ES2928585T3 - Biomarcadores asociados con prediabetes, diabetes y condiciones relacionadas con diabetes - Google Patents

Biomarcadores asociados con prediabetes, diabetes y condiciones relacionadas con diabetes Download PDF

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Abstract

La invención proporciona biomarcadores para prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con la diabetes, y métodos para su uso, incluidos los biomarcadores de las tablas 1 y 2, como peroxirredoxina-2, subunidad B del subcomponente Clq del complemento, sulfhidrilo oxidasa 1 y apolipoproteína A. -IV. En particular, la invención proporciona un método para evaluar la enfermedad renal de un sujeto que comprende medir al menos un biomarcador en una muestra del sujeto, en el que dicho al menos un biomarcador es similar al antígeno CD5. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcadores asociados con prediabetes, diabetes y condiciones relacionadas con diabetes
Campo de la invención
La invención se refiere a biomarcadores asociados con prediabetes, diabetes y condiciones relacionadas con diabetes, tal como nefropatía diabética, métodos para usar los biomarcadores para determinar el riesgo de que un individuo desarrolle prediabetes, diabetes y condiciones relacionadas con diabetes, métodos para examinar una población para identificar personas en riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y condiciones relacionadas con diabetes y objetivos de fármacos para prediabetes, diabetes y diabetes.
Antecedentes de la invención
La diabetes mellitus es una enfermedad crónica y uno de los principales problemas de salud pública de nuestro tiempo. En todo el mundo hay una población cada vez mayor de pacientes con diabetes que están imponiendo una gran carga financiera a los sistemas de salud. La prevalencia de diabetes para todos los grupos de edad en todo el mundo se estimó que es 2,8 % en 2000 y 4,4 % para 2030. Se prevé que el número total de personas con diabetes aumente de 171 millones en 2000 a 366 millones en 2030. En 2002, la prevalencia de diabetes en la población australiana fue 7,4 % en aquellos de 25 años de edad y mayores, y el número de australianos con diabetes se ha triplicado desde 1981.
La diabetes tipo 2 es, con mucho, la más común, por ejemplo, afecta 90 a 95 % de la población con diabetes de Estados Unidos. La prevalencia de diabetes mellitus incrementa con la edad y se espera que el número de personas mayores con diabetes aumente conforme la población vieja incrementa en número. Junto con tasa creciente de diabetes, también hay una prevalencia más alta de metabolismo de glucosa alterado, que se asocia con un riesgo incrementado de enfermedades cardíacas y diabetes. La diabetes es un término que abarca la prevalencia de diabetes, obesidad, metabolismo de glucosa alterado y los factores de riesgo asociados de hipertensión y perfiles anormales de lípidos en plasma (dislipideamia). La “epidemia de diabetes” continuará incluso si los niveles de obesidad se mantienen constantes. Dada la creciente prevalencia de obesidad, es probable que estas cifras subestimen la prevalencia de diabetes futura.
La diabetes mellitus es una condición donde el cuerpo no puede mantener niveles normales de glucosa en sangre. La mayoría de los casos de diabetes mellitus se dividen en tres categorías amplias: Diabetes tipo 1, tipo 2 y gestacional. La diabetes tipo 1 resulta de la incapacidad del cuerpo para producir insulina y actualmente requiere que la persona se inyecte insulina. La diabetes tipo 2 resulta de la resistencia a la insulina, una condición en la cual las células no usan la insulina adecuadamente, algunas veces combinada con una deficiencia absoluta de insulina.
La diabetes tipo 2 usualmente se puede controlar en primera instancia con dieta y ejercicio regulares. Las tabletas y eventualmente las inyecciones de insulina se pueden necesitar conforme la enfermedad progresa. Con el paso del tiempo, los altos niveles de glucosa en sangre pueden dañar los vasos sanguíneos y los nervios. Estas complicaciones de la diabetes pueden provocar daño a los ojos, nervios y riñones e incrementan el riesgo de ataque cardíaco, derrame cerebral, impotencia y problemas en los pies. Este daño puede ocurrir antes de que un individuo sepa que tiene diabetes si no se detecta durante mucho tiempo. Por lo tanto, es importante diagnosticar y controlar la diabetes y sus complicaciones en una etapa muy temprana.
La diabetes también es la principal causa de enfermedad renal (nefropatía) en países desarrollados y es responsable de los enormes costos en diálisis. 10 % a 20 % de las personas con diabetes morirán de insuficiencia renal. Las razones detrás de la complicación de nefropatía en la diabetes son complejas e incluyen los efectos tóxicos de altos niveles de glucosa; presión arterial elevada; niveles anormales de lípidos y anormalidades de vasos sanguíneos pequeños. El resultado acumulativo es que hay engrosamiento de los glomérulos en el riñón que permite que la proteína (albúmina) se excrete en la orina.
La diabetes se ha convertido en la causa más común individual de insuficiencia renal terminal (ESRF) en 40-50 % de los casos de ESRD y los gastos anuales de los cuidados médicos de Australia son mayores para los pacientes con ESRF provocada por la diabetes en comparación con todos los demás diagnósticos primarios de ESRD. Hasta un tercio de los adultos con diabetes tipo 2 recién diagnosticada ya tienen enfermedad renal crónica, y los datos sugieren que en muchos de estos pacientes se puede haber desarrollado en el curso del estado prediabético. La enfermedad es progresiva y afecta más a los hombres que a mujeres.
La nefropatía diabética se detecta principalmente al medir la cantidad de albúmina excretada en la orina (albuminuria). La albuminuria se mide usualmente usando la relación de albúmina - creatinina (ACR). Esta es la relación entre la albúmina y la creatinina en la orina. La relación considera la concentración de la albúmina en relación con la tasa de filtración glomerular, que se determina por la cantidad de creatinina en la orina. La albuminuria se define como: ACR > 2,5mg/mmol (hombres) o >3,5 mg/mmol (mujeres).
A pesar de los numerosos estudios y algoritmos que se han usado para valorar el riesgo de diabetes y condiciones relacionadas, sigue existiendo la necesidad de métodos precisos para valorar estos riesgos o condiciones que se puedan adoptar fácilmente por los médicos de atención primaria que tienen más probabilidades de encontrar inicialmente el pre­ diabético o diabético no diagnosticado temprano.
Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de métodos relativamente económicos y convenientes para examinar personas en riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes y para monitorear pacientes con prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes. Estos métodos se pueden usar para examinar a una gran población para identificar personas en riesgo de diabetes, para probar a una persona individual para determinar el riesgo de que ese individuo desarrolle diabetes, para monitorear la salud de pacientes con diabetes y para valorar la eficacia de las intervenciones diseñadas para tratar diabetes, prediabetes y/o condiciones relacionadas. También es necesario identificar nuevos objetivos de fármacos para prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes, incluidos los objetivos de fármacos proteicos. La identificación de nuevos objetivos de fármacos permitirá el desarrollo de nuevas intervenciones para prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes.
D1 (WO2010/085879) divulga biomarcadores de orina y suero asociados con nefropatía diabética.
D2 (KR100792630) divulga un biomarcador para diagnosticar nefropatía diabética.
D3 (Granier et al, 2008 Nephrology Dialysis Transplantation vol 32 páginas 792-799) divulga marcadores de genes y proteínas de nefropatía diabética.
D4 (US2007111245) divulga una técnica para predecir nefropatía diabética.
D5 (Rao et al 2007 Diabetes Care vol. 30 páginas 629 - 637) divulga la identificación proteómica de biomarcadores urinarios de nefropatía diabética.
D6 (Hung et al, 2005 Molecular Biosystems vol. 7 páginas 1990 - 1998) divulga el análisis proteómico en plasma de los marcadores de isquemia crítica de extremidades en pacientes diabéticos con hemodiálisis.
Ante este panorama y los problemas y dificultades asociados con lo mismo es que se ha desarrollado la presente invención.
Breve descripción de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para valorar un sujeto para enfermedad renal, donde este sujeto es un sujeto prediabético, o este sujeto tiene diabetes, donde este sujeto tiene albuminuria, que comprende medir al menos un biomarcador en una muestra del sujeto, donde el al menos un biomarcador es tipo antígeno CD5.
