ES2926796T3 - Método para la detección de infecciones de articulaciones sinoviales - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para detectar una infección de la articulación sinovial que comprende los pasos de - poner en contacto una muestra de líquido sinovial con al menos un sustrato de lisozima, y - detectar una infección de la articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para la detección de infecciones de articulaciones sinoviales
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para detectar infecciones en articulaciones sinoviales.
Antecedentes de la técnica
La infección de articulaciones tales como rodillas, caderas u hombros suele ser la consecuencia de un procedimiento quirúrgico o de lesiones en las que pueden entrar bacterias o virus en las articulaciones. Por lo tanto, las articulaciones artificiales o los implantes a menudo se ven afectados por tales infecciones. La detección de una infección bacteriana, por ejemplo, en las articulaciones se lleva a cabo mediante una punción articular con análisis sinovial, en el que las bacterias se detectan mediante un cultivo en medios de cultivo especiales en una incubadora. Sin embargo, un resultado negativo de un cultivo no prueba que se esté exento de gérmenes, ya que hay hasta un 30% de falsos negativos (Simank HG et al. (2004) Joint Anemia Orthopedist 33: 327-31). Ese sistema de detección con cultivos microbianos suele tardar de 2 a 5 días. Alternativamente, se puede realizar un recuento de leucocitos en el líquido sinovial (leucocitos/mm3). Sin embargo, los recuentos de leucocitos entre 1.000 y 10.000 no excluyen una infección bacteriana (Carpenter CR et al. (2011) Acad Emerg Med 18: 781-96; Coutlakis Pj et al. (2002) J Clin Rheumatol 8: 67-71).
La artritis séptica, también conocida como infecciosa o, si hay bacterias involucradas, artritis bacteriana, es una enfermedad peligrosa. Dependiendo del germen, puede provocar daños considerables en muy poco tiempo en la articulación. Esto es especialmente cierto para una infección con Staphylococcus aureus. Además, puede conducir a una siembra de los agentes patógenos en el torrente sanguíneo y, como consecuencia, a una infección general potencialmente mortal (sepsis).
En el caso de una artritis bacteriana, el diagnóstico más rápido posible y la terapia inmediata son absolutamente decisivos para el resultado de la enfermedad y la curación completa. Cada día que pasa sin diagnóstico, las bacterias en la articulación causan daños que nunca podrán repararse por completo. Además, cada día que pasa con una infección sin tratar, aumenta el riesgo de propagar los agentes patógenos a otras partes del cuerpo y, por lo tanto, el riesgo de enfermedades potencialmente mortales.
En el caso de infecciones bacterianas, es necesario el tratamiento con antibióticos (por ejemplo, Dutta S et al. (Asian J Pharm Clin Res 9 (2016): 243-252, describen el uso de vancomicina e inmunomoduladores en el tratamiento de la artritis estafilocócica), los implantes deben retirarse la mayor parte del tiempo. Por otro lado, a menudo se producen procesos inflamatorios en las distintas articulaciones, que también provocan hinchazón, enrojecimiento y dolor. A diferencia de las infecciones bacterianas, en esos casos no es necesaria la administración de antibióticos. En su lugar, se administrará una terapia antiinflamatoria. Por lo tanto, para un diagnóstico preciso, es necesario realizar una punción de la articulación afectada.
Los métodos conocidos en la técnica no se pueden utilizar para diferenciar de manera fiable una infección de la articulación sinovial de una afección inflamatoria no infecciosa de una articulación sinovial. Sin embargo, esa distinción es de gran importancia porque permite determinar cómo se puede tratar de manera eficiente el trastorno de una articulación sinovial. Si la causa del trastorno es una infección bacteriana, por ejemplo, se deben administrar antibióticos al mamífero que padece el trastorno de la articulación sinovial. Carpenter et al. (Academic Emergency Medicine, vol. 18, n° 8, 1 de agosto de 2011, páginas 781-796) dan a conocer un método para una diferenciación rápida de una etiología bacteriana y examina marcadores tales como recuentos de glóbulos blancos, velocidad de sedimentación de eritrocitos, PCR, etc.
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para detectar infecciones de las articulaciones sinoviales en cuestión de minutos y diferenciar entre trastornos de una articulación sinovial causados por bacterias, por ejemplo, y afecciones inflamatorias no infecciosas.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un método para detectar la infección de una articulación sinovial que comprende las etapas de
- poner en contacto una muestra de líquido sinovial con al menos un sustrato de lisozima, y
- detectar la infección de una articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato.
