ES2928879T3

ES2928879T3 - Linfocitos citolíticos naturales

Info

Publication number: ES2928879T3
Application number: ES18710125T
Authority: ES
Inventors: Hugh J M Brady; Matthew Fuchter
Original assignee: Imperial College Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2022-11-23
Anticipated expiration: 2038-03-02
Also published as: US20190381102A1; JP7225107B2; JP2020510431A; EP4137563A1; US20230330145A1; US11559547B2; DK3589728T3; GB201703476D0; US12496298B2; PT3589728T; EP3589728B1; WO2018158587A1; EP3589728A1; JP2023025190A

Abstract

Esta invención se refiere a poblaciones de células asesinas naturales (NK), a métodos para producir las mismas y aplicaciones terapéuticas de las mismas. Más específicamente, la invención se refiere a la expansión de células NK aumentando la expresión de factores de transcripción específicos asociados con la producción de células NK. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Linfocitos citolíticos naturales

Campo de la invención

[0001] Esta invención se refiere a poblaciones de linfocitos citolíticos naturales (NK, por sus siglas en inglés) expandidas y a procedimientos para producir las mismas. También se describen aplicaciones terapéuticas. Más específicamente, la invención se refiere a la expansión de linfocitos NK mediante el aumento de la expresión de factores de transcripción específicos asociados con la producción de linfocitos NK.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Ha habido un aumento en el interés en los linfocitos citolíticos naturales (NK), ya que son citotóxicos contra células cancerosas, infectadas por patógenos y dañadas de otro modo. Los linfocitos NK son células linfoides innatas (ILCs, por sus siglas en inglés), específicamente linfocitos citotóxicos granulares grandes que unen los brazos innato y adaptativo de la respuesta inmunitaria. Constituyen el 10-15% de los linfocitos circulantes en la sangre periférica. Los linfocitos NK también presentan el nivel más alto de actividad citotóxica dentro del sistema inmunitario. Por lo tanto, la alteración de la funcionalidad o el número de linfocitos NK repercute en el funcionamiento del sistema inmunitario frente a la infección y el cáncer. Por ejemplo, un estudio a gran escala en Japón ha demostrado que la reducción de los niveles de linfocitos NK en una cohorte de personas mayores de 40 años está asociada con una incidencia significativamente mayor de cáncer.

[0003] De manera similar a las células B y células T, estos linfocitos NK se derivan de células progenitoras linfoides comunes (CLP, por sus siglas en inglés) que, a su vez, proceden de células madre hematopoyéticas (HSCs, por sus siglas en inglés). Sin embargo, los linfocitos NK son diferentes de las células B y T, ya que carecen de receptores de antígeno de superficie celular específicos. Debido a esto, los linfocitos NK pueden destruir las células cancerosas e infectadas por patógenos sin sensibilización previa, lo que las convierte en parte de la respuesta inmunitaria innata. También tienen un papel crítico en la inmunovigilancia tumoral al influir directamente en la respuesta inmunitaria adaptativa.

[0004] La activación de los linfocitos NK hacen que éstos liberen perforina y gránulos citoplasmáticos que contienen granzimas. La perforina se polimeriza para formar poros en las células diana en presencia de Ca2+. Las granzimas pueden introducirse por estos poros en las células diana, causando la fragmentación del ADN y la apoptosis. Los linfocitos NK también pueden secretar citocinas, que activan la acción de otras células inmunitarias en el brazo adaptativo de la inmunidad.

[0005] Debido a la importancia de los linfocitos NK en la respuesta inmunitaria contra la infección por patógenos y las células cancerosas, múltiples ensayos clínicos han analizado la eficacia de los linfocitos NK en protocolos de transferencia adoptiva. En la transferencia adoptiva, los linfocitos NK aislados de la sangre de los donantes se expanden ex vivo y maduran en linfocitos NK sanos y funcionales antes de la transfusión en los receptores. Sin embargo, para que sea eficaz, es crucial que los donantes de linfocitos NK sean sometidos a un cribado para determinar su genotipo KIR, donde el donante debe tener el polimorfismo alélico KIR apropiado para el receptor para permitir el reconocimiento de células diana para su destrucción. En cualquier caso, los estudios han revelado que los productos expandidos tienen una tasa de éxito clínico inferior a lo esperado, con menos capacidad para destruir células cancerosas o infectadas. Por lo tanto, los actuales protocolos de transferencia adoptiva presentan importantes obstáculos.

[0006] Una estrategia terapéutica alternativa es aumentar la cantidad de linfocitos NK endógenos. Un procedimiento es la administración de citocinas que son esenciales para el desarrollo de linfocitos NK. Se predijo que la administración de IL-2 e IL-15 mejora el desarrollo de linfocitos NK. La IL-2 promueve la proliferación y la citotoxicidad de los linfocitos NK, mientras que la IL-15 promueve el desarrollo y la expansión de los linfocitos NK. Sin embargo, en estudios in vivo, se descubrió que las citocinas solo estimulan una expansión mínima de los linfocitos NK con una semivida reducida, incluso a una dosis muy alta. Además, la administración de citocinas a menudo conduce a toxicidad sistémica debido a la activación inapropiada de las respuestas inmunitarias y a la inducción de la apoptosis de los linfocitos NK.

[0007] Por lo tanto, utilizando procedimientos y técnicas convencionales, es difícil producir un gran número de linfocitos NK, y producir linfocitos NK totalmente funcionales con alta citotoxicidad es aún más difícil. Actualmente no hay ningún fármaco disponible que aumente selectivamente el número de linfocitos NK. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos procedimientos de producción de células NK; tanto ex vivo para producir grandes cantidades de linfocitos NK funcionales para uso terapéutico y de investigación como in vivo.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] Los linfocitos citolíticos naturales (NK) tienen un papel crítico en el sistema inmunitario, donde destruyen las células cancerosas, infectadas por patógenos o dañadas. Se predice que potenciar el número o la funcionalidad de linfocitos NK aumenta la destrucción de estas células. Las terapias existentes, como la transferencia adoptiva de linfocitos NK y la mejora de citocinas de linfocitos NK endógenos, no tienen mucho éxito en términos de su eficacia.

[0009] Los linfocitos NK se diferencian de las HSC en la médula ósea y se distribuyen a través de tejidos linfoides y no linfoides que incluyen ganglios linfáticos, bazo, sangre periférica, pulmones e hígado. Se necesitan citocinas y factores de transcripción específicos para alentar a las HSC a convertirse en linfocitos NK. Cada citocina y factor de transcripción deben estar presentes en un tiempo y concentración precisos con el fin de impulsar la diferenciación de las HSC en linfocitos NK. Sin embargo, la jerarquía precisa de las citocinas y los factores de transcripción que rigen la maduración de los linfocitos NK aún no se conoce del todo.

[0010] Los presentes inventores han trabajado para identificar fármacos que puedan aumentar el número de linfocitos NK. En particular, los presentes inventores se han centrado en la proteína de unión E4 4 (E4bp4), que también se conoce como Nfil3. La regulación al alza de E4bp4 es una estrategia prometedora para aumentar la producción de linfocitos NK ya que la sobreexpresión de E4bp4 en HSC mejora en gran medida la producción de linfocitos NK in vitro. Sin embargo, los factores de transcripción pueden ser difíciles de convertir en fármacos debido a su estructura y función. Por ejemplo, por lo general, carecen de actividad enzimática o sitios de unión a cofactores. Los presentes inventores han demostrado por vez primera que la inhibición de la acción de REV-ERB aumenta la producción de linfocitos NK. Con más detalle, los inventores han descubierto que la inhibición de la acción de REV-ERB aumenta la expresión de E4bp4, lo que a su vez aumenta la producción de linfocitos NK. En particular, los presentes inventores han demostrado que un antagonista de REV-ERB, SR8278, aumenta la expresión de E4bp4 y, con ello, la producción de linfocitos NK.

