproximadamente 28 mL/min, y resultaba óptimo un voltaje del transductor de aproximadamente 15 V de pico a pico a aproximadamente 28 V de pico a pico.

Puede mostrarse una mejor comprensión de la funcionalidad añadida que proporciona un dispositivo de perfusión acústica examinando las muestras celulares observadas que entran en el dispositivo y que se recolectan del mismo. La figura 29A es una imagen de microscopio (de un contador de células Vi-Cell) de la suspensión de alimentación, en este caso una población de cultivo celular viable con aproximadamente 56 millones de células/mL. Pueden observarse varias células sanas, redondas y grandes. La figura 29B es un histograma que muestra la distribución del diámetro de las células en la población. La distribución del diámetro es fuertemente bimodal, en torno a valores de aproximadamente 11 micras y aproximadamente 23 micras. Estos dos modos se corresponden aproximadamente con los restos más pequeños y células no viables, y las células viables de mayor tamaño. Debe señalarse que esta muestra es de una población celular particularmente “sucia”. En general, una línea celular de producción estaría bastante más limpia, y el pico que se encuentra en aproximadamente 11 micras sería mucho menor, o incluso no existente.

La figura 30A es otra imagen de microscopio (de un contador de células Vi-Cell), esta vez del flujo recolectado del dispositivo de perfusión acústica. En esta imagen, se observan muy pocas células grandes, brillantes, por contraposición a la figura 29A. En cambio, la imagen está llena de restos o partículas más oscuras, más pequeñas. Las condiciones experimentales en este caso fueron una velocidad del perfundido de 4 mL/min y una velocidad de recirculación de 2 L/min con un voltaje de entrada DC de 30 V. Esta observación cualitativa se confirmó mediante el histograma de la figura 30B, que muestra la distribución de diámetros en el perfundido. Mirando la figura 30B, la distribución de las partículas es ahora unimodal, con el pico de aproximadamente 9 micras. Esto indica que las células viables, más grandes, han sido capturadas y retenidas, o, de otra manera, se ha evitado en gran medida que las mismas salgan en el perfundido. Únicamente pasan las células más pequeñas, junto con restos celulares, residuos finos y fragmentos, de un tamaño submicrónico a micrónico.

Se elaboró un modelo de dinámica de fluidos computacional (CFD) de este dispositivo. La figura 31 muestra las distribuciones de velocidad dentro del dispositivo después de 500 segundos. Las unidades están en metros/segundo (m/s). Como se esperaba, las velocidades más altas se encuentran en el canal que va en sentido descendente desde el orificio de entrada al orificio de salida. La velocidad es cercana a 0 en la celda de fluido y fuera al pasar por el orificio de recogida. Esto es importante por dos motivos: el campo acústico es más eficaz en un flujo con una velocidad menor, más uniforme, y debido a que las células usadas en la biofabricación son sensibles al flujo, y a la velocidad de cizalla inducida.

La figura 32 es un diagrama que ilustra varios aspectos de esta forma de realización. El fluido fluye hacia el dispositivo a través del orificio de entrada 710 (flecha 780) y hacia la cámara acústica 790. El volumen de fluido 750 por debajo de la cámara acústica contiene el trayecto de flujo tangencial, indicado mediante la flecha 782. El fluido con una cantidad relativamente alta de células viables saldrá a través del orificio de salida 730, según se indica mediante la flecha 781. El efecto/región de interfaz acústica creado por las ondas estacionarias se marca con el numeral de referencia 783, y está aguas arriba del campo de onda estacionaria acústica 784. La interfaz acústica coincide aproximadamente con un plano x-y en este diagrama. Este efecto de interfaz separa células grandes con respecto a fragmentos celulares menores, restos en forma de partículas, biomoléculas deseadas, etcétera, que pueden pasar a través de la interfaz 783 y el campo de onda estacionaria acústica 784. A título comparativo, los agregados celulares que surgen dentro del campo de onda estacionaria acústica 784 durante el primer modo de funcionamiento (véase la figura 41) pueden describirse como alineados en el plano y-z. En el funcionamiento, la separación provocada por el efecto de interfaz se produce en la región de interfaz 783 en la medida en la que cualquier célula grande es retenida por el efecto de “ interfaz” o “barrera”. A continuación, la corriente de flujo de recolección 785 que contiene los fragmentos más pequeños, restos en forma de partículas, biomoléculas deseadas, etcétera, sale a través del orificio de recolección 770. El trayecto de flujo tangencial es parte del trayecto de flujo de entrada, y está situado debajo de la región de interfaz 783 generada por la onda estacionaria acústica. El trayecto de flujo tangencial transportará en alejamiento tanto los conglomerados de células que caen del campo de onda estacionaria acústica 784 debido a efectos de la gravedad como las células que son retenidas por el efecto de interfaz acústica.