Sorprendentemente, se ha llegado al resultado de que una infección de la articulación sinovial puede detectarse determinando la actividad de la lisozima en el líquido sinovial de un mamífero que padece una afección de la articulación sinovial, en donde la actividad enzimática se determina preferiblemente en una muestra de líquido sinovial
sin tratar, obtenida directamente a partir de dicho mamífero (es decir, obtenida mediante la punción de una articulación sinovial de un mamífero). Hasta ahora se pensaba que todo tipo de afecciones de las articulaciones sinoviales, causadas por infecciones o por inflamación no infecciosa, producían un aumento de la actividad de la lisozima. Sin embargo, como se muestra en este documento, la actividad de la lisozima en el líquido sinovial de mamíferos que padecen una afección inflamatoria no infecciosa de una articulación sinovial, no muestra o no muestra significativamente actividad de lisozima. Este hallazgo es aún más sorprendente si se tiene en cuenta que la actividad de la mieloperoxidasa, un marcador bien conocido de afecciones infecciosas, también muestra actividad en el líquido sinovial infectado, mientras que la elastasa y la catepsina G, por ejemplo, otros dos marcadores conocidos de afecciones infecciosas, no muestran ninguna actividad enzimática. Estos hallazgos son muy importantes porque permiten identificar de manera inequívoca las infecciones de las articulaciones sinoviales en mamíferos que se sabe que padecen una afección de las articulaciones sinoviales. La identificación de la causa de las afecciones de la articulación sinovial permite elegir el tratamiento adecuado para dicha afección. Por ejemplo, una infección bacteriana de una articulación sinovial se puede tratar con antibióticos, mientras que una afección inflamatoria no infecciosa requiere otros niveles de tratamiento.
Los descubrimientos de la presente invención permiten diferenciar en cuestión de minutos las afecciones de la articulación sinovial en una infección de la articulación sinovial y una afección inflamatoria no infecciosa.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para diferenciar entre una infección de una articulación sinovial y una afección inflamatoria no infecciosa de una articulación sinovial que comprende las etapas de
- poner en contacto una muestra de líquido sinovial de un mamífero que muestra síntomas de una afección de la articulación sinovial con al menos un sustrato de lisozima,
- detectar una infección de la articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato en dicha muestra y
- detectar una afección inflamatoria no infecciosa cuando no se determina sustancialmente ninguna actividad de lisozima.
La presente invención describe un sistema in vitro para detectar infecciones, en particular infecciones bacterianas, en fluidos sinoviales de mamíferos. Las infecciones pueden identificarse mediante el método de la presente invención en cuestión de minutos, ya que la actividad de la lisozima en las articulaciones infecciosas es significativamente mayor que en comparación con los mamíferos sanos y los mamíferos que padecen una afección inflamatoria no infecciosa.
En una realización preferida de la presente invención, se usan sustratos para la conversión con lisozima que pueden liberar un marcador que puede detectarse ópticamente usando, por ejemplo, métodos fotométricos o tiras reactivas. Ese sistema de prueba representa una gran ayuda para la toma de decisiones para un tratamiento posterior, ya que puede diferenciar entre procesos bacterianos e inflamatorios en las articulaciones de los mamíferos, en particular los seres humanos.
La presente invención permite un resultado rápido en términos de una posible infección directamente en la ambulancia o en el caso de caballos y ganado en el establo. El resultado es inmediato, no se necesita laboratorio ni microbiología que requiere mucho tiempo para el primer diagnóstico. Las enzimas en los líquidos sinoviales, que son secretadas por el sistema inmunitario del cuerpo en un mayor grado en el caso de infecciones articulares bacterianas, se detectan preferentemente mediante un sistema de reacción de color, simple y rápido. La preparación específica del material de la muestra permite que la muestra se transfiera de manera rápida y confiable al nuevo sistema de prueba. Los datos experimentales muestran claramente que, en el caso de una infección sinovial, diversas enzimas han aumentado significativamente y es posible diferenciar entre eventos bacterianos e inflamatorios.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra el diagrama de cajas de las concentraciones de lisozima en muestras de sinovia sin afección de la articulación sinovial (NSJC), muestras artríticas asépticas (ASA) y sépticas (S). Se analizó un total de 50 muestras, en donde 10 muestras no tenían afecciones de la articulación sinovial, 22 eran artríticas asépticas y 18 muestras eran sépticas. Los valores más altos de los diferentes grupos eran los siguientes: NSJC 2,0 pg/ml, ASA 4,5 pg/ml, S 377,7 pg/ml. Las medianas de los diferentes grupos eran: NSJC 0,74 pg/ml, ASA 1,2 pg/ml y S 15,3 pg/ml. Los valores más bajos para los tres grupos diferentes eran: NSJC 0,30 pg/ml, ASA 0,0 pg/ml y S 9,9 pg/ml.