[0011] Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para expandir una población de linfocitos NK, que comprende las etapas de: a) cultivar una célula progenitora hematopoyética (HPC, por sus siglas en inglés) que comprende una muestra obtenida de un paciente; b) poner en contacto dicha muestra con un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB; y c) expandir dichas células in vitro para producir una población de linfocitos NK.

[0012] Dicho compuesto puede aumentar la expresión de E4bp4 al disminuir la actividad de REV-ERB. Típicamente, dicho compuesto disminuye la actividad de REV-ERB-a y/o REV-ERB-p. Preferentemente, dicho compuesto disminuye la actividad de REVERB-a y REV-ERB-p. En algunas realizaciones, dicho compuesto es un antagonista de REV-ERB, preferentemente un antagonista de REV-ERB-a y REV-ERB-p. Dicho compuesto se puede seleccionar de entre una molécula pequeña, un reactivo PROTAC, un ARN bicatenario (ARNbc), un ^aRⁿde interferencia pequeña (ARNip), un ARN de horquilla pequeña (ARNhp), un microARN, un ARN antisentido, un aptámero, un anticuerpo, una ribozima, un péptido o un peptidomimético. En algunas realizaciones preferidas, dicho compuesto es una molécula pequeña, por ejemplo, SR8278, ARN5187, 2-(5-metilfuran-2-carbonil)-1,2,3,4-tetrahidroiso-quinolina-3-carboxilato de etilo, 4-((4-clorobencil)((5-nitrotiofen-2-il)metil)amino)-N-fenilpiperidin-1-carboxamida, 4-(((1-(4-fluorofenil)ciclopentil)amino)metil)-2-((4-metilpiperazin-1-il)metil)fenol, 1-(2-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina o 1-(4-fluorofenil)-N-(3-(1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina, es particularmente preferido SR8278.

[0013] La muestra de HPCs puede obtenerse a partir de médula ósea, sangre del cordón umbilical y/o sangre periférica. En algunas realizaciones, el compuesto se añade dentro de los 2 días de aislar las HPC en la muestra.

[0014] También se describe una población de linfocitos NK expandida obtenida mediante el procedimiento de la invención, donde al menos el 90 % de los linfocitos NK son CD56+ y CD45+, así como una composición que comprende una población de linfocitos NK expandida de la invención y un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0015] También se describe un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB para su uso en un procedimiento de terapia al aumentar la producción de linfocitos citolíticos naturales (NK) en un paciente. Típicamente, dicho compuesto es un compuesto de la invención como se define en esta solicitud. El procedimiento de terapia puede ser un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno seleccionado de entre cáncer, una enfermedad infecciosa (aguda o crónica), una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad o trastorno relacionado con la infertilidad femenina o embarazo. La infección a tratar puede ser una infección viral, una infección bacteriana, una infección por protistos, una infección por hongos y/o una infección por helmintos. En algunas realizaciones, el compuesto para su uso de la invención se usa en combinación con la inmunoterapia mediada por anticuerpos. Dicho compuesto puede estar destinado a administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de la inmunoterapia mediada por anticuerpos. En algunas realizaciones preferidas, dicho compuesto es SR8278, ARN5187, 2-(5-metilfuran-2-carbonil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato de etilo, 4-((4-clorobencil)((5-nitrotiofen-2-il)metil)amino)-N-fenilpiperidin-1-carboxamida, 4-(((1-(4-fluorofenil)ciclopentil)amino)metil)-2-((4-metil-piperazin-1-il)metil)fenol, 1-(2-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina o 1 -(4-fluorofenil)-N-(3-(((l -metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina, siendo particularmente preferido SR8278.

[0016] En esta solicitud, también se describe un procedimiento de tratamiento mediante el aumento de la cantidad de linfocitos NK en un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB. Dicho compuesto puede usarse en combinación con inmunoterapia mediada por anticuerpos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017]

Figura 1: Ruta de desarrollo de linfocitos NK. Los linfocitos NK se diferencian de las células madre hematopoyéticas (HSCs). Los linfocitos NK se desarrollan a partir de HSC en células progenitoras linfoides comunes (CLP), células progenitoras de NK (NKP, por sus siglas en inglés), linfocitos NK inmaduros (iNK, por sus siglas en inglés), linfocitos NK maduros (mNK, por sus siglas en inglés) y finalmente en linfocitos NK convencionales (cNK, por sus siglas en inglés), que circulan en el torrente sanguíneo. Bajo el diagrama de la ruta se encuentran las citocinas y los factores de transcripción que se requieren para el desarrollo de linfocitos NK. La IL-15 es una de las principales citocinas necesarias para el desarrollo de los linfocitos NK. Otros son factores de transcripción necesarios para las transiciones que se muestran en el diagrama.

Figura 2: Cronología del ensayo de desarrollo de linfocitos NK. Las HPC se aislaron y se cultivaron más citocinas Flt3L, IL-7 y SCF. En el Día 2, a continuación, se transfirieron a células estromales OP9 más o menos susceptibles en convertirse en fármacos en medio de cultivo más la citocina IL-15. Los medios de los cultivos se cambiaron en el Día 5 y las células se cosecharon y analizaron en el Día 9.

Figura 3: Las HPC se cultivaron en condiciones de producción de linfocitos NK con la adición de diferentes compuestos farmacológicos en el Día 2. En el Día 9, el porcentaje de linfocitos NK se cuantificó usando citometría de flujo. (A) Gráfico que muestra la producción relativa de linfocitos NK de ratón maduro (NK1.1 CD3') para la adición de D4476 5, 10 y 20 |iM (control positivo), Remodelina y SR8278 en comparación con el control "Sin fármaco". (B) Estrategia de marcación-análisis para citometría de flujo para la identificación de linfocitos NK de ratón. (C) Resultados representativos de citometría de flujo con porcentaje de linfocitos NK mostrados. Los resultados se promediaron de un experimento con seis repeticiones y las barras de error representan la media DT. Los asteriscos indican diferencias significativas de los dos resultados anotados (* es P<0,01) basándose en la prueba de Mann-Whitney.

Figura 4: Las HPC se cultivaron en condiciones de producción de linfocitos NK con la adición de diferentes concentraciones de SR8278. En el Día 9, el porcentaje de linfocitos NK se cuantificó usando citometría de flujo. (A) Gráfico que muestra la producción relativa de linfocitos NK de ratón maduro (NK1.1+CD3') para la adición de SR82782, 5, 10 y 20 |iM en comparación con el control "Sin fármaco". Los resultados se promediaron a partir de tres experimentos independientes con duplicados biológicos y triplicados técnicos y las barras de error representan la media DT. Los asteriscos indican diferencias significativas de los dos resultados anotados (* es P<0,05; es P<0,001) basándose en la prueba de Mann-Whitney. (B) Resultados representativos de citometría de flujo (a modo de ejemplo) con porcentaje de linfocitos NK mostrados.

Figura 5: Las células negativas de linaje (HPCs) se cultivaron en condiciones de producción de linfocitos NK con la adición de SR8278 5 o 10 |iM el Día 0, 1, 2, 3 o 4. En el Día 9, el porcentaje de linfocitos NK se cuantificó usando citometría de flujo. (A) Gráfico que muestra la producción relativa de linfocitos NK de ratón maduro (NK1.1 CD3-) cuando se añadió SR82785 y 10 |iM en diferentes días en comparación con el control "Sin fármaco". (B) Resultados representativos de citometría de flujo con porcentaje de linfocitos NK mostrados. La adición de SR8278 5 |iM se muestra en la parte superior, mientras que la adición de SR8278 10 |iM se muestra en la parte inferior. (C) El gráfico muestra el número de células vivas cuando se añadió SR8278 5 y 10 |iM en días diferentes. Los resultados se promediaron a partir de dos experimentos con cuatro repeticiones cada uno y las barras de error representan la media DT. Los asteriscos indican diferencias significativas de los dos resultados anotados (* es P<0,01, *** es P<0,0001 y es P<0,00001) basándose en la prueba de Mann-Whitney.

