ES2927412T3 - Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla - Google Patents

Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla Download PDF

Info

Publication number
ES2927412T3
ES2927412T3 ES18205148T ES18205148T ES2927412T3 ES 2927412 T3 ES2927412 T3 ES 2927412T3 ES 18205148 T ES18205148 T ES 18205148T ES 18205148 T ES18205148 T ES 18205148T ES 2927412 T3 ES2927412 T3 ES 2927412T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polynucleotide
rna
segment
rna polynucleotide
hairpin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18205148T
Other languages
English (en)
Inventor
Yiwei Huang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare GmbH
Original Assignee
Siemens Healthcare GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Siemens Healthcare GmbH filed Critical Siemens Healthcare GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2927412T3 publication Critical patent/ES2927412T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un método para caracterizar un polinucleótido de ARN diana que comprende (i) proporcionar un polinucleótido de ARN; (ii) modificar dicho polinucleótido de ARN hibridando y ligando un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de tallo-bucle; (iii) opcionalmente realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN; (iv) escindir el segmento de bucle de tallo de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente 3'A; (v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de unión de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv); (vi) poner en contacto el polinucleótido de ARN modificado obtenido en el paso (v) con un poro transmembrana de manera que la translocasa de ARN controle el movimiento del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana y el anclaje de colesterol ancle el polinucleótido de ARN en la vecindad del poro transmembrana; y (vii) tomar una o más medidas durante el movimiento del polinucleótido de ARN a través de dicho poro transmembrana, donde las medidas son indicativas de una o más características del polinucleótido de ARN, caracterizando así el polinucleótido de ARN diana. También se proporciona un kit para caracterizar un polinucleótido de ARN diana, así como el uso de un polinucleótido que comprende un segmento multimérico aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de tallo-bucle para la modificación de un polinucleótido de ARN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se refiere a un método para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo que comprende (i) proporcionar un polinucleótido de ARN; (ii) modificar dicho polinucleótido de ARN al hibridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG; (iii) opcionalmente, realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN; (iv) escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3'; (v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv); (vi) poner en contacto el polinucleótido de ARN modificado obtenido en el paso (v) con un poro transmembrana de modo que la translocasa de ARN controle el movimiento del polinucleótido de a Rn a través del poro transmembrana y el anclaje de colesterol ancle el polinucleótido de ARN en la vecindad del poro transmembrana; y (vii) tomar una o más mediciones durante el movimiento del polinucleótido de ARN a través de dicho poro transmembrana, en donde las mediciones son indicativas de una o más características del polinucleótido de ARN, caracterizando así el polinucleótido de ARN objetivo. También se proporciona un kit para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo, así como el uso de un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla para la modificación de un polinucleótido de ARN.
El objetivo general de la transcriptómica es secuenciar completamente todas las especies transcripcionales en una muestra, determinar la estructura transcripcional de un gen, incluyendo las variantes de empalme y los genes de fusión, cuantificar los cambios en los niveles de expresión de las transcripciones en diferentes etapas de desarrollo y en diferentes entornos, y determinar que la transcripción antisentido se produce en las células biológicas. Las estrategias más utilizadas para la secuenciación de ARN de última generación incluyen el cebado con poli-T o la fragmentación del ácido ribonucleico (ARN) seguida de la iniciación aleatoria de hexámeros de ADN sintéticamente complementario (ADNc). Estas cadenas de ADNc luego se preparan normalmente para su análisis en un sistema de secuenciación dado utilizando métodos de preparación de bibliotecas que incluyen PCR. No obstante, el tipo de PCR que se utilice en la preparación de una biblioteca introducirá sesgos. Por ejemplo, la biblioteca resultante será menos compleja que la cantidad total de ARNm debido a que no todas las transcripciones se amplificarán con la misma eficiencia, lo que provocará la salida de ciertas especies de ARN y la sobreamplificación de otras especies. Además, la amplificación por PCR genera una copia sintética de la cadena de a Rn original y puede perderse información epigenética potencial. Por lo tanto, existe una clara necesidad de evitar en gran medida la amplificación de moléculas de ARN durante las preparaciones de bibliotecas con fines de secuenciación.
Las excepciones a las preparaciones de bibliotecas basadas en PCR incluyen FRT-Seq en las plataformas Illumina, en donde la reacción de síntesis de ADNc de primera cadena se realiza en cadenas únicas de ARN hibridadas con la superficie de la celda de flujo. Otro ejemplo es la secuenciación directa de ARN en la plataforma Helicos, que es una reacción de secuenciación por síntesis que utiliza cadenas de ARN nativas como plantilla. En ambos casos se evita la amplificación por PCR, eliminando esta fuente de distorsión, por lo que los datos obtenidos reflejan más fielmente la abundancia de ARNs en la muestra original. Sin embargo, estos enfoques todavía se basan en copias sintéticas de la cadena de ARN original, por lo que no se conserva la información sobre las modificaciones. Ambos enfoques, además, necesariamente producen lecturas de secuencias cortas, lo que es un tanto desventajoso, ya que las transcripciones en eucariotas generalmente se someten a empalmes alternativos, produciendo varias isoformas diferentes, por ejemplo, con diferentes sitios de inicio de transcripción, secuencias de codificación y regiones no traducidas. Sin embargo, la secuenciación de lectura corta normalmente no puede abarcar transcripciones completas y puede pasar por alto nuevas variantes de empalme.
Oxford Nanopore Technologies ha desarrollado un nuevo enfoque de secuenciación directa de ARN. Este enfoque, que también se representa en la Figura 1, se basa en la hibridación de un cebador poli-T con una cola poli-A de moléculas de ARNm. Por lo tanto, funciona única y exclusivamente con moléculas de ARN que tienen una cola poli-A y excluye todas las demás moléculas de ARN.
El documento Jonkhout et al., 2017, RNA, 23, 12, 1754-1769 proporciona una descripción general del panorama de modificación del ARN en enfermedades humanas.
El documento Garalde et al., 2018, Nature Methods, 15, 3, 201-206 describe métodos de secuenciación directa de ARN altamente paralelos en un haz de nanoporos.
El documento WO 2004/041337 se refiere a un método para modificar un polinucleótido plantilla para la caracterización, especialmente para la secuenciación de nanoporos. El método produce un polinucleótido modificado que es complementario al polinucleótido plantilla en algunas posiciones y que contiene nucleótidos universales o abásicos en las otras posiciones.
El documento US 2017/067097 describe métodos, reactivos, aparatos y sistemas para la replicación o amplificación de moléculas de ácido nucleico a partir de muestras biológicas.
El documento Shchyolkina et al., 1999, Nucleosides & Nucleotides, 18, 6-7, 1555-1562 proporciona información sobre oligonucleótidos de cadena paralela con secuencias alternantes d(AisoG)/d(T-C) y d(A-G)/d(T-m5isoC).
Por lo tanto, existe la necesidad de una metodología de secuenciación de ARN directa mejorada que permita secuenciar todas las especies de ARN, es decir, también aquellas moléculas de ARN que no poseen una cola poli-A.
La presente invención aborda esta necesidad y proporciona un método para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo que comprende: (i) proporcionar un polinucleótido de ARN; (ii) modificar dicho polinucleótido de ARN al hibridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG; (iii) opcionalmente, realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN; (iv) escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3'; (v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv); (vi) poner en contacto el polinucleótido de ARN modificado obtenido en el paso (v) con un poro transmembrana de modo que la translocasa de ARN controle el movimiento del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana y el anclaje de colesterol ancle el polinucleótido de ARN en la vecindad del poro transmembrana; y (vii) tomar una o más mediciones durante el movimiento del polinucleótido de ARN a través de dicho poro transmembrana, en donde las mediciones son indicativas de una o más características del polinucleótido de ARN, caracterizando así el polinucleótido de ARN objetivo.
El método presentado, al estar basado en secuencias multiméricas aleatorias, permite ventajosamente realizar una secuenciación directa de ARN con todas las especies de ARN, no sólo aquellas que comprenden colas poli-A, es decir, ARNm. Por consiguiente, también pueden secuenciarse fragmentos de ARNm de diferentes orígenes. El polinucleótido de horquilla permite además una estabilización de la transcripción y permite la presentación del multímero aleatorio en el extremo 3' del polinucleótido de horquilla. Además, la presencia de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción en el polinucleótido de horquilla permite además una escisión de dicho polinucleótido que produce un saliente A 3', que posteriormente puede usarse para la conexión de un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN necesario para translocar la molécula de ARN a través de un poro transmembrana para obtener su secuencia.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar un polinucleótido de ARN objetivo para la secuenciación transmembrana que comprende: (i) proporcionar un polinucleótido de ARN; (ii) modificar dicho polinucleótido de ARN al hibridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG; (iii) opcionalmente, realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN; (iv) escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3'; y (v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv).
En una realización, dichos pares de bases 5-metil-isoC-isoG se proporcionan al menos en cada 4a, 5a o 6a posición del polinucleótido de horquilla.