La Fig. 2 muestra el diagrama de cajas de las concentraciones de MPO en muestras de sinovia sin afección de la articulación sinovial (NSJC), muestras artríticas asépticas (ASA) y sépticas (S). Se analizó un total de 50 muestras, en donde 10 muestras no tenían afecciones de la articulación sinovial, 22 eran artríticas asépticas y 18 muestras eran sépticas. Los valores más altos de los diferentes grupos eran los siguientes: NSJC 0,054 pg/ml, ASA 0,41 pg/ml, S 58,6 pg/ml. Las medianas de los diferentes grupos eran: NSJC 0,046 pg/ml, ASA 0,046 pg/ml y S 1,1 pg/ml. Los valores más bajos para los tres grupos diferentes eran: NSJC 0,046 pg/ml, ASA 0,046 pg/ml y S 0,046 pg/ml.
La Fig. 3 muestra los valores de absorbancia medidos en los ensayos de actividad de la lisozima según el ejemplo 2.
La Fig. 4 muestra la liberación de colorante dependiente del tiempo partiendo del Black 5, reactivo con peptidoglicano usando concentraciones crecientes de lisozima.
La Fig. 5 muestra la influencia de la concentración de sustrato sobre la cinética de reacción de la lisozima.
Descripción de las realizaciones
La presente invención se refiere a un método para detectar una infección de la articulación sinovial.
Sorprendentemente, se vio que la actividad de la lisozima en el líquido sinovial es la de un marcador de infecciones en las articulaciones sinoviales, ya que el líquido sinovial se obtenía a partir de articulaciones sanas, así como a partir de articulaciones de mamíferos que padecen una afección inflamatoria no infecciosa del líquido sinovial (p. ej., artritis, en particular artritis reumatoide). Esto es particularmente sorprendente porque según Pruzanski W et al. (Arth Rheumat (1970) 13:389-399; Sem Arthritis Rheumat (1972) 1: 361-381), por ejemplo, la actividad de la lisozima puede detectarse en muestras de suero y de líquido sinovial de pacientes que padecen artritis reumatoide utilizando un sistema de prueba que se basa en la lisis de la pared celular de Micrococcus lysodeiktikus (como una prueba de difusión en agar). Por el contrario, los ejemplos proporcionados en este documento muestran claramente que la actividad de la lisozima en pacientes sanos no es detectable o solo en un grado muy bajo. Cabe señalar que Pruzanski W et al. (1970) no determinaron la actividad de la lisozima en el líquido sinovial de individuos sanos, por lo que la actividad de la lisozima descrita en ese documento no puede ser un indicador para determinar si un individuo padece artritis reumatoide.
También se descubrió sorprendentemente que otros marcadores de una infección conocidos por las infecciones de heridas, como la elastasa, no muestran actividad enzimática en el líquido sinovial. Este es un hallazgo sorprendente porque se puede esperar que las infecciones puedan provocar en el cuerpo de un mamífero la secreción de las mismas sustancias o al menos de sustancias similares.
"Articulación sinovial", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a articulaciones planas (o articulaciones deslizantes), articulaciones en bisagra, articulaciones en pivote, articulaciones condiloides (o articulaciones elipsoidales), articulaciones en silla de montar y articulaciones esféricas. Todas esas articulaciones están llenas de líquido sinovial, que se requiere para reducir la fricción entre el cartílago articular de las articulaciones sinoviales durante el movimiento.
"Infección de una articulación sinovial", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a infecciones provocadas por bacterias, hongos y/o virus. Esas infecciones pueden ser el resultado de una lesión mecánica que provoca la infiltración de bacterias, hongos y/o virus en una articulación sinovial. Sin embargo, las infecciones articulares también pueden ocurrir en el curso de una cirugía o después de la misma. Otra fuente de infección puede ser la sangre, si la sangre del mamífero contiene los respectivos microorganismos y/o virus.
Los microorganismos comunes que causan infecciones de las articulaciones sinoviales son Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, estreptococos hemolizadores del grupo A, neumococos, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, E. coli, Haemophilus influenzae, propionibacterias y salmonelas. Además, también otros gérmenes aerobios y anaerobios, así como hongos como Candida albicans pueden ser responsables de las infecciones de una articulación sinovial (por ejemplo, Hepburn MJ, et al. Rheumatol Int. (2003) 23:255-7; Lequerre T, et al. (2002) Joint Bone Spine 69(5):499-501)
El término "sustrato", en particular "sustrato de lisozima", tal y como se usa en este documento, incluye compuestos que pueden convertirse (por ejemplo, hidrolizarse, degradarse) mediante enzimas como lisozima o que interactúan de otra forma específica con enzimas.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la muestra de líquido sinovial es de un mamífero que muestra síntomas de una afección de la articulación sinovial.
Se prefiere particularmente detectar infecciones de la articulación sinovial en mamíferos de los cuales se sospecha que padecen una afección de la articulación sinovial, ya que la obtención de líquido sinovial es invasiva y requiere realizar una punción de la articulación.
