ES2927919T3 - Uso terapéutico de composiciones biocompatibles y materiales polimerizados a partir de las mismas para la inhibición de la angiogénesis - Google Patents

Uso terapéutico de composiciones biocompatibles y materiales polimerizados a partir de las mismas para la inhibición de la angiogénesis Download PDF

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Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de una composición biocompatible, que se puede polimerizar para producir un material que forma hidrogel y que se basa en un polímero hidrofílico, para inhibir y/o prevenir la angiogénesis o la proliferación de células endoteliales, donde el polímero hidrofílico es cruzado. albúmina de suero enlazable o proteína de suero enlazable. La invención se refiere además al uso de un material polimerizado formador de hidrogel, obtenido por polimerización de una composición a base de albúmina sérica o proteínas séricas, para inhibir y/o prevenir la angiogénesis o la proliferación de células endoteliales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Uso terapéutico de composiciones biocompatibles y materiales polimerizados a partir de las mismas para la inhibición de la angiogénesis
La presente invención se refiere al uso terapéutico de una composición biocompatible y de un material polimerizado a partir de la misma, a base de polímero hidrofílico reticulable, para la inhibición y/o prevención de la angiogénesis. Como angiogénesis se designa la formación de nuevas estructuras vasculares, que presentan un revestimiento de células endoteliales así como también células de músculo liso y pericitos. La angiogénesis desempeña un gran papel tanto en el caso de procesos fisiológicos, por ejemplo, en el desarrollo embrionario y la cicatrización de heridas, como también en el caso de procesos patológicos, por ejemplo, en el caso de poliartritis y crecimiento tumoral. En la investigación y la literatura se han utilizado y se utilizan en parte tres términos diferentes para la nueva formación de vasos sanguíneos - vasculogénesis, angiogénesis, arteriogénesis - en donde el término angiogénesis ha prevalecido hoy en día como un término general para todas las formas de nueva formación de vasos sanguíneos, ya que una delimitación de las tres formas mencionadas es parcialmente difícil y el principio subyacente es uniforme. En el caso de la angiogénesis se trata de un proceso complejo, en el que las células endoteliales, los pericitos y las células de músculo liso necesarios para la formación de las paredes vasculares se activan por distintos factores de crecimiento angiogénicos, por ejemplo por el factor de crecimiento de fibroblastos "Fibroblast Growth Factor (FGF)" y/o el factor de crecimiento endotelial vascular "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)". Se crean nuevos capilares por proliferación y migración de células endoteliales ya presentes en el tejido en cuestión.
La angiogénesis tiene una importancia biológica y médica considerable, en donde se distinguen dos aplicaciones terapéuticas de la angiogénesis, el tratamiento proangiogénico y el tratamiento antiangiogénico o no angiogénico. En el primero, se debe estimular la nueva formación de vasos sanguíneos, en particular mediante el uso y la administración de factores de crecimiento, tal como por ejemplo para el tratamiento de la arteriosclerosis, en particular de la enfermedad arterial coronaria y de la enfermedad oclusiva periférica.
Un tratamiento antiangiogénico o no angiogénico se utiliza en particular allí donde la nueva formación de vasos sanguíneos está absolutamente impedida y es indeseada, tal como por ejemplo en el tratamiento de tumores, ya que los tumores sólidos dependen de una red capilar que crece con ellos, que suministra oxígeno y nutrientes al tumor. En consecuencia, los enfoques terapéuticos antiangiogénicos intentan reducir/bloquear el suministro vascular y, por lo tanto, el flujo de sangre a un tumor. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales neutralizantes de VEGF se han usado para un tratamiento antiangiogénico de tumores en el estado de la técnica.
También en el caso de otras enfermedades, como la enfermedad de Crohn, soriasis y artritis reumatoide, la angiogénesis sin impedimentos desempeña un papel importante, dado que a través de los vasos formados de nuevo se crea un flujo de entrada constante de poblaciones de células inflamatorias a los sitios afectados en el organismo. Una visión general de las enfermedades y afecciones, que están directamente relacionadas con una angiogénesis, se puede encontrar, por ejemplo, en la Tabla 1 de la publicación de Polverini, "Angiogenesis in health and Disease: Insights into Basic Mechanisms and Therapeutic Opportunities", Journal of Dental Education, (2002) vol. 66, 962­ 975.
También en el caso de dispositivos/implantes médicos que pueden implantarse, o sea por ejemplo implantes con los que debe sustituirse tejido dañado, o endoprótesis/injertos de endoprótesis, que se introducen en determinados órganos para sostener su pared, a menudo es un requisito previo para el uso exitoso a largo plazo que estos no fomente la nueva formación de vasos sanguíneos en el sitio en el que se han implantado, sino que se introduzcan a ser posible de manera neutra e inerte en el tejido que los rodea, donde dado el caso también se reabsorben. En estos casos existe, en el caso de implantes médicos, un gran riesgo de que las células endoteliales se adhieran a ellos y pongan en marcha los mecanismos de la nueva formación de vasos sanguíneos. Debido a ello pueden aparecer efectos secundarios no deseados, tal como por ejemplo hinchazones y engrosamientos del tejido, en el que se implantó el dispositivo, hasta el crecimiento tumoral.
Para evitar esto, en el estado de la técnica, los dispositivos a implantar suelen estar revestidos con principios activos antiangiogénicos (y también antiinflamatorios), tal como por ejemplo anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF), ácido retinoico y sus derivados, suramina, inhibidores de metaloproteinasa 1 y metaloproteinasa 2, epotilon, colchicina, vinblastina, paclitaxel, etc., que deben inhibir la adhesión de células endoteliales a los dispositivos, y la nueva formación de vasos sanguíneos que puede desencadenarse debido a ello.
