ES2928505T3 - Dispositivo y procedimiento para la extracción de ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Dispositivo y método para la extracción de ácidos nucleicos, que comprende un cuerpo hueco, preferiblemente una punta de pipeta, a través del cual se conduce un fluido, caracterizado porque en este cuerpo hueco se dispone un material con una superficie rugosa o estructurada de manera que el material se puede lavar. alrededor con un fluido. Después de la lisis de la muestra y el ajuste de las condiciones de unión necesarias para la adsorción de los ácidos nucleicos en el material de soporte, la formulación se "pipetea" varias veces más allá del material de unión de ácidos nucleicos ubicado verticalmente en la punta de la pipeta mediante un proceso de pipeteo. Los ácidos nucleicos se unen al material. Posteriormente, los tampones de lavado también se "pipetean más allá" del material de unión de ácido nucleico. Posteriormente tiene lugar una etapa de secado. Finalmente, el eluyente a su vez "se pipetea" varias veces más allá del material de unión de ácido nucleico, disponiéndose dicho material verticalmente, y de este modo se disuelve el ácido nucleico unido. El ácido nucleico está ahora disponible para la aplicación posterior necesaria. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo y procedimiento para la extracción de ácidos nucleicos
El objeto de la invención es un dispositivo novedoso con el que los ácidos nucleicos se pueden aislar o purificar de forma rápida y altamente eficiente, así como cuantitativamente. El novedoso dispositivo para la extracción de ácidos nucleicos se puede utilizar tanto para la extracción manual en el laboratorio como también bajo condiciones de campo. Se dan a conocer ventajas especiales en el contexto de la automatización de las extracciones de ácidos nucleicos.
Bajo condiciones clásicas, el aislamiento del ADN a partir de células y tejidos se realiza porque los materiales de partida que contienen ácidos nucleicos se descomponen en condiciones altamente desnaturalizantes y reductoras, en parte también con el uso de enzimas degradantes de proteínas, se purifican las fracciones de ácido nucleico salientes a través de etapas de extracción fenol-cloroformo y se obtienen los ácidos nucleicos de la fase acuosa por medio de diálisis o precipitación de etanol (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning"). Estos "procedimientos clásicos" para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de células y especialmente a partir de tejidos requieren mucho tiempo (en parte más de 48 h), requieren un considerable esfuerzo de aparato y, además, tampoco se pueden realizar bajo condiciones de campo. Además, debido a los productos químicos utilizados, como el fenol y el cloroformo, tales métodos son peligrosos para la salud en un grado no bajo.
La siguiente generación de procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos se basa en un método desarrollado y descrito por primera vez por Vogelstein y Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615 - 619) la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El método combina la disolución de la agarosa que contiene la banda de ADN a aislar en una solución saturada de una sal caotrópica (NaJ) con una unión del ADN a partículas de vidrio. El ADN fijado a las partículas de vidrio se lava a continuación con una solución de lavado (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50 % v/v etanol) y a continuación se separa de las partículas de soporte. Este método ha experimentado una serie de modificaciones hasta la fecha y se aplica en el momento actual para diferentes procedimientos de extracción y purificación de ácidos nucleicos de diferentes orígenes y, en última instancia, es la base de casi todos los kits disponibles comercialmente para el aislamiento manual y automatizado de ácidos nucleicos. Además, hay una pluralidad de patentes y publicaciones que se refieren al principio básico del aislamiento de los ácidos nucleicos, que fue publicado por primera vez por Vogelstein y Gillespie y eventualmente poseen otras ventajas. Estas variantes se refieren tanto al uso de diferentes materiales de soporte minerales como también al tipo de tampones usados para la unión de los ácidos nucleicos. Ejemplos son, entre otros, la unión de ácidos nucleicos a soportes minerales en presencia de soluciones de diferentes sales caotrópicas, en las que como material de soporte se utilizan polvo de vidrio finamente molido (BIO 101, La Jolla, CA), tierras