ES2926954T3 - Extracción de hemicelulosas hidrotérmica asistida por enzimas - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un nuevo proceso para producir fracciones de hemicelulosa de cultivos de cereales, que comprende la extracción con agua caliente a presión de fracciones de hemicelulosa de cultivos de cereales en combinación con tratamientos enzimáticos posteriores y/o ultrafiltración de membrana posterior para purificar aún más los extractos. El nuevo proceso descrito en este documento permite la extracción y el aislamiento sostenibles y escalables de valiosas fracciones de hemicelulosa, especialmente arabinoxilanos (AX), a partir de productos secundarios de cereales. El proceso permite el fraccionamiento selectivo de arabinoxilanos en función de su estructura molecular y funcionalidades inherentes, que pueden utilizarse, por ejemplo, para la preparación de materiales basados en carbohidratos con propiedades funcionales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Extracción de hemicelulosas hidrotérmica asistida por enzimas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un proceso novedoso para producir fracciones de hemicelulosa a partir de cultivos de cereal, que comprende extracción con agua caliente a presión (PHWE) de fracciones de hemicelulosa a partir de cultivos de cereal en combinación con tratamientos enzimáticos del residuo después de la extracción y/o ultrafiltración por membrana del extracto con una endo-beta-xilanasa y una feruloil esterasa. El proceso novedoso descrito en el presente documento permite la extracción y aislamiento sostenible y escalable de fracciones de hemicelulosa valiosas, especialmente arabinoxilanos feruloilados (AX), a partir de productos secundarios de cereales. El proceso permite el fraccionamiento selectivo de arabinoxilanos basándose en su estructura molecular y funcionalidades inherentes, que, por ejemplo, pueden usarse para la preparación de materiales basados en carbohidratos con propiedades funcionales y/o productos alimenticios. Opcionalmente, el proceso puede incluir un tratamiento previo de los cultivos de cereal antes de la extracción con agua caliente a presión.
Las fracciones de hemicelulosa poliméricas y oligoméricas obtenidas muestran propiedades antioxidantes significativas en comparación con las fracciones equivalentes obtenidas mediante procesos alcalinos tradicionales.
Antecedentes de la invención
Las hemicelulosas constituyen una fracción rica en polisacáridos de pared celular en cultivos de cereal, tanto en el grano (como polisacáridos sin almidón) como en la paja (asociada con fibras de celulosa y ligninas). Estas fracciones de polisacáridos representan un valioso recurso renovable que hasta ahora no se ha explotado al máximo potencial para aplicaciones de alto valor. Por lo tanto, la valorización de tales productos secundarios agrícolas es fundamental para una implementación completa de biorrefinerías de primera y segunda generación que manejan flujos de desechos de paja lignucelulósica y grano de cereal, respectivamente1.
Arabinoxilano (AX) es la hemicelulosa más abundante en cereales como parte del grano (como polisacáridos sin almidón) y la paja (asociada con fibras celulósicas y ligninas), con una composición promedio del 30 % en tales tejidos23. Los AX de cereal consisten en una cadena principal de unidades de 1,4-p-D-xilopiranosa (Xylp), que están fuertemente sustituidas por unidades de arabinofuranosilo (Araf) en las posiciones a-1,2 y/o a-1,3 en diferentes grados y distribuciones intramoleculares, dependiendo de la fuente biológica y el tejido4. Los compuestos secundarios de arabinosa (del inglés, arabinose decorations) pueden sustituirse adicionalmente por enlaces de éster en la posición C5 por compuestos fenólicos, principalmente ácido ferúlico (FerA); estos compuestos fenólicos pueden dimerizarse con otros restos aromáticos, creando una estructura covalente reticulada compleja5 (figura 1a).
Desde un punto de vista tecnológico, los AX de cereal se han clasificado tradicionalmente en arabinoxilanos extraíbles con agua (WE-AX) y no extraíbles con agua (WU-AX), dependiendo de su posible capacidad de extracción acuosa a temperatura ambiente3 (figura 1b). Los WE-AX están presentes principalmente en el endospermo de cereal y están moderadamente sustituidos con arabinosa. Por el contrario, los WU-AX son predominantes en salvado de cereal, representando aproximadamente el 95 % del contenido total estimado de AX3'4'6-8. Los WU-AX muestran una gran heterogeneidad en su estructura9, con fracciones que contienen patrones de sustitución de Araf muy divergentes y sustituidas adicionalmente con ácido ferúlico, lo que contribuye a la reticulación con otros polímeros de arabinoxilano y otros componentes de pared celular. Esta heterogeneidad molecular tiene un gran impacto en la capacidad de extracción de estas hemicelulosas y en sus propiedades macroscópicas (por ejemplo, propiedades de solubilidad, reológicas, de formación de película y mecánicas), que son fundamentales para sus aplicaciones materiales.
El documento REISINGER, M., et al.,(“Wheat bran biorefinery - A detailed investigation on hydrothermal and enzymatic treatment,” 3ioresource Technology 2013;144:179-185.) se refiere a un trabajo de investigación que trata de la desintegración del salvado de trigo de una manera más completa, pero no produce arabinoxilano feruloilado.
Los documentos WO 2015/014364 y WO 2014/019589 se refieren a la producción de monosacáridos fermentables, en particular monosacárido xilosa C5, a partir de hemicelulosa pero no producen arabinoxilano feruloilado.
Los documentos US 2012/0009642 y US 2012/0009626 se refieren a un método de producción de disolución de sacárido que usa un material de biomasa y un método de producción de alcohol que implica un sistema de descomposición hidrotérmica pero no produce arabinoxilano feruloilado.
El documento de AGUEDO, et al.,(“Extraction by three processes of arabinoxylans from wheat bran and characterization of the Tactions obtained”, Carbohydrate Polymers 2014;105:317-324.) se refiere a la extracción
de arabinoxilanos a partir del salvado de trigo usando tres métodos diferentes, los tres realizan un tratamiento hidrotérmico después de un tratamiento enzimático con endoxilanasa que da como resultado bajos rendimientos de arabinoxilanos feruloilados extraídos a partir de fracciones solubles y sin arabinoxilanos feruloilados de extracción a partir de los residuos insolubles obtenidos del tratamiento hidrotérmico.
El documento US 2005/0089602 se refiere a un proceso para fraccionamiento de fracciones a partir de salvados de cereal, un proceso de dos etapas que no implica extracción con agua caliente a presión, pero en el que el salvado se somete primero a una combinación de tratamiento enzimático y molienda en húmedo seguido de centrifugación secuencial y ultrafiltración para obtener, entre otras cosas, una fase insoluble. Por lo tanto, no se extraen arabinoxilanos feruloilados a partir de residuos insolubles.
Sumario de la presente invención
Las hemicelulosas en productos secundarios de cereal representan un valioso recurso renovable que aún no se ha explotado a plena capacidad.
La presente invención describe por primera vez un enfoque sostenible y escalable para extraer y aislar fracciones de hemicelulosa valiosas en la fase acuosa, especialmente arabinoxilanos feruloilados (F-AX), a partir de productos secundarios de cereal que comprende exponer cultivos de cereal a una o más extracciones con agua caliente a presión (PHWE) en combinación con uno o más tratamientos enzimáticos posteriores del residuo de extracción que comprende una endo-beta-xilanasa y una feruloil esterasa. Pueden añadirse uno o más tratamiento previos enzimáticos opcionales antes de la(s) extracción/extracciones con agua caliente a presión, por ejemplo, si el producto secundario de cereal contiene grandes cantidades de almidón (productos secundarios de cereal no desalmidonados) y/o grasa. Este proceso permite el fraccionamiento selectivo de arabinoxilanos basándose en su estructura molecular y funcionalidades inherentes, que puede usarse para la preparación de materiales basados en carbohidratos con propiedades funcionales y/o productos alimenticios.
En otra realización, la presente invención describe por primera vez un enfoque sostenible y escalable para extraer y aislar fracciones valiosas de hemicelulosa en la fase acuosa, especialmente arabinoxilanos feruloilados (AX), a partir de productos secundarios de cereal que comprende exponer cultivos de cereal a una o más extracciones con agua caliente a presión (PHWE) en combinación con una o más etapas de ultrafiltración por membrana posterior para purificar adicionalmente los extractos y fraccionarlos para dar una fracción polimérica y oligomérica. Pueden añadirse uno o más tratamientos previos enzimáticos opcionales antes de la(s) extracción/extracciones con agua caliente a presión, por ejemplo, si el producto secundario de cereal contiene grandes cantidades de almidón (productos secundarios de cereal no desalmidonados) y/o grasa. Este proceso permite el fraccionamiento selectivo de arabinoxilanos basándose en su estructura molecular y funcionalidades inherentes, que puede usarse para la preparación de materiales basados en carbohidratos con propiedades funcionales y/o productos alimenticios.
En una realización preferida actualmente, la invención se refiere a un enfoque sostenible y escalable para extraer y aislar fracciones de hemicelulosa valiosas en la fase acuosa, especialmente arabinoxilanos feruloilados (AX), a partir de productos secundarios de cereal que comprende exponer cultivos de cereal a una o más extracciones con agua caliente a presión (PHWE) en combinación con uno o más tratamientos enzimáticos posteriores del residuo de extracción con una endo-beta-xilanasa y una feruloil esterasa en combinación con una o más etapas de ultrafiltración por membrana posterior para purificar adicionalmente los extractos. De nuevo, pueden añadirse uno o más tratamiento previos enzimáticos opcionales antes de la(s) extracción/extracciones con agua caliente a presión, si el producto secundario de cereal, por ejemplo, contiene grandes cantidades de almidón (productos secundarios de cereal no desalmidonados) y/o grasa.
La presente invención se refiere a un proceso para producir una fracción de hemicelulosa a partir de un cultivo de cereal, tal como a partir de un producto secundario de cereal, que comprende someter dicho cultivo de cereal a extracción con agua caliente a presión y tratamiento(s) enzimático(s). La extracción con agua caliente a presión (hidrotérmica) puede realizarse en dos etapas, en la que la etapa a) comprende una extracción con agua caliente a presión y la etapa b) comprende un tratamiento enzimático posterior de la fracción residual (no extraída). El proceso de extracción con agua caliente a presión (hidrotérmica) se realiza típicamente a una temperatura entre 140-160 °C a un pH entre pH 5-7 a escala industrial.