Sin embargo, los dispositivos/implantes revestidos de esta manera tienen la desventaja de que, por un lado, la producción es compleja debido a la etapa de revestimiento adicional, y que, por otra parte, la acción antiangiogénica o no angiogénica del revestimiento depende de la calidad/cantidad de aplicación del revestimiento y del principio activo así como de la durabilidad del revestimiento. Además, se ha demostrado en el pasado que incluso los implantes revestidos no pueden evitar por completo la adhesión de las células endoteliales. Además, los revestimientos suelen provocar efectos secundarios en el paciente a tratar, que no solo influyen en el éxito de la respectiva intervención, sino que tales también pueden ser perjudiciales para la salud en total.
Por lo tanto, actualmente todavía existe una gran necesidad de provisión de implantes médicos, con los que puedan superarse las desventajas del estado de la técnica, y que - con una excelente biocompatibilidad al mismo tiempo -sean de uso eficiente y económicos de producir.
Ante este trasfondo, el objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos agentes para un implante médico, que no desencadenen ni provoquen la nueva formación de vasos sanguíneos, o que inhiban la adhesión de las células endoteliales. De acuerdo con la invención, el objetivo se soluciona mediante la composición biocompatible, que puede polimerizarse para dar un material formador de hidrogel terapéutico y que se basa en un polímero hidrófilo, en donde el polímero hidrófilo es albúmina sérica reticulable o proteína sérica reticulable, para su uso terapéutico en la inhibición y/o prevención de la angiogénesis o proliferación de células endoteliales.
Además, la invención también se refiere al uso terapéutico de la composición biocompatible mencionada para el revestimiento y modificación de superficie de implantes, que están constituidos por otros materiales distintos del material que se ha polimerizado partiendo de la composición mencionada.
El objetivo se soluciona además mediante la composición biocompatible de un material formador de hidrogel, polimerizado, que se ha obtenido mediante polimerización de una composición que se basa en albúmina sérica o proteínas séricas, para su uso terapéutico en la inhibición y/o prevención de la angiogénesis o proliferación de células endoteliales.
El objetivo en el que se basa la invención se soluciona debido a ello por completo.
Con el uso terapéutico de acuerdo con la invención de la composición y el material formador de hidrogel, polimerizado se proporciona un nuevo agente terapéutico o bien un material de soporte médico, que permite la posibilidad por ejemplo de sustituir un tejido por medio de un implante y al mismo tiempo inhibe la adhesión y la proliferación de células endoteliales al mismo. Ventajosamente se evita mediante esto la nueva formación de vasos sanguíneos así como un hinchazón y engrosamiento del tejido, en el que se introduce la composición para sustituir un tejido enfermo o deficiente, y al mismo tiempo sustituye el tejido deficiente o enfermo por reabsorción del material. Con el uso terapéutico de acuerdo con la invención se proporciona así un material de soporte para un implante, con el que puede inhibirse de manera dirigida la angiogénesis, y, por ejemplo, el crecimiento de otras células, que no participan en la angiogénesis, puede promoverse de manera específica mediante la incorporación previa en la composición/el material.
Es ventajoso en el nuevo uso terapéutico además que la composición pueda polimerizarse también solo in situ, es decir, la composición puede inyectarse en el sitio donde se llevará a cabo la sustitución del tejido o bien el soporte del tejido, y solo entonces polimeriza en este punto. Debido a ello es necesaria únicamente una intervención médica mínima para el tratamiento terapéutico reclamado. Por otro lado, la composición también puede polimerizarse completamente antes de introducirse en el organismo de un paciente, y a continuación implantarse a través de un intervención quirúrgica.
Los inventores han demostrado en sus propios experimentos que una composición a base de albúmina sérica o proteínas séricas o bien el material polimerizado a partir de la misma son extraordinariamente adecuados como material de soporte para inhibir la adhesión de células endoteliales y, por lo tanto, para inhibir/prevenir la angiogénesis. Por tanto, la composición/el material a base de albúmina/proteínas séricas puede utilizarse como implante médico para inhibir la angiogénesis, en particular donde la nueva formación de vasos sanguíneos sea desventajosa y/o deba evitarse absolutamente, por ejemplo, en el caso de una sustitución de tejido de cartílago, discos intervertebrales, córnea. Sorprendentemente, en los ensayos en los que se basa la invención se ha demostrado que, en comparación con otros soportes o matrices utilizados y conocidos en el estado de la técnica, solo el material a base de albúmina sérica/proteínas séricas inhibe la adhesión de células endoteliales. Sin embargo, a este respecto, el material no es tóxico para las propias células endoteliales y, por lo tanto, tampoco para el paciente, que debe recibir el material como implante médico, lo que a su vez demuestra la biocompatibilidad especialmente alta del material para el paciente. Además, las albúminas séricas pueden unir un gran número de sustancias diferentes, tal como por ejemplo iones metálicos (metales), ácidos grasos y aminoácidos, distintas proteínas y fármacos, por lo que son extremadamente biocompatibles y casi no provocan reacciones en el organismo.
Por lo tanto, el uso terapéutico de acuerdo con la invención también se puede realizar en combinación con otras sustancias biológica y/o terapéuticamente activas, que deben desarrollar una acción biológica y/o terapéutica a través de la composición o el gel en el sitio objetivo del paciente. El uso de acuerdo con la invención puede realizarse a este respecto de tal manera que el material se polimeriza solo in situ o sin embargo ya se ha polimerizado antes del implante, y se implanta en estado de hidrogel. A este respecto ha de entenderse que en caso de un implante del hidrogel completamente polimerizado se prefiere una consistencia bastante más sólida del hidrogel, que permita o facilite el manejo práctico del hidrogel. El grado de solidez, o bien las propiedades de fluido del hidrogel o del material se pueden ajustar a este respecto a través de su grado de reticulación, después de lo cual el hidrogel o el material es más sólido, cuanto más reticulado está. Las propiedades de fluido de un gel se encuentran, por consiguiente, entre las de un líquido y las de un cuerpo sólido.