Ejemplo 3

Puede interpretarse otra forma de explicar el funcionamiento del dispositivo de perfusión acústica mirando los resultados de un estudio numérico. En el estudio numérico, se modelaron dos fluidos con distintas propiedades acústicas efectivas (es decir, velocidad del sonido y densidad), con una interfaz entre ellos en COMSOL, que es un software de simulación numérica. Se calcula el campo acústico y, a partir del mismo, se calcula la fuerza de radiación lateral que actúa sobre una partícula en la dirección de la velocidad del fluido usando la ecuación de Gorkov.

La figura 34 muestra la geometría de la simulación, utilizando un transductor piezoeléctrico, un reflector de acero, una caja de aluminio y dos fluidos: el primer fluido es agua dentro del campo acústico, simulando el fluido clarificado, y el segundo fluido es una concentración al 15% de células CHO en solución de agua fuera del campo acústico, de manera que el segundo fluido tiene una densidad y una velocidad del sonido mayores que el fluido de agua y simula el fluido de biorreactor que contiene las células.

Los dos fluidos se separaron tal como se indica mediante la línea continua en el modelo de la figura 34. En esta configuración, la velocidad del fluido a través del sistema se produjo en una dirección horizontal de izquierda a derecha. Por lo tanto, para actuar como dispositivo de retención, es necesario que el campo acústico genere una fuerza sobre las células que actúe en la dirección x negativa (es decir, opuesta a la velocidad del fluido). Se modeló agua con una densidad de fluido de 1000 kg/m3 y una velocidad de sonido de 1500 m/s. Se modelaron células CHO con una densidad de 1050 kg/m3 y una velocidad del sonido de 1550 m/s. Se llevó, a diversas frecuencias de excitación, una simulación numérica multifísica acoplada que incluía una simulación piezoeléctrica completa del material piezoeléctrico, una simulación acústica de los dos fluidos y una simulación elástica lineal en los cuerpos de acero y aluminio. El transductor se excitó con un voltaje de pico de 40 V.

Las figuras 35A-35C muestran la presión acústica en los dos fluidos y el desplazamiento del material piezoeléctrico, la caja de aluminio y el reflector de acero del modelo en las frecuencias de funcionamiento de 2.218 MHz, 2.2465 MHz y 2.3055 MHz. La fuerza de radiación lateral (es decir, horizontalmente en la dirección del flujo del fluido) se calculó en la interfaz entre los dos fluidos junto con la potencia eléctrica real consumida por el transductor. Se muestran el desplazamiento estructural del transductor y el acero, junto con la presión acústica en el fluido.

La figura 36 muestra la fuerza de radiación lateral (N) y la fuerza de radiación lateral normalizada por la potencia (N/W) con respecto a la frecuencia y que actúan sobre las células CHO suspendidas. Esta gráfica muestra que, a las frecuencias de resonancia (es decir, máximos locales en la potencia), la fuerza de radiación lateral promedio en la interfaz es negativa, lo cual significa que se produce en la dirección x negativa. El resultado es la creación de un efecto de barrera acústica o un efecto de interfaz acústica. Es decir, el campo acústico en la interfaz entre los dos fluidos ejerce una fuerza lateral intensa sobre las partículas suspendidas en una dirección opuesta al flujo del fluido, impidiendo así que las partículas más grandes entren en el campo acústico y permitiendo que solamente el primer fluido (es decir, fluido que contiene solamente partículas más pequeñas, tales como el producto deseado, y que excluye células enteras) entre en el campo acústico, con lo cual se crea un dispositivo de retención celular por perfusión acústica. De esta manera, solamente puede fugarse el fluido clarificado y las células son retenidas por la fuerza de radiación. Esta fuerza no es positiva nunca, lo cual significa que retiene siempre las células en la interfaz, no permitiéndoles atravesar la misma. Los múltiples picos en la curva de potencia muestran la existencia de múltiples modos de funcionamiento que incluyen modos de resonancia plana y modos multidimensionales de funcionamiento, lo cual indica que este tipo de funcionamiento se puede generar a través de la utilización de ondas estacionarias planas y multidimensionales por igual. En sistemas que tienen dimensiones de 1”x1” , existe una resonancia plana aproximadamente cada 30 kHz. La gráfica presenta evidencia de picos adicionales que indican la existencia de los modos multidimensionales. Por unidad de potencia, estos modos pueden ser igual de efectivos o incluso más que los modos de resonancia plana. Como se ha explicado anteriormente, las células que son retenidas por la fuerza de radiación acústica pueden ser captadas a continuación por el movimiento de rozamiento del campo de flujo (es decir, el flujo en recirculación por debajo de la interfaz), y pueden ser devueltas continuamente al biorreactor para garantizar que reciben la nutrición y el oxígeno con el fin de mantener la producción del cultivo celular total.

