ES2927505T3 - Marcadores de metilación para cáncer pancreático - Google Patents
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Abstract
Se proporciona un método para determinar el cáncer de páncreas basado en marcadores de metilación específicos, donde los marcadores de metilación se identifican en ADN libre de células que se puede obtener de muestras de sangre. Además, se describe el tratamiento del cáncer de páncreas. También se proporcionan cebadores específicos para su uso en la determinación del cáncer de páncreas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Marcadores de mutilación para cáncer pancreático
Campo técnico
La presente invención se refiere a la detección y el tratamiento del cáncer pancreático.
Antecedentes
El cáncer pancreático es la 4' causa de muerte por cáncer en el mundo, aunque solo representa 2-3% de todos los casos de cáncer. Es uno de los cánceres más mortales con una tasa de supervivencia a 5 años de menos de 10%. La única posibilidad de curación radica en la detección temprana y la resección completa del tumor. Desafortunadamente solo 10-20% de los cánceres se pueden resecar de forma curativa en el momento del diagnóstico y, a pesar de la cirugía, muchos pacientes experimentan recurrencia. El tiempo medio de supervivencia de los pacientes que no se someten a cirugía es de 3 a 6 meses desde el momento del diagnóstico. Una de las principales razones de la alta mortalidad son las dificultades en la detección temprana debido a la falta de síntomas o a la falta de síntomas específicos durante la estadio temprana de la enfermedad. El dolor abdominal, la pérdida de peso, la fatiga y la ictericia son muy similares a los síntomas relacionados con la pancreatitis crónica, que es un diagnóstico diferencial esencial y un factor de riesgo conocido del cáncer pancreático.
Actualmente, CA-19-9 (antígeno de carbohidratos) es el mejor marcador en sangre para el cáncer pancreático. Los niveles de CA-19-9 pueden estar elevados en el cáncer pancreático, pero con frecuencia solo en la enfermedad avanzada. La elevación de CA-19-9 también se observa en otros tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias como la pancreatitis crónica y especialmente en condiciones de obstrucción biliar benigna. Aproximadamente el 10% de la población carece de la capacidad de producir CA-19-9, lo que hace que CA-19-9 sea insuficiente como marcador de diagnóstico temprano. En el diagnóstico del cáncer pancreático, las modalidades de imagen avanzadas, tales como el escáner PET-CT/tres-fases-CT son necesarios la ecografía transabdominal, la ecoendoscopia, la ecografía laparoscópica y la CPRE. El inconveniente es que varios de estos métodos son invasivos y conllevan un riesgo de complicaciones. Por lo tanto, sería un gran avance para los pacientes si se pudiera usar un marcador basado en sangre para el diagnóstico.
Las células cancerosas liberan ADN libre de células en la sangre. Los fragmentos de ADN tienen una longitud de aproximadamente 160 pares de bases equivalentes al ADN nucleosómico. El ADN libre de células se puede detectar en plasma y suero. Los cambios en el ADN son potencialmente específicos del tumor y se pueden utilizar en el desarrollo de un marcador de diagnóstico basado en sangre para el cáncer pancreático.
Durante el desarrollo del cáncer pancreático surgen cambios genéticos y epigenéticos. Las modificaciones epigenéticas ocurren a nivel genómico, lo que no cambiará la secuencia de las bases del ADN. Las modificaciones epigenéticas cambian la conformación del ADN y, como consecuencia, cambiará la expresión de los genes. Las principales modificaciones epigenéticas incluyen, entre otras, la hipermetilación del ADN, que consiste en la adición de un residuo metilo (CH3) en la citosina que precede a una guanosina, conocidos como dinucleótidos CpG. La hipermetilación del ADN a menudo ocurre en regiones ricas en CpG (islas CpG) de la secuencia promotora de los genes. La hipermetilación en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores da como resultado la regulación a la baja o el silenciamiento de la función supresora de tumores. La hipermetilación del ADN se puede detectar en el ADN libre de células y los cambios son potencialmente específicos del tumor y se pueden usar en el desarrollo de un marcador de diagnóstico basado en sangre para el cáncer pancreático.
La hipermetilación del ADN libre de células como marcador sanguíneo para el cáncer pancreático hasta ahora solo se ha estudiado en pocos y pequeños estudios que prueban el estado de metilación de un solo gen o un pequeño panel de genes. Se ha encontrado una diferencia estadísticamente significativa en la hipermetilación del ADN entre pacientes con cáncer pancreático y controles sanos. Sin embargo, es difícil diferenciar entre enfermedad pancreática maligna y benigna en función de los cambios en el estado de hipermetilación. Ninguno de los genes examinados anteriormente tiene el potencial de funcionar como un marcador de diagnóstico individual.
La presente divulgación proporciona un amplio panel de genes, que es capaz de determinar el cáncer pancreático con alta sensibilidad y especificidad.
Compendio
En un aspecto, se proporciona un método para determinar el cáncer pancreático, una predisposición al cáncer pancreático, el pronóstico de un cáncer pancreático, y/o monitorear un cáncer pancreático en un sujeto humano, comprendiendo dicho método en ADN libre de células de una muestra de sangre de dicho sujeto humano determinar el estado de metilación de al menos dos loci de genes seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM. En otro aspecto, se proporciona un método para evaluar si un sujeto humano tiene cáncer pancreático y/o una predisposición al cáncer pancreático, evaluar el pronóstico de un cáncer pancreático de un cáncer pancreático, y/o seguimiento de un cáncer pancreático, comprendiendo dicho método
a) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto humano,
b) aislar ADN libre de células de dicha muestra de sangre,
c) determinar en dicha muestra el estado de metilación de al menos dos loci génicos seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM,
d) sobre la base de dicho estado de metilación identificar a un sujeto humano que tiene cáncer pancreático y/o una predisposición al cáncer pancreático tiene más probabilidades de desarrollar cáncer pancreático.
Descripción de los dibujos
Figura 1: Diagrama de flujo de los pacientes incluidos en el estudio. A) Inclusión de pacientes con adenocarcinoma pancreático. B) Inclusión de pacientes con pancreatitis crónica. C) Inclusión de pacientes con pancreatitis aguda.
Figura 2: Selección paso a paso de genes para el modelo de predicción de diagnóstico de cáncer pancreático. Figura 3: Rendimiento del Modelo 13 en cáncer pancreático en estadio I, II, III y IV. Modelo 13 (edad>65, BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2) AUC= 086 (punto de corte de probabilidad de 05; sensibilidad 7579% y especificidad 8306%).
Figura 4: Rendimiento del Modelo 13 en cáncer pancreático en estadio I y II. Modelo 13 (edad>65, BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2) AUC= 086 (punto de corte de probabilidad de 05; sensibilidad 7250% y especificidad 8306%).
Figura 5: Tabla con datos descriptivos de los pacientes del ejemplo 1.
Figura 6: Frecuencias de hipermetilación para cada gen en cada grupo.
Figura 7: Diagrama de flujo de los pacientes incluidos en el estudio.
Figura 8: Selección paso a paso de genes para el modelo de predicción del pronóstico del cáncer pancreático (estadios AJCC*; I, II, III vs IV).
Figura 9: Rendimiento de la predicción pronóstica Modelo 10; cáncer pancreático en estadio AJCC* I, II, III vs IV
Figura 10: Selección paso a paso de genes para el modelo de predicción del pronóstico del cáncer pancreático (estadios AjCC*; I, II, III vs IV).
Figura 11: Desempeño de la predicción pronóstica Modelo 7; cáncer pancreático en estadio AJCC* I, II, III vs IV del
Figura 12: Genes con diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de hipermetilación entre las estadios AJCC del cáncer
Figura 13: Frecuencias de hipermetilación para cada gen según la estadificación del AJCC Descripción detallada
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos
La presente invención se refiere a biomarcadores de mutilación detectables en ADN libre de células plasmáticas para su uso en el diagnóstico y tratamiento del cáncer pancreático. Generalmente, los marcadores de metilación de la invención se pueden usar en métodos para identificar sujetos humanos que están predispuestos al cáncer pancreático; es decir, sujetos que tienen una mayor probabilidad de desarrollar cáncer pancreático. Los marcadores de metilación de la invención también se pueden usar en métodos para identificar sujetos que tienen cáncer pancreático y, en este caso, los marcadores permiten un diagnóstico temprano. Además, los marcadores de la invención proporcionan información de pronóstico con respecto al cáncer pancreático y, por lo tanto, los marcadores se pueden usar para identificar a un sujeto que tiene cáncer pancreático, y el ADN del cáncer se puede analizar para obtener información de pronóstico predictivo basada en los marcadores de metilación del invención, así como información sobre qué tratamiento curativo, de mejora o paliativo proporcionar para el cáncer pancreático. El estado de metilación de los marcadores de metilación de la invención también se puede utilizar para controlar un tratamiento proporcionado para la cura y/o mejorar un cáncer pancreático. Además, el estado de metilación del marcador se puede usar para controlar la recaída del cáncer pancreático en un sujeto humano previamente tratado por cáncer pancreático.
Por lo tanto, los aspectos de la presente invención se relacionan con i) métodos para identificar sujetos humanos que están predispuestos al cáncer pancreático, y/o que tienen un cáncer pancreático, incluyendo las estadios tempranas, tal como las estadios asintomáticas del cáncer pancreático; ii) métodos para proporcionar información de pronóstico de un cáncer pancreático and/, iii) métodos de seguimiento de un tratamiento de un cáncer pancreático, y/o seguimiento de la recaída de un cáncer pancreático.
Para facilitar la comprensión de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones a continuación.
Definiciones
La amplificación según la presente invención es el procedimiento en donde se sintetiza una pluralidad de copias exactas de uno o más loci de genes o porciones de genes (plantilla). En una realización preferida de la presente invención, la amplificación de un molde comprende el procedimiento en el que un molde es copiado por una polimerasa de ácido nucleico o un homólogo de polimerasa, por ejemplo, una polimerasa de ADN o una polimerasa de ARN. Por ejemplo, los moldes pueden amplificarse usando transcripción inversa, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación in vivo de ADN clonado, técnicas de amplificación isotérmica y otros procedimientos similares capaces de generar una secuencia de ácido nucleico complementaria.
Las copias amplificadas de una región genética diana a veces se denominan amplicón.
Un ácido nucleico de doble cadena contiene dos cadenas que son complementarias en secuencia y capaces de hibridarse entre sí. En general, un gen se define en términos de su cadena codificante, pero en el contexto de la presente invención, un cebador oligonucleotídico, que se hibrida con un gen definido por la secuencia de su cadena codificante, también comprende cebadores oligonucleotídicos, que se hibridan con el complemento del mismo.
El término "dinucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a dos nucleótidos secuenciales. El dinucleótido puede estar comprendido en un oligonucleótido o en una secuencia de ácido nucleico. En particular, el dinucleótido CpG, que denota una citosina unida a una guanina por un enlace fosfodiéster, puede estar comprendido en un oligonucleótido según la presente invención, y también comprendido en una secuencia de locus génico diana según la presente invención. Un dinucleótido CpG también se denomina en el presente documento como sitio CpG. Los sitios CpG son dianas para la metilación del residuo de citosina.
Los marcadores de metilación de loci génicos de la presente invención pueden usarse para inferir cáncer pancreático basándose en la detección de loci de ADN de marcadores de ADN libres de células positivos para metilación en una muestra que comprende una mezcla de moléculas de ADN libre de células de un sujeto. Por ejemplo, el estado de metilación de un locus genético específico se puede detectar como metilación positiva en aquellos casos en los que se puede encontrar ADN positivo para metilación en la muestra, independientemente de la cantidad relativa de moléculas positivas para metilación y negativas para metilación que estén presentes en la muestra.
El ADN libre de células es ADN que circula libremente en el torrente sanguíneo.
El cáncer pancreático en el presente documento se refiere a adenocarcinoma pancreático que incluye cualquier estadio del mismo, ya sea sintomático o asintomático.
El término "predisposición", como se usa en el presente documento con respecto al cáncer pancreático, se refiere a un estado de mayor probabilidad de desarrollar cáncer pancreático en el futuro. El término no pretende
implicar una disposición genética como tal. Sin embargo, la regulación epigenética puede contribuir a la predisposición al cáncer pancreático en el sentido de la presente divulgación.
Método de determinación del cáncer pancreático
La presente invención proporciona una serie de métodos para analizar un sujeto humano con respecto al cáncer pancreático. En particular, la invención proporciona métodos para determinar el cáncer pancreático en un sujeto humano, métodos para determinar la predisposición al cáncer pancreático en un sujeto humano, métodos para determinar el pronóstico de un cáncer pancreático y métodos para categorizar o estadificar un cáncer pancreático en un ser humano. tema, métodos para monitorear un cáncer pancreático, tal como monitorear el tratamiento de un cáncer pancreático y/o recaída de un cáncer pancreático. Los biomarcadores de metilación para el cáncer pancreático se describen en este documento con más detalle a continuación. Generalmente, se selecciona un grupo de al menos dos biomarcadores de metilación para el cáncer pancreático de un locus genético seleccionado del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM.
Así, en un aspecto, se proporciona un método para determinar el cáncer pancreático, la predisposición al cáncer pancreático, el pronóstico de un cáncer pancreático y/o el seguimiento de un cáncer pancreático en un sujeto, comprendiendo dicho método en una muestra de dicho sujeto determinar la estado de metilación de al menos un gen que incluye secuencias reguladoras de dichos genes, en donde dicho locus de genes se selecciona del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B , ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM.
En otro aspecto, se proporciona un método para categorizar o predecir el resultado clínico de un cáncer pancreático en un sujeto humano, comprendiendo dicho método en una muestra de dicho sujeto determinar el estado de metilación de al menos dos genes seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16 , PENK y VIM.
En otro aspecto, se proporciona un método para evaluar el riesgo de que un sujeto humano desarrolle cáncer pancreático, o para monitorear la recaída de un cáncer pancreático, comprendiendo dicho método en una muestra de dicho sujeto determinar el estado de metilación de al menos dos genes seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT , MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM.