Con el fin de tratar mamíferos que muestran síntomas de una afección de la articulación sinovial de manera más eficiente mediante el uso de la medicación más adecuada, es importante conocer la causa de la afección de la articulación. Esto se puede lograr con el método de la presente invención porque permite diferenciar entre una infección de la articulación sinovial y una afección inflamatoria no infecciosa de una articulación sinovial. Esa distinción es posible debido al hecho de que la actividad de la lisozima solo puede determinarse en articulaciones sinoviales infectadas con microorganismos tales como bacterias y hongos, así como con virus. Otras afecciones de las articulaciones sinoviales que no son debidas a infecciones, no muestran ninguna actividad de la lisozima o en un grado bajo.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para diferenciar entre una infección de una articulación sinovial y una afección inflamatoria no infecciosa de una articulación sinovial que comprende las etapas de
- poner en contacto una muestra de líquido sinovial de un mamífero que muestra síntomas de una afección de la articulación sinovial con al menos un sustrato de lisozima,
- detectar una infección de la articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato en dicha muestra y
- detectar una afección inflamatoria no infecciosa cuando no se determina sustancialmente ninguna actividad de la lisozima.
"Sustancialmente sin actividad de lisozima" y "sin actividad de lisozima", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a una actividad de lisozima que no es detectable por el método descrito en este documento, en particular en el ejemplo 1, sin embargo, preferiblemente menor de 200 U/ml.
La actividad de la lisozima se puede determinar utilizando varios métodos conocidos en la técnica. Los métodos preferidos implican la conversión de un sustrato específico en un producto que puede detectarse y cuantificarse posteriormente. Esos métodos pueden implicar también sustratos que sean capaces de liberar sustancias detectables tal como colorantes. Un método particularmente preferido para determinar la actividad de la lisozima se describe, por ejemplo, en el documento EP 2433 138. El sustrato de lisozima usado en los métodos descritos en ese documento es preferentemente un peptidoglicano y/o quitosano, u oligómeros de los mismos, más preferentemente un peptidoglicano y/o un quitosano teñido con un colorante de vinilsulfona. El peptidoglicano puede obtenerse a partir de Micrococcus lysodeikticus.
La concentración de sustrato de peptidoglucano teñido, por ejemplo, puede estar dentro de un intervalo de 1 mg/ml a 50 mg/ml, preferiblemente de 10 mg/ml - 20 mg/ml, en particular 15 mg/ml.
El sustrato de lisozima se incuba con la muestra de líquido sinovial durante un tiempo o intervalo de tiempo definido. Se prefiere particularmente incubar la muestra de líquido sinovial con el sustrato de lisozima de 1 a 30 min, preferiblemente de 1 a 20 min, más preferiblemente de 1 a 15 min, más preferiblemente de 1 a 10 min, más preferiblemente de 2 a 30 min, más preferiblemente de 2 a 20 min, más preferiblemente de 2 a 15 min, más preferiblemente de 2 a 10 min, más preferiblemente de 5 a 30 min, más preferiblemente de 5 a 20 min, más preferiblemente de 5 a 15 min, más preferiblemente de 5 a 10 min.
El método de la presente invención tiene la ventaja de que el líquido sinovial utilizado en el mismo se puede utilizar sin ninguna etapa de preparación. Por lo tanto, el líquido sinovial obtenido a partir de la articulación de un mamífero puede usarse directamente para evaluar su actividad de lisozima. Esto es sorprendente ya que los métodos conocidos en la técnica no usan el líquido sinovial directamente para determinar la actividad de la lisozima. Por ejemplo, Pruzanski W et al. (1970) sugieren centrifugar el líquido sinovial que se va a analizar y dializarlo antes de ponerlo en contacto con el sustrato de lisozima.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la afección inflamatoria no infecciosa de una articulación sinovial es la artritis inflamatoria, preferiblemente la artritis reumatoide, la artritis aséptica aguda o la osteoartritis, la osteocondrosis y la inflamación causada por eventos traumáticos.
De acuerdo con una realización preferida adicional de la presente invención, la infección de la articulación sinovial es una infección bacteriana, fúngica o vírica, en donde las infecciones bacterianas pueden estar causadas preferiblemente por Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, estreptococos hemolizadores del grupo A, neumococos, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, E. coli, Haemophilus influenzae, propionibacterias y salmonelas, y las infecciones fúngicas pueden estar causadas preferentemente por Candida albicans.
Las infecciones de las articulaciones sinoviales pueden estar causadas por uno o más de los organismos mencionados anteriormente. Las infecciones provocadas por uno o más de esos organismos pueden tratarse con medicamentos tales como antibióticos, como se conoce bien en la técnica.
El método de la presente invención se usa preferentemente con muestras obtenidas a partir de mamíferos que muestran síntomas de una afección de la articulación sinovial. Los síntomas de una afección de la articulación sinovial incluyen preferentemente dolor, hinchazón de la articulación, fiebre y/o incapacidad para mover la extremidad con la articulación infectada.