En una realización, la extracción con agua caliente a presión (hidrotérmica) en la etapa a) se realiza a 160 °C a pH 7.
El tratamiento enzimático puede comprender enzimas con actividad de polisacárido. Típicamente, diferentes fracciones de polisacáridos se aíslan unas con respecto a otras durante el proceso descrito en el presente documento, conduciendo en una realización al aislamiento de arabinoxilanos de alta masa molar (AX) y oligosacáridos de arabinoxilano de baja masa molar (AXO).
Típicamente, enzimas usadas en la etapa de tratamiento enzimático de la fracción residual (no extraída) se
seleccionan del grupo que comprende glucanasas, por ejemplo, liquenasas, celulasas, xilanasas e hidrolasas, por ejemplo, esterasas. En particular, endo p-xilanasa y/o feruloil esterasa son enzimas usadas para el tratamiento enzimático de la fracción residual (no extraída).
En una realización, el proceso incluye un procedimiento de fraccionamiento por ultrafiltración por membrana para separar los arabinoxilanos de alta masa molar por encima de 30.000 g mol-1, tal como entre 30.000-50.000, 30.000 100.000, 10.000-500.000 g mol-1, o al menos alrededor de 100.000 - 200.000 g mol-1) de los oligosacáridos de arabinoxilano de baja masa molar (AXO).
El proceso combina extracción con agua caliente a presión (PHWE), tratamiento(s) enzimático(s), y ultrafiltración/ultrafiltraciones de membrana alternativa(s) para aislar fracciones de AX a partir de salvado de trigo con alta pureza y estructura molecular bien definida. En una realización, el proceso comprende implementar ultrafiltración por membrana para purificar adicionalmente los extractos. Los extractos pueden fraccionarse en una fracción de alta masa molar, que contiene principalmente arabinoxilano feruloilado polimérico (F-AX), y una fracción de baja masa molar, que contiene principalmente xilo-oligosacáridos que contienen arabinosa (AXO). Las fracciones aisladas de alta masa molar y baja masa molar exhiben propiedades antioxidantes significativas en términos de actividad de captación de radicales, en comparación con AX a partir de endospermo de trigo y los extractos alcalinos. Esta actividad antioxidante puede atribuirse a la presencia de ácido ferúlico unido covalentemente a las moléculas de AX.
Además de esto, el proceso puede comprender diferentes tratamientos enzimáticos para liberar adicionalmente AX a partir del residuo no extraíble. En particular, una acción combinada de una endo p-xilanasa y una feruloil esterasa es capaz de producir cantidades adicionales de oligosacáridos de F-AX valiosos. El rendimiento total combinado del diseño del proceso integrado es más alto que el rendimiento obtenido solo por extracción alcalina. La composición molecular de las diferentes fracciones poliméricas y oligoméricas se ha caracterizado en detalle. Este conocimiento proporciona la prueba de concepto para un posible aumento de escala del proceso de extracción y fraccionamiento. Además, el proceso permite aislar con éxito una amplia gama de fracciones con estructuras moleculares bien definidas a partir de cereales, por ejemplo, a partir de salvado de trigo. Estas fracciones pueden aprovecharse para la preparación de películas y geles con actividad multifuncional, por ejemplo, combinando la barrera inherente y las propiedades reológicas con la capacidad antioxidante potencial. Estos materiales pueden usarse en una amplia gama de aplicaciones, desde películas de envasado activo a estabilizantes alimentarios.
En una realización preferida actualmente, los arabinoxilanos aislados (AX) están predominantemente feruloilados.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un proceso para aislar arabinoxilanos feruloilados (AX) a partir de un cultivo de cereal, tal como a partir de un producto secundario de cereal, que comprende someter dicho cultivo de cereal a extracción con agua caliente a presión y tratamiento enzimático de la fracción residual (no extraída) con una endo-beta-xilanasa y una feruloil esterasa. En dicho proceso, los arabinoxilanos aislados (AX) se fraccionan selectivamente basándose en su estructura molecular y funcionalidades inherentes.
Típicamente, el cultivo de cereal usado en un proceso según la presente invención se selecciona del grupo que consiste en salvado de trigo, grano de trigo, harina de trigo, paja de trigo, grano de cebada, grano agotado de destilería, harina de cebada, paja de cebada, grano de centeno, harina de centeno, salvado de centeno, paja de centeno, grano de avena, arroz, maíz, salvado de maíz, salvado de arroz, paja de maíz, cáscara de maíz, rastrojo de maíz y salvado de avena.
La presente invención también se refiere a arabinoxilanos feruloilados (AX) producidos por un proceso según la presente invención como tal y al uso de dichos arabinoxilanos feruloilados (AX) para la preparación de materiales basados en carbohidratos con propiedades funcionales, seleccionados del grupo que consiste en películas, hidrogeles, envasado de alimentos activo, prebióticos, compuestos bioactivos y agentes texturizantes.
Por consiguiente, la presente invención también se refiere a materiales basados en carbohidratos con propiedades funcionales, seleccionados del grupo que consiste en películas, hidrogeles, envasado de alimentos activo, prebióticos, compuestos bioactivos y agentes texturizantes que comprenden arabinoxilanos feruloilados (AX) producidos y/o producibles por el proceso según la presente invención.
Leyendas de las figuras
Figura 1: Estructura molecular de arabinoxilanos de cereal. Figura 1a: Los compuestos secundarios de arabinosa pueden sustituirse adicionalmente por enlaces de éster en la posición C5 por compuestos fenólicos, principalmente ácido ferúlico (FerA). Figura 1b: arabinoxilanos extraíbles con agua (WE-AX) y no extraíbles con agua (WU-AX).
Figura 2: Diagrama de flujo de los tratamientos de extracción y fracciones obtenidas de los mismos a partir de salvado de trigo. Fracciones: wbf (grano fino de salvado de trigo), wbm (grano medio de salvado de trigo), Dwbf (grano fino de salvado de trigo desalmidonado y desgrasado), Dwbm (grano medio de salvado de trigo desalmidonado y desgrasado), NE/Rwb (extracto de NaOH y residuo a partir de Dwbf), CE/Rwb (extracto de
Ca(OH)2 y residuo a partir de Dwbf), HE/Rwb-120 (extracto y residuo de extracción hidrotérmica a 120 °C pH 5), HE/Rwb-140 (extracto y residuo de extracción hidrotérmica a 140 °C pH 5), HE/Rwb-160-5 (extracto y residuo de extracción hidrotérmica a 160 °C pH 5), HE/Rwb-160-7 (extracto y residuo de extracción hidrotérmica a 160 °C pH 7), HE/Rwb-160-9 (extracto y residuo de extracción hidrotérmica a 160 °C pH 9). Imágenes: Material en bruto de salvado de trigo y desalmidonado: (A) wbf, (B) wbm, (C) Dwbf, (D) Dwbm. Extracción alcalina: (A) wbf, (B) Dwbf, (C) NEwb, (D) CEwb; Extracción hidrotérmica: (A) wbf, (B) Dwbf, (C) HEwb-120, (D) HEwb-140, (E) HEwb-160-5, (F) HEwb-160-7, (G) HEwb-160-9.
Figura 3: Evolución temporal de los extractos después del tratamiento hidrotérmico durante 5, 10 y 15 minutos: Contenido de AX (en % de carbohidrato total), Contenido de Glc (en % de carbohidrato total), Relación de A/X.
Figura 4: Distribuciones de masa molar y masas molares promedio de salvado de trigo a partir de extractos alcalinos (NEwb y CEwb) e hidrotérmicos (HEwb-120, HEwb-140, Hewb-160-5, HEwb-160-7 y HE-160-9).
Figura 5: Flujos de material propuesto y la producción de arabinoxilano a partir de una planta de proceso de trigo sueca para la producción de almidón y bioetanol (Lantmanen Reppe AB).
Figura 6: Estructura molecular de arabinoxilanos de cereal.
(a) Patrón de sustitución intramolecular en arabinoxilanos:
(i) unidad de Xylp no sustituida;
(ii) arabinoxilano monosustituido con u-1,2-Araf;
(iii) arabinoxilano sustituido con u-1,2-GlcA;
(iv) arabinoxilano disustituido con u-1,2- y u-1,3-Araf;
(v) arabinoxilano sustituido con u-1,2-4-O-metilGlcA;
(vi) arabinoxilano con ácido ferúlico acoplado a un sustituto de Araf.
(b) Plataforma bioanalítica integrada para el análisis estructural de fracciones de AX en los diferentes niveles jerárquicos.
Figura 7: Diseño de un bioproceso integrado para la extracción y fraccionamiento de biomoléculas a partir de salvado de trigo. Fracciones: wbf (grano fino de salvado de trigo), Dwbf (grano fino de salvado de trigo desalmidonado y desgrasado), HE (extracto de extracción con agua caliente a presión), HR (residuo de extracción con agua caliente a presión), HE-H (fracción de alta masa molar, material retenido después de filtración por membrana), HE-L (fracción de baja masa molar, eluyente después de filtración por membrana); EZ (fracción después de tratamiento enzimático del residuo), EZ+HE (fracción después de tratamiento enzimático del residuo y posterior extracción con agua caliente a presión).
Figura 8: Comparación de extracción con agua caliente a presión (PHW) y alcalina: (a) rendimientos gravimétricos g_1 (en % de Dw de Dwbf); (b) contenido de AX (en mg g_1 de DW) determinado después de hidrólisis ácida (hidrólisis de TFA para los extractos, hidrólisisH2so4 para los residuos): extractos E (blanco), residuos R (negro) y oscuro; contenido de ácido ferúlico (en mg g_1 de DW) en los extractos E (blanco) y los residuos R (negro).