Tabla 1
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Tabla 2
Figure imgf000003_0001
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende reactivos para medir al menos un biomarcador en una muestra de un sujeto, donde este al menos un biomarcador se selecciona de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un medio leíble por computadora que tiene instrucciones ejecutables por computadora para valorar un sujeto para prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes, el medio leíble por computadora que comprende: una rutina, almacenada en el medio leíble por computadora y adaptada para que se ejecute por un procesador, para almacenar datos de medición de biomarcadores que representan al menos un biomarcador seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para valorar un tratamiento para prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto que se somete al tratamiento, seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2 , al menos dos veces durante el curso del tratamiento.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para valorar el riesgo de que un sujeto desarrolle prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorear prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2 y comparar la medición obtenida con otra medida del al menos un biomarcador.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar o identificar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar de manera diferencial enfermedad renal de otras condiciones que también provocan proteinuria en un sujeto que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar de manera diferencial subclases o etapas de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema de prueba que comprende:
(i) medio para obtener datos de resultados de prueba que representen niveles de al menos un biomarcador seleccionado de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2 , en una muestra del sujeto;
(ii) medio para recolectar y rastrear los datos de resultados de prueba generados en el paso (i);
(iii) medio para calcular un valor de índice de riesgo de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes a partir de los datos de resultados de prueba, donde este valor de índice de riesgo es representativo del riesgo de que un individuo desarrolle o tenga prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes; y
(iv) medio para reportar este valor de índice de riesgo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para clasificar o agrupar una población de individuos, que comprende: obtener datos de índice de riesgo de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes para individuos en esta población; y clasificar individuos dentro de la población con respecto a los individuos restantes en la población o dividir la población en al menos dos grupos, con base en factores que comprenden estos datos de índice de riesgo obtenidos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para evaluar un criterio de valoración sustituto de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto, el método que comprende: medir al menos un biomarcador de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2 ; y evaluar un criterio de valoración sustituto de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en el sujeto con base en esta medida.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para evaluar el riesgo de que un sujeto desarrolle prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, donde este al menos un biomarcador se selecciona de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorear el riesgo de que un sujeto desarrolle prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, donde este al menos un biomarcador se selecciona de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar o identificar un sujeto con prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, donde este al menos un biomarcador se selecciona de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorear la terapia o intervención de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende medir al menos un biomarcador en una muestra del sujeto, donde este al menos un biomarcador se selecciona de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar de manera diferencial un estado de enfermedad o subclase de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende medir al menos un biomarcador, en una muestra del sujeto, donde este al menos un biomarcador se selecciona de la lista de biomarcadores en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto que comprende: evaluar el riesgo, para el sujeto, de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes usando al menos un biomarcador de la tabla 1 o 2 y tratar al sujeto cuando se identifica como que está en riesgo elevado de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes con un régimen de tratamiento para retrasar o prevenir el comienzo de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para clasificar o agrupar una población de sujetos, que comprende: obtener datos que representan una puntuación de riesgo de prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes para sujetos comprendidos dentro de esta población, donde esta puntuación de riesgo se calcula usando al menos un biomarcador de la tabla 1 o 2 y clasificar sujetos dentro de la población con respecto a los individuos restantes en la población o dividir la población en al menos dos grupos, con base en factores que comprenden estos datos de puntuación de riesgo obtenidos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar o valorar un agente para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende:
(i) poner en contacto células que expresan al menos un biomarcador de la tabla 1 o 2 con un agente putativo; y
(ii) comparar la expresión y/o niveles de al menos un biomarcador de la tabla 1 en las células antes del contacto con el agente putativo con la expresión y/o niveles de al menos un biomarcador de la tabla 1 o 2 en las células después del contacto con el agente putativo;
en donde un cambio en el nivel o expresión identifica el agente como un agente para tratar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de al menos un biomarcador en la tabla 1 o 2 como un objetivo de fármaco para prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un agente adaptado para cambiar la expresión o el nivel de al menos un biomarcador en la tabla 1 o 2.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un agente adaptado para cambiar la expresión o el nivel de al menos un biomarcador en la tabla 1 o 2 para preparar un medicamento para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente descripción detallada de la invención, dada a modo de ejemplo, pero no propuesta para limitar la invención a realizaciones específicas descritas, se puede entender en conjunto con las figuras anexas, en las cuales:
La figura 1 es una tabla que lista datos de proteínas de biomarcador obtenidos de tres estudios con respecto a la presencia de nefropatía diabética en pacientes con diabetes medida por monitoreo de reacción múltiple (MRM);
La figura 2 es una serie de gráficas de cajas y bigotes para cada biomarcador listado en la figura 1 del estudio FDS1 (diagrama de caja izquierdo: grupo diabético; diagrama de caja derecho: grupo diabético con nefropatía severa; eje x: proteína/péptido; eje y: relación de abundancia relativa; secuencias peptídicas: ATA = ATAVVDGAFK; TVA = TVAACNLPIVR; EYC = EYCGVPGDGDEELLR; LEP = LEPYADQLR; e ISA = ISASAEELR)
La figura 3 es una serie de gráficas de cajas y bigotes para cada biomarcador listado en la figura 1 del estudio FDS2 (diagrama de caja izquierdo: grupo diabético; diagrama de caja derecho: grupo diabético con nefropatía severa; eje x: proteína/péptido; eje y: Relación de abundancia relativa; secuencias peptídicas: IAF = IAFSATR; LEP = LEPYADQLR; ISA = ISASAEELR; ALA = ALAQCAPPPAVCAELVR; y FLN = FLNVLSPR; DAL = DALSSVQESQVAQQAR; TVA = TVAACNLPIVR; EYC = EYCGVPGDGDEELLR; GDI = GDIGETGVPGAEGPR; TGD = TGDIVEFVCK; LVY = LVYPSCEEK);
La figura 4 es una serie de gráficas de cajas y bigotes para cada biomarcador listado en la figura 1 del estudio BDS (diagrama de caja izquierdo: grupo diabético; diagrama de caja derecho: grupo diabético con nefropatía severa; eje x: proteína/péptido; eje y: relación de abundancia relativa; secuencias peptídicas: LVG = LVGGDNLCSGR; IWL = IWLDNVR; SVS = SVSLPSLDPASAK; y TEV = TEVIPPLIENR); y
La figura 5 es una tabla que lista datos de proteínas de biomarcador obtenidos del estudio BDS con respecto a pacientes con nefropatía diabética y pacientes sanos medidos por MRM.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la identificación de biomarcadores asociados con prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes, tal como nefropatía diabética. Por consiguiente, la presente invención presenta métodos para identificar sujetos que están en riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes, incluidos aquellos sujetos que son asintomáticos o solo exhiben indicadores no específicos de prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes por la detección de los biomarcadores divulgados en la presente. Estos biomarcadores también son útiles para monitorear sujetos que se someten a tratamientos y terapias para prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes, y para seleccionar o modificar terapias y tratamientos que serían eficaces en sujetos que tienen prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes, donde la selección y uso de estos tratamientos y terapias retrasan el progreso de prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes, o previenen su comienzo. La presente invención también presenta nuevos objetivos de fármacos para prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes que comprenden al menos uno de los biomarcadores en la tabla 1 o 2.
Definiciones
Los “agentes para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes” incluyen: insulina tal como insulina madura, pro-insulina y péptido c soluble (SCp), formas de insulina de acción rápida, insulina regular, insulina de acción intermedia y formas de insulina de acción prolongada; agentes hipoglucémicos; agentes antiinflamatorios; agentes reductores de lípidos; antihipertensivos tal como bloqueadores de canales de calcio, bloqueadores de receptor beta-adrenérgico, inhibidores de ciclooxigenasa 2 que incluyen profármacos de inhibidores de COX-2, inhibidores de sistema de angiotensina que incluyen bloqueadores de receptor de angiotensina II (ARB), inhibidores de ACE e inhibidores de rennina que incluyen aminoácidos y derivados de los mismos, péptidos y derivados de los mismos y anticuerpos contra renina.
Los “antagonistas de angiotensina II” son compuestos que interfieren con la actividad de la angiotensina II al unirse a los receptores de angiotensina II e interferir con su actividad e incluyen compuestos peptídicos y compuestos no peptídicos. La mayoría de los antagonistas de angiotensina II son congéneres ligeramente modificados en los cuales la actividad agonista se atenúa por el reemplazo de fenilalanina en la posición 8 con algún otro aminoácido. Los ejemplos de antagonistas de angiotensina II incluyen: compuestos peptídicos (por ejemplo, saralasina, octapéptido de angiotensina-(1-8) y análogos relacionados); imidazol-2-ona N-sustituida; derivados de acetato de imidazol que incluyen ácido 2-N-butil-4-cloro-1-(2-clorobencil) imidazol-5-acético; ácido 4,5,6,7-tetrahidro-1Himidazo[4,5-c]piridin-6-carboxílico y derivados análogos; análogos de N2-tetrazol beta-glucurónido; pirroles, pirazoles y triazoles sustituidos; fenol y derivados heterocíclicos tal como 1,3-imidazoles; heterociclos de anillos de 7 miembros fusionados a imidazo; anticuerpos contra angiotensina II; y compuestos de aralquil imidazol tal como imidazoles sustituidos con bifenil-metilo; ES8891 (N-morfolinoacetil-(-1-naftil)-L-alanil-1-(4,tiazolil)-L-alanil (35,45)-4-amino-3-hidroxi-5-ciclo-hexapentanoil-N-hexilamida); SKF108566 (ácido E-alfa-2-[2-butil-1-(carboxifenil)metil] 1H-imidazol-5-il[metilan-e]-2-tiofenopropanoico); losartán (DUP753/MK954); y remikirin.
Los “inhibidores de enzima convertidora de angiotensina (ACE)” incluyen aminoácidos y derivados de los mismos, péptidos, incluidos di y tripéptidos y anticuerpos contra ACE que intervienen en el sistema renina-angiotensina al inhibir la actividad de ACE reduciendo o eliminando de este modo la formación de la sustancia presora angiotensina II. Las clases de compuestos conocidos por ser útiles como inhibidores de ACE incluyen prolinas de acilmercapto y mercaptoalcanoilo tal como captopril y zofenopril, dipéptidos de carboxialquilo tal como enalapril, lisinopril, quinapril, ramipril y perindopril, miméticos de dipéptido de carboxialquilo tal como cilazapril y benazapril, prolinas de fosfinilalconoilo tal como fosinopril y trandolopril.