De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, la infección de una articulación sinovial se detecta cuando la actividad de la lisozima dentro de la muestra es de al menos 500 U/ml, preferiblemente de al menos 600 U/ml, más preferiblemente de al menos 700 U/ml, más preferiblemente de al menos 800 U/ml, más preferiblemente de al menos 900 U/ml, más preferiblemente de al menos 1.000 U/ml.
Se ha encontrado que la detección de una actividad de lisozima dentro del líquido sinovial de al menos 500 U/ml indica que dicho líquido sinovial se ha obtenido a partir de una articulación que tiene una infección causada por uno de los agentes patógenos/organismos mencionados anteriormente.
Según una realización preferida de la presente invención, se detecta una afección inflamatoria no infecciosa cuando la actividad de lisozima dentro de la muestra es inferior a 500 U/ml, preferentemente inferior a 400 U/ml, más preferiblemente inferior a 300 U/ml, más preferiblemente inferior a 200 U/ml.
De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención, al menos un sustrato de lisozima es peptidoglicano o un derivado del mismo.
Se sabe que la lisozima destruye las paredes celulares bacterianas al hidrolizar los enlaces 1,4-beta entre el ácido N-acetilmurámico y los residuos de N-acetil-D-glucosamina en el peptidoglicano. Además de su actividad lítica contra las bacterias Gram positivas, la lisozima puede actuar como una opsonina innata, no específica al unirse a la superficie bacteriana, reducir la carga negativa y facilitar la fagocitosis de la bacteria antes de que lleguen las opsoninas del sistema inmunitario adquirido.
En otra realización, proporcionada en este documento, el sustrato de lisozima puede tener una estructura A-I (Fórmula I) en la que A es un anclaje e I es una región indicadora, en donde el indicador (I) o un motivo en el mismo se conjuga con el anclaje y el conjugado es un sustrato para la lisozima (véase el documento WO 2017/168249).
En algunas realizaciones, la región del anclaje (A) está asociada con la región indicadora (I) a través de un sitio de reconocimiento de enzima (S). En esa realización, el sitio de reconocimiento de la enzima es una estructura o un motivo que permite la unión a una enzima.
En una realización, el sitio de reconocimiento de la enzima (S) está presente de forma natural en la región del anclaje. En otra realización, el sitio de reconocimiento de la enzima (S) se introduce en la región del anclaje mediante una modificación química. Alternativamente, el sitio de reconocimiento de la enzima (S) puede estar presente de forma natural en la región indicadora (I) o puede introducirse sintéticamente en la región indicadora (I) a través de una o más modificaciones químicas.
En una realización, la entidad química de la Fórmula I comprende un anclaje (A) que está asociado con el indicador (I), ya sea de forma covalente o no covalente. En particular, la asociación entre la región del anclaje (A) y la región indicadora (I) está mediada por una interacción covalente. Como se entiende en la técnica, los enlaces covalentes implican compartir electrones entre los átomos enlazados. Por el contrario, los enlaces no covalentes pueden incluir, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones electrostáticas, interacciones de enlaces de hidrógeno, interacciones fisicoquímicas, fuerzas de van der Waal, interacciones de ácido de Lewis/base de Lewis o combinaciones de las mismas.
En una realización, el anclaje A se asocia con el indicador I a través de una interacción covalente para formar el sitio de reconocimiento S. En otra realización, el anclaje A se asocia con el indicador I a través de una interacción covalente que no forma parte del sitio de reconocimiento S.
En algunas realizaciones, la entidad química comprende además una región lábil enzimáticamente o reactiva enzimáticamente (R). En una realización, la región reactiva (R) es una parte de la región del anclaje. En otra realización, la región reactiva (R) es una parte de la región indicadora (I). Más adicionalmente, la región reactiva (R) es una parte del sitio de reconocimiento de la enzima (S).
En una realización, la región reactiva (R) interacciona con lisozima o mieloperoxidasa, o una combinación de las mismas.
La estructura principal del sustrato de lisozima puede ser quitosano, peptidoglicano o cualquier derivado de los mismos, siendo preferible el peptidoglicano.
Los tintes reactivos para teñir el sustrato pueden tener diferentes cantidades de grupos sulfonato que oscilan entre 1 -6 grupos sulfonato.
La estructura principal se puede teñir con el reactivo Red 120 o el reactivo Green 19 (6 grupos sulfonato); con el reactivo Blue 109 (5 grupos sulfonato); con el reactivo Brown 10 (4 grupos sulfonato); con el reactivo Blue 5 (3 grupos sulfonato); con el reactivo Black 5 o el reactivo Violet 5 (2 grupos sulfonato); con el reactivo Orange 16 o el reactivo Blue 19 (1 grupo sulfonato). Se prefieren los colorantes que contienen 1-2 grupos sulfonato, como el reactivo Black 5 o el reactivo Blue 19.