En otra realización más, dichos pares de bases 5-metil-isoC-isoG se proporcionan al menos en cada 4a, 5a o 6a posición del polinucleótido de horquilla.
En otra realización de la presente invención, dicho segmento de multímero aleatorio es un segmento de hexámero aleatorio, heptámero aleatorio, octámero aleatorio, nonámero aleatorio o decámero aleatorio. Se prefiere que el segmento de multímero aleatorio sea un segmento de hexámero aleatorio.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene forma de horquilla comprende un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de la secuencia 5'-ACAGT-3' o 5'-TCAGA-3'.
En otra realización, se utiliza la enzima Hpy188I para escindir el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-TCAGA-3'; o se utiliza la enzima Bst4CI, HpyCH4III o Taal para escindir el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-ACAGT-3'.
En otra realización más, el polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla comprende adicionalmente una sección de código de barras.
En otra realización de la presente invención, dichas una o más características del polinucleótido de ARN que se miden durante la translocación del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana son (i) la longitud del polinucleótido de ARN, (ii) la identidad del polinucleótido de ARN, (iii) la secuencia del polinucleótido de ARN, y (iv) la presencia de una modificación de nucleótido en el polinucleótido de ARN. Se prefiere que la característica que se medirá sea la secuencia del polinucleótido de ARN.
En otra realización, dicho polinucleótido de ARN es cualquier polinucleótido de ARN. En realizaciones específicas es ARNm, un fragmento de ARNm, pre-ARNm, ARNnc, ARNr, miARN, ARNnop, ARN regulador pequeño (srRNA), por sus siglas en inglés), ARNtm, ARNip o ARNpi.
En otra realización de acuerdo con la presente invención, dicha translocasa de ARN es helicasa SF2, helicasa NS3, helicasa NPH-II, helicasa Upf1 o translocasa RIG-I, o derivados de los mismos, o un derivado de una helicasa de ADN, tal como helicasa Hel308, helicasa RecD, helicasa XPD o helicasa Dda que es capaz de translocar polinucleótidos de ARN.
De acuerdo con una realización adicional, dicha proteína de poro transmembrana es una proteína de poro derivada de hemolisina, leucocidina, MspA, MspB, MspC, MspD, CsgG, lisenina, porina F de membrana externa (OmpF, por sus siglas en inglés), porina G de membrana externa (OmpG, por sus siglas en inglés), fosfolipasa A de membrana externa, lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP, por sus siglas en inglés) o WZA.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un kit para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo que comprende un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde la forma de horquilla comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG, que comprende preferiblemente un polinucleótido con un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla como se define en la presente. Dichos pares de bases 5-metil-isoC-isoG se proporcionan al menos en cada 4a, 5a o 6a posición del polinucleótido de horquilla.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde la forma de horquilla comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG para la modificación de un polinucleótido de ARN, preparando así dicho polinucleótido de ARN para una secuenciación directa de ARN a través de un poro transmembrana.
Debe entenderse que las características mencionadas anteriormente y las que quedan por explicar a continuación pueden ser utilizadas no sólo en las respectivas combinaciones indicadas, sino también en otras combinaciones o de forma aislada sin apartarse del alcance de la invención, que está definido por el reivindicaciones adjuntas.
La Figura 1 muestra una ilustración esquemática de un enfoque de secuenciación de ARN limitado a polinucleótidos de ARN que comprenden colas poli-A.
La Figura 2 muestra una ilustración esquemática de los pasos del método de acuerdo con una realización de la presente invención que incluye el empleo de un polinucleótido que comprende la forma de horquilla, la provisión de un multímero aleatorio, la adición de elementos de enlace y translocasa a la molécula, y la determinación de la secuencia mediante translocación a través de un poro transmembrana.
La Figura 3 muestra un ejemplo de un polinucleótido que comprende la forma de horquilla de acuerdo con una realización de la presente invención.
Aunque la presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares, esta descripción no debe interpretarse en un sentido limitativo.
Antes de describir en detalle las realizaciones ejemplares de la presente invención, se proporcionan definiciones importantes para comprender la presente invención.
Como se usan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” y “una” también incluyen los respectivos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
En el contexto de la presente invención, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” indican un intervalo de precisión que un experto en la técnica entenderá para garantizar el efecto técnico de la característica en cuestión. El término indica normalmente una desviación del valor numérico indicado de ±20%, preferiblemente de ±15%, más preferiblemente de ±10% y aún más preferiblemente de ±5%.
Debe entenderse que el término “comprende” no es limitativo. Para los fines de la presente invención, el término “que consiste en” o “que consiste esencialmente en” se considera una realización preferida del término “que comprende”. Si en lo sucesivo se define un grupo para que comprenda al menos un cierto número de realizaciones, esto significa que también abarca un grupo que consiste preferiblemente en sólo estas realizaciones.
Además, los términos “(i)”, “(ii)”, “(iii)” o “(a)”, “(b)”, “(c)”, “(d)” o “primero”, “segundo”, “tercero”, etc., y similares en la descripción o en las reivindicaciones, se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico.
Debe entenderse que los términos así utilizados son intercambiables en las circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención descritas en la presente son capaces de operar en secuencias distintas a las descritas o ilustradas en la presente. En caso de que los términos se refieran a pasos de un método, procedimiento o uso, no hay una coherencia de tiempo o intervalo de tiempo entre los pasos, es decir, los pasos pueden realizarse simultáneamente o puede haber intervalos de tiempo de segundos, minutos, horas, días, semanas. etc., entre dichos pasos, a menos que se indique lo contrario.
Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, etc., particulares descritos en la presente, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente tiene el propósito de describir solamente modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado sólo por las reivindicaciones adjuntas.
Los dibujos se deben considerar como representaciones esquemáticas y los elementos ilustrados en los dibujos no se muestran necesariamente a escala. Más bien, los diversos elementos se representan de manera que su función y propósito general sean evidentes para un experto en la técnica.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica.
Como se ha establecido anteriormente, la presente invención se refiere en un aspecto a un método para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo que comprende (i) proporcionar un polinucleótido de ARN; (ii) modificar dicho polinucleótido de ARN al hibridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG; (iii) opcionalmente, realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN; (iv) escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3'; (v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv); (vi) poner en contacto el polinucleótido de ARN modificado obtenido en el paso (v) con un poro transmembrana de modo que la translocasa de ARN controle el movimiento del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana y el anclaje de colesterol ancle el polinucleótido de ARN en la vecindad del poro transmembrana; y (vii) tomar una o más mediciones durante el movimiento del polinucleótido de ARN a través de dicho poro transmembrana, en donde las mediciones son indicativas de una o más características del polinucleótido de ARN, caracterizando así el polinucleótido de ARN objetivo.
En un primer paso del método de la presente invención, se proporciona un polinucleótido de ARN.
De la manera que se usa en la presente, el término “polinucleótido de ARN” o “polinucleótido de ARN objetivo” se refiere a cualquier macromolécula que comprende dos o más ribonucleótidos. Los ribonucleótidos suelen contener una nucleobase, un azúcar ribosa y al menos un grupo fosfato. Las nucleobases son normalmente adenina, guanina, citosina y uracilo. Los polinucleótidos de ARN son normalmente moléculas monocatenarias, sin embargo, también pueden proporcionarse en forma bicatenaria mediante emparejamiento parcial de bases complementarias. El polinucleótido de ARN normalmente no forma largos tramos de doble hélice. El polinucleótido de ARN puede ser de origen natural o artificial. Puede comprender, además de los elementos mencionados anteriormente, modificaciones, tales como nucleótidos oxidados o metilados. El polinucleótido de ARN también puede, en ciertas realizaciones, comprender adiciones artificiales, tales como etiquetas o marcadores.