A pesar de que se conoce la albúmina como sustancia biocompatible, y también se ha descrito como gel o material de soporte como tal, por ejemplo, en el documento DE 102008008071.3, no se conoció así su uso para inhibir la adhesión y proliferación de células endoteliales, así como para inhibir la angiogénesis.
La composición a utilizar para el uso terapéutico de acuerdo con la invención o el material formador de hidrogel polimerizado que se basa en esta puede presentar a este respecto albúmina sérica/proteínas séricas, que se obtienen de cualquier mamífero, o bien pueden usarse de manera correspondiente para cualquier mamífero, en donde se prefieren albúmina sérica humana, bovina, ovina o de conejo, y en donde el uso de acuerdo con la invención se usa preferentemente en seres humanos con un material que se basa en albúmina sérica humana. Es además ventajoso en el caso del uso terapéutico de acuerdo con la invención que el precursor del material formador de hidrogel puede manipularse a temperatura ambiente. Según esto, el material puede almacenarse por separado de los aditivos o células que van a introducirse en cada caso y poco antes de la aplicación de acuerdo con la invención puede reunificarse con los aditivos, en caso deseado, o dado el caso células, que deben fomentar la nueva formación de tejidos. El tiempo de polimerización puede ajustarse a este respecto, en donde pueden estar previstos tiempos entre algunos segundos y 2 minutos. Por lo tanto, los aditivos y/o las células se anclan inmediatamente en el material, de modo que se evite una difusión no deseada del material. A este respecto puede realizarse la aplicación, tal como se ha mencionado ya anteriormente, o bien con el material formador de hidrogel que puede polimerizarse in situ, o sin embargo con un material que se ha polimerizado ya para dar un material de hidrogel antes de la introducción en el organismo de un paciente.
En la presente solicitud, los términos "composición" y "material" se utilizan en el uso terapéutico de acuerdo con la invención, en donde "composición" se usa predominantemente, sin embargo no exclusivamente, para el material aún no polimerizado, y "material" o "gel" para la composición polimerizada. Sin embargo, se entiende que estos términos no pueden separarse completamente uno de otro, ya que la composición y el material de hecho significan el mismo objeto. A este respecto por "gel" se entiende el estado semisólido de la composición, que se encuentra en forma de una red polimerizada, tridimensional.
Es ventajoso en el caso del uso terapéutico de acuerdo con la invención además que el material base para el polímero hidrófilo sea variable, de modo que, por un lado, la albúmina comercialmente disponible, por ejemplo albúmina humana, pueda usarse de manera purificada o preparada de manera recombinante, así como también suero alogénico o autólogo.
Tal como ya se ha mencionado, el uso terapéutico de acuerdo con la invención se realiza de forma que la composición a base de albúmina sérica o proteína sérica se inyecta en la zona a tratar, donde se polimeriza para dar el material formador de hidrogel, o el material formador de hidrogel polimerizado se implanta directamente. Después de la introducción en el paciente, la albúmina reticulada se disuelve en un cierto período de tiempo, durante el cual, por ejemplo, las células presentes en el material han desarrollado in situ una matriz pericelular, y así se instalan en el entorno. Al mismo tiempo, se evita que las células endoteliales se adhieran y proliferen y, por lo tanto, desencadenen la nueva formación de vasos sanguíneos partiendo del material.
A este respecto, en una forma de realización del uso terapéutico de acuerdo con la invención está previsto cuando la concentración de albúmina en el material formador de hidrogel polimerizado asciende a de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20, en particular aproximadamente 10 mg/ml de material.
Procedimientos a modo de ejemplo para la preparación de la composición para el uso terapéutico de acuerdo con la invención se encuentran en el documento De 102008 008071.3, ya mencionado anteriormente, a cuyo contenido se hace referencia de manera explícita por el presente documento con respecto a esto.
De acuerdo con la invención, en una forma de realización preferente está previsto que, por ejemplo, células de mamífero vivas, en particular células vivas humanas, así como un agente farmacológico, un agente biológicamente activo, o uno o varios o mezclas de los mismos se usen junto con la composición/el material.
Por células de mamífero se entiende a este respecto cualquier célula que se deriva o procede de un mamífero, en donde entre esto se encuentran en particular células humanas y animales. Tales células pueden seleccionarse, por ejemplo, entre células musculoesqueléticas, en particular condrocitos, osteocitos, fibrocondrocitos, así como células glandulares reguladoras del metabolismo, células de los islotes, células productoras de melatonina, células progenitoras y células madre, en particular células madre mesenquimatosas, por lo tanto células que son adecuadas y deseadas para el uso respectivo de la composición, o para el sitio de inyección respectivo. Estas células son viables en la composición o bien el material formador de hidrogel polimerizado y desarrollan un nuevo tejido durante la reabsorción simultánea de material.
El uso terapéutico de acuerdo con la invención también es adecuado para prevenir una nueva formación de vasos sanguíneos en terapias que tienen el objetivo de la producción de hormonas in situ, tal como por ejemplo insulina, tiroxina o melatonina. Si las células que producen estas u otras hormonas se introducen a través de la composición o el material en el sitio a tratar en el organismo de un paciente, producen estos las respectivas hormonas y las liberan en el entorno, en donde se impide al mismo tiempo una nueva formación de vasos sanguíneos.