Según una realización preferida de la presente invención, la muestra de líquido sinovial se pone además en contacto con al menos un sustrato de mieloperoxidasa y se detecta la infección de una articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato.
Se sabe que la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) aumenta significativamente en el tejido infeccioso. La determinación/cuantificación adicional de la actividad de MPO en una muestra de líquido sinovial puede usarse para confirmar que la articulación sinovial está infectada.
Según otra realización preferida de la presente invención, la infección de una articulación sinovial se detecta cuando la actividad mieloperoxidasa dentro de la muestra es de al menos 0,1 U/ml, preferiblemente de al menos 0,2 U/ml, más preferiblemente de al menos 0,3 U/ml, más preferiblemente de 0,4 U/ml, más preferiblemente de al menos 0,5 U/ml, más preferiblemente de al menos 1 U/ml.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el al menos un sustrato de la mieloperoxidasa se selecciona a partir del grupo que consiste en guaiacol, ácido 3,4-diamino benzoico, ácido 4-amino-3-hidroxibenzoico, 3,4-diaminobenzoato de metilo, ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico, ácido 2,3-diaminobenzoico, ácido 3,4-dihidroxibenzoico, 2-aminofenol, ácido 2-amino-3-metoxibenzoico, 2-amino-4-metilfenol, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, ácido 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), violeta cristal, violeta leucocristal y ácido sináptico Fast Blue RR modificado con isocianato.
De acuerdo con la presente invención, la actividad de MPO se puede determinar usando el siguiente sistema de detección para la detección de niveles elevados de MPO en el líquido sinovial. El sistema comprende un recipiente de reacción relleno con un volumen definido de tampón de fosfato (100-1400 gl, sodio o potasio, pH 6,2-8,0, 10,0-100 mM). A continuación, la muestra de líquido sinovial (100-1400 gl) se transfiere al recipiente de reacción que contiene el tampón añadido previamente. Por lo tanto, el factor de dilución puede oscilar entre 10:1 y 1:10. El factor de dilución más preferido oscila entre 2:1 - 1:2.
El sustrato de MPO se añade en forma sólida, por ejemplo como un comprimido, y puede contener uno de los sustratos mencionados anteriormente y, más preferentemente, un sustrato seleccionado a partir del grupo que consiste en guaiacol, ácido 3,4-diamino benzoico, ácido 4-amino-3-hidroxibenzoico, 3,4-diaminobenzoato de metilo, ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico, ácido 2,3-diaminobenzoico, ácido 3,4-dihidroxibenzoico, 2-aminofenol, ácido 2-amino-3-metoxibenzoico y 2-amino-4-metilfenol.
Si se usa un comprimido, el comprimido puede tener un peso de 10 - 100 mg, en donde el peso óptimo son 20 mg. Los comprimidos se pueden prensar con una presión de 2 t durante 10 segundos con un diámetro de 5 mm.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, un comprimido puede tener la siguiente composición:
0,01-0,10 mg de Na2CO3*1,5 H2O2 , idealmente 0,03-0,05 mg
0,01-1 mg de compuesto activo, idealmente 0,20-0,40 mg
La maltosa se puede usar como relleno y se puede añadir para obtener el peso final deseado
Después de la adición del sustrato a la muestra de líquido sinovial, todo el sistema está bien mezclado y la reacción enzimática comienza de inmediato. Dependiendo del nivel de actividad de MPO, se puede observar un cambio de color visible de la solución. El color que surge depende del ingrediente activo y puede ser amarillo, naranja, rojo, marrón, negro o cualquier combinación de los mismos.
De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el mamífero se selecciona a partir del grupo que consiste en seres humanos, vacas, cerdos, ovejas y caballos.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, sin embargo, sin limitarse a los mismos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Determinación de la actividad de lisozima en muestras de líquido sinovial obtenidas a partir de pacientes sanos y pacientes que padecen artritis reumatoide e infecciones microbianas de una articulación sinovial
La lisozima es una enzima, que es producida y secretada por células del sistema inmune innato. El peptidoglucano es el componente principal de las paredes celulares de las bacterias gram positivas y puede ser escindido por la lisozima. Este es un mecanismo de defensa natural del sistema inmune para hacer frente a las bacterias al digerir sus paredes celulares. Se ha demostrado que en el 100% (véase la Tabla 1, Sensibilidad) de las muestras sinoviales analizadas que fueron diagnosticadas como sépticas por los médicos responsables, la actividad de la lisozima era elevada. Además, el 100% (véase la Tabla 1, Especificidad) de las muestras que se clasificaron como negativas o inflamatorias, no mostraban niveles elevados de lisozima.
Las actividades de la lisozima se midieron del modo siguiente:
290 de una solución de 0,45 mg/ml de peptidoglicano (procedente de Micrococcus luteus) en un tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 6,5), se incubaron con 10 pl de una muestra (líquido sinoviai). Las mediciones de la absorbancia se llevaron a cabo a 450 nm durante 10 minutos a 37°C.