Ejemplo 4

La figura 37 y la figura 38 muestran otra configuración experimental para un dispositivo de perfusión acústica similar al ilustrado en la figura 9. Se conectan tubos al orificio de entrada, al orificio de salida, al orificio de recogida y al orificio de salida secundario (para células concentradas de un flujo). Se incluyen flechas para ilustrar el flujo de fluido. Las flechas indican el flujo hacia el orificio de entrada; el flujo hacia fuera del orificio de salida; el flujo perfundido hacia fuera por la parte superior del dispositivo y el flujo de concentrado hacia fuera por la parte inferior del dispositivo. El flujo a través del orificio de entrada hacia el orificio de salida es el caudal de recirculación. El flujo perfundido hacia fuera por la parte superior del dispositivo es el caudal de perfundido que contiene fluido clarificado empobrecido en células y que contiene producto deseado. El flujo de concentrado hacia fuera por la parte inferior del dispositivo es el flujo de células concentrado. El flujo de células concentrado se puede usar para una operación de purga celular o, si se desea, las células se pueden devolver al biorreactor.

El dispositivo se sometió a prueba con un voltaje del transductor de 40 V de pico a pico, un caudal de perfundido (hacia fuera por la parte superior) de 1-10 mL/min, un caudal de recirculación de 0.75-1 L/min, y un caudal de concentrado (hacia fuera por la parte inferior) de 15 mL/min. Se determinó la tasa de retención celular para diferentes caudales de perfundido. La figura 39 muestra los resultados. El eje y es la retención, indicando el 1.00 una retención del 100%. La eficiencia de retención celular permaneció por encima del 98% para caudales de perfundido de hasta 7 mL/min, y se situó justo por debajo del 90% en 10 mL/min.

Ejemplo 5

El dispositivo de la figura 7 y la figura 8 se sometió a prueba con caudales diferentes en dos días diferentes. La figura 50 muestra la retención celular (%) con respecto al tiempo. En este caso, son más deseables valores superiores, y la mayoría de los valores se situaron por encima del 95% con caudales que oscilaban de 1.5 mL/min a 8 mL/min. La figura 51 muestra la densidad celular del perfundido (millones de células/mL) con respecto al tiempo. En este caso, son más deseables valores menores (lo cual indica una separación celular exitosa). Como se esperaba, los resultados eran mejor con caudales inferiores.

Ejemplo 6

Se elaboró un modelo de dinámica de fluidos computacional (CFD) del dispositivo con la estructura interna de la figura 46A. La figura 52 muestra las distribuciones de velocidad dentro del dispositivo después de 500 segundos. Las unidades están en metros/segundo (m/s). Cabe señalar que, en este caso, la entrada es desde el lado izquierdo de la figura, y la salida está en el lado derecho de la figura (dirección del flujo indicada por la flecha). Como se esperaba, las velocidades más altas se encuentran en el paso de entrada hacia la cámara acústica. Las velocidades negativas en el paso de salida indican flujo hacia fuera de la cámara acústica. La velocidad es próxima a cero en la cámara acústica, y cerca del orificio de recogida en su parte superior. Este es un perfil de velocidad deseable.

Se elaboró también un modelo de dinámica de fluidos computacional (CFD) del dispositivo con la estructura interna de la figura 46C. La figura 53 muestra las distribuciones de velocidad dentro del dispositivo con un caudal de 250 mL/min, mientras que la figura 54 muestra las distribuciones de velocidad dentro del dispositivo con un caudal de 1000 mL/min. En estas dos figuras, la entrada es desde el lado derecho de la figura, y la salida está en el lado izquierdo de la figura (dirección del flujo indicada por la flecha). Nuevamente, la velocidad es próxima a cero en la cámara acústica, y cerca del orificio de recogida en su parte superior, incluso con el caudal mucho mayor de 1000 mL/min. Este es un perfil de velocidad deseable.

