ES2926295T3 - Injerto de tejido - Google Patents
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Abstract
La presente invención está dirigida a un método para producir un injerto de tejido, que comprende al menos las etapas de proporcionar un gel, sembrar el gel con células de al menos un primer tipo y/o células de un segundo tipo, y cultivar las células del primero. y/o células del segundo tipo en dicho gel hasta la formación de al menos una primera bioestructura en el gel por las células del primer tipo y/o las células del segundo tipo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Injerto de tejido
CAMPO TÉCNICO
[0001] La presente invención se refiere a un dispositivo que contiene al menos una bioestructura, y un método para fabricar el dispositivo, para uso en tratamiento terapéutico. Por ejemplo, el dispositivo se puede usar en heridas cutáneas para piel quemada, lesionada o enferma, y proporciona estructuras y funciones como en la piel normal no lesionada.
TÉCNICA ANTERIOR
[0002] La piel humana está compuesta por tres capas principales: la epidermis (exterior), dermis (medio) y la hipodermis (más profundo). Cuando se crea una herida profunda (herida cutánea de espesor total), después de, por ejemplo, un accidente por quemadura, la epidermis y toda la dermis (en algunos casos también la hipodermis) se dañan y se requiere una intervención quirúrgica. Las pequeñas heridas cutáneas de espesor total se tratan de manera óptima mediante autoinjertos de piel de espesor total: la epidermis y la dermis completa se extraen de una parte sana del cuerpo y se trasplantan a la herida. Por el contrario, los grandes defectos cutáneos de espesor total, tratados mediante autoinjertos cutáneos de espesor parcial (que consisten en epidermis y sólo una capa muy fina e incompleta de dermis), siguen representando un problema clínico no resuelto. De hecho, tales heridas cicatrizan mal y se convierten en cicatrices grandes, desfigurantes y no funcionales. Muchas son las razones por las que los autoinjertos de piel de espesor total curan de manera óptima las heridas profundas en contraste con los autoinjertos de espesor parcial. Una de estas razones se encuentra en la presencia de estructuras vasculares en los autoinjertos de espesor total y la ausencia de las mismas en los autoinjertos de espesor parcial. Las bioestructuras vasculares (vasos sanguíneos y linfáticos) son esenciales para los órganos del cuerpo humano, al proporcionar constantemente oxígeno y nutrientes, así como al tráfico de células inmunitarias, contribuyen a la plena funcionalidad y supervivencia. Lo mismo es válido para órganos trasplantados, incluso para órganos delgados y planos como la piel. Los capilares en los injertos de piel de espesor completo solo necesitan conectarse a los capilares del lecho de la herida, mientras que en el caso de los injertos de piel de espesor parcial, los capilares necesitan crecer hacia el interior del injerto para perfundir el tejido.
[0003] Recientemente, la investigación y la evidencia clínica también han sugerido que los vasos linfáticos pueden ser necesarios para la supervivencia del injerto de piel, esencialmente drenando las células inmunitarias, los desechos y el exceso de líquido del área herida. Cuando se piensa en una forma de proporcionar grandes cantidades de injertos de piel de espesor total para el tratamiento de defectos de piel de espesor total, entra en juego la ingeniería de tejidos de piel que contiene bioestructuras vasculares. Una de las principales ventajas de un hidrogel como material de andamiaje (frente a otros tipos de andamios, por ejemplo, esponjas de colágeno) son sus propiedades como sustrato de células 3D. Es altamente biocompatible y biomimético, tiene baja inmunogenicidad (conservada entre especies) y es remodelado naturalmente por células que pueden sembrarse intersticialmente fácilmente dentro de la red de fibrillas. Sin embargo, las malas propiedades mecánicas de los hidrogeles son una limitación importante en su uso clínico como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
[0004] La estabilidad mecánica es esencial para la aplicación clínica de productos de ingeniería tisular basados en hidrogeles, especialmente cuando estos productos se caracterizan por tener dimensiones físicas grandes y delgadas como en el caso de los injertos de piel (un tamaño clínicamente relevante para un injerto de piel es min. 50cm2 con un espesor inferior a 2 mm).
[0005] Se requiere estabilidad mecánica para permitir la manipulación y el procesamiento de un hidrogel durante y después del cultivo, así como durante y después de la aplicación y/o prueba quirúrgica. La estabilidad mecánica de los geles se puede aumentar mediante la compactación. El documento e P 0187 104 describe la compresión de una matriz de gel de colágeno para formar una red de fibras para uso médico. El documento EP 1773 416 describe el uso de la compactación plástica de un gel en la preparación de matrices de células de armazón para implantes de tejido.
[0006] Brasilulis et al. 2012 (Modified Plastic Compression of Collagen Hydrogels Provides an Ideal Matrix for Clinically Applicable Skin Substitutes, Tissue Engineering: Part C; Vol. 18, No. 6, 2012) informó sobre un método de compresión de plástico modificado para la ingeniería de hidrogeles grandes, 7x7 cm, injertos de piel dermoepidérmica humana. Estos productos de ingeniería comprimidos mostraron una estabilidad mecánica óptima durante y después de la fase de cultivo celular, así como durante las fases de trasplante en cerdos (Braziulis et al. 2011 Skingineering I: engineering porcine dermo-epidermal skin analogues for autologous transplantation in a large animal model, Pediatr. Surg. Int. (2011) 27:241-257), Schiestl et al., 2011 (Skingeineering II: transplantation of large-scale laboratorygrown skin analogues in a new pig model, Pediatr. Surg. Int. (2011) 27:249-254)). Sorprendentemente, las propiedades biológicas de las células sembradas en y sobre los hidrogeles no se vieron alteradas por el proceso de compresión.
[0007] Klar et al., Biomaterials vol. 35, n° 19, 5065-5078, describe injertos de piel vascularizados preparados sembrando células endoteliales derivadas de la fracción vascular del estroma adiposo en sistemas de hidrogel de fibrina o colágeno I, cultivándolos durante dos semanas y posteriormente sembrando queratinocitos en el hidrogel y cultivando durante una semana adicional.
[0008] Braziulis et al ", Tissue Engineering Part C: Methods, vol. 18, n° 6, 1,464-474, describe hidrogeles de colágeno de tipo I comprimidos plásticamente que comprenden fibroblastos humanos autólogos cultivados y que tienen queratinocitos en su superficie cultivada.
[0009] El documento WO 00/62833 describe un ensayo de angiogénesis in vitro 3D para células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC).
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0010] Un objetivo de la invención en general es producir un dispositivo de injerto de tejido mejorado y mecánicamente estable que contienen células y al menos una bioestructura en y/o sobre una matriz de hidrogel biodegradable preferiblemente biocompatible para uso clínico en humanos y/o pruebas. Más específicamente, tiene como objetivo desarrollar un injerto de piel dermoepidérmico, preferiblemente autólogo, con bioestructuras para uso clínico y ensayo.
[0011] Hasta ahora, se han generado con fines de investigación sustitutos de la piel dermoepidérmicos prevascularizados que contienen bioestructuras vasculares sanguíneas. No hay datos disponibles sobre la bioingeniería de injertos de piel dermoepidérmicos prevacularizados para uso clínico previsto para el tratamiento de defectos de la piel.
[0012] Además, hasta ahora hay datos limitados disponibles sobre la ingeniería de capilares linfáticos humanos y no hay datos disponibles sobre la bioingeniería de sustitutos de piel dermoepidérmicos prevascularizados que contienen capilares linfáticos humanos funcionales. En la dermis humana, los vasos linfáticos desempeñan un papel importante en la homeostasis de los líquidos tisulares y el tráfico de células inmunitarias. Los capilares linfáticos dérmicos exhiben una luz amplia, filamentos de anclaje y una membrana basal incompleta o nula, y carecen de cobertura celular mural. Estas características permiten que los capilares linfáticos respondan a la presión del líquido intersticial absorbiendo y eliminando el exceso de líquido tisular. Después de la herida, también se rompe el endotelio linfático; por lo tanto, se compromete la capacidad de drenaje de los vasos linfáticos. Como consecuencia, surge la acumulación de líquido tisular. El líquido intersticial local persistente, así como la eliminación tardía de los desechos locales y las células inflamatorias, impide la cicatrización de heridas. Por el contrario, se demostró que la inducción de la linfangiogénesis y el reclutamiento de células inmunitarias aceleran la regeneración de la piel.