Tabla 1: Sensibilidad, especificidad, valores de predicción positivos y negativos (VPP, VPN) para la detección de una infección en muestras de sinovia equina.
Ejemplo 2: Medición de la actividad de lisozima con peptidoglicano teñido
Se suspendieron 7,5 mg de peptidoglicano - reactivo Black 5 en 0,990 ml de solución de NaCl al 0,9%. Se añadieron 10 pl de diferentes concentraciones de lisozima a la solución de reacción hasta tener concentraciones finales que oscilaban entre 0 U/ml - 10000 U/ml (cada concentración por triplicado). Todas las muestras se incubaron a 37°C durante 60 minutos y se agitaron a 1400 rpm. Después de la etapa de incubación, todas las muestras se centrifugaron a 10000 g durante 5 minutos. Se transfirieron 100 pl de cada material sobrenadante a una placa de 96 pocillos y se midieron las absorbancias a 597 nm. Los valores de las absorbancias se muestran en la Fig. 3. Todas las concentraciones de lisozima se pudieron diferenciar claramente.
Ejemplo 3: Liberación de colorante durante 60 minutos para 10000 U/ml de lisozima
Se suspendieron 7,5 mg/ml de peptidoglicano - reactivo Black 5 en 0,990 ml de solución de NaCl al 0,9%. Se añadieron 10 pl de una solución de lisozima hasta tener una concentración final de 10000 U/ml. Todas las muestras se incubaron a 37°C durante 10 - 60 minutos y 1400 rpm. Cada 10 minutos se centrifugaron los triplicados (10000 g, 5 min) y se transfirieron 100 pl de los materiales sobrenadantes a una placa de 96 pocillos. La absorbancia se midió a 597 nm. La liberación del colorante en función del tiempo se muestra en la Fig. 4. Ya después de 10 minutos,
Ejemplo 4: Optimización de la concentración de sustrato utilizando peptidoglicano - reactivo Black 5
Se suspendieron diferentes cantidades de sustrato en una solución de NaCl al 0,9% (5 mg/ml - 20 mg/ml, por triplicado). Se añadieron 10 pl de una solución de lisozima a todas las diferentes concentraciones de sustrato hasta tener una concentración final de lisozima de 10000 U/ml. 10 pl de H2O sirvió como control negativo para todas las diferentes concentraciones de sustrato (todas por triplicado). Todas las muestras se incubaron a 37°C durante 60 minutos y 1400 rpm. Después de la incubación, se centrifugaron todas las muestras (10000 g, 5 min) y se transfirieron 100 pl de los materiales sobrenadantes a una placa de 96 pocillos. Las absorbancias se midieron a 597 nm. La liberación de colorante que depende del sustrato se puede observar en la Fig. 5.
Ejemplo 5: Determinación de la actividad de MPO en muestras de líquido sinovial obtenidas a partir de pacientes sanos y pacientes que padecen artritis reumatoide e infecciones microbianas de una articulación sinovial
MPO también es una enzima del sistema inmune innato y actúa como un mecanismo de defensa natural contra las bacterias al producir especies de oxígeno altamente activas. Una posible reacción de MPO es la oxidación de sustratos usando H2O2 como cofactor. El segundo mecanismo conocido es la actividad de cloración que también puede conducir a la oxidación y/o escisión de moléculas.
Se sabe que muchos sustratos cromogénicos cambian de color en las reacciones de oxidación y, por lo tanto, pueden usarse para la detección de la actividad de MPO.
Se utilizó un ensayo a base de guaiacol para la determinación de la actividad de MPO y se llevó a cabo de la siguiente manera:
Se añadieron 10 pl de una muestra de líquido sinovial a 290 pl de una solución de reacción que contenía guaiacol 187,4 mM en tampón de fosfato de potasio (100 mM, pH 7,0) y H2O20,35 mM. El cambio de absorbancia a 470 nm se registró durante un período de tiempo de 60 segundos.
Por un lado, pudimos mostrar que la actividad de MPO era elevada en el 75% de todas las muestras sinoviales investigadas que se habían clasificado como sépticas (sensibilidad, véase la tabla 2). Por otro lado, pudimos demostrar que la actividad de MPO era baja para el 90% de las muestras clasificadas como negativas (asépticas). Esto conduce a una sensibilidad del 75,0% y una especificidad del 90,0% (véanse la tabla 2 y la Fig. 2).
Tabla 2: Sensibilidad, especificidad, VPP y VPN para MPO como marcador para la detección de una infección en la sinovia
Ejemplo 6: Determinación de la actividad elastasa en muestras de líquido sinovial obtenidas a partir de pacientes sanos y pacientes que padecen artritis reumatoide e infecciones microbianas de una articulación sinovial
La enzima elastasa también se describe como una enzima marcadora en la sinovia. La elastasa es una enzima proteolítica y escinde las proteínas con una secuencia de reconocimiento específica. Esto se puede usar para escindir los cromóforos de las proteínas del sustrato. Se usó el siguiente ensayo para la determinación de la actividad elastasa.
