ES2928296T3 - Receptores de antígenos quiméricos anti-antígenos de maduración de linfocitos B con dominios humanos - Google Patents

Receptores de antígenos quiméricos anti-antígenos de maduración de linfocitos B con dominios humanos Download PDF

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Abstract

Se proporcionan receptores de antígenos quiméricos (CAR) que tienen especificidad de antígeno para el antígeno de maduración de células B (BCMA). También se proporcionan ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinantes, células huésped, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas relacionadas con las CAR. También se proporcionan métodos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígenos quiméricos anti-antígenos de maduración de linfocitos B con dominios humanos Declaración con respecto a
Investigación o desarrollo patrocinado por el gobierno federal
La presente invención se realizó con la financiación del gobierno con el número de proyecto ZIABC01143905 por los Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos. El Gobierno tiene determinados derechos en la invención.
Incorporación por referencia del material presentado
Electrónicamente
Se incorpora por referencia en su totalidad en el presente documento un listado de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador presentado al mismo tiempo con la presente e identificado como sigue: Un archivo ASCII (texto) de 67.061 bytes denominado "739534_ST25.TXT", con fecha del 25 de junio de 2018.
Antecedentes de la invención
El cáncer es un problema de salud pública. A pesar de los avances en tratamientos tales como quimioterapia, el pronóstico de muchos cánceres puede ser malo. Por ejemplo, los tratamientos para el mieloma múltiple (MM) pueden provocar remisiones, pero muchos pacientes finalmente recaen y mueren. En consecuencia, existe una necesidad insatisfecha por tratamientos adicionales para el cáncer.
El documento WO 2017/025038 A1 divulga receptores de antígenos quiméricos basados en anticuerpos de dominio único y procedimientos de uso de los mismos. https://clinicaltrials.gov/ct2/history/NCT03090659?V_1=View#StudyPageTop describe un estudio clínico de la tecnología de receptor de antígeno quimérico BMCA de Legend Biotech en el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple recidivante/resistente (R/R). Ali SA et al. (2016, Blood 123(13): 1688-1700) divulga que los linfocitos T que expresan un receptor de antígeno quimérico anti-antígeno de maduración de linfocitos B provocan remisiones de mieloma múltiple.
Breve sumario de la invención
Un modo de realización de la invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno, un dominio transmembranario (TM) y un dominio de activación de linfocitos T, en el que el CAR tiene especificidad de antígeno para el antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA), en el que el dominio de reconocimiento de antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de: (a) SEQ ID NO: 1­ 3; (b) SEQ ID NO: 4-6; (c) SEQ ID NO: 7-9; o (d) SEQ ID NO: 10-12. Los CAR de la invención se definen en las reivindicaciones 1-7.
Otros modos de realización de la invención proporcionan ácidos nucleicos relacionados, vectores, células huésped aisladas, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas relacionadas con los CAR de la invención y se definen en las reivindicaciones 8-14.
Los modos de realización adicionales de la invención proporcionan CAR, ácidos nucleicos, vectores, células huésped aisladas o poblaciones de células para su uso en procedimientos relacionados de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, como se define en la reivindicación 15.
Breve descripción de varias vistas del/de los dibujo(s)
Las figuras 1A-1D son diagramas que representan un CAR que comprende los dominios de reconocimiento de antígeno de solo la cadena pesada completamente humana de FHVH74 (A), FHVH32 (B), FHVH33 (C) o FHVH93 (D), en combinación con las regiones bisagra y transmembranaria de la molécula CD 8 a, la porción citoplásmica de la molécula coestimuladora de c D28 y la porción citoplásmica del dominio de activación de linfocitos T CD3Z
Las figuras 1E-1H son diagramas que representan un CAR que comprende los dominios de reconocimiento de antígeno de solo la cadena pesada completamente humana de FHVH74 (E), FHVH32 (F), FHVH33 (G) o FHVH93 (H), en combinación con las regiones bisagra y transmembranaria de la molécula CD 8 a, la porción citoplásmica de la molécula coestimuladora 4-1BB y la porción citoplásmica del dominio de activación de linfocitos T CD3Z
Las figuras 1I-1L son diagramas que representan un CAR que comprende los dominios de reconocimiento de antígeno de solo la cadena pesada completamente humana de FHVH74 (I), FHVH32 (J), FHVH33 (K) o FHVH93 (L), en combinación con las regiones bisagra y transmembranaria de la molécula CD 8 a, la porción citoplásmica de la proteína coestimuladora de linfocitos T inducible (ICOS) y la porción citoplásmica del dominio de activación de linfocitos T CD3Z
La figura 2 es una serie de gráficos que representan datos experimentales que ilustran que los cuatro CAR de FHVH mostrados se expresaron por linfocitos T humanos primarios, como se describe en el ejemplo 2. Se incluyen linfocitos T sin transducir (ST) como control negativo y se proporciona 11D5-3-CD828Z como un CAR de control positivo. Los linfocitos T se transdujeron el día 2 de cultivo y las células se tiñeron con un reactivo de proteína Fc-BCMA el día 7 de cultivo. En las gráficas están seleccionados linfocitos vivos. Los números en las gráficas son los porcentajes de células CD3+ que expresan CAR (parte superior) o que no expresan CAR (parte inferior).
La figura 3 es una serie de gráficos que representan datos experimentales que ilustran la desgranulación específica de BCMA por los linfocitos T que expresan CAR de FHVH. Los gráficos muestran los resultados para los linfocitos T humanos primarios transducidos con uno de los cuatro CAR de FHVH en un ensayo de desgranulación de CD107a para valorar la función específica de antígeno. Los linfocitos T que expresan cada CAR se desgranularon en mayor grado cuando se cultivaron con células diana BCMA+ (BCMA-K562) en comparación con las células diana negativas para BCMA (NGFR-K562), como se describe en el ejemplo 3. Se incluyen células ST como control negativo y se proporciona 11D5-3-CD828Z como un CAR de control positivo. En las gráficas están seleccionados linfocitos CD3+. Los números en las gráficas son los porcentajes de células CD3+ que regulan por incremento CD107a (parte superior) o que no regulan por incremento CD107a (parte inferior).
La figura 4A es un gráfico que representa datos experimentales que ilustran que el CAR 11D5-3-CD828Z proliferó de manera específica para BCMA. En las gráficas están seleccionados linfocitos CD3+ vivos. El histograma abierto representa los linfocitos T CAR+ que se estimularon con células diana BCMA-K562 (que expresan BCMA), y los histogramas negros representan los linfocitos T CAR+ que se estimularon con células NGFR-K562 (negativas para BCMA). Todos los resultados se generaron al mismo tiempo con células del mismo paciente.
Las figuras 4B-4E son gráficos que representan datos experimentales que ilustran que los CAR FHVH74-CD828Z (B), FHVH32-CD828Z (C), FHVH33-CD828Z (D) o FHVH93-CD828Z (E) proliferaron de manera específica para BCMA como se describe en el ejemplo 5.
La figura 4F es un gráfico que representa datos experimentales que ilustran que el número absoluto de linfocitos T CAR+ se incrementó cuando los linfocitos T transducidos con el CAR indicado se cultivaron con células diana BCMA+. El número de linfocitos T CAR+ se incrementó para los linfocitos T que expresan todos los CAR cuando los linfocitos T con CAR se cultivaron con células BCMA-K562. El eje Y representa el número de linfocitos T CAR+ (x106). El eje X representa el número de días que los linfocitos T se cultivaron con células diana BCMA+
La figura 5A es un gráfico que representa datos experimentales que ilustran la capacidad del CAR FHVH33-CD828Z para destruir células diana BCMA+, en comparación con la capacidad de las células ST para destruir células diana BCMA+. Los linfocitos T que expresan CAR FHVH33-CD828Z se cultivaron con células diana RPMI8226 in vitro durante cuatro horas en las proporciones indicadas de efector con respecto a diana. La citotoxicidad se determinó por duplicado. Los resultados se presentan como un /- error estándar de la media. El eje Y representa el % de citotoxicidad de los CAR. El eje X representa la proporción de linfocitos T con respecto a células diana.
La figura 5B es un gráfico que representa datos experimentales que ilustran la capacidad del CAR FHVH33-CD 8 BBZ para destruir células diana BCMA+, en comparación con la capacidad de las células ST para destruir células diana BCMA+. Los linfocitos T que expresan CAR FHVH33-CD8BBZ se cultivaron con células diana RPMI8226 in vitro durante cuatro horas en las proporciones indicadas de efector con respecto a diana. La citotoxicidad se determinó por duplicado. Los resultados se presentan como un /- error estándar de la media. El eje Y representa el % de citotoxicidad de los CAR. El eje X representa la proporción de linfocitos T con respecto a células diana.
La figura 6 es una serie de gráficos que representan datos experimentales que ilustran que los CAR con dominios coestimuladores 4-1BB se expresaron en la superficie de linfocitos T humanos primarios, mostrando FHVH33-CD8BBZ la expresión más alta. Las gráficas muestran la tinción de Fc-BCMA de los cuatro CAR de FHVH, la tinción del CAR de control 11D5-3-CD828Z y la tinción de las células ST. En las gráficas están seleccionados linfocitos vivos. Los números en los gráficos son los porcentajes de células que se tiñen con (número superior) o que no se tiñen con (número inferior) Fc-BCMA.
Las figuras 7A-7B representan la expresión de este CAR en células ST (A) en comparación con linfocitos T que expresan FHVH33-CD8BBZ (B). En las gráficas están seleccionados linfocitos CD3+ vivos. Los números en las gráficas son los porcentajes de BCMA-PE+ (parte superior) y BCMA-PE-(parte inferior).
Las figuras 7C-7F representan datos experimentales que ilustran que los linfocitos T transducidos con FHVH33-CD8BBZ se desgranularon de manera específica para BCMA, como se valora por tinción de CD107a. Los datos muestran una regulación por incremento de CD107a en células ST+BCMA-K562 (C) y ST+NGFR-K562 (D), en comparación con la regulación por incremento de CD107a en células FHVH33+BCMA-K562 (E) y FHVH33+NGFR-K562 (F). Se usaron los mismos cultivos de linfocitos T que se presentaron en las figuras 7A-7B. En las gráficas están seleccionados linfocitos CD3+ vivos. Los números en las gráficas son los porcentajes de CD107a+ (parte superior) y CD107a-(parte inferior).
La figura 7G representa datos experimentales que ilustran que los linfocitos T que expresan CAR produjeron IFNy de manera específica para BCMA. Se liberaron cantidades significativas de IFNy cuando los linfocitos T se cultivaron con las líneas celulares BCMA+ BCMA-K562 y RPMI8226. El eje Y representa la cantidad de IFNy en pg/ml. El eje X representa las células diana usadas en los experimentos.
La figura 8 es un gráfico que muestra la cantidad de IFNy (pg/ml) secretada por los linfocitos T que estaban sin transducir (ST) o transducidos con CAR FHVH33-CD828Z o FHVH33-CD8BBZ tras el cocultivo con células de médula ósea de mieloma humano primario diana (barras negras) o PBMC dianas de control (barras grises).