de diatomas (empresa Sigma) o también geles de sílice o suspensiones de sílice o filtros de fibra de vidrio o tierras minerales (DE 4139664 A1; US 5,234,809; WO-A 95/34569 DE 4321904; DE 20207793). Todas estas patentes se basan en la unión de ácidos nucleicos a un material de soporte mineral a base de vidrio o silicio en presencia de soluciones salinas caotrópicas. En las patentes más recientes se da a conocer que para la adsorción de ácidos nucleicos a los materiales minerales conocidos y utilizados por el experto en la materia también se pueden utilizar de forma muy eficiente y exitosa las denominadas sales anticaotrópicas como componente de sistemas tampón de lisis/unión (EP 1135479). En resumen, se puede describir el estado de la técnica en el sentido de que los ácidos nucleicos se unen a materiales minerales en presencia de tampones que contienen sales caotrópicas o anticaotrópicas o también en presencia de tampones que contienen mezclas de sales caotrópicas y anticaotrópicas, y de esta manera también se pueden aislar. A este respecto, también hay variantes preferentes en las que se utilizan adicionalmente alcoholes alifáticos para la mediación en uniones. El experto en la materia también se conoce que todos los productos comerciales comunes para el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos se basan en esta base. Los soportes minerales utilizados están presentes a este respecto en forma de materiales a granel sueltos, en forma de membranas de filtro o también en forma de suspensiones. Las partículas paramagnéticas o magnéticas se utilizan a menudo para la realización de secuencias de extracción automatizadas. A este respecto, se trata, por ejemplo, de materiales silicáticos que poseen un núcleo magnético o paramagnético o también partículas de óxido de hierro, cuya superficie se modifica de modo que estas portan las funcionalidades necesarias para la unión de los ácidos nucleicos. Para poder llevar a cabo extracciones automatizadas con mayor facilidad en particular, se utilizaron puntas de pipeta modificadas. Estas están caracterizadas porque contienen ya los materiales de soporte necesarios para la unión de ácidos nucleicos (materiales de soporte minerales porosos o intercambiadores de aniones porosos, etc.). Así, la patente DE3717211 describe una punta de pipeta con un material de cromatografía poroso para el aislamiento de ácidos nucleicos. La patente EP1951904 da a conocer una punta de pipeta que se compone de una parte superior e inferior, entre la que también se sitúa un material de soporte cromatográfico poroso y que se debe usar para el aislamiento automatizado de ácidos nucleicos. Una punta de pipeta modificada para la extracción de ácidos nucleicos también se da a conocer en el documento de solicitud de patente US2013/0078619. También en esta punta de pipeta se sitúa un material de soporte mineral poroso (vidrio poroso) para la unión directa de ácidos nucleicos. A todas estas puntas de pipeta modificadas es común que es un material cromatográfico poroso (material a granel suelto o cuerpo sólido poroso). Estos materiales de soporte siempre se sitúan horizontalmente dentro de la punta de pipeta. Los líquidos a procesar fluyen a través del material poroso utilizado. El proceso de extracción se basa en el hecho de que después de la lisis de la muestra y el ajuste de las condiciones de unión necesarias para la adsorción de los ácidos nucleicos en el material de soporte, esta preparación se arrastra a través del material de soporte poroso por medio de un proceso de pipeteo. Los ácidos nucleicos se unen al material de soporte. A continuación se pipetean tampones de lavado a través del material de soporte. Posteriormente, se realiza una etapa de secado (pipeteo de arriba abajo frecuente o aplicación de vacío). Finalmente, el eluyente se pipetea a través del material de soporte. A este respecto, el ácido nucleico unido se separa del material de soporte. El uso de puntas de pipeta que contienen material de soporte debe simplificar significativamente el desarrollo (en particular) automatizado de extracciones de ácido nucleico. Aunque estas ideas son en parte relativamente antiguas (la patente DE3717211 data del 22.5.1987), tal procedimiento no ha prevalecido. A este respecto, la causa consiste en algunos problemas fundamentales:
1) El pipeteo de lisados de alta viscosidad que contienen ácido nucleico solo funciona de manera limitada o conduce al cierre completo del material cromatográfico. Por lo tanto, no es posible una extracción.