Los agentes “antiinflamatorios” incluyen alclofenaco; dipropionato de alclometasona; acetónido de algestona; alfa amilasa; amcinafal; amcinafida; amfenaco sódico; clorhidrato de amiprilosa; Anakinra; anirolac; anitrazafeno; apazona; balsalazida disódica; bendazac; benoxaprofeno; clorhidrato de bencidamina; bromelinas; broperamolo; budesonida; carprofeno; cicloprofeno; cintazona; cliprofeno; propionato de clobetasol; butirato de clobetasona; clopirac; propionato de cloticasona; acetato de cormetasona; cortodoxona; deflazacort; desonida; desoximetasona; dipropionato de dexametasona; diclofenaco potásico; diclofenaco sódico; diacetato de diflorasona; diflumidona sódica; diflunisal; difluprednato; diftalona; dimetilsulfóxido; drocinonida; endrisona; enlimomab; enolicam sódico; epirizol; etodolaco; etofenamato; felbinaco; fenamol; fenbufeno; fenclofenaco; fenclorac; fendosal; fenpipalona; fentiazac; flazalona; fluazacort; ácido flufenámico; flumizol; acetato de flunisolida; flunixina; flunixina meglumina; butilo de fluocortina; acetato de fluorometolona; flucuazona; flurbiprofeno; fluretofeno; propionato de fluticasona; furaprofeno; furobufeno; halcinonida; propionato de halobetasol; acetato de halopredona; ibufenaco; ibuprofeno; ibuprofeno aluminio; ibuprofeno piconol; ilonitap; indometacina; indometacina sódica; indoprofeno; indoxol; intrazol; acetato de isoflupredona; isoxepac; isoxicam; ketoprofeno; clorhidrato de lofemizol; lomoxicam; etabonato de loteprednol; meclofenamato sódico; ácido meclofenámico; dibutirato de meclorisona; ácido mefenámico; mesalamina; meseclazona; suleptanato de metilprednisolona; morniflumato; nabumetona; naproxeno; naproxeno sódico; naproxol; nimazona; olsalazina sódica; orgoteína; orpanoxina; oxaprozina; oxifenbutazona; clorhidrato de paranilina; pentosan polisulfato sódico; glicerato de sodio de fenbutazona; pirfenidona; piroxicam; cinamato de piroxicam; piroxicam olamina; pirprofeno; prednazato; prifelona; ácido prodólico; procuazona; proxazol; citrato de proxazol; rimexolona; romazarit; salcolex; salnacedina; salsalato; salicilatos; cloruro de sanguinarium; seclazona; sermetacina; sudoxicam; sulindaco; suprofeno; talmetacina; talniflumato; talosalato; tebufelona; tenidap; tenidap sódico; tenoxicam; tesicam; tesimida; tetridamina; tiopinac; pivalato de tixocortol; tolmetina; tolmetina sódica; triclonida; triflumidato; zidometacina; glucocorticoides; zomepirac sódico, aspirina, inhibidores de citocinas tal como antagonistas de citocinas (por ejemplo, antagonistas de receptor de IL-6), aza-alquil lisofosfolípidos (AALP) e inhibidores de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), tal como anticuerpos anti-TNF-alfa , receptor de TNF soluble, TNF-alfa, moléculas de ácido nucleico antisentido, guanilhidrazona multivalente (CNI-1493), N-acetilcisteína, pentoxifilina, oxpentifilina, análogos de nucleósidos carbocíclicos, dexanabinol e inhibidores de TNF-alfa tal como Etanercept e Infliximab.
Los “agentes de bloqueo de receptor beta-adrenérgico” antagonizan los efectos cardiovasculares de las catecolaminas en la angina de pecho, hipertensión y arritmias cardíacas e incluyen atenolol, acebutolol, alprenolol, befunolol, betaxolol, bunitrolol, carteolol, celiprolol, hidroxalol, indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, metipranol, metindol, metoprolol, metrizoranolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, practolol, practolol, sotalolnadolol, tiprenolol, tomalolol, timolol, bupranolol, penbutolol, trimepranol, 2-(3-(1,1 -dimetiletil)-amino-2-hidroxipropoxi)-3-pi ridencarbonitrilHCl-, 1-butilamino-3-(2,5-diclorofenoxi-)-2-propanol, 1-isopropilamino-3-(4-(2-ciclopropilmetoxietil)fenoxi)-2-propanol, 3-isopropilamino-1-(7-metilindan-4-iloxi)-2-butanol, 2-(3-t-butilamino-2-hidroxi-propiltio)-4-(5-carbamoil-2-tienil)tiazol y 7-(2-hidroxi-3-tbutilaminpropoxi)ftalida.
Los “bloqueadores de canal de calcio” pertenecen a uno de tres grupos químicos principales de fármacos, las dihidropiridinas, tal como nifedipino, las fenilalquilaminas, tal como verapamilo y las benzotiazepinas, tal como diltiazem. Otros bloqueadores de canal de calcio útiles de acuerdo con la invención incluyen aminona, amlodipino, benciclano, felodipino, fendilina, flunarizina, isradipino, nicardipino, nimodipino, perhexileno, gallopamilo, tiapamilo y análogos de tiapamilo, feniloína, barbitúricos y los péptidos dinorfina, omega-conotoxina y omega-agatoxina.
La “diabetes” incluye diabetes tipo 1, tanto autoinmunitaria como idiopática, diabetes tipo 2 y diabetes gestacional. La diabetes se puede caracterizar por hiperglucemia recurrente y persistente y se puede diagnosticar por niveles de glucosa en sangre incrementados y hemoglobina glucosilada (> 6,5 %). De acuerdo con la definición actual, dos mediciones de glucosa en ayunas por arriba de 126 mg/dl (7,0 mmol/l) se consideran diagnósticas para la diabetes mellitus.
“Condición relacionada con diabetes” incluye cualquier condición o enfermedad que es un resultado o complicación de o se correlaciona o asociada de otro modo con diabetes que incluye una condición provocada por niveles de glucosa en sangre más altos de lo normal y una condición seleccionada de la lista que consiste de: hipoglucemia, cetoacidosis diabética, neuropatía diabética, enfermedad renal que incluye nefropatía diabética, enfermedad cardiovascular, derrame cerebral y retinopatía diabética y enfermedad arteriovascular.
“Biomarcador” en el contexto de la presente invención abarca, sin limitación, las proteínas en la tabla 1 o 2 y medidas de facto de las mismas; ácidos nucleicos que codifican para las proteínas en la tabla 1 o 2 ; metabolitos y productos de degradación de las proteínas en la tabla 1 o 2 ; polimorfismos, mutaciones, variantes, modificaciones, subunidades, péptidos (tal como aquellos en la tabla 3) y fragmentos de las proteínas en la tabla 1 o 2; y complejos de proteína-ligando que incluyen las proteínas en la tabla 1 o 2. Los biomarcadores también pueden incluir proteínas con al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad o similitud con las proteínas en la tabla 1 o 2, así como formas mutadas de las proteínas en la tabla 1 o 2 y ácidos nucleicos que codifican para estas mutaciones. Los biomarcadores se pueden usar para calcular índices matemáticos u otras mediciones, incluidas tendencias temporales y diferencias que son útiles con respecto a la presente invención.
“Diabetes gestacional” se refiere a la intolerancia a la glucosa durante el embarazo. Esta condición da por resultado un nivel alto de azúcar en sangre que inicia o se diagnostica primero durante el embarazo.
Los agentes “hipoglucémicos” incluyen agentes hipoglucémicos orales e incluyen, sin limitación, sulfonilureas de primera generación: acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida; sulfonilureas de segunda generación: glipizida, gliburida, glimepirida; biguanidas: metformina; inhibidores de alfa-glucosidasa: acarbosa, miglitol, tiazolidinedionas: rosiglitazona, pioglitazona, troglitazona; meglitinidas: repaglinida; y otros hipoglucemiantes tal como acarbosa; buformina; clorhidrato de butoxamina; camiglibosa; ciglitazona; englitazona sódica; darglitazona sódica; clorhidrato de etoformina; gliamilida; glibomurida; glicetanilo, gliclazida sódica; gliflumida; glucagón; glihexamida; glimidina sódica; glioctamida; gliparamida; linoglirida; fumarato de linoglirida; palmoxirato de metilo; palmoxirato sódico; tartrato de piroglirida; proinsulina humana; acetato de seglitida; tolazamida; tolpirramida; zopolrestat.
“Glucosa en ayunas alterada” (IFG, por sus siglas en inglés) es una condición prediabética asociada con un nivel de glucosa en sangre que es más alto de lo normal, pero no suficientemente alto para que se clasifique como diabetes. Un sujeto con IFG puede tener un nivel de azúcar en sangre en ayunas (glucosa) inferior o igual a 125 mg/l, entre 100 y 125 mg/dl o entre 105 y 125 mg/dl.
El término “identidad”, usado en la presente, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas, como se determina al comparar las secuencias. “Identidad” también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de molécula de ácido nucleico o polipéptido, como sea el caso, como se determina por la coincidencia entre cadenas de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. “Identidad” mide el por ciento de coincidencias idénticas entre dos o más secuencias con alineaciones de separación dirigidas por un modelo matemático particular de programas de computadora.
“Tolerancia a la glucosa alterada” (IGT, por sus siglas en inglés) es una condición prediabética asociada con un nivel de glucosa en sangre que es más alto de lo normal, pero no suficientemente alto para que se clasifique como diabetes. Un sujeto con IGT puede tener niveles de glucosa de dos horas de 140 a 199 mg/dl (7,8 a 11,0 mmol) en la prueba de tolerancia oral a la glucosa de 75 g.
