ES2926773T3

ES2926773T3 - Anticuerpos capaces de unirse específicamente a dos epítopos en el inhibidor de la ruta del factor tisular

Info

Publication number: ES2926773T3
Application number: ES14710541T
Authority: ES
Inventors: Krogh Berit Olsen; Mikael Kofod-Hansen; Ida Hilden; Petersen Helle Heibroch; Lars Christian Petersen; Jens Breinholt
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN105209497A; JP2016512214A; US10717784B2; JP6586016B2; US9896513B2; EP2970499A1; CN105209497B; EP2970499B1; WO2014140240A1; US20160032012A1; US20180208675A1

Abstract

La solicitud divulga una combinación de dos anticuerpos TFPI monoespecíficos, donde un anticuerpo es capaz de unirse específicamente a TFPI (1-181) y el otro anticuerpo es capaz de unirse específicamente a TFPI (182-276), así como anticuerpos anti-TFPI biespecíficos derivados de dos de tales anticuerpos monoespecíficos. Tanto la combinación de los dos anticuerpos monoespecíficos como el anticuerpo biespecífico mejoran fuertemente la generación de trombina al neutralizar el TFPIα de longitud completa, incluso cuando la concentración de TFPI es anormalmente elevada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos capaces de unirse específicamente a dos epítopos en el inhibidor de la ruta del factor tisular Campo de la invención

La presente invención se refiere a los anticuerpos, y composiciones de los mismos, que son capaces de unirse a un epítopo en la región N-terminal (residuos 1-181) presentes tanto en el inhibidor de la ruta del factor tisular alfa (TFPIa) como en el TFPI beta (TFPIp) y a otro epítopo dentro de la parte C-terminal (residuos 182-276), presentes solo en el TFPI de longitud completaa. La invención también se refiere a los usos farmacéuticos y terapéuticos de dichos anticuerpos.

Antecedentes

En un individuo que sangra, la coagulación se inicia por el complejo factor tisular/factor VIIa (TF/FVIIa) cuando el TF extravascular se expone al FVIIa en la sangre. La formación de complejos TF/FVIIa conduce a la activación del Factor X (FX) a FXa que, junto con el Factor V activado (FVa), genera una cantidad limitada de trombina. Pequeñas cantidades de trombina activan las plaquetas lo que, a su vez, resulta en la exposición superficial de los fosfolípidos de las plaquetas que soportan el ensamble y la unión del complejo tenasa compuesto por el Factor VIII (FVIIIa) y el Factor IX (IXa) activados. El complejo tenasa es un catalizador muy eficiente de la activación del FX y el FXa generado en esta segunda etapa sirve como la proteasa activa en el complejo FVa/FXa protrombinasa responsable de la ráfaga final de trombina. La trombina escinde el fibrinógeno para generar monómeros de fibrina, que se polimerizan para formar una red de fibrina que sella el vaso que se filtra y detiene el sangrado. La rápida y extensa ráfaga de trombina es un requisito previo para la formación de un coágulo de fibrina sólido y estable.

Una propagación inadecuada del FXa y de la generación de trombina provocada por la deficiencia del FVIII o del FIX es la razón subyacente de las diátesis hemorrágicas en pacientes con hemofilia A o B, respectivamente. En personas con hemofilia, la generación del FXa es conducida principalmente por el complejo TF/FVIIa porque la deficiencia del FVIII o del FIX conduce a una generación rudimentaria del FXa por el complejo tenasa. La activación del FX al FXa mediada por TF/FVIIa es, sin embargo, temporal porque el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) inhibe el Factor Xa y el complejo TF/FVIIa en un lazo autorregulador. La inhibición de la retroalimentación conduce a la formación de un complejo TF/FVIIa/FXa/TFPI. La inhibición neutralizante del TFPI prolonga la activación del FX mediada por TF/FVIIa durante el inicio de la coagulación y, de esta manera, promueve la hemostasia en personas con hemofilia con una generación inadecuada del FXa causada por una actividad alterada de la tenasa debido, por ejemplo, a una deficiencia del FVIII o del FIX.

El TFPI es un inhibidor competitivo de unión estrecha, lento, que regula la activación y la actividad del FX a través de la inhibición tanto de TF-FVIIa como del FXa. La inhibición del FXa mediante el TFPI ocurre en una reacción bifásica que inicialmente conduce a un complejo relajado TFPI-FXa, que después se reordena lentamente en un complejo TFPI-FXa de unión estrecha, donde el segundo dominio inhibidor de tipo Kunitz del TFPI (KPI-2) se une y bloquea el sitio activo del FXa. Después del inicio de la coagulación, la generación del FXa mediada por TF/FVIIa se regula negativamente, de manera muy exacta, mediante el TFPI. El TF/FVIIa se inhibe mediante el TFPI en un proceso que, como una etapa limitante de velocidad, implica la inhibición del FXa mediante el TFPI, ya sea cuando el FXa se une al complejo TF/FVIIa o cuando se une en su cercanía a la membrana (Baugh y otros, 1998, JBC, 273: 4378 4386). El primer dominio inhibidor de tipo Kunitz de TFPI (KPI-1) contribuye a la formación del complejo estrecho TFPI-FXa y directamente se une y bloquea el sitio activo del FVIIa unido al TF. La parte C-terminal del TFPI, que consiste del tercer dominio inhibidor de tipo Kunitz, KPI-3, y la cola C-terminal básica, no tiene ninguna actividad inhibidora directa, pero mejora la formación del complejo TFPI-FXa y se une a la Proteína S y a moléculas similares a la heparina que están involucradas en la localización del TFPIa a la superficie vascular.

El TFPIa inhibe la generación de trombina mediada por FXa por el complejo de protrombinasa a concentraciones de TFPIa fisiológicamente relevantes. Esta inhibición de la retroalimentación funciona principalmente como un impedimento temporal de la fase de inicio de la formación de coágulos. La inhibición del FXa mediante el TFPIa en el complejo de protrombinasa se media a través de una interacción de alta afinidad entre la región básica del TFPIa y una región ácida en FV, que se expone en el FVa de plaquetas y en el FVa cuando se activa inicialmente por FXa. La actividad inhibidora dependiente de FVa del TFPIa se pierde al eliminar la región ácida cuando FVa se escinde más por la trombina generada por el complejo de protrombinasa. El TFPIp carece de la región básica C-terminal y, por lo tanto, no es un inhibidor de la actividad de la protrombinasa (Wood y otros 2013, PNAS, 110: 17838-843). Los anticuerpos que son capaces de unirse al TFPI se conocen en la técnica. Por ejemplo, los documentos WO2010/072691, WO2012/001087 y WO2012/135671 describen anticuerpos monoclonales (mAb), cada uno de los cuales es capaz de unirse a un epítopo específico del TFPI. Las siguientes limitaciones pueden aplicarse a un anticuerpo de este tipo que se dirige a un único epítopo del TFPI, por ejemplo, en un dominio de KPI, que típicamente está restringido al área del parátopo de un anticuerpo definido por una única región variable. En primer lugar, la inhibición final del complejo TF/FVIIa/FXa depende de varias interacciones entre las áreas complementarias dispersas sobre el TFPI y el complejo TF/FVIIa/FXa. Esto se aplica no solo a la unión directa de KPI-1 y KPI-2 del TFPI a los sitios activos del FVIIa y del FXa, respectivamente, sino también a las interacciones con exositios de TF/FVIIa/FXa que involucran regiones de las regiones N- y C-terminales del TFPI. Un anticuerpo monoclonal que se une, por ejemplo, a un único KPI puede no ser capaz de bloquear completamente todas las funciones inhibidoras del TFPI, particularmente a concentraciones fisiológicamente elevadas del TFPI. En segundo lugar, el direccionamiento del TFPI con un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo puede causar que el TFPI se acumule en la circulación como resultado de un aclaramiento renal reducido del complejo TFPI-mAb, o como resultado de otros mecanismos de aclaramiento que se reducen debido a la formación del complejo TFPI-mAb. La dosificación de algunos anticuerpos monoclonales también puede causar la liberación de TFPI del endotelio y el aumento rápido de los niveles de TFPI en el plasma, de manera similar a lo que se ha observado después de la dosificación de la heparina o un aptámero, que se une al KPI-3 y a la cola C-terminal del TFPI (Wong y otros Hemofilia, 2012, 18: LB-^wE 03,1 p831, Hoppensteadt y otros, Thromb. Res., 77: 175-185). En tercer lugar, puede ser conveniente dirigirse a un grupo específico de TFPI. Se cree que el TFPIa circulante de longitud completa es de particular importancia para la regulación de la coagulación en un sitio de lesión. El hecho de que, de todos los grupos de TFPI, solo el TFPIa de longitud completa posee una región C-terminal expuesta (residuos 182-276) hace posible dirigirse selectivamente al grupo de TFPIa de longitud completa. Al dirigirse únicamente al grupo de TFPIa de longitud completa y no, por ejemplo, al TFPIp o TFPI asociado a lipoproteínas, puede reducirse la disposición del fármaco mediada por la diana, lo que conduce a semividas prolongadas del fármaco in vivo y requisitos de dosis más bajos. Sin embargo, los anticuerpos conocidos dirigidos específicamente a la región C-terminal del TFPIa no son capaces de neutralizar completamente la actividad de TFPIa, especialmente a concentraciones elevadas del TFPI. Los inventores prevén que los anticuerpos - y sus combinaciones - que se describen en la presente descripción pueden abordar dichas limitaciones.

Sumario

En la presente descripción se describe un anticuerpo biespecífico que es capaz de unirse específicamente a dos epítopos en el TFPI, el primero de los cuales se ubica dentro del TFPI (1-181) (SEQ ID NO: 1) y el segundo de los cuales se ubica dentro del TFPI (182-276) (numeración con relación a la SEQ ID NO: 1). El primero de dichos epítopos puede estar en el dominio KPI-1 del TFPI. Alternativamente, el primero de dichos epítopos puede estar en el dominio KPI-2 del TFPI. El segundo de dichos epítopos está en el dominio KPI-3 del TFPI. El anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo de longitud completa o puede ser una proteína conjugada o de fusión de dos fragmentos de anticuerpos, tal como un conjugado Fab-Fab o proteína de fusión.

Un anticuerpo biespecífico de la invención es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-2 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio KPI-3 del TFPI, en donde la cadena pesada que se une al KPI-2 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 3;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 66 de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 7;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 110 de la SEQ ID NO: 3;

en donde la cadena ligera que se une al KPI-2 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 4;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 4;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 4; en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 9;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 9;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 107 de la SEQ ID NO: 9; y en donde la cadena ligera que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 24 a 34 de la SEQ ID NO: 10;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 10;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 89 a 97 de la SEQ ID NO: 10.

Un segundo anticuerpo biespecífico de la invención es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio KPI-3 del TFPI, en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 26;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 26; • una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 26;

en donde la cadena ligera que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 24 a 34 de la SEQ ID NO: 27;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 27;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 27; en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

Un tercer anticuerpo biespecífico de la invención es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio KPI-3 del TFPI, en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 22;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 51 a 66 de la SEQ ID NO: 22;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 104 de la SEQ ID NO: 22;

en donde la cadena ligera que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 33 de la SEQ ID NO: 23;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 49 a 55 de la SEQ ID NO: 23;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 88 a 96 de la SEQ ID NO: 23;

en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

Un cuarto anticuerpo biespecífico de la invención es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio KPI-3 del TFPI, en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 24;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 24;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 24;

en donde la cadena ligera que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 34 de la SEQ ID NO: 25;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 25;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 25;

en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 9; • una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 9; • una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 107 de la SEQ ID NO: 9;

y en donde la cadena ligera que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 24 a 34 de la SEQ ID NO: 10; • una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 10; • una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 89 a 97 de la SEQ ID NO: 10.

Un quinto anticuerpo biespecífico de la invención es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio KPI-3 del TFPI,

en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 30;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 30;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 30;

en donde la cadena ligera que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 34 de la SEQ ID NO: 31;

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 31 y

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 31;

en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 107 de la SEQ ID NO: 9;

y en donde la cadena ligera que se une al KPI-3 comprende

En la presente descripción se describe también una combinación de dos anticuerpos monoespecíficos, en donde el primer anticuerpo monoespecífico es capaz de unirse específicamente al TFPI (1-181) y el segundo anticuerpo monoespecífico es capaz de unirse específicamente al TFPI (182-276). El primer anticuerpo puede unirse específicamente al dominio KPI-1 del TFPI o al dominio KPI-2 del TFPI y el segundo anticuerpo puede unirse específicamente al dominio KPI-3 del TFPI.

La formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico o la combinación de anticuerpos monoespecíficos de acuerdo con la invención puede encontrar utilidad como un medicamento.

Una composición farmacéutica de la invención comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-2 y un segundo anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al epítopo KPI-2 comprende

en donde la cadena ligera que se une al epítopo KPI-2 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 4;

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los residuos de aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 9; • una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 9;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 107 de la SEQ ID NO: 9; y en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

Una segunda composición farmacéutica de la invención comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3, en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 104 de la SEQ ID NO: 22, y

en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

Una tercera composición farmacéutica de la invención comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 24; y

en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 25; y

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 25

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

Una cuarta composición farmacéutica de la invención comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3, en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 26;

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 26;

en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 27;

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

y en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

Una quinta composición farmacéutica de la invención comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 31;

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

y en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra que la generación de trombina se potenció fuertemente por el anticuerpo combinado dirigido al KPI-2 y KPI-3 del TFPI en plasma humano en condiciones similares a la hemofilia A con niveles aumentados del TFPI. La generación de trombina (ensayo TGT) se midió con un grupo de plasma humano normal (NHP) con vesículas de fosfatidil colina/fosfatidil serina 10 pM. El inicio de la coagulación se indujo mediante la recalcificación y adición del factor tisular lipidado 1 pM (Innovin®). La curva (a) muestra el resultado obtenido en NHP sin más adiciones. La curva (b) muestra el resultado cuando se obtienen condiciones similares a la hemofilia A mediante la adición de 100 pg/ml de anticuerpo anti-FVIII humano de oveja (comercialmente disponible). La curva (c) muestra que la adición del TFPIa de longitud completa 20 nM al plasma similar a la hemofilia A suprimió completamente la generación de trombina. La curva (d) muestra que la supresión de la generación de trombina, como resultado del TFPIa de longitud completa 20 nM en combinación con la neutralización del FVIII, solo se revirtió parcialmente mediante la adición del mAb 2021 200 nM que se une específicamente al KPI-2. La curva (e) muestra que estas mismas condiciones evitaron por completo que el mAb 4F110 200 nM se uniera específicamente a KPI-3 al revertir la inhibición de TFPI tal como para permitir la reversión de una generación de trombina detectable. La curva (f) muestra que, por el contrario, una combinación del mAb 4F110 100 nM que se une al KPI-3 combinado con el mAb 2021 100 nM que se une al KPI-2 revirtió efectivamente la inhibición del TFPI y restauró la generación de trombina hasta aproximadamente el nivel obtenido en NHP sin anticuerpos a FVIII (curva (a)).

La figura 2A-D muestra la neutralización por los mAb y conjugados Fab-Fab de la inhibición de TFPIp de la generación del FXa mediada por TF/FVIIa en la superficie celular. Las células wt EA.hy926 se incubaron con concentraciones crecientes de los mAb o conjugados Fab-Fab. La actividad de FXa en el sobrenadante se midió después de la incubación con FVIIa 50 pM y FX 50 nM a 37 °C con diversas concentraciones (0 - 60 nM) de mAb 2021 (A), mAb 4F110: (B), conjugado Fab-Fab 9002 (C) o conjugado Fab-Fab 9004 (D). Los cuadrados muestran el efecto del anticuerpo policlonal anti TF humano de cabra a 0,5 mg/ml junto con el conjugado de mAb o Fab-Fab 60 nM. Los resultados se muestran como media ± SD, (n=3).

La figura 3 muestra que la generación de trombina se potenció fuertemente mediante el anticuerpo combinado dirigido al KPI-2 y KPI-3 del TFPI en plasma humano en condiciones similares a la hemofilia A con niveles aumentados del TFPI mediante el uso de un formato de anticuerpo biespecífico asimétrico.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos del TFPI alfa humano.

La SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos del TFPI (1-181).

La SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del Fab 0088. La SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del Fab 0088.

La SEQ ID NO: 5 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del Fab 0094. La SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del Fab 0094.

La SEQ ID NO: 7 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del Fab 0095. La SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del Fab 0095.

La SEQ ID NO: 9 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del Fab 0089 La SEQ ID NO: 10 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del Fab 0089.

La SEQ ID NO: 11 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 22F66.

La SEQ ID NO: 12 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 22F66.

La SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 22F71.

La SEQ ID NO: 14 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 22F71.

La SEQ ID NO: 15 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 22F74.

La SEQ ID NO: 16 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 22F74.

Las SEQ ID NO: 17-21 representa las secuencias de nucleótidos de los cebadores.

La SEQ ID NO: 22 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 1F91.

La SEQ ID NO: 23 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 1F91.

La SEQ ID NO: 24 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 2F3.

La SEQ ID NO: 25 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 2F3.

La SEQ ID NO: 26 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 2F22.

La SEQ ID NO: 27 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 2F22.

La SEQ ID NO: 28 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 2F35.

La SEQ ID NO: 29 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 2F35.

La SEQ ID NO: 30 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 2F45.

La SEQ ID NO: 31 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 2F45.

La SEQ ID NO: 32 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 2021

La SEQ ID NO: 33 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 2021.

La SEQ ID NO: 34 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 0094.

La SEQ ID NO: 35 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 0094.

La SEQ ID NO: 36 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 0095.

La SEQ ID NO: 37 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 0095.

La SEQ ID NO: 38 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 4F110.

La SEQ ID NO: 39 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 4F110.

La SEQ ID NO: 40 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del Fab 2F22.

La SEQ ID NO: 41 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del Fab 2F22.

La SEQ ID NO: 42 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 22F132.

La SEQ ID NO: 43 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 22F132.

La SEQ ID NO: 44 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 22F79.

La SEQ ID NO: 45 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 22F79.

La SEQ ID NO: 46 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 41F41.

La SEQ ID NO: 47 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 41F41.

La SEQ ID NO: 48 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del mAb 4F110.

La SEQ ID NO: 49 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del mAb 4F110.

La SEQ ID NO: 50 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del mAb 2021.

La SEQ ID NO: 51 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del mAb 2021.

La SEQ ID NO: 52 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del Fab 0296.

La SEQ ID NO: 53 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del Fab 0296.

La SEQ ID NO: 54 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del mAb 0094.

La SEQ ID NO: 55 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del mAb 0094.

La SEQ ID NO: 56 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del mAb 0095.

La SEQ ID NO: 57 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del mAb 0095.

La SEQ ID NO: 58 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del Fab 0313.

La SEQ ID NO: 59 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del Fab 0313.

La SEQ ID NO: 60 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (VH) del mAb 41F30.

La SEQ ID NO: 61 representa la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (VL) del mAb 41F30.

La SEQ ID NO: 62 representa la secuencia de aminoácidos del TFPI KPI-1/N-terminal etiquetado

La SEQ ID NO: 63 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC) del mAb 0309

La SEQ ID NO: 64 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del mAb 0309

La SEQ ID NO: 65 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (HC)) del mAb 0312.

La SEQ ID NO: 66 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (LC) del mAb 0312.

La SEQ ID NO: 67 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada 1 (HC1) del mAb 0325.

La SEQ ID NO: 68 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera 1 (LC1) del mAb 0325

La SEQ ID NO: 69 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada 2 (HC2) del mAb 0325.

La SEQ ID NO: 70 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera 2 (LC2) del mAb 0325.

Descripción

In vivo, el inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) se encuentra en varios compartimentos. Una fracción importante del TFPI se asocia con el endotelio vascular y una fracción menor circula en la sangre. Dos variantes de empalme del TFPI, el TFPI alfa (TFPIa) y el TFPI beta (TFPIp) se han descrito en seres humanos. El TFPIp es presumiblemente la forma predominante expresada en la superficie de la célula endotelial, mientras que los almacenamientos intracelulares del TFPIa pueden liberarse en la circulación ante determinados estímulos. El TFPIa circula en la sangre tanto como proteína de longitud completa como truncada, asociada con lipoproteínas o en plaquetas.

El TFPIa humano maduro es una proteína de 276 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) compuesta de una región N-terminal ácida, tres dominios inhibidores de tipo Kunitz dispuestos en tándem (KPI-1, KPI-2 y KPI-3) intercalados por regiones enlazadoras y una cola C-terminal básica. Los dominios KPI-1, KPI-2 y KPI-3 se definen como los residuos 26-76, los residuos 97-147 y los residuos 189-239, respectivamente, de la SeQ ID NO: 1. El TFPIp maduro es una proteína de 193 aminoácidos unida covalentemente a la superficie de la célula endotelial a través de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI). Los primeros 181 aminoácidos del TFPIp son idénticos al TFPIa (correspondiente a los residuos 1-181 de la SEQ ID NO: 1) mientras que los 12 aminoácidos finales de la secuencia C-terminal no están relacionados al TFPIa y tienen un anclaje de GPI unido al residuo 193.