El polinucleótido de ARN puede tener cualquier origen posible, por ejemplo, procariota, eucariota, arqueal o viral. El polinucleótido de ARN que se caracterizará según la presente invención puede tener cualquier función biológica o celular posible conocida. Por ejemplo, puede ser cualquier polinucleótido natural o sintético, como el ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), A r N heterogéneo nuclear (ARNhn), ARN de transferencia (ARNt), ARN de transferencia mensajero (ARNtm), micro ARN (miARN), ARN nuclear pequeño (ARNnp), ARN líder empalmado (SL RNA, por sus siglas en inglés), ARN nucleolar pequeño (ARNnop), ARN antisentido (ARNas), ARN guía (ARNg), ARN largo no codificante (lncRNA, por sus siglas en inglés), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN que interactúa con piwi (ARNpi), ARN de interferencia pequeño que actúa en trans (tasiRNA, por sus siglas en inglés), ARNm precursor (pre-ARNm) o ARNip asociado a repeticiones (rasiRNA, por sus siglas en inglés). Las especies de ARN mencionadas suelen diferir en términos de tamaño, composición de nucleótidos, estado de plegamiento y presencia o ausencia de extensiones 3'. Por ejemplo, las moléculas de ARNm en eucariotas normalmente comprenden una cola poli-A 3' que consiste en múltiples monofosfatos de adenosina y se une a las moléculas después de la transcripción por una poliadenilato polimerasa. Es posible que otras especies de ARN o fragmentos de ARNm eucariotas no comprendan tal elongación. Por ejemplo, los ARNm precursores (pre-ARNm) son moléculas de ARNm no procesadas que comprenden secuencias de intrones que aún no han sido modificadas por la poliadenilato polimerasa. En una realización preferida, el polinucleótido de ARN objetivo es un ARNm, un fragmento de un ARNm, una molécula de pre-ARNm, un ARNnc, un miARN, un ARNnop, un ARNtm, un ARNip o un ARNpi. Se prefiere particularmente que el ARN objetivo sea un polinucleótido de ARN que no comprenda una cola poli-A o una cola oligo-A en el extremo 3'. Por ejemplo, los fragmentos de polinucleótidos de ARNm que no comprenden la porción 3' del ARNm normalmente no comprenden una cola poli-A. Además, las moléculas de pre-ARNm normalmente no comprenden una cola poli-A. De manera similar, las especies de polinucleótidos de ARN que no pertenecen al grupo de los ARNm eucarióticos normalmente no comprenden extensiones de poli-A. Dichas especies son objetivos preferidos, ya que el método de la invención es capaz de caracterizar estos polinucleótidos debido al hecho de que no requiere la existencia de una extensión poli-A. En ciertas realizaciones, el polinucleótido de ARN objetivo también puede ser una molécula de ARNm eucariota típica, que también puede caracterizarse de acuerdo con la presente invención.
La provisión del polinucleótido de ARN puede incluir la extracción y/o purificación de la molécula de ARN, por ejemplo, mediante lisis de isotiocianato de guanidina, separación de residuos celulares, filtración, elución de una columna, por ejemplo, columnas de membrana de sílice, centrifugación, digestión, por ejemplo, digestión con DNasa, o eliminación de componentes de nucleótidos o proteínas en una muestra, etc. Se prefiere que el polinucleótido de ARN se proporcione en una solución amortiguadora que comprenda cualquier ingrediente adecuado que impida la degradación del ARN. La solución amortiguadora puede ser, por ejemplo, una solución amortiguadora H20 sin RNasa que comprenda EDTA (por ejemplo, 0,1 mM) o una solución amortiguadora TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA). La solución amortiguadora puede comprender preferiblemente compuestos bloqueadores de RNasa o inhibidores de RNasa, tales como RNaseZap, Superase, RNaseOUT, inhibidor de ribonucleasa, RNasin o similares.
En realizaciones adicionales, la provisión de polinucleótidos de ARN también puede incluir el empleo de condiciones adecuadas para mantener la molécula de ARN o una parte de ella en una forma monocatenaria. Dichas condiciones pueden incluir el uso de una cierta temperatura o rango de temperaturas antes o durante la realización de los métodos de la invención y/o el uso de soluciones amortiguadoras específicas o condiciones salinas para evitar la formación de estructuras secundarias en la molécula de ARN. Se prefiere que el polinucleótido de ARN o una parte del mismo sea monocatenario mediante una breve desnaturalización por calentamiento. Esta breve desnaturalización por calentamiento se puede aplicar, por ejemplo, al hibridar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla como se describe en la presente.
La provisión de polinucleótidos de ARN también puede implicar la toma de muestras de un sujeto y su procesamiento, por ejemplo, extracción de ARN o pasos preparatorios que facilitan la extracción de ARN. De la manera que se usa en la presente, el término “muestra de un sujeto” se refiere a cualquier material biológico obtenido de un sujeto a través de métodos adecuados conocidos por el experto en la técnica. La muestra utilizada en el contexto de la presente invención debe recolectarse preferiblemente de una manera clínicamente aceptable, más preferiblemente de manera que se conserven los polinucleótidos de ARN. Las muestras biológicas pueden incluir tejidos y/o fluidos corporales, tal como sangre, o componentes sanguíneos, tales como suero o plasma, sudor, esputo o saliva, semen y orina, así como heces o muestras de heces. Además, la muestra biológica puede contener un extracto celular derivado de una población celular que incluye una célula epitelial, preferiblemente una célula epitelial neoplásica o una célula epitelial derivada de un tejido sospechoso de ser neoplásico. Alternativamente, la muestra biológica puede derivarse del medio ambiente, por ejemplo, del suelo, un lago, un río, etc., o de fuentes animales.
En ciertas realizaciones, las células pueden usarse como fuentes primarias de polinucleótidos de ARN. Por consiguiente, las células pueden purificarse a partir de tejidos y fluidos corporales obtenidos si es necesario, y luego pueden procesarse adicionalmente para obtener polinucleótidos de ARN. En ciertas realizaciones, las muestras, en particular después del procesamiento inicial, pueden agruparse. La presente invención prevé preferiblemente el uso de muestras no agrupadas.
En una realización específica de la presente invención, el contenido de una muestra biológica también puede someterse a un paso de enriquecimiento. Por ejemplo, una muestra puede ponerse en contacto con ligandos específicos para la membrana celular o con orgánulos de ciertos tipos de células funcionalizados, por ejemplo, con partículas magnéticas. El material concentrado por las partículas magnéticas puede utilizarse posteriormente para la extracción de polinucleótidos de ARN. En realizaciones adicionales de la invención, se pueden obtener y/o usar muestras de biopsia o resecciones. Tales muestras pueden comprender células o lisados celulares. Además, las células, por ejemplo, las células tumorales, pueden enriquecerse mediante procesos de filtración de fluidos o muestras líquidas, por ejemplo, sangre, orina, sudor, etc. Tales procesos de filtración también pueden combinarse con pasos de enriquecimiento basados en interacciones específicas de ligando como se describió anteriormente en la presente.
En un siguiente paso del método de la invención, se modifica el polinucleótido de ARN mencionado anteriormente. La modificación es en primer lugar una hibridación con un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG. De la manera que se usa en la presente, el término “hibridación de un polinucleótido” se refiere al emparejamiento del polinucleótido de ARN monocatenario con un polinucleótido monocatenario complementario mediante enlaces de hidrógeno para formar un polinucleótido bicatenario. El polinucleótido complementario puede ser una molécula de ARN o un polinucleótido de ADN. Puede comprender además una o más modificaciones, tales como comprender uno o más nucleótidos de origen no natural, modificaciones químicas de los nucleótidos, la presencia de etiquetas o elementos espaciadores, etc. Se prefiere que el polinucleótido complementario sea un polinucleótido de ADN o un polinucleótido de ADN modificado.
El polinucleótido de hibridación puede tener cualquier longitud o tamaño total adecuado, por ejemplo, puede tener una longitud total de aproximadamente 20 a 100 nucleótidos, preferiblemente una longitud total de aproximadamente 25 a 75 nucleótidos, más preferentemente una longitud total de aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, por ejemplo, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos, o cualquier longitud total entre los valores mencionados.
De la manera que se usa en la presente, el término “multímero aleatorio terminal 3'” significa que la región complementaria, que es capaz de hibridarse con el polinucleótido de ARN, tiene una secuencia aleatoria multimérica en el extremo 3'. El segmento correspondiente es normalmente monocatenario y, por lo tanto, capaz de formar enlaces de hidrógeno que conducen a un polinucleótido bicatenario que comprende el polinucleótido de ARN y el segundo polinucleótido hibridado con él. Dichos segmentos aleatorios pueden comprender entre 5 y 15 nucleótidos con una secuencia de bases aleatoria, es decir, sin una secuencia predefinida. La secuencia de bases aleatoria normalmente cubre todas las posibilidades de secuencia en el tramo cubierto, incluyendo tramos de mononucleótidos, tales como poli-T, poli-A, poli-G, poli-C. Por consiguiente, el polinucleótido se usa como un grupo de diferentes polinucleótidos para cubrir todas las posibilidades. El número de polinucleótidos diferentes usados para el paso de hibridación depende del tamaño de la secuencia cubierta, y las secuencias más largas requieren más polinucleótidos diferentes para cubrir todas las posibles variaciones de secuencia que las secuencias más cortas. Se prefiere que el segmento aleatorio comprenda 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, es decir, que el segmento aleatorio sea un hexámero, heptámero, octámero, nonámero o decámero. Se prefiere particularmente usar 6 nucleótidos (hexámeros). La presencia del multímero aleatorio permite que se hibride con cualquier polinucleótido de ARN presente independientemente de la secuencia del polinucleótido de ARN o de la presencia de una cola poli-A. Por lo tanto, ventajosamente, es posible caracterizar no sólo moléculas de ARNm, sino también fragmentos no poli-A de las mismas, así como cualquier otra molécula de ARN.