La figura 9A es un esquema que ilustra una valoración de dosis de linfocitos T FHVH33-CD8BBZ en ratones. A ratones NSG hembra (H), de 7-8 semanas (sem.) de edad se les inyectaron por vía intradérmica (i.d.) ocho millones (M) de células RPMI8226 y se dejó que los tumores crecieran durante 10 días. El día 0, los ratones recibieron infusiones intravenosas (i.v.) de diversos números de linfocitos T que expresan FHVH33-CD 8 BBZ. Los tumores se midieron cada tercer día (d).
La figura 9B es un gráfico que muestra el volumen del tumor (mm3) medido en ratones tratados como se muestra en la figura 9A con 0,2 * 10 6 (triángulos rellenos), 0,7 * 10 6 (círculos rellenos) o 2,2 * 10 6 (círculos blancos) linfocitos T que expresan FHVH33-CD8BBZ en el número indicado de días después de la infusión de linfocitos T con c A r . Los ratones no tratados están representados por triángulos blancos.
La figura 9C es un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones mostrados en la figura 9B después del tratamiento con 0,2 * l0 6 (triángulos rellenos), 0,7 * 10 6 (círculos rellenos) o 2,2 * 10 6 (círculos blancos) linfocitos T que expresan FHVH33-CD8BBZ en el número indicado de días después de la infusión de linfocitos T con CAR. Los ratones no tratados están representados por triángulos blancos.
La figura 10A es un gráfico que muestra el volumen del tumor (mm3) medido en ratones tratados con linfocitos T que expresan los CAR SP6-CD828Z (triángulos), 11D5-3-CD8BBZ (cuadrados), FHVH33-CD 8 BBZ (círculos blancos) o FHVH33-CD828Z (círculos rellenos) en el número indicado de días después de la infusión de linfocitos T con CAR. Los ratones no tratados se representan por rombos.
La figura 10B es un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con linfocitos T que expresan los CAR SP6-CD828Z (triángulos), 11D5-3-CD8BBZ (cuadrados), FHVH33-CD8BBZ (círculos blancos) o FHVH33-CD828Z (círculos rellenos) en el número indicado de días después de la infusión de linfocitos T con CAR. Los ratones no tratados se representan por rombos.
Descripción detallada de la invención
Un modo de realización de la invención proporciona un CAR que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno, un dominio TM y un dominio de activación de linfocitos T, en el que el CAR tiene especificidad de antígeno para BCMA. Un CAR es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo enlazado a los dominios de señalización de linfocitos T o de activación de linfocitos T. Los CAR tienen la capacidad de redirigir la especificidad y la reactividad de los linfocitos T hacia una diana seleccionada de manera no restringida por MHC, aprovechando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento de antígeno no restringido por MHC da a los linfocitos T que expresan CAR la capacidad de reconocer un antígeno independientemente del procesamiento del antígeno, eludiendo por tanto un mecanismo principal de escape tumoral. Además, cuando se expresan en linfocitos T, los CAR de forma ventajosa no se dimerizan con las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T (TCR) endógeno.
Los CAR según la invención tienen especificidad de antígeno por el antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA, también conocido como CD269). BCMA es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (véase, por ejemplo, Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192(1): 129-135 (2000) y Mackay et al., Annu. Rev. Immunol., 21 : 231-264 (2003)). BCMA se une al factor activador de linfocitos B (Ba Ff ) y un ligando inductor de proliferación (APRIL) (véase, por ejemplo, Mackay et al., supra y Kalled et al., Immunological Reviews, 204: 43­ 54 (2005)). Entre las células benignas, se ha informado de que BCMA se expresa en su mayoría en células plasmáticas y subconjuntos de linfocitos B maduros (véase, por ejemplo, Laabi et al., EMBO J., 11(11): 3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22(7): 1147-1154 (1994); Kalled et al., supra; O'Connor et al., J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97 (2004); y Ng et al., J. Immunol., 173(2): 807-817 (2004)). Se ha detectado universalmente ARN de BCMA en células de mieloma múltiple, y se ha detectado proteína de BCMA en la superficie de células plasmáticas de pacientes con mieloma múltiple por varios investigadores (véase, por ejemplo, Novak et al., Blood, 103(2): 689-694 (2004); Neri et al., Clinical Cancer Research, 13(19): 5903-5909 (2007); Bellucci et al., Blood, 105(10): 3945-3950 (2005); y Moreaux et al., Blood, 103(8): 3148-3157 (2004)). También se ha detectado expresión de BCMA en la superficie de células de linfoma de Hodgkin (véase, por ejemplo, Chiu et al., Blood, 109(2): 729-739 (2007)). El b Cm A humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No : 42.
Las frases "tiene especificidad de antígeno" y "provocan una respuesta específica de antígeno", como se usan en el presente documento, significan que el CAR se puede unir específicamente a y reconocer inmunológicamente un antígeno, de modo que la unión del CAR al antígeno provoca una respuesta inmunitaria.
Los CAR según la invención pueden proporcionar una cualquiera o más de una variedad de ventajas. Por ejemplo, los CAR según la invención pueden proporcionar inmunogenicidad anti-CAR reducida. Los CAR que comprenden uno o ambos dominios no humanos (por ejemplo, dominios de ratón) y un péptido conector artificial pueden provocar una respuesta inmunitaria anti-CAR tras la administración a un paciente. Dichas respuestas inmunitarias anti-CAR pueden reducir la persistencia de las células que expresan CAR y reducir o eliminar la eficacia del tratamiento con CAR. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo particular, se cree que uno cualquiera o más de los siguientes rasgos característicos de los CAR según la invención pueden reducir o eliminar fuentes potenciales de inmunogenicidad anti-CAR: (i) todos los dominios del CAR son humanos; (ii) el CAR no comprende un péptido conector artificial, por ejemplo, un péptido conector que tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 residuos aminoacídicos y que consiste en uno cualquiera o más de glicina, serina y treonina; (iii) el CAR no comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo; y (iv) el dominio de reconocimiento de antígeno comprende no más de una única región variable de la cadena pesada de anticuerpo. Se cree que la reducción o eliminación de fuentes potenciales de inmunogenicidad anti-CAR mejora la persistencia de las células que expresan CAR y la eficacia del tratamiento con CAR. Además, uno cualquiera o más de los rasgos característicos anteriores (ii)-(iv) pueden facilitar la preparación de CAR que se dirijan a uno o más antígenos diferentes (distintos de BCMA) además de BCMA.
Los CAR según la invención pueden tener menos inmunogenicidad anti-CAR en comparación con los CAR tradicionales. Los CAR tradicionales pueden tener uno cualquiera o más de los siguientes rasgos característicos: (i) no todos los dominios del CAR tradicional son humanos; (ii) el CAR tradicional comprende un péptido conector artificial, por ejemplo, un péptido conector que tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 residuos aminoacídicos y que consiste en uno cualquiera o más de glicina, serina y treonina; y (iii) el CAR tradicional comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (a continuación en el presente documento, "cA r tradicionales").
La inmunogenicidad anti-CAR se reduce de acuerdo con la invención si la respuesta inmunitaria al CAR según la invención disminuye, cuantitativa o cualitativamente, en comparación con la respuesta inmunitaria a un CAR tradicional. Una disminución cuantitativa en la inmunogenicidad anti-CAR engloba una disminución en la magnitud o grado de la respuesta inmunitaria anti-CAR. La magnitud o el grado de inmunogenicidad anti-CAR se puede medir sobre la base de cualquier número de parámetros conocidos, tales como una disminución en el nivel de producción de citocinas (por ejemplo, citocinas específicas de CAR) (concentración de citocinas), una disminución en el número de linfocitos activados (por ejemplo, proliferación de linfocitos (por ejemplo, linfocitos específicos de CAR)) o reclutados, y/o una disminución en la producción de anticuerpos (anticuerpos específicos de CAR) (concentración de anticuerpos), una disminución de la capacidad del huésped (receptor) para destruir los linfocitos T que expresan CAR, etc. Una disminución cualitativa en la inmunogenicidad anti-CAR engloba cualquier cambio en la naturaleza de la respuesta inmunitaria anti-CAR que hace que la respuesta inmunitaria anti-CAR sea menos eficaz para mediar la reducción de la actividad citotóxica del CAR. Los procedimientos de medición de la inmunogenicidad anti-CAR son conocidos en la técnica. Por ejemplo, medir los tipos y niveles de citocinas producidas puede medir la inmunogenicidad anti-CAR. La inmunogenicidad anti-CAR reducida se puede caracterizar por una disminución en la producción de citocinas tales como una cualquiera o más de IFN-y, TNF-a y granzima B, y/o una estimulación reducida de una respuesta inmunitaria anti-CAR mediada por células, tal como una disminución en la proliferación y activación de linfocitos T y/o macrófagos específicos para el CAR según la invención en comparación con la obtenida con un CAR tradicional. La inmunogenicidad anti-CAR reducida se puede caracterizar por una cualquiera o más de una disminución en la estimulación de linfocitos T anti-CAR, una disminución en la proliferación de linfocitos T anti-CAR, una disminución en la secreción de IFNy y/o granzima B de linfocitos T anti-CAR y una disminución en la capacidad de los linfocitos T del huésped para destruir los linfocitos T que expresan CAR. La disminución cualitativa y cuantitativa de la inmunogenicidad anti-CAR se puede producir simultáneamente y no son mutuamente excluyentes. La frase "inmunogenicidad anti-CAR", como se usa en el presente documento, se refiere a la respuesta inmunitaria contra el propio CAR y no a ningún aspecto de la respuesta inmunitaria contra el antígeno diana BCMA que puede proporcionar el CAR.
El CAR comprende un dominio de reconocimiento de antígeno. El dominio de reconocimiento de antígeno reconoce y se une a BCMA. En un modo de realización de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno comprende una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-BCMA humano. Un anticuerpo completo típicamente consiste en cuatro polipéptidos: dos copias idénticas de un polipéptido de la cadena pesada (H) y dos copias idénticas de un polipéptido de la cadena ligera (L). Cada una de las cadenas pesadas contiene una región variable (VH) N terminal y tres regiones constantes (CH1, CH2 y CH3) C terminales, y cada cadena ligera contiene una región variable (VL) N terminal y una región constante (CL) C terminal. Las regiones VH y VL tienen la misma estructura general, comprendiendo cada región cuatro regiones estructurales, con secuencias que están relativamente conservadas. Las regiones estructurales están conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR), a saber, CDR1, CDR2 y CDR3. Sin embargo, como se explica anteriormente, en un modo de realización de la invención, el CAR no comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo. En consecuencia, en un modo de realización de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno comprende no más de una única región variable de la cadena pesada de anticuerpo.