Además se enseña un método para evaluar si es probable que un sujeto humano desarrolle cáncer pancreático, comprendiendo dicho método
i) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto humano,
ii) aislar el ácido nucleico de dicha muestra de sangre,
iii) determinar en dicha muestra el estado de metilación de al menos dos loci génicos seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM,
iv) sobre la base de dicho estado de metilación identificar un sujeto humano que es más probable que desarrolle cáncer pancreático.
Los métodos, entre otras cosas, implican así determinar el estado de metilación de dos o más loci de genes como se define en el presente documento. Por lo tanto, el estado de metilación se determina para múltiples loci de genes, por ejemplo, se determina el estado de metilación para al menos dos loci de genes, tal como al menos tres loci de genes, tal como al menos cuatro loci de genes, o cinco o más loci de genes. La pluralidad de loci de genes se selecciona preferiblemente de los loci de genes seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM.
Tabla 1. Nombres de genes y función conocida
Gen Nombre Función
ALX4 Homeobox 4 tipo Aristaless Desarrollo del cráneo y las extremidades APC Poliposis adenomatosa coli Supresor de tumores, adhesión celular, angiogénesis, regulación de p-catenina BMP3 proteína morfogénica ósea 3 Formación ósea, angiogénesis
BNC1 Basonucleína 1 Regulador de la transcripción de ARNr.
BRCA1 Cáncer de mama 1 Supresor de tumores, estabilidad genómica, reparación de ADN
CDKN2B inhibidor de cinasa dependiente de ciclina Supresor de tumores, regulación del ciclo celular 2B (P15)
CHFR Punto de control con dominios de cabeza de regulación del ciclo celular
horquilla y dedo anular
ESR1 receptor de estrógeno 1 angiogénesis
EYA2 coactivador transcripcional y desarrollo de los ojos,
fosfatasa2 factor de transcripción
GSTP1 glutatión S-transferasa pi 1 detoxificación
HIC1 Hipermetilado en cáncer 1 Transcripción de genes y división celular MGMT O-6-metilguanina-ADN metiltransferasa Reparación de ADN
MLH1 homólogo MutL 1 Reparación de ADN
NEUROG1 neurogenina 1 Diferenciación neuronal
MESTvl Transcripción específica del mesodermo desarrollo fetal
NPTX2 Pentraxina neural II Supresor de tumor
p16 inhibidor de cinasa dependiente de ciclina Supresor de tumores, regulación del ciclo celular 2A
PENK proencefalina Vía NF-kB (transcripción de ADN, proliferación celular, apoptosis)
RARB receptor de ácido retinoico, beta proliferación celular, diferenciación celular RASSF1A miembro de familia de dominio de Supresor de tumores, regulación del ciclo celular y asociación Ras 1 reparación del ADN
SEPT9v2 Septin 9 Supresor de tumores, regulación del ciclo celular, citocinesis, angiogénesis
SFRP1 Proteína 1 relacionada con Frizzled Angiogénesis, vía Wnt (proliferación celular, secretada diferenciación celular)
SFRP2 Proteína 2 relacionada con Frizzled Angiogénesis, vía Wnt (proliferación celular, secretada diferenciación celular)
SST Somatostatina Proliferación celular
TAC1 Precursor de taquiquinina 1 Neurotransmisores y vasodilatadores
TFPI2 Inhibidor 2 de la vía del factor tisular Supresor de tumores, angiogénesis
VIM Vimentina Forma celular e integridad
mantenimiento
WNT5a Familia de sitios de integración MMTV de vía Wnt (proliferación celular, diferenciación celular) tipo sin alas, miembro 5A
Nota. Las funciones de las proteínas se comparan con RefSeq: NCBI Reference Sequence Database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Generalmente, el aumento de los niveles de mutilación de los respectivos loci del gen marcador en relación con los niveles de metilación de una muestra de control predeterminada de ADN no canceroso es indicativo de la presencia de un cáncer pancreático, mayor probabilidad de desarrollar cáncer, disminución de la supervivencia general, resultado negativo, diferente cáncer en estadio y/o mayor riesgo de contraer cáncer.
Por lo tanto, los métodos de la invención comprenden preferiblemente las estadios de comparar el estado de metilación de los respectivos loci de genes determinados para un sujeto con un estado de metilación predeterminado para el gen correspondiente de una muestra de referencia que comprende ADN de sujetos no cancerosos.
El estado predeterminado se determina preferiblemente a partir del ADN de sujetos no cancerosos. Sin embargo, el grupo control podrían ser pacientes con pancreatitis, tanto aguda como crónica.
En principio, los métodos descritos en este documento podrían aplicarse a cualquier sujeto con riesgo o no de cáncer pancreático y con sospecha o no de cáncer pancreático. Sin embargo, en una realización preferida, los métodos se aplican a sujetos de los que se sospecha que tienen dicho cáncer o que están en riesgo de tener dicho cáncer basándose en otros síntomas. Por ejemplo, los métodos descritos en este documento podrían aplicarse preferiblemente a sujetos que presenten síntomas no específicos, tales como fatiga, ictericia, náuseas, pérdida de apetito y pérdida de peso. El sujeto también puede ser un individuo en el que se ha observado una señal de exploración por TC inespecífica en el páncreas, que puede ser o no un tumor.
En una realización, los métodos descritos en este documento se aplican a un sujeto que tiene pancreatitis, y los métodos descritos en este documento son particularmente eficaces para distinguir el cáncer pancreático de la pancreatitis, que puede tener síntomas superpuestos.
Método para el tratamiento del cáncer pancreático
Los aspectos de la invención también se relacionan con métodos para determinar el pronóstico de un cáncer pancreático en un sujeto humano y/o inferir un tratamiento adecuado, así como para monitorear un cáncer pancreático y, en particular, monitorear el tratamiento de un cáncer pancreático y/o seguimiento de la recaída de un cáncer pancreático.
Entonces, en un aspecto, se proporciona un método para el tratamiento del cáncer pancreático en un sujeto humano, el método comprende las estadios de
i. determinar el cáncer pancreático, una predisposición al cáncer pancreático o el pronóstico de un cáncer pancreático en un sujeto mediante un método de la presente invención, como se define en otra parte de este documento,
ii. seleccionar sujetos humanos que tengan cáncer pancreático, una predisposición al cáncer pancreático o una recaída de un cáncer pancreático,
iii. someter dichos sujetos identificados en la estadio ii. a un tratamiento adecuado para el cáncer pancreático.
La estadio de determinar el cáncer pancreático mediante un método de la presente invención permite la detección temprana del cáncer pancreático y, por lo tanto, permite iniciar el tratamiento del cáncer antes de que se desarrolle en estadios posteriores y/o antes de formar metástasis. Esto aumenta las posibilidades de proporcionar un tratamiento curativo. En una realización preferida tal tratamiento es la resección quirúrgica del cáncer pancreático.
Sin embargo, si la resección quirúrgica no es posible, los tratamientos preferidos incluyen quimioterapia y/o radioterapia Un posible tratamiento también es la electroporación irreversible (IRE), que implica pulsos de electricidad cortos, repetitivos y no térmicos de alta energía para destruir las células cancerosas. En una realización, el sujeto humano seleccionado se somete a un tratamiento seleccionado entre cirugía, quimioterapia y/o radioterapia, sin embargo, también se puede aplicar una combinación de las mismas, tal como la resección quirúrgica seguida de quimioterapia y/o radioterapia.
Los marcadores de metilación también permiten monitorear la recaída del cáncer pancreático, así como ofrecer un tratamiento personalizado del cáncer pancreático mediante la vigilancia y el control de calidad del tratamiento ofrecido, lo que permite terminar tratamientos ineficaces y ofrecer tratamientos alternativos. Por lo tanto, en otro aspecto, la enseñanza proporciona un método para el tratamiento personalizado de un cáncer pancreático de un sujeto humano, comprendiendo dicho método
i) en una muestra de dicho sujeto humano, determinar el estado de metilación de al menos dos loci génicos seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM,
ii) proporcionar un tratamiento de cáncer pancreático a dicho sujeto humano,
iii) después de una cantidad de tiempo suficiente de haber proporcionado el tratamiento, en una muestra de dicho sujeto humano, determinar el estado de metilación de dichos al menos dos genes loci seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2,
EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM,
iv) comparar el estado de mutilación de dicho locus genético antes y después del tratamiento, y v) si la metilación de dichos loci genéticos es similar o aumenta en relación con la metilación antes del tratamiento, finalizar dicho tratamiento proporcionado y, preferiblemente, ofrecer un tratamiento alternativo, o
vi) si la metilación de dicho locus genético se reduce con respecto a la metilación antes del tratamiento, continuar dicho tratamiento proporcionado.
Biomarcadores de metilación para el cáncer pancreático
Como se describe anteriormente en el presente documento, la presente enseñanza proporciona una serie de métodos diferentes para evaluar el cáncer pancreático en un sujeto humano en función del estado de metilación de un grupo específico de loci de genes. La enseñanza también proporciona cebadores de oligonucleótidos específicos para usar en la determinación del estado de metilación de loci de genes específicos, que son biomarcadores de metilación para el cáncer pancreático según la presente enseñanza. Estos loci de genes incluyen BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM.
El estado de metilación se determina preferiblemente en una región rica en GC cadena arriba del codón de inicio de cualquier locus genético identificado en este documento. Tales regiones aguas arriba comprenden elementos promotores y el estado de metilación se determina en una realización más preferida en una región promotora de un loci de gen marcador identificado en este documento. Preferiblemente, es una región promotora ubicada aguas arriba del marco de lectura abierto, es decir, aguas arriba del codón de inicio (ATG: metionina) o el primer exón del gen codificado por cualquiera de los loci de genes identificados en este documento, es decir, ALX4, APC, BMP3, BNC1, BRCA1, CDKN2B, CHFR, ESR1, EYA2, GSTP1, HIC1, MGMT, MLH1, NEUROG1, MESTv1, NPTX2, p16, PENK, RARB, RASSF1A, SEPT9v2, SFRP1, SFRP2, SST, TAC1, TFPI2, VIM o WNT5a. El tamaño de una región promotora puede variar considerablemente entre genes, sin embargo, un experto en la materia puede identificar elementos promotores sobre la base de elementos de secuencia utilizando herramientas bioinformáticas disponibles para él. En el contexto de los loci identificados en el presente documento, generalmente se considera que la región promotora comprende 1000 pares de bases cadena arriba del codón de inicio. Por lo tanto, en una realización preferida, el estado de metilación se determina en una región dentro de 1000 pb, como dentro de 900 pb, como dentro de 800 pb, tal como dentro de 700 pb, tal como dentro de 600 pb, tal como dentro de 500 pb, tal como dentro de 400 pb, tal como dentro de 300 pb, tal como dentro de 200 pb, tal como dentro de 100 pb aguas arriba del codón de inicio de dos o más loci de genes seleccionados del grupo que consta de Bm P3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM. Sin embargo, el estado de metilación se determina en una realización particular en una región dentro de los 1000 pb aguas arriba del codón de inicio de dos o más loci de genes seleccionados de cualquiera de los subgrupos identificados aquí anteriormente, tal como
a) BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2;
b) ; MLH1, SEPT9v2, BNC1, ALX4, CDKN2B, NEUROG1, WNT5A y TFPI2;
c) SEPT9v2, SST, ALX4, CDKN2B, HIC1, MLH1, NEUROG1 y BNC1; y
d) ALX4, BNC1, HIC1, Sept9v2, SST, TFPI2 y TAC1.
Generalmente, en los métodos enseñados, el estado de metilación se determina para al menos dos loci de genes seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MEs Tv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM.
En una realización, el estado de metilación se determina para al menos dos loci de genes seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2. Por ejemplo, el estado de metilación se determina en 3, 4, 5, 6, 7 o preferiblemente 8 loci de genes del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, s Fr P1 y SFRP2. Por lo tanto, en una realización preferida, el estado de metilación se determina en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2.
En una realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A y BNC1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1 y MESTv1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1 y TFPI2.
En otra realización, el estado de mutilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTvl, TFPI2 y APC. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTvl, TFPI2, APC y SFRP1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2 y EYA2. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, Me STv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2 y NPTX2. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2 y SEPT9v2. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2 y WNT5a. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a y CDKN2B. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B y ALX4. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4 y HIC1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, Me Stv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1 y RARB. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB y SST. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST y ESR1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1 y TAC1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1 y BRCA1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, Me STv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1 y CHFR. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR y GSTP1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1 y MGMT. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT y MLH1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1 y NEUROG1. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1 y p16. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16 and PENK. En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16 PENK y VIM.
En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos dos loci de genes seleccionados del grupo que consta de MLH1, SEPT9v2, BNC1, ALX4, CDKN2B, NEUROG1, WNT5A y TFPI2. Por ejemplo, el estado de metilación se determina en 3, 4, 5, 6, 7 o preferiblemente 8 loci de genes del grupo que consiste en MLH1, SEPT9v2, BNC1, ALX4, CDKN2B, NEUROG1, WNT5A y TFPI2. Por lo tanto, en una realización preferida, el estado de metilación se determina en MLH1, SEPT9v2, BNC1, ALX4, CDKN2B, NEUROG1, WNT5A y TFPI2.
En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos dos loci de genes seleccionados del grupo que consta de ALX4, BNC1, HIC1, Sept9v2, SST, Tf PI2 y TAC1. Por ejemplo, el estado de metilación se determina en 3, 4, 5, 6 o preferiblemente 7 loci de genes del grupo que consiste en ALX4, BNC1, HIC1, Sept9v2, SST, TFPI2 y TAC1. Por lo tanto, en una realización preferida, el estado de metilación se determina en ALX4, BNC1, HIC1, Sept9v2, SST, TFPI2 y TAC1.
En otra realización, el estado de metilación se determina para al menos dos loci de genes seleccionados del grupo que consta de SEPT9v2, SST, ALX4, CDKN2B, HIC1, MLH1, NEUROG1 y BNC1. Por ejemplo, el estado de metilación se determina en 3, 4, 5, 6, 7 o preferiblemente 8 loci de genes del grupo que consiste en SEPT9v2, SST, ALX4, CDKN2B, HIC1, MLH1, NEUROG1 y BNC1. Por lo tanto, en una realización preferida, el estado de metilación se determina en SEPT9v2, SST, ALX4, CDKN2B, HIC1, MLH1, NEUROG1 y BNC1.