En la presente descripción se describe una combinación de dos anticuerpos monoespecíficos que se unen a dos epítopos distintos y/o únicos en el TFPIa. En la presente descripción se describe un anticuerpo biespecífico que se deriva de dichos dos anticuerpos monoespecíficos. Uno de los anticuerpos monoespecíficos, de los cuales se deriva un sitio de reconocimiento al antígeno (o “brazo”) del anticuerpo biespecífico, se dirige hacia un epítopo en la región KPI-1/KPI-2 del TFPI, en la presente descripción definido como TFPI (1-181), que puede ser el TFPI humano (1-181) (SEQ ID NO: 2). El segundo anticuerpo monoespecífico, del cual se deriva el segundo sitio de reconocimiento al antígeno (o “brazo”) del anticuerpo biespecífico, se dirige hacia la “región KPI-3” solo presente en el TFPIa, en la presente descripción se define como TFPⁱ(182-276).

“Región KPI-1/KPI-2” en la presente descripción se refiere a los residuos de aminoácidos 1-181 del TFPI (es decir, TFPI (1-181)), que puede ser TFPI humano (1-181) (SEQ ID NO: 2) y, por lo tanto, abarca los dominios KPI-1 y KPI-2 del TFPI. “Región KPI-3” en la presente descripción se refiere a los residuos de aminoácidos 182-276 del TFPI (es decir, TFPI (182-276)) y por lo tanto, abarca el dominio KPI-3 y la cola C-terminal del TFPI. Por lo tanto, un anticuerpo monoespecífico o un brazo del anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítopo que se ubica dentro de la región KPI-1/KPI-2 del TFPI (es decir, TFPi 1-181), que incluye la región ácida cerca del N-terminal, KPI-1, KPI-2, la región enlazadora entre KPI-1 y KPI-2 y la primera porción de la región enlazadora entre KPI-2 y KPI-3. El segundo anticuerpo monoespecífico o segundo brazo del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse específicamente a un epítopo que se ubica dentro de los residuos de aminoácidos 182-276 presentes solo en el TFPI de longitud completaa, pero no en el TFPIp. Los residuos 182-276 corresponden a la segunda porción de la región enlazadora entre KPI-2 y KPI-3, el dominio KPI-3 y la cola C-terminal básica.

La combinación de dos anticuerpos monoespecíficos de la invención o el anticuerpo biespecífico de la invención pueden tener un perfil superior cuando su efecto procoagulante se compara con el efecto aditivo anticipado de los anticuerpos individuales de los cuales se deriva. Por ejemplo, los dos anticuerpos monoespecíficos combinados, o el anticuerpo biespecífico puede ser capaz de bloquear todas las funciones inhibidoras del TFPIa, incluso cuando la concentración del TFPIa es elevada con relación a, por ejemplo, los niveles fisiológicos normales. El enlace de dos restos de unión al antígeno dirigidos hacia dos epítopos separados, como se describe en la presente descripción, para obtener un anticuerpo biespecífico o un conjugado Fab-Fab, puede, debido a un efecto de avidez, conducir a una neutralización más potente de la actividad del TFPIa que la obtenida por el efecto combinado de los dos restos de unión al antígeno separados. No es un requisito previo que ambos anticuerpos monoespecíficos, de los que se deriva la combinación inventiva o el anticuerpo biespecífico, tengan una actividad procoagulante detectable cuando se prueban solos, un hallazgo que es particularmente sorprendente. El efecto que surge del anticuerpo o el único brazo del anticuerpo biespecífico, dirigido hacia la región KPI-1/KPI-2, puede modular la actividad de todos los grupos de TFPI mientras que el efecto superior de la combinación de los dos anticuerpos monoespecíficos, o el anticuerpo biespecífico, modulará preferentemente la actividad del TFPIa de longitud completa.

El anticuerpo biespecífico descrito en la presente descripción puede ser capaz de modular selectivamente la actividad de un grupo específico de TFPI, específicamente TFPIa. . Un único brazo del anticuerpo biespecífico, capaz de unirse a la región KPI-1/KPI-2, puede en sí mismo, como un anticuerpo monoespecífico, ser incapaz de evitar significativamente la actividad inhibidora del TFPI. Sin embargo, puede contribuir de manera más significativa al bloqueo específico de la inhibición del TFPIa cuando el segundo brazo del anticuerpo biespecífico se une a la región KPI-3 del TFPIa. Dicho anticuerpo biespecífico puede, de esta manera, ser capaz de neutralizar la inhibición del TFPI de longitud completaa. La unión al TFPIp de dicho anticuerpo biespecífico dependerá exclusivamente del brazo que se dirige a la región KPI-1/KPI-2. El debilitamiento de la unión a la región KPI-1/KPI-2 disminuirá preferentemente la unión al TFPIp mientras que la neutralización de la inhibición del TFPIa todavía permanece esencialmente intacta debido al direccionamiento del segundo brazo del anticuerpo biespecífico a la región KPI-3. Debido a la reducción o ausencia del direccionamiento al TFPIp o TFPI asociado a lipoproteínas, dicho debilitamiento de la afinidad a la región KPI-1/KPI-2 de un brazo en dicho anticuerpo biespecífico también puede dar como resultado una reducción de la disposición del fármaco mediada por la diana que conduce a una semivida del fármaco in vivo prolongada y/o a requisitos de dosis de anticuerpo más bajas.

La afinidad del componente de direccionamiento de la región KPI-3 del anticuerpo biespecífico puede ser suficiente por sí sola para garantizar el acoplamiento eficiente del TFPI. Debido al efecto de avidez, puede entonces ser posible disminuir sustancialmente la unión al TFPIp en las células endoteliales mientras se preserva un efecto eficiente en el plasma con neutralización de la actividad del TFPIa. Esto puede obtenerse mediante el debilitamiento de la unión del componente de direccionamiento a KPI-1/KPI-2 del anticuerpo biespecífico a un punto donde el efecto de avidez de los dos parátopos unidos entre sí todavía está presente. Dichos anticuerpos pueden construirse al seleccionar anticuerpos dirigidos a determinados epítopos y al ajustar las afinidades absolutas y relativas de los componentes de unión KPI-1/KPI-2 y KPI-3 del anticuerpo biespecífico mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Adicionalmente, la selectividad y otras propiedades de dicho anticuerpo biespecífico pueden modularse al variar el formato biespecífico.

El término “TFPI” como se usa en la presente descripción, abarca formas de origen natural del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) que pueden derivarse de cualquier organismo adecuado. Por ejemplo, el TFPI para usar como se describe en la presente descripción puede ser un TFPI de mamífero, tal como TFPI humano, de ratón, de rata, de primate, bovino, ovino, de conejo o porcino. Preferentemente el TFPI es TFPI humano. El TFPI puede ser una forma madura del TFPI tal como una proteína TFPI que experimentó el procesamiento postraduccional dentro de una célula adecuada. Tal proteína TFPI madura puede, por ejemplo, estar glicosilada. El TFPI puede ser una proteína TFPI de longitud completa. El término TFPI también abarca variantes, isoformas y otros homólogos de tales moléculas del TFPI. La actividad TFPI se refiere a su actividad inhibidora. Generalmente las variantes de moléculas del TFPI pueden caracterizarse por tener el mismo tipo de actividad que el TFPI de origen natural, tal como la capacidad de neutralizar la actividad catalítica del FXa, o la capacidad de inhibir un complejo de TF-FVIIa/FXa.

El término “anticuerpo” en la presente descripción se refiere a una proteína, derivada de una secuencia de inmunoglobulina, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno o una porción del mismo. El término anticuerpo incluye, pero no se limita a, anticuerpos de longitud completa de cualquier clase (o isotipo), es decir, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM y/o IgY. El término también puede incluir uno o más fragmentos de anticuerpos de longitud completa que se unen a antígenos. Un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, o a una porción del mismo, puede unirse exclusivamente a ese antígeno, o a una porción del mismo, o puede unirse a un número limitado de antígenos homólogos, o porciones de los mismos.

Los anticuerpos de longitud completa de origen natural generalmente comprenden al menos cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que se conectan mediante enlaces disulfuro. En algunos casos, los anticuerpos de origen natural comprenden menos de cuatro cadenas, como en el caso de los anticuerpos con solo una cadena pesada que se encuentran en los camélidos (fragmentos V^hH) y los IgNAR encontrados en Chondrichthyes. Una clase de inmunoglobulinas de interés farmacéutico particular son las IgG. En seres humanos, la clase IgG puede subdividirse en cuatro subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, en base a la secuencia de sus regiones constantes de cadena pesada. Las cadenas ligeras pueden dividirse en dos tipos, cadenas kappa y lambda en base a diferencias en su composición de secuencias. Las moléculas de IgG están compuestas por dos cadenas pesadas, interconectadas por dos o más enlaces disulfuro, y dos cadenas ligeras, cada una unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro. Una cadena pesada de IgG puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) y hasta tres regiones constantes de cadena pesada (CH): CH1, CH2 y CH3. Una cadena ligera puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables (HVR), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Las regiones VH y VL están compuestos, típicamente, por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los dominios variables con las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera forman un dominio que es capaz de interactuar con un antígeno, mientras que la región constante de un anticuerpo puede mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen, pero no se limitan a, diversas células del sistema inmunológico (células efectoras), receptores Fc y el primer componente (C1q) del complejo C1 del sistema de complemento clásico.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden aislarse. El término “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo que se ha separado y/o recuperado de otro(s) componente(s) en el ambiente en el que se produjo y/o que se ha purificado a partir de una mezcla de componentes presentes en el ambiente en el que se produjo.

El término “anticuerpo monoespecífico”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo que tiene un único sitio de reconocimiento al antígeno (es decir, monovalente) o dos sitios de reconocimiento al antígeno idénticos (es decir, bivalente), cada uno de los cuales es específico para un antígeno diana común.

Los anticuerpos monoespecíficos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos monoclonales, en el sentido de que representan un conjunto de secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera únicas, como las que se expresan a partir de una única célula B o por una población clonal de células B. Los anticuerpos pueden producirse y purificarse mediante el uso de diversos métodos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse a partir de células de hibridomas. Los anticuerpos pueden producirse mediante la expansión de células B. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden expresarse de manera recombinante en sistemas de expresión microbiana o de mamíferos, o mediante traducción in vitro. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos también pueden expresarse de manera recombinante como moléculas unidas a la superficie celular, por medio de, por ejemplo, la exposición en fagos, la exposición en bacterias, la exposición en levadura, la exposición en células de mamífero o la exposición en ARNm o ribosoma. Una vez producidos, los anticuerpos pueden cribarse por su capacidad para unirse al TFPI (1-181), al TFPIa y al TFPIp, de longitud completa, tal como TFPI (1-181) humano, FPIa humano y TFPIp humano de longitud completa.

Los diversos fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos también pueden ser anticuerpos monoespecíficos de acuerdo con la presente invención, ya que se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. El término “fragmento de unión al antígeno” de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene(n) la capacidad de unirse o reconocerse específicamente un antígeno, tal como TFPIa, , tal como TFPIa humano (SEQ ID NO: 1), tal como TFPI humano (1-181) (SEQ ID NO: 2), tal como TFPI humano (182-276, numeración de acuerdo con la SeQ ID NO: 1), tal como el TFPIp, tal como el TFPIp humano u otra molécula diana, como se describe en la presente descripción. Los ejemplos de los fragmentos de unión al antígeno incluyen Fab, Fab', Fab², Fab'², FabS, Fv (típicamente, los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo), Fv de cadena única (scFv; véase, por ejemplo, Bird y otros, Science (1988) 242:42S-426; y Huston y otros PNAS (1988) 85: 5879-5883), los fragmentos dsFv, Fd (típicamente, el dominio VH y CH1) y dAb (típicamente un dominio VH); los dominios VH, VL, VhH, y V-NAR; las moléculas monovalentes que comprenden una única cadena VH y una única cadena VL; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y cuerpos kappa (véase, por ejemplo, Ill y otros Protein Eng (1997) 10:949-57); IgG de camello; IgNAR; así como también una o más CDR aisladas o un parátopo funcional, donde las CDR aisladas o los residuos o polipéptidos de unión al antígeno pueden asociarse o unirse juntos para formar un fragmento de anticuerpo funcional. Diversos tipos de fragmentos de anticuerpos se han descrito o revisado en, por ejemplo, Holliger y Hudson, Nat Biotechnol (2005) 23: 1126-1136; el documento WO2005040219, y las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas 20050238646 y 20020161201. Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante el uso de técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos pueden cribarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los “fragmentos Fab” de un anticuerpo, que incluyen fragmentos “Fab”, “Fab'” y ”Fab'²”, pueden derivarse de dicho anticuerpo por escisión de la cadena pesada en la región de bisagra en el extremo N-terminal o C-terminal de los residuos de cisteína de la bisagra que conectan las cadenas pesadas del anticuerpo. Un fragmento “Fab” incluye los dominios variable y constante de la cadena ligera y el dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos “Fab'²” comprenden un par de fragmentos “Fab'” que se unen generalmente de manera covalente por sus cisteína de la bisagra. Un Fab' se deriva formalmente de un fragmento Fab'²por escisión de los enlaces disulfuro de la bisagra que conectan las cadenas pesadas en el Fab'². Además, en la técnica se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos diferentes de los enlaces disulfuro. Un fragmento Fab retiene la capacidad del anticuerpo parental para unirse a su antígeno, potencialmente con una afinidad más baja. Los fragmentos Fab'²son capaces de unirse de manera divalente, mientras que los fragmentos Fab y Fab' pueden unirse de manera monovalente. Generalmente, los fragmentos Fab carecen de los dominios constantes CH2 y CH3, es decir la parte Fc, donde ocurriría la interacción con los receptores Fc. Por lo tanto, los fragmentos Fab en general carecen de funciones efectoras. Los fragmentos Fab pueden producirse mediante métodos conocidos en la técnica, ya sea mediante escisión enzimática de un anticuerpo, por ejemplo, mediante el uso de papaína para obtener el Fab o la pepsina para obtener el Fab'², los fragmentos Fab que incluyen Fab, Fab', Fab'²pueden producirse de manera recombinante mediante el uso de técnicas que se conocen bien por los expertos en la técnica.

Un fragmento “Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión al antígeno y comprende generalmente un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en una asociación que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en un fragmento del dominio variable de cadena única (scFv). Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables o un subconjunto de las mismas confieren al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable único que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno puede retener la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque usualmente a una afinidad más baja que la del sitio de unión completo (Cai y Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 6280 6285). Por ejemplo, los anticuerpos de camélidos de origen natural que solo tienen un dominio variable de la cadena pesada (Vh H) pueden unirse al antígeno (Desmyter y otros, J. Biol. Chem. (2002) 277: 23645-23650; Bond y otros, J. Mol. Biol. (2003) 332: 643-655).

Los fragmentos de anticuerpos “Fv de cadena única” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además, un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun, 1994, En: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315.

El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión al antígeno, en los que los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH y VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios variables en la misma cadena, los dominios variables se fuerzan a aparearse con dominios complementarios de otra cadena, lo que crea dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y otros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 90:6444-6448.

La expresión “anticuerpos lineales” se refiere a anticuerpos como se describe en Zapata y otros, 1995, Protein Eng., 8(10):1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos contienen un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

El término “monocuerpo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de unión al antígeno con un dominio variable de la cadena pesada y ningún dominio variable de la cadena ligera. Un monocuerpo puede unirse a un antígeno en ausencia de cadenas ligeras y tiene típicamente tres regiones hipervariables, por ejemplo, las CDR denominadas CDRH1, CDRH2 y CDRH3. Un monocuerpo de cadena pesada de IgG tiene dos moléculas de unión al antígeno de cadena pesada conectadas mediante un enlace disulfuro. El dominio variable de la cadena pesada comprende una o más regiones hipervariables, preferentemente, una región CDRH3 o HVL-H3.

Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante el uso de técnicas convencionales de modificación por ingeniería genética recombinante o de proteínas y los fragmentos pueden cribarse para la unión al TFPI (1-181), TFPIa y TFPIp de longitud completa u otra función de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los fragmentos de anticuerpos pueden hacerse mediante truncamiento, por ejemplo, mediante eliminación de uno o más aminoácidos de los extremos N y/o C-terminal de un polipéptido. Los fragmentos pueden generarse, además, mediante una o más deleciones internas.

El término “anticuerpo biespecífico” en la presente descripción se refiere a un anticuerpo que tiene dos sitios de reconocimiento al antígeno distintos y/o únicos o “brazos” que le permiten acoplar dos antígenos diferentes o dos epítopos diferentes en el mismo antígeno. El término “anticuerpo multiespecífico” se refiere a un anticuerpo con la capacidad de acoplar dos o más antígenos diferentes o dos o más epítopos diferentes en el mismo antígeno. Los anticuerpos multiespecíficos comprenden por lo tanto anticuerpos biespecíficos.

Los anticuerpos biespecíficos en formato de IgG de longitud completa, que imitan los anticuerpos de origen natural, pueden generarse mediante la fusión de dos hibridomas individuales para formar un cuadroma híbrido que produce una mezcla de anticuerpos que incluyen una fracción de anticuerpos heterodimerizantes biespecíficos (Chelius D. y otros; MAbs. 2010 mayo-junio; 2(3): 309-319). Los anticuerpos heterodimerizantes biespecíficos pueden producirse alternativamente mediante el uso de tecnologías recombinantes. La heterodimerización puede lograrse, además, mediante la modificación por ingeniería genética de la interfaz de dimerización de la región Fc para promover la heterodimerización. Un ejemplo de estas son las denominadas mutaciones de botón en agujero donde las cadenas laterales estéricamente voluminosas (botones) se introducen en un Fc acoplado mediante cadenas laterales estéricamente pequeñas (agujeros) en el Fc opuesto lo que crea de esta manera la heterodimerización estérica promovida por la complementariedad. Otros métodos para la heterodimerización de las interfaces Fc modificadas por ingeniería genética son la complementariedad electrostática, la fusión a dominios de heterodimerización no IgG o el uso del fenómeno natural de intercambio de brazo Fab de IgG4 humana para controlar la heterodimerización. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos heterodimerizados se describen bien en la literatura, por ejemplo, (Klein C, y otros; MAbs. 2012 noviembre-diciembre; 4(6): 653-663). Debe prestarse especial atención a las cadenas ligeras en los anticuerpos heterodiméricos. El emparejamiento correcto de las LC y HC puede lograrse mediante el uso de una cadena ligera común. Una vez más, la modificación por ingeniería genética de la interfaz LC/HC puede usarse para promover la heterodimerización o modificación por ingeniería genética del entrecruzamiento de cadena ligera como en CrossMabs. El reensamblaje in vitro bajo condiciones de reducción suave de anticuerpos de dos IgG individuales que contienen mutaciones apropiadas pueden usarse además para generar biespecíficos (por ejemplo, Labrijn y otros, PNAS, 110, 5145-5150 (2013)). Además, se informa el método de intercambio de brazo Fab natural para asegurar el emparejamiento correcto de las cadenas ligeras.

Las moléculas basadas en anticuerpos multiespecíficos pueden expresarse, además, de manera recombinante como proteínas de fusión que combinan los módulos naturales de las IgG para formar derivados de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes como se describe en la literatura. Los ejemplos de anticuerpos de fusión son DVD-Igs, IgG-scFV, diacuerpos, DART, etc. (Kontermann, MAbs. 2012 marzo-abril 4(2): 182-197). En las proteínas de fusión pueden incorporarse las etiquetas específicas de detección o purificación, los restos de extensión de la semivida u otros componentes. Las modalidades adicionales que no son IgG también pueden incorporarse en las proteínas de fusión. Los anticuerpos biespecíficos de longitud completa en base a la heterodimerización de Fc se denominan comúnmente como IgG asimétricas, independientemente de la metodología de apareamiento LC.

Las moléculas basadas en anticuerpos multiespecíficos pueden producirse, además, mediante conjugación química o acoplamiento de IgG de longitud completa individuales o acoplamiento de fragmentos de IgG para formar derivados de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes como se describe en la literatura. Ejemplos de anticuerpos de fusión son Fab'²acoplados químicamente, dímero de IgG, etc. (Kontermann, MAbs. 2012 marzo-abril 4(2): 182 197). En las proteínas conjugadas pueden incorporarse las etiquetas específicas de detección o purificación, las moléculas de extensión de la semivida u otros componentes. Los polipéptidos adicionales que no son IgG también pueden incorporarse en las proteínas de fusión. En los ejemplos se proporciona un ejemplo de tal anticuerpo biespecífico.

Las moléculas multiespecíficas también pueden producirse mediante la combinación de métodos recombinantes y químicos que incluyen los descritos anteriormente.

Un anticuerpo biespecífico de la presente invención puede comprender un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo mAb 2021, un anticuerpo monoclonal que se describió por primera vez en el documento WO2010/072691.

Un anticuerpo biespecífico de la presente invención puede comprender un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo mAb 2F22.

Un anticuerpo biespecífico de la presente invención puede comprender un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo mAb 2F3; el anticuerpo mAb 2F45; el anticuerpo mAb 1F91 o el anticuerpo 2F35.