Figura 9. Efecto de ultrafiltración por membrana sobre las distribuciones de masa molar de los extractos: extracto original después de la extracción con líquido a presión a 160 °C y pH 7 (HE-160-7, línea completa); fracción de polisacárido retenido con alta masa molar después de la ultrafiltración por membrana (HE-160-7-H, línea discontinua); fracción de oligosacárido eluido con baja masa molar después de la ultrafiltración por membrana (HE-160-7-L, línea de puntos);
Figura 10. Actividad enzimática de enzimas que actúan sobre xilano seleccionadas sobre el residuo después de PHWE (HR-160-7). FE: feruloil esterasa; X: endo 3-xilanasa; X+FE: acción combinada de feruloil esterasa y xilanasa. (a) Azúcares reductores liberados mediante ensayo de DNS; (b) obtención de perfil de masa oligomérica por ESI-MS. Asignación de los oligosacáridos. P: pentosa (Xylp o Araf); FA: ácido ferúlico; H: hexosa (Glc).
Figura 11. Efecto de una posterior extracción hidrotérmica a presión sobre el residuo (HR-160-7) después del tratamiento enzimático usando enzimas que actúan sobre xilano seleccionadas: FE: feruloil esterasa; X: endo 3-xilanasa; X+FE: acción combinada de feruloil esterasa y xilanasa. (a) Rendimientos de extracción (en % en peso seco del residuo): tratamiento enzimático solo (EZ, en blanco), tratamiento enzimático combinado y posterior extracción de PHW (EZ+PHWE, en negro); (b) composición de AX (en mg g_1 en peso seco) de los extractos después del tratamiento enzimático combinado del residuo y posterior extracción con pPHW (EZ+PHWE).
Figura 12. Actividad de captación medida usando la prueba de DPHP: control (DPHP); ácido ascórbico; ácido ferúlico, WE-AX (AX de endospermo, estándar de Megazyme); NE-AX (AX extraídos con NaOH); HE-160-7-H (fracción de polisacárido de alta masa molar a partir de extracto de PHW a 160 °C pH 7); HE-160-7-L (fracción de oligosacárido de baja masa molar a partir de extracto de PHW a 160 °C pH 7).
Descripción detallada de la invención
Las hemicelulosas constituyen una fracción rica en polisacáridos de pared celular en granos de cereal como polisacáridos sin almidón. La producción de cereal genera altos volúmenes de productos secundarios hemicelulósicos, que representan un valioso recurso renovable que aún no se ha explotado por completo a su plena capacidad. Por ejemplo, las plantas de producción de trigo (Lantmannen Reppe AB) tienen un flujo potencial de 1400 t/año de hemicelulosas que comprenden principalmente arabinoxilanos (AX) a partir de salvado de trigo. La presente invención valoriza las fracciones de polisacáridos así como de oligosacáridos a partir de salvado de trigo para producir materiales basados en carbohidratos (películas e hidrogeles) y aditivos con alto valor añadido en aplicaciones como agentes texturizantes y envasado de alimentos activo. Se aíslan diferentes fracciones de AX a partir de salvado de trigo, usando procesos quimioenzimáticos y cromatográficos escalables. Las estructuras a nivel molecular de las fracciones de AX aisladas se caracterizan usando enfoques analíticos avanzados. Los AX extraídos se modifican quimioenzimáticamente para adaptar sus estructuras a nivel macromolecular en términos de masa molar y patrón de sustitución. Esto permite lograr propiedades macroscópicas deseables (propiedades mecánicas, de barrera y reológicas) y sus funcionalidades como antioxidantes y absorbentes de UV en las películas e hidrogeles basados en AX. Estas nuevas películas e hidrogeles son capaces de reemplazar polímeros basados en petróleo e introducir nuevas funcionalidades en aplicaciones como envasado de alimentos activo y agentes texturizantes en productos cosméticos, adhesivos y aglutinantes. En una realización, se obtienen nuevos materiales basados en carbohidratos a partir de salvado de trigo usando enfoques bioquímicos “verdes”, que ofrecen nuevas funcionalidades y aplicaciones a estos productos secundarios de cereal con alto valor económico y medioambiental.
En Suecia, la producción total de cereal durante 2012 fue de 5,06 millones de toneladas, representando el trigo el 45 % de la producción, la cebada el 33 % y el resto es avena y centeno3. El trigo se usa ampliamente para diferentes aplicaciones alimentarias e industriales, tal como harina, almidón y bioetanol. Los productos secundarios generados (por ejemplo, salvado) todavía se consideran grados de valor bajo y se venden como piensos para animales con un valor de mercado consistente vinculado al de la harina de trigo. Por lo tanto, la valorización de tales productos secundarios agrícolas para aplicaciones materiales es fundamental para una implementación completa de las biorrefinerias de primera generación que manejan flujos residuales de granos de cereal.
La presente invención da a conocer diferentes procedimientos de extracción escalables para el aislamiento de fracciones ricas en AX a partir de cultivos de cereal, tales como productos secundarios de cereal, por ejemplo, salvado de trigo.
La extracción con agua caliente a presión se implementa en una realización a altas temperaturas para extraer AX poliméricos así como oligoméricos con funcionalidades ferúlicas intactas. Se optimizan diferentes condiciones de temperatura y pH para lograr altos rendimientos de material. Además, en comparación con la extracción alcalina convencional con hidróxido de sodio (NaOH) e hidróxido de calcio (Ca(OH)2), el procedimiento de extracción con líquido a presión descrito en el presente documento es superior en términos de rendimientos y composición global de los extractos y los residuos. Se emplean diferentes enzimas activas con respecto a carbohidratos (CAZymes) en combinación con la extracción con agua caliente a presión para aumentar los rendimientos de hemicelulosas extraídas y aislar poblaciones de polisacáridos específicos en función de su estructura molecular.
Las estructuras moleculares de las fracciones aisladas a partir de salvado de trigo se caracterizan en detalle utilizando enfoques glucómicos avanzados desarrollados para diferentes hemicelulosas de madera y cereal. La composición de carbohidratos (incluyendo la relación de Ara/Xyl de las poblaciones de AX) y el contenido de compuestos fenólicos (FerA) se analizan en las fracciones aisladas. El enlace intramolecular y el patrón de sustitución se monitorizan adicionalmente usando hidrólisis enzimática, cromatografía y espectrometría de masas. Finalmente, la arquitectura macromolecular se analiza mediante cromatografía de exclusión por tamaño de detección múltiple para proporcionar distribuciones de peso molecular significativas e información sobre la conformación hidrodinámica en disolución. Esta caracterización molecular detallada permite una comprensión profunda del proceso de extracción con agua caliente a presión y las posibilidades de las fracciones de hemicelulosa para futuras aplicaciones materiales.
El tratamiento hidrotérmico ofrece rendimientos de extracción comparables a la extracción alcalina convencional preservando los restos feruloilados en la cadena principal de AX. Además de esto, la composición de extracto puede controlarse a lo largo del tiempo durante el tratamiento con agua caliente a presión, lo que ofrece una indicación de la capacidad de extracción de los diferentes componentes de polisacárido, por ejemplo, en salvado de trigo, basándose en su estructura molecular. Curiosamente, los residuos hidrotérmicos contienen cantidades significativas de AX no extraíbles en agua con alto contenido de ácido ferúlico (AX feruloilados), que se asigna a
un material altamente reticulado. Se emplean diferentes tratamientos enzimáticos para liberar dicho material reticulado del residuo insoluble para dar una forma extraída en agua, lo que constituye una fracción valiosa con funcionalidades interesantes.
En el presente contexto, el término “AX con alto contenido de ácido ferúlico (AX feruloilados)” se emplea para describir una fracción de AX aislada con un contenido de ácido ferúlico de 4 mg g-1 (4 mg/g) tal como de un 0,4 %, 0,5, 0,6, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 5, 10 % o superior, unido covalentemente a la estructura de polisacárido.
El proceso de producción dado a conocer actualmente permite la valorización de productos secundarios de cereal para dar materiales basados en carbohidratos usando enfoques bioquímicos “verdes”. En particular, arabinoxilanos feruloilados (AX) se extraen y fraccionan, por ejemplo, a partir de salvado de trigo, usando procesos escalables, se caracterizan estructuralmente por enfoques bioanalíticos avanzados. Estas fracciones de hemicelulosa pueden modificarse quimioenzimáticamente para adaptar sus propiedades para el diseño de películas e hidrogeles con alto valor añadido en aplicaciones como agentes texturizantes y envasado de alimentos activo, respectivamente. Estos nuevos materiales en sí proporcionan funcionalidades valiosas adicionales como antioxidantes y absorbentes de UV. Las propiedades macroscópicas (propiedades mecánicas, de barrera y reológicas) de estos nuevos materiales de base biológica son comparables e incluso mejores que los polímeros de base fósil existentes. Los nuevos materiales basados en AX pueden reemplazar fácilmente los productos basados en petróleo en una gran cantidad de aplicaciones.
El proceso de producción descrito en el presente documento proporciona una plataforma tecnológica basada en el conocimiento para la valorización de productos secundarios de cereal en nuevos materiales basados en carbohidratos con propiedades adaptadas usando enfoques bioquímicos “verdes”. Estos materiales novedosos tienen un gran potencial en aplicaciones de alto valor como envasado de película activo y agentes texturizantes en diversas industrias (productos cosméticos, aglutinantes de pintura, adhesivos). La valorización de diferentes productos secundarios constituye una tarea fundamental para alcanzar un proceso de biorrefinería eficaz con una generación de residuos cercana a cero.
Además, el proceso también ofrece un medio para obtener conocimiento valioso sobre la estructura molecular de las fracciones de polisacárido a partir de trigo, lo que en sí mismo contribuye a una mejor comprensión de la estructura general del cereal y cómo optimizar procesos biotecnológicos existentes con menores costes de producción.