Figura 6: Las HPC se cultivaron en condiciones de producción de linfocitos NK con la adición de diferentes concentraciones de GSK4112. En el Día 9, el porcentaje de linfocitos NK se cuantificó usando citometría de flujo. (A) Gráfico que muestra la producción relativa de linfocitos NK de ratón maduro (NK1.1+ CD3-) para la adición de GSK4112 2, 5, 10 y 20 |iM en comparación con el control "Sin fármaco". (B) Resultados representativos de citometría de flujo con porcentaje de linfocitos NK mostrados. Los resultados se promediaron a partir de dos experimentos con cuatro repeticiones cada uno y las barras de error representan la media DT. Los asteriscos indican diferencias significativas de los dos resultados anotados (* es P<0,01 y *** es P<0,0001) basándose en la prueba de Mann-Whitney.

Figura 7: Las HPCs aisladas de ratones de tipo salvaje (WT), con genes inactivados E4bp4 (KO) o heterocigotos (Het) fueron cultivadas con la adición de SR82785 o 10 |iM. En el Día 9, el porcentaje de linfocitos NK se cuantificó usando citometría de flujo. Gráfico que muestra la producción relativa de linfocitos NK de ratón maduro (NK1.1 CD3') en comparación con el control "sin fármaco" en experimentos con ratones (A) WT, (B) Het y (C) E4bp4 KO. (D) Resultados representativos de citometría de flujo con porcentaje de linfocitos NK mostrados para la adición de SR827810 |iM. Los resultados se promediaron a partir de dos experimentos con cuatro repeticiones cada uno y las barras de error representan la media DT. Los asteriscos indican diferencias significativas de los dos resultados anotados (* es P<0,01 y " es P<0,001) basándose en la prueba de Mann-Whitney.

Figura 8: Las HPC se cultivaron con o sin SR82785 |iM añadido el Día 2. En los Días 3, 4 y 5, se recolectaron células con el fin de cuantificar sus expresiones de citocinas relativas mediante RT-qPCR. Las gráficas muestran la expresión relativa de (A) E4bp4, (B) Id2 y (C) Eomes normalizados respecto al gen constitutivo, Hprt.

Figura 9: Las células CD34+ humanas se cultivaron con la adición de SR82785 |iM en el Día 4. En los Días 14 y 16, el porcentaje de células hCD56+ hCD45+ (marcadores para linfocitos NK humanos) se cuantificó usando citometría de flujo. (A) Gráfico que muestra el porcentaje de células hCD56+ hCD45+ en comparación con el control "Sin fármaco" en diferentes condiciones. (B) Estrategia de marcación-análisis para citometría de flujo para la identificación de linfocitos NK humanos. (C) Resultados representativos de citometría de flujo con porcentaje de linfocitos NK mostrados. Los resultados se promediaron a partir de un experimento con seis repeticiones cada uno y las barras de error representan la media DT.

Figura 10: (A) Estrategia de marcación-análisis para citometría de flujo para la identificación de preNKPs y rNKPs en la médula ósea de ratones WT (Parte superior) y REV-ERB-a KO (Parte inferior). El porcentaje de población seleccionada se muestra en cada gráfico de citometría de flujo (B) Resultados de citometría de flujo con porcentaje de linfocitos NK mostrados para la identificación de linfocitos NK de ratón en médula ósea (BM, por sus siglas en inglés) y bazo de ratones WT y REV-ERB-a KO. Los resultados se obtuvieron mediante el uso de la estrategia de marcación-análisis en la Figura 3B.

Figura 11: (A) Estrategia de marcación-análisis para citometría de flujo para la identificación de preNKPs y rNKPs en la médula ósea de ratones WT (Parte superior) y REV-ERB-a y REV-ERB-p doble KO (Parte inferior). El porcentaje de población seleccionada se muestra en cada gráfico de citometría de flujo. (B) Análisis de médula ósea de ratones REV-ERB-a/p doble KO. DKO = ratones con genes REV-ERB-a y -p eliminados, aHet/pHet= ratones con solo un alelo de cada gen REV-ERB eliminado y pKO = ratones con el gen REV-ERB-p eliminado. N=2 para cada punto de datos. LMPP = células progenitoras pluripotentes linfoides-mieloides, ^cL^p= células progenitoras linfoides comunes y NKP = células progenitoras de linfocitos NK. El eje y indica que estas cantidades celulares se representan como porcentaje de la población celular total de médula ósea de linaje negativo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Linfocitos citolíticos naturales

[0018] Los linfocitos citolíticos naturales (NK) presentan el nivel más alto de actividad citotóxica dentro del sistema inmunitario. Los linfocitos NK son similares a las células B y células T, pero carecen de receptores de antígeno de superficie celular específicos. En cambio, los linfocitos NK tienen receptores activadores e inhibidores que reconocen motivos.

[0019] Los linfocitos NK circulan en la sangre y en los órganos linfoides periféricos, como los ganglios linfáticos y el bazo. Pueden activarse por citocinas o al encontrar células diana. El reconocimiento y la eliminación de las células diana se basa en el equilibrio entre las señales inhibidoras y activadoras. Las señales activadoras son generadas por receptores activadores (NKG2D, NKp46, NKp3o) que se unen a ligandos, que pueden estar presentes no solo en células cancerosas, infectadas por patógenos y dañadas, sino también en células sanas. Por otro lado, las señales inhibidoras se generan cuando los receptores inhibidores (KIR, CD94/NKG2A) en linfocitos NK se unen a moléculas del complejo de histocompatabilidad mayor (MHC, por sus siglas en inglés) clase I que normalmente están presentes en todas las células sanas. Las moléculas del MHC clase I en las células diana están ausentes o muy reguladas por disminución, lo que las convierte en dianas de linfocitos NK ideales. Esto permitió que los linfocitos NK distinguieran entre células diana y células sanas. Para que los linfocitos NK reconozcan y destruyan las células diana, las señales activadoras generales deben ser mayores que las señales inhibidoras.

[0020] Los linfocitos NK reconocen y destruyen células cancerosas, infectadas por patógenos y dañadas sin sensibilización previa, lo que los convierte en parte de la respuesta inmunitaria innata. Por ejemplo, los linfocitos NK proporcionan una respuesta temprana a la infección por virus, que se produce antes de que las células T destruyan las células infectadas. Los linfocitos NK pueden destruir las células diana en cuestión de minutos. Los linfocitos NK también secretan citocinas y "arman" otras partes del sistema inmunitario. Por ejemplo, los linfocitos NK promueven la función efectora de linfocitos T y mejoran la citotoxicidad celular dirigida por anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés).

[0021] Los linfocitos NK se diferencian de las células madre hematopoyéticas (HSCs) a través de la ruta establecida en la Figura 1. Más detalladamente, los linfocitos NK se desarrollan a partir de HSCs en células progenitoras linfoides comunes (CLP), células progenitoras de pre-NK (pre-NKP), células progenitoras de NK (NKP), linfocitos NK inmaduros (iNK), linfocitos NK maduros (mNK) y finalmente en linfocitos NK convencionales (cNK), que circulan en el torrente sanguíneo. Aunque esta terminología se deriva del desarrollo de los linfocitos NK en los ratones, en el desarrollo de los linfocitos NK humanos se produce una ruta correspondiente. Por ejemplo, las HSC se desarrollan a través de múltiples fases de precursores (fases 1, 2 y 3), antes de convertirse en linfocitos NK maduros (fases 4 y 5). Para mayor coherencia, en esta solicitud se usan células HSC, CLP, preNKP, NKP, iNK, mNK, cNK y NK de referencia. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, estos términos son intercambiables con las fases 1 a 5 de la nomenclatura humana. Bajo el diagrama de la ruta de la Figura 1 se encuentran las citocinas y los factores de transcripción que son esenciales para el desarrollo de linfocitos NK. La IL-15 es una de las principales citocinas necesarias para el desarrollo de los linfocitos NK. Otros factores extrínsecos, como las células estromales específicas, también son necesarios para el desarrollo y la maduración de los linfocitos NK. Según la presente invención, las células progenitoras hematopoyéticas (HPCs) son una población heterogénea que contiene progenitores multipotenciales tales como HSCs, CLPs y también NKPs. Las HPC se denominan células negativas de linaje, ya que aún no se han comprometido con una ruta de desarrollo. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, las HSC, las células CLP y las células NKP son todas HPCs y una referencia a HPCs es una referencia a cualquiera de las HSCs, células CLP y/o células CLP, o cualquier combinación de estas, a menos que se indique explícitamente lo contrario.