[0013] Una primera forma de realización de la invención se dirige a un método para producir un injerto de tejido, que comprende al menos los siguientes pasos:
- proporcionar un gel,
- sembrar el gel con células de al menos un primer tipo y/o células de un segundo tipo,
- cultivar las células del primer tipo y/o las células del segundo tipo en dicho gel hasta la formación de al menos una primera bioestructura en dicho gel por las células del primer tipo y/o las células del segundo tipo, donde la primera bioestructura es una estructura vascular,
- donde
o las células del primer tipo son células de la fracción vascular del estroma, SVF, o
o las células del primer tipo son células endoteliales y las células del segundo tipo son fibroblastos, donde las células endoteliales y los fibroblastos se cocultivan juntos en el gel para la formación de la primera bioestructura,
- en el que las células de un tercer tipo se siembran en el gel después de que al menos una primera bioestructura haya sido formada en el gel por las células del primer tipo o las células del primer tipo y del segundo tipo, donde las células del tercer tipo se seleccionan de queratinocitos,
- donde después de la siembra de las células del tercer tipo, el gel se cultiva hasta la formación de al menos una segunda bioestructura en el gel, donde la segunda bioestructura es una estructura epidérmica,
- y en la que después de la siembra del gel con las células del primer tipo o las células del primer tipo y del segundo tipo, el gel se compacta.
[0014] En otras palabras, el gel se siembra con uno o más tipos de células y las células se cultivan en y/o sobre dicho gel hasta la formación de al menos un tipo de bioestructura.
[0015] El gel utilizado para el método de la invención puede ser cualquier biomatriz 3D, como un hidrogel de colágeno, preferentemente de colágeno tipo I, o un hidrogel de fibrina.
[0016] En biología, las estructuras existen en todos los niveles de organización, variando jerárquicamente desde el nivel atómico y molecular hasta el nivel celular, tisular, de órganos, organísmico, de población y de ecosistema. A los efectos de esta solicitud, el término "bioestructura" debe entenderse como cualquier estructura/tejido/órgano, que está compuesto por más de una célula, presente en el cuerpo/embrión/feto humano o de otro mamífero, que tiene algún tipo de organización y/o complejidad y/o funcionalidad. Por lo tanto, un mero grupo aleatorio de celdas no entraría en esta definición.
[0017] Los resultados presentados en esta solicitud muestran datos para la formación de bioestructuras epidérmicas y vasculares humanas en y/o sobre el gel, respectivamente.
[0018] La primera bioestructura/primer tipo de bioestructura es una estructura vascular, preferiblemente un plexo vascular de capilares sanguíneos y/o linfáticos, preferiblemente de ambos.
[0019] Para la inducción de una bioestructura vascular se utiliza una mezcla de células endoteliales y fibroblastos. En otras palabras, según una primera alternativa de la invención, las células del primer tipo son células endoteliales y las células del segundo tipo son fibroblastos. A continuación, las células endoteliales y los fibroblastos se cocultivan juntos en el gel para la formación de la primera bioestructura. Preferiblemente, las células endoteliales y los fibroblastos se siembran y cocultivan en el gel con una proporción de fibroblastos a células endoteliales de al menos 3:7, preferiblemente de al menos 2:3, más preferiblemente de aproximadamente 1:1.
[0020] Las células endoteliales son preferentemente células endoteliales vasculares sanguíneas humanas (hBEC) y/o células endoteliales linfáticas humanas (hLEC), preferentemente células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) o derivados de SVF. Los HDMEC consisten en una mezcla de hLEC y hBEC, por lo que ambos tipos de capilares funcionales (sangre y linfa) se formaron a partir de estas células in vitro en los hidrogeles de fibrina o colágeno. Según una segunda alternativa de la invención, otra fuente de células son las SVF, que son una mezcla de células endoteliales sanguíneas, fibroblastos y células murales en la proporción específica de un paciente, dando lugar a la formación de capilares sanguíneos funcionales in vitro en la fibrina o hidrogeles de colágeno.
[0021] Todas o parte de las células y bioestructuras pueden ser autólogas, lo que significa que su origen es el receptor del dispositivo cultivado (el paciente a tratar con el injerto). Las células autólogas se aíslan del mismo cuerpo humano o de otro mamífero que el cuerpo que se va a tratar con el injerto de tejido de reemplazo. El trasplante autólogo elimina ventajosamente las preocupaciones sobre la compatibilidad y el rechazo del tejido.
[0022] De acuerdo con la invención, las células de un tercer tipo (o más tipos) se siembran en el gel después de que la al menos una primera bioestructura se haya formado (al menos parcialmente o completamente) en el gel por las células del primer tipo y/o las células del segundo tipo. Después de sembrar las células del tercer tipo, el gel se cultiva en un medio adecuado hasta la formación de al menos una segunda bioestructura en el gel. Sin embargo, el trasplante también es posible antes de que se forme parcial o completamente la segunda bioestructura. La segunda bioestructura, formada por/de las células del tercer tipo, es una estructura epidérmica.
[0023] Preferiblemente, el gel se cultiva conjuntamente con las células respectivas en un matraz que contiene un medio de cultivo celular adecuado para el crecimiento celular del tipo o tipos de células específicos.
[0024] Las células del tercer tipo, que se van a sembrar en el hidrogel para la inducción de una bioestructura epidérmica, son queratinocitos.
[0025] Preferiblemente, las células de un primer tipo y/o de un segundo tipo y/o de un tercer (o más) tipo son células de mamífero, más preferiblemente células humanas. Es especialmente ventajoso que las células utilizadas para sembrar el gel sean células autólogas. A continuación se describe adicionalmente un método dirigido a la bioingeniería in vitro y el injerto in vivo de un sustituto de piel dermoepidérmico humano prevascularizado por capilares sanguíneos y/o linfáticos, preferiblemente ambos. Tanto una población pura de hLEC (aislado de prepucio humano) como una fracción de hLEC presente en HDMEC (aislado de prepucio humano) se desarrollaron en lúmenes que formaron capilares linfáticos genuinos in vitro dentro de los 21 días en hidrogeles de fibrina o colágeno tipo I. La naturaleza linfática de los microvasos diseñados se confirmó al mostrar que presentaban filamentos de anclaje, expresaban todos los principales marcadores linfáticos y podían ser modulados por estímulos linfangiogénicos y antilinfangiogénicos. La funcionalidad linfática se confirmó al demostrar que los microvasos linfáticos creados mediante bioingeniería absorbieron líquido del espacio intersticial in vitro y desencadenaron el drenaje de líquido in vivo. Los estudios de injerto in vivo revelaron que los microvasos linfáticos diseñados mantuvieron sus lúmenes y sus características típicas, como la ausencia de una membrana basal completa y la falta de cobertura celular mural. Se encontró que los linfáticos humanos creados mediante bioingeniería se anastomosan con los linfáticos del receptor tan pronto como 14 días después del trasplante. Cuando se trasplantó a ratas inmunoincompetentes, la dermis prevascularizada apoyó el desarrollo de la epidermis, lo que indica que, en el futuro, puede ser posible traducir estos sustitutos dermoepidérmicos prevascularizados en aplicaciones clínicas.
[0026] Además, los capilares sanguíneos pueden diseñarse en el hidrogel utilizando la fracción estromal del tejido adiposo humano vascular (SVF). Las células SVF han mostrado un alto potencial vasculogénico. Las células SVF se convirtieron en un plexo capilar funcional en injertos de piel dermoepidérmicos humanos. Después del trasplante, la toma del injerto y la remodelación con perfusión rápida del injerto respaldaron la supervivencia y la funcionalidad del injerto trasplantado.