El dominio de reconocimiento de antígeno comprende la región CDR1, la región CDR2 y la región CDR3 de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-BCMA humano. A este respecto, el dominio de reconocimiento de antígeno comprende:
(a) una región CDR1 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1; una región CDR2 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2; y una región CDR3 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 3 (las regiones CDR de la región variable de la cadena pesada de FHVH74);
(b) una región CDR1 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 4; una región CDR2 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 5; y una región CDR3 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 6 (las regiones CDR de la región variable de la cadena pesada de FHVH32);
(c) una región CDR1 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 7; una región CDR2 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 8 ; y una región CDR3 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 9 (las regiones CDR de la región variable de la cadena pesada de FHVH33); o
(d) una región CDR1 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 10; una región CDR2 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 11; y una región CDR3 de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 12 (las regiones CDR de la región variable de la cadena pesada de FHVH93).
El dominio de reconocimiento de antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de (a) todas las SEQ ID NO: 1-3; (b) todas las SEQ ID NO: 4-6; (c) todas las SEQ ID NO: 7-9; o (d) todas las SEQ ID NO: 10-12.
En un modo de realización de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno comprende la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-BCMA humano. A este respecto, el dominio de reconocimiento de antígeno puede comprender la secuencia de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 13 (región variable de la cadena pesada de FHVH74), (b) SEQ ID NO: 14 (región variable de la cadena pesada de FHVH32), (c) SEQ ID NO: 15 (región variable de la cadena pesada de FHVH33) o (d) SEQ ID NO: 16 (región variable de la cadena pesada de FHVH93).
En un modo de realización de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno no comprende un péptido conector. Los dominios de reconocimiento de antígeno de los CAR tradicionales pueden estar compuestos por fragmentos variables monocatenarios (scFv). Un scFv es una molécula monovalente que incluye los dos dominios del fragmento Fv (es decir, VL y VH) unidos por un péptido conector artificial que posibilita que los dos dominios se sinteticen como una única cadena polipeptídica. Uno cualquiera o más de los siguientes rasgos característicos de los CAR según la invención pueden, de forma ventajosa, reducir o eliminar uniones potencialmente inmunogénicas que unen diferentes componentes del CAR, por ejemplo, las dos uniones potencialmente inmunogénicas que unen el péptido conector a la VL y VH de los scFv empleados en CAR tradicionales: (i) la falta de un péptido conector, tal como el que se encuentra típicamente en los scFv empleados en los CAR tradicionales, (ii) la falta de una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (que también se emplea en los CAR tradicionales), y (iii) la presencia de no más de una única región variable de la cadena pesada de anticuerpo. Las uniones y el/los péptido(s) conector(es) pueden ser inmunogénicos porque son secuencias artificiales que habitualmente no se encuentran en seres humanos. De forma alternativa o adicionalmente, uno cualquiera o más de los rasgos característicos anteriores (i)-(iii) pueden eliminar cualquier región potencialmente inmunogénica en uno o ambos del péptido conector y la región variable de la cadena ligera de anticuerpo. El propósito del péptido conector es en general formar un enlace flexible entre otros dos péptidos o proteínas (por ejemplo, entre una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo). El péptido conector puede ser de cualquier longitud y muchos comprenden cualquier secuencia de aminoácidos. En un modo de realización de la invención, el péptido conector puede tener una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 8 a aproximadamente 75 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 residuos aminoacídicos, de aproximadamente 8 a aproximadamente 4o residuos aminoacídicos o de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 residuos aminoacídicos. En un modo de realización de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno no comprende un péptido conector que tenga una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 residuos aminoacídicos. Por ejemplo, el péptido conector puede comprender o consistir en una cualquiera o más de glicina, serina, treonina, con o sin otros residuos aminoacídicos. En un modo de realización de la invención, el dominio de reconocimiento de antígeno no comprende un péptido conector que tiene una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 residuos aminoacídicos y que consiste en uno o más de glicina, serina y treonina.
En otro modo de realización, el CAR según la invención comprende un dominio líder. El dominio líder se puede situar en el extremo amínico del dominio de reconocimiento de antígeno (por ejemplo, la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-BCMA). El dominio líder puede comprender cualquier secuencia líder adecuada. Preferentemente, el dominio líder es un dominio líder humano. En un modo de realización, el dominio líder es una secuencia de receptor de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) humana o una secuencia líder de CD 8 a humana.
En otro modo de realización, el CAR comprende un dominio bisagra. Un experto en la técnica apreciará que un dominio bisagra es una secuencia corta de aminoácidos que facilita la flexibilidad del anticuerpo (véase, por ejemplo, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)). El dominio bisagra se puede situar entre el dominio de reconocimiento de antígeno y el dominio de activación de linfocitos T. El dominio bisagra puede comprender cualquier secuencia adecuada derivada u obtenida de cualquier molécula adecuada. Preferentemente, el dominio bisagra comprende una secuencia humana. En un modo de realización, por ejemplo, el dominio bisagra es una porción de la molécula CD 8 a humana o la molécula CD28 humana.
El CAR comprende un dominio TM. El dominio TM puede ser cualquier dominio TM derivado u obtenido de cualquier molécula conocida en la técnica. Preferentemente, el dominio TM es un dominio TM humano. Por ejemplo, el dominio TM puede comprender el dominio TM de una molécula CD 8 a humana o una molécula CD28 humana. CD 8 es una glucoproteína TM que sirve como correceptor para el receptor de linfocitos T (TCR) y se expresa principalmente en la superficie de los linfocitos T citotóxicos. La forma más común de CD 8 existe como un dímero compuesto por una cadena de CD 8 a y CD 8 p. CD28 se expresa en los linfocitos T y proporciona las señales coestimuladoras necesarias para la activación de los linfocitos T. CD28 es el receptor para CD80 (B7.1) y CD 86 (B7.2).
El CAR comprende un dominio de activación de linfocitos T. El dominio de activación de linfocitos T puede comprender un dominio de señalización de linfocitos T intracelular (es decir, citoplásmico). El dominio de señalización de linfocitos T intracelular se puede obtener o derivar de una molécula CD28, una molécula CD3 zeta (Z), una cadena gamma de receptor Fc (FcRy), una molécula CD27, una molécula OX40, una molécula 4-1BB, una proteína coestimuladora de linfocitos T inducible (ICOS) u otras moléculas de señalización intracelular conocidas en la técnica, o versiones modificadas de cualquiera de las anteriores. Como se analiza anteriormente, CD28 es un marcador de linfocitos T importante en la coestimulación de linfocitos T. CD3Z se asocia con TCR para producir una señal y contiene motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptores (ITAM). 4-1BB, también conocido como CD137, transmite una potente señal coestimuladora a los linfocitos T, promoviendo la diferenciación y potenciando la supervivencia a largo plazo de los linfocitos T. ICOS es una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 que se expresa en los linfocitos T activados. En un modo de realización preferente, el CD28, c D3 zeta, FcRy, Ic Os , 4-1b B, OX40 y CD27 son humanos.
El CAR según la invención puede comprender uno cualquiera de los dominios TM mencionados anteriormente y uno cualquiera o más de los dominios de señalización de linfocitos T intracelulares mencionados anteriormente en cualquier combinación. Por ejemplo, el CAR según la invención puede comprender un dominio TM de CD 8 a y dominios de señalización de linfocitos T intracelulares de CD28 y CD3 zeta. De forma alternativa, por ejemplo, el CAR de la invención puede comprender un dominio TM de CD 8 a y dominios de señalización de linfocitos T intracelulares de CD3 zeta y 4-1BB. Todavía en otro ejemplo, el CAR según la invención puede comprender un dominio TM de CD 8 a y dominios de señalización de linfocitos T intracelulares de ICOS y CD3 zeta.
En un modo de realización, el CAR según la invención comprende, desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico, un dominio líder de CD 8 a humana, una región variable de la cadena pesada de anticuerpo anti-BCMA humano, las regiones bisagra y transmembranaria de la molécula CD 8 a humana, el dominio de señalización de linfocitos T citoplásmico de la molécula CD28 humana y el dominio de señalización de linfocitos T citoplásmico de la molécula CD3Z humana. En otro modo de realización, el CAR según la invención comprende, desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico, un dominio líder de CD 8 a humana, una región variable de la cadena pesada de anticuerpo anti-BCMA humano, las regiones bisagra y transmembranaria de la molécula CD 8 a humana, el dominio de señalización de linfocitos T citoplásmico de la molécula 4-1 BB humana y el dominio de señalización de linfocitos T citoplásmico de la molécula CD3Z humana. Todavía en otro modo de realización, el CAR según la invención comprende, desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico, un dominio líder de CD 8 a humana, una región variable de la cadena pesada de anticuerpo anti-BCMA humano, las regiones bisagra y transmembranaria de la molécula CD 8 a humana, el dominio de señalización de linfocitos T citoplásmico de la molécula ICOS humana y el dominio de señalización de linfocitos T citoplásmico de la molécula CD3Z humana. Los modos de realización adicionales de la invención proporcionan CAR que comprenden, consisten en, o consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 17-28. Los componentes de los CAR de SEQ ID NO: 17-28 se exponen en la tabla A continuación.
TABLA A
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En un modo de realización de la invención, todos los dominios del CAR son humanos. A este respecto, todo el dominio líder, el dominio bisagra, el dominio de reconocimiento de antígeno, el dominio TM y el dominio de activación de linfocitos T son humanos. En consecuencia, los CAR según la invención pueden tener, de forma ventajosa, inmunogenicidad anti-CAR reducida, como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención, en comparación con los CAR que incluyen uno cualquiera o más de un dominio líder no humano, un dominio bisagra no humano, un dominio de reconocimiento de antígeno no humano, un dominio TM no humano y un dominio de activación de linfocitos T no humano.
Se incluyen en el alcance de la invención porciones funcionales de los CAR según la invención descritos en el presente documento. El término "porción funcional" cuando se usa en referencia a un CAR se refiere a cualquier parte o fragmento del CAR de la invención, en el que su parte o fragmento conserva la actividad biológica del CAR del que es parte (el CAR original). Las porciones funcionales engloban, por ejemplo, aquellas partes de un CAR que conservan la capacidad de reconocer células diana, o detectar, tratar o prevenir una enfermedad, en una medida similar, la misma medida, o en mayor medida, que el CAR original. En referencia al CAR original, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente un 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 % o más del CAR original.
La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amínico o carboxílico de la porción, o en ambos extremos, en la que los aminoácidos adicionales no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del CAR original. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, reconocer células diana, detectar cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del CAR original.
Se incluyen en el alcance de la divulgación las variantes funcionales de los CAR según la invención descritos en el presente documento. El término "variante funcional" como se usa en el presente documento se refiere a un CAR, polipéptido o proteína que tiene una identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un CAR original, en el que la variante funcional conserva la actividad biológica del CAR del que es una variante. Las variantes funcionales engloban, por ejemplo, aquellas variantes del CAR descritas en el presente documento (el CAR original) que conservan la capacidad de reconocer las células diana en una medida similar, la misma medida o en mayor medida que el CAR original. En referencia al CAR original, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 98 % o más idéntica en la secuencia de aminoácidos al CAR original.
Una variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del CAR original con al menos una sustitución aminoacídica conservadora. De forma alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR original con al menos una sustitución aminoacídica no conservadora. En este caso, es preferente que la sustitución aminoacídica no conservadora no interfiera en o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución aminoacídica no conservadora puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de modo que la actividad biológica de la variante funcional se incrementa en comparación con el CAR original.