Se obtienen nuevos productos que comprenden fracciones de polisacáridos residuales que tradicionalmente no se han usado de manera óptima, expandiendo su rango de aplicabilidad. Se prevén materiales basados en carbohidratos novedosos con alto valor añadido, que son capaces de sustituir materiales basados en petroquímicos tradicionales. El potencial de estos materiales se basa en las propiedades inherentes de los polisacáridos constituyentes (resistencia mecánica, capacidad de formación de gel, bioactividad), sus funcionalidades adicionales como antioxidantes y absorbentes de UV, y su sostenibilidad. Lo que es más, los materiales basados en AX obtenidos por el proceso de producción dado a conocer en el presente documento surgen de recursos renovables, pueden procesarse usando tecnología limpia, y no presentan efectos nocivos durante todo su ciclo de vida, contribuyendo a un desarrollo sostenible y mitigando los efectos del cambio climático.
En la sección experimental, se evalúan diferentes procedimientos de extracción industrialmente escalables para el aislamiento de fracciones ricas en arabinoxilano (AX) a partir de salvado de trigo. La extracción alcalina convencional con hidróxido de sodio e hidróxido de calcio se comparó con la extracción hidrotérmica con agua caliente a presión en términos de rendimientos y composición global de los extractos y los residuos. Se evaluaron diferentes condiciones experimentales, incluyendo la temperatura, el pH y el tiempo para la extracción hidrotérmica. Se evaluó la composición general de dos materias primas de salvado de trigo con granulometría fina y media indicando un alto contenido de arabinoxilano. Sin embargo, el contenido de carbohidratos y la composición de AX fueron diferentes en las dos materias primas. La extracción alcalina con NaOH ofrece altos rendimientos de AX poliméricos con alta masa molar; sin embargo, los altos valores de pH causaron la escisión de las funcionalidades de ácido fenólico de las fracciones de AX. El tratamiento hidrotérmico a 160 °C ofreció rendimientos de extracción de AX comparables con masas molares algo más pequeñas que los extractos alcalinos.
El proceso propuesto se escala fácilmente utilizando un recipiente a presión con el volumen deseado (30-200 l) capaz de manejar la presión del agua subcrítica a la temperatura de extracción (véase la tabla 1). Por ejemplo, para la temperatura de extracción propuesta de 160 °C, un recipiente a presión a 10 bar ofrece las condiciones para la extracción con agua caliente a presión a gran escala. El fraccionamiento de los extractos para dar una fracción de polisacárido de alta masa molar y una fracción de oligosacárido de baja masa molar puede aumentarse de escala usando ultrafiltración por membrana convencional con el mismo corte de membrana que el usado en el experimento 2.
Tabla 1.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un proceso para producir una fracción de hemicelulosa a partir de un cultivo de cereal, tal como a partir de un producto secundario de cereal, que comprende someter dicho cultivo de cereal a extracción con agua caliente a presión y tratamiento enzimático a una temperatura de entre 140-160°C, tal como entre 140-150, 145-155, o 150-160 °C, o de al menos 140, 150, 155, 156, 157, 158, 159 o 160 °C, a un pH entre pH 5-7,5, tal como entre pH 5-5,5, 5-6, 6-6,5 o 6,5-7,0, o a un pH de al menos 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 o 7,5.
En una realización, la extracción con agua caliente a presión (hidrotérmica) en la etapa a) se realiza a una temperatura de como máximo 160 °C a un pH de como máximo pH 7,0.
En otra realización, la extracción con agua caliente a presión (hidrotérmica) en la etapa a) se realiza a una temperatura de al menos 158 °C, tal como al menos 159 o 160 °C a un pH de al menos pH 6,7, tal como al menos pH 6,8, 6,9 o 7,0.
La evolución de la composición de extracto durante el tratamiento con agua caliente a presión ofrece una indicación de la capacidad de extracción de los diferentes componentes de polisacárido en el salvado de trigo basándose en su estructura molecular. Curiosamente, los residuos hidrotérmicos contenían cantidades significativas de AX no extraíbles con agua con alto contenido de ácido ferúlico (AX feruloilados) que constituyen una fracción valiosa con funcionalidades interesantes. Se implementan tratamientos enzimáticos adicionales para aislar tales fracciones de AX feruloilados a partir de los residuos no extraíbles con agua. Todas las fracciones extraídas contienen cantidades significativas de impurezas de menor masa molar y poblaciones de glucanos (probablemente p-glucanos). Por lo tanto, los tratamientos de purificación por ultrafiltración por membrana e hidrólisis enzimática pueden implementarse cuando sea necesario para lograr fracciones de AX extraídas con mayor pureza. En conclusión, puede obtenerse una amplia gama de fracciones de AX con alta pureza y estructura molecular bien definida para la preparación de materiales basados en AX funcionales.
Arabinoxilano (AX)
Arabinoxilano (AX) es la hemicelulosa más abundante en cereales como parte del grano y la paja. AX, como otras hemicelulosas vegetales, posee una estructura molecular muy compleja en términos de las posibilidades prácticamente infinitas para los patrones de sustitución a lo largo de la cadena principal de azúcar, y su (poli)dispersidad en términos de distribuciones de masa molar. Esta estructura heterogénea varía no solo de una especie de cereal a otra, sino también en los diferentes tejidos (figura 2a). Los AX de cereal consisten en una cadena principal de unidades de 1,4-p-D-xilopiranosa (Xylp), que están sustituidas principalmente por unidades de arabinofuranosilo (Araf) en las posiciones a-1,2 y/o a-1,3 en diferentes grados y distribuciones intramoleculares, dependiendo de la fuente biológica y el tejido56. Las unidades de Xylp pueden estar sustituidas en menor medida por ácido 1,2-a-D-glucurónico, o bien no sustituidas (GlcA) o bien metiladas en la posición C4 (4-O-Me-GlcA)7. Finalmente, los compuestos secundarios de arabinosa pueden sustituirse adicionalmente por enlaces de éster en la posición C5 por compuestos fenólicos, principalmente ácido ferúlico; estos compuestos fenólicos pueden dimerizarse con otros restos de ácido ferúlico en otras moléculas de arabinoxilano, creando una estructura covalente reticulada compleja en algunos tejidos8. Esta heterogeneidad molecular tiene un gran impacto en la capacidad de extracción de estas hemicelulosas durante los procesos industriales y en sus propiedades macroscópicas (por ejemplo, propiedades de solubilidad, reológicas, formación de película y mecánicas), que son fundamentales para sus aplicaciones materiales.
Desde un punto de vista tecnológico, los arabinoxilanos a partir de diferentes cereales y tejidos se han clasificado tradicionalmente en arabinoxilanos extraíbles con agua (WE-AX) y arabinoxilanos no extraíbles con agua (WU-AX), dependiendo de su potencial capacidad de extracción acuosa a temperatura ambiente. De nuevo, el contenido de cada fracción de arabinoxilano y su estructura macromolecular depende ampliamente de la fuente de cereal y el tejido. Existe una amplia variabilidad en la bibliografía sobre la disponibilidad y composición de cada fracción de arabinoxilano en cada cereal y tejido (tabla 1). Como regla general, los WE-AX están presentes principalmente en el endospermo de cereal y están moderadamente sustituidos con arabinosa. Por el contrario, los WU-AX son predominantes en el salvado de cereal, representando aproximadamente el 95 % del contenido total de AX estimado. Los WU-AX muestran una gran heterogeneidad en su estructura910, con fracciones que contienen patrones de sustitución de Araf muy divergentes y además decoradas con GlcA y ácido ferúlico, que contribuyen a la reticulación con otras moléculas de arabinoxilano y otros componentes de pared celular. Este proyecto
abordará estos desafíos implementando procedimientos de extracción fisicoquímicos y enzimáticos integrados para maximizar el rendimiento de WU-AX extraídos a partir de salvado de trigo y desarrollando una plataforma analítica para la caracterización detallada de la estructura molecular de tales fracciones de AX extraídas.
Los xilanos de madera y cereal han mostrado un gran potencial para la producción de películas biopoliméricas para aplicaciones de envasado. Ya se han realizado varios esfuerzos para la aplicación de los AX de cereal como películas de envasado11-16. Estos estudios han usado principalmente fracciones comerciales de arabinoxilano soluble en agua refinado (WE-AX) con grado moderado de sustitución de Araf, para preparar películas, con y sin la adición de plastificantes, mostrando buenas propiedades de barrera al oxígeno pero limitada sensibilidad al agua y propiedades mecánicas17. Las películas de AX también se han reforzado con nanoestructuras de celulosa para mejorar sus propiedades mecánicas18-20.
Además, los AX tienen propiedades reológicas muy interesantes y pueden formar geles fuertes bajo la acción de determinados agentes oxidantes, con olor neutro y alta estabilidad8. Hasta este punto, hay cuatro patentes para la explotación de hemicelulosas de madera y cereal como películas con propiedades de barrera al oxígeno y a la humedad21-24, pero en todos los casos dependen de la modificación química y de la introducción de aditivos externos. Hay disponibles diferentes métodos para la extracción y producción de oligosacáridos de AX a partir de salvado de cereal para usarse como ingredientes alimenticios (por ejemplo2526). Sin embargo, todavía no hay disponible ninguna técnica sobre el fraccionamiento de arabinoxilanos de alta masa molar a partir de salvado de trigo y su aplicación para películas y agentes texturizantes como componentes principales.
La presente invención permite por primera vez la producción de diferentes fracciones de AX aisladas a partir de salvado de trigo y su uso para la preparación de películas e hidrogeles con estructura molecular adaptada, seleccionando como objetivo su aplicación como envasado de alimentos activo y agentes texturizantes. Estos agentes texturizantes pueden encontrar amplias aplicaciones como reemplazo de geles acrílicos como aglutinantes en adhesivos y recubrimientos, o como agentes espesantes en formulaciones cosméticas. No solo se obtienen y evalúan en el presente documento las funcionalidades de Araf sino también de GlcA y ácido ferúlico en las fracciones de AX. Las sustituciones de Araf y GlcA influyen en las propiedades de formación de película, barrera y reológicas de las fracciones de AX, que pueden adaptarse para la preparación de películas e hidrogeles. Además, los grupos de ácido urónico y ferúlico pueden usarse para reticulación química y enzimática adicional, que puede aumentar las propiedades mecánicas y reológicas de los materiales. Finalmente, los restos de ácido ferúlico pueden introducir propiedades antioxidantes y absorbentes de UV, lo que proporcionará un valor alto a los productos de gel texturizantes y película de envasado.