Un anticuerpo biespecífico de la invención puede comprender además un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo mAb 4F110, el anticuerpo mAb 22F66 o el anticuerpo mAb 22F71, anticuerpos monoclonales que se describieron por primera vez en el documento WO2012/001087 o, alternativamente, un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo mAb 22F74, como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede comprender un fragmento Fab de uno de los anticuerpos mencionados anteriormente. Un anticuerpo biespecífico de la invención puede comprender además una variante de fragmento Fab en base a uno de los anticuerpos mencionados anteriormente, tales como Fab 0094 o Fab 0095 o Fab 0313 (derivados del mAb 2021) como se describe en la presente descripción.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales de la invención pueden obtenerse por conjugación química de dos anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a diferentes epítopos del TFPI:

mAb1 (o fragmento)-mAb2 (o fragmento)

mAb1 (o fragmento)-enlazador-mAb2 (o fragmento)

El enlace puede ser un enlace covalente simple (enlace directo) o comprender un birradical descrito generalmente como:

en donde X es al menos, pero no se limita a, un átomo seleccionado del grupo que consiste de carbono, oxígeno, azufre, fósforo y nitrógeno. * muestra las posiciones de las conexiones de este birradical. El término “birradical” se refiere a un compuesto químico de electrones pares con dos centros radicales libres que actúan independientemente entre sí.

En una modalidad, el enlazador es una cadena compuesta por no más de 40 átomos.

En una modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende la estructura birradical con la estructura

En una modalidad, la parte del enlazador comprende el birradical que tiene una estructura simétrica (enlazador homobifuncionalizado).

El enlazador también puede ser un polímero de estructura similar a la descripción anterior.

En una modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un polímero: una macromolécula compuesta de unidades estructurales repetidas que se conectan mediante enlaces químicos covalentes. Dicho polímero puede ser hidrófilo.

El término hidrófilo o "soluble en agua" se refiere a restos que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Los métodos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua se conocen bien en la técnica.

Los polímeros solubles en agua ilustrativos incluyen péptidos, sacáridos, (poli)éteres, (poli)aminas, ácidos (poli)carboxílicos y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mezcladas y componerse de un único aminoácido, por ejemplo, (poli)lisina. Un polisacárido ilustrativo es el ácido (poli)siálico. Un (poli)éter ilustrativo es el (poli)etilenglicol. La (poli)etilenimina es una poliamina ilustrativa, y el ácido (poli)acrílico es un ácido (poli)carboxílico representativo.

Muchos otros polímeros también son adecuados. Las cadenas principales poliméricas que son solubles en agua son particularmente útiles. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli(alquilenglicoles), tales como poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli([alfa]-hidroxi ácido), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), tal como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,629,384, así como también copolímeros, terpolímeros, y mezclas de los mismos.

El enlazador polimérico es, preferentemente, lineal.

Aunque el peso molecular de cada cadena polimérica individual puede variar, el peso molecular promedio del polímero está típicamente en el intervalo de aproximadamente 1000 Da (1 kDa) a aproximadamente 40 000 Da (40 kDa), tal como de aproximadamente 1000 Da a aproximadamente 12000 Da; tal como de aproximadamente 2000 Da a aproximadamente 11 000 Da; tal como de aproximadamente 2000 Da a aproximadamente 3000 Da; de aproximadamente 3000 Da a aproximadamente 4000 Da; de aproximadamente 4000 a aproximadamente 5000 Da; de aproximadamente 5000 a aproximadamente 6000 Da; de aproximadamente 6000 a aproximadamente 7000 Da; de aproximadamente 7000 a aproximadamente 8000 Da; de aproximadamente 8000 a aproximadamente 9000 Da; de aproximadamente 9000 a aproximadamente 10 000 Da; o de aproximadamente 10 000 a aproximadamente 11000 Da. Debe entenderse que estos tamaños representan estimaciones en lugar de medidas exactas. De acuerdo con una modalidad preferida, las moléculas se conjugan con una población heterogénea de polímeros hidrófilos.

En una modalidad particular, un resto químico usado en el enlazador comprende polietilenglicol (PEG).

El término “PEG”, en la presente descripción, se refiere a un birradical que comprende la estructura

en donde n' es un número entero mayor que 1.

El PEG se prepara mediante polimerización de óxido de etileno y está disponible comercialmente en un amplio intervalo de pesos moleculares. El PEG es, preferentemente, lineal.

Además, el “PEG” puede referirse a un compuesto de polietilenglicol o derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento, restos de acoplamiento o activadores (por ejemplo, con un resto de ácido carboxílico/éster activo, ceto, alcoxiamina, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, alquino, azida o una maleimida). Los otros enlazadores mencionados en la presente descripción también pueden estar con o sin agentes de acoplamiento, restos de acoplamiento o activadores (por ejemplo, con un resto de ácido carboxílico/éster activo, ceto, alcoxiamina, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, alquino, azida o maleimida)

En una modalidad particular, el PEG es monodisperso. En otra modalidad particular, el PEG es polidisperso.

El PEG polidisperso se compone de moléculas de PEG que tienen diversos pesos moleculares. La distribución de tamaño puede caracterizarse estadísticamente por su peso, peso molecular promedio (Mw) y su peso molecular promedio numérico (Mn), cuya relación se denomina índice de polidispersión (Mw/Mn) (véase, por ejemplo, “Polymer Synthesis and Characterization”, J. A. Nairn, Universidad de Utah, 2003). El Mw y el Mn pueden medirse mediante espectroscopía de masa.

El índice de polidispersión puede ser un número que es mayor o igual a uno y puede estimarse a partir de los datos cromatográficos de permeación en gel. Cuando el índice de polidispersión es 1, el producto es monodisperso y por lo tanto se compone de compuestos con un peso molecular único. Cuando el índice de polidispersión es mayor que 1, el polímero es polidisperso, y el índice de polidispersión indica cuán amplia es la distribución de polímeros con diferentes pesos moleculares. El índice de polidispersión aumenta típicamente con el peso molecular del PEG. En modalidades particulares, el índice de polidispersión del PEG es i) más abajo de 1,06, ii) más abajo de 1,05, iii) más abajo de 1,04, iv) más abajo de 1,03 o v) entre 1,02 y 1,03.

Diferentes formas del PEG están disponibles, en dependencia del iniciador usado para el proceso de polimerización. Numerosos métodos para la conjugación de sustituyentes de PEG se describen en Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 459-476, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 214-221 DOI:10.1038/nrd1033, Adv Polym Sci, 2006, 192, 95-134, DOI 10.1007/12_022, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2005 y referencias en ellas. Alternativamente, la conjugación del sustituyente de polímero hidrófilo podría llevarse a cabo mediante el uso de métodos enzimáticos. Tales métodos son, por ejemplo, el uso de transglutaminasas como se describe en el documento WO2006134148.

Para efectuar la unión covalente de la(s) molécula(s) polimérica(s) al polipéptido, los grupos terminales de la molécula polimérica se proporcionan en forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos. Las moléculas poliméricas activadas adecuadas se disponen comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, EE.UU., Rapp Polymere GmbH, Tübingen, Alemania, o de PolyMASC Pharmaceuticals plc, Reino Unido. Alternativamente, las moléculas poliméricas pueden activarse por métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento WO 90/13540. Los ejemplos específicos de polímeros de PEG activados se describen en la patente de Estados Unidos Núms. 5,932,462 y 5,643,575. Además, las publicaciones siguientes describen moléculas poliméricas útiles y/o productos químicos por PEGilación: documentos WO2003/031464, WO2004/099231.

La conjugación del anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo con las moléculas poliméricas activadas puede realizarse mediante el uso de cualquier método convencional, por ejemplo, como se describe en las referencias siguientes (que describen, además, los métodos adecuados para la activación de moléculas poliméricas): R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson y otros, (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y., Bioconjugate Techniques, Segunda Edición, Greg T. Hermanson, 2008, Holanda, Elsevier). El experto estará al tanto de que el método de activación y/o la química de conjugación a usarse depende del(de los) grupo(s) de unión del polipéptido (ejemplos de los cuales se proporcionaron adicionalmente anteriormente), así como también de los grupos funcionales del polímero (por ejemplo, que sean amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfhidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona o haloacetato). La PEGilación puede dirigirse hacia la conjugación a todos los grupos de unión disponibles en el polipéptido (es decir, dichos grupos de unión que se exponen en la superficie del polipéptido) o pueden dirigirse hacia uno o más grupos de unión específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal o un tiol. Además, la conjugación puede lograrse en una etapa o de manera escalonada.

En otra modalidad, un resto químico usado como el enlazador es el almidón de hidroxietilo. El término “almidón de hidroxietilo” (HES/HAES), como se usa en la presente descripción, se refiere a un derivado de almidón no iónico. Los diferentes tipos de almidones de hidroxietilo se describen típicamente por su peso molecular promedio, típicamente alrededor de 130 a 200 kDa.

En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende ácido polisiálico.

En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un polímero de heparosano que se describe, por ejemplo, en Glycobiology (2011) 21: 1331-1340.

En otra modalidad, un resto químico en el enlazador se usa para unir al menos una de las proteínas de un glicano: un polisacárido o un oligosacárido que se une a una proteína.

En otra modalidad, un resto químico en el enlazador se usa para unir al menos una de las proteínas de un glicano unido a O.

En otra modalidad, un resto químico en el enlazador se usa para unir al menos una de las proteínas de un glicano unido a N.

Tanto los N-glicanos como los O-glicanos se unen a proteínas tales como mAb mediante las células que producen estas proteínas. La maquinaria de N-glicosilación celular reconoce y glicosila las señales de N-glicosilación (motivos N-X-S/T) en la cadena de aminoácidos, a medida que la proteína naciente se transloca desde el ribosoma al retículo endoplásmico (Kiely y otros, J. Biol. Chem. 1976, 251: 5490; Glabe y otros, J. Biol. Chem., 1980, 255, 9236). Igualmente, los O-glicanos se unen a sitios de O-glicosilación específicos en la cadena de aminoácidos, pero los motivos que desencadenan la O-glicosilación son mucho más heterogéneos que las señales de N-glicosilación y nuestra capacidad para predecir los sitios de O-glicosilación en las secuencias de aminoácidos todavía es inadecuada (Julenius y otros, Glycobiology, 2005, 15: 153). Los métodos de conjugación de polipéptidos con varios grupos poliméricos laterales se describen, por ejemplo, en el documento WO0331464.

En otra modalidad, un resto químico usado en el enlazador comprende un resto químico, que se usa para unir dicho enlazador a al menos una de las proteínas con una estructura seleccionada de los birradicales:

Los anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos humanos o humanizados. Se pretende que el término “anticuerpo humano”, como se usa en la presente descripción, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que al menos una porción de una región marco y/o al menos una porción de una región CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. (Por ejemplo, un anticuerpo humano puede tener regiones variables en los que tanto las regiones marco como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana.) Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante o una porción de la misma se deriva, además, de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).

Tal anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Tal anticuerpo monoclonal humano puede producirse por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende repertorios de segmentos génicos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, fusionados a una célula inmortalizada.

Los anticuerpos humanos pueden aislarse a partir de bibliotecas de secuencias incorporadas en selecciones de secuencias de líneas germinales humanas, diversificadas adicionalmente con una diversidad de secuencias natural y sintética.

Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con el virus Epstein-Barr.

El término “derivado de anticuerpo humano” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

El término “anticuerpo humanizado”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo quimérico humano/no humano que contiene una secuencia (regiones CDR o partes de las mismas) derivadas de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado es, por tanto, una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de al menos una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de un anticuerpo de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de un ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad, composición de secuencias y funcionalidad convenientes. En algunos casos, los residuos del marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Un ejemplo de tal modificación es la introducción de una o más de las denominadas mutaciones de retroceso, que son, típicamente, residuos de aminoácidos derivados del anticuerpo donante. La humanización de un anticuerpo puede realizarse mediante el uso de técnicas recombinantes conocidas por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, editado por Benny K. Lo). Un marco receptor humano adecuado para el dominio variable de cadena ligera y pesada puede identificarse mediante, por ejemplo, homología estructural o de secuencia. Alternativamente, pueden usarse marcos receptores fijos, por ejemplo, basados en el conocimiento de la estructura, las propiedades biofísicas y bioquímicas. Los marcos receptores pueden derivarse de la línea germinal o derivarse de una secuencia de anticuerpos maduros. Las regiones c Dr a partir del anticuerpo donante pueden transferirse mediante injerto de CDR. El anticuerpo humanizado injertado con CDR puede optimizarse adicionalmente, por ejemplo, la afinidad, la funcionalidad y las propiedades biofísicas mediante la identificación de posiciones de marco crítico donde la re introducción (mutación de retroceso) del residuo de aminoácido del anticuerpo donante tiene un impacto beneficioso sobre las propiedades del anticuerpo humanizado. Además de las mutaciones de retroceso derivadas de anticuerpos donantes, el anticuerpo humanizado puede modificarse por ingeniería genética mediante la introducción de residuos de la línea germinal en las regiones CDR o del marco, eliminación de epítopos inmunogénicos, mutagénesis dirigida a un sitio, maduración por afinidad, etc.

Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el comportamiento del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá al menos uno - típicamente dos - dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y en la que todos o sustancialmente todos los residuos de las FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede, opcionalmente, comprender además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente, la de una inmunoglobulina humana.

El término “derivado de anticuerpo humanizado” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humanizado, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente químico o anticuerpo o fragmento de anticuerpo o polipéptido.

El término “anticuerpo quimérico”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo cuyos genes de la cadena ligera y pesada se han construido, típicamente, mediante ingeniería genética, a partir de genes de región variable y constante de inmunoglobulinas que se originan de especies diferentes. Por ejemplo, los segmentos variables de genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a regiones constantes humanas.

La región cristalizable del fragmento (“región FcVdominio Fc”) de un anticuerpo es la región C-terminal de un anticuerpo, que comprende los dominios constantes CH2 y CH3. El dominio Fc puede interactuar con receptores de la superficie celular denominados, receptores de Fc, así como también con algunas proteínas del sistema de complemento. La región Fc permite que los anticuerpos interactúen con el sistema inmunológico. Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden modificarse por ingeniería genética para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente, para alterar una o más de sus propiedades funcionales, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc, la estabilidad de proteínas y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno, o la carencia de los mismos, entre otros. Además, un anticuerpo descrito en la presente descripción puede modificarse químicamente (por ejemplo, uno o más restos químicos pueden unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Un anticuerpo IgG1 puede portar un dominio Fc modificado que comprende una o más, y quizás todas las siguientes mutaciones que darán como resultado una menor afinidad por determinados receptores de Fc (L234A, L235E y G237A) y una disminución de la fijación del complemento mediada por C1q (A330S y P331S), respectivamente (numeración de residuos de acuerdo con el índice de la EU).

El isotipo de un anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser IgG, tal como IgG1, tal como IgG2, tal como IgG4. Si se desea, la clase de un anticuerpo puede “conmutarse” mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, un anticuerpo que se produjo originalmente como una molécula IgM puede cambiarse de clase a un anticuerpo IgG. Las técnicas de cambio de clase pueden usarse, además, para convertir una subclase de IgG a otra, por ejemplo: de IgG1 a IgG2 o IgG4; de IgG2 a IgG1 o IgG4; o de IgG4 a IgG1 o IgG2. Además, puede realizarse la modificación por ingeniería genética de los anticuerpos para generar moléculas quiméricas de región constante, mediante la combinación de regiones de diferentes subclases de IgG.

En una modalidad, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región de bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe además, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5,677,425 por Bodmer y otros

La región constante puede modificarse para estabilizar el anticuerpo, por ejemplo, para disminuir el riesgo de que un anticuerpo bivalente se separe en dos fragmentos monovalentes de VH-V^l. Por ejemplo, en una región constante lgG4, el residuo S228 (de acuerdo con el índice de numeración de la EU, S241 de acuerdo con Kabat) puede mutarse a un residuo de prolina (P) para estabilizar la formación de puente disulfuro entre las cadenas pesadas en la bisagra (véase, por ejemplo, Angal y otros, Mol Immunol. 1993; 30:105-8).

Pueden generarse anticuerpos biespecíficos o dos anticuerpos monoespecíficos que se unen a dos epítopos únicos en el TFPI mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. Pueden prepararse formatos biespecíficos, por ejemplo, mediante conjugación química de dos fragmentos de anticuerpos - tales como dos fragmentos Fab o scFv, ya sea directamente o a través de un enlazador que proporcione la flexibilidad necesaria para un funcionamiento adecuado. Un método específico para acoplar fragmentos Fab es usar la funcionalidad tiol en residuos de cisteína colocados apropiadamente en los fragmentos Fab.

Los anticuerpos o fragmento de los mismos pueden definirse en términos de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR). El término “región determinante de complementariedad” o “región hipervariable”, cuando se usa en la presente descripción, se refiere a las regiones de un anticuerpo en el que se ubican los residuos de aminoácidos involucrados en la unión al antígeno. La región de hipervariabilidad o CDR puede identificarse como las regiones con la mayor variabilidad en los alineamientos de aminoácidos de dominios variables de anticuerpos. Las bases de datos pueden usarse para la identificación de las CDR tales como la base de datos de Kabat, las CDR, por ejemplo, se definen como que comprenden los residuos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; (Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación del NIH núm. 91-3242). Alternativamente, las CDR pueden definirse como los residuos de un "lazo hipervariable" (residuos 26-33 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (H3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196: 901 917). Típicamente, la numeración de residuos de aminoácidos en esta región se realiza mediante el método descrito en Kabat y otros, supra. Las frases tales como “posición Kabat”, “residuo de Kabat” y "de acuerdo con Kabat" en la presente descripción se refieren a este sistema de numeración para dominios variables de la cadena pesada o dominios variables de la cadena ligera. Con el uso del sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, un marco (FR) o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (residuo 52a, 52b y 52c de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de CDR H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etcétera de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.

Los términos “región marco” o residuos “FR” se refieren a los residuos de aminoácidos VH o VL que no están dentro de las CDR, como se define en la presente descripción.

El anticuerpo de la invención puede comprender una región CDR de uno o más de los anticuerpos específicos descritos en la presente descripción, tales como una región CDR de dentro de las SEQ ID NO: 3 a 61, como se define mediante el uso de la numeración de Kabat o de acuerdo con la numeración de aminoácidos secuencial descrita en la presente descripción.

Por lo tanto, un anticuerpo monoespecífico de la invención que es capaz de unirse al TFPI (1-181) puede tener la porción del anticuerpo biespecífico de la invención que se une al TFPi (1-181) también puede comprender dichas regiones CDR.

Un anticuerpo monoespecífico de la invención que es capaz de unirse al TFPI (1-181) puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 3, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 110 de la SEQ ID NO: 3, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente.

Un anticuerpo monoespecífico de la invención que es capaz de unirse al TFPI (1-181) puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 4; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 4; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 4.

Un anticuerpo monoespecífico de la invención que es capaz de unirse al TFPI (182-276) puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 9, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 9, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-107 de la SEQ ID NO: 9, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

Un anticuerpo monoespecífico de la invención que es capaz de unirse al TFPI (182-276) puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 10, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 10, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 10, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

Un anticuerpo monoespecífico que es capaz de unirse al TFPI (182-276) puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31-35 de la SEQ ID NO: 11, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 11, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-106 de la SEQ ID NO: 11, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

Un anticuerpo monoespecífico que es capaz de unirse al TFPI (182-276) puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-33 de la SEQ ID NO: 12, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 49-55 de la SEQ ID NO: 12, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 88-96 de la SEQ ID NO: 12, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

La porción de un anticuerpo biespecífico que se une al TFPI (182-276) puede comprender además dichas regiones CDR.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31-35 de la SEQ ID NO: 13, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 13, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-111 de la SEQ ID NO: 13, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 14, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 14, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 14, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31-35 de la SEQ ID NO: 15, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 15, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-106 de la SEQ ID NO: 15, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 16, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 16, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 16, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

La porción de un anticuerpo biespecífico que se une al TFPI (182-276) puede comprender dichas regiones CDR.

Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la invención que es capaz de unirse al TFPI (1-181) puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 36 de la SEQ ID NO: 22, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 51 a 66 de la SEQ ID NO: 22, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 104 de la SEQ ID NO: 22, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente.

Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la invención que es capaz de unirse al TFPI (1-181) puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 33 de la SEQ ID NO: 23, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 49 a 55 de la SEQ ID NO: 23, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 88 a 96 de la SEQ ID NO: 23, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 24, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 24, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 24, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 34 de la SEQ ID NO: 25, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 25, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 25, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

Un anticuerpo monoespecífico que es capaz de unirse al TFPI (1-181) puede tener una cadena pesada que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 28, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 66 de la SEQ ID NO: 28, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 105 de la SEQ ID NO: 28, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente.