2) El pipeteo de lisados sobre un material poroso conduce a la formación de espuma. Esto se ve reforzado por el creciente número de etapas de pipeteo e igualmente puede hacer que el proceso de extracción sea imposible. 3) La eliminación de componentes alcohólicos de un material poroso es difícil y, a menudo, no se resuelve de manera satisfactoria.
El documento de solicitud de patente WO 01/05510 A1 también pertenece al estado de la técnica. En él se describe un cuerpo hueco que contiene partículas magnéticas. No se proporciona información sobre las propiedades de la superficie de estas partículas magnéticas. La unión de ácidos nucleicos por medio de partículas magnéticas se realiza normalmente por medio de partículas de hierro lisas. Las propiedades de la superficie no desempeñan ningún papel en el estado de la técnica, solo las propiedades magnéticas.
Por lo tanto, la invención se basó en el objetivo de resolver los problemas conocidos y permitir un procedimiento sencillo y rápido de la extracción de ácidos nucleicos por medio de una punta de pipeta modificada.
El objeto se soluciona según las características de las reivindicaciones. Según la reivindicación 1 se proporciona un dispositivo para la extracción de ácidos nucleicos, que comprende un cuerpo hueco a través del cual se conduce un líquido, donde en este cuerpo hueco está dispuesto un material en forma de tornillos metálicos o esponjas metálicas o un disco de polímero rugoso o granulados de plástico rugosos de modo que se puede lavado alrededor por un líquido. En el caso del material, la rugosidad del disco o los granulados de plástico se puede reconocer por contacto o por visión. En una forma de realización preferida, una punta de pipeta actúa como un cuerpo hueco. El material tiene un tamaño tal que no puede salir por debajo de la punta de pipeta y, por lo tanto, se diferencia de las partículas magnéticas descritas en el estado de la técnica (WO 01/05510 A1). Las reivindicaciones 2 a 3 describen formas de realización preferidas del dispositivo. La invención comprende también un aparato según el principio walk-away, que utiliza el dispositivo. Además, se describe un procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos por medio del dispositivo. Este procedimiento está caracterizado por las siguientes etapas:
a) Una muestra biológica lisada se mezcla con al menos una sustancia que reduce la polaridad de la solución acuosa o con un medio para la unión de ácidos nucleicos a una fase sólida.
b) Aspiración de esta mezcla bajo a) con una punta de pipeta en la que se sitúa un material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y pipeteo de arriba abajo repetidas veces, donde el líquido se mueve a este respecto más allá del material y los ácidos nucleicos precipitan en el material rugoso o estructurado - y por lo tanto se unen a la fase sólida.
c) Retirada de la punta de pipeta de la muestra.
d) Inmersión de la punta de pipeta en una solución tampón de lavado y pipetear de arriba abajo varias veces, en el que el líquido se mueve más allá del material.
e) Secado de la punta de pipeta para eliminar el alcohol residual del tampón de lavado.
f) Desprendimiento del ácido nucleico con un tampón de elución mediante pipeteo de arriba abajo varias veces del tampón de elución, donde el tampón de elución se mueve a este respecto más allá del material.