En una realización, el estado de metilación se determina para los loci del gen BNC1 y TFPI2.
En otra realización, el estado de mutilación se determina para los loci del gen ALX4, HIC1, Sept9v2 y SST. En otra realización, el estado de metilación se determina para los loci del gen ALX4 y SST. En otra realización, el estado de metilación se determina para los loci del gen ALX4, HIC1 y SST. En otra realización, el estado de metilación se determina para los loci del gen ALX4 y HIC1. En otra realización, el estado de metilación se determina para los loci del gen ALX4, Sept9v2 y SST. En otra realización, el estado de metilación se determina para los loci del gen HIC1, Sept9v2 y s St . En otra realización, el estado de metilación se determina para los loci del gen ALX4, HIC1, Sept9v2 y SST.
En una realización preferida, el estado de metilación se determina mediante un método que comprende amplificar un locus génico de la invención. En una realización preferida, la amplificación se realiza utilizando al menos un cebador seleccionado de la tabla 1 que identifica cebadores y sondas específicos para cada locus de genes. Por ejemplo para SST, usando SEQ ID NO: 1 y 2 y/o 3 y 4. Por lo tanto, se prefiere que al menos un cebador se seleccione del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 1-135
Muestra
según la presente invención, el estado de metilación de uno o más loci de genes se determina en una muestra de sangre de un sujeto humano. La muestra también puede ser una muestra de plasma, o se puede preparar una muestra de plasma a partir de la muestra de sangre mediante centrifugación. La muestra es preferiblemente una muestra de ADN libre de células. La muestra de la invención comprende material biológico en forma de moléculas de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico deben extraerse de la muestra antes del análisis.
El ácido nucleico a analizar para detectar la presencia de CpG metilado puede extraerse de las muestras mediante una variedad de técnicas como la descrita por Maniatis, et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, pp 280, 281, 1982 ).
Cualquier ácido nucleico, en forma purificada o no purificada, se puede utilizar como ácido o ácidos nucleicos de partida, siempre que contenga, o se sospeche que contiene, la secuencia de ácido nucleico específica que contiene el sitio diana de metilación (p. ej., CpG). La secuencia de ácido nucleico específica que se va a amplificar puede ser parte de una molécula más grande o está presente inicialmente como una molécula discreta. La secuencia de ácido nucleico a amplificar no necesita estar presente en forma pura, puede ser, por ejemplo, una fracción de una mezcla compleja de otras moléculas de ADN, y/o ARN. En un ejemplo, la secuencia de ácido nucleico es una fracción de una preparación de ácido nucleico genómico.
Pueden usarse cantidades extremadamente bajas de ácido nucleico como secuencia diana según los métodos de la presente invención. El experto en la materia apreciará que, en términos prácticos, no existe un límite superior para la cantidad de ácido nucleico a analizar. El problema que puede encontrar el experto en la materia es que la cantidad de ácido nucleico a analizar es limitada. Por lo tanto, es beneficioso que el método de la presente invención se pueda realizar en pequeñas cantidades de ácidos nucleicos. Los presentes métodos permiten la detección de muy pocas copias de ácido nucleico. La cantidad de ácido nucleico a analizar es en una realización de al menos 0,01 ng, tal como 0,1 ng, tal como 0,5 ng, por ejemplo, 1 ng, tal como al menos 10 ng, por ejemplo, al menos 25 ng, tal como al menos al menos 50 ng, por ejemplo al menos 75 ng, tal como al menos 100 ng, por ejemplo al menos 125 ng, tal como al menos 150 ng, por ejemplo al menos 200 ng, tal como al menos 225 ng, por ejemplo al menos 250 ng, tal como al menos 275 ng, por ejemplo, al menos 300 ng, 400 ng, por ejemplo, al menos 500 ng, tal como al menos 600 ng, por ejemplo, al menos 700 ng, tal como al menos 800, ng, para ejemplo al menos 900 ng o tal como al menos 1000 ng.
Estado de metilación
Los métodos enseñados para determinar el cáncer pancreático en un sujeto humano, los métodos para determinar una predisposición al cáncer pancreático en un sujeto humano, los métodos para determinar el pronóstico de un cáncer pancreático en un sujeto, los métodos para categorizar o estadificar un cáncer pancreático en un sujeto humano y métodos para monitorear un cáncer pancreático, todos incluyen un paso de proporcionar u obtener una muestra del sujeto humano, y en esa muestra determinar el estado de metilación de al menos dos loci genéticos seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1 , TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM, así como subregiones de las mismas, en particular regiones promotoras, como las regiones dentro de 1000 pb cadena arriba del codón de inicio, incluidas las subregiones delineadas por los respectivos pares de cebadores identificados en la tabla 2, tales como los pares de cebadores 1 y 2, 3 y 4, 6 y 7, 8 y 9, 11 y 12 etc.
El estado de metilación de los loci del gen diana o las regiones genéticas de la presente invención puede determinarse mediante cualquier método adecuado disponible para el experto en la materia para detectar el estado de metilación. En una realización, el estado de metilación se determina mediante un método cuantitativo,
que es capaz de detectar niveles de alelos positivos de mutilación y/o alelos negativos de mutilación en una población de moléculas diana presentes en una muestra. Por ejemplo, el método cuantitativo es preferiblemente capaz de detectar diferentes niveles de alelos positivos de metilación de una secuencia de locus diana dada, como detectar si 0%, menos que 1%, más que 1%, tal como aproximadamente 10%, 25%, 50%, 75% o 100% de los alelos de un locus marcador determinado son positivos para la metilación. Algunas técnicas en el arte detectan la presencia de uno o más alelos positivos de metilación y/o negativos de metilación de una secuencia diana determinada sin proporcionar datos cuantitativos y sin proporcionar información de los niveles relativos de alelos positivos de metilación y negativos de metilación.
Estado de metilación: el término "estado de metilación", como se usa en este documento, se refiere a la presencia o ausencia de metilación en una región de ácido nucleico específica. En particular, la presente invención se refiere a la detección de citosina metilada (5-metilcitosina). Una secuencia de ácido nucleico, p. ej., un locus génico de la invención puede comprender uno o más sitios de metilación CpG. La secuencia de ácido nucleico del locus del gen puede estar metilada en todos los sitios de metilación (es decir, 100% metilada) o no metilada en todos los sitios de metilación (es decir, 0% metilada). Sin embargo, la secuencia de ácido nucleico también puede metilarse en un subconjunto de sus sitios de metilación potenciales (sitios CpG). En este último caso, la molécula de ácido nucleico está heterogéneamente metilada. En una realización preferida, el estado de metilación se refiere a la presencia o ausencia de ácido nucleico metilado de dos o más de los loci descritos en este documento, preferiblemente regiones promotoras de los loci descritos en este documento.
Los métodos para inferir el cáncer pancreático de la presente invención incluyen determinar el estado de metilación de marcadores de metilación específicos al determinar si un marcador de metilación específico en una muestra obtenida o proporcionada de un sujeto es metilación positiva o metilación negativa, así como detectar el nivel relativo de metilación. alelos de un locus dado.
En una realización preferida, el estado de metilación se determina mediante PCR específica de metilación, preferiblemente en ADN libre de células, donde el ADN se modifica mediante un agente capaz de convertir residuos de citosina no metilados.
En otra realización, el estado de metilación se determina mediante el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación. Muchas enzimas de restricción son sensibles a los estados de metilación del ADN. La escisión puede bloquearse o deteriorarse cuando se modifica una base particular en el sitio de reconocimiento. Por ejemplo, se ha descubierto que la familia de enzimas de restricción MspJI depende de la metilación y la hidroximetilación para que se produzca la escisión. Estas enzimas eliminan ~ 32 fragmentos de pares de bases que contienen un residuo modificado de 5 hmC o 5 mC ubicado en el centro que se puede extraer y secuenciar. Debido a la posición conocida de esta modificación epigenética, no se requiere la conversión de bisulfito antes del análisis posterior.
Las enzimas sensibles a la metilación son bien conocidas en la técnica e incluyen: Aatll, Accll, Aor13HI, Aor51HI, BspT104I, BssHII, Cfr10I, Clal Cpol, Eco52I, Haell, Hapll, Hhal, Mlul, Nael, Notl, Nrul, Nsbl, PmaCI, Psp1406I, Pvul, Sacll, SaII, Smal y SnaBI.
La muestra de ácido nucleico digerida se analiza posteriormente, por ejemplo, mediante electroforesis en gel.
Entonces, en una realización de los métodos de las enseñanzas subyacentes, el estado de metilación se determina mediante un método que comprende las estadios de
i) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto humano,
ii) aislar y procesar el ácido nucleico contenido en dicha muestra utilizando una o más enzimas endonucleasas de restricción sensibles a la metilación,
iii) opcionalmente, amplificar dicha secuencia de ácido nucleico procesada para obtener un producto de amplificación, y
iv) analizar dicha secuencia de ácido nucleico procesada o dicho producto de amplificación para detectar la presencia de y/o secuencias de ácido nucleico sin procesar, lo que infiere la presencia de metilado y/o secuencias de ácido nucleico no metiladas, en las que se determina el estado de metilación de al menos dos loci de genes seleccionados de BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM.
El estado de metilación se puede determinar modificando el ADN con un agente que se dirija a secuencias metiladas o no metiladas, amplificando el ADN y analizando los productos de amplificación.
Por ejemplo, el producto de amplificación se analiza detectando la presencia o ausencia del producto de amplificación, donde la presencia del producto de amplificación indica que el ácido nucleico diana no ha sido escindido por las enzimas de restricción, y donde la ausencia del producto de amplificación indica que el ácido nucleico diana el ácido ha sido escindido por las enzimas de restricción.
Por lo tanto, generalmente, en los métodos de la invención, el estado de metilación se determina mediante un método que comprende las etapas de
i) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto que comprende material de ácido nucleico,
ii) opcionalmente, aislar material de ácido nucleico de dicha muestra de sangre,
iii) modificar dicho material de ácido nucleico usando un agente que modifica las secuencias de ácido nucleico de una manera dependiente de la metilación,
iv) amplificar al menos una porción de dicho locus génico utilizando cebadores, que abarcan o comprenden al menos un dinucleótido CpG en dicho locus génico para obtener un producto de amplificación, y
v) analizar dicho producto de amplificación para detectar la presencia de modificado y/o residuos de citosina no modificados, en donde la presencia de residuos de citosina modificados es indicativa de residuos de citosina metilados.
Por ejemplo, el método comprende las estadios de
i) proporcionar una muestra, tal como una muestra de sangre, de dicho sujeto que comprende material de ácido nucleico que comprende dicho locus génico,
ii) opcionalmente, aislar material de ácido nucleico de dicha muestra de sangre,
iii) modificar dicho material de ácido nucleico usando un agente que modifica las secuencias de ácido nucleico de una manera dependiente de la metilación,
iv) amplificar al menos una porción de dicho locus génico utilizando cebadores, que abarcan o comprenden al menos un dinucleótido CpG en dicho locus génico para obtener un producto de amplificación, y
v) analizar dicho producto de amplificación.
El producto de amplificación puede analizarse en busca de sustituciones de ácidos nucleicos que resulten de la conversión de residuos de citosina modificados, preferiblemente donde la presencia de residuos de citosina convertidos sea indicativa de residuos de citosina no metilados, y la presencia de residuos de citosina no convertidos sea indicativa de residuos de citosina metilados. Típicamente, la citosina no metilada se convierte en timidina después del tratamiento con bisulfito y la amplificación, mientras que la citosina metilada permanece sin cambios después del mismo tratamiento.
En una realización preferida, el material de ácido nucleico se modifica usando bisulfito y se amplifica usando cebadores, que abarcan al menos un dinucleótido CpG en dichos loci de genes. En este caso, los cebadores de amplificación específicos para el ácido nucleico modificado solo admitirán la amplificación y generarán un producto de amplificación para los ácidos nucleicos que no están metilados. En contraste, los cebadores de amplificación específicos para el ácido nucleico modificado solo admitirán la amplificación y generarán un producto de amplificación para los ácidos nucleicos que no están metilados.
El producto de amplificación, el amplicón, es en una realización preferida una región genética de un gen de las enseñanzas, donde dicha región está delineada por los pares de cebadores identificados en la tabla 2.
Modificación de ADN
El método para determinar el estado de metilación en la presente invención comprende preferiblemente una estadio de modificación de los ácidos nucleicos contenidos en la muestra, o extraídos de la muestra, usando un agente que modifica específicamente la citosina no metilada en el ácido nucleico. Como se usa en este documento, el término "modifica" se refiere a la modificación específica de una citosina no metilada o una citosina metilada, por ejemplo, la conversión específica de una citosina no metilada en otro nucleótido que distinguirá la citosina no metilada modificada de una citosina metilada. En una realización preferida, un agente modifica la citosina no metilada a uracilo. Tal agente puede ser cualquier agente capaz de dicha conversión, en donde se modifica la citosina no metilada, pero no la citosina metilada. En una realización preferida, el agente para modificar la citosina no metilada es bisulfito de sodio. El bisulfito de sodio (NaHSO3) reacciona fácilmente con el doble enlace 5,6 de la citosina, pero solo de forma deficiente con la citosina metilada. La
citosina reacciona con el ion bisulfito, formando un intermedio de reacción en forma de citosina sulfonada que es propensa a la desaminación, lo que finalmente da como resultado un uracilo sulfonado. El uracilo se puede formar posteriormente en condiciones alcalinas que eliminan el grupo sulfonato.
Durante un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, la polimerasa Taq reconocerá el uracilo como una timidina. El producto de la amplificación por PCR de un ácido nucleico modificado con bisulfito de sodio contiene citosina en la posición donde se produjo una citosina metilada (5-metilcitosina) en el ADN molde inicial de la muestra. El producto de la amplificación por PCR de un ácido nucleico modificado con bisulfito de sodio contiene citosina en la posición donde se produjo una citosina metilada (5-metilcitosina) en el ADN molde inicial de la muestra. Por lo tanto, una citosina no metilada se convierte en un residuo de timidina tras la amplificación de un ácido nucleico modificado con bisulfito.
En una realización preferida de la presente invención, los ácidos nucleicos se modifican usando un agente que modifica la citosina no metilada en el ácido nucleico. En una realización específica, tal agente es un bisulfito, sulfito de hidrógeno, y/o reactivo de disulfito, por ejemplo bisulfito de sodio.