Un anticuerpo monoespecífico que es capaz de unirse al TFPI (1-181) puede tener una cadena ligera que comprende:

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 39 de la SEQ ID NO: 29, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 29, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 29, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31 a 35 de la SEQ ID NO: 30, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 65 de la SEQ ID NO: 30, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 30, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24 a 34 de la SEQ ID NO: 31, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 31, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 31, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31-35 de la SEQ ID NO: 42, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-105 de la SEQ ID NO: 42, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 43, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 43, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 43, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31-35 de la SEQ ID NO: 44, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 44, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-109 de la SEQ ID NO: 44, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 45, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 45, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 45, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31-36 de la SEQ ID NO: 46, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 51-66 de la SEQ ID NO: 46, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-106 de la SEQ ID NO: 46, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-38 de la SEQ ID NO: 47, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 54-60 de la SEQ ID NO: 47, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 93-101 de la SEQ ID NO: 47, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 31-35 de la SEQ ID NO: 60, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-66 de la SEQ ID NO: 60, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos puede sustituirse por un residuo de aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99-107 de la SEQ ID NO: 60, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

• una secuencia de CDR1 correspondiente a los aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 61, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 61, en donde uno de estos residuos de aminoácidos puede sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 61, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

Dichos anticuerpos monoespecíficos pueden combinarse para formar un anticuerpo biespecífico KPI-1 / KPI-3. En una modalidad, un anticuerpo específico del dominio KPI-1 o fragmento del mismo se combina con la región C-terminal (182-276 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1) anticuerpo específico o fragmento del mismo para formar un anticuerpo biespecífico en formato de longitud completa, entre otros, o conjugado Fab-Fab.

En una de dicha modalidad, el mAb 1F91 (SEQ ID NO: 22 y 23) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F74 (SEQ ID NO: 15 y 16) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 1F91 (SEQ ID NO: 22 y 23) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F132 (SEQ ID NO: 42 y 43) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 1F91 (SEQ ID NO: 22 y 23) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F79 (SEQ ID NO: 44 y 45) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 1F91 (SEQ ID NO: 22 y 23) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F41 (SEQ ID NO: 46 y 47) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 1F91 (SEQ ID NO: 22 y 23) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F30 (SEQ ID NO: 60 y 61) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F3 (SEQ ID NO: 24 y 25) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F74 (SEQ ID NO: 15 y 16) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F3 (SEQ ID NO: 24 y 25) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F132 (SEQ ID NO: 42 y 43) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F3 (SEQ ID NO: 24 y 25) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F79 (SEQ ID NO: 44 y 45) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F3 (SEQ ID NO: 24 y 25) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F41 (SEQ ID NO: 46 y 47) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F3 (SEQ ID NO: 24 y 25) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F30 (SEQ ID NO: 60 y 61) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F22 (SEQ ID NO: 26 y 27) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F74 (SEQ ID NO: 15 y 16) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F22 (SEQ ID NO: 26 y 27) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F132 (SEQ ID NO: 42 y 43) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F22 (SEQ ID NO: 26 y 27) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F79 (SEQ ID NO: 44 y 45) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F22 (SEQ ID NO: 26 y 27) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F41 (SEQ ID NO: 46 y 47) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F22 (SEQ ID NO: 26 y 27) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F30 (SEQ ID NO: 60 y 61) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F35 (SEQ ID NO: 28 y 29) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F74 (SEQ ID NO: 15 y 16) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F35 (SEQ ID NO: 28 y 29) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F132 (SEQ ID NO: 42 y 43) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F35 (SEQ ID NO: 28 y 29) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F79 (SEQ ID NO: 44 y 45) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F35 (SEQ ID NO: 28 y 29) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F41 (SEQ ID NO: 46 y 47) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F35 (SEQ ID NO: 28 y 29) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F30 (SEQ ID NO: 60 y 61) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F45 (SEQ ID NO: 30 y 31) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F74 (SEQ ID NO: 15 y 16) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F45 (SEQ ID NO: 30 y 31) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F132 (SEQ ID NO: 42 y 43) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F45 (SEQ ID NO: 30 y 31) o fragmento del mismo se combina con el mAb 22F79 (SEQ ID NO: 44 y 45) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F45 (SEQ ID NO: 30 y 31) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F41 (SEQ ID NO: 46 y 47) o fragmento del mismo.

En una de dicha modalidad, el mAb 2F45 (SEQ ID NO: 30 y 31) o fragmento del mismo se combina con el mAb 41F30 (SEQ ID NO: 60 y 61) o fragmento del mismo.

Un anticuerpo variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10 o más sustituciones y/o deleciones y/o inserciones de aminoácidos de las secuencias y fragmentos específicos discutidos anteriormente. Las variantes de “deleción” pueden comprender la deleción de aminoácidos individuales, la deleción de pequeños grupos de aminoácidos tales como 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o la deleción de regiones de aminoácidos más grandes, tales como la deleción de dominios de aminoácidos específicos u otras características. Las variantes de “inserción” pueden comprender la inserción de aminoácidos individuales, la inserción de pequeños grupos de aminoácidos tales como 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o la inserción de regiones de aminoácidos más grandes, tales como la inserción de dominios de aminoácidos específicos u otras características. Las variantes de "sustitución", preferentemente, implican la sustitución de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y la realización de sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, un aminoácido puede sustituirse con un aminoácido alternativo que tiene propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales que pueden usarse para seleccionar sustituyentes adecuados son las siguientes:

Las "variantes" o "derivados" preferentes incluyen aquellas en las que en lugar del aminoácido de origen natural que aparece en la secuencia comprende un análogo estructural del mismo. Los aminoácidos usados en las secuencias también pueden derivatizarse o modificarse, por ejemplo, marcarse, lo que proporciona que la función del anticuerpo no se vea afectada adversamente de manera significativa.

Las sustituciones pueden ser, pero no se limitan a, sustituciones conservadoras.

Los derivados y variantes como se describió anteriormente pueden prepararse durante la síntesis del anticuerpo o por modificación posterior a la producción, o cuando el anticuerpo está en forma recombinante mediante el uso de técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o ligadura de ácidos nucleicos.

También se describen en la presente descripción los polinucleótidos que codifican los anticuerpos descritos en la presente descripción. Los términos “molécula de ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento génico, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede proporcionarse en forma aislada o purificada.

Una secuencia de ácido nucleico que “codifica” un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Dichas secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero no se limitan a, ADNc a partir del ARNm viral, procariota o eucariota, secuencias genómicas de ADN o a Rn viral o procariota, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción puede ubicarse 3' a la secuencia codificante.

En una modalidad, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos VH o VL como se describió anteriormente. Por ejemplo, un polinucleótido puede codificar un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 11 o una variante o fragmento de la misma como se describió anteriormente. Una secuencia de polinucleótidos adecuada puede ser alternativamente una variante de una de estas secuencias de polinucleótidos específicas. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, deleción o adición de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores. Un polinucleótido variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 75 o más sustituciones y/o deleciones de ácidos nucleicos de las secuencias dadas en el listado de secuencias.

Las variantes adecuadas pueden ser al menos 70 % homólogas a un polinucleótido que codifica un polipéptido como se describe en la presente descripción, preferentemente, al menos 80 o 90 % y con mayor preferencia al menos 95 %, 97 % o 99 % homólogas al mismo. Los métodos para medir la homología se conocen bien en la técnica y los expertos en la técnica entenderán que en el presente contexto, la homología se calcula sobre la base de la identidad del ácido nucleico. Tal homología puede existir en una región de al menos 15, preferentemente al menos 30, por ejemplo, al menos 40, 60, 100, 200 o más nucleótidos contiguos. Tal homología puede existir en toda la longitud de la secuencia de polinucleótidos no modificada.

En la técnica se conocen métodos para medir la homología o identidad de polinucleótidos. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo, usado en su configuración predeterminada) (Devereux y otros (1984) Nucleic Acids Research 12: 387-395).

Los algoritmos PILEUP y BLAST también pueden usarse para calcular la homología o alinear secuencias (típicamente en su configuración predeterminada), por ejemplo, como se describe en Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S.F. y otros (1990) J Mol Biol 215: 403-10.

El programa informático para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar el par de secuencias de puntuación alta (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de puntuación de la palabra del vecindario (Altschul y otros supra). Estos impactos de la palabra del vecindario inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contengan. Los impactos de la palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que la puntuación de alineamiento acumulada pueda aumentarse. Las extensiones para los impactos de la palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulada va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa como predeterminado una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 5873-5787.

El término “antígeno” (Ag) en la presente descripción se refiere a la entidad usada para la inmunización de un vertebrado inmunocompetente para producir un anticuerpo (Ac) que reconoce el Ag. En el contexto de la presente invención, los antígenos adecuados incluyen TFPI humano (1-181) y TFPIa humano de longitud completa. En la presente descripción, el Ag se denomina más ampliamente y generalmente pretende incluir moléculas diana que se reconocen específicamente por el Ac, por tanto, incluye fragmentos o miméticos de la molécula usada en el proceso de inmunización, u otro proceso, por ejemplo, la exposición en fagos, usado para generar el Ac.

El término “epítopo”, como se usa en la presente, se define en el contexto de una interacción molecular entre un “polipéptido de unión al antígeno”, tal como un anticuerpo (Ac), y su antígeno correspondiente (Ag). Generalmente, “epítopo” se refiere al área o región en un Ag a la que se une específicamente un Ac, es decir, el área o región en contacto físico con el Ac. El contacto físico puede definirse mediante el uso de varios criterios (por ejemplo, un límite de distancia de 2-6 A, tal como 3 A, tal como 4 A, tal como 5 A; o la accesibilidad a solventes) para átomos en las moléculas de Ac y Ag. Un epítopo de proteína puede comprender residuos de aminoácidos en el Ag que se involucran directamente en la unión a un Ac (también llamado el componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no se involucran directamente en la unión, tal como los residuos de aminoácidos del Ag que se bloquean efectivamente por el Ac, es decir, residuos de aminoácidos dentro de la “superficie excluida al solvente” y/o la "huella" del Ac.

El término “epítopo” en la presente descripción comprende ambos tipos de región de unión en cualquier región particular del TFPI que se une específicamente a un anticuerpo al TFPI mono- o biespecífico, u otro agente específico a TFPI, a menos que se indique de cualquier otra manera. El TFPI puede comprender un número de epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación, (1) epítopos peptídicos lineales (2) epítopos conformacionales que consisten en uno o más aminoácidos no contiguos ubicados cerca entre sí en la conformación del TFPI maduro; y (3) epítopos postraduccionales que consisten, ya sea en su totalidad o en parte, en estructuras moleculares unidas covalentemente al TFPI, tales como grupos de carbohidratos.

El epítopo para un par anticuerpo (Ac)/antígeno (Ag) dado puede describirse y caracterizarse a niveles diferentes de detalle mediante el uso de una variedad de métodos experimentales y computacionales de mapeo de epítopos. Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (^rMⁿ), Espectrometría de Masa de Intercambio de Deuterio de Hidrógeno (HX-MS) y diversos métodos de unión por competencia; métodos que se conocen en la técnica. Como cada método depende de un principio único, la descripción de un epítopo se relaciona íntimamente con el método mediante el cual se ha determinado. Por lo tanto, en dependencia del método de mapeo de epítopos empleado, el epítopo para un par Ac/Ag dado puede describirse de manera diferente.

A su nivel más detallado, el epítopo para la interacción entre el Ag y el Ac puede describirse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ac, así como también la información acerca de sus contribuciones relativas a las termodinámicas de unión. A un nivel menos detallado, el epítopo puede caracterizarse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ag y el Ac. A un nivel incluso menos detallado el epítopo puede caracterizarse por los residuos de aminoácidos que comprende cómo se define por criterios específicos tales como la distancia entre, o la accesibilidad a solventes de, los átomos en el complejo Ac: Ag. A un nivel aún menos detallado, el epítopo puede caracterizarse a través de la función, por ejemplo, mediante la unión por competencia con otros Ac. Además, el epítopo puede definirse más genéricamente como que comprende residuos de aminoácidos cuya sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ac y el Ag.

En el contexto de una estructura cristalina derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ac, por ejemplo, un fragmento Fab, y su Ag, el término epítopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como residuos del TFPI que tiene un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el Ac.

A partir del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, en dependencia del método de mapeo de epítopos usado, se obtienen a niveles diferentes de detalle, se deduce que la comparación de epítopos para Ac diferentes en el mismo Ag puede conducirse de manera similar en niveles diferentes de detalle.

Se dice que los epítopos descritos a nivel de los aminoácidos, por ejemplo, determinados a partir de una estructura de rayos X, son idénticos si contienen el mismo conjunto de residuos de aminoácidos. Se dice que los epítopos se solapan si los epítopos comparten al menos un aminoácido. Se dice que los epítopos están separados (son únicos) si los epítopos no comparten ningún residuo de aminoácido.

La definición del término “parátopo” deriva de la definición anterior de “epítopo” al invertir la perspectiva. Por lo tanto, el término “parátopo” se refiere al área o región en el Ac al que se une específicamente un Ag, es decir, con lo que hace contacto físico con el Ag.

En el contexto de una estructura cristalina, derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ac, tal como un fragmento Fab, y su Ag, el término parátopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como residuos del Ag que se caracteriza por tener un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el TFPI.

El epítopo y el parátopo para un par anticuerpo (Ac)/antígeno (Ag) dado pueden identificarse mediante métodos de rutina. Por ejemplo, la ubicación general de un epítopo puede determinarse mediante la evaluación de la capacidad de un anticuerpo para unirse a fragmentos o variantes diferentes de polipéptidos del TFPI. Los aminoácidos específicos dentro del TFPI que hacen contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que hacen contacto con el TFPI (parátopo) también pueden determinarse mediante el uso de métodos de rutina. Por ejemplo, el anticuerpo y la molécula diana pueden combinarse y el complejo Ac:Ag puede cristalizarse. La estructura cristalina del complejo puede determinarse y usarse para identificar sitios específicos de interacción entre el anticuerpo y su diana.

Los anticuerpos que se unen al mismo antígeno pueden caracterizarse con respecto a su capacidad de unirse simultáneamente a su antígeno común y pueden someterse a “unión por competencia”/“mapeo de epítopos”. En el presente contexto, el término “mapeo de epítopos” se refiere a un método para agrupar anticuerpos que se unen al mismo antígeno. El “mapeo de epítopos” de anticuerpos puede basarse en la unión por competencia de dos anticuerpos a su antígeno común en ensayos basados en técnicas estándar tales como resonancia de plasmón superficial (SPR), ELISA o citometría de flujo.

Una “unión” del anticuerpo se define mediante el uso de un anticuerpo de referencia. Si un segundo anticuerpo es incapaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece a la misma “unión” que el anticuerpo de referencia. En este caso, la referencia y el segundo anticuerpo se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan “anticuerpos competitivos”. Si un segundo anticuerpo es capaz de unirse a un antígeno al mismo tiempo que el anticuerpo de referencia, se dice que el segundo anticuerpo pertenece a una “unión” separada. En este caso, el anticuerpo de referencia y el segundo anticuerpo no se unen competitivamente a la misma parte de un antígeno y se denominan “anticuerpos no competitivos”.

El “mapeo de epítopos” del anticuerpo no proporciona información directa acerca del epítopo. Los anticuerpos competitivos, es decir, anticuerpos que pertenecen a la misma “unión” pueden tener epítopos idénticos, epítopos solapados o incluso epítopos separados. Este último es el caso si el anticuerpo de referencia unido a su epítopo en el antígeno toma el espacio requerido para que el segundo anticuerpo entre en contacto con su epítopo en el antígeno (“impedimento estérico”). Los anticuerpos no competitivos generalmente tienen epítopos separados.

Ajustar las afinidades relativas y absolutas de los dos sitios de reconocimiento al antígeno de los anticuerpos monoespecíficos o el anticuerpo biespecífico para TFPI (1-181) y TFPI (182-276) puede ser ventajoso en términos de, por ejemplo, proporcionar una unión selectiva a TFPIa mientras que todavía proporciona un bloqueo completo de la inhibición del TFPI.

El término “afinidad de unión” se usa en la presente descripción como una medida de la fortaleza de una interacción no covalente entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento de este, y un antígeno. El término “afinidad de unión” se usa para describir interacciones monovalentes (actividad intrínseca).

La afinidad de unión entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o el fragmento del mismo, y un antígeno, a través de una interacción monovalente puede cuantificarse mediante la determinación de la constante de disociación de equilibrio (K^d). A su vez, la K^dpuede determinarse mediante la medición de la cinética de la formación y disociación de complejos, por ejemplo, mediante el método SPR. Las constantes de velocidad correspondientes a la asociación y la disociación de un complejo monovalente se denominan como la constante de la tasa de asociación k^a(o k^on) y constante de la tasa de disociación k^d(o k^off), respectivamente. K^dse relaciona con k^ay k^da través de la ecuación K^d= k^d/k^a.

Después de la definición anterior, las afinidades de unión asociadas con diferentes interacciones moleculares, tales como la comparación de la afinidad de unión de diferentes anticuerpos para un antígeno dado, pueden compararse mediante la comparación de los valores de K^dpara los complejos individuales anticuerpo/antígeno.

El anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser capaz de competir con otra molécula, tal como un ligando o receptor de origen natural u otro anticuerpo, para unirse al TFPI y de esta manera afectar las funciones asociadas con estas interacciones. La capacidad de un anticuerpo para competir con un ligando/receptor natural puede evaluarse mediante diversos ensayos de actividad que miden el efecto en la Kⁱaparente para la inhibición del TFPI. Los valores K^dpueden deducirse entonces a partir de los valores aparentes de Kⁱ. Típicamente, el valor de interés de la K^dpara el anticuerpo con respecto a la diana (TFPI) será 2 veces, preferentemente 5 veces, con mayor preferencia 10 veces menor que el valor de la K^dde otros ligandos del TFPI. Con mayor preferencia, la K^dserá 50 veces menor, tal como 100 veces menor, o 200 veces menor; incluso aún con mayor preferencia 500 veces menor, tal como 1000 veces menor o 10000 veces menor.

El valor de esta constante de disociación puede determinarse directamente mediante métodos bien conocidos. Los ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de ligandos tales como anticuerpos hacia las dianas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA, calorimetría isotérmica de titulación y análisis de citometría de flujo. La cinética de unión y la afinidad de unión del anticuerpo pueden evaluarse, además, mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como SPR.

Puede realizarse un ensayo de unión competitiva en el que la unión del anticuerpo a la diana se compara con la unión de la diana por otro ligando de esa diana, tal como otro anticuerpo.

Un anticuerpo monoespecífico o cualquier brazo de un anticuerpo biespecífico descrito en la presente descripción, puede tener una K^dpara su diana de 1 x 10-7 M o menos, 1 x 10-8 M o menos, o 1 x 10-9 M o menos, o 1 x 10-10 M o menos, 1 x 10-11 M o menos, o 1 x 10-12 M o menos. La K^dde un anticuerpo descrito en la presente descripción puede ser menor que 0,8 nM, tal como menor que 0,7 nM, tal como menor que 0,6 nM, tal como menor que 0,5 nM, tal como menor que 0,4 nM, tal como menor que 0,3 nM, tal como menor que 0,2 nM, tal como menor que 0,1 nM, tal como menor que 0,05 nM, tal como menor que 0,025 nM, tal como menor que 0,015 nM, tal como entre 0,015 nM y 0 nM.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas de la invención, tales como los anticuerpos biespecíficos reivindicados. Por ejemplo, en la presente descripción se describe una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpos de la invención biespecíficos a TFPI, formulada junto con un portador aceptable farmacéuticamente.

En consecuencia, un objeto es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende tal anticuerpo biespecífico a TFPI que está presente en una concentración de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, y en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además, uno o más de un sistema tampón, un conservante, un agente de tonicidad, un agente quelante, un estabilizador o un surfactante, así como también diversas de sus combinaciones. El uso de conservantes, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizadores y surfactantes en la composiciones farmacéuticas es bien conocido por los expertos en la técnica. Puede hacerse referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

En una modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Tal formulación es, típicamente, una solución o una suspensión pero puede incluir además coloides, dispersiones, emulsiones, y materiales multifase. El término “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos 50 % p/p de agua. Igualmente, el término “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua.

En otra modalidad, la composición farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de usar.

En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de tal anticuerpo y un tampón, en donde el anticuerpo se presenta en una concentración de 1 mg/ml o más, y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

Puede usarse un anticuerpo biespecífico o una formulación farmacéutica que comprende dos anticuerpos monoespecíficos de acuerdo con la invención para tratar a un sujeto con una coagulopatía.

El término “sujeto”, como se usa en la presente descripción, incluye cualquier paciente humano o vertebrado no humano.

El término “coagulopatía”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una mayor tendencia hemorrágica que puede provocarse por cualquier deficiencia cualitativa o cuantitativa de cualquier componente procoagulativo de la cascada de coagulación normal o por cualquier regulación positiva de la fibrinólisis. Tales coagulopatías pueden ser congénitas y/o adquiridas y/o iatrogénicas y se identifican por un experto en la técnica.

Los ejemplos no limitantes de hipocoagulopatías congénitas son la hemofilia A, la hemofilia B, la deficiencia del Factor VII, la deficiencia del Factor X, la deficiencia del Factor XI, la enfermedad de von Willebrand y las trombocitopenias tales como la trombobastenia de Glanzmann y el síndrome de Bernard-Soulier. Dicha hemofilia A o B puede ser grave, moderada o leve. La gravedad clínica de la hemofilia se determina por la concentración de unidades funcionales de FIX/FVIII en la sangre y se clasifica como leve, moderada o grave. La hemofilia grave se define por un nivel del factor de coagulación de < 0,01 U/ml correspondiente a < 1 % del nivel normal, mientras que los pacientes moderados y leves tienen niveles de 1-5 % y > 5 %, respectivamente. La hemofilia A con “inhibidores” (es decir, los aloanticuerpos contra el factor VIII) y la hemofilia B con “inhibidores” (es decir, los aloanticuerpos contra el factor IX) son ejemplos no limitantes de coagulopatías que son parcialmente congénitas y parcialmente adquiridas.