Se entiende que el uso terapéutico de acuerdo con la invención también puede tener lugar junto con sustancias biológica o farmacéuticamente activas. "Sustancia biológicamente activa o bien eficaz" y "sustancia farmacéuticamente activa o bien eficaz" debe significar a este respecto cualquier sustancia natural o sintética que puede tener o bien una influencia biológica o farmacéutica en células o tejidos, o bien que puede ejercer reacciones sobre o en las células. Esta influencia puede estar limitada a este respecto a ciertas células y ciertas condiciones, sin que la sustancia perdiera su significado biológico o farmacéuticamente activo. La naturaleza química de las sustancias que se pueden utilizar en cuestión no está limitada a este respecto a una clase específica (de compuesto), sino que más bien puede incluir cualquier sustancia natural o sintética que por su naturaleza y/o en forma modificada ejerza cualquiera acción sobre las células biológicas.
Así se prefiere en particular cuando como sustancias biológica o farmacéuticamente activas o bien eficaces se usan por ejemplo antibióticos, agentes antiinflamatorios, hormonas metabólicas, agentes condroprotectores, agentes de terapia génica, hormonas de crecimiento o factores de diferenciación y/o modulación, inmunosupresores, sustancias inmunoestimuladoras, péptidos generales, proteínas, ácidos nucleicos, principios activos orgánicos, ácido hialurónico, principios activos que inducen apoptosis, agonistas de receptores y antagonistas de receptores, o mezclas de los mismos. Además pueden usarse proteínas de la matriz extracelular, proteínas de la superficie celular, así como generalmente polisacáridos, lípidos, anticuerpos, factores de crecimiento, azúcares, lectinas, hidratos de carbono, citocinas, ADN, ARN, ARNpi, aptámeros, así como fragmentos relevantes de la unión o acción de los mismos, así como los denominados agentes modificadores de enfermedad para la osteoartritis, o mezclas de los mismos. A este respecto, todas las sustancias se pueden producir sintéticamente o pueden estar presentes de forma natural o pueden proceder de fuentes recombinantes. Por "agentes modificadores de enfermedad para osteoartritis" (DMOA) ha de entenderse a este respecto una serie de sustancias que actualmente se utilizan como medicamentos en particular en el caso de artrosis - entre tanto sin embargo también en el caso de otras enfermedades autoinmunitarias - para aliviar el dolor y la inflamación, y cuyo mecanismo de acción exacto aún no se ha aclarado por completo. La mayoría de estas sustancias contienen mezclas de glucosamina y sulfato de condroitina.
En particular, en una forma de realización del uso terapéutico de acuerdo con la invención se prefiere cuando la sustancia biológicamente eficaz es ácido hialurónico y está presente en el material en una concentración final de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/ml de material, en particular con aprox. 4 mg/ml de material.
Otros ejemplos incluyen, pero no exclusivamente, las siguientes fuentes sintéticas o naturales o recombinantes de los mismos: hormonas de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento recombinante (rhGH), hormonas de crecimiento bovinas, hormonas de crecimiento porcinas; hormonas liberadoras de la hormona del crecimiento; interferones, incluyendo interferón alfa, beta y gamma; interleucina-1; interleucina-2; insulina; factor de crecimiento similar a la insulina, incluyendo IGF-1; heparina; eritropoyetina; somatostatina; somatotropina; Inhibidores de la proteasa; adrenocorticotropina; prostaglandinas; así como análogos, fragmentos, miméticos o derivados modificados con polietilenglicol (PEG) de estos compuestos; o una combinación de los mismos. Se entiende que actualmente en el campo general de la terapia de enfermedades se tienen en cuenta todas las sustancias (activas) que van a liberarse in situ desde soportes/matrices para la aplicación terapéutica para la presente invención, en donde se vuelve evidente para el experto en cada caso que la sustancia (principio activo) que va a usarse o bien las células que van a usarse dependen del respectivo caso que va a tratarse.
En una forma de realización del uso terapéutico de acuerdo con la invención se prefiere cuando la albúmina sérica o la proteína sérica está funcionalizada por grupos, que se seleccionan de grupos maleimida, vinilsulfona, acrilato, haluro de alquilo, azirina, piridilo, ácido tionitrobenzoico, o grupos de arilación.
En el presente caso, se entiende por "funcionalizado" o funcionalizar cualquier proceso - completado - con el cual se le da una función al polímero, por ejemplo, agregando grupos al polímero, que normalmente no tiene.
La funcionalización del polímero con grupos maleimida puede asegurar una buena reticulación del polímero y al mismo tiempo la viabilidad de las células o la biofuncionalidad de las sustancias, cuando se incorporan estas a la composición/el material. Las células o sustancias a introducir dado el caso en la composición se introducen por dispersión en la composición con el polímero funcionalizado, que reticula con las células/sustancias.
Como ya se mencionó anteriormente, la invención también se refiere al uso terapéutico de la composición o el material para el revestimiento y la modificación de superficie de los implantes, que están constituidos por otros materiales distintos del material que se ha polimerizado partiendo de la composición mencionada.
Un revestimiento o modificación de este tipo ofrece la posibilidad de revestir implantes, que están constituidos por otro material no compatible comparativamente, para hacer entonces que estos implantes, que normalmente promueven la proliferación de células endoteliales y, por lo tanto, también la angiogénesis, sean no angiogénicos. A este respecto se tiene en consideración cualquier implante, en particular aquellos que a su vez se basan en hidrogeles, sin embargo que no se basan en la composición. Esto es ventajoso además en particular en los casos donde es posible una química de unión química directa, tal como se usa para el material polimerizado. Esto permite una unión covalente de una fina capa de material al material del implante.