[0022] Debido a la importancia de los linfocitos NK en la respuesta inmunitaria, múltiples ensayos clínicos han analizado la eficacia de los linfocitos NK en protocolos de transferencia adoptiva. Típicamente se trata de una transferencia alogénica, con los linfocitos NK aislados de un donante sano y expandidos. Sin embargo, la regulación por disminución de las moléculas de MHC clase I en las células diana es parcial y el genotipo KIR de donantes y receptores puede ser similar. Debido a esto, los linfocitos NK transfundidos a los receptores, incluso de diferentes individuos, pueden no unirse a las células diana si sus KIR reconocen moléculas MHC clase I. Por lo tanto, es crucial que los donantes de linfocitos NK se sometan a un cribado para determinar su genotipo KIR, donde el donante debe tener el polimorfismo alélico KIR apropiado para el receptor para permitir el reconocimiento de células diana para su destrucción. Por otra parte, se descubrió que los productos expandidos tenían una tasa de éxito clínico más baja de lo esperado, con menos capacidad para destruir células cancerosas o infectadas.

[0023] Un linfocito NK se puede definir en términos de su expresión marcadora, su función/actividad o una combinación de las mismas. Dichas definiciones son estándares en la técnica y se conocen procedimientos mediante los cuales se puede evaluar la expresión del marcador y/o la actividad de los linfocitos NK. Por lo tanto, un experto en la materia sería capaz de clasificar fácilmente una célula como un linfocito NK usando metodología y definiciones convencionales.

[0024] Por ejemplo, las células mNK y cNK pueden reconocerse por su expresión de los marcadores de superficie CD16 (FcyRiIi) y/o CD56, típicamente CD16 y CD56 en humanos, y NK1.1 o NK1.2 en algunas cepas de ratones. NKp46 es otro marcador para células mNK y cNK, y se expresa en humanos y varias cepas de ratones. Por lo tanto, NKp46 se puede usar como marcador para linfocitos NK con o sin CD16 y/o CD56 (en humanos) o con o sin NK1.1 o NK1.2 (en ratones). Otros ejemplos de marcadores que se pueden usar para identificar/definir linfocitos NK según la presente invención incluyen Ly49, receptores de citotoxicidad natural (NCRs, por sus siglas en inglés), CD94, NKG2, receptores similares a inmunoglobulinas de linfocitos citolíticos (KIR, por sus siglas en inglés) y/o receptores inhibidores de leucocitos (ILT o LIR, por sus siglas en inglés), o cualquier combinación de estos, incluso en combinación con CD16 y/o CD56 (en humanos) o NK1.1/NK1.2 (en ratones). En algunas realizaciones preferidas, los linfocitos NK maduros según la invención (es decir, células mNK y cNK) son CD56+ y CD45+, y también pueden ser CD16+. Como se usa en esta solicitud, el término linfocito NK humano maduro comprende linfocitos NK que son CD56brillante (fase 4) y CD56tenue (fase 5), los cuales son CD56+. Los linfocitos NK maduros también se pueden definir por la ausencia de marcadores, tales como CD34, y marcadores de linfocitos CD3 y/o CD19. Por lo tanto, los linfocitos NK maduros de la invención pueden ser CD56+, CD45+, CD16+, CD3- y/o CDl9-, o cualquier combinación de los mismos, tal como CD56+, CD45+, CD16+, CD3- y CD19-.

[0025] Además o alternativamente, un NK puede ser identificado por/definido en términos de su actividad. Por ejemplo, un linfocito NK puede identificarse/definirse mediante la presencia de gránulos citolíticos dentro de su citoplasma, mediante su capacidad para secretar moléculas antimicrobianas tales como a-defensinas, y/o su mediante su capacidad para secretar citocinas tales como TNF-a, IL-10, IFN-^yy TFG-p.

[0026] A menos que se indique lo contrario en esta solicitud, una referencia a linfocitos NK incluye una referencia a células iNK, mNK y cNK. Las HSC, células CLP y NKPs se denominarán típicamente como tales.

Poblaciones de linfocitos NK expandidas

[0027] Tal como se describe en esta solicitud, la invención proporciona procedimientos para generar una población expandida de linfocitos NK (a los que se hace referencia indistintamente en esta solicitud como una población de linfocitos NK expandida o una población de linfocitos NK). Cualquiera de la descripción en esta solicitud en relación con los linfocitos NK de la presente invención también se puede aplicar a una población de linfocitos NK expandida de la invención.

[0028] Típicamente, una población de linfocitos NK expandida producida por un procedimiento de la invención comprende células iNK, células mNK y/o células cNK, o una combinación de las mismas. Dicha población puede comprender HPCs, tales como HSCs, células CLP y/o NKPs, o una combinación de las mismas, aunque la cantidad de dichas células es típicamente baja con respecto a la cantidad de linfocitos NK, ya que la mayoría de estas HPC se han diferenciado en linfocitos NK en la población. Dicha población puede comprender otras células inmunitarias y/o no inmunitarias. De nuevo, el número de cualquiera de dichas células es típicamente bajo con respecto al número de linfocitos NK presentes en la población.

[0029] Como ejemplo no limitativo, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más, hasta el 100 % de las células de una población de linfocitos NK expandida pueden ser linfocitos NK. Típicamente, al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 % de las células de una población de linfocitos NK expandida son linfocitos NK.

[0030] Al menos el 60 %, al menos el 70%, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más, hasta el 100 % de las células de una población de linfocitos NK expandida producidas mediante un procedimiento de la invención son linfocitos NK maduros (es decir, células mNK y/o células cNK). Preferentemente, al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 % e incluso más preferentemente al menos el 95%, incluso más preferentemente al menos el 98% o más de las células de una población de linfocitos NK expandida son linfocitos NK maduros.

[0031] La cantidad de HPCs (que incluyen HSCs, células CLP y/o NKPs) puede ser inferior a 40 %, inferior a 30 %, inferior a 25 %, inferior a 20 %, inferior a 15 %, inferior a 14 %, inferior a 13 %, inferior a 12 %, inferior a 11 %, inferior a 10 %, inferior a 9 %, inferior a 8 %, inferior a 7 %, inferior a 6 %, inferior a 5 %, inferior a 4 %, inferior a 3 %, inferior a 2 %, inferior a 1 % de las células de la población de linfocitos NK expandida. Típicamente, el número de HPCs (que incluye HSCs, células CLP y/o NKPs) es inferior al 20%, preferentemente inferior al 10%, más preferentemente inferior al 5 %, incluso más preferentemente inferior al 2 % o inferior de las células de la población de linfocitos NK expandida.

[0032] El número de otras células inmunitarias y/o no inmunitarias puede ser inferior al 40 %, inferior al 30 %, inferior al 25 %, inferior al 20 %, inferior al 15 %, inferior al 14 %, inferior al 13 %, inferior al 12 %, inferior al 11 %, inferior al 10 %, inferior al 9 %, inferior al 8 %, inferior al 7 %, inferior al 6 %, inferior al 5 %, inferior al 4 %, inferior al 3 %, inferior al 2 %, inferior al 1 % de las células de la población de linfocitos NK expandida. Típicamente, el número de otras células inmunitarias y/o no inmunitarias es inferior al 20%, preferentemente inferior al 10%, más preferentemente inferior al 5 % de las células, incluso más preferentemente inferior al 2 %, o inferior a la población de linfocitos NK expandida.