[0027] Hasta el momento, no hay datos disponibles sobre la bioingeniería de injertos de piel dermoepidérmicos prevascularizados mediante el uso de células endoteliales derivadas de tejido adiposo (fracción vascular estromal, SVF). Las ventajas de las células SVF frente a las células endoteliales aisladas de otros tejidos son las siguientes: en primer lugar, una única biopsia de SVF proporciona células estromales, vasculogénicas y murales autólogas en una proporción ideal. En segundo lugar, las células SVF revelan un alto potencial vasculogénico en todos los grupos de edad, incluso en
pacientes de edad avanzada o con quemaduras. En tercer lugar, las células de la SVF se pueden aislar en un procedimiento completamente automatizado, en grandes cantidades para que no requieran expansión in vitro, y se pueden usar frescas, por ejemplo, para uso intraoperatorio directo.
[0028] Los injertos de acuerdo con la presente descripción podrían usarse para diseñar cualquier tejido del cuerpo humano, como piel, córnea, cartílago, endotelio, válvulas, etc.), u otras estructuras como glándulas, cabello, nervios, músculos, etc., y podrían usarse como herramientas de prueba para, por ejemplo, exámenes de detección de drogas.
[0029] Los injertos prevascularizados según la invención mencionados anteriormente son adecuados para fines de investigación, tales como pruebas y selección, así como para el trasplante en modelos animales pequeños, tales como, por ejemplo, ratones y ratas. De acuerdo con el método de la presente invención, los capilares humanos formadores de lúmenes completamente funcionales, tanto sanguíneos como linfáticos, pueden diseñarse en hidrogeles in vitro. Sin embargo, por ejemplo, para la prueba en animales grandes, como cerdos y conejos, etc., o, lo que es más importante, para investigaciones clínicas en humanos, se requieren construcciones más grandes, más delgadas y mecánicamente más estables.
[0030] Además, tras la siembra del gel con células de un primer y/o segundo tipo (o más tipos), el gel se compacta, preferentemente por compresión.
[0031] Se ha demostrado que el gel de colágeno sembrado con células (p. ej., en el documento EP 1773416 B1) es un excelente punto de partida biomimético para implantes equivalentes de tejido, sin embargo, su debilidad mecánica ha sido un inconveniente. Añadiendo la etapa de compactación del gel, se pueden aprovechar las características óptimas de un gel (por ejemplo, de colágeno) sin tener que soportar su insuficiencia en términos de resistencia mecánica. De ese modo, se pueden producir injertos muy delgados, es decir, de espesor fisiológico de tejido/órgano sin tener que sacrificar la resistencia mecánica. La compactación/compresión no solo aumenta la resistencia mecánica de un gel con un espesor específico, sino que la estabilidad mecánica de los geles muy delgados que se logra mediante la compactación/compresión es incluso mayor que la estabilidad mecánica de los geles con un espesor mucho mayor.
[0032] Según una forma de realización especialmente preferida de la invención, el gel se compacta por compactación plástica, preferiblemente por compresión en un dispositivo de compresión, preferiblemente aplicando una fuerza de compresión mecánica al gel. De este modo, se incrementan la densidad y la resistencia mecánica de la matriz del andamio.
[0033] "Compactación plástica" en el sentido de esta solicitud significa deformar el gel para reducir su volumen, de manera que el gel retiene sustancialmente su nuevo volumen, incluso después de eliminar la causa de la compactación. El volumen del el gel preferiblemente se reduce en al menos un 40%, preferiblemente hasta un 90%.
[0034] La compactación en términos de esta descripción es un proceso rápido e independiente de las células que resulta de someter el gel a un tratamiento físico, como una fuerza externa o presión, que expulsa el líquido intersticial del gel. Por lo tanto, la compactación plástica es independiente de la acción de las células que se cultivan dentro del gel. La cantidad y el alcance de la compactación pueden variar según la reducción deseada en el espesor del gel.
[0035] La compactación del gel se puede realizar antes o después de la formación de al menos una primera bioestructura. Para la forma de realización preferida de un injerto de piel dermoepidérmico, la compactación se aplica al ge prevascularizado yo En otras palabras, según esta realización preferida, la compresión del gel se realiza sobre un gel que ya contiene bioestructuras vasculares. Sorprendentemente, el desarrollo de las bioestructuras, es decir, en este caso del plexo vascular, no se ve afectado por la compactación/compresión plástica del hidrogel.
[0036] El gel se siembra con las células del tercer tipo (o más tipos) después de la compactación del gel. Por ejemplo, para la forma de realización preferida de un injerto de piel dermoepidérmico, la estructura epidérmica en la superficie del gel se dañaría de otro modo por la compresión.
[0037] El gel en estado descomprimido tiene un primer espesor, y se realiza la compactación hasta que el gel en estado comprimido alcanza un segundo espesor de 3-20 veces menor, preferentemente unas 10 veces menor que el primer espesor. Para un injerto dermoepidérmico de piel, por ejemplo, el espesor preferido del gel en estado comprimido es de aproximadamente 0,7-1 mm, que corresponde al espesor fisiológico de la piel.
[0038] El gel se puede cocultivar con las células respectivas en un matraz que contiene un medio adecuado para el crecimiento celular del tipo o tipos de células específicos. Preferiblemente, el gel se retira del matraz para comprimirlo y se devuelve al matraz después de la compresión para seguir cultivando.
[0039] La presente invención se dirige además a un injerto de piel dermoepidérmico que comprende un gel, comprendiendo el gel
- al menos una primera bioestructura formada por células de un primer tipo o células de un primer tipo y un segundo tipo en el gel, en el que la primera bioestructura es una bioestructura vascular, donde
- las células del primer tipo son células de la fracción vascular del estroma, SVF, o
- las células del primer tipo son células endoteliales y las células del segundo tipo son fibroblastos, donde las células endoteliales y los fibroblastos se cocultivan juntos en el gel para la formación de la primera bioestructura,
- al menos una segunda bioestructura formada por células de al menos un tercer tipo en y/o sobre el gel, en el que la segunda bioestructura es una bioestructura epidérmica, y donde las células del tercer tipo se seleccionan de queratinocitos, y donde
- el gel es un gel compactado.
[0040] Preferiblemente, el injerto se produjo mediante un método de acuerdo con una de las formas de realización mencionadas anteriormente.
[0041] Según una forma de realización especialmente preferida, el injerto comprende células endoteliales humanas autólogas y fibroblastos humanos autólogos en el gel, preferiblemente en una proporción de fibroblastos a células endoteliales de al menos 3:7, más preferiblemente de al menos 2:3. lo más preferiblemente alrededor de 1:1.
[0042] La primera bioestructura es una bioestructura vascular, preferentemente un plexo vascular de capilares sanguíneos y/o linfáticos. La segunda bioestructura es una bioestructura epidérmica. La primera bioestructura es una bioestructura vascular formada en el gel y la segunda bioestructura es una bioestructura epidérmica formada sobre el gel.
[0043] En el caso de que la primera bioestructura sea un plexo vascular de capilares sanguíneos y linfáticos en el gel, los capilares linfáticos del mismo tienen preferiblemente un lumen continuo de tamaño fisiológico, preferiblemente de 17-60 mm. Estos capilares linfáticos que forman el lumen tienen preferiblemente filamentos de anclaje, preferiblemente filamentos de anclaje de fibrilina.
[0044] El gel que forma el armazón del injerto es preferiblemente un hidrogel de fibrina o colágeno, preferiblemente un hidrogel de colágeno tipo I. El gel es un hidrogel compactado, preferiblemente comprimido. Preferiblemente, el gel se ha comprimido en un dispositivo como se describe en la solicitud EP 13174441.
[0045] El injerto de tejido es un injerto de piel dermoepidérmico, en el que preferiblemente las células comprendidas en la primera bioestructura son células HDMEC o SVF y las células comprendidas en la segunda bioestructura son queratinocitos, preferiblemente queratinocitos epidérmicos. Especialmente en el caso de un injerto de piel dermoepidérmico, el injerto tiene preferiblemente un grosor de 0,2-3 mm, preferiblemente 0,7-1 mm.
[0046] Los injertos de piel dermoepidérmicos prevascularizados por bioingeniería autólogos basados en un armazón de hidrogel han mostrado la capacidad de regenerarse in vivo. De hecho, después del trasplante, los capilares preformados se conectaron funcionalmente a la vasculatura del receptor y la regeneración dérmica y epidérmica recibió un gran respaldo (Marino et al. 2014, Bioengineering dermo-epidermal skin grafts with blood and lymphatic capillaries, Sci Transl Med. 2014 enero 29;6(221):221ra14, y Klar et al., 2014, Tissue-engineered dermo-epidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells, Biomaterials, junio de 2014;35(19):5065-78).