De manera sorprendente, esto se puede lograr con medios simples. Se descubrió que un material de unión de ácidos nucleicos no se coloca horizontalmente en una punta de pipeta, sino verticalmente, de modo que el líquido pueda fluir libremente por delante de uno o ambos lados del material de unión de ácidos nucleicos. En otra forma de realización, la punta de pipeta también puede estar llena con un material particulado de unión ácidos nucleicos, tal que se sitúan cavidades suficientemente grandes entre este material, de modo que un líquido también fluye por delante de este material y no a través de este material. Otra forma de realización posible consiste en que en una punta de pipeta se sitúa un material estructurado en la superficie. En este caso, el líquido fluye igualmente por delante de las "estructuras" del material. Todas estas formas de realización significan en última instancia que los líquidos utilizados para el aislamiento de ácidos nucleicos no se mueven a través de un material cromatográfico, sino por delante de un material de unión de ácidos nucleicos. La base de que con el medio según la invención se pueden aislar los ácidos nucleicos de las muestras líquidas se basa a este respecto en un principio completamente novedoso. Este se diferencia fundamentalmente de los principios conocidos del aislamiento de ácidos nucleicos en materiales de soporte cromatográficos. Se muestra que es esencial que el material utilizado para la unión de los ácidos nucleicos en forma de tornillos metálicos o esponjas metálicas o un disco de polímero rugoso o granulados de plástico rugosos presente una superficie rugosa o que se trate de un material estructurado en la superficie, lo que anula la suavidad por la estructura en la superficie (ésta puede estar ordenada o también desordenada), donde la rugosidad del disco o granulados de plástico se puede reconocer por contacto o por visión. En suma, es necesario que dentro de la punta de pipeta se origine una estructura bidimensional/tridimensional a través del material colocado, en la que los ácidos nucleicos se pueden adsorber. La unión del ácido nucleico parece basarse en el hecho de que los ácidos nucleicos contenidos en la muestra precipitan después de la puesta en contacto de la muestra con una superficie rugosa en la superficie rugosa, una superficie estructurada o una red bidimensional/tridimensional. Esto se realiza a este respecto porque mediante la adición, por ejemplo, de un alcohol, se vuelve más menor la polaridad del entorno y, por lo tanto, se reduce la solubilidad del ácido nucleico. Sorprendentemente, la "precipitación" del ácido nucleico en estas superficies descritas funciona de forma extremadamente eficiente con un alto rendimiento y pureza.
Por lo tanto, el núcleo de la invención consiste en que los ácidos nucleicos libres o liberados por lisis se sitúan en un entorno acuoso, cuya polaridad está ajustada por medio de sustancias orgánicas, de modo que se reduce la solubilidad del ácido nucleico y, a continuación, este entorno acuoso se introduce en la punta de pipeta según la invención, de modo que luego el ácido nucleico se mueve por delante del material/red colocado en la punta de pipeta (que se puede realizar mediante pipeteo repetido) y se precipita en la superficie del material/red y, a continuación, el ADN precipitado se separa de nuevo de la superficie y está a disposición. Opcionalmente, el ácido nucleico precipitado en la superficie también se puede lavar y separar después de las etapas de lavado.
El desarrollo práctico de la extracción por medio del procedimiento según la invención se basa, por lo tanto, en las siguientes etapas. Después de proporcionar una muestra que contiene ácido nucleico en una forma acuosa se ajustan las condiciones necesarias para la precipitación de los ácidos nucleicos, de modo que el ácido nucleico pueda precipitar en el material colocado en las puntas de pipeta. La preparación se "pipetea por delante" por medio de procesos de pipeteo en el material de unión de ácidos nucleicos colocado verticalmente en la punta de pipeta. Los ácidos nucleicos precipitan en el material. A continuación, los tampones de lavado opcionalmente también se pueden "pipetear por delante" del material de unión de ácido nucleico. A continuación se realiza una etapa de secado (por ejemplo, pipeteo frecuente de arriba abajo). Finalmente, el medio de elución se "pipetea por delante" varias veces del material de unión de ácido nucleico dispuesto verticalmente y, a este respecto, se desprende el ácido nucleico unido. El ácido nucleico está presente ahora para la aplicación necesaria aguas abajo. El proceso es extremadamente rápido y fácil de llevar a cabo y permite el aislamiento de ácidos nucleicos con un rendimiento y pureza extremadamente altos. No hay problemas con las soluciones viscosas y no hay problemas con la eliminación de componentes alcohólicos o con una formación de espuma extrema, como es el caso con el uso de materiales de soporte porosos dispuestos horizontalmente o con puntas de pipeta que están llenas con un material cromatográfico poroso. El procedimiento se puede utilizar de forma universal y se puede llevar a cabo tanto de forma automática como también manual. Es adecuado de la manera más ideal para el uso de una extracción de ácido nucleico automatizada, ya que las etapas necesarias para la unión de ácidos nucleicos, para el lavado de los ácidos nucleicos unidos, así como para la separación de los ácidos nucleicos, solo son todavía etapas de pipeteo múltiples. A este respecto, la punta de pipeta según la invención evita las desventajas conocidas del estado de la técnica, que están condicionadas por la disposición constructiva anterior o el llenado de puntas de pipeta con materiales cromatográficos porosos.