Los “agentes reductores de lípidos” incluyen gemfibrozilo, coliestiramina, colestipol, ácido nicotínico e inhibidores de HMG-CoA reductasa tal como simvastatina, lovastatina, pravastatina sódica, fluvastatina, atorvastatina y cerivastatina.
El término “que mide” y variantes tal como “medir”, como se usan en la presente en relación con los biomarcadores descritos en la presente, se refieren a la determinación de la presencia y/o cantidad de un biomarcador dado.
“Prediabetes” es un estado en el cual se cumplen algunos pero no todos los criterios de diagnóstico para la diabetes. Incluye condiciones en las cuales los sujetos muestran niveles de azúcar en sangre entre niveles normales y diabéticos, condiciones en las cuales los sujetos padecen de tolerancia a la glucosa alterada (IGT), glucosa en ayunas alterada (IFG) y/o hemoglobina glucosilada entre 5,7 y 6,4 %.
Una “muestra” en el contexto de la presente invención es una muestra biológica aislada de un sujeto y puede incluir, a modo de ejemplo y no de limitación, sangre completa, fracción sanguínea, suero, plasma, células sanguíneas, células endoteliales, biopsias de tejido, fluido linfático, fluido de ascitis, fluido intersticial (también conocido como “fluido extracelular” y abarca el fluido encontrado en espacios entre células, incluido, entre otros, fluido crevicular gingival), médula ósea, fluido cefalorraquídeo (CSF), saliva, mucoso, esputo, sudor, orina o cualquier otra secreción, excreción u otros fluidos corporales.
El término “similitud” es un concepto relacionado con “identidad”, pero en contraste se refiere a una medida de similitud que incluye tanto coincidencias idénticas como coincidencias de sustitución conservadoras. Puesto que las sustituciones conservadoras aplican a polipéptidos y no a moléculas de ácido nucleico, la similitud solo se refiere a comparaciones de secuencias de polipéptidos. Si dos secuencias de polipéptidos tienen, por ejemplo, 10 de 20 aminoácidos idénticos, y el resto son todas sustituciones no conservadoras, entonces el por ciento de identidad y similitud sería 50 %. Si en el mismo ejemplo, hay 5 posiciones más donde existen sustituciones conservadoras, entonces el por ciento de identidad permanece 50 %, pero el por ciento de similitud sería 75 % (15 de 20). Por lo tanto, en casos donde hay sustituciones conservadoras, el grado de similitud entre dos secuencias de polipéptidos será mayor que el por ciento de identidad entre aquellas dos secuencias.
El término “sustitución de aminoácidos conservadora” se refiere a una sustitución de un residuo de aminoácidos nativo con un residuo normativo de modo que hay poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Por ejemplo, una sustitución conservadora resulta del reemplazo de un residuo no polar en un polipéptido con cualquier otro residuo no polar. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también se puede sustituir con alanina. Las reglas generales para sustituciones de aminoácidos conservadoras se exponen en la tabla a continuación:
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Las sustituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan residuos de aminoácidos que no se presentan de forma natural que se incorporan habitualmente por síntesis química de péptidos en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de porciones de aminoácidos. Se espera que las modificaciones conservadoras a la secuencia de aminoácidos (y la correspondiente modificación a los nucleótidos codificadores) produzcan polipéptidos que tienen características funcionales y químicas similares a aquellas de los biomarcadores en la tabla 1. Por el contrario, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los biomarcadores en la tabla 1 se pueden lograr al seleccionar sustituciones que difieren de manera significativa en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la estructura molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se presentan de manera natural se pueden dividir en grupos con base en las propiedades de cadena lateral común:
1) hidrófobo: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr;
3) ácido: Asp, Glu;
4) básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro; y
6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
Los métodos preferidos para determinar la identidad y/o similitud se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen el paquete de programa GCG, incluido GAP (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)). El programa BLAST X está públicamente disponible en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (Altschul et al., BlAs T Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, Md.); Altschul et al., 1990, supra). El conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.
Un “sujeto” en el contexto de la presente invención es preferentemente un mamífero. El mamífero puede ser un humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca. Un sujeto puede ser alguien que se ha diagnosticado o identificado previamente como que tiene diabetes, prediabetes o una condición relacionada con diabetes y opcionalmente ya se ha sometido, o se está sometiendo, a una intervención terapéutica para la diabetes, prediabetes o condición relacionada con diabetes. De manera alternativa, un sujeto también puede ser alguien que no se ha diagnosticado previamente como que tiene prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes. Por ejemplo, un sujeto puede ser alguien que exhibe uno o más factores de riesgo para prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes, o un sujeto que no exhibe ninguno de estos factores de riesgo o un sujeto que es asintomático para prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes. Un sujeto también puede ser alguien que padece o está en riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes.
Diagnósticos y pronósticos
La invención proporciona diagnóstico y pronóstico mejorados de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. El riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes se puede valorar al medir uno o más de los biomarcadores descritos en la presente y al comparar los valores medidos con valores de índice o referencia. Esta comparación se puede llevar a cabo con fórmula o algoritmos matemáticos a fin de combinar la información de los resultados de múltiples biomarcadores individuales y otros parámetros en una medición o índice individual. Los sujetos identificados como que tienen un riesgo incrementado de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes se pueden seleccionar opcionalmente para recibir regímenes de tratamiento, tal como administración de compuestos profilácticos o terapéuticos o implementación de regímenes de ejercicio o suplementos dietéticos para prevenir, tratar o retrasar el comienzo de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes.
La cantidad del biomarcador se puede medir en una muestra de prueba y compararse con un nivel de referencia o normal, utilizando técnicas tal como límites de referencia, límites de discriminación o umbrales de definición de riesgo para definir puntos de corte y valores anormales para prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. El nivel de control normal es el nivel de uno o más biomarcadores o índices de biomarcadores combinados encontrados habitualmente en un sujeto que no padece prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Los niveles normales y anormales y los puntos de corte pueden variar con base en si un biomarcador se usa solo o en una fórmula que se combina con otros biomarcadores en un índice. De manera alternativa, el nivel normal o anormal puede ser una base de datos de patrones de biomarcadores o “signaturas” de sujetos previamente probados que desarrollaron o no o se convirtieron a prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes en un horizonte de tiempo clínicamente relevante.
La presente invención se puede usar para realizar mediciones continuas o categóricas del riesgo de desarrollar o convertir a prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes, diagnosticando y definiendo de este modo el espectro de riesgo de una categoría de sujetos con un estado clínico definido. En el escenario categórico, los métodos de la presente invención se pueden usar para discriminar entre cohortes normales y cohortes con prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. En otras realizaciones, la presente invención se puede usar para discriminar la prediabetes de la diabetes, diabetes de condiciones normales diferentes relacionadas con diabetes o diferentes condiciones de diabetes de lo normal. Este uso diferente puede requerir diferentes combinaciones de biomarcadores en paneles individuales, algoritmos matemáticos y/o puntos de corte, pero sujeto a las mismas mediciones de precisión mencionadas anteriormente para el uso propuesto.
La identificación de un sujeto antes de que desarrolle prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes permite la selección e iniciación de diferentes intervenciones terapéuticas o regímenes de tratamiento a fin de retrasar, reducir o prevenir la conversión de ese sujeto a un estado de enfermedad. El monitoreo de los niveles de al menos un biomarcador también permite que se monitoree el curso del tratamiento de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Por ejemplo, se puede proporcionar una muestra de un sujeto que se somete a regímenes de tratamiento o intervenciones terapéuticas, por ejemplo, tratamientos con fármacos, para prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Estos regímenes de tratamiento o intervenciones terapéuticas pueden incluir regímenes de ejercicio, modificación dietética, suplementación dietética, intervención quirúrgica bariátrica, administración de productos farmacéuticos y tratamiento con agentes terapéuticos o profilácticos usados en sujetos diagnosticados o identificados con prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Las muestras se pueden obtener del sujeto en diferentes puntos de tiempo antes, durante o después del tratamiento.
La presente invención también se puede usar para examinar poblaciones en una variedad de entornos. Para grupos de sujetos se pueden examinar: para identificar aquellos que requieren intervenciones; para la recolección de datos epidemiológicos; para valoraros para propósitos de seguro de salud. Los datos obtenidos a través de los exámenes de población serán particularmente valiosos cuando se correlacionan con medidas clínicas de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes y se pueden almacenar en arreglos de datos u otras recolecciones en medios leíbles por máquina para uso conveniente por los proveedores de servicios de salud y la industria de salud aliada para mejorar la prestación de servicios y eficiencia y, por lo tanto, mejorar los resultados de paciente.
Un medio de almacenamiento leíble por máquina incluye cualquier material de almacenamiento de datos codificado con datos leíbles por máquina o arreglos de datos que, cuando se usa una máquina programada con instrucciones para usar estos datos, es capaz de usarse para una variedad de propósitos, tal como, sin limitación, proporcionar o generar información de sujeto relacionada con factores de riesgo de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes con el paso del tiempo o en respuesta a intervenciones o terapias y descubrimiento de fármacos. La valoración o medición de los biomarcadores de la invención y/o el correspondiente riesgo determinado a partir de lo mismo se puede implementar en programas de computadora que se ejecutan en computadoras programables, que comprenden, entre otros, un procesador, un sistema de almacenamiento de datos (incluidos elementos de almacenamiento y/o memoria volátil y no volátil), al menos un dispositivo de entrada y al menos un dispositivo de salida. El código de programa o software se puede aplicar a los datos de entrada para realizar las funciones requeridas para generar la salida requerida.