Un ejemplo no limitante de una coagulopatía adquirida es la deficiencia de serina proteasa provocada por la deficiencia de la vitamina K; dicha deficiencia de la vitamina K puede provocarse por la administración de un antagonista de la vitamina K, tal como la warfarina. La coagulopatía adquirida puede producirse, además, después de un trauma extenso. En este caso, conocido de cualquier otra manera como el “ciclo vicioso de sangramiento”, se caracteriza por hemodilución (trombocitopenia por dilución y dilución de factores de coagulación), hipotermia, consumo de factores de coagulación y trastornos metabólicos (acidosis). La terapia con fluidos y el aumento de la fibrinólisis pueden exacerbar esta situación. Dicha hemorragia puede ser de cualquier parte del cuerpo.

Un ejemplo no limitante de una coagulopatía iatrogénica es una sobredosificación de medicamentos anticoagulantes, tales como heparina, aspirina, warfarina y otros inhibidores de la agregación plaquetaria, que pueden prescribirse para tratar una enfermedad tromboembólica. Un segundo ejemplo no limitante de coagulopatía iatrogénica es la que se induce por una terapia de líquidos excesiva y/o inapropiada, tal como la que puede inducirse mediante una transfusión de sangre.

En una modalidad, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B con inhibidores adquiridos. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con trombocitopenia. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la enfermedad de von Willebrand. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con graves daños tisulares. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con trauma grave. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con cirugía. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con gastritis y/o enteritis hemorrágica. En otra modalidad, la hemorragia es un sangrado uterino profuso, tal como en el desprendimiento de la placenta. En otra modalidad, la hemorragia se produce en órganos con una posibilidad limitada de hemostasia mecánica, tal como intracraneal, intraauricular o intraocular. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con terapia anticoagulante.

El término “tratamiento”, como se usa en la presente, se refiere a la terapia médica de cualquier ser humano u otro sujeto vertebrado que lo necesite. Se espera que dicho sujeto se haya sometido a un examen físico por parte de un profesional médico, o un profesional médico veterinario, que haya dado un diagnóstico tentativo o definitivo que indicaría que el uso de dicho tratamiento específico es beneficioso para la salud de dicho humano u otro vertebrado. El momento y el propósito de dicho tratamiento pueden variar de una persona a otra, de acuerdo con el status quo de la salud del sujeto. Por lo tanto, dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo. Los tratamientos profilácticos, paliativos, sintomáticos y/o curativos pueden representar aspectos separados de la invención.

Un anticuerpo de la invención puede administrarse por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, tal como por vía intramuscular, tal como por vía subcutánea. Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede administrarse por medio de una vía no parenteral, tal como por vía perioral o tópica. Un anticuerpo de la invención puede administrarse profilácticamente. Un anticuerpo de la invención puede administrarse terapéuticamente (a demanda). En una modalidad, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención se usan para medir los niveles de TFPIa in vitro.

Ejemplos

Ejemplo 1: Inmunización, fusión y cribado

Los ratones RBF se inmunizaron con TFPIa humano (SEQ ID NO: 1) o un fragmento de TFPI, por ejemplo, correspondiente a los residuos 1-161 de la SEQ ID NO: 1. Los ratones se inyectaron por vía subcutánea: 20|ig del TFPI humano se mezcló con adyuvante completo de Freund para la primera inyección. Para las inmunizaciones subsecuentes, se usó adyuvante incompleto de Freund con la misma concentración del antígeno. Diez días después de la inmunización final, se cribó la sangre ocular de los ratones, mediante el uso de ELISA, para anticuerpos específicos del TFPI humano. Los ratones con títulos positivos de suero recibieron una dosis de refuerzo de 10 |ig del TFPI humano o TFPI (1-161) mediante inyección intravenosa y se sacrificaron después de tres días. Los bazos se retiraron asépticamente y se dispersaron en una suspensión de célula única. La fusión de las células del bazo y las células de mieloma se realizó por medio del método PEG o mediante electrofusión. Las células de hibridomas resultantes se clonaron mediante dilución limitante en placas de microtitulación. Los sobrenadantes de los hibridomas individuales se cribaron inicialmente mediante ELISA para la expresión de anticuerpos capaces de unirse al TFPIa de longitud completa o fragmentos de TFPI.

Los anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad de proteína A estándar y se usaron para determinar la unión y afinidad al TFPI humano y la actividad de neutralización del TFPI en plasma (tiempo de protrombina diluida). Los hibridomas que producen anticuerpos de interés, se subclonaron mediante dilución limitante y el perfil de anticuerpo original se verificó para el material de los hibridomas subclonados. Las células de los hibridomas subclonados se usaron para el aislamiento de ARN y la subsecuente clonación de anticuerpos e identificación de secuencias.

Ejemplo 2: Clonación y secuenciación de los mAb específicos anti-TFPI KPI-3/C-terminal de ratón TFPI4F110, TFPI22F66 y TFPI22F71

Las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera murinas de los anticuerpos a TFPI: TFPI4F110, TFPI22F66 y TFPI22F71 se clonaron y secuenciaron como se describe en el documento WO2012/001087.

El ARN total se extrajo de células de hibridoma mediante el uso del kit RNeasy-Mini de Qiagen y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc. El ADNc se sintetizó en una reacción 5'-RACE mediante el uso del kit de amplificación de ADNc SMART™ RACE de Clontech. La amplificación subsecuente dirigida de las secuencias de HC y LC se realizó por PCR mediante el uso de polimerasa Phusion Hot Start (Finnzymes) y la mezcla de cebadores universales (UPM) incluida en el kit SMART™ RACE como cebador directo. Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de HC (dominio VH):

5'- CTTGCCATTGAGCCAGTCCTGGTGCATGATGG -3' (SEQ ID NO: 17)

Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de LC (dominio VL) de TFPI22F66 y TFPI22F71:

5'- GTTGTTCAAGAAGCACACGACTG -3' (SEQ ID NO: 18)

Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de LC de TFPI4F110:

5'- GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG -3' (SEQ ID NO: 19)

Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel, se extrajeron mediante el uso del kit GFX PCR DNA & Gel Band Purification de GE Healthcare Bio-Sciences y se clonaron para la secuenciación mediante el uso de un kit de clonación Zero Blunt TOPO PCR y un TOP10 químicamente competente E.coli (Invitrogen). La PCR de colonia se realizó en colonias seleccionadas mediante el uso de una mezcla AmpliTaq Gold Master de Applied Biosystems y cebadores M13uni/M13rev. La limpieza del PCR de colonias se realizó mediante el uso de la mezcla de enzimas ExoSAP-IT (USB). La secuenciación se realizó en Eurofins MWG Operon, Alemania, mediante el uso de cebadores de secuenciación M13uni(-21)/M13rev(-29). Las secuencias se analizaron y anotaron mediante el uso del programa VectorNTI. Todos los kits y reactivos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se identificó una sola LC tipo kappa murina única y una sola HC murina única, subclase IgG1 para cada uno de los hibridomas: TFPI4F110, TFPI22F66 y TFPI22F71. Las secuencias de aminoácidos se proporcionan en el listado de secuencias: las secuencias peptídicas líderes no están incluidas.

Ejemplo 3: Clonación y secuenciación del mAb específico anti-TFPI KPI-3/C-terminal de ratón 22F74, 41F41, 41F30, 22^f132, 22F79 y clonación y secuenciación del mAb anti-TFPI KPI-1 de ratón 2F3, 2F22, 2F45, 1F91 y 2F35.

Las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera murinas de anticuerpos anti-TFPI se clonaron y secuenciaron de la siguiente manera.

El ARN total se extrajo de células de hibridoma mediante el uso del kit RNeasy-Mini de Qiagen y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc. El ADNc se sintetizó en una reacción 5'-RACE mediante el uso ya sea del kit de amplificación de ADNc SMART™ o SMARTer™ RACE de Clontech. La amplificación subsecuente dirigida de las secuencias de HC y LC se realizó por PCR mediante el uso de la polimerasa Phusion Hot Start (Finnzymes) y la mezcla de cebadores universales (U^pM) incluida en el kit SMART™/SMARTer™ RACE como cebador directo. Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de HC (dominio VH):

5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3' (SEQ ID NO: 20)

Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de LC:

5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3' (SEQ ID NO: 21)

Se identificó una sola LC tipo kappa murina única y una sola HC murina única, subclase IgG para cada hibridoma. Las secuencias de aminoácidos se proporcionan en el listado de secuencias: las secuencias peptídicas líderes no están incluidas.

Ejemplo 4: Clonación y modificación por ingeniería genética de mAb 2021 y de variantes de mAb 2021

Este ejemplo describe la clonación y la modificación por ingeniería genética del anticuerpo anti-TFPI: mAb2021 y variantes del mismo.

El ARN total se extrajo de células de hibridoma M-hTFPI 4F36A1 B2 mediante el uso del kit RNeasy-Mini de Qiagen y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc. El ADNc se sintetizó en una reacción 5'-RACE mediante el uso del kit de amplificación de ADNc SMART™ RACE de Clontech. La amplificación subsecuente dirigida de las secuencias de HC y LC se realizó por PCR mediante el uso de polimerasa Phusion Hot Start (Finnzymes) y la mezcla de cebadores universales (UPM) incluida en el kit SMART™ RACE como cebador directo. Se usó un cebador inverso con la siguiente secuencia para la amplificación de HC (dominio VH):

5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3' (SEQ ID NO: 20)

5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3' (SEQ ID NO: 21)

Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel, se extrajeron mediante el uso del kit GFX PCR DNA & Gel Band Purification de GE Healthcare Bio-Sciences y se clonaron para la secuenciación mediante el uso de un kit de clonación Zero Blunt TOPO PCR y un TOP10 químicamente competente E.coli (Invitrogen). La PCR de colonia se realizó en colonias seleccionadas mediante el uso de una mezcla AmpliTaq Gold Master de Applied Biosystems y cebadores M13uni/M13rev. La limpieza del PCR de colonias se realizó mediante el uso de la mezcla de enzimas ExoSAP-IT (USB). La secuenciación se realizó en Eurofins MWG Operon, Alemania, mediante el uso de cebadores de secuenciación M13uni (-21)/M13rev (-29) o T3/T7. Las secuencias se analizaron y anotaron mediante el uso del programa VectorNTI. Todos los kits y reactivos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se identificó una sola LC tipo kappa murina única y una sola HC murina única, subclase IgG1.

Generación de vectores de expresión para el anti-HzTFPI4F36A1B2 injertado

Se generó una serie de vectores de expresión basados en el promotor de CMV (vectores pTT) para la expresión transitoria del anticuerpo anti-TFPI /fragmento de anticuerpo en el sistema de expresión basado en EBNA HEK293-6E desarrollado por Yves Durocher (Durocher y otros Nucleic Acid Research, 2002). Además del promotor de CMV, los vectores basados en pTT contienen un origen pMB1, un origen EBV y el gen de resistencia a Amp.

En base a las secuencias de VH y VL anti-TFPI4F36A1B2 murinas clonadas, se diseñó una versión humanizada de anti-TFPI4F36 mediante injerto de CDR en secuencias de la línea germinal humana. Las secuencias de ADN para las regiones VH y VL de HzTFPI4F36 injertadas se sintetizaron (GENEART AG) de acuerdo con el diseño de humanización del anticuerpo descrito anteriormente. Las secuencias se obtuvieron con el injerto de CDR mínimo básico y sin mutaciones inversas adicionales. Las respectivas secuencias del péptido líder de la línea germinal LC y HC se incluyeron en las construcciones así como también una secuencia de Kozak (5'-GCCGCCACC-3') inmediatamente aguas arriba del codón de inicio ATG.

Se generaron vectores de expresión basados en pTT para la expresión transitoria del anticuerpo TFPI4F36 injertado como un isotipo kappa/IgG4(S241P) humano. La mutación de prolina en la posición 241 (numeración de acuerdo con Kabat, correspondiente al residuo 228 por el sistema de numeración de la UE (Edelman G.M. y otros, Proc. Natl. Acad. EE. UU. 63, 78-85 (1969)) se introdujo en la región de bisagra de IgG4 para la formación eliminada de fragmentos de anticuerpos monoméricos, es decir, “medios anticuerpos” compuestos de una LC y una HC.

El fragmento VH se escindió del vector de clonación GENEART y se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para un dominio CH de IgG4(S241P) humano y subsecuentemente se transformó en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN. El fragmento VL se escindió del vector de clonación GENEART y se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para un dominio kappa CL humano y subsecuentemente se transformó en E. coli para la selección. La secuencia de las construcciones finales se verificó mediante secuenciación de ADN.

Mutagénesis dirigida al sitio para aislar el mAb 2021

Se generó una serie de mutaciones inversas de humano a ratón (denominadas mutaciones inversas) en la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) del HzTFPI4F36 injertado.

Se realizó la mutagénesis dirigida al sitio para introducir mutaciones inversas de humano a ratón (en lo sucesivo denominadas mutaciones inversas) en los residuos específicos en las construcciones HzTFPI4F36 LC/HC injertadas para optimizar las construcciones injertadas. Las mutaciones se introdujeron mediante dos métodos diferentes: 1. Los kits de mutagénesis dirigida al sitio o dirigida a sitios múltiples QuikChange® de Stratagene se usaron para introducir mutaciones puntuales y mutaciones de combinación. Los kits se usaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. También se usaron métodos estándar de la PCR superpuesta en 2 etapas para introducir mutaciones puntuales y generar mutaciones de combinación.

Los plásmidos de expresión LC y HC para HzTFPI4F36 injertado se usaron como plantillas para la mutagénesis. Las secuencias de todas las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de ADN.

Las secuencias finales para mAb 2021 HC llevan una región FR2 con 4 mutaciones inversas que hacen que la secuencia marco sea idéntica a la FR2 original de ratón y 3 mutantes CDR2, es decir, un total de 7 mutaciones inversas de HC (A40T, G42E, G44R, S49A, Y59F, A60P, K64Q) en comparación con la secuencia injertada original (numeración de acuerdo con Kabat). La secuencia LC es la secuencia LC injertada HzTFPI4F36. Las CDR y los marcos se definen de acuerdo con Kabat.

Las secuencias de aminoácidos para la HC y LC del mAb 2021 final se enumeran como SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51, respectivamente.

Con el fin de mejorar el rendimiento de expresión, las secuencias del péptido señal original (secuencia de la línea germinal humana) tanto para HC como para LC, se intercambiaron por el péptido señal (SP) CD33 humano. Las secuencias del péptido señal se intercambiaron mediante amplificación por PCR estándar del fragmento de HC o LC con cebadores que contenían un elemento Kozak (GCCGCCACC), el codón de inicio y la secuencia señal CD33 (cebador con sentido) y el codón de parada y sitio de restricción EcoRI (cebador antisentido). Los fragmentos amplificados se clonaron en vectores basados en pTT linealizados y se transformaron en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Generación de variantes del mAb 2021 de menor afinidad

Durante la humanización de anti-TFPI4F36A1B2 para obtener mAb 2021, se identificaron varias variantes de menor afinidad. Las variantes se generaron como se describió anteriormente mediante mutagénesis dirigida al sitio. El mAb 2007 y el mAb 2014 fueron dos dichas variantes de menor afinidad. El mAb 2007 porta una única mutación inversa de A60P en el dominio VH en comparación con la secuencia para el HzTFPI4F36 injertado (numeración de acuerdo con Kabat). En comparación con la secuencia para el HzTFPI4F36 injertado, el mAb 2014 porta una región FR2 con 4 mutaciones inversas (Y36L, K39R, Q42E, Q45K) en el dominio v L, lo que hace que la secuencia del marco sea idéntica a la del FR2 de ratón original (numeración de acuerdo con Kabat). La cadena pesada del mAb 2014 corresponde al HzTFPI4F36 injertado. Las dos variantes tiene afinidades de unión al TFPI que son menores en al menos uno o dos órdenes de magnitud, respectivamente, en comparación con el mAb 2021. La variante HzTFPI4F36 injertada inicial (mAb 2000) exhibió afinidades de unión al TFPI aproximadamente tres órdenes de magnitud más bajas en comparación con mAb 2021.

Los vectores de expresión para la expresión de fragmentos Fab de mAb 2021 y variantes de mAb 2021 se generaron como se describe en el ejemplo 6. La HC basada en IgG4 se truncó en la región de bisagra después de la cisteína correspondiente a la posición 227 en la secuencia de HC para el mAb 2021, SEQ. ID. NO: 50. El truncamiento deja la cisteína en el extremo C-terminal disponible para la conjugación química. El fragmento Fab del mAb 2007 se expresó como Fab 0094, mediante el uso del vector de LC del mAb 2021 y el vector de HC del mAb 2007 truncado descritos anteriormente. El fragmento Fab del mAb 2014 se expresó como Fab 0095, mediante el uso del vector de LC del mAb 2014 y el vector de HC del mAb 2014 truncado descritos anteriormente. El fragmento Fab del mAb 2000 se expresó como Fab 0313, mediante el uso del vector de LC del mAb 2021 y la HC truncada para el HzTFPI4F36 injertado.

Ejemplo 5: Generación de vectores de expresión para los mAb quiméricos de ratón/humano TFPI4F110, TFPI22F66, TFPI22F71, TFPI2F22

Se generó una serie de vectores de expresión basados en el promotor de CMV (vectores pTT) para la expresión transitoria del anticuerpo/fragmento de anticuerpo anti-TFPI quimérico de ratón/humano en el sistema de expresión basado en EBNA HEK293-6E desarrollado por Yves Durocher (Durocher y otros Nucleic Acid Research, 2002) o el sistema EXPI293F de Invitrogen. Además del promotor de CMV, los vectores basados en pTT contienen un origen de pMB1, un origen de EBV y el gen de resistencia a Amp. Las variantes de anticuerpos anti-TFPI que incluyen fragmentos Fab se expresaron transitoriamente en las células HEK293-6E o EXPI293F por cotransfección de vectores de expresión de LC y HC como se describió en el ejemplo 7. Se generaron vectores de expresión de LC basados en pTT para la expresión transitoria del mAb anti-TFPI quimérico y fragmentos Fab. Inicialmente, la región correspondiente a los dominios VL de TFPI4F110, TFPI22F66, t Fp I22F71 o TFPI 2F22 se amplificaron por PCR en una reacción de 2 etapas a partir de un clon de secuenciación TOPO original, mediante el uso de cebadores específicos para las secuencias de los extremos N y C terminales. El péptido señal murino original se intercambió por el péptido señal de CD33 humano mediante PCR superpuesta en 2 etapas. Los cebadores sentido primarios portan la parte C-terminal de la secuencia del péptido señal de CD33 y el cebador sentido secundario contenía un sitio de restricción HindIII para propósitos de clonación, una secuencia de Kozak (5'-GCCGCCACC-3') inmediatamente aguas arriba del codón de inicio ATG y la parte N-terminal de las secuencias del péptido señal de CD33. El cebador antisentido contiene un sitio de restricción BsiWI en el marco en la secuencia de transición VL/CL.

Los fragmentos amplificados se clonaron en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para un dominio CL kappa humano y subsecuentemente se transformó en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Los vectores de expresión del HC basados en pTT se generaron para la expresión transitoria de los mAb anti-TFPI quiméricos. Inicialmente, la región correspondiente a los dominios VH de TFPI4F110, TFPI22F66, TFPI22F71 o TFPI2F22 se amplificaron por PCR en una reacción de 2 etapas a partir de un clon de secuenciación TOPO original, mediante el uso de cebadores específicos para las secuencias de los extremos N y C terminales. El péptido señal murino original se intercambió por el péptido señal de CD33 humano mediante PCR superpuesta en 2 etapas. Los cebadores sentido primarios portan la parte C-terminal de la secuencia del péptido señal de CD33 y el cebador sentido secundario contenía un sitio de restricción HindIII para propósitos de clonación, una secuencia de Kozak (5'-GCCGCCACC-3') inmediatamente aguas arriba del codón de inicio ATG y la parte N-terminal de las secuencias del péptido señal de CD33. El cebador antisentido contenía un sitio de restricción NheI en marco en la transición VH/CH. El fragmento de PCR del dominio VH generado se digirió con restricción y se clonó en un vector basado en pTT linealizado que contenía la secuencia de un dominio CH de IgG4(S241P) humano modificado por ingeniería genética y subsecuentemente se transformó en E. coli para la selección. La mutación de prolina en la posición 241 (numeración de acuerdo con Kabat, correspondiente al residuo 228 por el sistema de numeración de la UE (Edelman G.M. y otros, Proc. Natl. Acad. EE.UU. 63, 78-85 (1969))) se introdujo en la región de bisagra de IgG4 para la formación eliminada de fragmentos de anticuerpos monoméricos, es decir, “medios anticuerpos” compuestos de una LC y una HC. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de a Dn .

La versión quimérica de TFPI4F110 se expresó de manera recombinante como mAb 4F110, mediante el uso de los vectores de LC y HC de TFPI4F110.