[0033] Tal como se describe en esta solicitud, las poblaciones de linfocitos NK expandida preparadas mediante los procedimientos de la presente invención ofrecen varias ventajas sobre las poblaciones de linfocitos NK preparadas mediante procedimientos de transferencia adoptiva convencionales. En particular, los procedimientos de la presente invención permiten la producción de poblaciones expandidas con mayor número de linfocitos NK en comparación con los procedimientos convencionales. Además, una mayor proporción de los linfocitos NK en una población de la invención son funcionales, preferentemente, completamente funcionales, en comparación con las poblaciones obtenidas mediante procedimientos convencionales, en las cuales un gran número de los linfocitos NK son "agotados".

[0034] Como se usa en esta solicitud, el término "agotado" en el contexto de los linfocitos NK significa que una población de linfocitos NK o linfocitos NK expandida ha perdido al menos algunas de sus funciones efectoras, tales como función citotóxica, producción de citocinas y/o ADCC. Por lo tanto, una población de linfocitos NK agotados o de linfocitos NK expandida puede presentar una supervivencia alterada, una función citotóxica alterada, una producción de citocinas alterada o modificada y/o una ADCC alterada. Por ejemplo, una población de linfocitos NK agotados o de linfocitos NK agotados puede presentar al menos una reducción del 50 % en una de sus funciones efectoras. Por ejemplo, al menos una reducción del 50 % en la secreción de citocinas, al menos una reducción del 50 % en ADCC y/o al menos una reducción del 50 % en la actividad citotóxica. Estos valores se pueden cuantificar con respecto a cualquier control apropiado como se define en esta solicitud. Se puede usar cualquier técnica apropiada para determinar la función efectora y, por lo tanto, para cuantificar y reducir la misma. Dichas técnicas son conocidas en la técnica. De manera alternativa y/o adicional, los linfocitos ⁿK agotados pueden presentar una expresión marcadora modificada, tal como un aumento en la expresión de uno o más receptores inhibidores (como se describe en esta solicitud) y/o una disminución en la expresión de uno o más receptores activadores (como se describe en esta solicitud). En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de NKG2A y/o Tim3 se puede usar como un marcador para el agotamiento de linfocitos NK. De nuevo, la expresión de estos marcadores se puede cuantificar con respecto a cualquier control apropiado como se define en esta solicitud.

[0035] Por el contrario, los términos "funcional" y "completamente funcional" en el contexto de los linfocitos NK significan que una población de linfocitos NK o linfocitos NK expandida tiene todas las funciones efectoras esperadas cuando responde a una exposición inmunitaria dada. Por lo tanto, un linfocito NK (completamente) funcional o una población de linfocitos NK expandida presentará típicamente una función citotóxica, producción de citocinas y/o ADCC como se observaría in vivo cuando los linfocitos n K se activan en respuesta a una exposición inmunitario, y presentará típicamente una supervivencia mejorada en comparación con los linfocitos NK producidos usando procedimientos convencionales. De manera alternativa y/o adicional, los linfocitos NK (completamente) funcionales pueden presentar una expresión marcadora modificada, tal como un aumento en la expresión de uno o más receptores activadores (como se describe en esta solicitud) y/o una disminución en la expresión de uno o más receptores inhibidores (como se describe en esta solicitud). Como ejemplo no limitativo, un linfocito NK humano funcional (maduro) puede ser CD56+ y/o CD45+, preferentemente tanto CD56+ como CD45+.

[0036] Como ejemplo no limitativo, la citotoxicidad de los linfocitos NK se puede determinar mediante el uso de un ensayo de degranulación en linfocitos NK coincubados con "células diana". Un ensayo de degranulación implica analizar la expresión de CD107a dentro de la población de linfocitos NK. La cantidad de CD107a se correlaciona con la secreción de citocinas y la lisis mediada por linfocitos NK de células diana. Los linfocitos NK también se pueden analizar para la expresión de interferón-y (IFN-y), que es la principal citocina secretada cuando se activan los linfocitos NK funcionales. Los linfocitos NK que son funcionales deben expresar CD107a similar o superior, así como IFN-^yen comparación con un control.

[0037] Cualquier aumento en el número/funcionalidad de linfocitos NK en una población de linfocitos NK expandida preparada mediante un procedimiento de la presente invención se puede comparar con el número/función de linfocitos NK de una población de linfocitos NK obtenida a partir de un procedimiento de control como se describe en esta solicitud. Un procedimiento de control puede ser cualquier procedimiento estándar conocido en la técnica para producir poblaciones de linfocitos NK. Por ejemplo, un procedimiento de control puede usar técnicas de transferencia adoptiva convencionales, en lugar de un procedimiento que usa un inhibidor de REV-ERB según la presente invención. Los linfocitos NK y las poblaciones de linfocitos NK producidas por dichos procedimientos de control/convencionales se pueden usar como células y poblaciones de control como se describe en esta solicitud.

[0038] Ya que una población de linfocitos NK expandida preparada mediante un procedimiento de la presente invención comprende significativamente menos linfocitos NK agotados en comparación con las poblaciones de linfocitos NK preparadas convencionalmente, pero en cambio contiene una mayor proporción de linfocitos NK completamente funcionales, esto permite ventajosamente el uso de cantidades más pequeñas de células para tratar pacientes.

[0039] Tal como se describe en esta solicitud, los procedimientos de la invención producen poblaciones de linfocitos NK expandida con una mayor proporción de linfocitos NK (completamente) funcionales en comparación con los procedimientos convencionales, que producen poblaciones con grandes cantidades de linfocitos ⁿK "agotados". Típicamente, en una población de linfocitos NK expandida de la invención al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más, hasta el 100% de los linfocitos NK de una población de linfocitos NK expandida de la invención son (completamente) funcionales. Típicamente, al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 %, incluso más preferentemente al menos el 98 % o más de los linfocitos NK de una población de linfocitos NK expandida de la invención son completamente funcionales, según cualquier definición (por ejemplo, definición de función marcadora y/o efectora) en esta solicitud.

[0040] Se puede producir una población de linfocitos NK expandida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en esta solicitud. Típicamente, se produce una población de linfocitos NK expandida mediante un procedimiento ex vivo como se describe en esta invención.

E4bp4

[0041] E4bp4 (también conocido como Nfil3) es un factor de transcripción de proteína de cremallera de leucina básica que participa en la regulación de la expresión de IL-3, y participa en la coordinación del reloj circadiano. La secuencia de ADN genómico del gen E4bp4 humano se proporciona en la SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso a Genbank X64318, versión X64318.1). Como se muestra en la Figura 1, E4bp4 se expresa en CLPs y es fundamental en la producción de linfocitos NK a partir de progenitores de células madre sanguíneas. Los ratones con el gen E4bp4 eliminado no tienen linfocitos NK funcionales, pero tienen números normales de células T y B. Por el contrario, la sobreexpresión de E4bp4 en HSCs in vitro aumenta la producción de linfocitos NK. Por lo tanto, E4bp4 es un factor de compromiso de linaje, que controla el desarrollo de NKPs a partir de HSCs (Figura 1). La función crítica de E4bp4 en linfocitos NK es específica para las primeras fases de la ruta de desarrollo, ya que la ablación específica de E4bp4 en células mNK periféricas no afecta al número de linfocitos NK ni a la respuesta a la infección por citomegalovirus. Asimismo, E4bp4 regula otros factores de transcripción que son esenciales en el desarrollo de linfocitos NK, tales como Id2 y Eomes.