El código de programa o software puede realizar una o más de las funciones en relación con los datos relacionados con los biomarcadores que incluyen: determinar niveles normales o anormales de un biomarcador y comparar un nivel de un biomarcador con un valor de referencia, por ejemplo, un sujeto de control o población cuyo estado de prediabetes, diabetes o condición relacionada con diabetes se conoce o un valor de índice o valor de línea base. La muestra de referencia o valor de índice o valor de línea base se puede tomar o derivar de uno o más sujetos que se han expuesto a un tratamiento, o se puede tomar o derivar de uno o más sujetos que están en bajo riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes, o se puede tomar o derivar de sujetos que han mostrado mejoras en uno o más factores de riesgo asociados con prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes (incluidos los parámetros clínicos establecidos) como resultado de la exposición a un tratamiento. La muestra de referencia o valor de índice o valor de línea base también se puede tomar o derivar de uno o más sujetos que no se han expuesto al tratamiento. Por ejemplo, se pueden recolectar muestras de sujetos que han recibido tratamiento inicial para prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes y tratamiento posterior para prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes para monitorear el progreso del tratamiento. Un valor de referencia también puede comprender un valor derivado de un algoritmo de predicción de riesgos o índices calculados a partir de estudios de población.
Por lo tanto, los biomarcadores de la presente invención se pueden usar para generar un perfil de biomarcador o signatura de sujetos: (i) que no tienen y no se espera que desarrollen prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes y/o (ii) que tienen o se espera que desarrollen prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. El perfil de biomarcador de un sujeto se puede comparar con un perfil de biomarcador de referencia o predeterminado para diagnosticar o identificar sujetos en riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes, para monitorear la progresión de la enfermedad, así como la velocidad de progresión de la enfermedad y para monitorear la efectividad de los tratamientos de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Los perfiles de biomarcadores de la presente invención se contienen preferentemente en un medio leíble por máquina y están “vivos” en la medida en que se pueden actualizar con datos adicionales que se obtienen, mejorando de este modo la resistencia e importancia clínica de los biomarcadores. Los datos relacionados con los biomarcadores de la presente invención también se pueden combinar o correlacionar con otros datos o resultados de pruebas, tal como, sin limitación, mediciones de parámetros clínicos u otros algoritmos para prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Otros datos incluyen edad, etnia, índice de masa corporal (IMC), niveles de colesterol total, niveles de glucosa en sangre, presión arterial, niveles de LDL y HDL. Los medios leíbles por máquina también pueden comprender información de sujeto tal como historial médico y cualquier historial familiar relevante.
La presente invención también proporciona métodos para identificar agentes para tratar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes que son apropiados o personalizados de otro modo para un sujeto específico. En este sentido, se puede tomar una muestra de prueba de un sujeto, expuesto a un agente terapéutico o un fármaco, y se puede determinar el nivel de uno o más biomarcadores. El nivel de uno o más biomarcadores se puede comparar con una muestra derivada del sujeto antes y después del tratamiento, o se puede comparar con muestras derivadas de uno o más sujetos que han mostrado mejoras en los factores de riesgo como resultado de este tratamiento o exposición.
Pruebas
Los biomarcadores y paneles de los mismos de la presente invención se pueden implementar en una variedad de sistemas de prueba. Habitualmente, los sistemas de prueba incluyen un medio para obtener resultados de prueba de una muestra, un medio para recolectar, almacenar, procesar y/o rastrear resultados de prueba para la muestra, usualmente en una base de datos y un medio para reportar resultados de prueba. El medio para obtener los resultados de prueba puede incluir un módulo adaptado para la prueba automática utilizando uno o más de los ensayos de detección de ácido nucleico, inmunológicos y bioquímicos. Algunos sistemas de prueba pueden procesar múltiples muestras y pueden correr múltiples pruebas en una muestra dada. El medio para recolectar, almacenar, procesar y/o rastrear resultados de prueba puede comprender un dispositivo de almacenamiento de datos físico y/o electrónico tal como un disco duro o memoria flash o impresiones en papel. El medio para reportar los resultados de prueba puede incluir una pantalla visible, un enlace a una estructura de datos o base de datos, o una impresora. En este sentido, el medio de notificación puede ser simplemente un enlace de datos que se adapta para enviar resultados a otro dispositivo tal como una base de datos, pantalla visual o impresora.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un sistema de prueba adaptado para ayudar en la identificación de individuos en riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes o diagnosticar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes, el sistema de prueba que comprende un medio que usa datos relacionados con al menos uno de los biomarcadores descritos en la presente. Habitualmente, los resultados de pruebas del sistema de la presente invención sirven como entradas a una computadora o microprocesador programado con un código de máquina o software que toma los datos relacionados con al menos uno de los biomarcadores descritos en la presente y determina el riesgo de desarrollar o ya tener prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes.
Selección de biomarcadores
Se ha identificado que los biomarcadores en la tabla 1 tienen niveles de concentración o presencia alterados o modificados en sujetos que tienen diabetes y/o nefropatía diabética. Por lo tanto, los biomarcadores y métodos de la presente invención permiten que un experto en la técnica identifique, diagnostique o valore de otro modo sujetos que no exhiben ningún síntoma de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes, pero que sin embargo pueden tener o estar en riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes.
Uno o más de los biomarcadores en la tabla 1 o 2 se pueden seleccionar para formar un panel de marcadores. Por ejemplo, una realización de la invención es un método para evaluar el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes, que comprende el paso de medir los niveles de al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12 o 13 biomarcadores de la tabla 1 o 2. Preferentemente, el panel incluye al menos uno de: peroxiredoxina-2 (P32119), proteína AMBP (P02760); apolipoproteína A-IV (P06727) y subunidad B de subcomponente C1q de complemento (P02746); al menos uno de adiponectina (Q15848), proteína 2 relacionada con factor H de complemento (P36980), subunidad beta de hemoglobina (P68871), apolipoproteína B-100(P04114) y sulfhidril oxidasa 1 (000391) o; al menos uno de apolipoproteína C-III (P02656), proteína 3 de unión a factor de crecimiento tipo insulina (P17936), tipo antígeno CD5 (O43866) y cadena beta de componente C8 de complemento (P07358).
Algoritmos clínicos
Los resultados obtenidos usando los biomarcadores de la presente invención se pueden combinar en índices útiles en la práctica de la invención usando cualquiera de una o más fórmulas. Como se indicó anteriormente y sin limitación, estos índices pueden indicar, entre las diversas indicaciones diferentes, la probabilidad, posibilidad, riesgo absoluto o relativo, tiempo para o velocidad de conversión de un estado de enfermedad a otro, o hacer predicciones de mediciones futuras de biomarcadores de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Esto puede ser para un horizonte o período de tiempo específico, o para el riesgo de por vida restante, o simplemente se proporciona como un índice con respecto a otra población de sujetos de referencia.
Las fórmulas preferidas incluyen la clase amplia de algoritmos de clasificación estadística tal como característica operativa relativa (ROC, por sus siglas en inglés), el uso de análisis discriminante, por ejemplo, análisis discriminante lineal (LDA, por sus siglas en inglés). Las características se pueden identificar para LDA usando un enfoque basado en eigengene con diferentes umbrales (ELDA, por sus siglas en inglés) o un algoritmo de pasos basado en un análisis de varianza de múltiples variables (MANOVA, por sus siglas en inglés). Se pueden realizar algorit, por sus siglas en inglés mos de avance, retroceso y paso a paso que reducen al mínimo la probabilidad de no separación con base en la estadística de Hotelling-Lawley. Otras fórmulas incluyen una máquina de vectores de soporte (s Vm , por sus siglas en inglés), un bosque aleatorio o partición recursiva también se pueden usar por separado o en combinación para identificar combinaciones de biomarcadores que son más importantes.
Se puede usar otra fórmula a fin de preprocesar los resultados de mediciones de biomarcadores individuales en formas de información más valiosas, antes de procesamiento adicional. El preprocesamiento incluye transformaciones de raíz cuadrada e inversa, normalización de resultados de biomarcadores, usando transformaciones matemáticas tal como funciones logarítmicas o logísticas. Se prefieren particularmente las normalizaciones con base en parámetros clínicos tal como edad, género, raza, IMC o sexo.
Uno o más parámetros clínicos se pueden usar en la práctica de la invención en combinación con los biomarcadores de la presente invención como una entrada a una fórmula o como criterios de preselección que definen una población relevante que se va a medir usando una fórmula y panel de biomarcador particular. Los parámetros clínicos también pueden ser útiles en el preprocesamiento y normalización de biomarcadores, o en la selección de biomarcadores, construcción de paneles, derivación y selección de tipo de fórmula y post-procesamiento de resultado de fórmula.
Los paneles de biomarcadores de la presente invención se pueden adaptar a la población y al criterio de valoración o uso que se propone. Por ejemplo, se pueden usar paneles y fórmulas de biomarcadores para valoración de sujetos para prevención y diagnóstico primario y para prevención y manejo secundario. Para valoración primaria, los paneles y fórmulas se pueden usar para predicción y estratificación de riesgo para condiciones, para el diagnóstico de condiciones diabéticas, para el pronóstico del nivel de glucosa y la velocidad de cambio y para la indicación de diagnóstico futuro. Para prevención y manejo secundario, los paneles y fórmulas se pueden usar para pronóstico y estratificación de riesgo para complicaciones de diabetes. Los paneles y fórmulas se pueden usar para apoyar decisiones clínicas, tal como determinar si posponer la intervención a la próxima visita, recomendar chequeos preventivos normales, recomendar frecuencia incrementada de visita, recomendar prueba incrementada y recomendar intervención terapéutica. Los paneles y fórmulas también pueden ser útiles para la intervención en sujetos con condiciones diabéticas, tal como respuesta y selección terapéutica, ajuste y dosificación de terapia, monitoreo de eficiencia terapéutica en curso e indicación de cambio en intervención terapéutica.