La versión quimérica de TFPI22F66 se expresó de manera recombinante como mAb 22F66, mediante el uso de los vectores de LC y HC de TFPI22F66.

La versión quimérica de TFPI22F71 se expresó de manera recombinante como mAb 22F71, mediante el uso de los vectores de LC y HC de TFPI22F71.

La versión quimérica de TFPI2F22 se expresó de manera recombinante como mAb 2F22, mediante el uso de los vectores de LC y HC de TFPI2F22.

Ejemplo 6: Componentes Fab para moléculas biespecíficas

Para generar los fragmentos Fab adecuados para los conjugados químicos Fab-Fab, se generó un vector de expresión para la expresión de la HC del mAb 4F110 truncada. La HC basada en IgG4 del mAb 4F110 se truncó en lo que corresponde a la región de bisagra después de la cisteína en la posición 227 en la región constante de la IgG4 humana (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 50). El truncamiento deja la cisteína en el extremo C-terminal disponible para la conjugación química. La secuencia truncada se generó al introducir un codón de parada después del residuo de cisteína por mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® de Stratagene. Las secuencias de las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de ADN. El fragmento Fab del mAb 4F110 se expresó como Fab 0089, mediante el uso del vector de LC del mAb 4F110 y el vector de HC truncada descritos anteriormente (SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10).

Para los conjugados químicos Fab-Fab, se generó también un vector de expresión para la expresión de la HC del mAb 2021 truncada. La clonación, humanización y expresión de mAb 2021 se describe en el documento WO2010/072691. La HC basada en IgG4 del mAb 2021 se truncó en la región de bisagra después de la cisteína en la posición 227 en la HC de la región constante de la IgG4 humana del mAb 2021, SEQ ID NO: 50. El truncamiento deja la cisteína en el extremo C-terminal disponible para la conjugación química. La secuencia truncada se generó al introducir un codón de parada después del residuo de cisteína por mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® de Stratagene. Las secuencias de todas las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de ADN. El fragmento Fab del mAb2021 se expresó como Fab 0088, mediante el uso del vector de LC del mAb 2021 y el vector de HC truncada descritos anteriormente (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4).

También se generaron vectores de expresión de cadena pesada para la expresión de variantes de menor afinidad de mAb 2021. Las variantes de mAb 2021 se originan a partir de la humanización del mAb 2021 y se describen en el documento WO2010/072691. Las HC basadas en IgG4 se truncaron en la región de bisagra después de la cisteína correspondiente a la posición 227 en la HC de la región constante de la IgG4 humana del mAb 2021, SEQ ID NO: 50. El truncamiento deja la cisteína en el extremo C-terminal disponible para la conjugación química. Para ensamblar los vectores de expresión, la región correspondiente al dominio VH de las HC del mAb 2000, mAb2007 y mAb2014 descritos en el ejemplo 4 se clonaron mediante el uso de clonación estándar basada en enzimas de restricción, en un vector de caja de herramientas basado en pTT linealizado que contenía la secuencia del dominio CH de la IgG4 humana truncada. Las HC basadas en IgG4 se truncaron en la región de bisagra después de la cisteína en la posición 227 como se describió anteriormente. Las secuencias de las construcciones finales se verificaron mediante secuenciación de ADN. Los fragmentos Fab de menor afinidad del mAb2007, mAb 20014 y mAb 2000 se expresaron como Fab 0094 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6), Fab 0095 (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8) y Fab 0313 (SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59), respectivamente.

El método descrito anteriormente para la generación de vectores de expresión de HC truncadas para Fab 0094,0095, 0313 también se usó en la generación de otros fragmentos Fab de la presente invención tales como Fab 2F22 (SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41).

Ejemplo 7: Expresión y purificación de los mAb y Fab

Las variantes de anticuerpos anti-TFPI que incluyen fragmentos Fab se expresaron transitoriamente en cultivos en suspensión de células HEK293-6E o células EXPI293F, mediante la cotransfección de los vectores de expresión de LC y HC. Los siguientes procedimientos describen el protocolo de transfección genérico usado para las células HEK293-6E o las células EXPI293F adaptadas en suspensión.

Protocolo con HEK293-6E

Las células HEK293-6E se cultivaron en suspensión en medio de expresión FreeStyle™ 293 (Gibco) suplementado con 25 |jg/ml de Geneticin (Gibco), 0,1 % v/v del surfactante Pluronic F-68 (Gibco) y 1 % v/v de penicilinaestreptomicina (Gibco). Las células se cultivaron en matraces agitadores Erlenmeyer en incubadoras con agitación a 37 °C, 8 % de CO²y 125 rpm y se mantuvieron a densidades celulares entre 0,1-1,5 x 106 células/ml.

Transfección HEK293-6E

La densidad celular de los cultivos usados para la transfección fue de 0,9-2,0 x 106células/ml.

Se usó una mezcla de 0,5 jg de ADN del vector de LC 0,5 jg de ADN del vector de HC por ml de cultivo celular.

El ADN se diluyó en medio Opti-MEM (Gibco) 30 pl de medio/pg de ADN, se mezcló e incubó a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 5 min.

El 293Fectin™ (Invitrogen) se usó como reactivo de transfección a una concentración de 1 j l p o r jg de ADN. El 293Fectin™ se diluyó 30X en medio Opti-MEM (Gibco), se mezcló e incubó a temperatura ambiente (23 25 °C) durante 5 min.

Las soluciones de ADN y 293Fectin se mezclaron y se dejaron incubar a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 25 min.

Luego, la mezcla de ADN-293Fectin se añadió directamente al cultivo celular.

El cultivo celular transfectado se transfirió a una incubadora con agitación a 37 °C, 8 % de CO²y 125 rpm.

De 3-6 días después de la transfección, los sobrenadantes del cultivo celular se recolectaron mediante centrifugación, seguido de filtración a través de un filtro PES de 0,22 jm (Corning).

• El análisis cuantitativo de la producción de anticuerpos se realizó mediante interferometría de biocapa directamente en sobrenadantes de cultivos celulares clarificados mediante el uso del sistema FortéBio Octet y biosensores de proteína A o HPLC de proteína A cuantitativa.

Protocolo con EXPI293F

Las células EXPI293F se cultivaron en suspensión en medio de expresión Expi293™ (Life Technologies). Las células se cultivaron en matraces agitadores Erlenmeyer en una incubadora con agitación orbital a 36,5 °C, 8 % de CO²y 85-125 rpm y se mantuvieron a densidades celulares entre 0,4-4 x 106 células/ml.

Transfección EXPI293F

1) Inicialmente se preparan diluciones separadas de ADN y reactivo de transfección.

a) Usar un total de 1 pg del ADN del vector (0,5 ug del vector de LC y 0,5 ug del vector de HC) por ml de cultivo celular. Diluir el ADN en medio Opti-MEM (Gibco) 50 pl medio/pg ADN, mezclar e incubar a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 5 min.

b) Usar Expifectamin™ 293 (Life Technologies) como reactivo de transfección a una concentración de 2,7 j l por pg de ADN. Diluir la solución Expifectamin™ 18,5X en medio Opti-MEM (Gibco), mezclar e incubar a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 5 min.

2) Mezclar diluciones de ADN y Expifectamin™ 293 y dejar incubar a temperatura ambiente (23-25 °C) durante 10 min.

3) Añadir la mezcla ADN-Expifectamin™ 293 directamente al cultivo celular EXPI293F.

a) En el momento de la transfección la densidad celular del cultivo de EXPI293F debe ser 2,8-3,2 x 106 células/ml.

4) Transferir el cultivo celular transfectado a una incubadora con agitación orbital a 36,5 °C, ⁸% de CO²y 85 125 rpm.

5) ¹⁸horas después de la transfección, añadir 5 ul del potenciador de transfección 1 Expifectamin™ 293/ml de cultivo y 50 ul del potenciador de transfección 2 Expifectamin™ 293/ml de cultivo y retornar el cultivo a una incubadora con agitación orbital a 36,5 °C, ⁸% de CO²y 85-125 rpm.

⁶) 5 días después de la transfección, los sobrenadantes de los cultivos celulares se recolectaron mediante centrifugación, seguido de filtración a través de una unidad de filtro PES de 0,22 pm (Corning).

Protocolo de purificación general

Las variantes de mAb se purificaron por cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina MabSelectSuRe de GE Healthcare de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos purificados se intercambiaron de tampón al tampón PBS pH 7,2.

Los fragmentos Fab se purificaron mediante cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina KappaSelect desarrollada por GE Healthcare. Los fragmentos Fab purificados se intercambiaron de tampón al tampón PBS pH 7,2.

La evaluación de la calidad y la determinación de la concentración se realizaron mediante SEC-HPLC.

El Fab 0088 (fragmento Fab del mAb 2021) (5 mg, 3,92 mg/ml, 0,104 mmol) en tampón PBS se mezcló con una solución de sal sódica de hidrato de tris(3-sulfonatofenil)fosfina (3,2 ml, 10 mg/ml, grado técnico, (Alfa Aesar # 39538, CAS: 63995-70-0). La reacción se dejó durante 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se sometió a intercambio de tampón en tampón acetato 50 mM (ácido acético diluido ajustado a pH 5 con hidróxido de sodio; tampón A) mediante el uso de un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (MWCO de 5 kDa, Millipore). La proteína se inmovilizó en una columna HiTrap SP HP preacondicionada (GE Healthcare) y se eluyó con un gradiente en el que el tampón B era el tampón A que contenía cloruro de sodio 300 mM.

La proteína eluida (3 ml, 0,6 mg) se mezcló con una solución de 1,8-W,W’-bis(maleimido)-3,6-dioxaoctano (Thermo Scientific/Pierce, producto núm. 22336; 6,2 mg en 2 ml de tampón). La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La mezcla se sometió a intercambio de tampón en tampón acetato 50 mM (ácido acético diluido ajustado a pH 5 con hidróxido de sodio; tampón A) mediante el uso de un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (MWCO de 5 kDa, Millipore). La proteína se inmovilizó en una columna HiTrap SP HP preacondicionada (GE Healthcare) y se eluyó con un gradiente en el que el tampón B era el tampón A que contenía cloruro de sodio 300 mM.

El Fab 0089 (fragmento Fab del mAb 4F110) (5 mg, 3,58 mg/ml, 0,105 mmol) en tampón PBS se mezcló con una solución de sal sódica de hidrato de tris(3-sulfonatofenil)fosfina (3,2 ml, 10 mg/ml, grado técnico, (Alfa Aesar # 39538, CAS: 63995-70-0).

La reacción se dejó durante 2 horas y 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se sometió a intercambio de tampón en tampón acetato 50 mM (ácido acético diluido ajustado a pH 5 con hidróxido de sodio; tampón A) mediante el uso de un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra (MWCO de 5 kDa, Millipore). La proteína se inmovilizó en una columna HiTrap SP HP preacondicionada (GE Healthcare) y se eluyó con un gradiente en el que el tampón B era el tampón A que contenía cloruro de sodio 300 mM.

Las dos soluciones (Fab 0088 reducido y acoplado al enlazador, 4 ml; y Fab 0089, reducido, 4 ml) se mezclaron. La mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante toda la noche. La solución se concentró y se cargó en una columna Superdex200 10/300 GL (GE Healthcare) mediante el uso de un instrumento de FPLC Ákta y se eluyó en tampón (histidina 9,7 mM, CaCl²2,3 mM, NaCl 308 mM, sacarosa ^{8 , 8}mM, 0,01 % de Tween 80, pH 7,0). Las fracciones aisladas se analizaron mediante análisis de SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño analítica y determinación de la secuencia de Edman.

Ejemplo 9: Preparación de 1,16-N,N'-bis(maleimido)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano

W-Maleoil-p-alanina (1,26 g, 7,4 mmol) se disolvió en DCM (20 ml). Se añadió W,W’-diisopropilcarbodiimida (1,15 ml, 7,4 mmol). La mezcla se agitó durante 30 minutos. Se añadió gota a gota una solución de 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano en DCM a la solución en agitación durante un período de 60 minutos. La mezcla se agitó durante 1 h. La solución se concentró al vacío hasta la sequedad. Los sólidos crudos se suspendieron en agua/MeCN (2:1) con algo de ácido acético presente. La mezcla se purificó mediante el uso de HPLC RP (0-50 % de MeCN en agua, 0,1 % de TFA, columna C¹⁸). El producto se caracterizó mediante LCMS (ESI): 451 ([M+H]+:) y NMR.

Ejemplo 10: Conjugación del Fab 0088 y Fab 0089 con 1,16-W,W’-bis(maleimido)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano (ref. 9002)

El Fab 0089 (5 mg, 3,58 mg/ml, 1,42 ml, 104 nmol) se intercambió de tampón en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 7. El volumen final fue de 2000 microlitros (50 micromolar, 2,5 mg/ml). Se añadió sal dipotásica dihidratada de bis(psulfonatofenil)fenilfosfina de una solución en el tampón fosfato a una concentración final de 200 micromolar (sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina, CAS: 151888-20-9, Sigma-Aldrich; 2,24 mg, 4.19 micromol); se disolvió en 1 ml de tampón fosfato de sodio 25 mM, pH de 7 que resulta en una concentración de 4.19 mM (factor de dilución: 20,9); se añadieron 95 microlitros a la soluciones proteicas (2000 microlitros de volumen total).

Se añadió 1,16-W,W’-bis(maleimido)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano (5 mg, 11 micromol) a la solución. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos.

La muestra se diluyó con tampón acetato 5 mM, pH 5. La muestra se cargó en una columna HiTrap SP HP (1 ml). La columna se lavó con acetato 5 mM y tampón acetato 25 mM. El compuesto se eluyó con tampón acetato 25 mM que contiene NaCl 1 M.

El Fab 0088 (5 mg, 3,92 mg/ml, 1,27 ml, 104 nmol) se intercambió de tampón en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 7. El volumen final fue de 2000 microlitros (50 micromolar, 2,5 mg/ml). Se añadió sal dipotásica dihidratada de bis(psulfonatofenil)fenilfosfina a partir de una solución en el tampón fosfato a una concentración final de 200 micromolar (sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina, CAS: 151888-20-9, Sigma-Aldrich; 2,24 mg, 4,19 micromol); se disolvió en 1 ml de tampón fosfato de sodio 25 mM, pH 7 que resulta en una concentración de 4.19 mM (factor de dilución: 20,9); se añadieron 95 microlitros a la soluciones proteicas (2000 microlitros de volumen total).

Las dos soluciones proteicas se mezclaron, el tampón se intercambió a un tampón acetato 25 mM, pH 5 y se concentró a la mitad del volumen. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se cargó en una columna Superdex200 10/300 GL que se había preacondicionado en L-histidina 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7. El compuesto se eluyó mediante el uso de dicho tampón. Las fracciones seleccionadas se agruparon y analizaron mediante el uso de análisis SDS-PAGE, LCMS (m/z: 96 144, [M-NH3+H]+), HPLC de fase inversa y determinación de la secuencia de Edman. Este conjugado se designó como 9002.

Ejemplo 11: Conjugación del Fab 2F22 y Fab 0089 con 1,16-W,W’-bis(maleimido)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano ref. 9028

En completa analogía con el ejemplo anterior, Fab 2F22 (3,9 mg) y Fab 0089 (8,0 mg) se intercambiaron de tampón a la solución salina tamponada con fosfato mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (Millipore Corp., MWCO de 10 kDa). Las concentraciones de ambas proteínas se ajustaron a 50 micromolar.

Se añadió sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina a partir de una solución en el tampón fosfato a una concentración final de 200 micromolar. Las mezclas resultantes se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente. El Fab 2F22 se intercambió de tampón en tampón acetato de sodio 15 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 5,0.

El Fab 0089 se intercambió de tampón en tampón acetato de sodio 15 mM, pH 4,5. Se añadió 1,16-N,N’-bis(maleimido)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano (punta de una espátula) a la solución. La mezcla resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla se cargó en una columna HiTrap SP HP preacondicionada (GEHealthcare, 1 ml). La proteína inmovilizada se lavó con tampón acetato de sodio 15 mM, pH 4,5, 25 CV. La proteína se eluyó de la columna con tampón acetato de sodio 15 mM, NaCl 1 M, pH 5,0 y se mezcló con Fab 2F22. La mezcla resultante se concentró en el filtro centrífugo de centrifugado Amicon Ultra (MWCO de 10 kDa). Volumen final: 400 microlitros. La mezcla se incubó durante 20 h. La muestra se inyectó en una columna de permeabilidad en gel que se había preacondicionado en HEPES 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 (columna HiLoad16/600 Superdex 200, GE Heathcare). La muestra se eluyó de la columna mediante el uso de un flujo de 1 ml/min de HEPE^s5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 en agua. Las fracciones que contienen el conjugado deseado se identificaron mediante el uso del análisis SDS-PAGE. Las fracciones agrupadas se concentraron en un volumen de 1000 microlitros mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (MWCO de 10 kDa). LCMS (m/z: 95629, [M+H]+). Este conjugado se designó como 9028.

Ejemplo 12: Conjugación del Fab 0094 y Fab 0089 con 1,16-N,N’-bis(maleimido)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano (ref. 9004)

En completa analogía con el ejemplo anterior, se formó un conjugado de Fab 0094 y Fab 0089. LCMS (m/z: 95994, [M+H]+). Este conjugado se designó como 9004.

Ejemplo 13: Conjugación del Fab 0095 y Fab 0089 con 1,16-N,N’-bis(maleimido)-4,13-diaza-7,10-dioxa-3,14-dioxohexadecano (ref. 9005)

En completa analogía con el ejemplo anterior, se formó un conjugado de Fab 0095 y Fab 0089. LCMS (m/z: 95928, [M-NH3+H]+). Este conjugado se designó como 9005.

Ejemplo 14: Preparación de bis(bromoacetil)etileno diamina

El ácido bromoacético (2,1 g, 15 mmol) se disolvió en DCM (40 ml). La solución se añadió gota a gota a una suspensión de carbodiimida inmovilizada en resina PS (N-ciclohexilcarbodiimida-N'-metil poliestireno; Novabiochem, prod#: 8.55029.0025; 2,3 mmol/g; 10 g) durante un período de 15 minutos. Se añadió gota a gota una solución de diamina (450 mg, 7,5 mmol) en DCM (20 ml) a la solución en agitación durante un período de 20 minutos. La mezcla se agitó durante 1 h. La solución se filtró y se concentró al vacío hasta la sequedad. LCMS (m/z: 302,9, [M+H]+). Ejemplo 15: Conjugación del Fab 0088 y Fab 0089 mediante el uso de bis(bromoacetil)etileno diamina (ref. 9029)

El Fab 0088 y Fab 0089 se intercambiaron de tampón a solución salina tamponada con fosfato mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (Millipore Corp., MWCO de 10 kDa). Las concentraciones de ambas proteínas se ajustaron a 50 micromolar. Se añadió sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina a partir de una solución en el tampón fosfato a una concentración final de 200 micromolar. Las mezclas resultantes se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente.

Las proteínas se intercambiaron de tampón a trietanolamina 20 mM, NaCl 1 M, sal dipotásica dihidratada de bis( psulfonatofenil)fenilfosfina 200 micromolar, pH 8,5. El Fab 0089 (60 mg, 10 mg/ml) se mezcló con bis(bromoacetil)etileno diamina (37 mg). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. LCMS (m/z: 47 858 [M-NH3+H]+). La muestra se diluyó (aproximadamente 10 veces) con tampón acetato 15 mM, pH 4,5. La muestra se cargó en una columna HiTrap SP HP preacondicionada (5 ml). La columna se lavó con un tampón acetato 15 mM. El compuesto se eluyó con un tampón acuoso de trietanolamina 20mM y NaCl 1 M, pH 8,5. Las dos soluciones proteicas se mezclaron y se concentró/intercambió de tampón en trietanolamina 20mM, NaCl 1 M, pH 8,5, sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina 200 micromolar, pH 8,5 mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (Millipore Corp., MWCO de 10 kDa). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución se cargó en una columna Superdex200 26/60 GL que se había preacondicionado en HEPES 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 (columna HiLoad26/60 Superdex 200, GE Heathcare). La muestra se eluyó de la columna mediante el uso de un flujo de 2,5 ml/min en HEPES 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 en agua. Las fracciones que contienen el conjugado deseado se identificaron mediante el uso del análisis SDS-PAGE. Las fracciones agrupadas se concentraron en un volumen de 1000 microlitros mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (MWCO de 10 kDa). LCMS (m/z: 95834, [M-NH3+H]+).

Ejemplo 16: Conjugación del Fab 0094 y Fab 0089 mediante el uso de bis(bromoacetil)etileno diamina (ref. 9030)

El Fab 0094 y Fab 0089 se intercambiaron de tampón a solución salina tamponada con fosfato mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (Millipore Corp., MWCO de 10 kDa). Las concentraciones de ambas proteínas se ajustaron a 50 micromolar. Se añadió sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina a partir de una solución en el tampón fosfato a una concentración final de 200 micromolar. Las mezclas resultantes se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente. Las proteínas se intercambiaron de tampón a trietanolamina 20 mM, NaCl 1 M, sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina 200 micromolar, pH 8,5.