Tal como ya se ha mencionado anteriormente, la invención también se refiere al uso terapéutico de la composición descrita o del material formador de hidrogel polimerizado para el tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas a la angiogénesis.
Esta medida tiene la ventaja de que estas enfermedades pueden aliviarse o incluso impedirse de forma preventiva mediante el uso terapéutico de acuerdo con la invención mediante la inhibición de la angiogénesis.
Se puede encontrar una lista de enfermedades asociadas con la angiogénesis, por ejemplo, en Carmeliet, "Angiogenesis in health and disease", Nature Medicine (2003), vol. 9, n.° 6: 653-660, y en particular en la Tabla 1 enumerada allí, en la que están enumeradas enfermedades que se caracterizan por una angiogénesis excesiva. Por ejemplo, a esto pertenecen cáncer, algunas enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, síndrome de DiGeorge, arteriosclerosis, obesidad, soriasis sarcoma de Karposi, retinopatía diabética, hipertensión pulmonar primaria, asma bronquial, adherencias peritoneales, endometriosis, artritis, sinovitis, formación de osteofitos, osteomielitis. Otras ventajas resultan de la descripción y del dibujo adjunto.
Se entiende que las características mencionadas anteriormente y las que aún se explicarán a continuación se pueden usar no solo en las combinaciones especificadas en cada caso, sino también en otras combinaciones o por sí mismas, sin abandonar el contexto de la presente invención.
Los ejemplos de realización de la invención se muestran en el dibujo y se explican con más detalle en la siguiente descripción. Muestran:
la figura 1 los resultados de las pruebas de adhesión de células endoteliales en un material formador de hidrogel, polimerizado a base de albúmina sérica (en adelante también "gel de albúmina" o "albugel"): representación esquemática del cultivo de células endoteliales en el albugel (A); diagrama de la cuantificación del número de células endoteliales en el albugel después de 1 día y 5 días (B); células endoteliales teñidas con faloidina en las diferentes condiciones de cultivo (C);
la figura 2 la detección de la vitalidad de las células endoteliales en albugel: diagrama de la cuantificación de células endoteliales en el albugel (A); diagrama del estudio de la acción citotóxica de extractos de albugel en las células endoteliales (B); células endoteliales teñidas con calceína y DAPI en las diferentes condiciones de cultivo (C, E, G, I) y absorción de Dil-Ac-LDL (D, F, H, J);
la figura 3 los resultados del estudio para determinar la proliferación de células endoteliales en albugel: células endoteliales teñidas con DAPI y BrdU en las diferentes condiciones de cultivo (A-D); diagrama de la cuantificación de la proliferación de células endoteliales en el albugel (E);
La figura 4 los resultados de los estudios de la invasión de células endoteliales a través del albugel:
representación esquemática de la estructura (A); diagrama de la cuantificación de células endoteliales migradas a través del gel de albúmina (B); diagrama del análisis del índice quimiotáctico (C); diagrama del análisis del índice quimioinvasivo (D), células endoteliales teñidas con rosa de Bengala en la parte inferior de los filtros Transwell (E-L);
la figura 5 los resultados de los estudios para determinar el crecimiento interno de vasos sanguíneos desde la membrana corioalantoidea hacia el albugel: fotos del implante in ovo (A, B); fotos de la membrana corioalantoidea explantada con el albugel (C, D): membrana corioalantoidea teñida con HE (hematoxilina-eosina) con el albugel (E, F); membrana corioalantoidea teñida con lectina de Sambucus nigra con albugel (G, H); y registros de contraste de fases de G y H (I, J);
la figura 6 los resultados de las pruebas de implante de albugel por vía subcutánea en la espalda de un ratón Skid/nu: tinción con HE del albugel con tejido de ratón circundante (A), tinción con lectina de Sambucus nigra y tinción con DAPI del albugel con tejido de ratón circundante (B); y
la figura 7 los resultados de las pruebas de adhesión de células endoteliales inmortalizadas en el albugel: células endoteliales teñidas con faloidina en las diferentes condiciones de cultivo (A-F); diagrama de la cuantificación del número de células endoteliales en el albugel después de 1 día (G).
Ejemplos:
A) Preparación de albúmina sérica modificada con maleimida
Se disolvieron 250 mg de albúmina sérica humana, de conejo o de oveja (Sigma-Aldrich) en 5 ml de borato de Na 1 M (pH 8,2). A esto se añadieron 75 pl de una solución de N-maleoil-S-alanina 260 mM (Sigma-Aldrich n.° de cat.
63285) en PBS/borato de Na (pH 8,2) (1:1), y se incubó durante 90 min a temperatura ambiente. Se disolvieron 106 mg de éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-maleimidopropiónico (SMP, Obiter Research, Urbana, IL, EE.UU.) en 950 pl de dimetilformamida (DMF). El material insoluble se eliminó por centrifugación. Se añadieron 500 pl del sobrenadante a la solución de albúmina, que luego se incubó durante 60 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 500 pl de acetato de sodio 3 M (pH 4,7) y se dializaron tres veces frente a 1 litro de PBS en hielo. A continuación, el dializado se concentró por ultrafiltración (membrana YM-3, Millipore) hasta obtener un volumen de 3,5 ml, se esterilizó por filtración y se almacenó a -80 °C.
La albúmina/proteína sérica funcionalizada de este modo puede polimerizarse añadiendo agentes reticuladores SH. A este respecto se tiene en consideración en particular el agente reticulador bis-tio polietilenglicol, que lleva un grupo SH en ambos extremos. Además del bis-tio-PEG se tienen en consideración como agente reticulador generalmente sustancias que llevan grupos SH, en particular polímeros, y, por ejemplo, ditio-PEG o dextrano modificado con SH, poli(alcohol vinílico) modificado con SH, polivinilpirrolidona modificada con SH, etc.