Se elaboraron dos modelos de CFD adicionales correspondientes a variantes de las configuraciones que se ven en la figura 53 y la figura 54, las cuales son posibles estructuras internas para el dispositivo de la figura 43. La primera variante se ve en la figura 55. En este caso, el rectángulo en la parte superior indica la posición del transductor ultrasónico / onda estacionaria acústica multidimensional. Por debajo de este rectángulo, los lados de la cámara acústica se estrechan progresivamente de manera uniforme hacia abajo en dirección al paso de salida. El paso de entrada tiene una parte superior arqueada hacia la cámara acústica. La segunda variante se observa en la figura 56. Esta variante es mucho más alta y estrecha en comparación con la figura 55. El lado de flujo saliente de la cámara acústica se estrecha progresivamente de manera uniforme hacia abajo en dirección al paso de salida. Como puede verse en ambas figuras, el perfil de velocidad deseable está presente, siendo próximo a cero en el área de la onda estacionaria acústica multidimensional, y cerca del orificio de recogida en su parte superior. Estos trayectos de flujo de las figuras 52-56 muestran claramente cómo puede gestionarse el fluido a través de diferentes configuraciones de la geometría que conduce del trayecto de recirculación principal (a través de la tubería de recirculación) a la cámara acústica. En la figura 55 y la figura 56, el trayecto de recirculación principal a la cámara de fluido tiene el mismo caudal. Una de las consecuencias de estas configuraciones es que las velocidades de separación serán mayores.

A continuación, se sometió a prueba el dispositivo con la estructura interna de la figura 46A con diferentes caudales. La figura 57 muestra la retención celular (%) con respecto al tiempo. Son más deseables valores mayores, y la mayoría de los valores estaba por encima del 97% con caudales que oscilaban de 0.37 mL/min a 1.5 mL/min. La figura 58 muestra la densidad celular del perfundido (millón de células/mL) con respecto al tiempo. En este caso, son más deseables valores menores (lo cual indica separación celular exitosa). Como se esperaba, los resultados fueron mejores con caudales más bajos.

A continuación, el dispositivo se sometió a prueba usando dos frecuencias de funcionamiento diferentes para el transductor ultrasónico, 1 MHz ó 2 MHz, y con caudales diferentes. La figura 59 muestra la retención celular (%) con respecto al tiempo. Son más deseables valores mayores. A 2 MHz, los valores eran cercanos al 100% para caudales de 1.5 mL/min a 3 mL/min. A 1 MHz, los valores permanecieron por encima del 90% para caudales de 1.5 mL/min a 3 mL/min. En general, la frecuencia de 2 MHz ofrecía mejor rendimiento. La figura 60 muestra la densidad celular (millón de células/mL) del perfundido con respecto al tiempo. Nuevamente, los resultados fueron mejores para una frecuencia de funcionamiento de 2 MHz.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo de perfusión acústica, que comprende:

una cámara acústica (4350);

un orificio de entrada (4310) y un trayecto de flujo de entrada (4351) que conduce del orificio de entrada (4310) a la cámara acústica (4350);

un orificio de salida (4330) y un trayecto de flujo de salida (4355) que conduce de la cámara acústica (4350) al orificio de salida (4330) para recircular una mezcla fluida;

por lo menos un orificio de recogida (4370) para recoger fluido de recolección de la mezcla fluida; y por lo menos un transductor ultrasónico y por lo menos un reflector opuesto a dicho por lo menos un transductor ultrasónico, en el que dicho por lo menos un transductor ultrasónico incluye un material piezoeléctrico excitado por una señal de voltaje para crear una onda estacionaria acústica multidimensional a través de un trayecto de flujo de recogida que conduce de la cámara acústica a dicho por lo menos un orificio de recogida, caracterizado por que

el orificio de entrada (4310) y el orificio de salida (4330) están situados ambos en el extremo inferior (4316) del dispositivo, y el orificio de recogida (4370) está situado en el extremo superior (4318) del dispositivo, el orificio de entrada (4310) está situado sobre un primer lado (4312) del dispositivo, y el orificio de salida (4330) está situado sobre un segundo lado (4314) del dispositivo,

una tubería de recirculación (4340) conecta el orificio de entrada (4310) directamente al orificio de salida (4330), un paso de entrada (4380) y un paso de salida (4390) conectan la cámara acústica (4350) a la tubería de recirculación (4340).

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que:

dicho por lo menos un reflector está realizado a partir de un material transparente.