[0042] Aunque se ha demostrado que IL-7 e IL-15 regulan la expresión de E4bp4, generalmente se sabe muy poco sobre cómo los estímulos extrínsecos o intrínsecos influyen en E4bp4. Los factores de transcripción como E4bp4 pueden ser difíciles de dirigir debido a su estructura y función. Por ejemplo, por lo general, carecen de actividad enzimática o sitios de unión a cofactores. Sin embargo, como se demuestra en los Ejemplos en esta solicitud, los presentes inventores han descubierto que la expresión de E4bp4 se puede aumentar usando un compuesto que inhibe la actividad de REV-ERB. Además, los presentes inventores han demostrado que el uso de un inhibidor de REV-ERB para aumentar la expresión de E4bp4 da como resultado un aumento en el número de linfocitos NK. Sin desear quedar limitado a la teoría, el REV-ERB se une a la porfirina hemo, y es esta característica la que se cree que hace que el REV-ERB sea una diana susceptible de convertirse en fármacos (véase más adelante). En resumen, los inventores han demostrado que al dirigirse a REV-ERB e inhibir su actividad, es posible aumentar la expresión de E4bp4 y, por ello, aumentar el número de linfocitos NK. Por consiguiente, la presente invención hace referencia a compuestos que inhiben la acción de REV-ERB y su uso para aumentar la expresión de E4bp4 y, por ello, el número de linfocitos NK.

Aumento de la expresión de E4bp4

[0043] Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos ex vivo para producir poblaciones de linfocitos NK expandidas, y procedimientos terapéuticos y aplicaciones para aumentar el número de linfocitos NK en un paciente que lo necesite. Tal como se describe en esta solicitud, dichos procedimientos y aplicaciones implican el uso de un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB. Típicamente, dichos compuestos actúan aumentando la expresión de E4bp4.

[0044] Un aumento de la expresión de E4bp4 se puede medir con respecto a un control. Por lo tanto, la expresión de E4bp4 en una muestra de HPCs, una población de linfocitos NK expandida o en una muestra obtenida de un paciente a tratar según la invención se puede comparar con la expresión de E4bp4 en un control. La expresión puede cuantificarse en términos de expresión génica y/o proteica, y puede compararse con la expresión de un control (por ejemplo, gen constitutivo o proteína). La cantidad real del gen E4bp4, transcrito y/o proteína de ARNm, tal como la masa, cantidad molar, concentración o molaridad del gen E4bp4, transcrito y/o proteína de ARNm, o la cantidad de moléculas de ARNm por célula en una muestra de HPCs, una población de linfocitos NK expandida o en una muestra obtenida de un paciente a tratar según la invención y el control se puede evaluar y comparar con el valor correspondiente del control. De manera alternativa, la expresión del gen y/o proteína E4bp4 en una muestra de HPCs, una población de linfocitos NK expandida o en una muestra obtenida de un paciente a tratar según la invención se puede comparar con la del control sin cuantificar la masa, cantidad molar, concentración o molaridad del uno o más genes y/o proteínas.

[0045] Típicamente, el control es una población o muestra equivalente en la que no se ha realizado ningún aumento de la expresión de E4bp4. Como ejemplo no limitativo, en el caso de que un paciente sea tratado con un compuesto que inhibe la actividad de REV-ERB con el fin de aumentar la expresión de E4bp4, un control adecuado sería un individuo diferente al que no se le ha administrado el compuesto o el mismo individuo antes de la administración del compuesto. Los procedimientos convencionales para la expansión ex vivo de linfocitos NK, incluidos los procedimientos conocidos, pueden considerarse procedimientos de control según la presente invención.

[0046] En el contexto de la presente invención, se puede entender que una referencia al aumento de la expresión de E4bp4 significa que la expresión de E4bp4 aumenta en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 %, al menos el 150 %, al menos el 200 % en comparación con el control. Típicamente, la expresión de E4bp4 aumenta en al menos el 50 %, preferentemente al menos el 70 %, más preferentemente al menos el 80 %, incluso más preferentemente al menos el 90 % o más en comparación con el control.

[0047] Se puede entender que una referencia al aumento de la expresión de E4bp4 significa que la expresión de E4bp4 se incrementa al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2.3 veces, al menos 2,4 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,6 veces, al menos 2,7 veces, al menos 2,8 veces, al menos 2,9 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces o más con respecto a un control. Típicamente, la expresión génica de E4bp4 aumenta al menos 2 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2,3 veces, al menos 2.4 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,6 veces, al menos 2,7 veces, al menos 2,8 veces, al menos 2,9 veces, al menos 3 veces o más en comparación con el control. Típicamente, la expresión de la proteína E4bp4 aumenta al menos 2 veces, al menos 3 veces, preferentemente al menos 5 veces, más preferentemente al menos 6 veces o más en comparación con el control.

[0048] La expresión del gen y/o proteína E4bp4 según la invención se puede determinar mediante análisis cuantitativo y/o cualitativo. Típicamente, la expresión génica se puede expresar en términos de niveles de ARNm.

[0049] El nivel de expresión del gen y/o proteína E4bp4 según la invención abarca la masa del transcrito y/o proteína de ARNm de E4bp4, la cantidad molar del gen, transcrito y/o proteína E4bp4, la concentración del gen y/o proteína E4bp4 y la molaridad del gen y/o proteína E4bp4. Este nivel de expresión podrá indicarse en cualquier unidad apropiada. Por ejemplo, la concentración del gen y/o proteína E4bp4 se puede dar en pg/ml, ng/ml o pg/ml.

[0050] El nivel de expresión del gen y/o proteína E4bp4 según la invención se puede medir directa o indirectamente.

[0051] La expresión relativa del gen y/o proteína E4bp4 según la invención con respecto a un control se puede determinar usando cualquier técnica apropiada. En la técnica se conocen técnicas convencionales adecuadas, por ejemplo, inmunoelectrotransferencia, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) y RT-qPCR.

[0052] El nivel de expresión del gen y/o proteína E4bp4 puede aumentarse en comparación con un control durante al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 30 horas, al menos 36 horas, al menos 42 horas, al menos 48 horas, al menos 54 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana. Preferentemente, el nivel de expresión del gen y/o proteína E4bp4 aumenta durante al menos 12 a 72 horas. Típicamente, esto se evalúa con respecto a la última administración del compuesto que inhibe la actividad de REV-ERB.

[0053] El nivel de expresión del gen y/o proteína E4bp4 puede aumentarse en comparación con un control para al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o más pases de los precursores de linfocitos NK en cultivo. El nivel de expresión del gen y/o proteína E4bp4 puede modificarse indefinidamente.

REV-ERB

[0054] Las proteínas REV-ERB son miembros de la familia de receptores nucleares de factores de transcripción intracelular. La secuencia de ARNm del gen REV-ERB-a humano (Nr1d1) se proporciona en la SEQ ID NO: 3 (N.° de acceso a Genbank NM_021724, versión NM_021724.4). La secuencia de ARNm del gen REV-ERB-p humano (Nrld2) se proporciona en la SEQ ID NO: 5 (N.° de acceso a Genbank AB307693, versión AB307693.1). REV-ERB regula el reloj circadiano, y también participa en la regulación de la descomposición del cartílago. Anteriormente se ha demostrado que los ratones con genes inactivados REV-ERB-a han disminuido el número de células TH17 en comparación con la cepa de ratón de tipo salvaje correspondiente. Sin embargo, el papel de REV-ERB en el desarrollo de linfocitos NK no ha sido investigado previamente.