Sin embargo, en otra realización, se usa un agente que modifica específicamente la citosina metilada en el ácido nucleico y no modifica la citosina no metilada.
estadio de amplificación
Después de la modificación de los ácidos nucleicos de la muestra, la región genética específica seleccionada para la determinación del estado de metilación se amplifica preferiblemente para generar y así obtener múltiples copias (amplicones) de las respectivas regiones genéticas, que pueden permitir su posterior análisis con respecto al estado de metilación. La amplificación se realiza preferiblemente utilizando al menos un cebador oligonucleotídico, que se dirige a la región genética específica que comprende marcadores de metilación para el cáncer pancreático según la presente invención. Lo más preferiblemente, la amplificación se realiza utilizando dos cebadores de oligonucleótidos, que delimitan la región analizada. El experto en la materia puede utilizar su conocimiento general común para diseñar cebadores adecuados. Sin embargo, en una realización preferida, se emplean al menos uno y preferiblemente dos cebadores de oligonucleótidos independientes de la metilación para la amplificación del ácido nucleico modificado. La naturaleza de los cebadores independientes de la metilación se describe con más detalle a continuación.
La estadio de amplificación es una reacción de polimerización en donde interviene un agente de polimerización que efectúa una extensión del cebador de oligonucleótidos. El agente para la polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que funcione para realizar la síntesis de los productos de extensión del cebador, incluyendo enzimas. Las enzimas que son adecuadas para este propósito incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, fragmento Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa T4, otras ADN polimerasas disponibles, muteínas de polimerasa, transcriptasa inversa y otras enzimas, incluyendo la enzimas estables (es decir, aquellas enzimas que realizan la extensión del cebador después de haber sido sometidas a temperaturas suficientemente elevadas para provocar la desnaturalización, también conocidas como polimerasas Taq). Las enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos de la manera adecuada para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios a cada hebra de ácido nucleico del locus. Generalmente, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador y continuará en la dirección 5' a lo largo de la hebra molde, hasta que termine la síntesis, produciendo moléculas de diferentes longitudes. Sin embargo, puede haber agentes para la polimerización que inicien la síntesis en el extremo 5' y procedan en la otra dirección, usando el mismo procedimiento que se describió anteriormente.
El producto de amplificación (amplicón) puede tener cualquier longitud, sin embargo, normalmente, el producto de amplificación comprende entre 15 y 1000 nucleótidos, como entre 15 y 500 nucleótidos, tal como entre 50 y 120 nucleótidos, preferiblemente entre 80 y 100 nucleótidos. En una realización preferida, el amplicón está delimitado por los cebadores identificados en la tabla 2 para cada gen respectivo, cf. en este documento arriba.
La reacción de PCR se caracteriza por tres estadios a) fundir una plantilla de ácido nucleico, b) hibridar al menos un cebador de oligonucleótido independiente de la metilación con dicha plantilla de ácido nucleico, y c) alargar dicho al menos un cebador de oligonucleótido independiente de la metilación. Estas tres estadios se repiten a través de múltiples ciclos, como bien conocen los expertos en la técnica.
La PCR generalmente se realiza en una máquina de PCR, que también se conoce como termociclador. Específicamente, el termociclador se puede acoplar a un fluorómetro, lo que permite el seguimiento de la amplificación del ácido nucleico en tiempo real mediante el uso de colorantes fluorescentes intercalados u otras sondas fluorescentes. Los colorantes aplicables según la presente invención incluyen cualquier colorante de intercalación de ADN. Los ejemplos de sondas específicas de metilación se enumeran en la tabla 2 con respecto a cada locus genético proporcionado en el presente documento, p. ej., SEQ ID NO: 5 para la detección de un amplicón del gen SST, SEQ ID NO: 8 para la detección del gen APC, etc.
Los tintes adecuados incluyen bromuro de etidio, EvaGreen, LC Green, Syto9, SYBR Green, kit de tinte SensiMix HRM™, sin embargo, muchos tintes están disponibles para este mismo propósito.
La PCR en tiempo real permite una fácil realización de la PCR cuantitativa (qPCR), que generalmente cuenta con la ayuda de algoritmos incluidos en el software, que generalmente se suministra con las máquinas de PCR.
Además, el fluorómetro puede equiparse con un software que permitirá la interpretación de los resultados. Tal software para análisis de datos también puede suministrarse con el kit de la presente invención.
Otra variante de la técnica de PCR, la PCR multiplex, permite la amplificación simultánea de muchos dianas de interés en una reacción mediante el uso de más de un par de cebadores.
La PCR según la presente invención comprende todas las variantes conocidas de la técnica de PCR conocidas por los expertos en la materia. Por lo tanto, la tecnología PCR comprende PCR en tiempo real, qPCR, PCR multiplex.
Cebadores de oligonucleótidos
Los cebadores de oligonucleótidos de la presente invención pueden emplearse en reacciones de amplificación, en donde los cebadores se usan en la amplificación del ADN molde que se origina a partir de una hebra de metilación positiva o de metilación negativa. Los cebadores preferidos de la presente invención comprenden al menos un dinucleótido CpG.
El diseño de cebadores de oligonucleótidos adecuados para técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, como PCR, es conocido por los expertos en la materia. El diseño de dichos cebadores implica el análisis de las temperaturas de fusión de la imprimación y la capacidad para formar dúplex, horquillas u otras estructuras secundarias. Tanto la secuencia como la longitud de los cebadores de oligonucleótidos son relevantes en este contexto. Los cebadores de oligonucleótidos según la presente invención comprenden entre 10 y 200 nucleótidos consecutivos, tales como al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 180 o al menos 200 nucleótidos. En una realización específica, los cebadores oligonucleotídicos comprenden entre 15 y 60 nucleótidos consecutivos, tales como 15, 16, 17, 18, 19, 20, preferiblemente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, tal como 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, alternativamente al menos 41, al menos 42, al menos 44, al menos 46, al menos 48, al menos 50, al menos 52, al menos 54, al menos 56, al menos 58 o al menos 60 nucleótidos consecutivos.
Los métodos empleados para determinar el estado de metilación de un ácido nucleico según la presente invención comprenden preferiblemente la amplificación de un ácido nucleico modificado mediante el uso de un cebador oligonucleotídico independiente de la metilación. En una realización, los cebadores de oligonucleótidos de la presente invención pueden hibridar con una secuencia de ácido nucleico que comprende islas CpG. En una realización, los cebadores de oligonucleótidos comprenden 2, alternativamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dinucleótidos CpG. Los cebadores específicos para alelos metilados reconocen los dinucleótidos CpG presentes en la secuencia nucleica diana, mientras que los cebadores específicos para alelos no metilados están diseñados para reconocer dinucleótidos TpG debido a la conversión mediada por PCR de residuos C no metilados en timina.
En una realización, el cebador de oligonucleótidos de la presente invención se selecciona del grupo de cebadores identificados en la tabla 2. El estado de metilación se determina preferiblemente para un gen mencionado en la tabla 2 usando el cebador directo y el cebador inverso respectivos establecidos en la tabla 2.
En una realización, los cebadores de oligonucleótidos se hibridan con una secuencia de ácido nucleico diana de un locus genético seleccionado del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM, o el complemento de los mismos.
En una realización, un cebador oligonucleotídico de las presentes enseñanzas se hibrida específicamente con regiones dentro de 1000 pb aguas arriba del codón de inicio de loci de genes seleccionados del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM, o el complemento de los mismos.
En otra realización, el cebador oligonucleotídico se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana de un locus génico seleccionado del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2, o el complemento de los mismos, preferiblemente con una secuencia diana dentro de los 1000 pb aguas arriba del codón de inicio.
En otra realización, el cebador oligonucleotídico se híbrida con una secuencia de ácido nucleico diana de un locus génico seleccionado del grupo que consiste en MLH1, SEPT9v2, BNC1, ALX4, CDKN2B, NEUROG1, WNT5A y TFPI2, o el complemento de los mismos, preferiblemente con una secuencia diana dentro de los 1000 pb aguas arriba del codón de inicio.
En otra realización, el cebador oligonucleotídico se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana de un locus génico seleccionado del grupo que consiste en ALX4, BNC1, HIC1, Sept9v2, SST, TFPI2 y TAC1, o el complemento de los mismos, preferiblemente con una secuencia diana dentro de los 1000 pb aguas arriba del codón de inicio.
En otra realización, el cebador oligonucleotídico se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana de un locus génico seleccionado del grupo que consiste en SEPT9v2, SST, ALX4, CDKN2B, HIC1, MLH1, NEUROG1 y BNC1, o el complemento de los mismos, preferiblemente con una secuencia diana dentro de los 1000 pb aguas arriba del codón de inicio.
En una realización, un cebador oligonucleotídico de la presente invención comprende o consiste específicamente en 5-50, como 5-30, como 10-20 nucleótidos consecutivos de una subsecuencia (preferiblemente subsecuencia de la región promotora) de un locus génico seleccionado del grupo compuesto por BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv1, TFPI2, APC, SFRP1, SFRP2, EYA2, NPTX2, SEPT9v2, WNT5a, CDKN2B, ALX4, HIC1, RARB, SST, ESR1, TAC1, BRCA1, CHFR, GSTP1, MGMT, MLH1, NEUROG1, p16, PENK y VIM, o el complemento de los mismos.
Análisis de ácidos nucleicos que contienen CpG amplificados
Según la presente invención, la muestra de ácido nucleico (diana) se somete a un agente que convierte una citosina no metilada en otro nucleótido que distinguirá la citosina no metilada de la metilada. En una realización preferida, un agente modifica la citosina no metilada a uracilo. El agente modificador puede ser bisulfito de sodio. Durante el procedimiento de amplificación, el uracilo se convertirá en timidina.
Por lo tanto, después de la conversión de citosinas no metiladas en uracilos en la muestra de ácido nucleico (diana), la posterior amplificación por PCR convierte los uracilos en timina. Como consecuencia del bisulfito de sodio y la conversión específica mediada por PCR de citosinas no metiladas en timinas, los pares de bases G:C se convierten en pares de bases A:T en las posiciones donde que se metiló la citosina.
La diferencia en la secuencia de ácido nucleico en citosinas previamente metiladas (metilación positiva) o no metiladas (metilación negativa) permite el análisis del estado de metilación en una muestra. Este análisis puede comprender la identificación de residuos de citosina, que se han convertido en timidina después de la amplificación, como residuos de citosina no metilados, y la identificación de residuos de citosina, que no se han convertido, como residuos de citosina metilados.
Mediante este método, el análisis del ácido nucleico amplificado después del tratamiento con un agente modificador tal como el bisulfito de sodio y la subsiguiente amplificación por PCR pueden revelar el estado de metilación de la secuencia de ácido nucleico diana. Por lo tanto, en una realización, el método para determinar el estado de metilación de un ácido nucleico según la presente invención comprende además una estadio de análisis de los ácidos nucleicos amplificados.
Específicamente, el análisis subsiguiente se puede seleccionar del grupo que consiste en análisis de curva de fusión, análisis de fusión de alta resolución, secuenciación de ácidos nucleicos, extensión de cebadores, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, transferencia Southern, digestión con enzimas de restricción, análisis de conformación monocatenario sensible a la metilación ( MS-SSCA) y cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC).
En una realización, el estado de metilación del ácido nucleico amplificado se determina mediante cualquier método seleccionado del grupo que consiste en PCR específica de metilación (MSP), secuenciación de bisulfito del genoma completo (BS-Seq), ensayos HELP, ensayos ChIP-on-chip, detección genómica de puntos de referencia de restricción, Inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP), Pirosecuenciación de ADN tratado con bisulfito, Ensayos de luz de rotura molecular y transferencia Southern sensible a metilo.
En una realización preferida, el estado de metilación del ácido nucleico amplificado (producto/amplicón de amplificación) se determina mediante PCR específica de metilación (MSP), en donde la secuencia de cebadores determina si se genera un amplicón, porque un conjunto de cebadores solo admite la amplificación de alelos metilados y otro conjunto de cebadores solo admite la amplificación de alelos no metilados. En este caso, el análisis del amplicón implica la detección de la cantidad relativa de cada grupo de amplicones, amplicones específicos de metilación vs. amplicones específicos de desmetilación.
En otra realización, el estado de mutilación del ácido nucleico que contiene amplificado se determina mediante un método seleccionado del grupo que consiste en secuenciación con bisulfito, COBRA, análisis de curva de fusión o matrices de metilación de ADN.
En una realización, el análisis de la región de ácido nucleico amplificado es un análisis de curva de fusión. En otra realización, el análisis del ácido nucleico amplificado es un análisis de fusión de alta resolución (HRM).