Las sustituciones aminoacídicas de los CAR según la invención son preferentemente sustituciones aminoacídicas conservadoras. Las sustituciones aminoacídicas conservadoras son conocidas en la técnica e incluyen sustituciones aminoacídicas en las que un aminoácido que tiene determinadas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tenga las mismas o similares propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución aminoacídica conservadora puede ser un aminoácido polar ácido/con carga negativa sustituido por otro aminoácido polar ácido/con carga negativa (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc.), un aminoácido polar básico/con carga positiva sustituido por otro aminoácido polar básico/con carga positiva (por ejemplo, Lys, His, Arg, etc.), un aminoácido sin carga con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido sin carga con una cadena lateral polar (por ejemplo, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), un aminoácido con una cadena lateral ramificada beta sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral ramificada beta (por ejemplo, Ile, Thr y Val), un aminoácido con una cadena lateral aromática sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral aromática (por ejemplo, His, Phe, Trp y Tyr), etc.
El CAR puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de modo que otros componentes, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional.
Los CAR de los modos de realización de la divulgación (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales) pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender un número cualquiera de aminoácidos, siempre que los CAR (o las porciones funcionales o las variantes funcionales de los mismos) conserven su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente al antígeno, detectar células enfermas en un mamífero o tratar o prevenir enfermedades en un mamífero, etc. Por ejemplo, el CAR puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 aminoácidos, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud.
Los CAR de los modos de realización de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos naturales. Dichos aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometilcisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina, p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6 -hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentanocarboxílico, ácido a-aminociclohexanocarboxílico, ácido a-aminocicloheptanocarboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,p-diaminopropiónico, homofenilalanina y a-ferc-butilglicina.
Los CAR de los modos de realización de la invención pueden estar glucosilados, amidados, carboxilados, fosforilados, esterificados, N-acilados, ciclados por medio de, por ejemplo, un puente disulfuro, o convertidos en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizados o polimerizados, o conjugados.
Los CAR de los modos de realización de la invención se pueden obtener por procedimientos conocidos en la técnica. Los CAR se pueden preparar por cualquier procedimiento adecuado de preparación de polipéptidos o proteínas. Por ejemplo, los CAR se pueden producir de forma recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando procedimientos recombinantes estándar. Véase, por ejemplo, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2012. De forma alternativa, los CAR descritos en el presente documento se pueden sintetizar comercialmente por compañías, tales como Synpep (Dublín, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los CAR según la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.
Además, se proporciona por un modo de realización de la invención un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los CAR descritos en el presente documento. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los dominios líder, dominios bisagra, dominios de reconocimiento de antígeno, dominios TM y dominios de activación de linfocitos T descritos en el presente documento. En un modo de realización de la invención, el ácido nucleico puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 29 (FHVH74-CD828Z), SEQ ID NO: 30 (FHVH32-CD828Z), SEQ ID NO: 31 (FHVH33-CD828Z), SEQ ID NO: 32 (FHVH93-CD828Z), SEQ ID NO: 33 (FHVH74-CD8BBZ), SEQ ID NO: 34 (FHVH32-CD8BBZ), SEQ ID NO: 35 (FHVH33-CD8BBZ), SEQ ID NO: 36 (FHVH93-CD8BBZ), SEQ ID NO: 37 (FHVH74-CD8ICOSZ), SEQ ID NO: 38 (FHVH32-CD8ICOSZ), SEQ ID NO: 39 (FHVH33-CD8ICOSZ) y SEQ ID NO: 40 (FHVH93-CD8ICOSZ).
"Ácido nucleico" como se usa en el presente documento incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y en general significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. El ácido nucleico no comprende ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos de la divulgación, como se analiza en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.
Los ácidos nucleicos de un modo de realización de la invención pueden ser recombinantes. Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que se pueden replicar en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en (i) anteriormente. Para los propósitos en el presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.
Un ácido nucleico recombinante puede ser uno que tiene una secuencia que no es natural o que tiene una secuencia que se prepara por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial a menudo se logra por síntesis química o, más comúnmente, por la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de genomanipulación, tales como las descritas en Green y Sambrook, supra. Los ácidos nucleicos se pueden construir en base a síntesis química y/o reacciones de fijación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, supra. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos naturales o nucleótidos diversamente modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N 6 -isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N 6 -sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N 6 -isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. De forma alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden adquirir de compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).
El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos aislada o purificada que codifique cualquiera de los CAR. De forma alternativa, en un modo de realización de la divulgación, la secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que se degenera en cualquiera de las secuencias o una combinación de secuencias degeneradas.
Un modo de realización de la divulgación también proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
La secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas puede hibridar en condiciones de alta restricción. Por "condiciones de alta restricción" se quiere decir que la secuencia de nucleótidos hibrida específicamente a una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta restricción incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o una que contenga solo unos pocos emparejamientos erróneos dispersos de una secuencia aleatoria que tenga unas pocas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que se emparejan con la secuencia de nucleótidos. Dichas regiones pequeñas de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación con alta restricción las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de relativamente alta restricción incluirían, por ejemplo, condiciones bajas en sal y/o de alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl aproximadamente 0,02-0,1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70 °C. Dichas condiciones de alta restricción toleran poco, si acaso, emparejamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos y la hebra molde o diana, y son en particular adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los CAR según la invención. En general, se aprecia que las condiciones se pueden volver más rigurosas por la adición de cantidades crecientes de formamida.
La divulgación también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 70 % o más, por ejemplo, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
En un modo de realización, los ácidos nucleicos de la invención se pueden incorporar en un vector de expresión recombinante. A este respecto, un modo de realización de la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para los propósitos en el presente documento, el término "vector de expresión recombinante" quiere decir una construcción de oligonucleótidos o polinucleótidos genomanipulados que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula huésped, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que exprese el ARNm, proteína, polipéptido o péptido dentro de la célula. Los vectores de la invención no son naturales en su conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser naturales. Los vectores de expresión recombinantes según la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos naturales o no naturales, o ambos tipos de enlaces. Preferentemente, los nucleótidos o enlaces internucleotídicos no naturales o alterados no dificultan la transcripción o replicación del vector.
En un modo de realización, el vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y se puede usar para transformar o transfectar cualquier célula huésped adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector se puede seleccionar del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden usar vectores de bacteriófagos, tales como AGT10, áGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen pBI01, pB1101.2, pB1101.3, pB1121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión de animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). El vector de expresión recombinante puede ser un vector vírico, por ejemplo, un vector retrovírico (por ejemplo, un vector gammarretrovírico) o un vector lentivírico.
En un modo de realización, los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante estándares descritas, por ejemplo, en Sambrook y Green, supra. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparar para que contengan un sistema de replicación funcional en una célula huésped procariota o eucariota. Los sistemas de replicación se pueden derivar, por ejemplo, de ColEl, plásmido de 2 |j, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.
El vector de expresión recombinante puede comprender secuencias reguladoras, tales como los codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos del tipo de célula huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, como sea apropiado, y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN. El vector de expresión recombinante puede comprender sitios de restricción para facilitar la clonación. Además de la secuencia de ácido nucleico según la invención que codifica el CAR, el vector de expresión recombinante comprende preferentemente secuencias de control de expresión, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES) y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped.
El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células huésped transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un huésped auxotrófico para proporcionar prototrofia y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión según la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.
El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor natural o no natural enlazado de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos de desarrollo, está dentro de las habilidades comunes del experto. De forma similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de las habilidades del experto. El promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV o un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de citoblastos murinos.
Los vectores de expresión recombinante según la invención se pueden diseñar para expresión transitoria, para expresión estable o bien para ambas. Además, los vectores de expresión recombinante se pueden preparar para la expresión constitutiva o para la expresión inducible.
Además, se pueden preparar los vectores de expresión recombinante para que incluyan un gen suicida. Como se usa en el presente documento, el término "gen suicida" se refiere a un gen que provoca que la célula que expresa el gen suicida se destruya. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, a la célula en la que se expresa el gen, y provoca que la célula se destruya cuando la célula se pone en contacto con o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), citosina daminasa, nucleósido de purina fosforilasa y nitrorreductasa.
Un modo de realización de la invención proporciona además una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante según la invención. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células huésped adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células de E. coli DH5a, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Para los propósitos de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula huésped puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Para los propósitos de producir un CAR recombinante, la célula huésped puede ser una célula de mamífero. La célula huésped puede ser una célula humana. La célula huésped puede ser cualquier tipo de célula, se puede originar a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier fase de desarrollo. La célula huésped puede ser un linfocito en la sangre periférica (PBL) o un leucocito monomorfonuclear en la sangre periférica (PBMC).
En un modo de realización de la invención, la célula huésped es un linfocito T. Para los propósitos en el presente documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como un linfocito T cultivado, por ejemplo, un linfocito T primario, o un linfocito T de una línea de linfocitos T cultivados, por ejemplo, Jurkat, SupTI, etc., o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T se puede obtener de numerosas fuentes incluyendo pero sin limitarse a sangre, médula ósea, ganglio linfático, el timo u otros tejidos o humores. Los linfocitos T también se pueden enriquecer o purificar. El linfocito T puede ser un linfocito T humano. El linfocito T puede ser un linfocito T aislado de un ser humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede estar en cualquier fase de desarrollo, incluyendo pero sin limitarse a, linfocitos T CD4+/CD8+ doble positivos, linfocitos T auxiliares CD4+, por ejemplo, células Thi y Th 2 , linfocitos T CD 8 + (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos), células infiltrantes de tumor, linfocitos T de memoria, linfocitos T indiferenciados y similares. El linfocito T puede ser un linfocito T CD 8 + o un linfocito T CD4+.
En un modo de realización de la invención, la célula huésped es un linfocito citolítico natural (NK). Los linfocitos NK son un tipo de linfocito citotóxico que desempeña un papel en el sistema inmunitario innato. Los linfocitos NK se definen como linfocitos granulares grandes y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfático común que también da origen a los linfocitos B y T (véase, por ejemplo, Immunobiology, 9.a ed., Janeway et al., eds., Garland Publishing, Nueva York, NY (2016)). Los linfocitos NK se diferencian y maduran en la médula ósea, el ganglio linfático, el bazo, las amígdalas y el timo. Después de la maduración, los linfocitos NK se incorporan a la circulación como linfocitos grandes con gránulos citotóxicos característicos. Los linfocitos NK pueden reconocer y destruir algunas células anómalas, tales como, por ejemplo, algunas células tumorales y células infectadas por virus, y se cree que son importantes en la defensa inmunitaria innata contra patógenos intracelulares. Como se describe anteriormente con respecto a los linfocitos T, el linfocito NK puede ser cualquier linfocito NK, tal como un linfocito NK cultivado, por ejemplo, un linfocito NK primario o un linfocito NK de una línea de linfocitos NK cultivados, o un linfocito NK obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito NK se puede obtener de numerosas fuentes incluyendo pero sin limitarse a sangre, médula ósea, ganglio linfático, el timo u otros tejidos o humores. Los linfocitos NK también se pueden enriquecer o purificar. El linfocito NK preferentemente es un linfocito NK humano (por ejemplo, aislado de un ser humano). Las líneas de linfocitos NK están disponibles, por ejemplo, en American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e incluyen, por ejemplo, células NK-92 (At CC CRL-2407), células NK92MI (ATCC CRL-2408) y derivados de las mismas.