El Fab 0089 (60 mg, 10 mg/ml) se mezcló con bis(bromoacetil)etileno diamina (37 mg). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. LCMS (m/z: 47858 [M-NH3+H]+).

La muestra se diluyó (aproximadamente 10 veces) con tampón acetato 15 mM, pH 4,5. La muestra se cargó en una columna HiTrap SP HP preacondicionada (5 ml). La columna se lavó con un tampón acetato 15 mM. El compuesto se eluyó con un tampón acuoso de trietanolamina 20mM y NaCl 1 M, pH 8,5.

Las dos soluciones proteicas se mezclaron y se concentró/intercambió de tampón en trietanolamina 20mM, NaCl 1 M, pH 8,5, sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina 200 micromolar y yoduro de sodio 200 micromolar pH 8,5 mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (Millipore Corp., MWCO de 10 kDa). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución se cargó en una columna Superdex200 26/60 GL que se había preacondicionado en HEPES 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 (columna HiLoad26/60 Superdex 200, GE Heathcare). La muestra se eluyó de la columna mediante el uso de un flujo de 2,5 ml/min en HEPES 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 en agua. Las fracciones que contienen el conjugado deseado se identificaron mediante el uso del análisis SDS-PAGE. Las fracciones agrupadas se concentraron en un volumen de 1000 microlitros mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (MWCO de 10 kDa). LCMS (m/z: 95664, [M-NH3+H]+). Este compuesto se designó como 9030.

Ejemplo 17: Conjugación del Fab 0313 y Fab 0089 mediante el uso de bis(bromoacetil)etileno diamina (ref. 9031)

El Fab 0094 y Fab 0089 se intercambiaron de tampón a solución salina tamponada con fosfato mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (Millipore Corp., MWCO de 10 kDa). Las concentraciones de ambas proteínas se ajustaron a 50 micromolar. Se añadió sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina a partir de una solución en el tampón fosfato a una concentración final de 200 micromolar. Las mezclas resultantes se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente.

Las proteínas se intercambiaron de tampón a trietanolamina 20 mM, NaCl 1 M, sal dipotásica dihidratada de bis( psulfonatofenil)fenilfosfina 200 micromolar, pH 8,5.

La muestra se diluyó (aproximadamente 10 veces) con tampón acetato 15 mM, pH 4,5. La muestra se cargó en una columna HiTrap s P HP preacondicionada (5 ml). La columna se lavó con un tampón acetato 15 mM. El compuesto se eluyó con un tampón acuoso de trietanolamina 20mM y NaCl 1 M, pH 8,5.

Las dos soluciones proteicas se mezclaron y se concentró/intercambió de tampón en trietanolamina 20mM, NaCl 1 M, pH 8,5, sal dipotásica dihidratada de bis(p-sulfonatofenil)fenilfosfina 200 micromolar y yoduro de sodio 200 micromolar pH 8,5 mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (Millipore Corp., MWCO de 10 kDa). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución se cargó en una columna Superdex200 26/60 GL que se había preacondicionado en HEPES 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 (columna HiLoad26/60 Superdex 200, GE Heathcare). La muestra se eluyó de la columna mediante el uso de un flujo de 2,5 ml/min en HEPES 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3 en agua. Las fracciones que contienen el conjugado deseado se identificaron mediante el uso del análisis SDS-PAGE. Las fracciones agrupadas se concentraron en un volumen de 1000 microlitros mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon Ultra (MWCO de 10 kDa). LCMS (m/z: 95638, [M-NH3+H]+).

Ejemplo 18: Ensayo de generación de trombina

El efecto de los anticuerpos sobre la generación de trombina se estudió en plasma humano normal (NHP, plasma de calibración HemosIL) suplementado con PS/PC 10 jM: Fosfatidilserina/fosfatidilcolina al 25/75 %. La coagulación se inició mediante recalcificación y adición de Innovin® (1,0 pM). El plasma similar a la Hemofilia A se obtuvo mediante la adición de 100 jg/ml de anticuerpo anti-FVIII humano de oveja (disponible comercialmente).

La actividad de trombina se evaluó continuamente después de la conversión del sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl (I-1140), de Bachem (Bubendorf, Suiza). La fluorescencia se midió en una placa de microtitulación de fluorómetro Fluorskan Ascent (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia) con longitudes de onda de excitación y emisión a 368 y 460 nm, respectivamente. Se usó un calibrador para permitir el cálculo de la cantidad de trombina formada y la corrección de las unidades de fluorescencia relativa obtenidas para los efectos del filtro interno y el consumo de sustrato fluorogénico. Además, se restó la contribución a la conversión del sustrato mediante el complejo trombina-a2-macroglobulina. Estas correcciones se realizaron automáticamente por medio del programa informático de trombograma automatizado calibrado (CAT) proporcionado por Synapse BV (Maaestricht, Holanda). La primera derivada de los datos que se obtuvieron rindieron la curva generación de trombina, que permitió el cálculo de i) tiempo de retardo, ii) área total bajo la curva, el potencial endógeno de trombina (ETP), iii) altura del pico de trombina (Pico), iv) tiempo hasta el pico (ttPico) y v) velocidad máxima de generación de la trombina (Velocidad). Ejemplo 19: Análisis de la interacción de unión

El análisis de la interacción de unión se obtuvo por resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore T200. El aglutinante Fab humano (kit de captura de Fab humano, GE Healthcare) se inmovilizó a un chip de sensor CM4 serie S (GE Healthcare) en las celdas de flujo 1-4 a 10000 unidades de respuesta (RU) mediante el uso del protocolo de acoplamiento de amina disponible dentro del programa informático de control de Biacore T-200 (GE Healthcare) y los reactivos proporcionados con el kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). El fragmento Fab relevante o conjugado Fab-Fab se capturó en las celdas de flujo 2, 3 o 4 a una concentración fija. Diferentes concentraciones del TFPI se evaluaron al diluir TFPI en el tampón de corrida (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, CaCl²5 mM, 0,05 % de surfactante P20, 1 mg/ml de BSA). Cada muestra se ensayó mediante el uso de 300 segundos de tiempo de contacto seguido de 600 segundos de tiempo de disociación a 50 pl/min de régimen de flujo. Además se evaluó un tampón blanco. La superficie del sensor se regeneró con glicina 10 mM pH 2,1 con dos ciclos cada uno de 30 segundos a 50 pl/min de régimen de flujo.

El programa informático de evaluación Biacore T200 se usó para analizar los datos. La determinación de las constantes de unión (k^on, k^off, K^d) se obtuvo al asumir una interacción 1:1 del TFPI y la variante de Fab o el conjugado Fab-Fab de interés.

Ejemplo 20: Efecto de anticuerpos anti-TFPI sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana

Un efecto sinérgico de los anticuerpos anti-TFPI sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana puede obtenerse mediante la combinación o fusión de un anticuerpo que se dirige a un epítopo en la región KPI-3 con un anticuerpo que se dirige a un epítopo en la región KPI-1/KPI-2 del TFPI.

El efecto de los anticuerpos sobre la generación de trombina se estudió en un ensayo de generación de trombina de acuerdo con el ejemplo 18.

La figura 1 (curva a) muestra la curva de generación de trombina con NHP. La adición de 100 pg/ml de anticuerpo anti-FVIII humano de oveja al NHP para simular una afección similar a la hemofilia A (curva b) disminuyó fuertemente la generación de trombina. El NHP contiene aproximadamente TFPI 1,6 nM, de los que solo aproximadamente 0,2 nM están presentes como TFPI de longitud completaa. La adición de un número de anticuerpos anti-TFPI, que incluyen el mAb 2021 (también descrito en el documento WO2010/072691), al plasma neutralizado con FVIII restablece de manera eficiente una curva de generación de trombina cercana a la normal. Sin embargo, los estudios preclínicos y clínicos han demostrado que el direccionamiento in vivo del TFPI con anticuerpos o aptámeros provoca una elevación significativa del nivel plasmático de TFPI. Por lo tanto, fue de interés estudiar el efecto del direccionamiento del TFPI en condiciones con una concentración de TFPI elevada. La figura 1 muestra que la adición de TFPIa de longitud completa 20 nM al plasma neutralizado con FVIII evitó por completo una generación de trombina medible (curva c) y que la adición de 200 nM de un anticuerpo de alta afinidad contra KPI-2 (mAb 2021) no pudo anular de manera eficiente la inhibición del TFPI y establecer una generación de trombina robusta en estas condiciones (curva d). La adición de 200 nM de un anticuerpo de alta afinidad contra KPI-3 (mAb 4F110) es completamente incapaz de establecer una generación de trombina significativa en presencia de TFPI 20 nM (curva e). Sin embargo, sorprendentemente, la combinación de mAb 2021 100 nM y mAb 4F110 100 nM muestra un efecto sinérgico al establecer una generación de trombina robusta (Curva f) que es claramente mayor que la suma de generación de trombina producida por cada anticuerpo solo y es del mismo orden de magnitud que la generación de trombina producida en NHP (Curva a).

Los datos en la figura 1 muestran que una combinación de un anticuerpo contra KPI-3 de TFPI en combinación con un anticuerpo contra KPI-2 actuó sinérgicamente en la inversión de la inhibición del TFPI a concentraciones elevadas de TFPI. Los parámetros de la altura del pico de trombina (pico) derivados de las curvas en la figura 1 se enumeran en la tabla 1.

Tabla 1. Efecto de las combinaciones de anticuerpos monoespecíficos anti-TFPI KPI-2 y anti-TFPI KPI-3 en la n r i n r m in n NHP HAP n r liz n FVIII n TFPI l n i m l 2 nM

Subsecuentemente se evaluó un número de anticuerpos contra la región C-terminal del TFPI para un posible efecto sinérgico sobre la generación de trombina, cuando se combina con el mAb 2021. En condiciones con una concentración elevada de TFPI obtenida mediante la adición de TFPIa humano 20 nM al plasma neutralizado con FVIII, ninguno de los anticuerpos C-terminal fueron capaces por sí mismos de evitar la inhibición por TFPI y promover una generación de trombina medible (datos no mostrados). Sin embargo, los datos en la tabla 2 muestran que un número de anticuerpos anti-TFPI KPI-3/C-terminal (marcados *) actúan sinérgicamente junto con el mAb 2021 para producir un pico de trombina prominente en plasma en condiciones similares a la hemofilia A con concentraciones elevadas de TFPI. La altura del pico de trombina derivada de las curvas de generación de trombina se enumeran en la tabla 2.

Tabla 2. Efecto de las combinaciones de anticuerpos a TFPI monoespecíficos anti-TFPI KPI-2 y anti-TFPI KPI-3 en l nr i n r min n NHP HAP n rliz n FVIII n TFPI lni ml 2 nM

Se evaluó un número de anticuerpos contra el dominio KPI-1 del TFPI para un posible efecto sinérgico en la generación de trombina cuando se combina con el mAb 4F110 específico del dominio KPI-3. La tabla 3 y la tabla 4 muestran datos sobre el efecto de los mAb específicos del dominio KPI-14903 (American Diagnostica, núm. de cat. ADG4903), 1F91, 2F3, 2F22, 2F35 y 2F45 en el tiempo de retardo, el tiempo hasta el pico y el pico, solo y en combinación con el mAb 4F110 en plasma neutralizado con FVIII (HAP) con 20 nM de TFPIa humano añadido. Solo algunos de los anticuerpos específicos a KPI-1 eran capaces por sí mismos de evitar la inhibición por el TFPI y promover una generación de trombina medible. Sin embargo, los datos en la tabla 4 muestran que un número de anticuerpos específicos del dominio KPI-1 (marcados *) actúan sinérgicamente junto con el mAb 4F110 para producir un pico de trombina prominente en plasma en condiciones similares a la hemofilia A con concentraciones elevadas de TFPI. La altura del pico de trombina se derivó de las curvas de generación de trombina.

Tabla 3. Efecto de las combinaciones de anticuerpos a TFPI monoespecíficos anti-TFPI KPI-1 y anti-TFPI KPI-3 en l nr i n r min n NHP HAP n r liz n FVIII n TFPI lni ml 2 nM

Tabla 4. Efecto de las combinaciones de anticuerpos monoespecíficos anti-TFPI KPI-1 y anti-TFPI KPI-3 en la nr in r min n NHP HAP n r liz n FVIII n TFPI lni m l 2 nM

continuación

Ejemplo 21: Efecto sinérgico de los conjugados de fragmentos Fab anti-TFPI sobre la generación de trombina inducida por factor tisular en plasma de hemofilia A humana

Los fragmentos Fab y conjugados Fab-Fab preparados de acuerdo con los ejemplos 6, 7 10, 12, 13 y 17 se analizaron en un ensayo de análisis de interacción de unión de acuerdo con el ejemplo 19 para determinar la afinidad de unión hacia el TFPI humano.

La tabla 5 muestra las constantes de disociación de equilibrio (K^d) para cinco fragmentos Fab:

Fab 0088 (KPI-2) SEQ ID NO: 3+4,

Fab 0094 (KPI-2) SEQ ID NO: 5+6

Fab 0095 (KPI-2) SEQ ID NO: 7+8

Fab 0313 (KPI-2) SEQ ID NO: 58+59

Fab 0089 (KPI-3) SEQ ID NO: 9+10

y cuatro conjugados Fab-Fab específicos del dominio KPI-2/KPI-3 (las SEQ ID NO para los Fab individuales son los mismos que los anteriores):

Fab 0088-Fab 0089 (también denominado como 9002; KPI-2/KPI-3)

Fab 0094-Fab 0089 (también denominado como 9004; KPI-2/KPI-3)

Fab 0095-Fab 0089 (también denominado como 9005; KPI-2/KPI-3)

Fab 0313-Fab 0089 (también denominado como 9031; KPI-2/KPI-3)

Tabla 5. Unión de los fragmentos Fab anti-TFPI KPI-2 y anti-TFPI KPI-3 y los conjugados Fab-Fab al TFPIa humano

TFPIa

Los fragmentos Fab contra el dominio KPI-2 del TFPI se evaluaron para un posible efecto sobre la generación de trombina (según se midió de acuerdo con el ejemplo 18). La tabla 6 muestra los datos sobre el efecto de los fragmentos Fab específicos del dominio KPI-20088, 0094 y 0095 y el mAb 2021 sobre el pico de trombina en NHP (HAP) neutralizado con FVIII con niveles de TFPI endógenos. Los fragmentos Fab 0088, 0094 y 0095 son variantes del mAb 2021. La tabla 7 muestra los resultados de un experimento similar en donde se añadió TFPIa de longitud completa 2 nM al NHP (HAP) neutralizado con FVIII. La altura del pico de trombina se derivó de las curvas de generación de trombina.

Tabla 6. Efecto de los fragmentos Fab específicos anti-TFPI KPI-2 o el mAb 2021 sobre la generación de trombina en NHP^HAP neutralizado con FVIII con niveles de TFPI endó enos.

Tabla 7. Efecto de los fragmentos Fab específicos anti-TFPI KPI-2 o el mAb 2021 sobre la generación de trombina en NHP HAP neutralizado con FVIII con TFPIa. de lonitud comleta 2 nM

Los conjugados Fab-Fab dirigidos a los dominios KPI-2 y KPI-3 se prepararon de acuerdo con los ejemplos 6,710 (9002) y 12 (9004) y se compararon con los fragmentos Fab no conjugados correspondientes para determinar un posible efecto sobre la generación de trombina según se midió de acuerdo con el ejemplo 18. Las tablas 8A y 8B muestran datos sobre el efecto de los conjugados Fab 0088-Fab 0089 (designado 9002) y Fab 0094-Fab 0089 (designado 9004) específico de los dominios KPI-2 KPI-3 así como también los fragmentos Fab en una forma no conjugada en la generación de trombina en NHP (HAP) neutralizado con FVIII con TFPIa de longitud completa 20 nM.

De ello se deduce claramente que los conjugados Fab-Fab, además del efecto sinérgico obtenido al combinar con anticuerpos o fragmentos Fab, muestran un efecto de avidez sobre la generación de trombina en comparación con una combinación - es decir, no conjugados - de fragmentos Fab, a la misma concentración. La altura del pico de trombina se derivó de las curvas de generación de trombina.

Tabla 8A. Efecto de los fragmentos Fab específicos anti-TFPI KPI-2 y anti-TFPI KPI-3 o de los conjugados Fab-Fab n l nr i n r min n NHP HAP n r liz n FVIII n TFPI.2 nM

Tabla 8B. Efecto de los fragmentos Fab específicos anti-TFPI KPI-2 y anti-TFPI KPI-3 o de los conjugados Fab-Fab n l nr in r min im h l i n NHP HAP n r liz n FVIII n TFPI.2 nM

De ello se deduce claramente que los conjugados Fab-Fab muestran un efecto de avidez en la unión al TFPI, lo que resulta en un aumento sinérgico en la generación de trombina que es mayor que el efecto obtenido al combinar dos anticuerpos o dos fragmentos Fab no conjugados.

Los fragmentos Fab y conjugados Fab-Fab dirigidos a los dominios KPI-1 y KPI-3 se prepararon de acuerdo con el ejemplo 6,7 y 11 (9028) y se analizaron en un ensayo de análisis de interacción de unión de acuerdo con el ejemplo 19 para determinar la afinidad de unión hacia el TFPI humano. La tabla 9 muestra las constantes de disociación de equilibrio (K^d) para un fragmento Fab:

Fab 2F22 (KPI-1) (SEQ ID NO: 40 y 41) y un conjugado Fab-Fab específico del dominio KPI-1/KPI-3 (las SEQ ID NO para los Fab individuales son los mismos que los anteriores):

Fab 2F22-Fab 0089 (también denominado como 9028; KPI-1/KPI-3)

Tabla 9. Unión del fragmento Fab 2F22 anti-TFPI KPI-1 y de un conjugado Fab-Fab anti-TFPI KPI-1 y anti-TFPI KPI-3 al TFPIa humano TFPIa.

Los conjugados Fab-Fab dirigidos a los dominios KPI-1 y KPI-3 se compararon con los fragmentos Fab no conjugados correspondientes para determinar un posible efecto sobre la generación de trombina medido de acuerdo con el ejemplo 18. La tabla 10 muestra datos sobre el efecto de los conjugados Fab 2F22-Fab 0089 específicos del dominio KPI-1/KPI-3 así como también los fragmentos Fab en forma no conjugada en la generación de trombina en NHP (HAP) neutralizado con FVIII con TFPIa. de longitud completa 20 nM

Efecto de los fragmentos Fab específicos anti-TFPI KPI-1 y anti-TFPI KPI-3 y compuestos de conjugados Fab-Fab en la generación de trombina en NHP (HAP) neutralizado con FVIII con TFPIa de longitud completa 20 nM 'Pico': altura del pico de trombina; 'ttPico': tiempo hasta el pico. n.a.: no disponible.

Ejemplo 22: Estructura cristalina del TFPI KPI-1 soluble en complejo con el fragmento Fab del mAb 2F22 anti-TFPI

La estructura en 3D del dominio 1 inhibidor de la proteasa de tipo Kunitz (KPI-1) del TFPI humano soluble, incluida la parte N-terminal que antecede al TFPI KPI-1 (TFPI 1-79, numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 1), en complejo con un fragmento Fab (SEQ ID NO: 52 y 53) del anticuerpo monoclonal anti-TFPI2F22, se determinó a alta resolución mediante el uso de la cristalografía de rayos X. Los resultados demuestran que el anticuerpo es capaz de unirse al KPI-1 del TFPI y parte del N-terminal anterior. Los residuos de epítopos de TFPI humano resultantes comprenden: Leu 16, Pro 17, Leu 19, Lys 20, Leu 21, Met 22, Phe 25, Cys 35, Ala 37, Met 39, Arg 41, Tyr 56, Gly 57, Gly 58, Cys 59, Glu 60, Gly 61, Asn 62, Gln 63, Arg 65, Phe 66, Glu 67, Glu 71 y Met 75 (SEQ ID NO: 1).

Materiales y métodos

Para obtener fragmentos Fab adecuados para cristalografía, se generó un vector de expresión basado en pTT para la expresión de una HC de mAb 2F22 truncado. El fragmento VH se escindió del vector de expresión de HC del mAb 2F22 mediante digestión con enzimas de restricción y se clonó en un vector de caja de herramientas basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para una región constante de IgG4 humana truncada. Las HC basadas en IgG4 se truncaron en la región de bisagra después de la lisina correspondiente a la posición 222 en la secuencia para la HC del Fab 2F22 extendido (Fab para acoplamiento químico, SEQ ID NO: 40). La reacción de clonación se transformó subsecuentemente en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN. El fragmento Fab del fragmento de mAb 2F22 se expresó como Fab 0296 (SEQ ID NO: 52 y 53) en células EXPI293F y se purificó mediante cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina KappaSelect como se describió en el ejemplo 7.