De la manera que se usa en la presente, el término “forma de horquilla” significa que el polinucleótido hibridado con el polinucleótido de ARN comprende en el sector adyacente al segmento de multímero aleatorio un segmento parcialmente bicatenario que comprende un sector de tallo bicatenario y un sector de horquilla o bucle en horquilla que conecta los sectores bicatenarios. Por lo tanto, la parte del tallo normalmente comprende dos regiones de la misma cadena, que son complementarias en la secuencia de nucleótidos cuando se leen en direcciones opuestas. Estos segmentos pueden formar pares de bases y formar una doble hélice que termina en un bucle no apareado.
Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que la formación de una estructura de horquilla depende de la estabilidad de las regiones de hélice y bucle resultantes. El primer requisito previo suele ser la presencia de una secuencia que pueda plegarse sobre sí misma para formar una doble hélice emparejada. La estabilidad de esta hélice puede estar determinada predominantemente por su longitud, el número de desfases o protuberancias que pueda contener y la composición de bases de la región emparejada. Dado que los emparejamientos entre guanina y citosina tienen tres enlaces de hidrógeno, son más estables en comparación con los emparejamientos de adenina-timina, que tienen sólo dos. En cierta realización, el segmento de tallo comprende más emparejamientos de guanina-citosina que emparejamientos de adenina-timina.
Además, la estabilidad del bucle puede tener una influencia en la formación de la estructura de horquilla. Se prefiere que el bucle en horquilla no tenga un tamaño más pequeño que tres bases, por ejemplo, tiene 4, 5, 6, 7, 8 o más bases de longitud. Se prefiere además que los bucles no sean más largos que de aproximadamente 10 a 12 bases, ya que los bucles grandes normalmente tienden a ser inestables. En determinadas realizaciones, el bucle puede tener un tamaño de más de 12 bases y mostrar una estructura secundaria adicional, tal como un pseudonudo. Se prefiere particularmente que el bucle tenga una longitud de aproximadamente 4-8 bases. En algunas realizaciones, el bucle tiene la secuencia 5'-TNCG-3', es decir, es un tetrabucle que se estabiliza debido a las interacciones de apilamiento de bases de sus nucleótidos componentes.
De acuerdo con la presente invención, la forma de horquilla se estabiliza mediante la presencia de nucleótidos no de ADN en el polinucleótido. De la manera que se usa en la presente, el término “nucleótido no de ADN” se refiere a nucleótidos artificiales que no son de origen natural. De acuerdo con la invención, dichos nucleótidos artificiales transmiten un apareamiento de bases que es más fuerte que citosina-guanina y adenina timina. Tales nucleótidos son 5-metil-isocitosina e iso-guanina. Un experto en la técnica tendrá conocimiento de más detalles sobre estos nucleótidos o se pueden derivar de fuentes bibliográficas adecuadas, tales como Bande et al., Chem. Eur. J., 2015, 21, 5009-5022. De acuerdo con la invención, el polinucleótido que se hibrida a través de su multímero aleatorio con un polinucleótido de ARN objetivo comprende uno o más nucleótidos de 5-metil-iso-citosina e iso-guanina colocados de manera que permitan un apareamiento de bases. Se prefiere que dicho apareamiento de bases tenga como resultado la presencia de un bucle en horquilla como se describió anteriormente, preferiblemente un bucle en horquilla de 4 a 8 bases.
En realizaciones preferidas adicionales, el segmento de horquilla del polinucleótido de hibridación de acuerdo con la presente invención comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más apareamientos de bases 5-metil-iso-citosina e iso-guanina. Normalmente, dichos pares de bases pueden proporcionarse a ciertas distancias entre sí. Por ejemplo, el segmento de horquilla del polinucleótido de hibridación de acuerdo con la presente invención puede diseñarse de manera que los pares de bases 5-metil-iso-citosina e iso-guanina se produzcan cada 4a, 5a o 6a posiciones del segmento de horquilla. También se prevén diferentes distancias, tal como la presencia de los pares de bases 5-metil-iso-citosina e iso-guanina cada 2a, 3 a o, en el caso de estructuras más largas, cada 7 a, 8a o 9a posiciones del segmento de horquilla. Las posiciones pueden modificarse aún más, por ejemplo, 2 o más, por ejemplo, 2, 3, 4 Los apareamientos de bases 5-metil-iso-citosina e isoguanina pueden agruparse seguidos de un tramo sin tales apareamientos de bases, seguido de un único apareamiento de bases 5-metil-isocitosina e iso-guanina, u otro grupo de 2 o más apareamientos de bases, etc. Se prefiere que los apareamientos de bases 5-metil-iso-citosina e iso-guanina se diseñen de modo que sean capaces de evitar daños en el multímero aleatorio cuando se unen a polinucleótidos de ARN como se describe en la presente. Los apareamientos de bases en el segmento de horquilla que no son apareamientos de bases 5-metil-iso-citosina e iso-guanina pueden ser apareamientos de bases G-C o A-T, o AU. Se prefiere que dichos apareamientos de bases sean apareamientos de bases G-C.
La modificación del polinucleótido de ARN como se mencionó anteriormente es, después de la hibridación, en segundo lugar, una ligadura del polinucleótido hibridado que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla como se describió anteriormente al polinucleótido de ARN. La ligadura tiene lugar en el extremo 5' del polinucleótido hibridado. Por consiguiente, la presente invención prevé que el extremo 5' del polinucleótido comprenda un resto de fosfato. Este resto de fosfato puede, en ciertas realizaciones, por ejemplo, cuando no está presente, añadirse al polinucleótido mediante la actividad de una enzima fosforiladora. Ejemplos de enzimas adecuadas son una quinasa, tal como la polinucleótido quinasa T4
La ligadura puede ser una ligadura química o enzimática. Una ligadura química normalmente requiere la presencia de reactivos de condensación. Un ejemplo de ligadura química contemplada por la presente invención hace uso de grupos fosforotioéster electrofílicos. Otros ejemplos incluyen el uso de bromuro de cianógeno como un agente de condensación.
La unión enzimática entre el polinucleótido de ARN que se caracterizará y el polinucleótido hibridado que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla como se describió anteriormente puede, por ejemplo, realizarse posteriormente con cualquier ligasa enzimática adecuada conocida por el experto en la técnica. Los ejemplos de ligasas adecuadas incluyen ADN ligasa T4. Alternativamente, pueden usarse ligasas tales como ADN ligasa de E. coli, ADN ligasa Taq, ADN ligasa Tma, ADN ligasa 9°N, polimerasa T4 1, polimerasa T42 o App ADN/ARN ligasa 5' termoestable.
Para que la fosforilación y/o la ligadura funcionen correctamente, se proporcionan condiciones de solución amortiguadora adecuadas y la presencia de ingredientes adecuados. Por ejemplo, para la fosforilación se debe proporcionar ATP (por ejemplo, 1 mM). Una solución amortiguadora adecuada puede comprender además Tris-HCl, por ejemplo, en una concentración de 50 mM, MgCh, por ejemplo, en una concentración de 10 mM, y DTT, por ejemplo, en una concentración de 10 mM. El pH se puede ajustar a 7,8.
Para la ligadura, por ejemplo, se puede proporcionar una solución amortiguadora de ADN ligasa T4, ATP, por ejemplo, en una cantidad de 10 mM, y p Eg , por ejemplo, PEG8000 al 50%. Para diferentes ligasas, las condiciones pueden cambiarse, por ejemplo, de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
El método de la presente invención normalmente no comprende la amplificación del polinucleótido objetivo o la transcripción inversa para reducir la cantidad de flujo de trabajo necesario para caracterizar el polinucleótido de ARN objetivo.
Sin embargo, en ciertas realizaciones, el paso de la transcripción inversa puede, opcionalmente, realizarse para obtener una construcción de ARN-ADNc que sea capaz de estabilizar el polinucleótido de ARN, por ejemplo, al evitar las estructuras secundarias o terciarias del ARN, etc. Por lo tanto, la presente invención contempla en estas realizaciones la transcripción inversa del polinucleótido de ARN a partir del polinucleótido hibridado que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla. La transcripción inversa se puede realizar con cualquier transcriptasa inversa adecuada conocida por el experto en la técnica. Ejemplos de tales transcriptasas inversas adecuadas son las transcriptasas inversas que no comprenden una actividad de RNasa H. Los ejemplos específicos incluyen transcriptasa inversa MMLV sin actividad de RNasa H o transcriptasas inversas disponibles comercialmente, tales como SuperScript, SuperScript II, SuperScript III, StrataScript, etc.
La reacción de transcriptasa inversa se realiza con o en presencia de una solución amortiguadora adecuada. Dicha solución amortiguadora puede comprender, por ejemplo, TrisHCL, por ejemplo, en una concentración de 250 mM, KCl, por ejemplo, en una concentración de 375 mM, MgCh, por ejemplo, en una concentración de 15 mM y DTT, por ejemplo, en una concentración de 0,1 M, preferiblemente a un pH de 8,3. Además, se debe utilizar una cantidad adecuada de dNTP, por ejemplo, dATP, dCTP, cGTP y cTTP, por ejemplo, en una concentración adecuada, tal como 10 mM.