También se proporciona por un modo de realización de la invención una población de células que comprende al menos una célula huésped descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, un linfocito T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula distinta de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. De forma alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células huésped que comprenden (por ejemplo, que consisten esencialmente en) el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población sean clones de una única célula huésped que comprenda un vector de expresión recombinante, de modo que todas las células de la población comprendan el vector de expresión recombinante. En un modo de realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento.
Los vectores de expresión recombinantes según la invención que codifican un CAR se pueden introducir en una célula por "transfección", "transformación" o "transducción". "Transfección", "transformación" o "transducción", como se usa en el presente documento, se refieren a la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en una célula huésped usando procedimientos físicos o químicos. Son conocidos en la técnica muchas técnicas de transfección e incluyen, por ejemplo, coprecipitación de ADN con fosfato de calcio; DEAE-dextrano; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de wolframio; y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio. Se pueden introducir en las células huésped vectores víricos o de fagos, después del crecimiento de partículas infecciosas en células de encapsidación adecuadas, de las que muchas están disponibles comercialmente.
Los conjugados están incluidos en el alcance de la invención, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped o poblaciones de células huésped según la invención. Los conjugados, así como los procedimientos de síntesis de conjugados en general, son conocidos en la técnica.
Los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huésped (incluyendo las poblaciones de las mismas), todos los que se denominan conjuntamente "materiales de CAR según la invención" a continuación en el presente documento, se pueden aislar y/o purificar. El término "aislado" como se usa en el presente documento quiere decir que se ha retirado de su entorno natural. El término "purificado" o "aislado" no requiere pureza absoluta o aislamiento; más bien, se pretende como un término relativo. Por tanto, por ejemplo, una preparación de célula huésped purificada (o aislada) es aquella en la que la célula huésped es más pura que las células en su entorno natural dentro del cuerpo. Dichas células huésped se pueden producir, por ejemplo, por técnicas de purificación estándar. En algunos modos de realización, una preparación de una célula huésped se purifica de modo que la célula huésped representa al menos aproximadamente un 50 %, por ejemplo al menos aproximadamente un 70 %, del contenido celular total de la preparación. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente un 50 %, puede ser mayor de aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o aproximadamente un 80 %, o puede ser de aproximadamente un 100 %.
Los materiales de CAR según la invención se pueden formular en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, un modo de realización de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión o células huésped (incluyendo las poblaciones de las mismas) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas según la invención que contienen cualquiera de los materiales de CAR según la invención pueden comprender más de un material de CAR según la invención, por ejemplo, un CAR y un ácido nucleico, o dos o más CAR diferentes. De forma alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un material de CAR según la invención en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos o fármacos, tales como agentes quimioterápicos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En un modo de realización preferente, la composición farmacéutica comprende la célula huésped según la invención o poblaciones de la misma.
Preferentemente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el vehículo puede ser cualquiera de los usados convencionalmente para el material de CAR según la invención particular en consideración. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Es preferente que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.
La elección del vehículo estará determinada en parte por el material de CAR según la invención particular, así como por el procedimiento particular usado para administrar el material de CAR según la invención. En un modo de realización preferente, el CAR se expresa por una célula huésped, que es preferentemente un linfocito T o un linfocito NK, y las células huésped que expresan el CAR se administran a un paciente. Estas células podrían ser autólogas o alogénicas en relación con el receptor de las células. Un ácido nucleico que codifica el CAR se puede introducir en las células por cualquiera de una variedad de procedimientos de modificación genética que incluyen, pero sin limitarse a, transducción con un retrovirus gamma, un lentivirus o un sistema de transposones. Existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraarterial, intratecal o interperitoneal. Se puede usar más de una vía para administrar los materiales de CAR según la invención, y en determinados casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.
Preferentemente, el material de CAR según la invención se administra por inyección, por ejemplo, por vía intravenosa. Cuando el material de CAR según la invención es una célula huésped que expresa el cA r según la invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable para las células para inyección puede incluir cualquier vehículo isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente un 0,90 % p/v de NaCl en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), solución electrolítica NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), dextrosa aproximadamente al 5 % en agua o lactato de Ringer. En un modo de realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable se complementa con seroalbúmina humana.
La composición puede emplear sistemas de administración de liberación prolongada, liberación lenta y liberación mantenida de modo que la administración de la composición según la invención se produzca antes de, y con el tiempo suficiente para provocar, la sensibilización del sitio que se va a tratar. Muchos tipos de sistemas de administración de liberación están disponibles y son conocidos por los expertos en la técnica. Dichos sistemas pueden evitar las administraciones repetidas de la composición, incrementando de este modo la conveniencia para el sujeto y el médico, y pueden ser en particular adecuados para determinados modos de realización de composición de la invención.
Sin estar ligado a una teoría o mecanismo particular, se cree que al provocar una respuesta específica de antígeno contra BCMA, los CAR según la invención proporcionan uno o más de los siguientes: seleccionar y destruir células cancerosas que expresan BCMA, reducir o eliminar células cancerosas, facilitar la infiltración de células inmunitarias en el/los sitio(s) del tumor y potenciar/extender las respuestas antineoplásicas.
Se contempla que los materiales de CAR según la invención se pueden usar en procedimientos de tratamiento o prevención de una enfermedad, por ejemplo, cáncer, en un mamífero. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo particular, los CAR según la invención tienen actividad biológica, por ejemplo, capacidad de reconocer el antígeno, por ejemplo, BCMA, de modo que el CAR cuando se expresa por una célula puede mediar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa el antígeno, por ejemplo, BCMA, para el que el CAR es específico. A este respecto, un modo de realización de la invención proporciona el material de CAR según la invención para uso de un procedimiento de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células huésped, la población de células y/o las composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero. En un modo de realización preferente, el procedimiento comprende infundir al mamífero células huésped transducidas con el CAR según la invención.
Una o más células huésped aisladas que expresan el CAR para BCMA según la invención descrito en el presente documento se pueden poner en contacto con una población de células cancerosas que expresan BCMA ex vivo, in vivo o in vitro. "Ex vivo" se refiere a los procedimientos llevados a cabo dentro o sobre células o tejido en un entorno artificial fuera de un organismo con una alteración mínima de las condiciones naturales. Por el contrario, el término "in vivo" se refiere a un procedimiento que se lleva a cabo dentro de organismos vivos en su estado intacto normal, mientras que un procedimiento "in vitro"se lleva a cabo usando componentes de un organismo que se han aislado de su contexto biológico habitual. El procedimiento divulgado implica preferentemente componentes ex vivo e in vivo. A este respecto, por ejemplo, las células huésped aisladas descritas anteriormente se pueden cultivar ex vivo en condiciones para expresar el CAR anti-BCMA según la invención, y a continuación transferirse directamente a un mamífero (preferentemente un ser humano) afectado por un cáncer positivo para BCMA, por ejemplo, mieloma múltiple. Un procedimiento de transferencia de células de este tipo se denomina en la técnica "transferencia de células adoptivas (ACT)", en el que las células de origen inmunitario se transfieren a un receptor para transferir la funcionalidad de las células de origen inmunitario al huésped. Las células de origen inmunitario se pueden haber originado en el receptor o en otro individuo. Los procedimientos de transferencia de células adoptivas para tratar diversos tipos de cánceres, incluyendo cánceres hemáticos tales como mieloma.
Una vez que la composición que comprende células huésped que expresan la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR según la invención, o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica cA r según la invención, se administra a un mamífero (por ejemplo, un ser humano), se puede medir la actividad biológica del CAR por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. De acuerdo con el procedimiento divulgado, el CAR se une a BCMA en el cáncer y las células cancerosas se destruyen. La unión del CAR a BCMA en la superficie de las células cancerosas se puede someter a ensayo usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática) y citometría de flujo. La capacidad del CAR para destruir células se puede medir usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, tal como los ensayos de citotoxicidad descritos, por ejemplo, en Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). La actividad biológica del CAR también se puede medir analizando la expresión de determinadas citocinas, tales como CD107a, IFNy, IL-2 y TNF.
Un modo de realización de la divulgación comprende además la linforreducción del mamífero antes de administrar el material de CAR según la invención. Los ejemplos de linforreducción incluyen, pero pueden no limitarse a, quimioterapia linforreductora no mielosupresora, quimioterapia linforreductora mielosupresora, irradiación corporal total, etc.
Para los propósitos de los procedimientos divulgados, en los que se administran células huésped o poblaciones de células, las células pueden ser células que sean alogénicas o autólogas al mamífero. Preferentemente, las células son autólogas al mamífero.
Una "cantidad eficaz" o "una cantidad eficaz para tratar" se refiere a una dosis que es adecuada para prevenir o tratar el cáncer en un individuo. Las cantidades eficaces para un uso terapéutico o profiláctico dependerán, por ejemplo, del estadio y la gravedad de la enfermedad o trastorno que se esté tratando, la edad, el peso y el estado general de salud del paciente y el criterio del médico prescriptor. El tamaño de la dosis también estará determinado por el material de CAR particular seleccionado, el procedimiento de administración, el momento y la frecuencia de la administración, la existencia, la naturaleza y el alcance de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de CAR particular y el efecto fisiológico deseado. Se apreciará por un experto en la técnica que diversas enfermedades o trastornos (por ejemplo, cáncer) podrían requerir un tratamiento prolongado que implica múltiples administraciones, quizás usando los materiales de CAR según la invención en cada o diversas rondas de administración. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la divulgación, la dosis del material de CAR según la invención puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día. En un modo de realización de la divulgación, la dosis puede ser de aproximadamente 1 * 10 4 a aproximadamente 1 * 10 10 células que expresan el CAR según la invención por kg de peso corporal. Cuando el material de CAR según la invención es una célula huésped, una dosis ejemplar de células huésped puede ser un mínimo de un millón de células (1 mg de células/dosis), por ejemplo, 1 * 10 9 células por kg de peso corporal. Cuando el material de CAR según la invención es un ácido nucleico encapsidado en un virus, una dosis ejemplar de virus puede ser de 1 ng/dosis.
Para los propósitos de la divulgación, la cantidad o dosis del material de CAR según la invención administrado debería ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal durante un plazo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de CAR según la invención debería ser suficiente para unirse al antígeno, o detectar, tratar o prevenir la enfermedad, por ejemplo, el cáncer, en un período de desde aproximadamente 2 horas o más, por ejemplo, de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 o más horas, desde el momento de la administración. En determinados modos de realización, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis estará determinada por la eficacia del material de CAR según la invención particular y la afección del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) que se va a tratar.