Bis-tio-PEG está disponible comercialmente, se utilizó el agente reticulador con una masa molar de 10000 g/mol. Si la masa molar se encuentra por debajo de esto, reduce esto la formación de gel, con masas más altas gelifica el gel demasiado rápido, lo que hace imposible un mezclado suficiente de las sustancias. La mejor formación de gel se logra cuando los grupos SH del agente reticulador y los grupos maleimida de la albúmina están presentes en concentraciones equimolares. Se usó en cada caso una concentración final de maleimida 3 mM y grupos SH en el gel. Adicionalmente, el albugel de oveja contenía 4 mg/ml de ácido hialurónico altamente polimérico (en adelante y en las figuras también denominado/abreviado como "HS"), que se mezcla antes de la polimerización y, por lo tanto, está físicamente anclado firmemente. Sin embargo, se puede utilizar una amplia variedad de albúminas de suero humano y animal como fuente de albúmina.
B) Pruebas para detectar la propiedad no angiogénica del albugel
1. Ensayo del albugel como sustrato para células endoteliales humanas
a) Para someter a estudio las acciones de albugel en las células endoteliales ("CE"), se cultivaron células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVEC) (PromoCel, Heidelberg) de los pasajes 3 a 9 en gel y a continuación se sometió a estudio la adhesión, la vitalidad y la proliferación de las células. Para ello, se polimerizaron en cada caso 100 pl de albugel de oveja en una placa de 48 pocillos y se cultivaron en el gel en cada caso 1,5 x 104 HUVEC en 300 pl de medio de células endoteliales por pocillo durante 24 horas o durante 5 días (estructura de ensayo, véase la figura 1A). Como control, se cultivó el mismo número de células en una placa de 48 pocillos gelatinizados (0,5 %) y se preparó un albugel con un 0,5 % adicional de gelatina (concentración final en el gel). Al mismo tiempo, las células se cultivaron en 10 mg/ml de Matrigel™, un extracto de membrana basal poco definido del sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm, que funciona como un equivalente de la membrana basal en la investigación básica.
Preparación de los albugeles (también abreviado/designado como "AG" a continuación y en las figuras):
Figure imgf000007_0001
Revestimiento de gelatina y Matrigel™:
Para el revestimiento de gelatina, se mezcló solución de gelatina al 2 % 1:4 con PBS (solución salina tamponada con fosfato) y las placas se incubaron con esto durante 30 min. A continuación, las placas se lavaron una vez con PBS. Se mezcló Matrigel™ (20 mg/ml; BD Biosciences, San Jose, EE.UU.) 1:2 con medio de células endoteliales sin FCS (suero de ternera fetal) y se polimerizó en la placa durante 20 min a 37 °C.
Las células se cultivaron durante 1 día o durante 5 días en las diferentes condiciones de cultivo. Para la evaluación, las células endoteliales se trataron de la siguiente manera:
Después de 1 día y después de 5 días, las HUVEC se fijaron con glutaraldehído al 2,5 %/PBS para determinar la adhesión celular, se permeabilizaron con Triton-X 100/PBS al 0,2 % y a continuación se tiñeron con DAPI (4',-diamidino-2-fenilindol) y Oregon Green de faloidina.
O: Con ayuda del "5-Bromo-2'-deoxy-Uridin Cell Labeling and Detetion Kit I" (Roche, Mannheim) se visualizaron HUVEC en proliferación después de 1 día.
O: Después de 1 y 5 días, las células se trataron con DiI-Ac-LDL (lipoproteína de baja densidad acetilada con perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametil-indocarbocianina) y a continuación se tiñeron con calceína y DAPI para detectar HUVEC viables y muertas.
b) Adicionalmente se sometieron a estudio los extractos de albugel con respecto a su acción citotóxica sobre las células endoteliales.
Preparación de los extractos:
Se polimerizaron 200 pl de albugel (con y sin gelatina añadida) en un tubo Eppendorf y se cultivaron con 1 ml de medio de células endoteliales a 37 °C durante 24 horas con agitación. Como control, se prepararon extractos de Matrigel™ de manera correspondiente. Las células endoteliales se incubaron durante 24 horas con los diversos extractos y con DMSO (dimetilsulfóxido) como control muerto. La vitalidad de las células, relacionada con las células que se cultivaron únicamente con medio, se determinó utilizando el ensayo azul de Alamar.
c) Resultados:
Como puede verse en la figura 1, después de 1 día de cultivo en los albugeles y en Matrigel™, el recuento de células se encontraba significativamente por debajo del recuento de células del revestimiento de gelatina. Después de 5 días de cultivo, el número de células en los geles disminuyó, mientras que siguió aumentando en la gelatina. La morfología de las células en las diversas condiciones de cultivo se puede ver en las figuras 1 C-J. Mientras que las células endoteliales formaron agregados en los albugeles y no pudieron adherirse al gel, las células endoteliales se esparcieron en gelatina y formaron en Matrigel™ típicos "tubos". Los resultados muestran que las células endoteliales no pueden adherirse en el albugel y se desprenden del gel, por ejemplo, cuando se cambia el medio.