Los materiales a utilizar, colocados verticalmente en la punta de pipeta para la unión de ácidos nucleicos pueden ser extremadamente diferentes. Además de los materiales minerales, también se pueden utilizar materiales plásticos modificados, cuya superficie no es lisa, sino rugosa o estructurada. Esto también incluye los llamados materiales compuestos, las mezclas de polímeros y, por ejemplo, componentes orgánicos, como también componentes inorgánicos y materiales compuestos. Es esencial solo la puesta a disposición o la transferencia de material a la punta de pipeta, que conduce a la configuración de una red bidimensional/tridimensional, donde los ácidos nucleicos precipitan entonces en esta estructura. La arquitectura del material tampoco es limitante (redonda, rectangular, etc.). A este respecto, también se puede tratar de varios materiales (por ejemplo, varios granulados). En formas de realización sencillas ya se puede utilizar por sí solo un tornillo colocado en la punta de pipeta para el aislamiento de ácidos nucleicos.
Solo es importante que el material se lleve a una punta de pipeta y se pueda enjuagado en cualquier momento por un líquido, sin que el líquido tenga que pasar a través del material incorporado. También se puede utilizar una punta de pipeta, en la que (fabricada a partir de una pieza moldeada por inyección) ya se sitúa el material de unión y este ya no tiene que llevarse a la punta. También es ventajoso el uso de material magnético rugoso. Dicho material se conoce como granulado bajo el nombre de marca TECACOPM®.
El término "superficie rugosa" se debe entender de modo que, por contacto o por visión de la superficie, se puede reconocer que no es lisa. Pero, a este respecto, también se puede tratar de una superficie que presenta una estructura (por ejemplo, estrías). Debido a esta estructura se elimina la suavidad de la superficie, incluso si la estructura, es decir, las estrías, puede ser lisa. Tales superficies se designan como "superficies estructuradas". En caso de que por visión o contacto de la superficie no se puede reconocer si una superficie es lisa o rugosa, se puede llevar a cabo un test en el que un rayo láser se dirige hacia esa superficie. En una superficie lisa, el láser solo se refleja en la dirección principal en la superficie. En superficies rugosas se realiza una dispersión en todas las direcciones espaciales. Un test semejante se ha descrito en la página web de la Universidad de Kiel (http://www.tf.unikiel.de/matwis/amat/semitech en/kap 3/illustr/oberflaechenstruktur.pdf
La invención se debe explicar con más detalle a continuación mediante ejemplos de realización. A este respecto, los ejemplos de realización no representan una limitación de la invención.