Para los propósitos de la divulgación, se podría usar un ensayo que comprende, por ejemplo, comparar la medida en que las células diana se lisan y/o se secreta IFN-y por los linfocitos T que expresan el CAR según la invención tras la administración de una dosis dada de dichos linfocitos T a un mamífero, entre un conjunto de mamíferos a los que se les da a cada uno una dosis diferente de linfocitos T, para determinar una dosis de partida que se ha de administrar a un mamífero. La medida en que las células diana se lisan y/o se secreta IFN-y tras la administración de una determinada dosis se puede someter a ensayo por procedimientos conocidos en la técnica.
Cuando los materiales de CAR según la invención se administran con uno o más agentes terapéuticos adicionales, se pueden coadministra uno o más agentes terapéuticos adicionales al mamífero. Por "coadministración" se quiere decir administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales y los materiales de CAR según la invención suficientemente cerca en el tiempo, de modo que los materiales de CAR según la invención puedan potenciar el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales o viceversa. A este respecto, los materiales de CAR según la invención se pueden administrar en primer lugar y el uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar en segundo lugar o viceversa. De forma alternativa, los materiales de CAR según la invención y el uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar simultáneamente. Un agente terapéutico ejemplar que se puede coadministrar con los materiales de CAR es IL-2. Se cree que IL-2 potencia el efecto terapéutico de los materiales de CAR según la invención. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo particular, se cree que IL-2 potencia el tratamiento potenciando la expansión in vivo del número de células que expresan los CAR de la invención.
El mamífero al que se hace referencia en el presente documento puede ser cualquier mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Los mamíferos pueden ser del orden Carnivora, incluyendo felinos (gatos) y caninos (perros). Los mamíferos pueden ser del orden Artiodactyla, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluyendo equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, Ceboidea o Simoides (monos) o del orden Antropoides (seres humanos y simios). Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
Con respecto a los procedimientos divulgados, el cáncer puede ser cualquier cáncer. En un modo de realización de la divulgación, el cáncer es un cáncer que expresa BCMA. En un modo de realización de la divulgación, el cáncer es mieloma múltiple o linfoma de Hodgkin.
Como se analiza en el presente documento, el mieloma múltiple, también conocido como mieloma de células plasmáticas o enfermedad de Kahler, es un cáncer de las células plasmáticas, que son un tipo de leucocitos normalmente responsables de la producción de anticuerpos (Raab et al., Lancet, 374: 324-329 (2009)). El mieloma múltiple afecta a 1-4 de cada 100.000 personas al año. La enfermedad es más común en los hombres y, por motivos aún desconocidas, es dos veces más común en los afroestadounidenses que en los estadounidenses de raza blanca. El mieloma múltiple es la neoplasia hemática menos común (14 %) y constituye un 1 % de todos los cánceres (Raab et al., supra). El tratamiento del mieloma múltiple típicamente implica quimioterapia en dosis altas seguida de trasplante de hemocitoblastos (alogénicos o autólogos); sin embargo, es común una alta tasa de recidiva en pacientes con mieloma múltiple que se han sometido a dicho tratamiento. Como se analiza anteriormente, BCMA se expresa altamente por células de mieloma múltiple (véase, por ejemplo, Novak et al., supra; Neri et al., supra; Bellucci et al., supra; y Moreaux et al., supra).
El linfoma de Hodgkin (anteriormente conocido como enfermedad de Hodgkin) es un cáncer del sistema inmunitario que se caracteriza por la presencia de un tipo de células multinucleadas llamadas células de Reed-Sternberg. Los dos tipos principales de linfoma de Hodgkin incluyen el linfoma de Hodgkin clásico y el linfoma de Hodgkin con predominio de linfocitos nodulares. Actualmente, el linfoma de Hodgkin se trata con radioterapia, quimioterapia o trasplante de hemocitoblastos, dependiendo la elección del tratamiento de la edad y el sexo del paciente y el estadio, volumen y subtipo histológico de la enfermedad. Se ha detectado expresión de BCMA en la superficie de células de linfoma de Hodgkin (véase, por ejemplo, Chiu et al., Blood, 109(2): 729-739 (2007)).
Los términos "tratar" y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, como se usa en el presente documento, no necesariamente implican un 100 % de tratamiento o prevención completos. Más bien, existen grados variados de tratamiento o prevención de los que un experto en la técnica reconoce como que tienen un beneficio o efecto terapéutico potencial. A este respecto, los procedimientos divulgados pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o prevención proporcionados por el procedimiento divulgado pueden incluir el tratamiento o prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que se está tratando o previniendo. Además, para los propósitos en el presente documento, "prevención" puede englobar retrasar la aparición de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, o un síntoma o afección de la misma.
Otro modo de realización de la invención proporciona cualquiera de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped, poblaciones de células y/o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Todavía otro modo de realización de la divulgación proporciona el uso de cualquiera de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped, poblaciones de células y/o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. El cáncer puede ser cualquiera de los cánceres descritos en el presente documento.
Los siguientes ejemplos ilustran además la invención, pero, por supuesto, no se deben interpretar de ninguna manera como limitantes de su alcance.
Los materiales y procedimientos empleados en los ejemplos 1-10 se proporcionan a continuación.
Líneas celulares y células primarias
Las líneas celulares BCMA+ de mieloma múltiple H929, U266 y RPMI8226 se obtuvieron de ATCC. La línea celular de cáncer de pulmón negativa para BCMA A549 se obtuvo de ATCC. La línea celular de sarcoma negativa para BCMA se obtuvo de ATCC.
Las células BCMA-K562 y K562 de ATCC se transdujeron con el gen para BCMA de longitud completa en el laboratorio antes de los siguientes experimentos. Las células NGFR-K562 y K562 se transdujeron con el gen para el factor de crecimiento nervioso de baja afinidad en el laboratorio antes de los siguientes experimentos. Se usaron los mismos procedimientos y vector gammarretrovírico para transducir células BCMA-K562 y NGFR-K562.
Las muestras de tejido o los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PMBC) de seis pacientes con mieloma múltiple se designaron como pacientes con mieloma 1-6. Se usaron PBMC de 3 sujetos con melanoma y los donantes se marcaron como donante A, donante B y donante C. También se obtuvieron células hematopoyéticas CD34+ primarias de tres donantes sanos. Todas las muestras humanas usadas se obtuvieron de pacientes incluidos en ensayos clínicos aprobados por la Junta de Revisión Institucional en el Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos.
Construcción de CAR de solo la cadena pesada completamente humana (FHVH)
Se preparó una serie de CAR que contenían dominios de reconocimiento de antígeno de solo la cadena pesada completamente humana (FHVH). La secuencia de cada CAR siguió este patrón desde el extremo 5' hasta el extremo 3': secuencia líder de CD 8 a, uno de los 4 dominios de región variable de la cadena pesada única y regiones bisagra y transmembranaria de la molécula CD 8 a humana. A continuación, se añadió la porción citoplásmica de las moléculas CD28, 4-1BB o bien coestimuladoras de linfocitos T inducibles (ICOS), seguido de la porción citoplásmica de la molécula CD3Z Las secuencias de aminoácidos completas de estos CAR se proporcionan en SEQ ID N.os: 17-28.
Los cuatro dominios de reconocimiento de antígeno de CAR de solo la cadena pesada completamente humana se designaron FHVH 74, 32, 33 y 93, como se muestra en las figuras 1A-1L. Las denominaciones CAR también incluyen el dominio transmembranario y de bisagra de CD 8 a, el dominio coestimulador incluido y el dominio CD3Z Por ejemplo, FHVH74-CD828Z tiene el dominio de reconocimiento de antígeno FHVH74, un dominio transmembranario y de bisagra de CD 8 a, un dominio coestimulador de CD28 y el dominio de activación de linfocitos T CD3Z. Se usó c Ar anti-BCMA 11D5-3-CD828Z como control positivo.
Se construyeron estos CAR y se fijaron las secuencias de nucleótidos de CAR en la cadena principal del vector gammarretrovírico de MSGV por procedimientos estándar. Las secuencias de nucleótidos completas de los CAR se proporcionan en SEQ ID N.os: 29-40. Las secuencias de la cadena pesada variable específica de BCMA se sintetizaron como fragmentos GBLOCK (Integrated DNA Technologies (IDT), Skokie, IL). Cada fragmento sintetizado contenía un trinucleótido GTC, el sitio Ncol, la secuencia líder de CD 8 a, la secuencia de FHVH, parte del dominio transmembranario y de bisagra de CD 8 a, el sitio Blpl y un hexanucleótido TATCGT (proporcionado como SEQ ID N.° 41). Se añadieron los nucleótidos GTC y TATCg T (SEQ ID NO: 41) para garantizar la escisión de extremo completa con Ncol y Blpl. Los fragmentos se digirieron con Blpl y NCOI-Hf (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante dos horas a 37 °C. A continuación, los fragmentos digeridos se purificaron usando el kit de purificación de PCR QIAQUICK (Qiagen). Los fragmentos se fijaron en las cadenas principales del vector de MSGV digeridos con Blpl/Ncol-HF y purificados en gel que también incluían otros componentes del CAR no incluidos en los fragmentos Gb LOCK (Integrated DNA Technologies (IDT), Skokie, IL).
Los componentes de CAR incluidos en las cadenas principales del vector de MSGV fueron: el resto del dominio de CD 8 a que no estaba incluido en el fragmento GBLOCK (Integrated DNA Technologies (IDT), Skokie, IL), la secuencia que codifica el dominio coestimulador, CD28 o 4-1BB o bien ICOS y el dominio CD3Z. La unión de cada fragmento de CAR GBLOCK (Integrated DNA Technologies (IDT), Skokie, IL) y el fragmento de la cadena principal del vector de MSGV se llevó a cabo usando el kit de fijación de ADN rápida (Roche Applied Sciences).
Detección de CAR en linfocitos T
Los linfocitos T que se transdujeron con uno de los vectores de CAR y los linfocitos T sin transducir se lavaron y tiñeron con una proteína Fc-BCMA marcada con ficoeritrina para detectar moléculas de CAR en la superficie celular. Se suspendieron quinientos mil linfocitos T en 50 ml de tampón de tinción y se añadió una cantidad valorada de reactivo BCMA-Fc-PE. La tinción para CD3, CD4 y CD 8 también se realizó usando procedimientos estándar. Las células muertas se excluyeron usando 7-AAD (tinte de 7-amino-acinomicina, (BD Biosciences)).
Cultivo de linfocitos T
Los PBMC se descongelaron y lavaron en medio de linfocitos T que contenía medio AIM V (Invitrogen, Waltham, MA) más suero AB al 5 % (Valley Biomedical, Winchester, VA), 100 U/ml de penicilina y 100 |jg/ml de estreptomicina. Antes de las transducciones, los PBMC se suspendieron a una concentración de 1 *10 6 células/ml en medio de linfocitos T más 50 ng/ml del anticuerpo monoclonal anti-CD3 OKT3 (Ortho, Bridgewater, NJ) y 300 Ul/ml de IL-2. Después de las transducciones, los linfocitos T se mantuvieron en medio de linfocitos T más IL-2.