La vitalidad de las células endoteliales se muestra en la figura 2A y cualitativamente en la figura 2C, E, G e I. Mientras que en el revestimiento de gelatina también tras 5 días apenas pudieron detectarse células muertas y también en Matrigel™ tras 5 días habían muerto menos del 40 % de las células, el número de células endoteliales muertas en los albugeles aumentó en más del 60 %. Por el contrario, las células vitales pudieron absorber DiI-Ac-LDL en todas las condiciones de cultivo (véase la figura 2D, F, H, J), según esto se conserva la funcionalidad de las células endoteliales. Los extractos de los albugeles adicionalmente no mostraron ninguna acción citotóxica sobre las células endoteliales (figura 2, B).
Tal como puede deducirse de la figura 3 (A-D de manera cualitativa, E de manera cuantitativa), las células endoteliales proliferaron en el albugel en contraste con el revestimiento de gelatina solo en pequeña medida. La adición de gelatina, que se conoce por sus propiedades pro-angiogénicas y pro-adhesivas, en el gel de albúmina no mostró ningún efecto positivo sobre las células endoteliales.
2. Ensayo del albugel como sustrato para células endoteliales humanas
Para descartar que el ácido hialurónico ("HS") sea el responsable de los efectos observados, se realizaron adicionalmente pruebas con albugel de conejo sin ácido hialurónico.
a) Realización:
Para el cultivo se usaron células endoteliales de vena umbilical humana inmortalizadas (HUVEC hTERT). Se cultivaron 1,5x104 HUVEC en 300 pl de medio de células endoteliales en un 0,5 % de revestimiento de gelatina, 100 pl de Matrigel™ (10 mg/ml) o 100 pl de gel de albúmina puro en una placa de 48 pocillos. Como control adicional se preparó adicionalmente con gelatina al 0,5 % (concentración final).
Preparación de los geles de albúmina:
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Recubrimiento de gelatina y Matrigel™:
Para el revestimiento de gelatina, se mezcló solución de gelatina al 2 % 1:4 con PBS (solución salina tamponada con fosfato) y las placas se incubaron con esto durante 30 min. A continuación, las placas se lavaron una vez con PBS.
Se mezcló Matrigel™ (20 mg/ml) 1:2 con medio de células endoteliales sin FCS (suero de ternera fetal) y se polimerizó en la placa durante 30 min a 37 °C. Las células se cultivaron durante 1 día en las diversas condiciones de cultivo.
Para la evaluación, las células endoteliales se trataron de la siguiente manera:
Después de 1 día, las HUVEC se fijaron con glutaraldehído al 2,5 %/PBS para determinar la adhesión celular, se permeabilizaron con Triton-X 100/PBS al 0,2 % y a continuación se tiñeron con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) y Oregon Green de faloidina.
b) Resultados:
Tal como puede deducirse de la figura 7G, después de 1 día de cultivo en los albugeles y en Matrigel™, el recuento de células se encuentra significativamente por debajo del recuento de células del revestimiento de gelatina. La morfología de las células en las diversas condiciones de cultivo se puede ver en las figuras 7 A - H. Las células endoteliales se esparcen en gelatina y forman los típicos "tubos" en Matrigel™. Las células endoteliales en el albugel forman agregados (figura 7C y E) o forman una especie de estructura esferoide (figura 7D y F).
. Invasión de células endoteliales por el albugel
a) La invasión de células endoteliales por el albugel en un filtro Transwell se comparó con la invasión por Matrigel™ y la migración por un filtro no revestido. De la figura 4A puede deducirse una representación esquemática de la estructura de prueba.
Se revistieron filtros Transwell con un tamaño de poro de 8 pm con 100 pl de albugel con ácido hialurónico, 100 pl de ácido de albúmina con gelatina al 0,5 % y 100 pl de Matrigel™ (5 mg/ml). Se usaron filtros Transwell sin revestir para determinar la migración.
Por mezcla de reacción se transfirieron 3x105 HUVEC marcadas con Hoechst 33258 en 200 pl de medio de células endoteliales a los filtros. Después de que las células se habían asentado durante 2 horas, se pipetearon 600 pl de medio de células endoteliales con y sin 40 ng/ml de VEGF ((Vascular endothelial growth factor) en el compartimento inferior. Después de 24 horas, se limpiaron las células de la parte superior del filtro y se fijaron y contaron las células de la parte inferior del filtro. Alternativamente, las células se tiñeron con rosa de Bengala. b) Resultados:
El número de células endoteliales en la parte inferior de los filtros Transwell se muestra en la figura 4B, las células endoteliales teñidas con rosa de Bengala en las figuras 4E-L. A partir de los valores promedio del número de células en la parte inferior de los filtros se calculó el índice quimiotáctico (véase la figura 4C), que indica el cociente de migración o invasión con inducción por VEGF con respecto a sin inducción por VEGF y el índice quimioinvasivo (véase la figura 4D), que indica el cociente de células que han migrado por un gel. Los índices quimiotácticos en todos los revestimientos se encontraban aproximadamente al mismo nivel, la inducción por VEGF es por lo tanto comparable. Sin embargo, los índices quimioinvasivos de los dos albugeles estaban muy por debajo del índice quimioinvasivo de Matrigel™, lo que muestra que las células endoteliales solo pueden migrar por el albugel en pequeña medida.
. Crecimiento interno de vasos sanguíneos desde la membrana corioalantoidea hacia el albugel
a) Realización
En los huevos de la raza Hisex Brown, se insertó una ventana en la cáscara del huevo en el día embrionario 3.