En un paso siguiente del método de acuerdo con la invención, se escinde el segmento de horquilla del polinucleótido hibridado. De la manera que se usa en la presente, el término “escisión” o “división” se refiere a un corte bicatenario, es decir, una incisión a través de cada cadena, en una molécula de ácido nucleico bicatenaria, normalmente realizada por una enzima de restricción o una endonucleasa de restricción.
La escisión se puede realizar mediante cualquier enzima de restricción adecuada. La escisión puede tener lugar en cualquier posición adecuada dentro del segmento de horquilla. Normalmente, la escisión puede tener lugar en la porción de tallo del segmento de horquilla. Al cortar la porción de tallo del segmento de horquilla, se puede producir cualquier extremo adecuado en el sitio cortado. Tal extremo puede ser un extremo cohesivo, es decir, con un saliente 5' o 3', o puede ser un extremo romo, es decir, sin saliente. Se prefiere que se obtenga un extremo cohesivo. Se prefiere además que el extremo cohesivo tenga un saliente de 3'. De acuerdo con realizaciones específicas, el saliente puede tener cualquier longitud adecuada, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos. En realizaciones particularmente preferidas, el saliente es un saliente 3' de 1 nucleótido. La invención además prevé específicamente que el saliente 3' sea un saliente A de 1 nucleótido.
La escisión se puede realizar en cualquier condición adecuada. Por ejemplo, la enzima de restricción utilizada puede emplearse en una solución amortiguadora adecuada. Por ejemplo, dicho solución amortiguadora puede comprender NaCl, por ejemplo, 50 mM, TrisHCl, por ejemplo, 10 mM, MgCh, por ejemplo, 10 mM y BSA, por ejemplo, 100 |jm/ml; o acetato de potasio, por ejemplo, 50 mM, tris-acetato, por ejemplo, 20 mM, Mg-acetato, por ejemplo, 10 mM y BSA, por ejemplo, 100 jm/ml, bis-Tris-propano-HCl, por ejemplo, 10 mM, MgCh, por ejemplo, 10 mM y b Sa , por ejemplo, 100 jm/ml. La solución amortiguadora puede, por ejemplo, tener un pH de 7,9.
En un grupo específico de realizaciones, la escisión se realiza en el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-ACAGT-3' o 5'-TCAGA-3'. El polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y una forma de horquilla de acuerdo con la presente invención puede comprender, por consiguiente, el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-ACAGT-3' o 5'-TCAGA-3'. El sitio puede proporcionarse como un sitio único o en forma múltiple. Se prefiere que el sitio sea un sitio único. De acuerdo con realizaciones adicionales, el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-ACAGT-3' puede escindirse en la tercera posición para producir 5'-ACA/GT-3', proporcionando así un saliente 3' de 1 nucleótido, más específicamente para proporcionar un saliente A 3' de 1 nucleótido. De acuerdo con diferentes realizaciones, el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-TCAGA-3' puede escindirse en la tercera posición para producir 5'-TCA/GA-3', proporcionando así un saliente 3' de 1 nucleótido, más específicamente para proporcionar un saliente A 3' de 1 nucleótido. Cualquier enzima de restricción que reconozca la secuencia mencionada y la corte para producir un saliente 3' de 1 nucleótido puede emplearse dentro del método de la presente invención.
Se prefiere que los nucleótidos no de ADN como se describió anteriormente en la presente, por ejemplo, las bases 5-metil-isoC o isoG no forman parte del sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-ACAGT-3' o 5'-TCAGA-3'.
En realizaciones adicionales, la enzima Hpy188I se utiliza dentro del método de la presente invención para escindir el segmento de horquilla. Se sabe que la enzima Hpy188I reconoce el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-TCAGA-3'. En realizaciones alternativas adicionales, la enzima Bst4CI, HpyCH4III o Taal puede usarse dentro del método de la presente invención para escindir el segmento de horquilla. Se sabe que las enzimas Bst4CI, HpyCH4III y TaaI reconocen el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-ACAGT-3'.
Por consiguiente, si el segmento de horquilla del polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y una forma de horquilla de acuerdo con la presente invención comprende el sitio de reconocimiento de enzima de restricción 5'-TCAGA-3', la enzima de restricción afín Hpy188I puede utilizarse en el método de la presente invención para escindirlo. Alternativamente, si el segmento de horquilla del polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y una forma de horquilla de acuerdo con la presente invención comprende el sitio de reconocimiento de enzima de restricción 5'-ACAGT-3', la enzima de restricción afín Bst4CI, HpyCH4III o Taal pueden utilizarse en el método de la presente invención para escindirlo.
El segmento de horquilla del polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y una forma de horquilla de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente puede, en realizaciones específicas, comprender adicionalmente una sección de código de barras. De la manera que se usa en la presente, el término “sección de código de barras” se refiere a una secuencia que se incluye artificialmente en el polinucleótido y que sirve para fines de identificación después del paso de caracterización, por ejemplo, después de la secuenciación. El segmento de código de barras puede, por lo tanto, informar al usuario cuál de varias muestras se caracteriza, por ejemplo, secuencia. Por consiguiente, una sección de código de barras comprende una secuencia única que se proporciona sólo una vez, es decir, sólo para una molécula/polinucleótido como se describió anteriormente. La secuencia del código de barras es preferiblemente diferente de los motivos de secuencia de origen natural conocidos. En otras realizaciones, es preferiblemente lo suficientemente larga para evitar confusiones con secuencias de origen natural o diferentes secuencias de códigos de barras. De acuerdo con realizaciones preferidas, la secuencia de código de barras tiene una longitud de al menos 6 a aproximadamente 12 o más nucleótidos. En ciertas realizaciones, un segmento de código de barras puede estar presente una o varias veces en el polinucleótido de la presente invención. Si hay más de un segmento de código de barras, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 o más, la diferenciación, es decir, la secuencia de indexación de cada segmento es diferente, lo que permite dos o más procesos de identificación independientes. El experto en la técnica conocerá más detalles, o se pueden derivar de fuentes bibliográficas adecuadas, tal como Kozarewa et al., 2011, Methods Mol. Biol.
733, 279-298.
En un paso adicional del método de la presente invención, un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol se conectan al polinucleótido obtenido en el paso anterior, es decir, un polinucleótido de ARN asociado con un polinucleótido como se definió anteriormente en la presente, que se ha escindido en la porción de horquilla de dicho polinucleótido. De la manera que se usa en la presente, el término “complejo de polinucleótido adaptador” se refiere a un complejo de polinucleótidos no de ARN que comprende, entre otras cosas, una secuencia que facilita la entrada de una enzima translocasa de ARN en un poro transmembrana. En realizaciones específicas de la presente invención, dicho complejo polinucleotídico adaptador comprende un par de dos polinucleótidos no de ARN al menos parcialmente complementarios. El polinucleótido no de ARN puede comprender uno o más nucleótidos no de ARN; es preferiblemente un polinucleótido de ADN.
La porción del complejo adaptador que está asociada con una enzima translocasa de ARN puede, en ciertas realizaciones, comprender una secuencia líder. Normalmente, dicha secuencia líder se pliega en el poro transmembrana como se describe en la presente. La secuencia líder puede comprender además segmentos adicionales, tales como uno o más espaciadores. El espaciador puede, por ejemplo, comprender una secuencia que sea capaz de detener la translocasa de a Rn . Se prefiere particularmente que la secuencia líder comprenda un sitio de unión para una enzima translocasa de ARN. De la manera que se usa en la presente, el término “sitio de unión de la enzima translocasa de ARN” incluye una secuencia de ADN o un análogo de ADN de una longitud que permite que una o más enzimas translocasa de ARN se unan a ella. La longitud del sitio de unión depende normalmente del número de enzimas de translocasa de ARN que deben unirse al mismo. La región a la que es capaz de unirse una enzima translocasa de ARN es preferiblemente un polinucleótido, tal como ADN, un polinucleótido modificado (por ejemplo, un ADN abásico), APN, ANB o polietilenglicol (PEG). Preferiblemente, el sitio de unión de la enzima translocasa de ARN es una región no hibridada monocatenaria. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, dicho complejo polinucleotídico adaptador está unido previamente a una o más translocasas de ARN. De la manera que se usa en la presente, el término “translocasa de ARN” se refiere a una proteína motora, que es capaz de interactuar con un poro transmembrana como se describe en la presente y que, en consecuencia, transporta un polinucleótido como una entidad monocatenaria a través de dicho poro, es decir, controla la translocación de un polinucleótido como se describe en la presente, por ejemplo, un polinucleótido de ARN como se definió anteriormente. Los ejemplos de translocasas adecuadas incluyen helicasa SF2, helicasa NS3, helicasa NPH-II, helicasa Upf1 o translocasa RIG-I o derivados de las mismas, o un derivado de una helicasa de ADN, tal como helicasa Hel308, helicasa RecD, helicasa XPD o helicasa Dda que es capaz de translocar polinucleótidos de ARN.
En realizaciones adicionales, la secuencia líder puede comprender uno o más sitios de bloqueo que son capaces de prevenir los movimientos hacia atrás de la enzima translocasa de ARN o cualquier escape de dichas enzimas del poro transmembrana.