Transducciones gammarretrovíricas
Para producir gammarretrovirus incapaces de reproducirse, se transfectaron células encapsidantes con plásmidos que codifican CAR junto con un plásmido que codifica la proteína de la envoltura RD114. La transducción gammarretrovírica de linfocitos T se realizó 2 días después del inicio de los cultivos de linfocitos T.
ELISA de interferón-Y y factor de necrosis tumoral alfa
Se combinaron cien mil células diana BCMA+ o negativas para BCMA con 100.000 linfocitos T transducidas con CAR en pocillos duplicados de una placa de fondo redondo de 96 pocillos en 200 |jl de medio AIM-V suero humano al 5 %. Las placas se incubaron a 37 °C durante 18-20 horas. Después de la incubación, se realizaron los ELISA para interferón gamma (INFy) usando procedimientos estándar (Pierce). Los ELISA del factor de necrosis tumoral (TNF) alfa se realizaron usando procedimientos estándar (R&D).
Ensayo CD107a
Para cada cultivo de linfocitos T que se sometió a prueba, se prepararon dos tubos. Un tubo contenía células BCMA-K562 y el otro tubo contenía células NGFR-K562. Ambos tubos contenían linfocitos T transducidas con CAR, 1 ml de medio AIM-V suero AB humano al 5 %, una concentración valorada de un anticuerpo anti-CD 107a (eBioscience, clon eBioH4A3) y 1 j l de GOLGI STOP (monesina, BD Biosciences, San José, CA). Todos los tubos se incubaron a 37 °C durante 4 horas y a continuación se tiñeron para CD3, CD4 y CD 8 .
Citometría de flujo
Para la tinción anti-BCMA, se tiñeron las células con anticuerpos caprinos anti-BCMA humano marcados con biotina policlonal (R&D Systems, número de catálogo BAF 193) seguido de estreptavidina (BD). También se tiñeron las células de la médula ósea con anti-CD38 (eBioscience). También se tiñeron las células de la médula ósea con anti-CD38 (eBioscience) y anti-CD56 (BD). El análisis de citometría de flujo para todos los experimentos se realizó usando un software FLOWJO (Tree Star, Inc. Oregón, EE. UU.).
Ensayos de proliferación
Los cocultivos se prepararon en placas de 24 pocillos. Las células diana incluidas en los cocultivos eran 0,5x10 6 células BCMA-K562 irradiadas o bien 0,5x10 6 células NGFR-K562 irradiadas. Los cocultivos también incluían 1x10 6 linfocitos T de cultivos que se habían transducido con anti-bcma2 o bien SP 6 . Los linfocitos T se marcaron con éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE, Invitrogen) como se describe previamente. El medio usado en los cocultivos fue AIM V suero AB humano al 5 %. No se añadió IL-2 al medio. Cuatro días después del inicio, se contaron las células vivas en cada cocultivo con azul tripano para la exclusión de células muertas y se realizó citometría de flujo.
Ensayo de citotoxicidad
La citotoxicidad se midió comparando la supervivencia de las células diana BCMA+ en relación con la supervivencia de las células CCRF-CEM de control negativo. Ambos tipos de células se combinaron en los mismos tubos con linfocitos T transducidos con CAR. Las células de control negativo CCRF-CEM se marcaron con el tinte fluorescente 5-(y-6)-(((4-clorometil)benzoil)amino)tetrametilrrodamina (CTMMR) (Invitrogen), y las células diana BCMA+ se marcaron con CFSE. Los cocultivos se prepararon en tubos de ensayo de 5 ml estériles (BD) por duplicado en proporciones múltiples de linfocitos T con respecto a células diana. Las células diana contenidas en los tubos eran 50.000 células diana BCMA+ junto con 50.000 células de control negativo CCRF-CEM. Los cultivos se incubaron durante 4 horas a 37 °C. Inmediatamente después de la incubación, se añadió 7AAD (7-aminoactinomicina D) (BD) y se realizó la adquisición de citometría de flujo. Para cada cultivo de linfocitos T más células diana, se determinó el porcentaje de supervivencia de las células diana BCMA+ dividiendo el porcentaje de células BCMA+ vivas entre el porcentaje de células de control negativo CCRF-CEM vivas. El porcentaje de supervivencia corregido de las células diana BCMA+ se calculó dividiendo el porcentaje de supervivencia de las células diana BCMA+ en cada cultivo de linfocitos T más células diana entre la proporción del porcentaje de células diana BCMA+ vivas con respecto al porcentaje de células de control negativo CCRF-CEM vivas en tubos que contenían solo células diana BCMA+ y células CCRF-CEM sin linfocitos T efectores. Esta corrección fue necesaria para tener en cuenta la variación en el número de células de partida y la muerte espontánea de células diana. La citotoxicidad se calculó como sigue: el porcentaje de citotoxicidad de células diana BCMA+=100-porcentaje de supervivencia corregido de células diana BCMA+.
Experimentos de tratamiento de modelos murinos in vivo
Se usaron ratones NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) de The Jackson Laboratory. Los ratones recibieron inyecciones intradérmicas de células RPMI8226. Se dejó que los tumores crecieran durante 10 días. A continuación, los ratones recibieron infusiones intravenosas de las dosis señaladas en el ejemplo 9 (figuras 9B-9C) o el ejemplo 10 de linfocitos T humanos que se transdujeron con los CAR indicados en el ejemplo 9 (figuras 9B-9C), el ejemplo 10 o se dejaron sin transducir. Los tumores se midieron con compases calibradores cada 3 días. Se multiplicaron la longitud más larga y la longitud perpendicular a la longitud más larga para obtener el tamaño del tumor (área) en mm2. Cuando la longitud más larga alcanzó los 15 mm, se sacrificaron los ratones. Los estudios en animales se aprobaron por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos.
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra el diseño de los CAR con dominios de reconocimiento de antígeno de solo la cadena pesada.
Se diseñaron doce CAR con dominios de reconocimiento de antígeno de solo la cadena pesada completamente humana, como se muestra en las figuras 1A-1L. El diseño general de estos CAR desde el extremo N hasta el extremo C comprende: la secuencia líder de CD 8 a, una región variable de la cadena pesada completamente humana, los dominios transmembranario y de bisagra de CD 8 a, la porción citoplásmica de uno de los 3 dominios coestimuladores, la porción citoplásmica del dominio de activación de CD3Z Los 3 dominios coestimuladores sometidos a prueba fueron CD28, 4-1BB y coestimuladores de linfocitos T inducibles (ICOS). Este ejemplo demuestra los primeros CAR que se informaron con dominios de reconocimiento de antígeno de solo la cadena pesada.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra que los CAR de solo la cadena pesada se expresaron en la superficie de los linfocitos T.
Para llevar a cabo los experimentos, se transdujeron los linfocitos T humanos primarios de pacientes con mieloma múltiple (MM) con los c A r de solo la cadena pesada mostrados en la figura 2. La expresión de la superficie de CAR se evaluó tiñendo las células con un reactivo Fc-BCMA seguido de citometría de flujo (figura 2). Los cuatro CAR de FHVH se expresaron continuamente en la superficie de los linfocitos T como se muestra en la figura 2. La mediana de la intensidad de fluorescencia de la tinción fue algo mayor para el CAR de control 11D5-3-CD828Z que contenía tanto una región variable de la cadena ligera como regiones variables de la cadena pesada por motivos desconocidos.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra que los CAR de solo la cadena pesada se desgranularon de manera específica para BCMA.
Se midió la desgranulación específica de BCMA de los linfocitos T que expresan cada uno de los cuatro CAR de FHVH mostrados en la figura 3 y el CAR 11D5-3-CD828Z. Los linfocitos T transducidos con cada uno de los CAR de FHVH regularon por incremento CD107a específicamente en respuesta a la estimulación con células diana que expresan BCMA pero no con células diana negativas para BCMA, como se muestra en la figura 3. Los linfocitos T que expresan 11D5-3 también regularon por incremento CD107a (figura 3). La regulación por incremento de CD107a demuestra la desgranulación específica de BCMA de los linfocitos T, que es parte del proceso de citotoxicidad mediado por perforina.
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T que expresan CAR de solo la cadena pesada liberaron citocinas de manera específica para BCMA.
Se evaluó la capacidad de los linfocitos T humanos primarios de pacientes con MM para liberar interferón gamma (IFNy) y factor de necrosis tumoral (TNF) alfa cuando se cultivaron in vitro con una variedad de líneas celulares diana. Se encontró que todos los CAR de FHVH mostrados en las tablas 1-3 liberan estas citocinas de una manera altamente específica para BCMA, como se expone en las tablas 1-3, respectivamente.
Tabla 1. ELISA de interferón gamma
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Con referencia a la tabla 1, los linfocitos T cultivados se transdujeron con los CAR indicados y se cultivaron durante la noche con las células diana indicadas (fila superior). Después de la incubación durante la noche, se realizó un ensayo ELISA estándar en el sobrenadante del cultivo. BCMA-K562 y RPMI8226 son BCMA+. NGFR-K562, CCRF-CEM y 293GP son negativos para BCMA. El porcentaje de linfocitos T que expresan el CAR indicado se determinó por tinción con un reactivo BCMA-Fc-PE seguido de citometría de flujo. El % CAR+ es igual al porcentaje de células CD3+ transducidas con cada CAR que se tiñeron con el reactivo BCMA-Fc-PE menos el porcentaje de linfocitos CD3+ sin transducir que se tiñeron con el reactivo BCMA-Fc-PE. Excepto por la columna % c Ar , todos los números son pg/ml de interferón gamma.
Tabla 2. ELISA de factor de necrosis tumoral alfa
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Con referencia a la tabla 2, los linfocitos T cultivados se transdujeron con los CAR indicados y se cultivaron durante la noche con las células diana indicadas (fila superior). Después de la incubación durante la noche, se realizó un ensayo ELISA estándar en el sobrenadante del cultivo. BCMA-K562 es BCMA+. Todas las demás dianas son negativas para BCMA. El porcentaje de linfocitos T que expresan el CAR indicado se determinó por tinción con un reactivo BCMA-Fc-PE seguido de citometría de flujo. El % CAR+ es igual al porcentaje de células CD3+ transducidas con cada CAR que se tiñeron con el reactivo BCMA-Fc-PE menos el porcentaje de linfocitos CD3+ sin transducir que se tiñeron con el reactivo BCMA-Fc-PE. Excepto por la columna % CAR+, todos los números son pg/ml de interferón gamma.
Los resultados de las tablas 1 y 2 muestran que los CAR indicados reconocen específicamente células diana BCMA+ .
Tabla 3. Reconocimiento de células diana BCMA+
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Con referencia a la tabla 3, los linfocitos T cultivados se transdujeron con los CAR indicados y se cultivaron durante la noche con las células diana indicadas (fila superior). Después de la incubación durante la noche, se realizó un ensayo ELISA estándar en el sobrenadante del cultivo. BCMA-K562 es BCMA+. Todas las demás dianas son negativas para BCMA. El porcentaje de linfocitos T que expresan el CAR indicado se determinó por tinción con un reactivo BCMA-Fc-PE seguido de citometría de flujo. El % CAR+ es igual al porcentaje de células CD3+ transducidas con cada CAR que se tiñeron con el reactivo BCMA-Fc-PE menos el porcentaje de linfocitos CD3+ sin transducir que se tiñeron con el reactivo BCMA-Fc-PE. Excepto por la columna % CAR+, todos los números son pg/ml de interferón gamma.