Como sustrato se usó metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilida. Al escindir la p-nitroanilina del péptido, surge un color amarillo y se puede medir a 405 nm. El sustrato se disolvió en sulfóxido de dimetilo y se diluyó con tampón de fosfato de sodio (10-50 mM, pH 6,0 - 8,0). La concentración de sustrato final era de 1 -5 mM.
La actividad elastasa no era detectable en ninguna muestra de sinovia, lo que es un resultado sorprendentemente diferente, en comparación con el hecho de que la actividad elastasa podía detectarse en el líquido de una herida infectada. Esto es particularmente sorprendente considerando que se sabe por las publicaciones que la elastasa es detectable en el líquido sinovial mediante ensayos ELISA.
En comparación con el sistema para la detección de una infección de heridas, no es necesario un control positivo ya que las muestras se toman mediante punción y por tanto se evita un muestreo erróneo o insuficiente.
Ejemplo 7: Determinación de la actividad de catepsina en muestras de líquido sinovial obtenidas a partir de sujetos sanos y sujetos que padecen artritis reumatoide e infecciones microbianas de una articulación sinovial
Se añadieron 10 pl de líquido sinovial (equino) de caballos sanos, de sujetos que padecían artritis reumatoide e infecciones microbianas, de cada uno a 90 pl de una solución 3 mM de sustrato de catepsina G (N-Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilida) (stock disuelto hasta 30 mM en DMSO) en tampón de fosfato de sodio (25 mM, pH 7,0, NaCl 0,5 M). Las absorbancias se midieron a 405 nm durante 20 minutos a 37°C. Se analizaron 9 muestras: 3 muestras de sinovias sépticas y 3 asépticas (artritis), así como 3 muestras de líquido sinovial de sujetos sanos. La actividad de la catepsina G no se pudo medir en ninguna muestra.
Claims (13)
1. Un método para detectar una infección de una articulación sinovial que comprende las etapas de
- poner en contacto una muestra de líquido sinovial con al menos un sustrato de lisozima, y
- detectar una infección de una articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de líquido sinovial es de un mamífero que muestra síntomas de una afección de la articulación sinovial.
3. Método para diferenciar entre una infección de una articulación sinovial y una afección inflamatoria no infecciosa de una articulación sinovial que comprende las etapas de
- poner en contacto una muestra de líquido sinovial de un mamífero que muestra síntomas de una afección de la articulación sinovial con al menos un sustrato de lisozima,
- detectar una infección de una articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato en dicha muestra y
- detectar una afección inflamatoria no infecciosa cuando no se determina sustancialmente una actividad de lisozima.
4. Método según la reivindicación 3, en el que la afección inflamatoria no infecciosa es artritis inflamatoria, preferentemente artritis reumatoide, artritis aséptica aguda u osteoartritis, osteocondrosis e inflamación provocada por eventos traumáticos.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la infección de la articulación sinovial es una infección bacteriana, fúngica o vírica.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que los síntomas de una afección de la articulación sinovial incluyen dolor, inflamación de la articulación, fiebre y/o incapacidad para mover la extremidad con la articulación infectada.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la infección de la articulación sinovial se detecta cuando la actividad de la lisozima dentro de la muestra es de al menos 500 U/ml, preferiblemente de al menos 700 U/ml, más preferiblemente de al menos 1.000 U/ml.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se detecta una afección inflamatoria no infecciosa cuando la actividad de la lisozima dentro de la muestra es inferior a 500 U/ml.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el al menos un sustrato de la lisozima es peptidoglicano o un derivado del mismo.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra de líquido sinovial se pone además en contacto con al menos un sustrato de la mieloperoxidasa y se detecta una infección de la articulación sinovial cuando se determina una conversión de dicho al menos un sustrato.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la infección de la articulación sinovial se detecta cuando la actividad mieloperoxidasa dentro de la muestra es de al menos 0,4 U/ml.
12. Método según la reivindicación 10 u 11, en el que el al menos un sustrato de la mieloperoxidasa se selecciona a partir del grupo que consiste en guaiacol, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico), violeta cristal, violeta leucocristal, ácido sináptico Fast Blue RR modificado con isocianato, ácido 3,4-diaminobenzoico, ácido 4-amino-3-hidroxibenzoico, 3,4-diaminobenzoato de metilo, ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico, ácido 2,3-diaminobenzoico, ácido 3,4-dihidroxibenzoico, 2-aminofenol, ácido 2-amino-3-metoxibenzoico y 2-amino-4-metilfenol.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el mamífero se selecciona a partir del grupo que consiste en seres humanos, vacas, cerdos, ovejas y caballos.
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