Ejemplos de realización
Ejemplo 1: Extracción manual de ácido nucleico de células NIH 3T3 por medio del procedimiento según la invención utilizando una punta de pipeta modificada
En una punta de pipeta de 1 ml (empresa Sarstedt) se fijó un disco de polietileno verticalmente en el último tercio. Se insertaron 5 x 105 células NIH 3T3. A este respecto, la química de extracción utilizada para el aislamiento de los ácidos nucleicos se tomó parcialmente del kit de extracción comercial innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG). Por medio de un tampón de lisis (Lysis Solution CBV) y proteinasa K, las células se lisaron a 60 °C durante 15 min. La lisis se llevó a cabo en un recipiente de reacción de 2,0 ml. Después de la lisis, la preparación se mezcló con 400 pl de isopropanol. A continuación se utilizó la punta de pipeta modificada y por medio de una pipeta se pipeteó la preparación 20 veces de arriba abajo. Luego se llenaron otros 3 recipientes de reacción de 2 ml con los tampones de lavado alcohólicos (solución de lavado LS, etanol al 80 %, etanol al 80 %). La punta de pipeta se sumergió sucesivamente en los respectivos tampones de lavado y respectivamente se pipeteó 5 veces de arriba abajo. Después de la última etapa de lavado, la punta se secó y, por lo tanto, se eliminó el etanol restante. La elución del ácido nucleico unido se realizó con 100 pl de tampón de elución. Este se colocó de nuevo en un recipiente de reacción de 2 ml. Se pipeteó 30 veces de hacia arriba abajo. Después de retirar la punta de pipeta, el ácido nucleico aislado está presente en el recipiente de reacción. El procedimiento es extremadamente simple y rápido.
La detección del ácido nucleico aislado se realizó mediante medición espectrofotométrica.
Resultados de la medición espectrofotométrica
Figure imgf000005_0001
Como muestran los resultados, con el medio según la invención es posible unir y aislar ácido nucleico solo con el uso de una química de extracción estándar y por medio de menos etapas de pipeteo con una pipeta estándar. Se muestra que los rendimientos son extremadamente altos.
Ejemplo 2: Extracción automatizada de ácido nucleico de células NIH 3T3 por medio del procedimiento según la invención y utilizando una punta de pipeta modificada, así como utilizando una máquina automática de extracción disponible comercialmente
La extracción automatizada se llevó a cabo con la máquina automática de extracción InnuPure C16 (Analytik Jena AG). Esta máquina automática de extracción se basa en una extracción de ácido nucleico de partículas magnéticas. Para llevar a cabo una extracción de ácido nucleico según el procedimiento según la invención, las puntas de pipeta que se utilizan para la máquina automática de extracción entonces se han modificado de modo que correspondan al medio según la invención. En las puntas de pipeta en el tercio inferior se incorporó verticalmente un disco fabricado a partir de un polímero rugoso, que no cierra el lumen y, por lo tanto, se conserva la función de pipeteo de las puntas de pipeta. A este respecto, se utilizaron discos rugosos de diferentes materiales.
Para la extracción de ácido nucleico se utilizaron respectivamente 5 x 105 células NIH 3T3. A este respecto, la química de extracción utilizada para el aislamiento de los ácidos nucleicos se tomó parcialmente del kit de extracción comercial innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG). Por medio de un tampón de lisis (Lysis Solution CBV) y proteinasa K, las células se lisaron a 60 °C durante 15 min en un recipiente de reacción de 2,0 ml.
A continuación se utilizó el procedimiento automatizado del InnuPure C16 para la purificación de los ácidos nucleicos. Las soluciones necesarias para la extracción estaban presentes en una placa Deep Well precargada. Los lisados descritos anteriormente se administraron en cavidades que se llenaron con 400 pl de isopropanol. Esta solución se mezcló entonces por medio de la punta de pipeta de tal manera que la solución fluya lateralmente por delante del disco incorporado en la punta. Se han llevado a cabo 100 repeticiones.
Luego se mezcló sucesivamente en tres cavidades adicionales que contenían tampones de lavado alcohólicos (solución de lavado LS, etanol al 80 %, etanol al 80 %) cada vez 5 veces.