El TFPI KPI-1 humano soluble, que incluye la parte N-terminal del TFPI humano y, adicionalmente, una etiqueta GSSGSSG unida en el extremo N terminal (SEQ ID NO: 62) y el Fab 0296 (el cual consiste de una cadena ligera correspondiente a la SEQ ID NO: 53 y un fragmento de cadena pesada correspondiente a la SEQ ID NO: 52), ambos en tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (4 tabletas en 2 litros de agua, GIBCO núm. de cat. 18912-014 Invitrogen Corporation), se mezclaron con un exceso molar ligero (1,1:1) de la especie del TFPI. Después, el complejo se concentró a aproximadamente 10,0 mg/ml mediante el uso de un filtro de centrífuga Amicon Ultra-4 con corte de peso molecular de 10000. Los cristales se cultivaron con la técnica de gota sentada mediante el uso de una placa tTp IQ de 96 pocillos de TTP Lab Tech núm.: 4150-05800 y 100 pl de solución precipitante por pocillo. La solución precipitante contenía 20 % p/v de PEG 3350, formato de potasio 200 mM y se mezcló con la solución proteica en una relación de 3:1. El tamaño de la gota total fue de 200 nl y los cristales aparecieron después de unos pocos días. Se preparó un cristal para criocongelar al transferir 1 pl de una mezcla de solución de congelación que contenía 75 % de la solución precipitante y 25 % de glicerol a la gota que contenía el cristal. El remojo se dejó durante aproximadamente 2 minutos. Después se tomó el cristal, se congeló inmediatamente en N²líquido y se mantuvo a una temperatura de 100 K mediante una corriente de gas N²criogénico durante la recogida de datos. Se recolectaron los datos cristalográficos, a 1,65 A en la línea del haz BL911-3 en MAX-lab, Lund, Suecia. La determinación, la integración y el escalado de los datos del grupo espaciador se realizaron mediante el paquete de programa informático XDS [Kabsch, W., J.Appl.Crystallogr., (1993), Vol. 26, páginas 795-800]. El grupo espaciador se determinó ser C2 y los parámetros de celda para los datos de sincrotrón se determinaron ser 89,010, 66,660, 106,110 A, respectivamente, y con un ángulo p de 111,18°. El R-sym a la resolución de 1,65 A fue de 8,4 % y la totalidad de 99,5 %. La media de intensidad/sigma (intensidad) de reflexiones únicas fueron igual a 2,0 a alrededor de 1,8 A de resolución.

El reemplazo molecular (MR) se usó para la determinación de la estructura mediante el uso de las coordenadas de una molécula de Fab con el código de acceso 1NGZ [Yin, J. y otros, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 4 de febrero de 2003, (100), Vol. 100 páginas 856-861] del Protein Data Bank (PDB) [Berman, H. M. y otros, Nucleic Acids Res., (2000), Vol. 28, páginas 235-242]. La molécula de Fab se dividió en dos dominios, los dominios variables y constantes, que cada uno se usaron como modelos de búsqueda en los cálculos de MR. El programa informático Molrep [Vagin, A. y otros, J.Appl.Crystallogr., (1997), Vol. 30, páginas 1022-1025] del CCP4 paquete CCP4 [Collaborative Computational Project, N., Acta crystallographica.Sección D, Biological crystallography, (1994), Vol.

50, páginas 760-763] se usó para encontrar las posiciones de los dominios Fab constantes y variables. El dominio KPI-1 no se encontró en la etapa de MR, sin embargo, el mapa de la diferencia de densidad de electrones indicó las posiciones aproximadas de las moléculas del dominio KPI-1 en esta etapa. Después de las mejoras de la densidad de electrones mediante el programa informático DM del paquete de programa informático CCP4, seguido de creación de modelos automatizados y mejoras de fases mediante el uso del programa informático ARP-wARP [Langer, G. y otros, Nat Protoc, (2008), Vol. 3, páginas 1171-1179] [Murshudov, G. N. y otros, Acta Crystallographica, Sección D, Biological Crystallography, (2011), Vol. 67, páginas 355-367] proporcionaron una estructura casi completa tanto de la molécula de Fab 0296 como de la estructura del dominio KPI-1, y parte del extremo N-terminal que antecede el dominio KPI-1. Para el TFPI (SEQ ID NO: 1) los residuos del 15 al 77 se incluyeron en el modelo de rayos X que, además de KPI-1 también incluye algunos residuos del extremo N-terminal del KPI-1 (residuos 26-79). Para el fragmento Fab 0296, se observan los residuos de la cadena ligera 1 a 212 y los residuos de la cadena pesada 1 a 221. Se registró un procedimiento de inspección de gráficos por computadora de los mapas de densidad de electrones, correcciones de modelos y creación mediante el uso del programa informático Coot [Emsley, P. y otros, Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (2004), Vol. 60, páginas 2126-2132] seguido de mejoras cristalográficas, mediante el uso de los programas informáticos Refmac5 [Murshudov, G. N. y otros, Acta Crystallographica Sección D Biological Crystallography, (2011), Vol. 67, páginas 355-367] del paquete de programas informático CCP4. El procedimiento se sometió a ciclos hasta que no se pudieron hacer mejoras significativas adicionales al modelo. La R final y la R libre para todos los datos a una resolución de 1,65 A fueron 0,192 y 0,220, respectivamente.

Resultados

El cálculo de las áreas promedio excluidas en las interacciones por pares mediante el programa informático Areaimol [Lee, B. y otros, J Mol Biol, (1971), Vol. 55, páginas 379-400][Saff, E. B. y otros, Math Intell, (1997), Vol. 19, páginas 5-11] del juego de programas CCP4 [Collaborative Computational Project, N., Acta crystallographica.Sección D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, páginas 760-763] proporcionó para el complejo molecular fragmento de TFPI humano soluble/Fab 0296 anti-TFPI de la estructura cristalina 1195 A2.

Los contactos directos entre el TFPI KPI-1, incluida la parte N-terminal del TFPI observada en la estructura cristalina, (SEQ ID NO: 62) y el Fab 0296 anti-TFPI (SEQ ID NO: 52 y 53), se identificaron mediante la corrida del programa informático Contacts del juego de programas CCP4 [Bailey, S., Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr., (1994), Vol.

50, páginas 760-763] mediante el uso de una distancia de corte de 4,0 A entre el Fab 0296 anti-TFPI y las moléculas de fragmentos del TFPI. Los resultados de la estructura cristalina del complejo fragmento del TFPI soluble/Fab 0296 anti-TFPI se muestran en la tabla 11. El TFPI KPI-1 resultante, que incluye el N-terminal del TFPI, epítopo para el anti-TFPI2F22 se encontró que comprende uno o más de los siguientes residuos del TFPI (la SEQ ID NO: 1): Leu 16, Pro 17, Leu 19, Lys 20, Leu 21, Met 22, Phe 25, Cys 35, Ala 37, Met 39, Arg 41, Tyr 56, Gly 57, Gly 58, Cys 59, Glu 60, Gly 61, Asn 62, Gln 63, Arg 65, Phe 66, Glu 67, Glu 71 y Met 75. Evaluados a partir de distancias, interacciones carga-carga, enlaces de hidrógeno, interacciones polares e hidrófobas y baja accesibilidad a los disolventes, los siguientes residuos parecen ser residuos particularmente importantes del epítopo: Arg 41, Arg 65 y Glu 67.

Por tanto, el epítopo de TFPI del anti-TFPI2F22 comprende residuos que anteceden al KPI-1, que incluye una ahélice corta en el extremo N-terminal, residuos en el lazo antes de las cadenas p 1 del KPI-1 y residuos al inicio de la cadena a 1. Además, incluye residuos en el extremo de la cadena p 2 y residuos en el lazo entre la cadena p 2 y la a-hélice del extremo C-terminal de KPI-1 y los residuos dentro de la a-hélice del extremo C-terminal de KPI-1.

El parátopo anti-TFPI2F22 para TFPI KPI-1 incluye los residuos Val 2, Phe 27, Tyr 32, Trp 52, Arg 53, Gly 54, Gly 55, Ser 56, Ile 57, Asp 58, Tyr 59, Ala 61, Met 64, Lys 97, Ser 99, His 100, Asn 102, Tyr 103, Val 104, Gly 105 y Tyr 106 de la cadena pesada (H) (SEQ ID NO: 52, tabla 11), y los residuos Pro 31, Ala 32, Tyr 49, Ser 50, Asn 53, Tyr 55, Thr 56, Tyr 91, Thr 92, Ser 93 y Tyr 94 de la cadena ligera (L) (SEQ ID NO: 53, tabla 11).

Tabla 11. Interacciones

Interacciones de TFPI KPI-1, cadena K, (SEQ ID NO: 1) con la cadena pesada (cadena H) del Fab 0296 anti-TFPI (SEQ ID NO: 52) y la cadena ligera (cadena L) del Fab 0296 anti-TFPI (SEQ ⁱD NO: 53) para el primer complejo independiente cristalográfico. Se usó una distancia de corte de 4,0 A. Los contactos se identificaron mediante el programa informático de computadoras CONTACT del paquete de CCP4 [Collaborative Computational Project, N., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, (1994), Vol. 50, páginas 760-763].En la última columna "***" indica una posibilidad grande para un enlace de hidrógeno en este contacto (distancia < 3,3 A) como se calculó mediante CONTACT, "*" indica una posibilidad baja (distancia > 3,3 A). El blanco indica que el programa consideró que no existe posibilidad de un enlace de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno son específicos entre un donante y un aceptor, son típicamente fuertes y se identifican fácilmente.

Estos resultados indican que el Fab 0296 anti-TFPI se une específicamente al TFPI KPI-1 y parte del N-terminal anterior.

co n tin u a c ió n

c o n tin u a c ió n

c o n tin u a c ió n

continuación

Estos resultados muestran que Fab 0296 anti-TFPI se une específicamente a TFPI KPI-1 y parte del N-terminal anterior.

Ejemplo 23: Unión de anticuerpos al TFPI asociado a la superficie celular

La capacidad de los anticuerpos anti-TFPI, fragmentos Fab o conjugados Fab-Fab para unirse al TFPI asociado con la superficie de la célula endotelial in vitro se estudió mediante el uso de citometría de flujo. Las células de la línea celular de la vena umbilical humana EA.hy926 (ATCC) se incubaron durante 30 minutos en hielo con diferentes concentraciones del mAb 2021 anti-TFPI, Fab 0088, Fab 0094, Fab 0095 o Fab 0313, o Fab 0088-Fab 0089 conjugado 9002 o Fab 0094-Fab 0089 conjugado 9004 en tampón de ensayo (PBS suplementado con FCS al 2 %). Las células se lavaron con PBS y subsecuentemente se incubaron en hielo con el anticuerpo secundario conjugado a APC (Aloficocianina-AffiniPure fragmento F(ab')2 de asno anti-IgG humana (H+L), Jackson ImmunoResearch, cat.

709-136-149) durante 30 minutos en tampón de ensayo. Las células se lavaron con PBS y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSRFortessa. Se trazaron perfiles de unión mediante el uso de la intensidad de fluorescencia media a diferentes concentraciones de anticuerpos y se calcularon los valores de unión medios máximos (EC50). Los datos enumerados en la tabla 12 muestran claramente que los Fab 0088, Fab 0094 y Fab 0313 a TFPI Kp I-2 (todos los fragmentos Fab se derivan del mAb 2021) se unen con afinidades similares al TFPI asociado a la superficie de las células EA.hy926 y TFPIa según lo determinado por el análisis SPR enumerado en la tabla 5. Por el contrario a la unión de alta afinidad al TFPIa (tabla 5), no se pudo detectar ninguna unión medible del mAb 4F110 anti-TFPI KPI-3 al TFPI asociado a la superficie de las células EA.hy926. Los datos también muestran que la afinidad del Fab del conjugado 9004 Fab 0094-Fab 0089 para el TFPI asociado a la superficie de las células EA.hy926 se reduce significativamente en comparación con su afinidad por TFPIa (tabla 5) que indica la unión preferencial a las especies de TFPI que comprende una región C-terminal.

Tabla 12. Valores de EC50 para la unión de anticuerpos anti-TFPI y fragmentos a TFPI asociado a la superficie de l l l EA.h 2 n. : in ni n m i l

Ejemplo 24: Neutralización por los mAb y conjugados Fab-Fab de la inhibición de TFPIp de la generación del FXa mediada por TF/FVIIa

Las células de la línea celular de la vena umbilical humana EA.hy926 (ATCC) se cultivaron hasta el 100 % de confluencia en placas de 96 pocillos en DMEM (Gibco) suministradas con FCS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Las células se estimularon con 20 ng/ml de TNFa y 20 ng/ml de IL-1p durante 3 horas y se usaron para probar la neutralización de la activación de FX dependiente de TF de la superficie celular. Las células se lavaron dos veces con HEPES 25 mM, NaCl 137 mM, KCl 3,5 mM, pH 7,4 antes de medir la activación de FX en HEPES 25 mM, NaCl 137 mM, KCl 3,5 mM, CaCl²5 mM, 1 mg/ml de B^sA, pH 7,4. Después de la incubación durante 15 min a 37 °C, la neutralización del TFPI se indujo mediante la adición del mAb o conjugado Fab-Fab 0 - 60 nM durante 120 min. A esto le siguió la incubación con rFVIIa 50 pM (Novo Nordisk A/S) durante 15 min. La generación de FXa se inició mediante la adición de FX 50 nM durante 40 min a 37 °C. La reacción se detuvo al mezclar 40 pl de sobrenadante con 10 pl (75 mM) de EDTA y la actividad de FXa se midió finalmente con sustrato cromogénico S-2765 0,6 mM (Chromogenix). La actividad de TF/FVIIa se verificó en experimentos de control con la adición de 0,5 mg/ml de anticuerpo policlonal anti TF humano de cabra neutralizante.

Los datos se analizaron con el programa informático GraphPad Prism (versión 5). Los resultados se muestran en la figura 2. La actividad de FXa en el sobrenadante se midió después de la incubación con FVIIa 50 pM y FX 50 nM a 37 °C con diversas concentraciones (0 - 60 nM) del mAb 2021: (A); mAb 4F110 (B); conjugado 9002 Fab 0088-Fab 0089 (C); o conjugado 9004 Fab 0094-Fab 0089 (D). Los cuadrados muestran el efecto del anticuerpo policlonal anti TF humano de cabra a 0,5 mg/ml junto con el conjugado de mAb o Fab-Fab 60 nM. Los resultados se muestran como media ± SD, n=3.

Los datos muestran que el mAb 2021, pero no el mAb 4F110, fue capaz de neutralizar la inhibición del TFPI de la activación de FX mediada por TF/FVIIa en la superficie de las células EA.hy926. La neutralización del TFPIp también se observó con el conjugado 9002 Fab 0088-Fab 0089. Por el contrario, 9004 Fab 0094-Fab 0089 no tuvo un efecto neutralizante significativo en la inhibición de TFPIp del TF/FVIIa en las células EA.hy926. Por lo tanto, la modulación de la afinidad de un anticuerpo de unión a KPI-2 se demuestra que es crucial para el efecto funcional de los conjugados Fab-Fab contra los KPI-2 y KPI-3.

Ejemplo 25: Generación de los anticuerpos biespecíficos asimétricos

Se generó un anticuerpo Mal biespecífico de unión a TFPI KPI-2/KPI-3 en base a un formato de IgG asimétrico, es decir, a través de heterodimerización de Fc. Con el fin de lograr la heterodimerización de FC, un conjunto de mutaciones disponibles se diseñaron por ingeniería genética en la región Fc de las variantes de hIgGI del mAb 2021 y mAb 4F110.

Los fragmentos VH se escindieron de los vectores de expresión de HC de mAb 2021 y mAb 4F110 mediante digestión con enzimas de restricción y se clonaron en un vector de caja de herramientas basado en pTT linealizado que contenía la secuencia para una región constante de IgG1 humana. La reacción de clonación se transformó subsecuentemente en E. coli para la selección. La secuencia de la construcción final se verificó mediante secuenciación de ADN.

Para apoyar la heterodimerización de FC mediante el intercambio controlado del brazo Fab, se introdujo una única mutación de fenilalanina a leucina en el dominio CH3 de la HC de IgG1 del mAb 2021, correspondiente a la posición 409 en la SEQ ID NO: 63. La mutación se introdujo mediante mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® de Stratagene. Las secuencias de la construcción final se verificaron mediante secuenciación de ADN. La versión de IgG1 diseñada por ingeniería genética del mAb 2021 se expresó como mAb 0309 (SEQ ID NO: 63 y 64) en células EXPI293F como se describió en el ejemplo 7. La purificación se realizó por cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina MabSelectSuRe de GE Healthcare de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos purificados se intercambiaron de tampón al tampón PBS pH 7,2.

Se introdujo una mutación coincidente de lisina a arginina en el dominio CH3 de la HC de IgG1 del mAb 4F110, correspondiente a la posición 410 en la SEQ ID NO: 65. La mutación se introdujo mediante mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® de Stratagene. Las secuencias de la construcción final se verificaron mediante secuenciación de ADN. La versión de IgG1 diseñada por ingeniería genética del mAb 2021 se expresó como mAb 0312 (SEQ ID NO: 65 y 66) en células EXPI293F como se describió en el ejemplo 7. La purificación se realizó por cromatografía de afinidad estándar mediante el uso de resina MabSelectSuRe de ^gE Healthcare de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos purificados se intercambiaron de tampón al tampón PBS pH 7,2.

Se preparó un anticuerpo biespecífico de unión a KPI-2/KPI-3 mediante intercambio controlado del brazo Fab entre la variante de IgG1 diseñada por ingeniería genética del mAb2021 (unión a KPI-2), mAb309 y la variante de IgG1 diseñada por ingeniería genética del mAb4F110 (unión a KPI-3), mAb312. El anticuerpo biespecífico se preparó esencialmente de acuerdo con métodos publicados (Labrijn y otros, PNAS, 110: 5145-5150 (2013)).

En resumen, el mAb 0309 (variante de IgG1 del mAb 2021 Phe-a-Leu, SEQ ID NO: 63) se mezcló con el mAb 0312 (variante de IgG1 del mAb 4F110 Lys-a-Arg, SEQ ID NO: 65) en una relación molar 1:1 (1 mg/ml por anticuerpo) en tampón PBS. Los anticuerpos se redujeron selectivamente mediante la incubación de la mezcla 1:1 durante 90 minutos a 37 °C en presencia de 2-mercaptoetilamina (MEA) 25 mM para formar medios anticuerpos y permitir el intercambio Fab-brazo. Finalmente, se obtuvo el reensamblaje y la reoxidación espontáneos después de la eliminación del agente reductor (diafiltración en tampón PBS sin MEA) y almacenamiento a 5 °C durante al menos 16 horas. La heterodimerización, promovida por las mutaciones del dominio CH3, se observó con una eficiencia que excede el 90 %. El anticuerpo biespecífico final derivado de mAb 0309 y 0312 se denominó mAb 0325 (SEQ ID NO: 67-70).

El conjunto inverso de mutaciones, es decir, Lys-a-Arg en la IgG1 del Mab 2021 y Phe-a-Leu en la IgG1 del Mab 4F110 también se generaron y analizaron con resultados similares.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico que es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-2 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio k PI-3 del TFPI,

en donde la cadena pesada que se une al KPI-2 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 110 de la SEQ ID NO: 3; en donde la cadena ligera que se une al KPI-2 comprende

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 55 a 61 de la SEQ ID NO: 4; una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 4; en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los residuos de aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO: 10; una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 89 a 97 de la SEQ ID NO: 10.

2. Un anticuerpo biespecífico que es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio k PI-3 del TFPI,

en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena ligera que se une al KPI-1 comprende

3. Un anticuerpo biespecífico que es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio ^kPI-3 del TFPI,

en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 104 de la SEQ ID NO: 22; en dond e la cad en a lige ra que se une al KPI-1 co m p re n d e

en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

4. Un anticuerpo biespecífico que es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio KPI-3 del TFPI,

en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena ligera que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

5. Un anticuerpo biespecífico que es capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del dominio KPI-1 del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) y un epítopo dentro del dominio ^kPI-3 del TFPI,

en donde la cadena pesada que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena ligera que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR2 correspondiente a los aminoácidos 50 a 56 de la SEQ ID NO:31 y

en donde la cadena pesada que se une al KPI-3 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 107 de la SEQ ID NO: 9; y en do nde la cad en a lige ra que se une al K P I-3 co m p re n d e

6. Una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-2 y un segundo anticuerpo contra TFPi monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al epítopo KPI-2 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 99 a 110 de la SEQ ID NO: 3; en donde la cadena ligera que se une al epítopo KPI-2 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 94 a 102 de la SEQ ID NO: 4; en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

7. Una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 99 a 104 de la SEQ ID NO: 22, y en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

8. Una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en dond e la cad en a pe sada del an ticu e rp o que se une al KPI-1 co m p re n d e

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 98 a 110 de la SEQ ID NO: 24; y en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 25 en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

9. Una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPⁱmonoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

• una secuencia de CDR3 correspondiente a los residuos de aminoácidos 89 a 96 de la SEQ ID NO: 27; en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

10. Una composición farmacéutica que comprende un primer anticuerpo contra TFPI monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-1 y un segundo anticuerpo contra TFPi monoespecífico capaz de unirse específicamente a un epítopo dentro del KPI-3,

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena ligera del anticuerpo que se une al KPI-1 comprende

en donde la cadena pesada del anticuerpo que se une al KPI-3 comprende

11. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es un conjugado Fab-Fab o en un formato de anticuerpo de longitud completa.

12. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 11, que es humanizado.