Los resultados de la tabla 3 muestran que los linfocitos T que expresan FHVH-CD828Z o FHVH-CD828Z reconocen específicamente las células diana BCMA+.
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T que expresan los CAR de solo la cadena pesada proliferaron de manera específica para BCMA in vitro.
Los linfocitos T primarios que expresan CAR marcados con CFSE de pacientes con MM se cultivaron con células diana BCMA+ o negativas para BCMA irradiadas. Los cuatro CAR de FHVH que se muestran en las figuras 4B-4E proliferaron de manera específica para BCMA, como se muestra en las figuras 4B-4E. Los linfocitos T que expresan el CAR 11D5-3-CD828Z también proliferaron de manera específica para BCMA (figura 4A). Además de documentar la proliferación específica de BCMA por dilución de CFSE, la proliferación específica de BCMA también se demostró por un incremento en el número absoluto de linfocitos T que expresan cA r que se cultivaron con células diana BCMA+. El número absoluto de linfocitos T CAR+ se incrementó cuando los linfocitos T se cultivaron con células diana BCMA+ como se muestra en la figura 4F.
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T que expresan CAR solo de la cadena pesada destruyen las células diana BCMA+.
Se valoró la capacidad de los linfocitos T con CAR de FHVH para destruir las células diana BCMA+. Se demostró que FHVH33-CD828Z y FHVH33-CD8BBZ tienen la capacidad de destruir células BCMA+RPMI226 en comparación con las células ST, como se muestra en las figuras 5A y 5B.
Ejemplo 7
Este ejemplo demuestra que los CAR de solo la cadena pesada con un dominio coestimulador 4-1BB se expresan y son funcionales.
Se construyeron y valoraron los cuatro CAR de solo la cadena pesada completamente humana mostrados en la figura 6 , con dominios coestimuladores 4-1BB. Los cuatro CAR se expresaron en la superficie de los linfocitos T humanos primarios, pero FHVH33-CD8BBZ tuvo continuamente la expresión más alta (figura 6 ) y, por lo tanto, se seleccionó para un estudio adicional. Los resultados de una valoración funcional de FHVH33-CD8BBZ se muestran en la figura 7A-7F. Estos linfocitos T que expresan CAR produjeron IFNy y se desgranularon de manera específica para BCMA.
Ejemplo 8
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T transducidos con CAR anti-BCMA reconocen las células primarias de mieloma múltiple.
Los linfocitos T que no estaban transducidos o bien que expresaban los CAR FHVH33-CD828Z o FHVH33-CD 8 BBZ se incubaron con células autólogas de mieloma de médula ósea (90 % de pureza) durante 4 horas. Se midió la regulación por incremento de CD107a como marcador de desgranulación de linfocitos T, y también se midió la coexpresión de CD 8 o CD4. Los porcentajes de células con los fenotipos indicados se muestran en la tabla 4. Como se muestra en la tabla 4, los linfocitos T transducidos con CAR FHVH33-CD828Z o FHVH33-CD 8 BBZ regularon por incremento la expresión de CD107a después del cocultivo con células diana de mieloma de médula ósea.
TABLA 4
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Los linfocitos T que estaban sin transducir (ST) o bien que expresaban CAR FHVH33-CD828Z o FHVH33-CD8BBZ se incubaron con células autólogas de mieloma de médula ósea (90 % de pureza) o PBMC de control durante la noche. La liberación de interferón gamma se midió con un ensayo ELISA estándar. Los resultados se muestran en la figura 8 . Como se muestra en la figura 8 , las células transducidas con CAR FHVH33-CD828Z o FHVH33-CD 8 BBZ secretaron IFN-y después del cocultivo con células diana de mieloma de médula ósea.
Ejemplo 9
Este ejemplo demuestra una valoración de dosis de linfocitos T que expresan FHVH33-CD8BBZ en ratones. Como se muestra en la figura 9A, a ratones NSG se les inyectaron por vía intradérmica células RPMI8226. Se dejó que los tumores crecieran durante 10 días. El día 0, los ratones recibieron infusiones intravenosas del número indicado de linfocitos T que expresan FHVH33-CD8BBZ. Los ratones recibieron una de las tres dosis diferentes de linfocitos T con CAR FHVH33-CD8BBZ, y otro grupo de ratones se dejó sin tratar. Todos los ratones tenían tumores establecidos en el momento de la infusión de linfocitos T.
Como se muestra en la figura 9B, 2,2 * 10 6 linfocitos T FHVH33-CD8BBZ pudieron erradicar los tumores de todos los ratones, y la eficacia de los linfocitos T con CAR FHVH33-CD8BBZ disminuyó de forma dependiente de la dosis. Todos los ratones que se dejaron sin tratar tuvieron un agrandamiento progresivo de sus tumores. (n=5 ratones por grupo).
La supervivencia de los ratones se muestra en la figura 9C. Todos los ratones que recibieron 2,2 * 10 6 linfocitos T que expresan FHVH33-CD8BBZ sobrevivieron y estuvieron sanos durante la duración del experimento.
Ejemplo 10
Este ejemplo demuestra la erradicación de tumores BCMA+ en ratones NSG.
A los ratones se les inyectaron por vía intradérmica células RPMI8226. Se dejó que los tumores crecieran durante 10 días. El día 0, los ratones recibieron infusiones intravenosas de 1*10 6 linfocitos T que expresan los CAR SP 6-CD828Z, 11D5-3-CD8BBZ, FHVH33-CD8BBZ o FHVH33-CD828Z o los ratones se dejaron sin tratar.
Como se muestra en la figura 10A, los ratones que recibieron infusiones de linfocitos T que expresan el control negativo SP6-CD828Z CAR y los ratones sin tratar tuvieron un crecimiento tumoral progresivo. Los ratones que recibieron linfocitos T que expresaban CAR 11D5-3-CD8BBZ, FHVH33-CD8BBZ o bien FHVH33-CD828Z lograron la eliminación de los tumores.
La supervivencia de los ratones se muestra en la figura 10B. Los ratones que recibieron linfocitos T que expresaban CAR 11D5-3-CD8BBZ, FHVH33-CD8BBZ o bien FHVH33-CD828Z sobrevivieron.
Ejemplo 11
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T que expresan CAR de solo la cadena pesada liberan IFN-gamma de manera específica para BCMA.
Los linfocitos T efectores se cultivaron durante la noche con las células diana indicadas en la tabla 5. Los linfocitos T efectores eran linfocitos T sin transducir, linfocitos T transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica FHVH33-CD828Z o bien linfocitos T transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica FHVH33 CD 8 BBZ. Los linfocitos T eran todos del mismo donante humano. Los linfocitos T transducidos con FHVH33-CD828Z proporcionaron un 71 % de expresión de CAR. Los linfocitos T transducidos con FHVH33-CD8BBZ proporcionaron un 80 % de expresión de CAR.
Las células diana BCMA+ fueron BCMA-K562 y RPMI8226. Las células diana negativas para BCMA fueron Panc10.05, U251, 293GP, células epiteliales bronquiales humanas normales primarias (NHBE), células endoteliales microvasculares humanas primarias (HMVEC), células epiteliales intestinales humanas primarias (InEpC).
Se realizó un ELISA de interferón (IFN)-gamma. Los resultados se muestran en la tabla 5. La producción de interferón gamma por los linfocitos T efectores solos también se muestra en la tabla 5. Todos los valores en la tabla 5 son pg/ml de IFN-gamma.
TABLA 5
Figure imgf000023_0001
Como se muestra en la tabla 5, los linfocitos T con CAR produjeron mucho más interferón gamma en presencia de dianas BCMA+.
El uso de los términos "uno" y "una" y "el/la" y "al menos uno" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se ha de interpretar para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. El uso del término "al menos uno" seguido de una lista de uno o más elementos (por ejemplo, "al menos uno de A y B") se ha de interpretar para querer decir un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) o cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se han de interpretar como términos abiertos (es decir, que quieren decir "incluyendo, pero sin limitarse a") a menos que se señale de otro modo. Se pretende que la enumeración de intervalos de valores en el presente documento sirva meramente como un procedimiento abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique de otro modo en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Se pretende que el uso de todos y cada uno de los ejemplos o terminología ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento sea meramente para iluminar mejor la invención y no plantea una limitación sobre el alcance de la invención a menos que se reivindique de otro modo. Ninguna terminología en la memoria descriptiva se debe interpretar como que indica que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de reconocimiento de antígeno, un dominio transmembranario (TM) y un dominio de activación de linfocitos T, en el que el CAR tiene especificidad de antígeno para el antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA), en el que el dominio de reconocimiento de antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de:
    (a) SEQ ID NO: 1-3;
    (b) SEQ ID NO: 4-6;
    (c) SEQ ID NO: 7-9; o
    (d) SEQ ID NO: 10-12.
  2. 2. El CAR de la reivindicación 1, en el que todos los dominios del CAR son humanos.
  3. 3. El CAR de la reivindicación 1 o 2, en el que el dominio de reconocimiento de antígeno no comprende un péptido conector que tenga una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 residuos aminoacídicos.
  4. 4. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el CAR no comprende una región variable de la cadena ligera de anticuerpo.
  5. 5. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el dominio de reconocimiento de antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de:
    (a) SEQ ID NO: 13;
    (b) SEQ ID NO: 14;
    (c) SEQ ID NO: 15; o
    (d) SEQ ID NO: 16.
  6. 6. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el dominio de activación de linfocitos T comprende un dominio de señalización de linfocitos T de una cualquiera de las siguientes proteínas: una proteína CD28 humana, una proteína CD3-zeta humana, una proteína de FcRy humana, una proteína CD27, una proteína OX40, una proteína 4-1BB humana, una proteína coestimuladora de linfocitos T inducible humana (ICOS), versiones modificadas de cualquiera de las anteriores o cualquier combinación de las anteriores.
  7. 7. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 17-28.
  8. 8. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  9. 9. El ácido nucleico de la reivindicación 8 que comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 29-40.
  10. 10. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 8 o 9.
  11. 11. Una célula huésped aislada que comprende el vector de la reivindicación 10.
  12. 12. La célula huésped aislada de la reivindicación 11, en la que la célula huésped es un linfocito T o un linfocito citolítico natural (NK).
  13. 13. Una población de células que comprende al menos una célula huésped de la reivindicación 11 o 12.
  14. 14. Una composición farmacéutica que comprende (a) el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el ácido nucleico de la reivindicación 8 o 9, el vector de la reivindicación 10, la célula huésped de la reivindicación 11 o 12, o la población de la reivindicación 13 y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  15. 15. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el ácido nucleico de la reivindicación 8 o 9, el vector de la reivindicación 10, la célula huésped de la reivindicación 11 o 12, o la población de la reivindicación 13, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, opcionalmente en el que el cáncer es mieloma múltiple o linfoma de Hodgkin.
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