Tabla 2. Composición y cantidades relativas (en % en peso seco) de AX y p-glucanos en diferentes tejidos de cereal.
El contenido de WU-AX puede estimarse como la diferencia entre el contenido de AX total y los WE-AX.
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Experimentos
Experimento 1
Objetivo del proyecto
El objetivo general del proyecto es la valorización de arabinoxilanos a partir de salvado de trigo para dar materiales basados en carbohidratos usando enfoques bioquímicos “verdes”. Arabinoxilanos a partir de salvado de trigo se extraen y fraccionan usando procesos escalables y las fracciones ricas en AX se caracterizan estructuralmente por enfoques bioanalíticos. Estas fracciones se usan para el diseño de películas e hidrogeles con alto valor añadido en aplicaciones como agentes texturizantes y envasado de alimentos activo, respectivamente. Estos nuevos materiales basados en AX pueden proporcionar funcionalidades valiosas adicionales como antioxidantes y absorbentes de UV.
Hipótesis
La extracción alcalina convencional es el procedimiento estándar para aislar arabinoxilanos a partir de flujos de cereales. Sin embargo, se sabe que altos valores de pH durante la extracción alteran la estructura molecular de las fracciones y retiran parte de los compuestos secundarios de los extractos de AX, que son valiosos para sus otras aplicaciones materiales. La extracción hidrotérmica con agua caliente a presión constituye un procedimiento de extracción más suave para hemicelulosas a partir de biomasa, preservando de ese modo las estructuras moleculares nativas de las poblaciones poliméricas. Se comparan la eficiencia (rendimiento) y la composición de las fracciones de AX extraídas a partir de salvado de trigo mediante extracciones alcalinas e hidrotérmicas y se evalúan diferentes condiciones experimentales (pH, temperatura, tiempo) para las últimas.
3. Materiales y métodos.
3.1 Materiales
El salvado de trigo se proporcionó por Lantmannen con dos tamaños de partícula diferentes: granulometría fina (wbf) y media (wbm) (figura 2). Todos los productos químicos, los patrones analíticos y reactivos fueron de Sigma-Aldrich. a-amilasa pancreática porcina se adquirió de Sigma-Aldrich. El reactivo fenol Pholin Ciocalcast fue de Merck. Se adquirieron membrana de diálisis Spectra/Por 1 y 3, MWCO de 6-8 kD y 3,5 kDa de SpectrumLabs.
3.2 Protocolos de extracción
Los procedimientos de extracción combinados y los diferentes materiales y fracciones obtenidos se resumen en la figura 2.
3.2.1 Desgrasado y contenido de grasa total
Las muestras wbf y wbm se desgrasaron y se determinó su contenido de grasa total según el método de Folch con algunas modificaciones.1 En resumen, se extrajeron 5 g de muestra seca con 50 ml de una mezcla de cloroformo (CHQb) y metanol (MeOH) (2:1, v/v) durante la noche bajo agitación. El extracto se filtró en un filtro de papel plisado, y se lavó con la misma mezcla. El extracto se colocó en un embudo y se añadieron 20 ml de NaCl al 0,58 %, se agitaron y se dejaron reposar. Se recuperó la fase orgánica, se secó bajo un flujo de aire constante a 35°C y se dejó a vacío durante 15 minutos antes de la determinación gravimétrica.
3.2.2 Desalmidonado
El salvado se destiló enzimáticamente con a-amilasa. En resumen, el salvado se suspendió en tampón fosfato 0,01 M con KCl 100 mM (pH 7,5) en una relación de 1:10 (p/v) y se hirvió durante 5 min para gelatinizar los gránulos de almidón. Las muestras se equilibraron a 40 °C y se incubaron con a-amilasa (2 U/mg de carbohidrato) durante 1 h a 40 °C; se realizó una segunda incubación con una dosis completa de a-amilasa durante 30 min más. Los polisacáridos se precipitaron mediante la adición de cuatro volúmenes de etanol absoluto frío a -8 °C durante la noche y se centrifugaron (1500 g, 5 min). Se retiró el sobrenadante, y el precipitado restante se lavó con etanol absoluto frío (3 veces) y agua, centrifugando entre lavados, antes de la liofilización. La retirada de almidón se verificó bajo el microscopio mediante tinción con yodo con yodo al 1 % (p/v), yoduro de potasio al 2 % (p/v). El contenido de almidón total se determinó gravimétricamente antes y después del tratamiento con a-amilasa.
3.2.3 Extracción alcalina
El salvado de trigo fino desgrasado y desalmidonado (Dwbf) se sometió a dos métodos de extracción alcalina diferentes usando o bien NaOH al 0,5 M o bien disolución concentrada de Ca(OH)2 a 80 °C durante 16 h usando una relación de 1:8 (p/v). Los residuos y sobrenadantes recuperados se neutralizaron con la adición de ácido acético y se dializaron contra agua corriente durante 48 h usando una membrana de diálisis de MWCO de 3,5 kDa. Los extractos alcalinos y residuos se concentraron y se liofilizaron, para dar los rendimientos respectivos en relación con el peso seco.
3.2.4 Extracción hidrotérmica mediante agua caliente a presión
La extracción hidrotérmica de Dwbf se realizó mediante agua caliente a presión usando un extractor de disolvente acelerado Dionex™ ASETM 350 de Thermo Scientific™. Se sometieron a prueba tres temperaturas diferentes: 120, 140 y 160 °C a pH 5,0, y pH 7,0 y 9,0 también se sometieron a prueba a 160 °C. Se usó tampón de formiato de sodio 1 M como disolvente y el pH se corrigió mediante la adición de ácido fórmico 1 M, el volumen de disolvente usado para cada extracción fue de 30 ml. Se usó 1 g de Dwbf en cada condición, y las extracciones se realizaron en tres ciclos posteriores de 5 min, dando como resultado 3 extractos y 1 residuo para cada una de las condiciones sometidas a prueba. Para obtener los rendimientos, todos los extractos y residuos se dializaron contra agua corriente con una membrana de MWCO de 6-8 kDa durante 72 h y se liofilizaron.
3.3 Caracterización de las fracciones extraídas
3.3.1 Composición y contenido de monosacáridos
La composición y el contenido de monosacáridos de la materia prima de salvado de trigo y las fracciones posteriores se analizaron mediante hidrólisis ácida seguida de cromatografía de intercambio aniónico de pH alto con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). La hidrólisis sulfúrica se realizó usando las condiciones notificadas originalmente por Saeman.2 En resumen, Se hinchó 1-5 mg de material liofilizado con H2SO4 al 72 % durante 3 h a temperatura ambiente y posteriormente se diluyó en H2SO41 M añadiendo agua Milli-Q. Las muestras se hidrolizaron adicionalmente a 100 °C durante 3 h, se enfriaron y diluyeron hasta un análisis de HPAEC-PAD adicional. La hidrólisis de TFA se realizó con 1-5 mg de material liofilizado con TFA 2 M a 121 °C durante 3 h. Se tomó una alícuota de 100 ul de los hidrolizados, se secó al vacío y se disolvió de nuevo en 1 ml de agua Milli-Q hasta un análisis de HPAEC-PAD adicional.
Los monosacáridos hidrolizados se analizaron por cromatografía de intercambio aniónico de pH alto con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) en un sistema ICS3000 (Dionex, Sunnyvale, CA) usando una columna Dionex CarboPac PA1 mantenida a 30 °C a un caudal de 1 ml min'1. Se emplearon diferentes gradientes para la detección y cuantificación de los monosacáridos neutros y ácidos urónicos.
3.3.2 Composición y contenido fenólico
La composición y el contenido de ácido fenólico se determinaron por saponificación, sililación y GC-MS (de sus siglas en inglés, cromatografía de gases-espectroscopía de masas). Se saponificaron 5 mg de cada muestra (por duplicado) con 300 |il de NaOH 2 M durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se acidificaron después (a pH 3,0) con 55 |il de ácido clorhídrico 12 M y se añadió un compuesto estándar interno (ácido 4-hidroxibenzoico - 5 |ig). Los compuestos fenólicos se extrajeron con 1 ml de acetato de etilo, se secaron con nitrógeno, y después se sililaron con 50 |il de N-O-bis (trimetilsilil acetamida) a 100 °C durante 5 min. Los compuestos fenólicos derivados se suspendieron de nuevo en diclorometano y se inyectaron en una GC-MS3.
3.3.3 Composición y contenido de aminoácidos
Las muestras (10 mg de peso seco) se hidrolizaron con HCl 6 M a 100 °C durante 20 h, con fenol al 1 % (v/v). Las muestras hidrolizadas y liofilizadas se disolvieron en disolución metanólica acuosa (200 |il; 1,5:8,5, v/v) que contenía HCI 0,6 N y 0,1 % de fenol (v/v), se calentaron a 100 °C durante 15 min, y se evaporaron bajo una corriente de N2. El residuo se modificaron con piridina-metanol-anhídrido acético (300 |il, 1:1:4, v/v) a 100 °C durante 60 min, para obtener ésteres metílicos de aminoácidos (aaMA). Los productos se analizaron directamente por GC-MS4.
3.3.4 Composición y contenido de grasa
Los principales ácidos grasos se esterificaron y luego se cuantificaron por GC-MS.4 En resumen, a una alícuota del extracto se añadió 1 ml de TFA 2 M, y la hidrólisis se realizó a 100 °C, durante 8 h. Las muestras hidrolizadas se disolvieron en NH4OH 0,5 N (100 |il), se mantuvieron a temperatura ambiente durante 10-15 min en tubos de hidrólisis reforzados con recipientes de tapa de rosca revestidos con Teflón. Se añadió NaBH4 (1 mg), y la disolución se mantuvo a 100 °C durante 10 min. El producto se secó, se lavó con ácido acético (100 |il) y metanol (X2), y se secó adicionalmente bajo N2 en una campana extractora. El residuo se trató con HCl 0,5 M en MeOH (200 |il) a 100 °C durante 15 min, seguido de evaporación bajo una corriente de N2 suave en una campana extractora, dando lugar a ésteres metílicos de ácidos grasos. La acetilación se realizó en piridina-Ac2O (200 |il; 1:1, v/v), se calentó durante 30 min a 100 °C. Los productos se añadieron a CuSO4 al 2 % ac., y se extrajeron con CHCl3, que se evaporó usando una corriente de N2 y se suspendió de nuevo en acetato de etilo para análisis por GC-MS.