3. Dispositivo según la reivindicación 1 o 2, que tiene un total de dos o más transductores ultrasónicos situados en múltiples lados del trayecto de flujo de recogida.

4. Dispositivo según la reivindicación 1, que comprende por lo menos una de las siguientes características: • dicho por lo menos un transductor es una matriz;

• la onda estacionaria acústica da como resultado una fuerza de radiación acústica que tiene un componente de fuerza axial y un componente de fuerza lateral que son del mismo orden de magnitud; o

• el dispositivo tiene dos o más orificios de recogida espaciados entre sí en el extremo superior del dispositivo.

5. Dispositivo según la reivindicación 1, que comprende asimismo un flujo de recirculación secundario entre el orificio de entrada (4310) y el orificio de salida (4330) que no entra en la cámara acústica (4350), estando el flujo de recirculación secundario situado por debajo de la cámara acústica.

6. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la mezcla fluida está formada por un fluido principal y partículas, en el que preferentemente las partículas comprenden células de mamífero, bacterias, restos celulares, residuos finos, proteínas, exosomas, vesículas, virus o células de insecto.

7. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que un área superior en sección transversal (4383) del paso de entrada (4380) es mayor que un área inferior en sección transversal (4384) del paso de entrada (4380).

8. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que un área superior en sección transversal (4393) del paso de salida (4390) es mayor que un área inferior en sección transversal (4394) del paso de salida (4390).

9. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que un área superior en sección transversal (4393) del paso de salida (4390) es mayor que un área superior en sección transversal (4383) del paso de entrada (4380).

10. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que un área inferior en sección transversal (4394) del paso de salida (4390) es igual o inferior a un área inferior en sección transversal (4384) del paso de entrada (4380).

11. Método para separar células biológicas de una mezcla fluida, que comprende:

hacer fluir la mezcla fluida que contiene las células biológicas a través de un dispositivo de perfusión acústica, comprendiendo el dispositivo:

una cámara acústica (4350);

un orificio de entrada (4310), un trayecto de flujo de entrada (4351) que conduce del orificio de entrada (4310) a la cámara acústica (4350);

un orificio de salida (4330) para recircular la mezcla fluida y las células biológicas;

por lo menos un orificio de recogida (4370) para recoger un fluido de recolección; y

por lo menos un transductor ultrasónico por debajo de dicho por lo menos un orificio de recogida y por lo menos un reflector opuesto a dicho por lo menos un transductor ultrasónico, incluyendo dicho por lo menos un transductor ultrasónico un material piezoeléctrico excitado por una señal de voltaje para crear una onda estacionaria acústica multidimensional a través de un trayecto de flujo de recogida que conduce de la cámara acústica a dicho por lo menos un orificio de recogida;

excitar dicho por lo menos un transductor ultrasónico para crear la onda estacionaria acústica; y recoger una mezcla fluida enriquecida en células del orificio de salida y recoger una mezcla fluida de recolección empobrecida en células de dicho por lo menos un orificio de recogida,

caracterizado por que

el orificio de entrada (4310) y el orificio de salida (4330) están situados ambos en el extremo inferior (4316) del dispositivo, y el orificio de recogida (4370) está situado en el extremo superior (4318) del dispositivo para recoger el fluido de recolección,

el orificio de entrada (4310) está situado sobre un primer lado (4312) del dispositivo, y el orificio de salida (4330) está situado sobre un segundo lado (4314) del dispositivo,

una tubería de recirculación (4340) conecta el orificio de entrada (4310) directamente al orificio de salida (4330), un paso de entrada (4380) y un paso de salida (4390) conectan la cámara acústica (4350) a la tubería de recirculación (4340) para recircular una mezcla fluida.

12. Método según la reivindicación 11, en el que:

un caudal a través del trayecto de flujo de recogida es por lo menos un orden de magnitud menor que un caudal a través del trayecto de flujo de entrada.

13. Método según la reivindicación 11, en el que se crea una corriente de fluido en recirculación que es de manera local sustancialmente tangencial a dicha por lo menos una onda estacionaria acústica, transportando lejos la corriente de fluido en recirculación las células que quedan retenidas constantemente en una región de interfaz de la onda estacionaria acústica.

14. Método según la reivindicación 11, en el que un caudal de la mezcla fluida que entra en el dispositivo a través del orificio de entrada es aproximadamente 1 litro por minuto y un caudal del fluido de recolección empobrecido en células que sale del dispositivo a través de dicho por lo menos un orificio de recogida es aproximadamente 10 mililitros por minuto.