Secuencias
Tabla 2. Secuencias de ADN para sondas y cebadores
SEQ ID Gen secuencia de ADN Tamaño del NO amplicón 1 SST M1 GCG TCG AGA TGT TTT GTC
2 SST M2 CCA AAA CCA AAA CGA TAA ACA ACG 67
3 baliza SST M (HEX)CGA TCG ACC AAC GC+G CAC TAA CGA
TCG(Dabcyl)
4 SST Am AGA GTA TAT AAG TCG TTT TAG GAG C
5 SST Bm CCA AAA CCA AAA CGA TAA ACA ACG 83
6 APC M1 AGT GCG GGT CGG GAA GC
7 APC M2 AAT CGA ACT CCC GAC G 93
8 baliza APC M (HEX)CGC GAT CGT TG+G ATG CG+G AAT CGC
G(Dabcyl)
9 APC Am ATT GCG GAG TGC GGG TC
10 APC Bm AAT CGA ACT CCC GAC G 99
11 MLH1 M1 TGG TTT GGC GTT AAA ATG TC
12 MLH1 M2 AAA TAA CTT CCC CCG 100
13 baliza MLH1 M (HEX)CGC GAT CTC GTC CAA CC+G CC+G AAT ATC
GCG(Dabcyl)
14 MLH1 Am TGG TTT GGC GTT AAA ATG TC
15 MLH1 Bm CAT CTC TTT AAT AAC ATT AAC TAA CCG 124
16 SFRP1 M1 GGA GTT GAT TGG TTG CGC
17 SFRP1 M2 CGC GAC ACT AAC TCC G 90
18 baliza SFRP1 M (HEX)CGC GAT G+GT T+CG GTC G+TA ATC
GCG(Dabcyl)
19 SFRP1 Am GAG GCG ATT GGT TTT CGC
20 SFRP1 Bm CGC GAC ACT AAC TCC G 121
21 CHFR M1 GTT TCG GTT TTA GTT TCG TAT TTC
22 CHFR M2 CGA CTC CTA CGT CTA AAC GCG 102
23 Baliza CHFR M (HEX)CGC GAT CCG CA+C GT+C CAT CGC G(Dabcyl)
24 CHFR Am GTT TCG GTT TTA GTT TCG TAT TTC
25 CHFR Bm CCC TAA AAA CGA CTC CTA CG 111
26 RASSF1A M1 GGG AGG CGT TGA AGT C
27 RASSF1A M2 GTA CTT CGC TAA CTT TAA ACG 76
28 Baliza RASSF1A (HEX)CGC GAT TCG TT+C G+GT TCG CTC
M GCG(Dabcyl)
29 RASSF1A Am GGG AGG CGT TGA AGT C
30 RASSF1A Bm A ATA AAC TCA AAC TCC CCC G 115
31 CDKN2A M1 TTT CGA GTA TTC GTT TAT AGC
32 CDKN2A M2 TTT CTT CCT CCG ATA CTA ACG 113
33 Baliza CDKN2A M (HEX)CGA CGT G+AA AGA TAT CG+C G+GT ACT
TCG(Dabcyl)
ID Gen secuencia de ADN 
CDKN2A Am TGT TCG GAG TTA ATA GTA TTT TTT TC
CDKN2A Bm TTT CTT CCT CCG ATA CTA ACG
RARB M1 GGG TAT CGT CGG GGT AGA TTC
RARB M2 TCG ACC AAT CCA ACC GAA ACG
Baliza RARB M (HEX)CGC GAC GAA TA+C GTT CCG AAT CGC
G(Dabcyl)
RARB Am AGT AGG GTT TGT TTG GGT ATC
RARB Bm TCG ACC AAT CCA ACC GAA ACG
ESR1 M1 GGG ATT GTA TTT GTT TTC GTC
ESR1 M2 ACG CAA CGC ATA TCC CG
baliza ESR1 M (HEX)CGC GAT GAA CGA CCC G+AC GAT CGC
G(Dabcyl)
ESR1 Am GTT TTG GGA TTG TAT TTG TTT TC
ESR1 Bm ACG CAA CGC ATA TCC CG
BRCA1 M1 TCG TGG TAA CGG AAA AGC GCG
BRCA1 M2 CCG TCC AAA TCT CAA CG
Baliza BRCA1 M (HEX)CGA TCG G+CG GCG+TG+A GCG TAC G(Dabcyl)
BRCA1 Am
BRCA1 Bm
MESTv2 M1 CGA CGT TTT AGT TTC GAG TC
MESTv2 M2 CGC TTC CAT AAA CCA AAA ATT CTCG
Baliza MESTv2 M (HEX)CGA TCG G+TG GT+C G+GG TTC GAT
CG(Dabcyl)
MESTv2 Am GCG ATG GGT TTG TGC GC
MESTv2 Bm GAA AAA CCG ATT ACG CAT ACG
MGMT M1 GAT ATG TTG GGA TAG TTC GC
MGMT M2 GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G
Baliza MGMT M (HEX)CGC GAT CG+T ATC G+TT TG+C GAT TTA TCG
CG(Dabcyl)
MGMTAm GAT ATG TTG GGA TAG TTC GC
MGMT Bm AAA CTC CGC ACT TCCG
SEPT9v2 M1 GTT TAG TAT TTA TTT TCG AAG TTC
SEPT9v2 M2 CCT CCG CGC GAC CCG
baliza SEPT9v2 M (FAM)CGA CGT ATT TAG TTG CGC GTT GAT CGA CGT
CG(Dabcyl)
SEPT9v2 Am GTT TAG TAT TTA TTT TCG AAG TTC
SEPT9v2 Bm GCC GAA AAC GCT TCC TCG
VIM M1 ATA TTT ATC GCG TTT TCG TTC
VIM M2 ACG AAC CTA ATA AAC ATA ACT ACG
baliza VIM M (FAM)CGA CGT GTT CGC GTT ATC GTC GTC GAC GTC
G(Dabcyl)
VIM Am GAG GTT TTC GCG TTA GAG AC
VIM Bm ACG AAC CTA ATA AAC ATA ACT ACG
EYA2 M1 CGG AGG TAG CGG TAA C
EYA2 M2 CGA TAC GAA CGA ACG AAC G
baliza EYA2 M (FAM)CGA CGT GTT CGC GTT ATC GTC GTC GAC GTC
G(Dabcyl)
EYA2 Am GGG TCG GTT TTT TCG GC
SEQ ID Gen secuencia de ADN Tamaño del NO amplicón 75 EYA2 Bm ACG AAT CCC GAC GAA CG 104
76 BMP3 M1 AGT GGA GAC GGC GTT C
77 BMP3 M2 CTT ACT ACG CTA ACC CAA CG 96
78 Baliza BMP3 M (FAM)CGT CGA GCG GGT GAG GTT CGC GTA TCG
ACG(Dabcyl)
79 BMP3 Am TAG CGT TGG AGT GGA GAC
80 BMP3 Bm CCA ACC CCA CTT ACT ACG 114
81 ALX4 M1 TTT TTC GGA GGC GAT AAG TTC
82 ALX4 M2 CGA ACC CGA CTC TTA ACG 85
83 Baliza ALX4 M (FAM)CGC GAT TGT CGG TCG TCG TTA AAG TAT CGC
G(Dabcyl)
84 ALX4 Am CGT TTT CGT TCG TTT GC
85 ALX4 Bm CGA ACC CGA CTC TTA ACG 114
86 SFRP2 M1 GTT TTT CGG AGT TGC GCG C
87 SFRP2 M2 CCG AAA AAC TAA CAA CCG ACG 98
88 baliza SFRP2 M (HEX)CGA CGT TTG TAG CGT TTC GTT CGC GTT GTT
ACG TCG(Dabcvl)
89 SFRP2 Am GTT TTT CGG AGT TGC GC
90 SFRP2 Bm CTC TTC GCT AAA TAC GAC TCG 124
91 NEUROG1 M1 GTT GAT TTG ATC GTC GGC
92 NEUROG1 M2 CTC GCC TAC AAA AAC CAC G 64
93 Baliza NEUROG1 (HEX)CGC GAT GCC C+GA CC+G ATC TCC TAA ATC
M GCG(Dabcyl)
94 NEUROG1 Am GTT TAT ACG AGT TGA TTT GAT C
95 NEUROG1 Bm CTT AAC CTA ACC TCC TCG 92
96 NTPX2 M1 AGG TTA GAG TGT CGA GTA GC
97 NTPX2 M2 TCG AAA ATC GCG TAC ACC G 80
98 Baliza NTPX2 M (HEX)CGC GAT CGG TG+C GGT TGT GAG A+CG GTG
ATC GCG(Dabcyl)
99 NTPX2 Am TTC GGT AGG TTA GAG TGT C
100 NTPX2 Bm CTA TCG TCT CGA AAA TCG CG 93
101 TFPI2 M1 TAT TTT TTA GGT TTC GTT TCG GC
102 TFPI2 M2 AAA CGA CCC GAA TAC CCG 72
103 Baliza TFPI2 M (HEX)CGC GAT CGT CGG T+CG GA+C GTT CGT TGA
TCG CG(Dabcyl)
104 TFPI2 Am TAT TTT TTA GGT TTC GTT TCG GC
105 TFPI2 Bm CGA CTT TCT ACT CCA AAC G 86
106 BNC1 M1 GTA GGT AGT TAG TTG GTT TTC
107 BNC1 M2 GAA ACA AAC GAC CCG AAA CG 84
108 Baliza BNC1 M (FAM)CGC GAT CGT ATT TA+C GGG AGT CGG AGT
TTG ATC GCG(Dabcyl)
109 BNC1 Am GTA GGT AGT TAG TTG GTT TTC
110 BNC1 Bm GCG AAA ATT CTC TAT ACG 102
111 CDKN2B M1 TAT TGT ACG GGG TTT TAA GTC
112 CDKN2B M2 TTC CCT TCT TTC CCA CG 109
113 baliza CDKN2B M (HEX)CGC GAT CGA CGA CGG GAG GGT AAT GGA
TCG CG(Dabcyl)
114 CDKN2B Am GGT CGT TCG GTT ATT GTA C
SEQ ID Gen secuencia de ADN Tamaño del NO amplicón 115 CDKN2B Bm TTC CCT TCT TTC CCA CG 119
116 WNT5A M1 CGT GGA ATA GTT TGC
117 WNT5A M2 TTA AAA CAA AAC TAA AAT ACG 135
118 Baliza WNT5A M (HEX)CGC GAT CAA CCT AAT C+GA AAC GCA ACT
AAA GAT CGC G(Dabcyl)
119 WNT5A Am CGT GGA ATA GTT TGC
120 WNT5A Bm CGA ACC TAA ACT CCC G 153
121 PENK M1 AGG CGA TTT GAG TCG TTT TTA C
122 PENK M2 GAC AAC CTC AAC AAA TCG 113
123 Baliza PENK M (HEX)CGC GAT CAA AGT TGT CGG T+CG GGA GG
ATC GCG(Dabcyl)
124 PENK Am CGC GTT ATT TCG GGA ATC
125 PENK Bm GAC AAC CTC AAC AAA TCG 134
126 HIC1 M1 TTC GGT TTT CGC GTT TTG TTC
127 HIC1 M2 CGA AAA CTA TCA ACC CTC G 92
128 baliza HIC1 M (FAM)CGC GAC GGT CGT CGT TCG GGT TCG CG
(Dabcyl)
129 HIC1 Am GAT ATA ACG TTT TCG CGT C
130 HIC1 Bm ATA CCC GCC CTA ACG CCG 142
131 GSTP1 M1 TCG GGG TGT AGC GGT C
132 GSTP1 M2 CCC AAT ACT AAA TCA CGA CG 86
133 Baliza GSTP1 M (HEX)CGCGAT GTC G+G+C GGG AGT TCG ATC GCG
(Dabcyl)
134 GSTP1 Am AGG GCG TTT TGC GGT C
135 GSTP1 Bm CCC AAT ACT AAA TCA CGA CG 100
136 *MESTv1 M1 CGC GGT AAT TAG TAT ATT TC
137 *MESTv1 M2 GCT ACG ACA CTA CGC TTA CG 67
138 baliza *MESTv1 m (HEX)CGC GAT CGG TA+G T+TG CGT TAT CGC
G(Dabcyl)
139 *MESTv1 U1 TGT GGT AAT TAG TAT ATT TT
140 *MESTv1 U2 CAA CCA CTC CAA CAT ACA CTA CA 86
141 baliza *MESTv1 U (FAM)CGC GAG+TA+G T+TG+TG+T TT+T GTT CGC
G(Dabcyl)
142 **M ESTv1 A GGT TTT AAA AGT T/CGG TGT TTA TT
143 **MEST1v1 B CCI AAC TAC AAC CAC TCC 130
M1; cebador directo específico de metilación para la matriz (cebador interno)
M2; cebador inverso específico de metilación para la matriz (cebador interno)
baliza M; sonda específica de metilación
Am; cebador directo específico de metilación para la PCR anidada/semianidada (cebador externo/ 1. Ronda de PCR)
Bm; cebador inverso específico de metilación para la PCR anidada/semianidada (cebador externo/ 1. Ronda de PCR)
* Variante 1 del transcrito MEST del gen de referencia hemimetilado
** Cebador no metilado para la variante 1 del transcrito MEST del gen de referencia
Ejemplo 1
Hipermetilación del promotor del ADN libre de células en plasma como marcador de diagnóstico para el adenocarcinoma pancreático
Métodos
Diseño del estudio
Este estudio se realizó como un estudio observacional transversal del perfil de hipermetilación del ADN libre de células en plasma de pacientes con cáncer pancreático presunto o verificado por biopsia ingresados en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal del Hospital Universitario de Aalborg entre febrero de 2008 y febrero de 2011. Un grupo de control benigno adicional fueron pacientes con pancreatitis crónica tratados en el hospital o en la consulta externa del Hospital Universitario de Aalborg desde agosto de 2013 hasta agosto de 2014 y pacientes ingresados con pancreatitis aguda en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal, Hospital Universitario de Aalborg o el Departamento de Medicina General. Cirugía, Hospital de Vendsyssel desde noviembre de 2013 hasta mayo de 2015.
El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Norte de Jutlandia, Dinamarca (N-2013037) y registrado en ClinicalTrails.gov: NCT02079363. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito.
Participantes
Los pacientes con cáncer gastrointestinal superior sospechado o verificado por biopsia se incluyeron de forma prospectiva y consecutiva y se les extrajo sangre al ingreso antes del estudio de diagnóstico y antes de cualquier tipo de tratamiento. Los pacientes se dividieron en los siguientes grupos (figura 1a). En este estudio se incluyeron pacientes con adenocarcinoma pancreático (grupo de cáncer) y pacientes examinados pero que no tenían cáncer gastrointestinal superior (grupo de control 3). Los pacientes fueron excluidos si tenían cáncer previo (dentro de los tres años) o concomitante, trombofilia congénita conocida, tromboembolismo venoso previo, enfermedad del tejido conectivo o terapia anticoagulante en curso. A los pacientes con pancreatitis crónica (grupo de control 1) se les extrajo sangre durante la hospitalización o en una visita programada en la consulta externa. Los pacientes diagnosticados de pancreatitis aguda (grupo control 2) se inscribieron durante los tres primeros días de hospitalización. La historia previa de cáncer fue el único criterio de exclusión para los pacientes con pancreatitis aguda o crónica.