3.3.5 Distribuciones de masa molar por SEC
Las distribuciones de masa molar de los arabinoxilanos extraídos a partir de salvado de trigo se analizaron por
cromatografía de exclusión por tamaño (SECcurity 1260, Polymer Standard Services, Mainz, Alemania) acoplada a un detector de índice de refracción (SECcurity 1260, Polymer Standard Services, Mainz, Alemania) con regulación de temperatura a 45 °C. Las fracciones extraídas se disolvieron directamente en el eluyente de SEC que consistía en dimetilsulfóxido (DMSO, grado de HPLC, Scharlab, Suecia) con 0,5 % p/p de LiBr (ReagentPlus) a 60°C. Las concentraciones se ajustaron entre 0,5 - 2 g l-1 para una señal de detección optimizada. Los análisis de SEC se realizaron con un caudal de 0,5 ml min-1 a 60 °C usando un conjunto de columnas que consistía en una precolumna GRAM, columnas analíticas 30 y 10000 (Polymer Standards Services, Mainz, Alemania). La calibración de la separación por SEC se realizó usando patrones de pululano proporcionados por Polymer Standards Services (PSS, Mainz, Alemania).
4. Resultados
4.1 Salvado de trigo en bruto y tratamientos previos iniciales (desalmidonado y desgrasado)
Los carbohidratos son los componentes principales del salvado, con contenidos que oscilan entre un 40-60 % en diferentes salvados de trigo industriales.56 Las proteínas representan aproximadamente el 15-20 % (DW) de la composición de salvado total56, mientras que el contenido de grasa esperado puede oscilar entre el 3-5 %.16 El ácido fenólico total representa un 1-2 % del salvado total, mientras que la lignina puede aparecer alrededor del 48 %.6 Otros componentes son ácido fítico, que puede representar el 3-6 % del peso seco total78, y contenido de cenizas, que oscila entre un 4-6 %.5,6910 El ácido fítico puede ser un producto químico fino interesante para aislar a partir de salvado de trigo, ya que tiene propiedades antioxidantes. La composición general de los dos materiales de salvado de trigo de partida concuerda bastante bien con los valores notificados de la bibliografía, como puede observarse en la tabla 1. Los ácidos grasos más abundantes en los dos materiales de salvado son el ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, según perfiles similares.167 El ácido ferúlico representa el principal ácido fenólico en el salvado de trigo, con menor contenido de ácido p-cumárico; no se detectaron trazas de ácido siringico en este estudio. El perfil de aminoácidos de los presentes inventores muestra una alta prevalencia de valina y ácido aspártico; este perfil es diferente con respecto a estudios previos, que notifican mayores cantidades de ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, prolina, leucina, serina, y fenilalanina.1112
Tabla 3. Composición general de salvado de trigo en bruto (granulometría fina y media) y material después de tratamientos previos iniciales (desgrasado y desalmidonado)
La composición y contenido de carbohidratos difieren significativamente entre salvado de trigo fino y medio, teniendo este último un mayor contenido global de AX. Los procedimientos de extracción se optimizaron solo para el material fino (wbf), ya que se esperan mayores rendimientos debido a la transferencia de masa mejorada a tamaños de partícula más bajos. Se espera que los tratamiento previos de desgrasado y desalmidonado retiren los componentes de ácido graso y almidón del salvado de trigo, respectivamente. El contenido de Glc disminuyó para la muestra de salvado de trigo fino después del desalmidonado (Dwbf), confirmando la eficiencia de la hidrólisis enzimática. Sorprendentemente, el contenido de Glc sigue siendo muy similar para la muestra de salvado de trigo medio; esto podría indicar que el material se desalmidonó eficazmente antes de la administración. Vale la pena mencionar que el proceso enzimático por a-amilasa puede causar la retirada de algunos compuestos solubles en agua, lo que puede causar una sobreestimación del contenido de almidón medido gravimétricamente.
4.2 lcalinas
La extracción alcalina es el procedimiento estándar para la extracción de hemicelulosas a partir de materia prima de biomasa con rendimientos de bajos a medios. La extracción en NaOH se ha usado ampliamente para la extracción de arabinoxilanos a partir de salvado de trigo.113 Se han propuesto hidróxidos bivalentes tales como Ca(OH)2 y Ba(OH)2 como extractores selectivos para arabinoxilanos.1415 Sin embargo, es bien sabido que las
condiciones de pH alto durante la extracción provocan la modificación de la estructura nativa de los arabinoxilanos. En este caso, la extracción en NaOH y Ca(OH)2 se han seleccionado como métodos de extracción de referencia para fines de comparación. La tabla 2 compara los rendimientos y la composición después de la extracción alcalina de salvado de trigo desalmidonado. Los rendimientos de extracción obtenidos con NaOH están en el mismo intervalo, aunque ligeramente más altos que los notificados en estudios similares (18 - 22 %), evidenciando la efectividad de las condiciones de extracción113. El extracto de NEwb tiene un alto contenido de arabinoxilano, aunque la presencia de glucosa (atribuible al 3-glucano de enlace mixto) es notable. El 3-glucano de enlace mixto más selectivo es notable. La extracción en Ca(OH)2 más selectiva ofreció rendimientos significativamente más bajos en comparación con NaOH pero con mayor pureza de AX. Sin embargo, en ambos casos, se requiere una purificación adicional de los extractos para lograr fracciones de AX puras. El contenido de ácido fenólico de las fracciones de extracto y residuo se reduce en gran medida después de la extracción alcalina, lo que indica que estas funcionalidades valiosas han sido escindidas y liberadas por los altos valores de pH durante la extracción.
Tabla 4. Rendimientos y composición de las fracciones obtenidas de extracción alcalina
4.3 Extracción hidrotérmica
La extracción hidrotérmica se llevó a cabo usando agua caliente a presión a diferentes temperaturas (120 °C, 140 °C, y 160 °C) y condiciones de pH para comparar los efectos sobre el rendimiento y la composición de los extractos y residuos.
Se realizó un estudio preliminar de la evolución de la extracción realizando tres etapas sucesivas de 5 minutos en cada condición (figura 3). La composición de glucano en los extractos es mayor durante cortos tiempos en todas las condiciones, mientras que la composición de AX aumenta progresivamente con el tiempo de extracción. Estos resultados indican la diferente capacidad de extracción de los componentes hemicelulósicos en el salvado de trigo; los glucanos parecen ser más accesibles y más fáciles de solubilizar que AX. Además, la relación de AX también disminuye de manera consistente durante los tiempos de extracción; las poblaciones de AX con relación de A/X alrededor de 0,8-0,9 son más fáciles de extraer que con menor contenido de Ara (A/X 0,6). Esto puede ofrecer información indirecta sobre las asociaciones intermoleculares de los componentes poliméricos en el salvado de trigo.
Las tres etapas de extracción en cada condición se combinaron en una muestra y se realizaron análisis de composición adicionales (tabla 3). Temperaturas de extracción más altas aumentan los rendimientos con respecto a la extracción hidrotérmica, aunque los rendimientos son algo más bajos que los obtenidos de la extracción de
NaOH. Los extractos tienen un alto contenido de AX con marcada presencia de glucanos, con el aumento del contenido de AX con la temperatura. Los residuos todavía tienen un alto contenido de AX, que corresponden con fracciones no solubilizadas que pueden estar altamente reticuladas. Los ácidos fenólicos parecen conservarse después de la extracción hidrotérmica. Vale la pena mencionar el alto contenido de ácido ferúlico en los residuos, lo que sugiere la presencia de fracciones de AX feruloilados que no se han solubilizado por extracción hidrotérmica.
Tabla 5. Rendimientos y composición de las fracciones obtenidas de extracción hidrotérmica.
4.4 Distribuciones de masa molar de los extractos a partir de salvado de trigo
La figura 4 muestra las distribuciones de masa molar de los extractos de salvado de trigo usando diferentes condiciones. En general, puede observarse una fracción de alta masa molar para todos los extractos (105-106 g/mol), con presencia significativa de impurezas de baja masa molar (103-104 g/mol) que podrían atribuirse a proteínas y oligosacáridos. También se notificaron las masas molares promedio (Mw) y el índice de dispersión (D). La extracción alcalina ofrece fracciones de AX con mayor masa molar, de alrededor de 4 x 105 g/mol. Las fracciones de AX extraídas a partir del tratamiento hidrotérmico tienen una masa molar ligeramente menor que sus homólogos alcalinos, lo que puede atribuirse o bien a la degradación durante la alta temperatura durante la extracción, o bien al hecho de que poblaciones de AX más grandes no pueden solubilizarse en esas condiciones. Temperaturas más altas y valores de pH más bajos parecen reducir ligeramente la masa molar de las fracciones.
5. Discusión
Se evalúa que dos materiales de salvado de trigo con diferente granulometría exhiben diferente composición y contenido de carbohidratos. El contenido de AX en el salvado de trigo de grano medio es ligeramente mayor.
La extracción alcalina con NaOH ofrece los mayores rendimientos de material, pero reduce significativamente la cantidad de funcionalidades fenólicas. La extracción hidrotérmica se ha evaluado en diferentes condiciones de
temperatura y pH. En una realización, se encuentra que 160 °C y pH7 son condiciones óptimas para la extracción hidrotérmica en términos de rendimiento, contenido de AX, y masa molar de los extractos. Todos los procedimientos de extracción exhiben cantidades apreciables de compuestos de baja masa molar (probablemente fracciones oligoméricas y de proteínas) y glucanos (probablemente p-glucano de enlace mixto). Pueden emplearse etapas de purificación adicionales mediante filtración por membrana y tratamientos enzimáticos para obtener fracciones de AX con alta pureza. Las fracciones de Ax feruloilados presentes en los residuos después de la extracción hidrotérmica pueden aislarse usando enfoques enzimáticos. Los AX feruloilados constituyen una fracción extremadamente valiosa con funcionalidades muy interesantes que podrían usarse como aditivos antioxidantes o absorbentes de UV en materiales basados en AX.