[0047] El método de acuerdo con la invención es particularmente útil en la producción de un implante equivalente de tejido, o un dispositivo para la implantación en un individuo para reparar o reemplazar tejido endógeno dañado o enfermo (injerto de tejido). Para el injerto de piel dermoepidérmico, el tejido dañado es preferiblemente tejido de piel. En comparación con los injertos de piel no vascularizados, los injertos dermoepidérmicos de piel de hidrogeles vascularizados han demostrado regenerarse más rápido y mejor in vivo, por lo que podrían ser clínicamente útiles. aplicable en el tratamiento de, por ejemplo, quemaduras y otros defectos de la piel.
[0048] Con la ayuda de la presente invención, tanto los vasos sanguíneos como los linfáticos humanos pueden diseñarse en un injerto de tejido u órgano. La red de capilares generada in vitro apoya significativamente la perfusión del componente dérmico y, por lo tanto, brinda un acceso rápido y eficiente al oxígeno y los nutrientes, lo que asegura una rápida toma, proliferación y diferenciación del trasplante de piel (Bottcher-Haberzeth et al., Tissue engineering of skin, Burns 36, 450 460 (2010)). La bioingeniería de una red preformada de capilares linfáticos en injertos de piel dermoepidérmicos debería ayudar a evitar la formación de seroma al mejorar el drenaje linfático y acelerar el establecimiento de la homeostasis de los fluidos tisulares. Las formas de realización adicionales de la invención se establecen en las reivindicaciones dependientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0050] Las formas de realización preferidas de la invención se describen a continuación con referencia a los dibujos, que tienen el propósito de ilustrar las presentes formas de realización preferidas de la invención y no el propósito de limitar las mismas. En los dibujos,
La Fig. 1 muestra la preparación de hidrogeles grandes, en los que A.) muestra el cultivo y la manipulación del hidrogel en general; B.) muestra el manejo y la consistencia de un hidrogel delgado sin comprimir; C.) muestra el manejo y la consistencia de un hidrogel espeso sin comprimir; y D.) muestra el manejo y la consistencia de un hidrogel comprimido delgado.
La Fig. 2 muestra la correlación de la estabilidad mecánica y el espesor del hidrogel en un gráfico de barras esquemático;
La Fig. 3 muestra una representación esquemática del proceso de producción de hidrogeles que contienen estructuras vasculares; primero mostrando la secuencia de pasos para la producción de grandes hidrogeles comprimidos que contienen estructuras vasculares (A); y de grandes injertos de piel dermoepidérmicos vascularizados (B); seguido de los resultados de dichos métodos en estudios de inmunofluorescencia (C, D-panel superior, D') y cortes histológicos (D-panel inferior).
La Fig. 4 muestra, para injertos de tejido prevascularizado sin comprimir, la proporción de células endoteliales (HDMEC) a fibroblastos dérmicos, en a.) con relación al área capilar, en b.) con relación al número de puntos de ramificación por mm2, y en c.) con relación al diámetro capilar medio en pm.
La Fig. 5 muestra las características de los vasos invariables en hidrogeles comprimidos frente a no comprimidos; donde a.) muestra el área del vaso; b.) muestra la cantidad de puntos de ramificación; y c.) muestre la eslora del buque;
La Fig. 6 muestra una representación esquemática de un proceso de producción de un hidrogel comprimido que contiene bioestructuras vasculares en dos variaciones con respecto a la secuencia de pasos,
Las Figuras 7-10 documentación fotográfica de la producción de un injerto de tejido prevascularizado comprimido; donde La Fig. 7 muestra una documentación fotográfica del ensamblaje del matraz y la preparación del hidrogel;
La Fig. 8 muestra una documentación fotográfica del montaje del dispositivo de compresión;
La Fig. 9 muestra una documentación fotográfica del paso de compresión;
La Fig. 10 muestra una documentación fotográfica del paso de transferencia del gel.
DESCRIPCIÓN DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS
[0051] La presente invención está dirigida a un injerto de piel que, contrariamente a la técnica anterior, no solo incluye células de la piel del paciente, sino que también contiene capilares linfáticos y/o sanguíneos "prevascularizados" ex vivo (en vitro) y luego se trasplanta a una herida. Los injertos de piel dermoepidérmica se crearon tomando HDMEC de prepucio humano o SVF de tejido adiposo humano e incrustándolos en hidrogeles tridimensionales. Moviéndose in vivo, los injertos de piel diseñados que contenían los HDMEC, así como fibroblastos humanos o células SVF y queratinocitos, se trasplantaron a las espaldas heridas de ratas desnudas (animales sin un sistema inmunitario funcional). Los injertos de piel humana formaron las capas de piel esperadas después de 2 semanas y los capilares se conectaron funcionalmente con los capilares de rata existentes. Estos hidrogeles dermoepidérmicos diseñados representan potencialmente la próxima generación de injertos de piel, completos con las bioestructuras vasculares sanguíneas y/o linfáticas y listos para el trasplante.
Ejemplo de referencia 1:
Producción de injertos de piel dermoepidérmicos prevascularizados sin com prim ir que contienen capilares sanguíneos y linfáticos
[0052] Se controló el trasplante de injertos de piel dermoepidérmicos humanos que contenían plexo vascular (sangre y linfa) en ratas. En primer lugar, se crearon injertos de piel in vitro usando HDMEC positivos para CD31 (CD31+), fibroblastos positivos para CD90 humanos (CD90+) y queratinocitos positivos para queratina 5 humana (K5+) en hidrogeles de fibrina.
[0053] Ambos tipos de células que constituyen el compartimento dérmico del injerto se dispusieron debajo de varias capas de queratinocitos, el compartimento epidérmico (visibilizado y verificado por micrografía confocal). Estos injertos de la piel se trasplantaron a continuación a las espaldas heridas de ratas nu/nu inmunoincompetentes usando una cámara Fusenig para evitar el crecimiento interno/sobrecrecimiento lateral competitivo de queratinocitos de rata. Dos semanas después del trasplante, se extrajo quirúrgicamente el sustituto de piel humana del tejido subyacente de la rata y se analizó la estructura dérmica y la neovascularización. La neodermis vascularizada apoyó la estratificación de la epidermis superpuesta. El análisis de inmunofluorescencia después de 2 semanas reveló la presencia de sangre humana y microvasos linfáticos en la neodermis. La mayoría de los microvasos linfáticos Proxl-positivos/CD31-positivos (Prox1+/CD31+) creados mediante bioingeniería mantuvieron su luz in vivo. Se detectaron microvasos humanos que expresaban Lyve-1 y podoplanina, lo que indica que los capilares linfáticos humanos permanecieron intactos 2 semanas después del trasplante. También se detectaron microvasos sanguíneos que expresaban únicamente CD31. En particular, nunca se encontró que los dos tipos distintos de microvasos se anastomosaran.
[0054] Un análisis adicional del capilar reveló que los microvasos linfáticos humanos presentaban filamentos de anclaje de fibrilina+, lo que sugiere fuertemente que los capilares podrían reaccionar a las variaciones de presión intersticial y resolver la acumulación de líquido tisular in vivo. Además, los capilares linfáticos humanos creados mediante bioingeniería carecían de cobertura celular mural. Se realizaron experimentos de drenaje linfático para investigar si los capilares linfáticos creados mediante bioingeniería serían funcionales in vivo. Se inyectaron pequeñas cantidades (25 pl) de azul de Evans en los injertos 15 días después del trasplante. Al analizar los injertos 30 minutos después de la inyección, se retuvo aproximadamente cinco veces más azul de Evans en los hidrogeles que contenían solo fibroblastos humanos, en comparación con los hidrogeles que contenían capilares sanguíneos y linfáticos humanos, lo que indica una función de drenaje linfático en los injertos prevascularizados. Estos datos sugieren que los linfáticos humanos injertados fueron reconocidos y anastomosados con los linfáticos del receptor y que el plexo linfático recién desarrollado drenó eficientemente el fluido in vivo.