Muestreo de sangre y método analítico
Todas las muestras de sangre fueron obtenidas por técnicos expertos mediante venopunctura según el procedimiento recomendado por la Acción Concertada Europea sobre la Trombosis. Inmediatamente después se realizaron análisis de rutina (proteína C reactiva (PCR), leucocitos, alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (ALP), amilasa, bilirrubina). El plasma con EDTA para el análisis de metilación se centrifugó 20 min. (4000 rpm) a 4 °C y almacenado dentro de las dos horas posteriores al muestreo en un biobanco a -80 °C hasta el análisis de metilación.
Todos los análisis de metilación fueron realizados por un solo científico de laboratorio capacitado. Extracción y desaminación: los ácidos nucleicos del plasma se extrajeron usando la plataforma EasyMag (Biomerieux) según las instrucciones del fabricante. Se usaron 450 - 1000 pl de plasma con EDTA para la extracción y los ácidos nucleicos purificados se eluyeron en 35 pl de tampón de elución (Biomerieux). Se utilizaron cinco pl para la cuantificación del ADN extraído, el resto se desaminó como se describió anteriormente por nuestro grupo. En resumen, se mezclaron 30 pl de extracto de ADN con 60 pl de solución de desaminación, se desaminó durante 10 min a 90 °C, seguido de purificación con EasyMag y se eluyó en 25 pl de KOH 10 mM.
PCR: Para expandir la cantidad de ADN desaminado relevante, se realizó una primera ronda de PCR utilizando una mezcla de cebadores externos (Tabla 2) para todas las regiones promotoras investigadas. Posteriormente, se llevó a cabo una segunda ronda de PCR utilizando cada uno de los cebadores y sondas internos (Tabla 2) en reacciones individuales.
Tabla 3. Variables incluidas en el estudio. Todas las variables se analizan mediante regresión logística simple comparando el grupo de cáncer pancreático y los grupos de control 1+3
Gen valor de p AUC ALX4 0-0034 057 APC 9 67 x 10-6 065 BMP3 264 x 10-6 064 BNC1 5 02 x 10-7 065 BRCA1 06804 051
Gen valor de p AUC CDKN2A 01652 052 CDKN2B 0 0757 053 CHFR 04668 051 ESR1 0 0095 058 EYA2 0 0778 054 GSTP1 02323 051 HIC1 0 0097 055 MESTv2 0 0004 062 MGMT 0-2778 051 MLH1 0-3448 052 NPTX2 434 x 10-5 064 NEUROG1 0-3969 0-52 RARB 00348 057 RASSF1A 14 x 10-6 065 SFRP1 0 0001 062 SFRP2 00197 057 SEPT9v2 00029 056 SST 869 x 10-5 064 TFPI2 796 x 10-5 060 TAC1 3 63 x 10-5 064 VIM * 0-5 WNT5a 0 0234 054 PENK * 05 sexo 05750 052 edad60 458 x 10-6 066 edad65 114 x 10-6 067 edad70 6 06 x 10-5 062 La negrita marca los genes, donde hay una diferencia significativa (p < 0-05) en la frecuencia de hipermetilación entre el grupo de cáncer y los grupos de control 1+3.Grupo de control 1; pacientes con pancreatitis crónica. Grupo de control 3; pacientes evaluados pero que no tienen cáncer pancreático. AUC; área bajo la curva característica operativa del receptor. * VIM y PENK no pudieron evaluarse mediante regresión logística porque ninguno de los pacientes del grupo de control tenía hipermetilación de los dos genes; sin embargo, la prueba de chi-cuadrado encontró una diferencia significativa entre el grupo de cáncer y el grupo de control 1+3. A pesar de eso, VIM y PENK se excluyeron del siguiente análisis porque solo unos pocos pacientes con cáncer tenían hipermetilación de VIM o PENK.
Primera ronda de amplificación por PCR: para expandir la cantidad de ADN desaminado relevante, se realizó una primera ronda de PCR utilizando una mezcla de cebadores externos (tabla 2) para todas las regiones promotoras investigadas. El tampón de reacción para cada muestra constaba de 25 pl que contenían; Stock de PCR, 13 pM MgCI2, 0-6 mM dNTP, 250 nM de cada cebador externo (tabla 2) 1-5 U Taq polimerasa (Bioline) y 0-3 U UNG (Invitrogen). La mezcla de reacción de la primera ronda se distribuyó en tubos de PCR individuales de 200 pl y se incubó durante 5 min a 37 °C (actividad UNG), seguido de 95 °C durante 5 min. y se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron veinticinco ul de producto de desaminación purificado a cada tubo que contenía la mezcla de reacción de la primera ronda. La PCR se realizó durante 20 rondas: 92 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos.
Segunda ronda de PCR: Se distribuyeron diez pl de mezcla que contenía cebadores internos y sondas 0,4 pM (tabla 2) en 30 pocillos individuales en una placa de PCR de 96 pocillos. Se añadieron diez pl de producto de PCR de primera ronda a 710 pl de mezcla de reacción que contenía; Stock de PCR, dNTP 250 pM, MgCI2 10 pM y Taq polimerasa 15 U (Bioline). Se añadieron veinte pl de la mezcla de reacción a cada uno de los 30 pocillos que contenían cebadores y sondas. La PCR en tiempo real se llevó a cabo durante 45 rondas de 94 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos. (recocido y detección), y 72 °C durante 30 seg.
Panel de genes: Veintiocho genes (Tabla 3), que tienen el potencial de participar en el desarrollo del cáncer pancreático, fueron seleccionados para el análisis de metilación. Diseño de cebadores y sondas: "Beacon Designer" se utilizó para diseñar cebadores y sondas potenciales para los genes seleccionados. Los cebadores se diseñaron para que fueran ricos en CpG y se ubicaran cadena arriba del exón uno que se interpretó como las regiones promotoras de los genes. El diana era diseñar productos de PCR con una longitud inferior a 140 150 pares de bases, ya que lo más probable es que los fragmentos de ADN libre de células tengan una longitud de 160 pares de bases en consonancia con el tamaño del ADN nucleosomal (tabla 2).
Resultado
El resultado primario del modelo de predicción fue el adenocarcinoma pancreático.
Métodos estadísticos
Cada gen en el panel de genes se analizó como una variable binaria.
Validación de datos dicotómicos: calculamos las diferencias entre los valores del ciclo umbral (Ct) del gen de referencia hemimetilado variante 1 del transcrito MEST y los valores de Ct de cada gen para el cual Ct > 0. Para evaluar la cantidad de información perdida en la dicotomización, se produjeron histogramas de las diferencias para el grupo de cáncer y el grupo de control 1 combinado con el grupo de control 3. No se observó ninguna indicación clara de diferencia en las dos distribuciones. Esto se interpretó como una indicación de que no se perdió una cantidad significativa de información al dicotomizar los genes como hipermetilados o no metilados sin tener en cuenta el valor de Ct observado.
Se calculó la frecuencia de metilación de cada gen y el intervalo de confianza (IC) del 95% (exacto) para cada grupo. Se calculó el número medio de genes hipermetilados en cada grupo y el IC del 95%. Las medias se compararon como datos numéricos con la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon. Los valores de P inferiores a 0-05 se consideraron estadísticamente significativos.
Desarrollo de modelos de predicción
1. Detección de cada variable individual como un marcador de diagnóstico para el cáncer pancreático: La regresión logística se realizó por separado para cada gen en el panel de genes y para el tabaquismo, el género y edad>65. Se calcularon el valor p y el área bajo la curva característica operativa del receptor (AUC) (Tabla 3).
2. La selección de variables: Las variables que tienen un valor de p inferior a 0-2 fueron seleccionadas para su posterior análisis.
3. Selección del modelo: Se realizó una eliminación hacia atrás paso a paso en modelos de regresión logística para seleccionar las variables relevantes utilizando 0-05 como nivel de significancia para la eliminación del modelo. Para cada modelo intermedio, se calculó el valor AUC (figura 2).
4. Determinación del mejor modelo: La decisión se basó en la complejidad del modelo combinada con el rendimiento del modelo según el AUC.
5. Interacciones entre las variables: En el modelo final se evaluó la importancia de las interacciones entre todos los pares de variables. Los valores de P inferiores a 0-01 se consideraron estadísticamente significativos.
6. Validación: para tener en cuenta el optimismo en la validación interna del rendimiento del modelo discriminativo (medido por el AUC), se utilizó la "la validación cruzada de dejar fuera de par". Para el rendimiento de la calibración, se realizó la prueba "Hosmer-Lemeshow".
7. Puntuación de probabilidad: Para cada paciente se calculó una puntuación de probabilidad.
Todos los datos fueron analizados utilizando el software STATA 14-0.
Resultados
Noventa y cinco pacientes con adenocarcinoma pancreático se incluyeron en el estudio (figura 1a). Después del trabajo de diagnóstico (gastroscopia, ultrasonido endoscópico, resonancia magnética (RM) o tomografía computarizada (CT)) y no se encontró evidencia de malignidad, 35 pacientes fueron clasificados como pacientes examinados pero sin adenocarcinoma pancreático (grupo de control 3). Ocho pacientes fueron posteriormente excluidos de este grupo, véase la figura 1a. Se incluyeron dos grupos de control adicionales de pacientes con enfermedad pancreática benigna. En total, se incluyeron 103 pacientes con pancreatitis crónica
(grupo control 1) (figura 1b) y 62 pacientes con pancreatitis aguda (grupo control 2) (figura 1c). Posteriormente, se excluyeron seis pacientes del grupo control 1 (figura 1 b) y tres pacientes del grupo control 2 (figura 1 c). Los datos descriptivos de los cuatro grupos se pueden ver en la Figura 5.
La frecuencia de metilación de cada gen se presenta en la tabla 1. El número medio de genes metilados de todo el panel de genes (28 genes) fue de 8 ■ 41 (IC del 95%: 7 ■ 62-9 ■ 20) para el grupo con cáncer en comparación con 4 ■ 34 (95% IC 3 ■ 85-4 ■ 83) para pacientes con pancreatitis crónica (grupo de control 1), 4 ■ 89 (95% IC 4 ■ 07-5 ■ 71) para pacientes examinados pero sin cáncer pancreático ( grupo control 3) y 5 ■ 34 (IC 95% 4 ■ 76-5 ■ 91) para pacientes con pancreatitis aguda (grupo control 2). La diferencia fue estadísticamente significativa entre el grupo de cáncer y los tres grupos de control benignos (Tabla 4).
Tabla 4. Número medio de genes hipermetilados en cada grupo.
Grupo N Número medio de genes IC del 95% Valor de p metilados
Cáncer pancreático 95 8^41 (762 - 920)
Grupo de control 1; Pancreatitis 97 4^34 (3^85- 4^83)
crónica
Grupo de control 2; pancreatitis aguda 59 5^34 (477- 591)
Grupo de control 3; controles sanos 27 489 (4^07- 5^71)
Grupo de control 1+3 124 4-46 (4 04- 488) <0, 0001 * grupo control 1+2+3 183 474 (440- 5^08) <0,0001** Las medias se compararon como datos numéricos con la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon. Los valores de P inferiores a 0-05 se consideraron estadísticamente significativos.
* Diferencia significativa entre pacientes con cáncer pancreático y grupo control 1+3
** Diferencia significativa entre pacientes con cáncer pancreático y grupo control 1+2+3
Desarrollo del modelo: en los siguientes análisis, elegimos combinar los grupos de control 1 y 3. El grupo combinado tiene síntomas similares a los del cáncer pancreático, lo que hace que un biomarcador para distinguirlos del cáncer pancreático sea de suma relevancia. Para el resto del análisis se excluyeron los pacientes con pancreatitis aguda, ya que rara vez se observa un cuadro clínico de inflamación aguda en el cáncer pancreático. Hubo una diferencia altamente significativa (p < 0^001) entre el grupo de cáncer y el grupo de control 1+3 en la frecuencia de hipermetilación de diez genes (APC, BMP3, BNC1, MESTv2, NPTX2, RASSF1A, SFRP1, SST, TFPI2 y TAC1) (Tabla 3) y diferencia significativa (p < 0^05) en siete genes (ALX4, ESR1, HIC1, RARB, SFRP2, SEPT9v2 y WNT5A) (Tabla 1). VIM y PENK no pudieron evaluarse mediante regresión logística ya que ninguno de los pacientes del grupo de control tenía hipermetilación de estos dos genes (Tabla 3 y tabla 4). No hubo diferencia significativa en el género, razón por la cual esta variable fue excluida del siguiente análisis. Fumar, sin embargo, fue un factor preventivo del cáncer al comparar pacientes con cáncer pancreático y pacientes con pancreatitis crónica. Por lo tanto, fumar se excluyó del modelo, ya que es un factor de riesgo conocido para el cáncer. Dividiendo a los pacientes en grupos según la edad; >65 año, < =65 año, se encontró una diferencia estadísticamente significativa. Como consecuencia, edad>65 se incluyó en el análisis de regresión logística multivariable.
Todos los genes con un valor p individual por debajo de 0^20 (20 genes de 28 genes examinados) y edad>65, se incluyeron en el modelo de regresión logística multivariable. Se realizó una selección por estadios hacia atrás (figura 2). El modelo inicial (modelo 1) con 20 genes tenía un AUC de 0^87 (figura 2). Eliminando los 12 genes menos significativos del modelo, quedan ocho genes (modelo 13; edad>65, BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2) dieron como resultado un AUC de 086 (95% IC 0^81-0^91) (figura 2 y 3). La probabilidad media de tener cáncer pancreático fue de 0^67 (0^61-0^72) para los pacientes con cáncer y de 0^26 (0^22-0^29) para los grupos de control 1+3. El modelo 13 se determinó como el modelo con mejor desempeño (punto de corte de probabilidad de 050; sensibilidad 75^79% y especificidad 83 06%). No hubo interacciones estadísticamente significativas entre las variables en el modelo 13. El modelo estaba bien calibrado (p=0^40) y tuvo un optimismo estimado en AUC de 0^03.
Cuarenta pacientes tenían tumores en estadio I o II. El modelo 13 tuvo un AUC aparente de 086 (95% IC 0^79-0^92) para tumores en estadio I/II (punto de corte de probabilidad de 050; sensibilidad 72^50% y especificidad 83^06%) (figura 4) con un optimismo en AUC de 0^6.