Experimento 2
Objetivo
El objetivo de este experimento fue diseñar un bioproceso integrado que combine la extracción con agua caliente a presión (PHWE), tratamientos enzimáticos, y ultrafiltración por membrana para fraccionar hemicelulosas de alta masa molar ricas en arabinoxilano con ácido ferúlico unido covalentemente (arabinoxilano feruloilado) a partir de oligosacáridos de baja masa molar. Al preservar el contenido feruloilado de estas fracciones poliméricas y oligoméricas, propiedades antioxidantes adicionales y valor potencialmente absorbente de UV se confirieron a estas fracciones. Estas funcionalidades novedosas proporcionan propiedades multifuncionales interesantes como antioxidante y absorbente de UV a las películas y geles a base de AX preparados, además de sus propiedades de barrera y reológicas.
3.1 Materiales
El salvado de trigo con granulometría fina (wbf) se proporcionó por Lantmannen. Todos los productos químicos, los patrones analíticos y reactivos fueron de Sigma-Aldrich. a-amilasa pancreática porcina se adquirió de Sigma-Aldrich. El reactivo de fenol Pholin Ciocalceau fue de Merck. La membrana de diálisis Spectra/Por 1 y 3, MWCO de 6-8 kD y 3,5 kDa, y tubo de diálisis Biotech CE, MWCO de 0,1-0,5 kDa y 20 kDa se adquirieron de SpectrumLabs. El casete Centramate 30kMWCO se adquirió de VWR. La feruloil esterasa 1A (Ruminococcus albus) se adquirió de NZytech. Endo-1,4-p-xilanasa (GH10) se adquirió de Megazyme.
3.2 Diseño de bioproceso
Los procedimientos de extracción combinados y los diferentes materiales y fracciones obtenidos se resumen en la figura 7. La descripción ampliada de los procedimientos de extracción se proporciona en el experimento 1. En este caso, la atención es sobre las nuevas tareas desarrolladas.
3.2.1 Desgrasado y desalmidonado
El salvado de trigo (wbf) se desgrasó con cloroformo (CHCb) y metanol (MeOH). El contenido de grasa total se determinó según el método de Folch.1 El salvado desgrasado se desalmidonó enzimáticamente con a-amilasa. El contenido de almidón total se determinó usando el kit de almidón total (Megazyme, Irlanda) antes y después del tratamiento con a-amilasa.
3.2.2 Extracción alcalina y con agua caliente a presión hidrotérmica (PHWE)
El salvado de trigo desgrasado y desalmidonado (Dwbf) se extrajo con NaOH o Ca(OH)2 0,5M a 80 °C durante 16 h usando una relación de 1:8 (p/v). La extracción con agua caliente a presión (PHWE) de Dwbf se realizó a diferentes temperaturas (100, 120, 140 y 160 °C) y pH (5,0, 7,0, y 9,0) usando tampón de formiato de sodio/ácido fórmico 1 M. Las extracciones se realizaron en tres ciclos posteriores de 5 min, dando como resultado 3 extractos y 1 residuo para cada condición sometida a prueba.
3.2.3 Filtración por membrana
Los diferentes extractos después de PHWE se solubilizaron en agua a 10 mg ml-1 y se sometieron a diálisis cerrada usando una membrana de MWCO de 20 kDa durante 48 h. Los eluyentes y los materiales retenidos recogidos se concentraron en un rotavapor y se liofilizaron. La ultrafiltración por membrana se aumentó a escala para los extractos de HE-160-7 en un flujo continuo (concentración inicial de 10 mg ml-1), usando un dispositivo de ultrafiltración por membrana de casete de 30 kDa. El material retenido (alta masa molar) y el eluyente (baja masa molar), se recogieron por separado, se concentraron y se liofilizaron.
3.2.4 Tratamientos enzimáticos
El residuo de extracción de PHW se trató enzimáticamente para valorizar aún más el residuo insoluble reticulado
después de la extracción con agua caliente a presión. Los residuos se incubaron con feruloil esterasa 1A sola o en sinergia con una endo-1,4-p-xilanasa en agua (20 ml) a 37 °C durante 16 h. Las incubaciones se centrifugaron, y tanto el sobrenadante como el residuo se liofilizaron. Los sobrenadantes generados después de las incubaciones enzimáticas se usaron para la cuantificación de los azúcares reductores (ensayo de DNS) y para el análisis de oligosacáridos por ESI-MS. Los residuos después del tratamiento enzimático se sometieron además a una nueva extracción de PHW a 160 °C pH 7,0 (3.2.2).
3.3 Caracterización de las fracciones extraídas
3.3.1 Composición y contenido de monosacáridos
La composición y el contenido de monosacáridos del salvado de trigo y las fracciones se analizaron por hidrólisis ácida seguido de cromatografía de intercambio aniónico de pH alto con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) (véase el experimento 1 para detalles completos).23
3.3.2 Composición y contenido fenólico
La composición y el contenido de ácido fenólico y se determinaron por saponificación, sililación y GC-MS4 (véase el experimento 1 para la descripción analítica completa).
3.3.3 Análisis de enlaces glucosídicos
El análisis del enlace glucosídico se realizó por metilación en condiciones alcalinas (exceso de NaOH) en dimetilsulfóxido (DMSO) usando las condiciones notificadas por Ciucanu & Kerek. Los polisacáridos parcialmente metilados se hidrolizaron con TFA 2 M a 121 °C durante 3 h y se modificaron adicionalmente para dar acetatos de alditol permetilados (PMAA) mediante reducción con NaBH4 y acetilación con anhídrido acético y piridina. Los PMAA se identificaron y cuantificaron por GC-MS en una columna capilar SP-2380 (30 m x 0,25 mm ID, Agilent Technologies) con una rampa de temperatura de 1 °C min'1 desde 160 hasta 210 °C.
3.3.4 Distribuciones de masa molar por SEC
Las distribuciones de masa molar de los arabinoxilanos extraídos a partir de salvado de trigo se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño acoplada al índice de refracción y la dispersión de luz láser multiángulo (véase el experimento 1 para la descripción analítica completa).
3.3.5 Método de ácido dinitrosalicílico (DNS) - determinación de azúcar reductor
1 ml del estándar (glucosa; 10 |imol l-1) o muestra se mezcló con 1 ml de reactivo de DNS, se agitó con vórtex y se incubó en un baño de agua hirviendo durante 15 min. Después de enfriar en un baño de hielo, el volumen se completó hasta 10 ml y la absorbancia se midió en un espectrofotómetro a 540 nm frente a un blanco de reactivo. La calibración se realizó usando disoluciones estándar de glucosa.
3.3.6 Identificación mediante huella de oligosacáridos por ESI—MS
Se realizó espectrometría de masas por ionización por electropulverización (ESI-MS) para identificar los oligosacáridos a partir de incubaciones enzimáticas. Las muestras se filtraron (3 kDa Amicon, 11500 rpm, 15 minutos) y se inyectaron directamente en el dispositivo de ESI-MS (Q-Tof-2, Waters) en modo positivo con voltaje de cono 80 V, voltaje de capilaridad 3,3 kV, y temperatura de desolvatación 140 °C.
3.3.7 Actividad antioxidante
La actividad antioxidante de los extractos alcalinos y de PHWE se evaluó según la reducción del radical DPPH en disolución metanólica con la presencia de un donante antioxidante.5 En resumen, se mezclaron alícuotas de muestra de 1,5 ml a diferentes concentraciones (10 - 100 |ig ml-1) con 0,5 ml de disolución metanólica 100 |iM l-1 de DPPH. Se usó arabinoxilano de endospermo de trigo (WE-AX) como control negativo, mientras que el ácido ascórbico y ferúlico se usaron como controles positivos. La mezcla de reacción se incubó durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente y la absorbancia se midió en un espectrofotómetro a 515 nm. La actividad de captación de radicales se midió como la disminución de la absorbancia de DPPH (ecuación 1):
Actividad de captación = (1 - Amuestra / Acontrol) X 100 (1 )
donde Amuestra fue la absorbancia en presencia de la muestra, y Acontrol fue la absorbancia del control que contenía los reactivos de reacción, excepto la muestra o los controles positivos o negativos. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.
4. Resultados
La tabla 6 presenta una versión resumida de la composición del salvado de trigo con granulometría fina (wbf) y después del desgrasado y desalmidonado (Dwbf). La composición general del salvado de trigo de partida concuerda bien con los valores notificados de la bibliografía, siendo AX el principal componente de polisacárido (aproximadamente el 24-36 % en DW), proteínas que representan aproximadamente el 15 % y una pequeña cantidad de ácido ferúlico (0,2 % de DW), con importancia significativa en la reticulación de la estructura de salvado. El tratamiento de desgrasado y desalmidonado retira con éxito los componentes de ácido graso y almidón.
Tabla 6. Composición general de salvado de trigo fino (wbf) y después de desgrasado y desalmidonado (Dwbf)
4.1 Comparación de extracción con agua caliente a presión y extracción alcalina
La extracción alcalina es el procedimiento estándar para la extracción de hemicelulosas a partir de materia prima de biomasa. Sin embargo, las condiciones de pH alto durante la extracción provocan la modificación de la estructura nativa y la escisión de los valiosos sustituyentes fenólicos (por ejemplo, ácido ferúlico). En este proyecto, los inventores proponen la extracción con agua caliente a presión como un método alternativo para liberar las fracciones poliméricas de AX mientras se mantienen las funcionalidades del ácido ferúlico.