Materiales y métodos para el Ejemplo 1:
[0055] Se aislaron células humanas (queratinocitos, fibroblastos y células endoteliales) como se describe en Marino et al.
2014, Bioengineering Dermo-Epidermal Skin Grafts with Blood and Lymphatic Capillaries, Sci. Traducir Medicina. 6, 221ra14 (2014). En ese estudio, primero, las hLEC se cocultivaron con fibroblastos dérmicos humanos dentro de hidrogeles 3D para investigar la capacidad de las LEC para convertirse en capilares linfáticos genuinos formadores de lúmenes. Sin embargo, los HDMEC, en lugar de los LEC, se utilizaron para diseñar sustitutos de piel dermoepidérmicos prevascularizados. Se eligieron los HDMEC porque son una mezcla de sangre dérmica y LEC; por tanto, estas células tienen el potencial de dar lugar a ambos tipos de capilares.
Aislam iento y cu ltivo de HDMEC y fibroblastos dérmicos:
[0056] Se coaislaron HDMEC (células endoteliales microvasculares dérmicas humanas) y fibroblastos dérmicos humanos de prepucios (n = 8) obtenidos del University Children's Hospital of Zurich después de circuncisiones de rutina. Los prepucios se procesaron como se describe en Montaño et al., Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices. Tissue Eng. Part A 16, 269-282 (2010). Los HDMEC y los fibroblastos aislados se cocultivaron en placas recubiertas de gelatina al 0,1 % (Sigma-Aldrich) en medio de crecimiento de células endoteliales 2 (EBM-2 MV con suplementos endoteliales; Lonza). Todos los días, los fibroblastos se eliminaron mediante rascado mecánico. Se utilizó el análisis FACS para CD90 (Dianova) y CD31 (DakoCytomation) para calcular el número de fibroblastos y HDMEC (su proporción fue de 1:1 en todos los experimentos). Las células se usaron en el pase 1 en todos los experimentos.
Generación de capilares en hidrogeles:
[0057] Se produjeron hidrogeles de fibrina o colágeno con un sistema Transwell consistente en insertos de cultivo de seis pozos con membranas con poros de 3 mm (BD Falcon). Brevemente, para los hidrogeles de fibrina, se reconstituyó fibrinógeno de plasma bovino (Sigma-Aldrich) en NaCl hasta una concentración final de 10 mg/ml y luego se añadieron 11 ml de trombina (SigmaAldrich, 100 U/ml). Para los hidrogeles de colágeno, las membranas se cubrieron con hidrogeles de colágeno tipo I de cola de rata (3,2 a 3,4 mg/ml, BD Biosciences). La matriz de colágeno se preparó como se describe en Montaño et al., 2010. A 1 ml de solución de hidrogel, 100.000 células dérmicas humanas (HDMECs/fibroblastos, 1:1) (inicialmente, únicamente con fines de investigación, 60.000 hLEC's (aisladas según Marino et al., 2014) en combinación con 40 000 fibroblastos dérmicos humanos) y se transfirieron a un inserto para placas de seis pocillos. Después de la coagulación a temperatura ambiente, las preparaciones se incubaron a 37°C durante 35 min en una incubadora humidificada que contenía 5% de CO2 para asegurar la polimerización. Al final del período de incubación, se agregó medio de cultivo a las cámaras superior e inferior [medio de crecimiento de células endoteliales-2 (EBM-2 MV con suplementos endoteliales; Lonza)] y los hidrogeles se incubaron hasta por 3 semanas. El medio se cambió cada dos días.
Prueba del papel de los fibroblastos en la formación de vasos linfáticos:
[0058] Como se describe en Marino et al., 2014, se produjeron hidrogeles de fibrina como se describe anteriormente y se cultivaron durante 3 semanas in vitro. Los hidrogeles con 0 fibroblastos/100 000 LEC se cultivaron en medio de cultivo, en medio de cultivo más VEGF-A (40 ng/ml, Chemicon), en medio de cultivo más VEGF-C (100 ng/ml, R&D Systems) o en medio de cultivo acondicionado con fibroblastos. Los hidrogeles con 10.000 fibroblastos/90.000 LEC o 40.000 fibroblastos/60.000 LEC en medio de cultivo. Para el ensayo Transwell, se sembraron 100.000 fibroblastos en la parte inferior del Transwell, mientras que en la parte superior se cultivaron hidrogeles con 100.000 LEC. Se observó la migración de un pequeño número de fibroblastos desde la parte inferior del inserto a través de la membrana porosa hacia el interior del hidrogel. El medio de cultivo se cambió todos los días.
[0059] La formación de capilares no se produjo en ausencia de fibroblastos. Del mismo modo, ni el medio acondicionado con fibroblastos, ni la adición de factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) o VEGF-C, ni la presencia de fibroblastos en la parte inferior de un sistema Transwell indujeron la formación de capilares en hLEC. Por lo tanto, el contacto físico entre los fibroblastos dérmicos humanos y las LEC era un requisito para el desarrollo de verdaderos capilares linfáticos ramificados en el hidrogel. La histología reveló que los capilares diseñados desarrollaron un lumen continuo de tamaño fisiológico (17 a 60 mm), medido en muestras completas. La naturaleza linfática de los capilares se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia doble realizada en preparaciones de hidrogel de montaje completo. Los capilares linfáticos creados mediante bioingeniería expresaron CD 31 y el factor de transcripción nuclear específico de los linfáticos Prox1. La mayoría de los capilares mostraron un tamaño fisiológico de los núcleos (10 mm de diámetro). Otros dos marcadores vasculares linfáticos, Lyve-1 y podoplanina, confirmaron la naturaleza linfática de los capilares humanos creados mediante bioingeniería.
[0060] En las pruebas cuyos resultados se muestran en la Fig. 4, se observó el área capilar (Fig. 4a), el número de puntos de ramificación por mm2 (Fig. 4b) y el diámetro capilar medio (Fig. 4c) y cuantificado con respecto a una proporción variable de células endoteliales (HDMEC) a fibroblastos. Para los tres parámetros a.)-c.), la siembra de una proporción de células endoteliales a fibroblastos de 1:1 ha demostrado ser la proporción óptima en términos de formación de capilares en geles sin comprimir, en donde las proporciones de 2:3 y 3:7 también mostró resultados positivos.
Preparación de injertos de piel prevascularizados:
[0061] Después de 2 semanas de cultivo, se sembraron 1 millón de queratinocitos humanos (aislados como se describe en Braziulis et al. 2012) sobre los hidrogeles de fibrina prevascularizados. Una semana después, se realizó el trasplante o la inmunotinción completa.
Injerto de injertos de piel producidos por bioingeniería en ratas nu/nu inmunoincompetentes:
[0062] Se anestesiaron ratas nu/nu hembra inmunoincompetentes (Elevage Janvier) (n = 12) mediante la inhalación de isoflurano al 5 % (Baxter) y se mantuvo la narcosis mediante la inhalación de isoflurano al 2,5 % mediante mascarilla. Previo a la operación se aplicó buprenorfina (0,5 mg/kg) (Temgesic) para analgesia y crema de retinol (Vitamina A “Blache”; Bausch & Lomb) para protección ocular. Para evitar el cierre de la herida lateral y el crecimiento excesivo del trasplante humano por tejido de rata, se diseñó en nuestro laboratorio un anillo especial de polipropileno (cámara de Fusenig modificada), de 2,6 cm de diámetro. Los anillos se suturaron a los defectos cutáneos de espesor total creados en el lomo de las ratas con suturas de poliéster no absorbible (Ethibond; Ethicon). Se colocaron injertos de piel redondos dermoepidérmicos prevascularizados cultivados de aproximadamente 2,6 cm de diámetro y un grosor de 3-8 mm en los anillos de polipropileno y se cubrieron con una lámina de silicona (Silon-SES; Bio Med Sciences) y esponjas de poliuretano (Ligasano; ligado). Las ratas se sacrificaron a los 15 días después de la cirugía. En el momento del sacrificio, se retiraron los apósitos y las suturas y se recogieron múltiples biopsias de injertos (n = 12 ) para diferentes análisis.