Los criterios de valoración de enfermedad de la invención incluyen prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Los paneles y fórmulas en la presente se pueden usar para evaluar el estado actual de los criterios de valoración de enfermedad al ayudar en el diagnóstico y/o la determinación de la severidad de la prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes y/o determinación de la subclase de la enfermedad o condición. Los paneles y fórmulas en la presente también son útiles para determinar el estado futuro de intervención tal como determinar el pronóstico de futura prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes con terapia, intervención y terapia de fármacos. La invención se puede adaptar a una intervención específica, clase de fármaco, terapia o clase terapéutica o terapia de fármacos o una combinación de las mismas.
Los criterios de valoración sustitutos de la invención incluyen medir HBAIc, glucosa (I7PG y OGTT) y clase de glucosa (tolerancia normal a la glucosa (NGT), IGT, IFG y T2DM). Los paneles y fórmulas en la presente son útiles para determinar el estado actual de los criterios de valoración sustitutos al diagnosticar la clase de glucosa con o sin ayuno. El estado futuro de los criterios de valoración sustitutos se puede determinar usando los paneles de biomarcadores en la presente, tal como la determinación del pronóstico de la clase de glucosa futura. Los paneles de biomarcadores y fórmulas también son útiles para determinar el estado futuro de intervención tal como determinación de pronóstico de futura clase de glucosa con terapia de fármacos.
Los criterios de valoración de complicación de condiciones diabéticas incluyen las condiciones relacionadas con diabetes en la presente, tal como enfermedad renal, retinopatía ocular, daño microvascular, daño hepático, amputación de extremidades y complicaciones cardiovasculares. Las fórmulas y paneles de biomarcadores se pueden usar para evaluar el estado actual de los criterios de valoración de enfermedad al ayudar en el diagnóstico de prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. El estado futuro de los criterios de valoración de complicación se puede determinar usando los paneles de biomarcadores y fórmulas tal como la determinación del pronóstico de futura prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Los paneles y fórmulas también son útiles para determinar el estado futuro de intervención tal como determinar el pronóstico de futura prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes con terapia.
Agentes para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes
Los biomarcadores de la presente invención también se pueden usar para identificar y valorar agentes para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes o una condición relacionada con diabetes. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para identificar o valorar un agente para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes que comprende:
(i) poner en contacto células que expresan al menos un biomarcador de la tabla 1 o 2 con un agente putativo; y (ii) comparar la expresión o nivel de al menos un biomarcador de la tabla 1 o 2 en las células antes del contacto con el agente putativo con la expresión de al menos un biomarcador de la tabla 1 o 2 en las células después del contacto con el agente putativo;
en donde un cambio en la expresión o nivel identifica el agente como un agente para tratar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes.
Las células se pueden poner en contacto con el agente putativo in vivo, tal como en un modelo animal, o in vitro, tal como en un cultivo o línea de células. La expresión o nivel se puede comparar usando un software o programa accionado por computadora.
La presente invención también proporciona un método para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes en un sujeto que comprende administrar una cantidad efectiva de un agente adaptado para cambiar la expresión o nivel de al menos un biomarcador en la tabla 1 o 2 al sujeto.
El agente se puede administrar de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos seleccionados por un profesional adecuadamente calificado. Los agentes se pueden administrar como parte de una composición que comprende una cantidad efectiva del agente en mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable tal como un portador farmacéuticamente aceptable. El material portador puede ser agua para inyección, preferentemente complementada con otros materiales comunes en soluciones para administración a mamíferos. Los agentes farmacéuticamente aceptables estándar tal como portadores, diluyentes y excipientes se pueden incluir como se desee. Otras composiciones de ejemplo comprenden amortiguador Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4,0 - 5,5, que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado para lo mismo.
La formulación óptima del agente se determinará por un experto en la técnica dependiendo de la vía de administración propuesta, formato de administración y dosis deseada. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1435­ 1712 (18a Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990). Estas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona el uso de un agente adaptado para cambiar la expresión o el nivel de al menos un biomarcador en la tabla 1 o 2 para preparar un medicamento para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes.
Preferentemente, el agente adaptado para cambiar la expresión o nivel de al menos un biomarcador en la tabla 1 o 2 es un agente para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o una condición relacionada con diabetes como se define en la presente. Otros agentes para tratar o reducir el riesgo de desarrollar prediabetes, diabetes y/o condiciones relacionadas con diabetes incluyen, inhibidores de lipasa tal como cetilistat; análogos de amilina sintética tal como Symlin pramlintide con o sin leptina recombinante; inhibidores de cotransportador 2 de sodio-glucosa tipo sergliflozina, YM543, dapagliflozina, activadores de PI3 cinasa y triglicérido lipasa adiposa duales como Adyvia; antagonistas de receptores de neuropéptido Y2, Y4 e Y5, análogo sintético de las hormonas humanas PYY3-36 y polipéptido pancreático; antagonistas de receptor cannabinoide CB1 tal como rimonabant, taranabant, CP-945,598, hormonas tipo oleoil-estrona; inhibidores de serotonina, dopamina y norepinefrina (también conocidos en la técnica como “inhibidores triples de recaptación de monoamina”) tipo tesofensina; inhibidores de recaptación de norepinefrina y dopamina, tipo Contrave (bupropion más antagonista opioide naltrexona) y Excalia (bupropion más zonisamina anticonvulsiva); inhibidores de 111.beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (11b-HSD1); inhibidores de síntesis de cortisol tal como ketoconazol; inhibidores de gluconeogénesis; activadores de glucocinasa; inhibidores antisentido de proteína tirosina fosfatasa-IB; así como otros agentes tipo inyecciones de gastrina y análogos de factor de crecimiento epidérmico (EGF) tal como Islet Neogenesis Therapy (E1-I.N.T.); y betahistina.
Medición de biomarcadores
Los biomarcadores se pueden medir usando una o más de una variedad de técnicas. Preferentemente, los biomarcadores se miden de una manera que reduce al mínimo la variabilidad de sujeto. Por ejemplo, se pueden medir en un estado de ayuno y más comúnmente por la mañana, proporcionando un nivel reducido de variabilidad de sujeto debido tanto al consumo de alimentos como al metabolismo y variación diurna. Se puede usar cualquier procedimiento de muestreo basado en ayuno o temporal en la presente invención.
La medición real de los niveles de los biomarcadores en la presente se puede determinar al nivel de proteína o ácido nucleico usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, a nivel de ácido nucleico, se pueden usar análisis de hibridación Norte y Sur, así como ensayos de protección de ribonucleasa usando sondas que reconocen específicamente una o más de estas secuencias para determinar la expresión génica. Los niveles de biomarcadores también se pueden medir usando ensayos de PCR basados en transcripción inversa (RT-PCR), por ejemplo, usando cebadores específicos para la secuencia de genes expresada de manera diferencial. Preferentemente, los niveles de biomarcadores se determinan al nivel de proteína, por ejemplo, al medir los niveles de péptidos codificados por los productos génicos descritos en la presente, o actividades de los mismos. Estos métodos incluyen, por ejemplo, inmunoensayos basados en anticuerpos contra proteínas codificadas por los genes, aptámeros o huellas moleculares.
Los biomarcadores en la tabla 1 o 2, polipéptidos, péptidos, mutaciones y polimorfismos de los mismos se pueden detectar de cualquier manera adecuada, pero se detectan habitualmente al poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo que se une a la proteína, polipéptido, mutación o polimorfismo de biomarcador y entonces al detectar la presencia o ausencia de un producto de reacción. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales, quiméricos o un fragmento de lo anterior, y el paso de detección del producto de reacción se puede llevar a cabo con cualquier inmunoensayo adecuado.
Los inmunoensayos llevados a cabo de acuerdo con la presente invención pueden ser ensayos homogéneos o ensayos heterogéneos. En un ensayo homogéneo, la reacción inmunológica usualmente implica el anticuerpo específico para el biomarcador, un analito etiquetado y la muestra de interés. La señal que surge de la etiqueta se modifica, directa o indirectamente, en la unión del anticuerpo al analito etiquetado. Tanto la reacción inmunológica como la detección del grado de la misma se pueden llevar a cabo en una solución homogénea.
Las etiquetas inmunoquímicas que se pueden emplear incluyen radicales libres, radioisótopos, tintes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos o coenzimas.