El complejo de polinucleótido adaptador puede además estar asociado con o comprender un segmento de enlace. De la manera que se usa en la presente, el término “segmento de enlace” se refiere a un elemento que es capaz de acoplar el complejo de polinucleótido adaptador y cualquier otro elemento conectado a él a una membrana bicapa. El acoplamiento es normalmente transitorio y lo transmite cualquier molécula adecuada, preferiblemente una entidad de colesterol o un ácido graso, más preferiblemente una entidad de colesterol, tal como una molécula de colesterol-TEG. En consecuencia, el acoplamiento ayuda a anclar el complejo de polinucleótido adaptador y sus elementos asociados en o cerca del poro transmembrana y, por lo tanto, permite que la introducción del polinucleótido de ARN entre en el poro transmembrana y se caracterice.
Los compuestos alternativos que pueden usarse para acoplarse a una membrana comprenden biotina, tiol o lípidos. El enlace normalmente comprende, además de la funcionalidad de acoplamiento, un polinucleótido no de ARN como se definió anteriormente, que está conectado a dicha entidad de acoplamiento, por ejemplo, una entidad de colesterol. El segmento de enlace puede comprender además uno o más segmentos enlazadores, por ejemplo, una porción de longitud variable, que se puede emplear para aumentar la distancia entre el polinucleótido de ARN objetivo y el poro transmembrana para facilitar su caracterización. El enlazador puede, en realizaciones adicionales, comprender un sitio de unión a la enzima translocasa de ARN como se definió anteriormente en la presente.
La conexión del complejo polinucleotídico con el polinucleótido obtenido en el paso anterior puede realizarse mediante pasos de hibridación y ligadura. Por ejemplo, un saliente T 5' de una cadena de dicho polinucleótido adaptador puede hibridarse con un saliente A 3' en el polinucleótido que comprende el segmento de horquilla de acuerdo con la presente invención después de la escisión con una enzima de restricción como se definió anteriormente en la presente. Alternativamente, se puede utilizar cualquier otro enfoque de conexión adecuado, por ejemplo, un enlace químico mediante química clic o enlaces covalentes, etc. Se prefiere que dicha conexión se realice de manera que la enzima translocasa de ARN se conecte al polinucleótido de ARN que se caracterizará, y que el elemento de unión se conecte a la cadena complementaria, por ejemplo, que comprende una parte del segmento de horquilla como se definió anteriormente en la presente, que también comprende opcionalmente una secuencia de ADNc producida por la transcriptasa inversa como se describió anteriormente en la presente. Una visión general esquemática de la configuración del complejo después de que el complejo adaptador se haya conectado al polinucleótido como se define en la presente y al polinucleótido de ARN objetivo se puede derivar de la Figura 2, designadores 8 y 9. Esta configuración permite caracterizar el polinucleótido de ARN objetivo, mientras que cualquier cadena de ADNc opcionalmente presente preferiblemente no se caracteriza, sino que se proporciona por razones de estabilidad y conformación.
En un paso adicional del presente método, el polinucleótido de ARN modificado obtenido en el paso anterior (v) se pone en contacto con un poro transmembrana de tal manera que la translocasa de ARN controla el movimiento del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana y el anclaje de colesterol ancla el polinucleótido de ARN en la vecindad del poro transmembrana. Normalmente, la función de un anclaje de enlace como se describe en la presente es llevar las moléculas a la superficie de la membrana, en donde se encuentra el poro transmembrana. En este escenario, la caracterización del polinucleótido de ARN se facilita ya que se puede llegar más fácilmente al poro transmembrana. De la manera que se usa en la presente, el término “poro transmembrana” se refiere a una proteína que atraviesa una membrana bicapa que comprende una abertura que es capaz de guiar a través de un polinucleótido, preferiblemente un polinucleótido de a Rn o ADN, o una versión modificada del mismo, por ejemplo, que comprende uno o más nucleótidos de origen no natural, tales como isoG o isoC, o derivados de los mismos. El poro transmembrana puede ser cualquier proteína adecuada. Los ejemplos de proteínas transmembrana preferidas incluyen un poro de proteína derivado de hemolisina, leucocidina, MspA, MspB, MspC, MspD, CsgG, lisenina, porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipasa A de membrana externa, lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP) o WZA. También se prevén proteínas de poros transmembrana disponibles comercialmente, tales como las proteínas de poros ofrecidas o descritas por Oxford Nanopore Technology.
En un último paso del presente método, se toman una o más mediciones durante el movimiento del polinucleótido de ARN a través de dicho poro transmembrana. Dichas mediciones pueden ser indicativas de una o más características del polinucleótido de ARN, lo que permite caracterizar el polinucleótido de ARN objetivo. De la manera que se usa en la presente, el término “medición” se refiere a mediciones ópticas y/o eléctricas, preferiblemente a mediciones eléctricas en el poro transmembrana. Normalmente, la corriente que pasa a través del poro transmembrana se mide cuando el polinucleótido de ARN objetivo o un polinucleótido de ADNc complementario a dicho polinucleótido de ARN pasa a través del poro transmembrana. La corriente medida suele ser indicativa de una o más características de los polinucleótidos analizados. El método puede, por ejemplo, realizarse utilizando un aparato como se describe en la técnica anterior, por ejemplo, descrito en principio en el documento WO 2008/102120, o derivados o versiones modificadas del mismo. En general, los métodos pueden llevarse a cabo usando un parche o un voltaje de sujeción para detectar cambios en la corriente a través del poro transmembrana cuando el polinucleótido se transloca a través de dicho poro. En ciertas realizaciones, la medición incluye el uso de un portador de carga, tal como sales metálicas, sales de cloruro, líquidos iónicos, sales orgánicas, en particular NaCl, KCl, CsCl; además se prevé el uso de una solución amortiguadora adecuada, por ejemplo, HEPES, Tris-HCl, etc.; además se prevé el uso de nucleótidos, por ejemplo, AMP, ADP, ATP, dAMP, dADP, dATP, etc., que pueden emplearse para la actividad de translocasa; y cofactores enzimáticos, tales como iones de metales divalentes, incluyendo Mg2+, Ca2+, Co2+.
Una de las características del polinucleótido de ARN a determinar de acuerdo con la presente invención es, en una realización (i), la longitud del polinucleótido de ARN. El método permite además la determinación de un polinucleótido de ADNc que se proporciona opcionalmente mediante transcripción inversa, siendo complementario a dicho polinucleótido de ARN. La longitud, como se mencionó anteriormente, puede medirse contando el número de interacciones, es decir, cambios de corriente, en el poro transmembrana. Dado que por cada nucleótido que pasa por el poro se espera un cambio de corriente, la suma de dichas interacciones proporciona una indicación de la longitud del polinucleótido analizado.
Otra característica del polinucleótido de ARN a determinar de acuerdo con la presente invención es, en una realización adicional (ii), la identidad del polinucleótido de ARN. Esta característica puede determinarse, por ejemplo, al determinar la secuencia del polinucleótido como se describe a continuación en la presente, o al determinar motivos o elementos específicos dentro de un polinucleótido que permitan derivar la identidad del polinucleótido, por ejemplo, un código de barras, etc., al escanear dichos elementos.
Otra característica del polinucleótido de ARN a determinar de acuerdo con la presente invención es, en una realización adicional (iii), la secuencia del polinucleótido de ARN. Esta característica puede determinarse, por ejemplo, al determinar la secuencia del polinucleótido como se describe en Shaghayegh et al., 2016, J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 413001; o en Timp et al., IEEE Trans Nanotechnol., 2010, 9, 3, 281-294. En general, cada uno de los nucleótidos A, U, G, C medidos que pasan a través del poro transmembrana produce un patrón de corriente eléctrica único que puede medirse, representando así la secuencia del polinucleótido.
Otra característica del polinucleótido de ARN a determinar de acuerdo con la presente invención es, en otra realización (iv), la presencia de una modificación de nucleótido en el polinucleótido de ARN. Normalmente, la modificación específica del polinucleótido de ARN conducirá a un patrón de corriente específico, que puede registrarse y correlacionarse con dichas modificaciones. Por ejemplo, el ADN se puede distinguir del ARN con base en la diferente composición química de ambas entidades.
Se prefiere que la característica a determinar sea la secuencia del polinucleótido de ARN objetivo.
En un aspecto diferente, la presente invención contempla un método de preparación de un polinucleótido de ARN para la secuenciación transmembrana que comprende los siguientes pasos:
(i) proporcionar un polinucleótido de ARN;
(ii) modificar dicho polinucleótido de ARN al hibridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG;
(iii) opcionalmente, realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN;
(iv) escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3'; y
(v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv).