Ejemplo de referencia 2: Producción de injertos de piel dermoepidérm icos prevascularizados sin com prim ir que contienen capilares sanguíneos generados por células SVF
[0063] Se controló el trasplante de injertos de piel dermoepidérmicos humanos que contenían un plexo vascular sanguíneo en ratas. En primer lugar, se crearon injertos de piel in vitro utilizando células SVF y queratinocitos en hidrogeles de fibrina.
[0064] Las células SVF se dispusieron debajo de varias capas de queratinocitos, el compartimento epidérmico (que se hizo visible y se verificó mediante micrografía confocal). A continuación, estos injertos de piel se trasplantaron a espaldas heridas de ratas nu/nu inmunoincompetentes usando una cámara Fusenig para evitar el crecimiento interno/sobrecrecimiento lateral competitivo de queratinocitos de rata. Dos semanas después del trasplante, se extrajo quirúrgicamente el sustituto de piel humana del tejido subyacente de la rata y se analizó la estructura dérmica y la neovascularización. La neodermis vascularizada apoyó la estratificación de la epidermis superpuesta. El análisis de inmunofluorescencia después de 2 semanas reveló la presencia de sangre humana en la neodermis. Los microvasos creados con bioingeniería mantuvieron su luz in vivo y se anastomosaron, perfundiendo el injerto, a la vasculatura del receptor tan pronto como 4 días después del trasplante. Esta rápida perfusión desencadenó la supervivencia y la funcionalidad de la piel.
Materiales y métodos para el Ejemplo 2:
[0065] Se aislaron células humanas (queratinocitos y células SVF) como se describe en Klar et al. 2014, Tissueengineered dermo-epidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells, Biomaterials. 2014 junio; 35 (19): 5065-78. En ese estudio, las células SVF se utilizaron para diseñar sustitutos de piel dermoepidérmicos prevascularizados.
Aislam iento y cu ltivo celular:
[0066] Se obtuvieron muestras de tejido adiposo subcutáneo humano ya sea a partir de lipoaspirados o escisiones de grasa de donantes humanos sanos (entre 18 y 68 años de edad), femeninos o masculinos, en su mayoría de localización corporal abdominal, todos ellos sometidos a un liposucción de grasa quirúrgica u operación de escisión. Los lipoaspirados o las muestras de grasa extirpada se trituraron en trozos pequeños y se digirieron con colagenasa tipo II al 0,075 % (p/v) (355 U/mg, Worthington, Lakewood, NJ, EE. UU.) durante 60 min a 37 °C con agitación. Después de centrifugar a 200 g durante 10 min, se desecharon las capas oleosa y acuosa. El sedimento resultante se lavó en una solución tamponada de fosfato (PBS, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se pasó por un colador de 100 mm y 40 mm. Los glóbulos rojos se lisaron mediante incubación durante 2 min con un tampón que contenía cloruro de amonio 0,15 M/l, bicarbonato de potasio 1,0 mM/l (ambos Merck, Darmstadt, Alemania) y Na-EDTA 0,1 mM/l (Fluka Analytical, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Suiza). Después de la centrifugación y el lavado en PBS, el sedimento de células SVF se resuspendió en un medio completo (CM) que constaba de medio Eagle modificado con a (a-MEM, Gibco) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, hepes al 1 %, 1 solución de piruvato de sodio al % y penicilina estreptomicina eglutamina al 1% (100x) (todas de Gibco), teñidas con cristal violeta (Sigma) y contadas usando una cámara de Neubauer. Se aislaron rutinariamente 1,6-0,9 x 105 células nucleadas de 1 ml de una biopsia por liposucción de grasa y 1-0,55 x 105 células nucleadas de 1 g de una biopsia por escisión. Para la expansión monocapa, las células SVF se sembraron a una densidad de 2 x 103 células/cm2 en placas de cultivo tisular, se cultivaron en CM suplementado adicionalmente con 5 ng/ml de FGF-2 (R&D Systems) y se pasaron a una densidad de 3 x 103 células/cm2 cuando confluente. Las células derivadas de tejido adiposo expandidas en monocapa compatibles con el donante se denominarán en lo sucesivo células estromales adiposas (ASC), para distinguirlas de la población de células SVF recién aisladas. Se aislaron y expandieron fibroblastos dérmicos humanos (HDF) y queratinocitos (KC) del prepucio (varones entre 2 y 18 años de edad) como se describe en Pontiggia et al., Markers to evaluate the quality and selfrenewing potential of engineered human skin substitutes
in vitro and after transplantation. J. Invest. Dermatol. 2009; 129:480-90).
Preparación de hidrogeles prevascularizados:
[0067] Se prepararon hidrogeles de fibrina usando fibrinógeno de plasma bovino (Sigma-Aldrich) reconstituido en NaCl al 0,9% a una concentración final de 10 mg/ml. Para lograr una siembra celular comparable dentro del hidrogel, 3 x 105 células SVF, 7,5 x 104 ASC o 7,5 x 104 HDF por 3 ml de gel. La concentración de células SVF se optimizó con respecto a la generación de un plexo capilar dérmico homogéneo y funcional antes del trasplante. Los injertos prevascularizados correspondientes comenzaron a perfundirse eficientemente 3-4 días después del trasplante. La densidad de siembra de las células se normalizó de acuerdo con el número de células mesenquimales, que fue aproximadamente cuatro veces mayor en ASC que en SVF.
[0068] Sembramos 1 x 105 células SVF por 1 ml de hidrogel para reconstituir la piel dérmica. Las células se centrifugaron, se resuspendió en 100 ml de medio EGM-2MV (Lonza, Basilea, Suiza) y se mezcló con 3 ml de la solución de fibrinógeno. Los geles se colocaron en insertos de cultivo celular de 6 pocillos con membranas de 3,0 mm de tamaño de poro (BD Falcon, Alemania). La polimerización se inició agregando 33 ml de trombina (Sigma-Aldrich, 100 U/mL) y los geles se mantuvieron durante 10 min a temperatura ambiente seguidos de 1 h a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía 5 % de CO2. Para preparar hidrogeles de colágeno, se mezcló colágeno de rata tipo I (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) con 0,2 ml de tampón de neutralización que contenía NaOH 0,15 M. Después del período de polimerización, se añadió EGM-2MV a las cámaras superior e inferior de los hidrogeles de fibrina/colágeno, se incubaron durante una o tres semanas y se analizó la formación de redes vasculares. Para preparar sustitutos dermoepidérmicos de la piel (DESS) para el trasplante, las células se cultivaron durante dos semanas en hidrogeles de fibrina/colágeno en medio EGM-2MV, posteriormente se cubrieron con queratinocitos (7,5 x 104/gel), se cultivaron durante una semana más y se trasplantaron a la ratas inmunoincompetentes. Las células del estroma (con o sin CE) formaron el compartimento dérmico, mientras que los queratinocitos constituyeron el tipo celular dominante en el compartimento epidérmico de DESS. Dado que el compartimento dérmico de vascDESS se prevascularizó in vitro, ya contenía una red madura de capilares de ingeniería humana.
Trasplante de sustitutos de piel obtenidos por ingeniería tisular:
[0069] El protocolo quirúrgico fue aprobado por el Comité local para la Investigación Animal Experimental (permiso número 76/2011). Se prepararon y anestesiaron ratas nu/nu hembra inmunoincompetentes, de ocho a diez semanas de edad (Harlan Laboratories, Países Bajos), (como se describe en Pontiggia et al., 2009); tres donantes independientes para SVF (n = 6 por condición; 18 ratas) y ASC (n = 6 por condición; 18 ratas), y cuatro para HDF (n = 4 por condición; 12 ratas) (en total 48 ratas) (Schneider et al., Matriderm versus Integra: un estudio experimental comparativo Burns 2009; 35:51-7). DESS se trasplantaron en defectos de piel de espesor total creados quirúrgicamente en la espalda de las ratas. Para proteger los trasplantes y evitar el cierre de heridas por la piel de rata circundante, se suturaron anillos de acero hechos a medida (diámetro de 2,6 cm) en los defectos de espesor total de la piel creados en la espalda de las ratas, utilizando suturas de poliéster no absorbible (Ethibond_, Ethicon, EE. UU.). Luego, los trasplantes se cubrieron con una lámina de silicona (Silon-SES, BMS, EE. UU.), una esponja de poliuretano (Ligasano, Ligamed, Austria), un vendaje conformador cohesivo (Sincohaft, Theo Frey AG, Suiza) y cinta como apósito para heridas. Por estos medios, el sitio vendado estaba completamente protegido y la rata no podía arañar el trasplante. Los cambios de apósito y las documentaciones fotográficas se realizaron una vez por semana. Después de 4, 7 y 14 días, los análogos de piel trasplantados se extirparon en su totalidad y se procesaron para secciones de crio y parafina, y microscopía electrónica.