En un enfoque de ensayo heterogéneo, los reactivos usualmente son la muestra, el anticuerpo y medio para producir una señal detectable. Se pueden usar muestras como se describió anteriormente. El anticuerpo se puede inmovilizar en un soporte, tal como una perla (tal como perlas de agarosa de proteína A y proteína G), placa o portaobjetos, y ponerse en contacto con el espécimen que se sospecha que contiene el antígeno en una fase líquida. Entonces, el soporte se separa de la fase líquida y se examina ya sea la fase de soporte o la fase líquida en busca de una señal detectable que emplea medio para producir esta señal. La señal se relaciona con la presencia del analito en la muestra. El medio para producir una señal detectable incluye el uso de etiquetas radioactivas, etiquetas fluorescentes o etiquetas enzimáticas. Por ejemplo, si el antígeno que se va a detectar contiene un segundo sitio de unión, un anticuerpo que se une a ese sitio se puede conjugar a un grupo detectable y adicionarse a la solución de reacción de fase líquida antes del paso de separación. La presencia del grupo detectable en el soporte sólido indica la presencia del antígeno en la muestra de prueba. Los ejemplos de inmunoensayos adecuados incluyen oligonucleótidos, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, métodos de inmunofluorescencia, métodos de quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia (ECL) o inmunoensayos ligados a enzimas.
Usando información de secuencia proporcionada por las entradas de base de datos para los biomarcadores en la tabla 1, la expresión de las secuencias de biomarcadores se puede detectar (si está presente) y medir usando técnicas bien conocidas por un experto en la técnica tal como análisis de hibridación de transferencia Northern o métodos que de manera específica y preferentemente, amplifican de manera cuantitativa secuencias de ácido nucleico específicas. Como otro ejemplo, las secuencias se pueden usar para construir cebadores para amplificar de manera específica las secuencias de biomarcadores en, por ejemplo, métodos de detección basados en amplificación tal como reacción en cadena de polimerasa basada en transcripción inversa (RT-PCR). Cuando las alteraciones en la expresión génica se asocian con amplificación génica, deleción, polimorfismos y mutaciones, se pueden realizar comparaciones de secuencia en poblaciones de prueba y de referencia al comparar cantidades relativas de las secuencias de ADN o ARN examinadas en las poblaciones de células de prueba y de referencia.
La proteína de biomarcador y/o metabolitos de ácido nucleico también se pueden medir usando una o más de una variedad de formas conocidas por un experto en la técnica, incluida la espectroscopía de índice de refracción (RI), espectroscopía ultravioleta (UV), análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopía de infrarrojo cercano (IR cercano), espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), análisis de dispersión de luz (LS), espectrometría de masas que incluye espectrometría de masas de monitoreo de reacción múltiple (MRM), espectrometría de masas de pirólisis, nefelometría, espectroscopia de Raman dispersiva, cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas, cromatografía de líquidos combinada con espectrometría de masas, ionización por desorción de láser asistida por matriztiempo de vuelo (MALDI-TOF) combinada con espectrometría de masas, espectroscopía de iones por aspersión combinada con espectrometría de masas, electrofilares, NMR y electroforesis capilar, RMN y detección IR.
Cuando los biomarcadores se miden usando espectrometría de masas, se pueden medir mediante un péptido seleccionado de la lista de:
(i) un péptido de 5-25 aminoácidos de una proteína de la tabla 1 o 2;
(ii) un péptido de 5-20 aminoácidos de una proteína de la tabla 1 o 2;
(iii) un péptido de 10-20 aminoácidos de una proteína de la tabla 1 o 2 ;
(iv) un péptido de 10-15 aminoácidos de una proteína de la tabla 1 o 2; o
(v) un péptido en la tabla 3.
Kits
La invención también incluye un reactivo de detección de biomarcador, por ejemplo, un anticuerpo específico para una proteína de biomarcador en la tabla 1 o 2 o un péptido en la tabla 3 o un ácido nucleico que identifica de manera específica o se une a uno o más ácidos nucleicos que codifican para una proteína de biomarcador en la tabla 1 o 2 o un péptido en la tabla 3 al tener secuencias de ácido nucleico homólogas, tal como aptámeros o secuencias de oligonucleótidos, complementarias a una porción del ácido nucleico empaquetado conjuntamente en la forma de un kit. El kit puede contener en recipientes separados un ácido nucleico o anticuerpo (ya sea, ya unido a una matriz sólida o empaquetado por separado con reactivos para unirlos a la matriz), formulaciones de control (positivas y/o negativas) y/o una etiqueta detectable tal como fluoresceína, proteína fluorescente verde, rodamina, tintes de cianina, tintes de Alexa, luciferasa, radioetiquetas, entre otros. Las instrucciones para llevar a cabo el ensayo también se pueden incluir en el kit. El ensayo puede estar, por ejemplo, en la forma de un arreglo de anticuerpo de proteína, ELISA sándwich o hibridación Norte. Los reactivos para detectar biomarcadores de la presente invención se pueden inmovilizar en una matriz sólida tal como una tira porosa para formar al menos un sitio de detección de biomarcador. La región de medición o detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de sitios que contienen un anticuerpo o ácido nucleico. Una tira de prueba también puede contener sitios para controles negativos y/o positivos. De manera alternativa, los sitios de control se pueden ubicar en una tira separada de la tira de prueba. Opcionalmente, los diferentes sitios de detección pueden contener diferentes cantidades de ácidos nucleicos o anticuerpos inmovilizados, por ejemplo, una cantidad mayor en el primer sitio de detección y cantidades menores en sitios posteriores. En la adición de la muestra de prueba, el número de sitios que muestran una señal detectable proporciona una indicación cuantitativa de la cantidad de biomarcador presente en la muestra. Los sitios de detección se pueden configurar en cualquier forma adecuadamente detectable y habitualmente tienen la forma de una barra o punto que abarca el ancho de una tira de prueba.
De manera alternativa, el kit contiene un arreglo de sustrato de ácido nucleico que comprende una o más secuencias de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos en el arreglo identifican específicamente una o más secuencias de ácido nucleico adaptadas para unirse a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un biomarcador en la tabla 1 o 2. El arreglo de sustrato puede estar en, por ejemplo, un sustrato sólido o “chip”. De manera alternativa, el arreglo de sustrato puede ser un arreglo de solución.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Identificación y validación de biomarcadores de diabetes
1. Materiales/métodos
A. Descripción de cohorte
A.1. Estudio de diabetes de Fremantle (fase 1)
Racional: La cohorte FDS1 comprendió 1294 pacientes que tenían diabetes tipo 2. Los sujetos diabéticos con y sin nefropatía diabética se seleccionaron para dar presentaciones fenotípicas marcadamente diferentes que permiten la mayor diferencia en la expresión de proteínas.
El estudio de diabetes de Fremantle (FDS) fase I fue un estudio observacional longitudinal de costo, complicaciones, control y cuidado de diabetes en pacientes de una comunidad urbana estable definida por código postal de 120.097 personas. Cuando la fase I se concibió en 1991, hubo pocos datos publicados de historia natural de diabetes.
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A.2. Estudio de diabetes de Fremantle (fase 2)
Racional: La cohorte FDS2 reclutó diabéticos remitidos por médicos en la localidad de Fremantle y aquellos de la base de datos de cohort FDS1. Los sujetos diabéticos con y sin nefropatía diabética se seleccionaron para dar presentaciones fenotípicas marcadamente diferentes que permiten la mayor diferencia en la expresión de proteínas.
La fase II se concibió en 2007 para recolección de datos mejorada y extendida a fin de caracterizar la naturaleza de la diabetes en Australia urbana contemporánea.
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A.3. Estudio de diabetes de Busselton
Racional: Ampliar la información sobre pacientes diabéticos de una comunidad rural. Complementar información obtenida de los estudios urbanos FDS1 y FDS2. Incluye sujetos de control no diabéticos emparejados.
El estudio de salud de Busselton es uno de los programas de investigación epidemiológica de mayor duración en el mundo. Los residentes de la ciudad de Busselton, una comunidad costera en el suroeste de Australia Occidental, han estado implicados en una serie de encuestas de salud desde 1966. Hasta la fecha, más de 16.000 hombres, mujeres y niños de todas las edades han participado en las encuestas y han contribuido a la comprensión de muchas enfermedades y condiciones de salud comunes.
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B. Descubrimiento de biomarcadores de proteínas usando iTRAQ y 2D LC MALDI TOF/TOF
Esta metodología de descubrimiento implica etiquetar químicamente el plasma de diferentes grupos de pacientes (por ejemplo, nefropatía diabética versus diabético sin nefropatía) y determinar por espectrometría de masas la relación relativa de la presencia de una proteína particular. Las proteínas con concentraciones significativamente alteradas después del análisis indican un cambio en la bioquímica de un grupo de pacientes versus otro. Esta técnica se usó para medir las concentraciones relativas de 130-200 proteínas por muestra. Se identificaron proteínas de concentración significativamente diferente entre los grupos, y estas se seleccionaron para examinación adicional por metodología MRM (sección C más adelante).
B.1. Preparación de muestra
Las muestras de plasma (N = 10 o 20) se mezclaron antes de inmunoagotamiento de las 14 proteínas más abundantes usando una columna MARS 14 HPLC (Agilent Technologies). Las muestras inmunoagotadas se intercambiaron con amortiguador usando filtros de centrifugado de corte de 10 kDa (Sartorius) en bicarbonato de trietilamonio 1M. Las muestras de proteína se redujeron, alquilaron, digirieron con tripsina y se etiquetaron de acuerdo con el protocolo iTRAQ (Applied Biosystems).
B.2. Análisis instrumental
Los péptidos se desalaron en una columna de fase inversa polimérica Strata-X 33 mM (Phenomenex) antes de la separación por cromatografía líquida de intercambio catiónico fuerte (SCX) en una HPLC Agilent 1100 usando una columna PolySulfoethyl (4,6 x 100 mm, 5 mm, 300 A). Los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de KCl 0-400 mM. Las fracciones de SCX se desalaron y se cargaron en un sistema de HPLC Ultimate 3000 nano (Dionex C18, PepMap 100, 3 mm) y se separaron con un gradiente de 10-40 % de acetonitrilo (ácido fórmico al 0,1 %) con manchado usando un observador robótico ProBot (LC Packings). Los puntos resultantes se analizaron en un analizador 4800 MALDI TOF/TOF.