Las características del método de preparación mencionado corresponden a las características definidas anteriormente en la presente. El producto obtenido mediante el método descrito anteriormente para preparar un polinucleótido de ARN para la secuenciación transmembrana puede usarse para actividades de secuenciación posteriores como se explicó anteriormente en la presente. El producto puede, en realizaciones alternativas, almacenarse para pasos posteriores o enviarse a diferentes ubicaciones, etc. También se contemplan pasos de modificación adicionales que no conducen directamente a una caracterización de la molécula mediante secuenciación de transmembrana. En una realización específica, el método de preparación de un polinucleótido de ARN para la secuenciación de transmembrana sólo puede comprender los pasos (i) a (iv) como se definió anteriormente en la presente. También se prevé un método que comprende sólo los pasos (i) y (ii) como se definió anteriormente en la presente, o los pasos (i) a (iii) como se definió anteriormente en la presente.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo que comprende un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde la forma de horquilla comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG, que comprende preferiblemente un polinucleótido con un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla como se definió.
Las características del método como se definió en la presente anteriormente se aplican también al kit de la presente invención, como se define en la reivindicación 12 adjunta. El kit puede, por ejemplo, comprender reactivos y componentes como se define en uno o más pasos de los presentes métodos. Por ejemplo, el kit puede comprender reactivos o componentes para modificar el polinucleótido de ARN al hibridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla como se definió anteriormente. En una realización diferente, el kit puede comprender o puede comprender además reactivos o componentes para realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN. En una realización adicional, el kit puede comprender o puede comprender además reactivos o componentes para escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3'. En una realización adicional, el kit puede comprender o puede comprender además reactivos o componentes para conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido como se describe en la presente. En una realización adicional, el kit puede comprender o puede comprender además reactivos o componentes para poner en contacto el polinucleótido de ARN modificado como se define en la presente con un poro transmembrana, de modo que la translocasa de ARN controle el movimiento del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana y el enlace de colesterol ancla el polinucleótido de ARN en la vecindad del poro transmembrana. En otra realización más, el kit puede comprender o puede comprender además reactivos o componentes que toman una o más mediciones durante el movimiento del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana, en donde las mediciones son indicativas de una o más características del polinucleótido de ARN, caracterizando así el polinucleótido de ARN objetivo, como se definió anteriormente. El kit puede comprender además dos o más de los grupos de componentes o reactivos definidos anteriormente, por ejemplo, componentes o reactivos para realizar 2 pasos como se define en la presente, 3 pasos como se define en la presente, 4 pasos como se define en la presente, etc.
El kit puede, en general, comprender soluciones amortiguadoras adecuadas, etiquetas o líquidos de lavado, etc. Además, el kit puede comprender una cantidad de una molécula de ácido nucleico o proteína conocida, que puede usarse para una calibración del kit o como un control interno. Los ingredientes correspondientes serán conocidos por el experto en la técnica.
Además, el kit puede comprender un folleto de instrucciones y/o puede proporcionar información sobre su uso, etc.
También se contempla, pero no forma parte de la invención reivindicada, un aparato que realiza los pasos del método mencionado anteriormente. El aparato puede, por ejemplo, estar compuesto por diferentes módulos que pueden realizar uno o más pasos del método de la presente invención. Estos módulos pueden combinarse de cualquier forma adecuada, por ejemplo, pueden estar presentes en un único lugar o pueden estar separados. También se prevé la realización del método en diferentes momentos y/o en diferentes lugares. Algunos pasos del método, tal como se define en la presente, pueden seguirse de descansos o pausas, en donde los reactivos o productos, etc., se almacenan adecuadamente, por ejemplo, en un recipiente o un dispositivo de refrigeración. En caso de que estos pasos se realicen en módulos específicos de un aparato como se define en la presente, dichos módulos pueden utilizarse como vehículo de almacenamiento. Los módulos también se pueden usar para transportar productos de reacción o reactivos a una ubicación diferente, por ejemplo, otro laboratorio, etc.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde la forma de horquilla comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG para la modificación de un polinucleótido de ARN, preparando así dicho polinucleótido de ARN para una secuenciación directa de ARN a través de un poro transmembrana. Las características del método como se define anteriormente en la presente también se aplican al uso de un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, en donde la forma de horquilla comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG para la modificación de un polinucleótido de ARN de la presente invención.
Nuevamente con referencia a la Figura 1, se muestra una ilustración esquemática de un enfoque de secuenciación de ARN limitado a polinucleótidos de ARN 1 que comprenden colas poli-A, es decir, polinucleótidos de ARN de longitud completa. A estas moléculas como cebador poli-T 2 se híbrida 3. La molécula 4 parcialmente bicatenaria resultante se puede transcribir de forma inversa 5, lo que da como resultado un híbrido de ARN/ADNc 6. Posteriormente, un adaptador de secuenciación 7 que comprende una translocasa y un elemento de enlace se liga 8 al híbrido 6, lo que da como resultado un híbrido de ARN/ADNc preparado para la secuenciación 9. En un paso siguiente, el híbrido de ARN/ADNc preparado para la secuenciación 9 se transloca 10 a un poro transmembrana 11, en donde se caracteriza, es decir, se secuencia, el polinucleótido de ARN 1. Para los dos primeros pasos es habitual un tiempo de aproximadamente 100 minutos (12). Para los siguientes pasos es normal un período de tiempo de 15 minutos (13).
La Figura 2 muestra una ilustración esquemática de los pasos del método de acuerdo con la presente invención que funciona con todo tipo de polinucleótidos de ARN 20, incluyendo los polinucleótidos de ARN que comprenden la cola poli-A y los polinucleótidos de ARN que no comprenden la cola poli-A. A dicho polinucleótido de ARN 20 un cebador de horquilla con un multímero aleatorio 21 se hibrida 22, lo que da como resultado un ácido nucleico 23 parcialmente bicatenario. A continuación, se puede realizar opcionalmente una transcripción inversa 24, lo que da como resultado un híbrido de ARN/ADNc con estructura de cebador de horquilla 25. En un paso siguiente, el cebador de horquilla se escinde 26 con una enzima de restricción para producir un híbrido de ARN/ADNc con un saliente A 27. Posteriormente, un adaptador de secuenciación 7 que comprende una translocasa y un elemento de enlace 7 se liga 8 al híbrido 27, lo que da como resultado un híbrido de ARN/ADNc preparado para la secuenciación 9. En el paso final, el híbrido de ARN/ADNc preparado para la secuenciación 9 se transloca 10 a un poro transmembrana 11, donde se caracteriza, es decir, se secuencia, el polinucleótido de ARN 20.
La Figura 3 muestra un ejemplo de una forma de horquilla que comprende un polinucleótido de acuerdo con una realización de la presente invención. El polinucleótido de horquilla 21 comprende un segmento de bucle 30, un sitio de reconocimiento de enzima de restricción 31, pares de bases 5-metil-isoC-isoG 32, así como un segmento de multímero aleatorio 33.
Lista de numerales de referencia
1 Polinucleótidos de ARN que comprenden colas poli-A
2 Cebador poli-T
3 Reacción de hibridación
4 Molécula parcialmente bicatenaria
5 Reacción de transcripción inversa
6 Híbrido de ARN/ADNc
7 Adaptador de secuenciación que comprende una translocasa y un elemento de enlace
8 Reacción de ligadura
9 Híbrido de ARN/ADNc preparado para secuenciación
10 Translocación al poro transmembrana
11 Poro transmembrana
12 Período de tiempo para los dos primeros pasos
13 Periodo de tiempo para los últimos pasos
20 Todo tipo de polinucleótidos de ARN
21 Cebador de horquilla con un multímero aleatorio
22 Reacción de hibridación con cebador de horquilla
23 Ácido nucleico parcialmente bicatenario que comprende el cebador de horquilla con un multímero aleatorio
24 Reacción de transcripción inversa a partir de un cebador de horquilla con un multímero aleatorio
25 Híbrido de ARN/ADNc con estructura de cebador de horquilla
26 Escisión con enzima de restricción en cebador de horquilla
27 Híbrido de ARN/ADNc con un saliente A
30 Segmento de bucle
31 Sitio de reconocimiento de enzimas de restricción
32 Pares de bases 5-metil-isoC-isoG
33 Segmento de multímero aleatorio
Las siguientes figuras se proporcionan con fines ilustrativos. Por lo tanto, se entiende que las figuras no deben interpretarse como limitativas. El experto en la técnica podrá prever claramente otras modificaciones de los principios expuestos en la presente.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo que comprende:
(i) proporcionar un polinucleótido de ARN;
(ii) modificar dicho polinucleótido de ARN al hibridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' monocatenario y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG;
(iii) opcionalmente realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN;
(iv) escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3';
(v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv);
(vi) poner en contacto el polinucleótido de ARN modificado obtenido en el paso (v) con un poro transmembrana de manera que la translocasa de ARN controle el movimiento del polinucleótido de ARN a través del poro transmembrana y el enlace de colesterol ancle el polinucleótido de ARN en la vecindad del poro transmembrana; y
(vii) tomar una o más mediciones durante el movimiento del polinucleótido de ARN a través de dicho poro transmembrana, en donde las mediciones son indicativas de una o más características del polinucleótido de ARN, caracterizando así el polinucleótido de ARN objetivo.