Discusión
Examinamos la hipermetilación del promotor de ADN libre de células de 28 genes en plasma de pacientes con cáncer pancreático (n=95) y lo comparó con tres grupos de control diferentes. El panel de genes estaba
compuesto por genes probados previamente en relación con el cáncer pancreático (BNC1, NPTX2, PENK, CDKN2A, RASSF1A, SFRP1 (SARP2), APC, BRCA1, CDKN2B, ESR1, MGMT, MLH1, RARB) y genes que no han anteriormente en plasma de pacientes con cáncer pancreático (ALX4, BMP3, CHFR, EYA2, GSTP1, HIC1, SFRP2, MESTv2, NEUROG1, SEPT9v2, SST, TFPI2, TAC1, VIM, WNT5a). Este es el primer estudio que examina la hipermetilación del ADN libre de células en una amplia selección de genes mediante PCR específica de metilación en un gran grupo de pacientes con enfermedad pancreática benigna o maligna.
Se encontró una diferencia estadísticamente significativa en el estado de hipermetilación en 19 de los 28 genes al comparar pacientes con cáncer pancreático y un grupo de control que contenía pacientes examinados, pero que no tenían cáncer pancreático, así como en pacientes con pancreatitis crónica. La hipermetilación del ADN libre de células de BMP3, MESTv2, SST, TFPI2, TAC1, ALX4, HIC1, SFRP2, SEPT9v2 y WNT5A no se ha descrito previamente en la literatura en relación con el cáncer pancreático. Yi et al. describieron que la hipermetilación de BNC1 tiene una sensibilidad del 79% y una especificidad del 89% al comparar el cáncer pancreático con individuos sanos. Parque et al. examinaron la hipermetilación de un pequeño panel de genes (NPTX2, RASSF1A, SFRP1, UCHL1, PENK y p16 (CDKN2A)) mediante PCR específica de metilación. El panel de genes pudo diferenciar el cáncer pancreático de los controles sanos, sin embargo, no pudo discriminar la enfermedad pancreática benigna de la maligna.
El ejemplo muestra que los pacientes con cáncer pancreático tienen un nivel más alto de genes hipermetilados en el ADN libre de células derivado del plasma en comparación con los grupos de control relevantes. En consistencia con estudios previos, nuestro panel de genes no demostró un solo gen que tuviera el potencial de ser utilizado como marcador de diagnóstico para el cáncer pancreático. Esto sugiere que se necesita un panel de genes más grande para lograr una precisión suficiente. Desarrollamos un modelo de predicción (edad>65, BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, Tf PI2, APC, SFRP1 y SFRP2) que pudo diferenciar entre el cáncer pancreático y un gran grupo de control relevante formado por pacientes con pancreatitis crónica o pacientes derivados al hospital con síntomas de cáncer pancreático. El AUC fue alto y el valor predictivo de nuestro modelo es superior al valor predictivo de CA-19-9, en particular teniendo en cuenta que CA-19-9 depende en gran medida del estado del grupo sanguíneo de Lewis de los pacientes. Sólo Lea+b o los individuos Lea-b+ son capaces de expresar CA-19-9, y no los individuos Leab que representan 5-10% de la población caucásica. CA-19-9 pudo en un estudio reciente diferenciar pacientes con cáncer pancreático en estadio I-II de pacientes con pancreatitis crónica con un AUC de 0-77 (sensibilidad del 53% y una especificidad de 91 -9%) y pacientes con cáncer pancreático de pacientes con obstrucción biliar benigna con un AUC de sólo 0 -65.6 Nuestro estudio incluyó pacientes con cáncer pancreático en estadio I-IV. Es muy importante diagnosticar a los pacientes con enfermedad en estadio I y II, ya que la detección temprana en este estadio de la enfermedad tiene el potencial de mejorar el resultado de la cirugía. Probamos nuestro modelo en la enfermedad en estadio I y II y encontramos un AUC de 0-86. Esto muestra que el rendimiento del modelo de predicción es independiente del estadio del cáncer. La alteración en la hipermetilación del ADN es detectable en plasma incluso en la estadio temprana de la enfermedad y, por lo tanto, potencialmente utilizable como marcador de diagnóstico temprano.
Para distinguir mejor la hipermetilación del ADN relacionada con la enfermedad pancreática maligna y benigna, se incluyeron pacientes con pancreatitis aguda. El objetivo fue lograr un conocimiento más básico sobre el ADN hipermetilado durante la causa de una reacción inflamatoria pancreática aguda, que no se ha descrito antes en la literatura. Nuestro estudio muestra que la hipermetilación del ADN tiene lugar durante la pancreatitis aguda; sin embargo, los cambios son más pronunciados en pacientes con cáncer pancreático.
Los datos proporcionados en este documento tienen varios puntos fuertes. Probamos la hipermetilación del ADN libre de células de un amplio panel de genes en plasma de un gran grupo de pacientes con cáncer pancreático, todos incluidos de forma prospectiva y consecutiva, antes del diagnóstico y antes de cualquier tratamiento. Incluimos un gran grupo de control relevante de pacientes con enfermedad pancreática benigna o síntomas que simulan el cáncer pancreático. Utilizamos un método optimizado de PCR específico para metilaciones, con una sensibilidad mejorada en comparación con los métodos anteriores. Sin embargo, el estudio también tiene algunas limitaciones. Al final de los análisis descubrimos que el uso de UNG (Invitrogen) tenía una tendencia a bajar la sensibilidad en comparación con el uso de COD UNG (ArcticZymes). Todas nuestras muestras se analizan con UNG (Invitrogen), ya que no fue posible repetir todos los análisis con COD UNG (ArcticZymes) por falta de material de muestra. Además, los pacientes no se emparejan según la edad, lo cual se debe tener en cuenta porque los cambios epigenéticos pueden ser parte del envejecimiento. Para abordar este problema, incorporamos la edad en nuestro modelo de predicción.
Conclusión
Este ejemplo muestra diferencias estadísticamente significativas en la hipermetilación de varios genes entre enfermedades pancreáticas malignas y benignas. Los pacientes con cáncer pancreático tienen un mayor número de genes hipermetilados en comparación con los pacientes con enfermedad pancreática benigna. Según los datos proporcionados en este ejemplo, las alteraciones en la hipermetilación del ADN libre de células se pueden aplicar como biomarcadores en sangre para el cáncer pancreático.
Ejemplo 2
Hipermetilación del promotor del ADN libre de células en plasma como marcador de diagnóstico para el adenocarcinoma pancreático
Métodos
Diseño del estudio
Este estudio se realizó como un estudio observacional transversal de la hipermetilación del ADN libre de células derivadas del plasma de pacientes con cáncer pancreático, que ingresaron en el Departamento de Cirugía Gastrointestinal del Hospital Universitario de Aalborg desde febrero de 2008 hasta febrero de 2011.(21) Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio se registró en ClinicalTrails.gov: NCT02079363 y fue aprobado por el Comité de ética de investigación de la región del norte de Dinamarca (N-2013037).
Participantes
Se incluyeron prospectiva y consecutivamente pacientes con sospecha de cáncer del tracto gastrointestinal superior o con confirmación por biopsia. Se extrajeron muestras de sangre al ingreso antes del estudio diagnóstico y antes de cualquier tipo de tratamiento. En este estudio solo se incluyeron pacientes con adenocarcinoma pancreático (figura 7). Los pacientes fueron excluidos si tenían cáncer previo (dentro de los tres años) o concomitante, trombofilia congénita conocida, tromboembolismo venoso previo, enfermedad del tejido conectivo o terapia anticoagulante en curso. Los datos de los mismos pacientes se publicaron en un estudio anterior sobre la hipermetilación del ADN como marcador de diagnóstico para el cáncer pancreático.
Diagnóstico y clasificación de estadios.
Se realizó tomografía computarizada o PET de tórax y abdomen en el trabajo de diagnóstico de todos los pacientes. El análisis histopatológico de muestras de biopsia obtenidas por ecografía endoscópica o laparoscópica confirmó el diagnóstico de cáncer. Los pacientes fueron estadificados según la clasificación AJCC TNM 7'. Las categorías T y N se determinaron mediante análisis histopatológico para pacientes que se sometieron a cirugía curativa prevista. Si no se realizaba la cirugía, la decisión clínica final determinaba las categorías T y N. El estadio del cáncer y el tratamiento de todos los pacientes se discutieron en una conferencia del equipo multidisciplinario, donde se tomó una decisión final.
Muestreo de sangre y método analítico
Las muestras de sangre fueron obtenidas por técnicos expertos. El plasma con EDTA para el análisis de metilación se centrifugó 20 min. (4000 rpm) a 4 °C y almacenado dentro de las dos horas posteriores al muestreo en un biobanco a -80 °C hasta el análisis de metilación.
Todos los análisis de metilación fueron realizados por un solo científico de laboratorio experto. La extracción y desaminación del ADN libre de células se realizó como se describe por nuestro grupo. Se realizó una primera ronda de amplificación por PCR para expandir la cantidad de ADN desaminado relevante. Se utilizó una mezcla de cebadores externos para todas las regiones promotoras investigadas (tabla 2). Posteriormente, se llevó a cabo una segunda ronda de PCR utilizando cada uno de los cebadores y sondas internos en reacciones individuales (tabla 2).
El panel de genes constaba de 28 genes (tabla 1), todos con el potencial de participar en el desarrollo del cáncer pancreático.
Resultado
El resultado primario de los modelos de predicción pronóstica fue el estadio del cáncer según la estadificación del AJCC. Se desarrollaron modelos para diferenciar (estadio I, II, III vs IV), (estadio I, II vs III, IV), (estadio I, IIa vs IIb) y (estadio I, II vs III).
Métodos de análisis estadísticos
La validación de los datos dicotómicos se describió en nuestro estudio anterior.
Los pacientes se dividieron en grupos según la estadificación del AJCC. Se calculó la media del número de genes hipermetilados y el intervalo de confianza (IC) del 95% (exacto) para cada grupo. Las medias se compararon como datos numéricos con la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon. Un valor de p de dos colas inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Desarrollo del modelo de predicción de pronóstico:
1. Detección de cada variable individual como un marcador de diagnóstico para el cáncer pancreático: La regresión logística se realizó por separado para cada gen en el panel de genes y para edad>65, género y puntuación ASA. Se calcularon el valor p y el área bajo la curva característica operativa del receptor (AUROC) (Tabla complementaria 3).
2. La selección de variables: Las variables que tienen un valor de p inferior a 0,3 fueron seleccionadas para su posterior análisis.
3. Selección del modelo: Se realizó una eliminación hacia atrás paso a paso en modelos de regresión logística para seleccionar las variables relevantes utilizando 0,10 como nivel de significancia para la eliminación del modelo. Para cada modelo intermedio, se calculó el valor AUROC.
4. Determinación del mejor modelo: el rendimiento del modelo según AUROC combinado con la complejidad del modelo determinaron el mejor modelo.
5. Interacciones entre las variables: En el modelo final se evaluó la significancia de las interacciones entre todos los pares de variables. Los valores de p inferiores a 0,01 se consideraron estadísticamente significativos.
6. Validación: Se utilizó la "validación cruzada de dejar el par fuera" (23) para tener en cuenta el optimismo en la validación interna del rendimiento del modelo discriminativo (medido por AUROC). Para el rendimiento de la calibración, se realizó la prueba "Hosmer-Lemeshow".
7. Puntuación de probabilidad: Para cada paciente se calculó una puntuación de probabilidad.
Todos los datos fueron analizados utilizando el software STATA 14.0.
Resultados
Noventa y cinco pacientes con adenocarcinoma pancreático se incluyeron en el estudio (figura 1). Los datos descriptivos de los pacientes se muestran en la tabla 5.
Tabla 5. Datos demográficos de pacientes con adenocarcinoma pancreático (n=95)
* Clasificación del estadio del American Joint Committee on Cancer
(AJCC) según T (tumor primario), N (ganglios linfáticos regionales) y
M (metástasis a distancia).
Las frecuencias de metilación de cada gen en cada estadio del cáncer se enumeran en la figura 13. El número medio de genes metilados de todo el panel de genes (28 genes) fue de 7,09 (5,51-8,66)) para pacientes con enfermedad en estadio I (IA y IB) en comparación con 7,00 (5,93-8,07) para pacientes con estadio II (IIA y IIB), 6,77 (5,08-8,46) para pacientes con enfermedad en estadio III y 10,24 (8,88-11,60) para pacientes con enfermedad en estadio IV. No hubo diferencia significativa en el número medio de genes metilados en la enfermedad en estadio I, II y III. La diferencia fue estadísticamente significativa entre los estadios (I, II y III) y el estadio (IV) de la enfermedad (Tabla 6).
Tabla 6. Número medio de genes metilados según estadio AJCC*
N Media IC del 95% P
11 7,09 (5,528,67)
N Media IC del 95% P
13 6,77% (5,088,46)
42 10,24 (8,88 11,60)
40 7,03 (6,177,88)
55 9,42 (8,26 10,58) 0,0078**
** Clasificación del estadio del American Joint Committee on Cáncer (AJCC) según T (tumor primario), N (ganglios linfáticos regionales) y M (metástasis a distancia).
IC; Intervalo de Confianza
** diferencia significativa entre estadios I, II vs III,IV
*** diferencia significativa entre estadios I, II vs III,IV
Estadio I, II, III vs IV
En los siguientes análisis, pacientes con estadio I, II o III (n = 53) la enfermedad se agrupa y se compara con el estadio IV (n=42) enfermedad para desarrollar un modelo para diferenciar entre pacientes con cáncer pancreático con metástasis a distancia y pacientes con cáncer pancreático sin metástasis a distancia. Hubo una diferencia significativa entre el estadio I, II y III y el estadio IV en la frecuencia de hipermetilación de siete genes (ALX4, BNC1, HIC1, Sept9v2, SST, TFPI2 y TAC1) (figura 12 y tabla 7). No hubo diferencias estadísticamente significativas en el sexo, la edad o la puntuación ASA entre los grupos. Hubo una tendencia a que más pacientes con metástasis a distancia tuvieran una puntuación ASA de tres, a pesar de que la puntuación As a , la edad y el sexo se excluyeron del análisis posterior. Todos los genes con un valor de p individual inferior a 0,30 (17 genes de los 28 genes examinados) (Tabla 7) se incluyeron en el modelo de regresión logística multivariable. Se realizó una selección paso a paso hacia atrás. La selección paso a paso de genes se aclara con el AUROC correspondiente (figura 8). El modelo inicial (modelo 1) con los 17 genes tenía un AUROC de 0,8886 (figura 8). Eliminar los nueve genes menos significativos del modelo, dejando ocho genes en el panel (Modelo 10; SEPT9v2, SST, ALX4, CDKN2B, HIC1, MLH1, NEUROG1, BNC1) dio como resultado un AUROC de 0,87 (figuras 2 y 3). Probabilidad media de 0,26 (0,20-0,31) para pacientes con cáncer en estadio I, II o III en comparación con la probabilidad media de 0,67 (0,59-0,76) para pacientes con enfermedad en estadio IV. El modelo 10 se determinó como el modelo con mejor desempeño (punto de corte de probabilidad de 0,55; sensibilidad 73,81% y especificidad 86,79%) (figura 9). No hubo interacciones estadísticamente significativas en el Modelo 10. El modelo estaba bien calibrado (p=0,18) y tuvo un optimismo estimado en AUROC de 0,05.