[0055] El control de la expresión de E4bp4 es un complejo mecanismo de múltiples componentes, que involucra muchos factores de transcripción que se unen a las regiones reguladoras de E4bp4, de las cuales REV-ERB es solo uno. Los presentes inventores han demostrado por vez primera que la inhibición de la actividad de REV-ERB es suficiente para provocar un aumento significativo de la expresión de E4bp4, y que esto, a su vez, produce una expansión de linfocitos NK, lo que resulta en un aumento del número de linfocitos NK. Como se demuestra en los Ejemplos de esta solicitud, los presentes inventores han demostrado por vez primera que la inhibición de la actividad de REV-ERB puede provocar un aumento del número de linfocitos NK, y que típicamente los linfocitos NK resultantes son (completamente) funcionales como se define en esta solicitud. Los inventores han demostrado además que el efecto de la inhibición de REV-ERB está mediado de una manera dependiente de E4pb4. Sin desear quedar limitado a la teoría, se cree que la inhibición de la actividad de REV-ERB da lugar a un aumento de la expresión de E4bp4 (la expresión de E4bp4 normalmente es reprimida por REV-ERB), y que E4bp4 actúa para estimular la producción de linfocitos NK (como se muestra en la Figura 1). En particular, los presentes inventores han demostrado que la molécula pequeña SR8278 es capaz de unirse al resto porfirina hemo de REV-ERB, lo que da lugar a la inhibición de la actividad de REV-ERB y a un aumento del número de linfocitos NK.

[0056] Por consiguiente, la presente invención hace referencia a compuestos que inhiben la acción de REV-ERB y su uso para aumentar la expresión de E4bp4 y, por ello, el número de linfocitos NK.

Inhibición de la actividad de REV-ERB

[0057] La presente invención se refiere al uso de compuestos para inhibir la acción de REV-ERB, es decir, compuestos que inhiben la actividad de REV-ERB. La actividad de REV-REB puede inhibirse por cualquier medio apropiado. En la técnica se conocen técnicas convencionales adecuadas. La inhibición puede tener lugar a través de cualquier mecanismo adecuado, dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza (véase más adelante) del compuesto usado, por ejemplo, interferencia estérica en cualquier interacción o inhibición directa o indirecta de REV-ERB. En el contexto de la presente invención, un inhibidor de REV-ERB (denominado indistintamente en esta solicitud antagonista de REV-ERB) es cualquier compuesto que inhibe, disminuye, suprime o extirpa la acción de REV-ERB, ya sea en parte o completamente.

[0058] Una disminución de la actividad de REV-ERB se puede medir con respecto a un control. Por lo tanto, la actividad de REV-ERB en una muestra de células precursoras o progenitoras de NK, una población de linfocitos NK expandida o en una muestra obtenida de un paciente a tratar según la invención se puede comparar con la actividad de REV-ERB en un control. La actividad se puede cuantificar en cualquier término apropiado, por ejemplo, la unión de REV-ERB al gen E4bp4, o en términos de expresión de E4bp4 como se define en esta invención. Se puede usar cualquier técnica o procedimiento apropiado para cuantificar la actividad de REV-ERB. En la técnica se conocen técnicas adecuadas, por ejemplo, ensayos de luciferasa para cuantificar la expresión de un gen indicador.

[0059] Típicamente, el control es una población o muestra equivalente en la que no se ha añadido ningún compuesto inhibidor de REV-ERB, por ejemplo, una muestra obtenida de un individuo diferente al que no se le ha administrado el compuesto, o el mismo individuo antes de la administración del compuesto. Los procedimientos convencionales para la expansión ex vivo de linfocitos NK, incluidos los procedimientos conocidos, pueden considerarse procedimientos de control según la presente invención.

[0060] En el contexto de la presente invención, se puede entender que una referencia a la inhibición de la actividad de REV-ERB significa que la actividad de REV-ERb disminuye en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, hasta la inhibición total (100 %) de la actividad de REV-ERB, en comparación con el control. Típicamente, la actividad de REV-ERB disminuye en al menos el 50 %, preferentemente al menos el 70 %, más preferentemente al menos el 80 %, más preferentemente al menos el 90 %, incluso más preferentemente al menos el 95 % o más en comparación con el control.

[0061] La actividad de REV-ERB puede determinarse mediante análisis cuantitativo y/o cualitativo, y puede medirse directa o indirectamente.

[0062] La actividad de REV-ERB en relación con un control puede determinarse mediante cualquier técnica adecuada. En la técnica se conocen técnicas convencionales adecuadas, tales como mediante la cuantificación de la expresión de E4bp4 y/o ensayos de luciferasa.

[0063] La actividad de REV-ERB puede inhibirse en comparación con un control durante al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 30 horas, al menos 36 horas, al menos 42 horas, al menos 48 horas, al menos 54 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana. Preferentemente, la actividad de REV-ERB disminuye durante al menos 12 a 72 horas. Típicamente, esto se evalúa con respecto a la última administración del compuesto que inhibe la actividad de REV-ERB.

[0064] La actividad de REV-ERB puede inhibirse en comparación con un control para al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o más pases de las células (ya sea in vivo, o cultivadas ex vivo o in vitro). La actividad de REV-ERB puede inhibirse y/o el nivel de expresión del gen y/o proteína E4bp4 puede modificarse indefinidamente.

[0065] En el contexto de la presente invención, se puede entender que cualquier referencia a la inhibición de la actividad de REV-ERB significa la inhibición de la actividad de REV-ERB-a y/o REV-ERB-p. En realizaciones preferidas, se inhibe la actividad tanto de REV-ERB-a como de REV-ERB-p. Por lo tanto, la invención se refiere a compuestos que inhiben la actividad de REV-ERB, incluyendo compuestos que inhiben la actividad de REV-ERB-a (es decir, inhibidores de REV-ERB-a, también denominados antagonistas de REV-ERB-a) y/o a compuestos que inhiben la actividad de REV-ERB-p (es decir, inhibidores de REV-ERB-p, también denominados antagonistas de r EV-ERB-p). En realizaciones preferidas, la invención se refiere a compuestos que inhiben la actividad tanto de REV-ERB-a como de REV-ERB-p (es decir, inhibidores de REV-ERB-a y de REV-ERB-p, también denominados antagonistas de REV-ERB-a y REV-ERB-p).

Antagonistas/inhibidores de REB-ERB

[0066] Los compuestos de la invención pueden ser específicos para REV-ERB. Por específico, se entenderá que el compuesto se une a REV-ERB-a y/o a REV-ERB-p, sin que haya una reactividad cruzada significativa con ninguna otra molécula, en particular con ninguna otra proteína. Por ejemplo, el modulador que es específico para REV-ERB-a y/o REV-ERB-p no mostrará reactividad cruzada significativa con la elastasa de neutrófilos humana. La reactividad cruzada se puede evaluar mediante cualquier procedimiento adecuado. La reactividad cruzada del inhibidor de REV-ERB-a y/o REV-ERB-p con una molécula que no sea REV-ERB-a y/o REV-ERB-p puede considerarse significativa si el inhibidor se une a la otra molécula al menos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 100 % con la misma fuerza con la que se une a REV-ERB-a y/o REV-ERB-p. Un inhibidor que es específico para REV-ERB-a y/o REV-ERB-p puede unirse a otra molécula tal como elastasa de neutrófilos humana con menos de 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % o 20 % de la fuerza con que se une a REV-ERB-a y/o REV-ERB-p. Preferentemente, el inhibidor se une a la otra molécula con menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 % o menos del 5 %, menos del 2 % o menos del 1 % de la fuerza con que se une a REV-ERB-a y/o REV-ERB-p.

[0067] Los compuestos de la invención pueden tener efectos inespecíficos. Un efecto inespecífico es la actividad contra una diana distinta de REV-ERB. Típicamente, los compuestos con efectos inespecíficos están abarcados por la presente invención si la actividad contra la diana que no es REV-ERB no es significativa en comparación con la actividad contra REV-ERB. El hecho de que un efecto inespecífico sea significativo puede depender del uso previsto del compuesto. Como ejemplo no limitativo, un compuesto que puede ejercer un efecto inespecífico en el sistema nervioso central no sería significativo para un compuesto usado en un procedimiento ex vivo como se describe en esta solicitud, pero puede ser significativo (dependiendo de la magnitud del efecto inespecífico) para una indicación terapéutica in vivo como se describe en esta solicitud. La presencia y magnitud de cualquier efecto potencial inespecífico se puede evaluar fácilmente mediante el uso de procedimientos convencionales conocidos en la técnica.