A continuación de la última etapa de lavado, la punta según la invención y el disco contenida en ella se secó mediante pipeteo 200 veces de aire y, por lo tanto, se eliminó el etanol restante. La elución de los ácidos nucleicos se realizó mediante la mezcla de 120 veces con 100 pl de tampón de elución, que había sido atemperado previamente por el aparato a 50° C. El volumen total de tampón de elución fue de 200 pl.
El procedimiento es extremadamente sencillo y rápido y muestra que se pueden utilizar máquinas de extracción disponibles comercialmente para llevar a cabo el procedimiento según la invención con el medio según la invención correspondiente. El requerimiento de tiempo en comparación con una extracción basada en partículas magnéticas es mucho menor. La detección del ácido nucleico aislado se realizó mediante medición espectrofotométrica.
Resultados de la medición espectrofotométrica:
Figure imgf000006_0001
La figura 2 muestra un análisis electroforético en gel del ácido nucleico aislado .
Está representado el ácido nucleico separado electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,8 %, que se ha aislado por medio del procedimiento según la invención. Las muestras se aplicaron de izquierda a derecha, comenzando con la muestra 1.
Como muestran los resultados, con el medio según la invención, que se puede componer diferentes polímeros, es posible unir y aislar ácido nucleico solo con el uso de una química de extracción estándar y por medio de menos etapas de pipeteo con una plataforma de pipeteo estándar. Se muestra que los rendimientos son extremadamente altos. Ejemplo 3: Extracción automatizada de ácido nucleico de células sanguíneas por medio del procedimiento según la invención y utilizando puntas de pipeta que contienen diferentes materiales para el aislamiento de ácidos nucleicos y utilizando una máquina automática de extracción disponible comercialmente
La extracción automatizada se llevó a cabo con la máquina automática de extracción InnuPure C16 (Analytik Jena AG). Esta máquina automática de extracción se basa en una extracción de ácido nucleico de partículas magnéticas. Para llevar a cabo una extracción de ácido nucleico según el procedimiento según la invención, las puntas de pipeta que se utilizan para la máquina automática de extracción entonces se han modificado de modo que correspondan al medio según la invención. Se han utilizado tres puntas diferentes:
Tipo 1: punta de pipeta que contiene una red tridimensional de metal (para ello se utilizó una llamada esponja de limpieza metálica (espiral de acero inoxidable) disponible comercialmente, de la que se cortó parte del material. Este material se metió en la punta de pipeta. Se origina una red tridimensional en la que se pipetea la solución). Tipo 2: punta de pipeta con dos tornillos de madera galvanizados uno contra el otro (estos representan una superficie estructurada según la descripción)
Tipo 3: punta de pipeta con 4 granulados de plástico, cuya superficie ha hecho rugosa previamente. Estos granulados de plástico de polietileno representan, según la descripción un material con una superficie rugosa. Material ferromagnético con polipropileno.
Para la extracción de ácido nucleico se utilizan respectivamente células sanguíneas de 2 ml de sangre total, que habían sido aisladas previamente. Las células sanguíneas fueron resuspendidas en 200 pl de PBS 1. A este respecto, la química de extracción utilizada para el aislamiento de los ácidos nucleicos se tomó parcialmente del kit de extracción comercial innuPREP Blood DNA Kit/IPC16 (Analytik Jena AG). Todo el proceso de extracción se llevó a cabo de forma automatizada por medio del dispositivo InnuPure C16 (Analytik Jena AG). El dispositivo se basa en un principio de walk-away. Para ello se precarga una placa Deep Well con los reactivos necesarios. Luego, la punta de pipeta (con las modificaciones según la invención) se conduce sucesivamente en las cavidades individuales y las respectivas soluciones se aspiran por medio de pipeteo de arriba abajo en la punta de pipeta y se pipetean por delante del material contenido en la punta de pipeta.