Tabla 7. Variables incluidas en el estudio. Todas las variables se analizan mediante regresión logística simple.
ALX4 0,0018 0,64 0,0333 0,59 APC 0,4163 0,53 0,6485 0,52 BMP3 0,2143 0,56 0,1296 0,58 BNC1 0,0002 0,69 0,0006 0,68 BRAC1 0,3458 0,53 0,5943 0,52 CDKN2B 0,1636 0,55 0,2304 0,54 CHFR * 0,50 * 0,50 ESR1 0,2590 0,55 0,1182 0,57 EYA2 0,8793 0,51 0,7505 0,51 GSTP1 0,4419 0,51 * 0,50 HIC1 0,0192 0,59 0,1949 0,55 MESTv2 0,6699 0,52 0,8301 0,51 MGMT 0,4723 0,52 0,3259 0,52 MLH1 0,2960 0,54 0,1019 0,56 NPTX2 0,0908 0,58 0,3665 0,54 NEUROG1 0,0965 0,56 0,1524 0,55 RARB 0,5218 0,53 0,8264 0,51
RASSF1A 0,5822 0,53 0,4388 0,54 SFRP1 0,1551 0,57 0,4814 0,54 SFRP2 0,0511 0,60 0,5015 0,53 SEPT9v2 0,0031 0,65 0,0189 0,61 SST 0,0009 0,67 0,0444 0,60 TFPI2 0,0124 0,61 0,1136 0,57 TAC1 0,0030 0,65 0,0550 0,60
VIM 0,4419 0,51 0,7559 0,51 WNT5a 0,2865 0,53 0,1110 0,55 CDKN2A 0,0807 0,55 0,2227 0,53 PENK * 0,50 * 0,50 Sexo 0,1789 0,57 0,6716 0,52 edad65 0,3544 0,55 0,2050 0,56
La negrita marca los genes, donde hay una diferencia significativa (p < 005) en la frecuencia de hipermetilación entre los dos
AUC; área bajo la curva característica operativa del receptor.
* Genes que no pudieron evaluarse mediante regresión logística porque uno de los grupos no contenía pacientes con hipermetilación de este gen específico.
Estadio I, II, vs. III, IV
Pacientes con estadio I o II (n = 40) la enfermedad se combina y se compara con el estadio III o IV (n=55) desarrollar un modelo para diferenciar entre pacientes con cáncer pancreático potencialmente resecable (estadio I o II) y pacientes con cáncer pancreático no resecable (estadio III o IV). Hubo diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre el estadio I o II y el estadio III o IV en la frecuencia de hipermetilación de cuatro genes (ALX4, BNC1, Sept9v2, SST) (figura 12 y tabla 7) y ninguna diferencia estadísticamente significativa en género, edad o puntuación ASA. Todos los genes con un valor de p individual por debajo de 0,30 (14 genes de los 28 genes examinados) (tabla 7) se incluyeron en el análisis de regresión logística multivariable utilizando selección paso a paso hacia atrás. El modelo 1 con los 14 genes tuvo un AUROC de 0,8330 (figura 10). Eliminar los seis genes menos significativos del modelo, dejar ocho genes en el panel (Modelo 7; MLH1, SEPT9v2, BNC1, ALX4, CDKN2B, NEUROG1, WNT5A y TFPI2) dió como resultado un AUROC de 0,8211 (figuras 10 y 11). El modelo 7 se determinó como el modelo con mejor rendimiento para diferenciar entre cáncer pancreático en estadio I o II y estadio III o IV (punto de corte de probabilidad de 0,66; sensibilidad 72,73% y especificidad 80%). No hubo interacciones estadísticamente significativas entre las variables en el modelo 7. El modelo estaba bien calibrado (p=0,2750) y tuvo un optimismo estimado en AUROC de 0,06.
Estadio I, IIa vs IIb
No fue posible diferenciar a los pacientes con cáncer pancreático con metástasis en los ganglios linfáticos (estadio IIb) de los pacientes sin metástasis en los ganglios linfáticos (estadio I o IIa) según el perfil de hipermetilación.
Estadio I, II vs III
El perfil de hipermetilación no fue capaz de diferenciar el tumor primario irresecable (T4) de los tumores primarios potencialmente resecables (T1-T3).
Discusión
Examinamos la hipermetilación del promotor del ADN libre de células de 28 genes en plasma de pacientes con cáncer pancreático y mostramos que la alteración en la hipermetilación del ADN libre de células es detectable en todas las estadios del cáncer, lo cual es consistente con estudios previos. En nuestro estudio, los pacientes con enfermedad en estadio IV se destacan por tener un número significativamente mayor de genes hipermetilados en el ADN libre de células que la enfermedad en estadio I, II y III. Esto puede deberse a una metástasis a distancia que da como resultado una mayor cantidad de ADN libre de células y una acumulación de cambios epigenéticos durante el desarrollo del cáncer. La asociación entre un estadio de cáncer pancreático
más avanzado y un mayor número de genes hipermetilados en el ADN libre de células no se ha descrito previamente. Dos pequeños estudios sobre la hipermetilación del ADN libre de células en el cáncer pancreático no pudieron demostrar esta asociación. Sato et al. demostraron la presencia de metilaciones aberrantes en tejido pancreático de lesiones precursoras tempranas (neoplasia intraductal pancreática (PanIN-1)), y encontraron un aumento en la prevalencia de metilación de PanIN-1 a PanIN-3, lo que sugiere que las hipermetilaciones de ADN aumentan progresivamente durante la progresión neoplásica. Nuestro estudio no puede demostrar que la alteración epigenética detectable en el ADN libre de células también se acumule desde el estadio I hasta el estadio III de la enfermedad, lo que probablemente se deba a una potencia insuficiente.
Encontramos que la hipermetilación del ADN libre de células de siete genes (ALX4, BNC1, HIC1, SEPT9v2, SST, TFPI2 y TAC1) se asoció significativamente con el cáncer pancreático con metástasis a distancia. Esto no ha sido descrito previamente. Zhao et al. encontró que la hipermetilación de HIC1 era significativamente mayor en el tejido de cáncer pancreático en estadio III y IV en comparación con el estadio I y II. La hipermetilación del ADN libre de células de TFPI2 también se ha asociado con el cáncer colorrectal en estadio cuatro. A diferencia del cáncer pancreático, se ha encontrado hipermetilación de ALX4 y SEPT9v2 con la misma frecuencia en todas las estadios del tejido del cáncer colorrectal. Además, la hipermetilación de SEPT9v2 fue detectable en el ADN libre de células de pacientes con cáncer colorrectal en todas las estadios, lo que sugiere que SEPT9v2 no está asociado con metástasis a distancia en el cáncer colorrectal.
Un estudio reciente sobre el cáncer colorrectal describió un panel de diez genes (incluyendo BNC1) que estaba hipermetilado con mayor frecuencia en tejido de adenomas y cáncer colorrectal en estadio temprana en comparación con tejido de cáncer colorrectal metastásico. Esto sugiere que las hipermetilaciones no solo se acumulan, sino que también cambian a lo largo de la progresión del cáncer. En este estudio desarrollamos dos paneles de genes; un panel para distinguir el estadio I, II, III del IV y un panel para distinguir el estadio I, II del III y IV. Los paneles se superponen con cinco genes de ocho, lo que indica que las hipermetilaciones específicas son importantes en diferentes estadios del cáncer. Anteriormente analizamos los mismos 28 genes como marcador de diagnóstico para el cáncer pancreático y encontramos un panel de genes alternativo para diferenciar entre pacientes con enfermedad pancreática benigna y maligna. Solo BNC1 fue recurrente en los paneles de genes de diagnóstico y pronóstico. Esto nuevamente apoya la hipótesis de que la alteración en la hipermetilación del ADN está cambiando durante la causa del cáncer pancreático.
Desarrollamos dos marcadores pronósticos, que son capaces de diferenciar a los pacientes con cáncer pancreático según el estadio. En particular, el panel de genes para distinguir pacientes con metástasis a distancia (estadio IV) de pacientes sin metástasis a distancia (estadios I, II y III), tiene un rendimiento muy alto. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se describen modelos de predicción de pronóstico basados en alteraciones en la hipermetilación del ADN libre de células con respecto al cáncer pancreático. Los paneles de genes tienen el potencial de usarse como complementos de las herramientas de diagnóstico existentes en la clasificación por estadios de pacientes con cáncer pancreático. Los paneles de genes son marcadores basados en sangre que son mínimamente invasivos y, por lo tanto, de gran beneficio para los pacientes. Además, el método analítico no es un procedimiento lento, sino que se puede realizar en solo dos horas. Los marcadores de pronóstico basados en la hipermetilación del ADN libre de células no dependen del estado del grupo sanguíneo como CA-19-9,(9) lo cual es una ventaja significativa. Sin embargo, se necesita una validación externa antes de que los marcadores de pronóstico puedan aplicarse en un entorno clínico.
Algunos de los grupos contenían un número limitado de pacientes. Esto podría dar como resultado una falta de potencia y, por lo tanto, una falta de diferencia en el perfil de metilación entre la estadio I, IIa vs IIb y la estadio I, II vs III. Al final de los análisis descubrimos que el uso de UNG (Invitrogen) tenía una tendencia a bajar la sensibilidad en comparación con el uso de COD UNG (ArcticZymes). Todas las muestras de nuestro estudio se analizaron mediante UNG (Invitrogen). Debido a la falta de material de muestra, fue imposible repetir el análisis con COD UNG (ArcticZymes). Aun así, la hipermetilación del ADN libre de células derivadas del plasma de un amplio panel de genes se probó en un gran grupo de pacientes que tenían adenocarcinoma pancreático. Los pacientes fueron incluidos de forma prospectiva y consecutiva. Se obtuvieron muestras de sangre antes del diagnóstico y de cualquier tratamiento. Todos los pacientes tuvieron un trabajo de diagnóstico sistemático y completo para asegurar el diagnóstico correcto y la clasificación de estadios. Se realizó una PCR específica de metilación con un método optimizado de tratamiento con bisulfito, que tiene una sensibilidad mejorada en comparación con los métodos anteriores.
Conclusión
Nuestro estudio muestra alteraciones detectables en la hipermetilación del ADN del ADN libre de células derivado del plasma, incluso en el cáncer pancreático en estadio temprano. Las hipermetilaciones se acumulan y cambian durante el desarrollo neoplásico y con el agravamiento de la estadio del cáncer. Con un alto rendimiento, los paneles de genes pueden diferenciar a los pacientes con cáncer pancreático según el estadio del cáncer. Según nuestro estudio, las alteraciones en la hipermetilación del a Dn libre de células tienen el potencial de ser marcadores de pronóstico basados en la sangre para el cáncer pancreático y un complemento de las herramientas clínicas existentes en la clasificación por estadios.
Claims (10)
1. Un método para determinar el cáncer pancreático en un sujeto humano, comprendiendo dicho método en el ADN libre de células de una muestra de sangre de dicho sujeto humano la determinación del estado de mutilación de los genes loci BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2.
2. Un método para evaluar si un sujeto humano tiene cáncer pancreático, comprendiendo dicho método a) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto humano,
b) aislar ADN libre de células de dicha muestra de sangre,
c) determinar en dicha muestra el estado de metilación de los loci de los genes BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2,
d) sobre la base de dicho estado de metilación identificar a un sujeto humano que tiene cáncer pancreático.
3. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muestra de sangre es una muestra de plasma.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la presencia de alelos de ácidos nucleicos metilados son indicativos de cáncer pancreático.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho estado de metilación se determina mediante PCR específica de metilación (MSP).
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método comprende las etapas adicionales de
i) proporcionar una muestra de sangre de dicho sujeto humano,
ii) aislar material de ácido nucleico, tal como ADN libre de células, de dicha muestra de sangre, iii) modificar dicho ácido nucleico usando un agente que modifica la citosina no metilada, iv) amplificar una porción de dichos loci de genes utilizando cebadores, que reconocen específicamente los alelos de ácidos nucleicos modificados y/o cebadores, que reconocen específicamente los alelos de ácidos nucleicos no modificados, obteniendo así un producto de amplificación, y
v) detectar la cantidad de producto de amplificación generado a partir de cebadores específicos para alelos de ácido nucleico modificado y/o alelos de ácidos nucleicos no modificados.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho estado de metilación se determina amplificando al menos una parte de dichos loci génicos utilizando al menos un par de cebadores seleccionados de las secuencias de ácido nucleico expuestas en la tabla 2 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1-135).
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho estado de metilación se determina amplificando al menos una parte de dichos loci génicos, y en donde la parte amplificada se detecta utilizando al menos una sonda de oligonucleótidos, en donde dicho cebador y/o la sonda se selecciona de los cebadores y sondas establecidos en la tabla 2.
9. Uso de un cebador de oligonucleótidos que comprende una secuencia, que es una subsecuencia de un locus génico seleccionado del grupo que consiste en BMP3, RASSF1A, BNC1, MESTv2, TFPI2, APC, SFRP1 y SFRP2 o el complemento de los mismos para diagnosticar cáncer pancreático en un método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
10. El uso según la reivindicación 9, en donde icho cebador oligonucleotídico se selecciona de las secuencias de ácido nucleico expuestas en la tabla 2 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1-135).
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