En el día embrionario 8, se transfirieron 200 |jl de albugel con ácido hialurónico y 200 |jl de albugel con ácido hialurónico y gelatina al 0,5 % a la membrana corioalantoidea (CAM) muy vascularizada. Los huevos se incubaron más hasta el día embrionario 13. La CAM se fijó en PFA (paraformaldehído)/PBS al 4 % a temperatura ambiente in ovo, a continuación se explantó y se fijó a 4 °C durante otro día, se deshidrató durante 2 días en sacarosa al 30 %/agua destilada y se congeló en Tissue Tek (O.C.T. Compound, Sakura; Torrance Canadá). Las secciones congeladas de 7 jm de espesor se tiñeron con HE (hematoxilina-eosina) y las secciones congeladas de 5 jm de espesor con la lectina de Sambucus nigra.
b) Resultados:
Los vasos sanguíneos de la CAM no crecen hacia los albugeles implantados (figura 5 A-D). No se pudieron detectar vasos sanguíneos ni en secciones teñidas con HE (figuras 5 E y F) ni en secciones teñidas con lectina de Sambucus nigra (figuras 5 G y H), en donde los vasos sanguíneos pudieron detectarse en la CAM utilizando ambos métodos de tinción. Los resultados muestran que el albugel no tuvo influencia angiogénica en los vasos sanguíneos de la CAM.
5. Implante del albugel en la espalda de un ratón Scid/nu
a) Se sembraron geles de albúmina, basados en albúmina sérica humana, con células de disco intervertebral humanas y se inyectaron en la espalda de ratones Scid/nu. Dos semanas después del implante, los geles de albúmina se explantaron de nuevo y las secciones de estos geles de albúmina explantados se examinaron después de la tinción con HE. Adicionalmente, los vasos sanguíneos se detectaron mediante tinción inmunohistoquímica frente al factor de von Willebrand humano.
b) Resultados
Por medio de la tinción con HE no se pudieron detectar vasos sanguíneos ni en el tejido circundante del ratón ni en los implantes (figura 6A), los núcleos celulares de células de disco intervertebral humanas en el implante se tiñeron con hematoxilina. La tinción específica de los vasos sanguíneos con un anticuerpo contra el factor von Willebrand humano mostró que había vasos sanguíneos en el tejido circundante, sin embargo, no creció hacia el interior del albugel (figura 6B). Únicamente las células de disco intervertebral humanas teñidas con DAPI son visibles en el implante.
En resumen, se pudo demostrar con los ensayos descritos anteriormente que las células endoteliales apenas se adhieren o proliferan en albugel. Además, se ha demostrado que las células endoteliales mueren en el albugel, no por la toxicidad del albugel, sino más bien por la falta de adhesión celular, que es fundamental para la supervivencia. La adición del atrayente quimiotáctico VEGf tampoco logró la migración de las células endoteliales hacia el albugel, y tampoco los vasos sanguíneos de la membrana corioalantoidea del huevo de gallina migran hacia el albugel. Tampoco los ensayos in vivo en el ratón con el albugel mostraron migración de vasos sanguíneos hacia el albugel. Estas propiedades no permisivas para las células endoteliales ofrecen por consiguiente la posibilidad de utilizar el albugel como matriz/implante para inhibir y prevenir la angiogénesis y la adhesión de las células endoteliales, en particular en el campo de implantes en medicina, por ejemplo, en el caso de tratamiento de la esclerosis, y de la medicina regenerativa, por ejemplo, en el caso del tratamiento de tejido cartilaginoso, del disco intervertebral, de la córnea enfermo y/o deficiente.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Composición biocompatible, que puede polimerizarse para dar un material formador de hidrogel y que se basa en un polímero hidrófilo, en donde el polímero hidrófilo es albúmina sérica reticulable o proteína sérica reticulable, para su uso terapéutico en la inhibición y/o prevención de la angiogénesis o proliferación de células endoteliales.
2. Composición biocompatible para su uso terapéutico según la reivindicación 1, caracterizada por que la composición presenta al menos uno de los siguientes: células de mamífero, un agente farmacológico, un agente biológicamente activo, o uno o varios o mezclas de los mismos.
3. Composición biocompatible para su uso terapéutico según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la albúmina sérica o la proteína sérica está funcionalizada mediante grupos, que se seleccionan de grupos de maleimida, vinilsulfona, acrilato, haluro de alquilo, azirina, piridilo, ácido tionitrobenzoico, o grupos de arilación.
4. Composición biocompatible para su uso terapéutico según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la albúmina sérica y la proteína sérica son albúmina sérica humana y proteína sérica humana.
5. Composición biocompatible para su uso terapéutico según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada por que el agente farmacológicamente activo se selecciona de al menos uno de los siguientes: un antibiótico, un agente antiinflamatorio, una hormona metabólica, agentes condroprotectores, agentes de terapia génica, hormonas de crecimiento, factores de diferenciación o modulación, inmunosupresores, sustancias inmunoestimuladoras, DMOA, ácidos nucleicos, principios activos que inducen apoptosis, principios activos que promueven la adhesión, agonistas de receptores y antagonistas de receptores, o mezclas de los mismos.
6. Composición biocompatible para su uso terapéutico según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la concentración de albúmina en el material asciende a de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg/ml de material, en particular a de aproximadamente 10 mg/ml de material.
7. Composición biocompatible para su uso terapéutico según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la composición se usa en forma inyectable.
8. Composición biocompatible de un material formador de hidrogel, polimerizado, que se ha obtenido mediante polimerización de una composición que se basa en albúmina sérica o proteínas séricas, para su uso terapéutico en la inhibición y/o prevención de la angiogénesis o proliferación de células endoteliales.
9. Composición biocompatible para su uso terapéutico según la reivindicación 8, caracterizada por que el material se usa como implante.
10. Composición biocompatible para su uso terapéutico según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que la composición se usa como revestimiento de superficie de un implante.
11. Composición biocompatible para su uso terapéutico según la reivindicación 8, caracterizada por que el material se usa como revestimiento de superficie de un implante.
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