En primer lugar, la suspensión celular se transfirió a la primera cavidad de la placa Deep Well prellenada. En esta cavidad se sitúa el tampón de lisis así como proteinasa K. La lisis se realizó a este respecto de tal manera que el lisado fue pipeteado varias veces de arriba abajo por medio de la punta de pipeta según la invención. Después de la lisis, el lisado se transfirió a la cavidad más cercana. En esta cavidad se sitúa el isopropanol. De nuevo se pipetearon de arriba abajo varias veces y, por lo tanto, el líquido se arrastró permanentemente hacia el interior de la punta de pipeta, y a este respecto por delante del material situado en la punta de pipeta. En esta etapa, el ácido nucleico se une al material. Después de esta etapa, la punta de pipeta se movió a las cavidades siguientes. En estos se sitúan los tampones de lavado alcohólicos. Por lo tanto, el ácido nucleico unido se lava de nuevo mediante múltiples procesos de pipeteo. Después del secado de la punta de pipeta, esta se movió a otra cavidad, en la que se sitúa agua. Por medio de pipetear de arriba abajo, el ácido nucleico se separa del material y finalmente está presente en forma disuelta. Por lo tanto, todo el proceso de extracción está completamente automatizado.
El procedimiento es extremadamente sencillo y rápido y muestra que se pueden utilizar máquinas de extracción disponibles comercialmente para llevar a cabo el procedimiento según la invención con el medio según la invención correspondiente. El requerimiento de tiempo en comparación con una extracción basada en partículas magnéticas es mucho menor.
La detección del ácido nucleico aislado se realizó mediante medición espectrofotométrica.
Resultados de la medición espectrofotométrica:
Figure imgf000008_0001
Figura 1: muestra una representación a modo de ejemplo del disco incorporado verticalmente en el cuerpo hueco a partir de un material polimérico de unión de ácido nucleico; está representada una forma de realización a modo de ejemplo del medio según la invención, que se puede utilizar para la extracción de ácido nucleico según el procedimiento según la invención.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Dispositivo para la extracción de ácidos nucleicos, que comprende un cuerpo hueco a través del cual se conduce un líquido; en dicho cuerpo hueco está dispuesto un material de modo que se pueda lavar alrededor mediante un líquido, caracterizado porque el material consiste en tornillos metálicos o esponjas metálicas o un disco de polímero rugoso o granulados de plástico rugosos, en los que la rugosidad del disco o granulados de plástico se puede reconocer por contacto o por visión.
2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el cuerpo hueco es una punta de pipeta y el material tiene un tamaño tal que evita que salga de la punta de pipeta.
3. Dispositivo según la reivindicación 1 o 2 , caracterizado porque el cuerpo hueco es una punta de pipeta que es rugosa en la pared interior o en cuya pared interior está inmovilizado el material incorporado.
4. Aparato según el principio walk-away para la extracción automatizada de ácidos nucleicos, que comprende, al menos, un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Aparato según la reivindicación 4 , caracterizado porque representa una máquina automática de pipeteo o una máquina automática de extracción.
6. Procedimiento para la extracción automatizada de ácidos nucleicos, caracterizado por las siguientes etapas:
a) una muestra biológica lisada se mezcla con, al menos, una sustancia que reduzca la polaridad de la solución acuosa;
b) aspiración de esta mezcla según lo dispuesto e a) con una punta de pipeta en la que se sitúa un material según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y pipetear de arriba abajo repetidas veces, donde el líquido se mueve a este respecto más allá del material y los ácidos nucleicos precipitan en el material;
c) retirada de la punta de pipeta de la muestra;
d) inmersión de la punta de pipeta en una solución tampón de lavado y pipetear de arriba abajo varias veces, en el que el líquido se mueve más allá del material;
e) secado de la punta de pipeta;
f) desprendimiento del ácido nucleico con un tampón de elución mediante pipeteo de arriba abajo varias veces del tampón de elución, donde el tampón de elución se mueve a este respecto más allá del material.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque como sustancia para reducir la polaridad de la solución acuosa se utilizan disolventes orgánicos, preferentemente alcoholes.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 por medio de una máquina automática de pipeteo o una máquina automática de extracción.
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