2. Un método para preparar un polinucleótido de ARN objetivo para la secuenciación de transmembrana que comprende:
(i) proporcionar un polinucleótido de ARN;
(ii) modificar dicho polinucleótido de ARN al hi bridar y ligar un polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' monocatenario y que tiene una forma de horquilla, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla es un polinucleótido de ADN que comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG;
(iii) opcionalmente realizar una transcripción inversa del polinucleótido de ARN;
(iv) escindir el segmento de horquilla de dicho polinucleótido hibridado para producir un saliente A 3'; y
(v) conectar un complejo de polinucleótido adaptador asociado con una enzima translocasa de ARN y al menos un segmento de enlace de colesterol al polinucleótido obtenido en el paso (iv).
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dichos pares de bases 5-metil-isoC-isoG se proporcionan al menos en cada 4a, 5a o 6a posición del polinucleótido de horquilla.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho segmento de multímero aleatorio es un segmento de hexámero aleatorio, heptámero aleatorio, octámero aleatorio, nonámero aleatorio o decámero aleatorio, preferiblemente un segmento de hexámero aleatorio.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla comprende un sitio de reconocimiento de enzima de restricción de la secuencia 5'-ACAGT-3' o 5'-TCAGA-3'.
6. El método de la reivindicación 5, en donde se utiliza la enzima Hpy188I para escindir el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-TCAGA-3'; o en donde se utiliza la enzima Bst4CI, HpyCH4III o Taal para escindir el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción 5'-ACAGT-3'.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho polinucleótido que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla comprende además una sección de código de barras.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 7, en donde dichas una o más características del polinucleótido de ARN son (i) la longitud del polinucleótido de ARN, (ii) la identidad del polinucleótido de ARN, (iii) la secuencia del polinucleótido de ARN y (iv) la presencia de una modificación de nucleótidos en el polinucleótido de ARN, preferiblemente la secuencia del polinucleótido de ARN.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho polinucleótido de ARN es cualquier polinucleótido de ARN, tal como ARNm, un fragmento de ARNm, pre-ARNm, ARNnc, ARNr, miARN, ARNnop, srRNA, ARNtm, ARNip o ARNpi.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 9, en donde dicha translocasa de ARN es helicasa SF2, helicasa NS3, helicasa NPH-II, helicasa Upf1 o translocasa RIG-I o derivados de las mismas, o un derivado de una helicasa de ADN, tal como helicasa Hel308, helicasa RecD, helicasa XPD o helicasa Dda que es capaz de translocar polinucleótidos de ARN.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 10, en donde dicha proteína de poro transmembrana es una proteína de poro derivada de hemolisina, leucocidina, MspA, MspB, MspC, MspD, CsgG, lisenina, porina F de membrana externa (OmpF), porina G de membrana externa (OmpG), fosfolipasa A de membrana externa, lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP) o WZA.
12. Un kit para caracterizar un polinucleótido de ARN objetivo que comprende un polinucleótido de ADN que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' y que tiene una forma de horquilla, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la forma de horquilla comprende pares de bases 5-metil-isoC-isoG, en donde dichos pares de bases 5-metil-isoC-isoG se proporcionan al menos en cada 4a, 5a o 6a posición del segmento de horquilla.
13. Un uso de un polinucleótido de ADN que comprende un segmento de multímero aleatorio terminal 3' monocatenario y que tiene una forma de horquilla, en donde la forma de horquilla comprende uno o más pares de bases 5-metil-isoC-isoG para la modificación de un polinucleótido de ARN, preparando así dicho polinucleótido de ARN para una secuenciación directa de ARN a través de un poro transmembrana.
ES18205148T 2018-11-08 2018-11-08 Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla Active ES2927412T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18205148.2A EP3650559B1 (en) 2018-11-08 2018-11-08 Direct rna nanopore sequencing with help of a stem-loop polynucleotide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2927412T3 true ES2927412T3 (es) 2022-11-04

Family

ID=64267654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18205148T Active ES2927412T3 (es) 2018-11-08 2018-11-08 Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla

Country Status (4)

Country Link
US (2) US11505824B2 (es)
EP (1) EP3650559B1 (es)
CN (1) CN111154845B (es)
ES (1) ES2927412T3 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017131124A1 (ja) * 2016-01-26 2017-08-03 日産化学工業株式会社 一本鎖オリゴヌクレオチド
ES2927412T3 (es) 2018-11-08 2022-11-04 Siemens Healthcare Gmbh Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla
WO2022107814A1 (ja) * 2020-11-18 2022-05-27 株式会社イクスフォレストセラピューティクス 変異プロファイリングのためのｒｎａプローブ及びその使用
CN116964221A (zh) * 2021-02-18 2023-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 阻止测序期间核酸模板穿过纳米孔的结构
GB202107192D0 (en) * 2021-05-19 2021-06-30 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2023125605A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 深圳华大生命科学研究院 单分子纳米孔测序方法
CN118679255A (zh) * 2021-12-31 2024-09-20 深圳华大生命科学研究院 能够阻断马达蛋白的核酸分子及其构建方法和用途
US20230257789A1 (en) * 2022-02-11 2023-08-17 Microsoft Technology Licensing, Llc Enzymatic oligonucleotide assembly using hairpins and enzymatic cleavage
WO2023196738A1 (en) * 2022-04-05 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Nanopore sequencing of rna using reverse transcription
CN118957022B (zh) * 2024-10-16 2025-01-21 新生命基因科技(杭州)有限公司 一种接头组合物和小rna文库及其构建方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003303395A1 (en) * 2001-05-22 2004-07-22 Dahl, Gary, A. Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase
US7906280B2 (en) * 2005-05-13 2011-03-15 Bruno John G Methods of producing intrachain fluorophore-quencher FRET-aptamers and assays
WO2008102120A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Oxford Nanopore Technologies Limited Lipid bilayer sensor system
US20090023190A1 (en) * 2007-06-20 2009-01-22 Kai Qin Lao Sequence amplification with loopable primers
US9175338B2 (en) * 2008-12-11 2015-11-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for identifying nucleic acid modifications
EP2895618B1 (en) * 2012-09-14 2017-07-26 Oxford Nanopore Technologies Limited Sample preparation method
US20170067097A1 (en) * 2014-04-11 2017-03-09 Redvault Biosciences, Lp Systems and methods for clonal replication and amplification of nucleic acid molecules for genomic and therapeutic applications
US10443097B2 (en) 2014-05-02 2019-10-15 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Method of improving the movement of a target polynucleotide with respect to a transmembrane pore
KR102457147B1 (ko) * 2014-10-17 2022-10-19 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 피엘씨 나노 세공 rna 특징 규명을 위한 방법
CN109310784B (zh) 2015-12-07 2022-08-19 阿克生物公司 用于制备和使用指导核酸的方法和组合物
EP3650558A1 (en) 2018-11-07 2020-05-13 Siemens Healthcare GmbH Liquid sample workflow for nanopore sequencing
ES2927412T3 (es) * 2018-11-08 2022-11-04 Siemens Healthcare Gmbh Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla

Also Published As

Publication number Publication date
US20200149101A1 (en) 2020-05-14
EP3650559A1 (en) 2020-05-13
US11505824B2 (en) 2022-11-22
US12486533B2 (en) 2025-12-02
CN111154845A (zh) 2020-05-15
US20230295713A1 (en) 2023-09-21
EP3650559B1 (en) 2022-06-29
CN111154845B (zh) 2023-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2927412T3 (es) Secuenciación directa de nanoporos de ARN con la ayuda de un polinucleótido de horquilla
US11459602B2 (en) Method for generating double stranded DNA libraries and sequencing methods for the identification of methylated cytosines
ES2841077T3 (es) Enriquecimiento de dianas por extensión del cebador de sonda individual
US10870845B2 (en) Methods for capturing nucleic acids
ES3030708T3 (en) Liquid sample workflow for nanopore sequencing
US20210017580A1 (en) Small rna detection method based on small rna primed xenosensor module amplification
CN112041461A (zh) 用于将衔接子附接至双链多核苷酸的单链区的方法
CN107002147B (zh) 用于俘获核酸的方法
ES3057312T3 (en) Methods for amplifying nucleic acids on substrates
ES2972957T3 (es) Método novedoso
ES3015628T3 (en) Method for amplifying nucleotide sequence, and sequence determination method
US20240209414A1 (en) Novel nucleic acid template structure for sequencing
CN118475704A (zh) 核酸表征
US20060110745A1 (en) Method for amplifying nucleic acids
JP2022536907A (ja) 連結された標的捕捉
Stelzl et al. SERF: in vitro selection of random RNA fragments to identify protein binding sites within large RNAs
Strobel et al. Chemical transcription roadblocking for nascent RNA display
JP4187057B2 (ja) 核酸合成法
AU2020396889A1 (en) Preparation of DNA sequencing libraries for detection of DNA pathogens in plasma