En el experimento 1 se presentaron los rendimientos y la composición de los extractos y los residuos después de la extracción alcalina y PHW usando diferentes condiciones de temperatura y pH. Estas se han extendido (100 °C pH 5) y se resumen en la figura 9. La extracción alcalina con NaOH ofrece el rendimiento más alto (30 % en DW). Las condiciones de temperatura y pH para PHWE se han optimizado a 160 °C pH 7 y ofrecen rendimientos más bajos pero comparables que la extracción alcalina con NaOH. Sin embargo, con PHWE se logra un contenido de AX similar y se mantienen las funcionalidades de ácido ferúlico tanto en el extracto como en el residuo. Curiosamente, el residuo después de PHWE todavía contiene más del 50 % de AX no extraíble con alto contenido de FerA asignado al material reticulado (figura 8), que constituye todavía un recurso valioso de F-AX para una recuperación adicional.
4.2 Separación por membrana de los extractos
Los extractos alcalinos y de PHW se sometieron a ultrafiltración por membrana para aislar los permeados de baja masa molar con respecto de los retenidos de alta masa molar. El procedimiento fue capaz de separar claramente los oligosacáridos (HE-160-7-L) con respecto de las fracciones poliméricas con masas molares en el intervalo de 105 - 106 g mol-1 (HE-160-7-H) (figura 9).
La tabla 7 presenta la masa molar promedio en número (Mn) y la masa molar promedio en peso de los permeados (L) y los retenidos (H) después de la ultrafiltración por membrana. Los permeados corresponden con poblaciones de oligosacáridos con masas molares entre 1000 - 2000 g mol-1. Los retenidos, por el contrario, corresponden con poblaciones de polisacáridos con masas molares en el intervalo de 105 - 106 g mol-1. Polisacáridos a partir de los extractos alcalinos, de NaOH (NE) y de Ca(OH)2 (CE), exhiben una masa molar más alta que los extraídos por extracción de PHW hidrotérmica. Esto podría atribuirse a la alteración de las reticulaciones ferúlicas entre fracciones hemicelulósicas, que mejora la extracción de poblaciones poliméricas más grandes, según los resultados de la figura 8.
Tabla 7. Masas molares promedio de las fracciones poliméricas (H) y oligoméricas (L) de los extractos de salvado de trigo después de la ultrafiltración por membrana
4.2.1 Estructura molecular de las fracciones de polisacárido después de la filtración por membrana
La estructura molecular de las fracciones de polisacárido de alta masa molar extraídas en diferentes condiciones alcalinas y de PHWE se caracterizó mediante análisis de enlaces glucosídicos (tabla 8). Esto ofrece información sobre el contenido de las diferentes poblaciones de polisacáridos presentes en los extractos y sobre el patrón de sustitución de las poblaciones de F-AX en términos de unidades de (^+4)-X ylp-(1^) no sustituidas, unidades de ( ^ 2,4)-Xylp-(1^ y ^ 3,4)-Xylp-(1^ ) monosustituidas y unidades de cadena principal (^2,3,4)-Xylp-(1^) disustituidas. A partir de la asignación de los enlaces glucosídicos, puede identificarse la presencia de poblaciones de pectina (principalmente 3-5 % de arabinogalactanos), p-glucanos de enlace mixto (15-20 %) y arabinoxilanos (70-80 %). Curiosamente, la estructura molecular del polisacárido influye en la capacidad de extracción en extracción de PHWE. Las pectinas y los p-glucanos de enlace mixto parecen ser más fáciles de extraer, mientras que el contenido de AX aumenta progresivamente con temperaturas y tiempos de extracción más altos. Además de esto, temperaturas y tiempos de extracción más altos dan como resultado poblaciones de F-AX con una relación más alta de unidades de Xylp sustituidas y un mayor contenido de ácido ferúlico. Esto indica que puede controlarse la estructura y composición de las fracciones de polisacárido eligiendo las condiciones de extracción, lo que se volverá útil durante la preparación de los materiales basados en carbohidratos.
Tabla 8. Composición de monosacárido y análisis de enlace glucosídico de la fracción de polisacárido de alta masa molar (H) después de la ultrafiltración por membrana
4.2.2 Estructura molecular de la fracción de oligosacáridos después de filtración por membrana
La estructura molecular de las fracciones de oligosacáridos después de la filtración por membrana también se estudió mediante análisis de enlaces glucosídicos (tabla 9). Puede observarse la presencia principalmente de enlaces mixtos. Principalmente, los oligosacáridos de p-glucano de enlace mixto (MLBGO) y los arabino-xilooligosacáridos (AXO) se observan como los componentes principales en las fracciones. Estos oligosacáridos se vuelven útiles como prebióticos en formulaciones alimentarias o como precursores para aditivos de base biológica (por ejemplo, plastificantes) en aplicaciones materiales.
Tabla 9. Composición de monosacáridos y análisis de enlaces glucosídicos de la fracción de oligosacáridos de baja masa molar después de la ultrafiltración por membrana
4.3 Tratamiento enzimático del residuo de extracción
Los residuos después de PHWE todavía contenían aproximadamente un 50 % de AX (figura 8b), que constituye un recurso valioso para una recuperación adicional. Se sometió a prueba el uso de enzimas específicas para alterar la estructura reticulada del residuo con el fin de obtener además valiosos polisacáridos y oligosacáridos funcionales. En esta dirección, se sometió a prueba una feruloil esterasa (FE) sola o en sinergia con una endo-1,4-P-xilanasa (X). La feruloil esterasa mostró su propia acción residual sobre el residuo, pero en combinación con una P-xilanasa/esterasa mostró su propia acción residual sobre el residuo como se muestra a partir del ensayo de azúcar reductor a partir del sobrenadante en la figura 10a. Los oligosacáridos consisten en pentosas (arabino-xilooligosacáridos, AXO) y pentosas feruloiladas (F-AXO) con 2-10 unidades de azúcar (figura 10b). Esto constituye una prueba de concepto de la acción enzimática sobre el residuo reticulado para liberar oligosacáridos funcionales valiosos con fines nutricionales y materiales.
El residuo después de la acción enzimática se sometió a otro ciclo de extracción con agua caliente a presión, que fue capaz de liberar más arabinoxilano. La figura 11 compara los rendimientos obtenidos después del tratamiento enzimático (EZ) y después del tratamiento enzimático combinado con la posterior extracción (EZ+PHWE), junto con el contenido de arabinoxilano. Este procedimiento iterativo garantiza la recuperación optimizada de arabinoxilano a partir del residuo.
4.4 Actividad antioxidante de las fracciones de AX a partir de salvado de trigo
La actividad antioxidante de las diferentes fracciones a diferentes concentraciones se evaluó mediante su actividad de captación en la prueba de radicales de DPPH. El extracto alcalino (NE-AX) muestra muy poca actividad de captación, similar al control negativo de arabinoxilano de endospermo (WE-AX) extraíble en agua, que puede asignarse a la pérdida de funcionalidades de ácido ferúlico durante las condiciones alcalinas agresivas. Tanto los extractos de polisacárido (HE-160-7-H) como de oligosacárido (HE-160-7-L) después de la ultrafiltración por PHWE y membrana muestran una actividad de captación similar con respecto a los controles positivos (ácido ascórbico y ferúlico). Estos resultados muestran el potencial de estas fracciones para la preparación de materiales de barrera multifuncionales con actividad de captación de radicales adicional en aplicaciones de contacto con alimentos (véase la figura 12).
Claims (13)
1. Proceso para producir y aislar arabinoxilanos feruloilados (AX) a partir de un cultivo de cereal, que comprende someter dicho cultivo de cereal a
a) extracción con agua caliente a presión,
b) un tratamiento enzimático posterior de los residuos insolubles con una endo-beta-xilanasa y una feruloil esterasa, y
c) una o más etapas de ultrafiltración por membrana posterior(es) para purificar adicionalmente los extractos.
2. Proceso según la reivindicación 1, en el que la extracción con agua caliente a presión en la etapa a) se realiza a una temperatura de entre 140-160 °C y a un pH entre pH 5-9.
3. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la extracción con agua caliente a presión en la etapa a) se realiza a 160 °C a pH 7.
4. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el tratamiento enzimático de los residuos insolubles en la etapa b) comprende someter los residuos insolubles a una o más etapas de tratamiento con una o más enzimas con actividad de polisacárido.
5. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los residuos insolubles se someten a al menos una etapa a) de extracción con agua caliente a presión adicional después del tratamiento enzimático en la etapa b).
6. Proceso según la reivindicación 5, en el que los residuos insolubles se someten además después de la al menos una etapa a) de extracción con agua caliente a presión adicional a al menos una etapa b) de tratamiento enzimático adicional.
7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además someter dicho cultivo de cereal a uno o más tratamientos previos enzimáticos antes de una extracción con agua caliente a presión en la etapa a).
8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se aíslan diferentes fracciones de polisacáridos entre sí de modo que los arabinoxilanos aislados (AX) se fraccionan selectivamente en función de su estructura molecular y funcionalidades inherentes.
9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se aíslan arabinoxilanos de alta masa molar (AX).
10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo de cereal se selecciona del grupo que consiste en salvado de trigo, grano de trigo, harina de trigo, paja de trigo, grano de cebada, grano agotado de destilería, harina de cebada, paja de cebada, grano de centeno, harina de centeno, salvado de centeno, paja de centeno, grano de avena, arroz, maíz, salvado de maíz, salvado de arroz, paja de maíz, cáscara de maíz, rastrojo de maíz y salvado de avena.
11. Arabinoxilanos feruloilados (XA) producidos mediante un proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y que tienen un contenido de ácido ferúlico de 4 mg g_1 (4 mg/g).
12. Uso de arabinoxilanos feruloilados (AX) según la reivindicación 11 para la preparación de material basado en carbohidratos con propiedades funcionales, seleccionado del grupo que consiste en películas, hidrogeles, envasado de alimentos activo, prebióticos, compuestos bioactivos y agentes texturizantes.
13. Materiales basados en carbohidratos con propiedades funcionales, seleccionados del grupo que consiste en películas, hidrogeles, envasado de alimentos activo, prebióticos, compuestos bioactivos y agentes texturizantes que comprenden arabinoxilanos feruloilados (AX) según la reivindicación 11.
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