Ejemplo 3:
Producción de injertos de piel dermoepidérmicos prevascularizados comprim idos
Materiales y métodos para el Ejemplo 3:
[0070] Se aislaron células humanas (queratinocitos, fibroblastos y células endoteliales) como se describe anteriormente. Se prepararon injertos de tejido a partir de hidrogeles de 7x8 cm de tamaño como se describe a continuación con referencia a las figuras 7-10. Para obtener estabilidad mecánica, se realizó una compresión plástica modificada con el dispositivo de compresión según EP 13174441.
Preparación del hidrogel (como se muestra en la Fig. 7):
[0071] Como se muestra en la Fig. 7, un marco de inserción (A) y un inserto (B) se colocan en un matraz de cultivo de tejidos de 115 cm2. Se resuspenden 1 millón de fibroblastos/células endoteliales (proporción 1:1) en 4 ml de medio de células endoteliales ("células"). 18 ±1 ml de hidrogel de colágeno se vierte en un tubo ("hidrogel"). Se añaden al "hidrogel" ("mezcla") 850 pl de ácido acético filtrado. La "mezcla" se mezcla girando suavemente el tubo.
- Adición de 7,5 ± 0,2 ml de tampón de reconstitución a las células ("células+RB") (el tampón de reconstitución comprende Aqua ad injectabilia, hidróxido de sodio, carbonato de hidrógeno de sodio, tampón HEPES; Referencia
de la receta original: Costea et al: Crucial Effects of Fibroblasts and Keratinocyte Growth Factor on Morphogenesis of Reconstituted Human Oral Epithelium (J Invest Dermatol 121:1479-1486, 2003)
- "células+RB" se mezcla invirtiendo suavemente el tubo.
- "células+ RB" se transfiere a la "mezcla": ("hidrogel final")
- el "hidrogel final" se mezcla invirtiendo suavemente el tubo
- el "hidrogel final" se vierte en el inserto del matraz (B)
Gelificación:
[0072] El matraz se incuba durante 10 ± 2 min a temperatura ambiente (18-26 °C), seguido de incubación durante 30 ± 1 min a 37 ± 1 °C.
[0073] Montaje del d ispositivo de compresión (como se muestra en la Fig. 8):
Para obtener estabilidad mecánica, se realizó una compresión plástica modificada con el dispositivo de compresión según EP 13174441, como se muestra en la Fig. 8:
- La bandeja base (C) es se coloca sobre el marco base (D)
- La placa porosa (E) se coloca en la bandeja base
- Los espaciadores (F) se colocan en la bandeja base
- La placa del pistón (G) se coloca en la placa superior
[0074] Compresión (como se muestra en la Fig. 9):
- El inserto del matraz se transfiere al dispositivo de compresión (H)
- La placa superior con la placa del pistón (I) se agrega al dispositivo de compresión
- Los 3 pesos de compresión (J) se agregados sucesivamente al dispositivo de compresión: 150g por 5min, luego 150g+200g por 5min, luego 150g+200g+500g por 5min
[0075] Transferencia de gel (como se muestra en la Fig. 10):
- Después de 15 ± 1min de tiempo de compresión, el éxito de la compresión es visualmente comprobado
- Los pesos de compresión se retiran del dispositivo de compresión
- La placa del pistón se desbloquea del placa superior (mecanismo de clic)
- La placa superior se retira del dispositivo de compresión con la placa del pistón permaneciendo en el inserto - La placa del pistón se retira del inserto de membrana levantándola con cuidado primero por un lado y luego por el otro lado sin alterar el hidrogel (K)
[0076] Cultivo en gel:
- El inserto con el gel se transfiere al marco del inserto del matraz.
- Se añaden 90 ml de medio de células endoteliales a la base del matraz (dentro de la barrera). El hidrogel debe estar completamente sumergido en el medio.
- Se agregan 10 ml de medio de células endoteliales al gel (dentro del inserto). El hidrogel debe estar completamente sumergido en el medio.
- El matraz se almacena en la incubadora durante 21 días para permitir la formación de la bioestructura vascular.
[0077] Siembra de queratinocitos:
- Se preparan 8 millones de queratinocitos y se resuspenden en 10±2 ml de medio de queratinocitos.
- Se aspira el medio encima del gel.
- Se aspira el medio debajo del gel.
- Se añaden 90±5 ml de medio de células endoteliales a la base del matraz (dentro de la barrera). El gel debe estar completamente sumergido en el medio.
- Se agregan 10±2 ml de medio de queratinocitos al gel (dentro del inserto). El gel debe estar completamente sumergido en el medio.
- El matraz se almacena en la incubadora durante 2 a 4 días para permitir la unión y proliferación de queratinocitos.
[0078] El último paso de proliferación es seguido por
trasplante in vivo
O
Fase líquida de aire para la formación de bioestructura epidérmica:
[0079] Se cultivan queratinocitos durante 4 días en medio de queratinocitos. Luego, la capa de queratinocitos se eleva a la interfaz aire/líquido y se cultiva durante 3 semanas adicionales (de acuerdo con el protocolo de estratificación de líquido de aire: Pontiggia L et al. Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 480-490; doi: 10.1038/jid.2008.254, publicado
en línea el 21 de agosto de 2008).
Análisis:
[0080] La morfología y funcionalidad de los microvasos linfáticos se caracterizaron y analizaron tanto in vitro como in vivo con inmunofluorescencia e histología. El análisis histológico y de montaje completo se realizó como se describe en Marino et al. 2014.
[0081] La Fig. 1 muestra las diferencias en el manejo entre diferentes tipos de hidrogeles. A.) Se prepararon hidrogeles grandes (7x8 cm, colágeno tipo 1) en combinación con células y se cultivaron en matraces que permitieron su extracción para su posterior procesamiento. B.) Hasta ahora, si era necesario crear un hidrogel delgado, por ejemplo, para alcanzar el grosor de la piel humana (0,7-1 mm), su pobre estabilidad mecánica era un problema dramático. C.) Los hidrogeles más gruesos de aproximadamente 10 mm de espesor presentaban una mayor estabilidad mecánica, pero no eran adecuados para la mayoría de los propósitos de ingeniería de tejidos. D.) La compactación/compresión plástica permite la bioingeniería de productos de tejido a base de hidrogel mecánicamente estables, grandes y delgados.
[0082] La Fig. 2 muestra la relación entre la estabilidad mecánica y el grosor del hidrogel para hidrogeles comprimidos frente a hidrogeles sin comprimir. En hidrogeles sin comprimir (columnas negras), la estabilidad mecánica aumenta al aumentar el espesor del hidrogel. En hidrogeles comprimidos del mismo espesor de aproximadamente 0,5 mm, la estabilidad mecánica es aproximadamente 80 veces mayor. La piel humana tiene un grosor de unos 0,7-1 mm, por lo que esta gama de hidrogel es especialmente interesante. De acuerdo con el diagrama de la Fig. 2, los hidrogeles comprimidos de 0,5-3 mm de espesor presentaron una estabilidad mecánica mucho mayor que los hidrogeles no comprimidos del mismo espesor, e incluso mayor que la estabilidad mecánica de los hidrogeles no comprimidos de 10 mm de espesor.