B. 3. Análisis de datos
El análisis de datos se realizó usando el software ProteinPilotMR 2.0.1 (Applied Biosystems). Las tasas de descubrimiento falso se calcularon usando el algoritmo PSPEP que funciona en conjunto con ProteinPilotMR 2.0.1 y solo se aceptaron proteínas con una tasa de descubrimiento falso (FDR) global de ajuste de < 5 %.
C. Validación de candidato de biomarcador usando monitoreo de reacción múltiple (MRM)
El monitoreo de reacción múltiple (MRM) es un enfoque basado en espectrometría de masas para dirigirse específicamente a transiciones (pares de iones de fragmento precursor) para un péptido característico, que representa un sustituto para la proteína candidata de biomarcador completa. Para cada candidato se usaron uno o dos péptidos únicos para esa proteína (cuando se comparó con la base de datos humana SwissProt ver 57.1). Este enfoque de alto rendimiento se usó para validar biomarcadores de la fase de descubrimiento (ver sección B anterior) en un mayor número de muestras de plasma de pacientes individuales.
C.1. Preparación de muestra
Se prepararon muestras mezcladas idénticas a los experimentos de iTRAQ anteriores, así como muestras individuales (N=10 por grupo) diferentes de las mezclas de iTRAQ anteriores (muestras de validación). Las muestras se inmunoagotaron de las 14 proteínas más abundantes usando una columna MARS 14 HPLC. Las muestras inmunoagotadas se intercambiaron con amortiguador usando filtros de centrifugado de corte de 10 kDa. Las muestras de proteína se redujeron, alquilaron, digirieron con tripsina y se desalaron. Además, una muestra de referencia de plasma (mezcla de individuos sanos) se etiquetó con 18O y finalmente se enriqueció en cada muestra de cohorte (1:1) antes del análisis LC-MRM/MS.
C.2. Traducción de listas de biomarcadores a listas de transición de MRM
Las listas de transición de MRM preliminares se generaron por una serie de pasos que incluyeron descargar secuencias de proteínas, digerir proteínas in silico en conjunto con un filtro (por ejemplo, 7-21 aminoácidos, 0 escisión perdida) y seleccionar un mínimo de 4 transiciones por péptido (usualmente carga de precursor z2, carga de producto z1). También se incorporó información útil sobre péptidos proteotípicos de la literatura y repositorios (PeptideAtlas, MRMaid) y la selección de transiciones se respaldó por bibliotecas espectrales (ISB, NIST, GPM, BiblioSpec). Se usó un software de código abierto llamado Skyline (laboratorio de MacCoss, University of Washington, Seattle, WA, EUA) para generar y refinar transiciones de MRM, así como para analizar datos de transición de MRM.
Una alícuota de 1 ug de digestión en plasma se cargó directamente en una nano columna (Dionex C18, PepMap 100, 3 mm) y los péptidos se eluyeron con un gradiente de 100 minutos de 2-30 % de acetonitrilo (ácido fórmico al 0,1 %) en un 4000 QTrap equipado con una fuente de ionización de nanoelectroaspersión. Se adquirieron un máximo de 200 MRM por corrida con un tiempo de permanencia de 20 ms y un ciclo de 5 s. Se analizaron las corridas (es decir, se eliminaron los péptidos sin transiciones razonables) y se sometió una lista refinada de péptidos y transiciones a un experimento MS/MS acticado por MRM para validar la asignación de péptidos. Puesto que la asignación de péptidos para proteínas de baja abundancia es una tarea bastante desafiante sin normas, la configuración de escaneo de iones de producto (EPI) varió, por ejemplo, velocidad de escaneo (1000-4000), el tiempo de llenado LIT (20-300 ms). Las dos transiciones más intensas por péptido se seleccionaron para validación y se enviaron para MS/MS (intervalo de masa 200-1200) cuando una transición excedió un umbral de 1000 cps. En total se usaron 40 MRM por corrida con un tiempo de permanencia de 20 ms y un ciclo de ~7 s. Los datos de MS/MS adquiridos se buscaron contra una base de datos actual de SwissProt con filtro de taxonomía humana usando MASCOTA. Los péptidos identificados se emparejaron contra los datos de MRM (secuencia peptídica, tiempo de retención). Finalmente, los péptidos validados se probaron para su idoneidad para usarse con el método de etiquetado de MRM 18O. La lista de transición final para cada estudio de cohorte consistió de 1-2 péptidos (ver tabla 3) por proteína candidata (ver tabla 1) y 3 transiciones por péptido. Si es posible, se excluyeron las secuencias peptídicas que no fueron únicas para la proteína candidata y los péptidos con aminoácidos M, W, Q o E N-terminal, etc.
Tabla 3
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C.3. Análisis instrumental
Todas las muestras se reconstituyeron y enriquecieron 1:1 con un plasma de referencia etiquetado con 18O (mezcla de individuos sanos) antes del análisis LC-MRM/MS para corregir la eficiencia de aspersión y las diferencias de ionización entre corridas. Cada muestra se inyectó por duplicado directamente en una nano columna (Dionex C18, PepMap 100, 3 mm) y los péptidos se eluyeron en un gradiente de 100 minutos de 2-30 % de acetonitrilo (ácido fórmico al 0,1 %) en un 4000 QTrap equipado con una fuente de ionización de nanoelectroaspersión. La opción MRM programada se usó para todas las adquisiciones de datos con un tiempo de escaneo objetivo de 4 s (al menos 8 puntos de datos a través de un pico) y una ventana de detección de MRM de 6-8 minutos que dio por resultado tiempos de permanencia mínimos de 50­ 60 ms.
C. 4. Análisis de datos
Todas las transiciones se integraron y para cada péptido se calculó una relación (ponderada) del área del péptido no etiquetado con respecto al área del péptido etiquetado. Las relaciones se normalizaron para las diferencias basadas en población con base en un conjunto invariable de proteínas. Finalmente, se aplicó una prueba de Mann-Whitney para datos no paramétricos a las relaciones normalizadas y se calculó un valor p, que define una proteína como expresada de manera significativamente diferente entre dos grupos de sujetos, por ejemplo, sano versus enfermo.
La sensibilidad, o tasa positiva verdadera versus tasa positiva falsa (curvas de características operativas relativas) también se graficaron para un intervalo de marcadores (de una variable y de múltiples variables). Se usaron varias transformaciones estadísticas para mejorar la potencia, incluido un logaritmo natural (in), inversa (inv) y raíz cuadrada (V).
2. Resultados
D. Biomarcadores
D1. Biomarcadores de nefropatía diabética en pacientes diabéticos
La tabla en la figura 1 muestra datos de proteínas de biomarcador de los estudios de diabetes tanto de Busselton como de Fremantle con respecto a la presencia de nefropatía diabética donde todos los sujetos tuvieron diabetes. La pregunta que se aborda es ¿Cuáles son los biomarcadores para nefropatía diabética en pacientes diabéticos?
Los resultados de la tabla en la figura 1 se ilustran como gráficas de cajas y bigotes en la figura 2 (estudio FDS1), figura 3 (estudio FDS2) y figura 4 (estudio BDS). Para cada candidato de biomarcador, se midieron uno a dos péptidos característicos por proteína por MRM. (Diagrama de caja izquierdo: grupo diabético; diagrama de caja derecho: grupo diabético con nefropatía severa; eje x: proteína/péptido; eje y: relación de abundancia relativa).
Los datos de ROC en las tablas 4-8 ilustran adicionalmente que el o los biomarcadores se pueden usar como un diagnóstico para nefropatía diabética.
Tabla 4 Análisis de una variable
Figure imgf000019_0001
_____ _____
Tabla 5 Análisis de múlti les variables modelo 3
Figure imgf000019_0002
_____ _____
Tabla 6 Análisis de múlti les variables modelo FDS1
Figure imgf000019_0003

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para valorar un sujeto para enfermedad renal, donde este sujeto es un sujeto prediabético, o este sujeto tiene diabetes, donde este sujeto tiene albuminuria, que comprende medir al menos un biomarcador en una muestra del sujeto, donde el al menos un biomarcador es tipo antígeno CD5.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el al menos un biomarcador comprende además al menos dos de los biomarcadores en la tabla 1.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el al menos un biomarcador comprende además al menos tres de los biomarcadores en la tabla 1.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el al menos un biomarcador comprende además al menos cuatro de los biomarcadores en la tabla 1.
5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el paso para medir al menos un biomarcador en una muestra del sujeto comprende detectar un fragmento de péptido de este al menos un biomarcador.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, donde los biomarcadores se miden usando espectrometría de masas y el fragmento de péptido es un fragmento de péptido de 5-25 aminoácidos.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, donde el fragmento de péptido se selecciona del grupo que comprende SEQ ID NO: 4, 5.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde este fragmento de péptido se detecta usando espectrometría de masas.
9. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el sujeto es asintomático o solo exhibe indicadores no específicos de enfermedad renal.
10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde el sujeto tiene microalbuminuria, macroalbuminuria o enfermedad renal de etapa terminal.
11. El método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, donde la muestra comprende una muestra de sangre.
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