[0083] La Fig. 3 muestra que se pueden crear hidrogeles comprimidos en combinación con bioestructuras vasculares y epidérmicas. En la parte superior, se representa el proceso de producción de hidrogeles que contienen estructuras vasculares e injertos de piel dermoepidérmicos vascularizados. La primera flecha marcada con A muestra que son necesarios cuatro pasos para la creación de grandes hidrogeles comprimidos que contienen estructuras vasculares (mezclar, verter, comprimir, cultivar). La segunda flecha marcada con B muestra que para la ingeniería de grandes injertos de piel dermoepidérmicos vascularizados basados en hidrogeles comprimidos, son necesarios los seis pasos representados (mezclar, verter, comprimir, sembrar, cultivar). En las dos imágenes marcadas con C, las estructuras vasculares se visualizan mediante inmunofluorescencia de montaje completo para un marcador endotelial (CD31) y un marcador linfático nuclear (Prox1) 21 días después de la siembra. En la primera imagen superior, se hacen visibles muchas estructuras vasculares. Esto confirma que los HDMEC se organizan en estructuras vasculares. En la segunda imagen inferior, solo se hacen visibles los vasos linfáticos. Esto confirma que los HDMEC aislados de prepucio humano contienen células endoteliales vasculares sanguíneas tanto linfáticas positivas para Prox1 como negativas para Prox1. En las imágenes etiquetadas con D, la primera imagen superior muestra una inmunofluorescencia de montaje completo para CD31 y un marcador de queratinocitos (Citoqueratina 5), que hace visibles las estructuras vasculares (puntas de flecha) en los injertos de piel debajo de una capa de queratinocitos (flecha). La segunda imagen inferior muestra un corte histológico que hace visible la capa epidérmica y los capilares con lumen. Si los hidrogeles se cultivan más en condiciones aire-líquido, se produce la formación de bioestructuras epidérmicas: En la imagen marcada con D', el análisis de inmunofluorescencia muestra una epidermis estratificada con una deposición de membrana basal (flecha). Esta epidermis está creciendo en el hidrogel que contiene las bioestructuras vasculares (punta de flecha).
[0084] La Fig. 5 muestra que las características de los vasos permanecen invariables en hidrogeles comprimidos (barras blancas) frente a NO comprimidos (barras negras). La formación de vasos se produjo tanto en hidrogeles comprimidos como NO comprimidos. El análisis cuantitativo mostró que el área del vaso y el número de puntos de ramificación eran mayores en los hidrogeles NO comprimidos en comparación con los comprimidos. Sin embargo, el análisis estadístico mostró una diferencia no significativa (p>0,05). La eslora del buque permaneció invariable. Sorprendentemente, esto mostró que el desarrollo del plexo vascular no se vio afectado por la compactación/compresión plástica de los hidrogeles.
[0085] En la Fig. 6, la fila superior muestra la secuencia de producción de la Fig. 3. Sin embargo, es posible invertir los pasos de compresión y cultivo de las células Ca (células del primer y/o segundo tipo sembradas para la formación de la primera bioestructura). Se pueden diseñar otros tejidos utilizando otras células para producir otras bioestructuras en hidrogeles comprimidos. La compresión se puede realizar antes o después de la formación de la estructura. Los injertos de tejido producidos al incluir el paso de compresión son útiles para todo tipo de tejidos delgados, como piel, córnea, cartílago, membranas, endotelio, mucosa, etc.
[0086] El método de la presente invención muestra que, además de los capilares sanguíneos (que pueden ser generados por células HDMEC o SVF), se pueden generar capilares linfáticos funcionales utilizando hidrogeles tridimensionales. Al igual que los vasos linfáticos normales, estos capilares se ramifican, forman la luz y toman líquido in vitro e in vivo después del trasplante en roedores inmunocomprometidos. La formación de capilares linfáticos podría modularse mediante estímulos linfangiogénicos y antilinfangiogénicos, lo que demuestra la utilidad potencial de este sistema para las pruebas in vitro. Las células endoteliales sanguíneas y linfáticas nunca se mezclaron durante el desarrollo de los vasos, ni la sangre y los linfáticos capilares anastomosados bajo las circunstancias descritas. Después del trasplante de los injertos diseñados, los capilares linfáticos humanos se anastomosaron al plexo linfático de la rata desnuda y permitieron el drenaje
de fluidos. Estos datos sugieren que estos injertos/sustitutos de piel con propiedades fisiológicas, estructurales y funcionales podrían aplicarse algún día en pacientes que padecen defectos graves de la piel.
Claims (15)
1. Método para producir un injerto de tejido que comprende al menos los siguientes pasos:
- proporcionar un gel,
- sembrar el gel con células de un primer tipo o células de un primer tipo y un segundo tipo,
- cultivar las células del primer tipo o las células del primer tipo y el segundo tipo en dicho gel hasta la formación de al menos una primera bioestructura en dicho gel por las células del primer tipo o las células del primer tipo y el segundo tipo, donde la primera bioestructura es una estructura vascular,
- donde
o las células del primer tipo son células de la fracción vascular del estroma, SVF, o
o las células del primer tipo son células endoteliales y las células del segundo tipo son fibroblastos, donde las células endoteliales y los los fibroblastos se cocultivan juntos en el gel para la formación de la primera bioestructura, - donde las células de un tercer tipo se siembran en el gel después de que al menos una primera bioestructura haya sido formada en el gel por las células del primer tipo o las células del primer tipo y el segundo tipo, en el que las células del tercer tipo se seleccionan de queratinocitos,
- en el que después de la siembra de las células del tercer tipo, el gel se cultiva hasta la formación de al menos una segunda bioestructura en el gel, en el que la segunda bioestructura es una estructura epidérmica,
- y en el que después de la siembra del gel con las células del primer tipo o las células del primer tipo y el segundo tipo, el gel se compacta.
2. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera bioestructura es un plexo vascular de capilares sanguíneos y/o linfáticos.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células del primer tipo y/o del segundo tipo y/o del tercer tipo son células de mamífero.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las células del primer tipo y/o del segundo tipo y/o del tercer tipo son células autólogas.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células endoteliales y los fibroblastos se siembran y cocultivan en el gel con una proporción de fibroblastos a células endoteliales de al menos 3:7.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las células del primer tipo son células endoteliales seleccionadas del grupo de células endoteliales vasculares sanguíneas humanas, hBEC, y/o células endoteliales linfáticas humanas, hLEC, o una mezcla de las mismas.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que tras la siembra del gel con células del primer tipo o con células del primer tipo y del segundo tipo, se compacta el gel por compresión.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gel se compacta por compresión en un dispositivo de compresión.
9. Método según la reivindicación 8, donde el gel en estado no comprimido tiene un primer espesor, y se realiza la compactación hasta que el gel en estado comprimido alcanza un segundo espesor de 3-20 veces menor que el primer espesor.
10. Un injerto dermoepidérmico de piel, particularmente obtenido por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende un gel, comprendiendo el gel
- al menos una primera bioestructura formada por células de un primer tipo o células de un primer tipo y un segundo tipo en el gel, donde la primera bioestructura es una estructura vascular, donde
- las células del primer tipo son células de fracción vascular estromal, SVF, o
- las células del primer tipo son células endoteliales y las células del el segundo tipo son los fibroblastos, en los que las células endoteliales y los fibroblastos se cultivan conjuntamente en el gel para la formación de la primera bioestructura,
- al menos una segunda bioestructura formada por células de al menos un tercer tipo en el gel, en el que la segunda bioestructura es una estructura epidérmica, y donde las células del tercer tipo se seleccionan de queratinocitos, y - donde el gel es un gel compactado.
11. El injerto dermoepidérmico de piel según la reivindicación 10, en el que las células del primero y/o del segundo y/o el tercer tipo son de origen humano, particularmente de origen humano autólogo.
12. El injerto dermoepidérmico de piel según la reivindicación 10 u 11, en el que la primera bioestructura es un plexo vascular de capilares sanguíneos y linfáticos.
13. El injerto dermoepidérmico de piel según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 , en el que el gel es un hidrogel de fibrina o colágeno.
14. El injerto dermoepidérmico de piel según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el injerto tiene un espesor de 0,2-3 mm.
15. El injerto dermoepidérmico de piel según una de las reivindicaciones 10 a 14 para uso en un método para el tratamiento de tejido dañado, en el que el tejido dañado es tejido de piel.
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