[0068] Se puede usar cualquier inhibidor adecuado según la invención, por ejemplo, moléculas pequeñas, reactivos PROTAC, ARN bicatenario (ARNbc), ARN de interferencia pequeña (ARNip), ARN de horquilla pequeña (ARNhp), microARN, ARN antisentido (monocatenario), péptidos y peptidomiméticos, anticuerpos, aptámeros y ribozimas. Los inhibidores preferidos incluyen moléculas pequeñas y reactivos PROTAC.

Moléculas pequeñas

[0069] Se pueden usar moléculas pequeñas para inhibir la actividad de REV-ERB como se describe en esta invención. Tal como se define en esta invención, las moléculas pequeñas son compuestos de bajo peso molecular, típicamente compuestos orgánicos. Típicamente, una molécula pequeña tiene un peso de molécula máximo de 900 Da, lo que permite una difusión rápida a través de las membranas celulares. En algunas realizaciones, el peso molecular máximo de una molécula pequeña es de 500 Da. Típicamente, una molécula pequeña tiene un tamaño del orden de 1 nm.

[0070] Según la presente invención, las moléculas pequeñas pueden ejercer un efecto inhibidor sobre la actividad de REV-ERB mediante la unión al resto porfirina hemo de REV-ERB. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas, un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB según la presente invención es un compuesto que se une al resto porfirina hemo de REV-ERB y, por ello, inhibe la actividad de REV-ERB. De manera alternativa, la molécula pequeña puede actuar mediante un mecanismo diferente, por ejemplo, mediante la unión a una parte no hemo de REV-ERB. En la técnica se conocen técnicas convencionales para la producción de moléculas pequeñas, que luego se pueden evaluar fácilmente para determinar la actividad inhibidora de REV-ERB como se describe en esta solicitud.

Estructura de porfirina hemo

[0071] En una realización preferida, la invención se refiere a la molécula pequeña éster etílico del ácido 1,2,3,4-tetrahidro-2-[[5-(metiltio)-2-tienil]carbonil]-3-isoquinolincarboxílico, denominado en esta solicitud SR8278 como inhibidor de REV-ERB.

Estructura de SR8278

[0072] La invención también comprende el uso de variantes de SR8278 que conservan la función inhibidora de REV-ERB de SR8278.

[0073] Cualquier molécula pequeña que ejerza un efecto inhibidor sobre la actividad de REV-ERB puede usarse como un inhibidor de REV-ERB según la presente invención. Dichos inhibidores de moléculas pequeñas también se pueden unir a REV-ERB. Los ejemplos de otras moléculas pequeñas que se pueden usar como inhibidores de REV-ERB según la presente invención incluyen 4-[[[1-(2-fluorofenil)ciclopentil]amino]metil]-2-[(4-metilpiperazin-1-il)metil]fenol (también denominado en esta solicitud como ARN5187), 2-(5-metilfuran-2-carbonil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato de etilo, 4-((4-clorobencil) ((5-nitrotiofen-2-il) metil)amino)-N-fenilpiperidin-1-carboxamida, 4-((1-(4-fluorofenil)ciclopentil)amino)metil)-2-((4-metilpiperazin-1-il)metil)fenol, 1-(2-fluorofenil)-N-(3-(1 metilpiperidin-4-il)metil)bencil)cidopentan-1-amina y 1-(4-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidm-4-¡l)met¡l)benc¡l)c¡clopentan-1-am¡na.

Estructura de ARN5187

[0074]

Estructura de 2-(5-metilfuran-2-carbonil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato de etilo

[0075]

Estructura de 4-((4-dorobencil)((5-nitrotiofen-2-il)metil)amino)-N-fenilpiperidin-1-carboxamida

[0076]

Estructura de 4-(((1-(4-fluorofenil)cidopentil)amino)metil)-2-((4-metilpiperazin-1-il)metil)fenol

[0077]

Estructura de 1-(2-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)cidopentan-1-amina

[0078]

Estructura de 1-(4-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)cidopentan-1-amina

[0079] La invención también comprende el uso de variantes de ARN5187, 2-(5-metilfuran-2-carbonil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato de etilo, 4-((4-clorobencil) ((5-nitrotiofen-2-il) ^iTi etil)a ^iTi ino)-N-fenilpiperidin-1-carboxamida, 4-(((1-(4-fluorofenil)ciclopenil)amino)metil)-2-((4-metilpiperazin-1-il)metil)fenol, 1-(2-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina o 1-(4-fluorofenil)-N-(3-((1- ^iTi etilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina que conservan la función inhibidora de REV-ERB de ARN5187, 2-(5-metilfuran-2-carbonil)-1,2,3,4-hidrohidrotetraquinil-3-carboxilato de etilo, 4-((4-clorobencil)((5-nitrotiofen-2-il)metil)amino)-N-fenilpiperidina-1-carboxamida, 4-(((1-(4-fluorofenil)ciclopentil)amino)metil)-2-((4-metilpiperazin-1-il)metil)fenol, 1-(2-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina o 1 -(4-fluorofenil)-N-(3-((1 -metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina, respectivamente.

Reactivos de PROTAC

[0080] Las quimeras dirigidas a proteólisis (también denominadas PROTAC o reactivos PROTAC) se pueden usar para inhibir la actividad de REV-ERB como se describe en esta invención. Los PROTAC son moléculas pequeñas heterobifuncionales que se unen simultáneamente a una proteína diana y a la ubiquitina ligasa, lo que permite la ubiquitinación y degradación de la diana. Con más detalle, un reactivo PROTAC típicamente comprende un ligando para la proteína diana (en el caso de la presente invención, REV-ERB) y un ligando para un dominio de reconocimiento de ligasa E3. Mediante el uso de dicho PROTAC, se recluta una ligasa E3 al REV-ERB unido a PROTAC, induciendo la transferencia de ubiquitina del complejo de ligasa E3 a la proteína diana (en el caso de la presente invención, REV-ERB). Una vez que PROTAC ha inducido un grado suficiente de ubiquitinación de la diana, éste es reconocido y degradado por el proteasoma.

[0081] Como ejemplo no limitativo, un reactivo PROTAC se puede producir mediante la conjugación de un ligando con una ligasa E3 a un inhibidor de molécula pequeña como se describe en esta solicitud (preferentemente SR8278) a través de un enlazador. En una realización preferida, un reactivo PROTAC comprende un ligando para la ligasa Cullin RING E3 de la proteína von-Hippel Lindau (VHL) o cereblon - una parte de un complejo ligasa CRL4 Cullin RING E3, conectado a un inhibidor de molécula pequeña de la invención mediante un enlazador. En algunas realizaciones particularmente preferidas, el reactivo PrOtAC comprende un ligando para la ligasa Cullin RING E3 de la proteína von-Hippel Lindau (VHL) conectada a SR8278, conectada a través de un enlazador. En otras realizaciones particularmente preferidas, el reactivo PROTAC comprende cereblon (una parte de un complejo ligasa CRL4 Cullin RING E3) y SR8278, conectado a través de un enlazador.

[0082] Debido a su mecanismo de acción, los reactivos PROTAC simplemente necesitan cualquier ligando para la proteína diana. La farmacología funcional del ligando, en ausencia del enlazador y el ligando ligasa E3, no es importante. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un reactivo PROTAC inhibidor de REV-ERB de la presente invención puede comprender un agonista de REV-ERB de molécula pequeña como el ligando, tal como GSK4112 (1,1-dimetiletil N-[(4-clorofenil)metil]-N-[(5-nitro-2-tienil)metil])glicinato, SR6452).

ARN bicatenario

[0083] Las moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) pueden usarse para inhibir la actividad de REV-ERB como se describe en esta solicitud. Las moléculas de ARNbc pueden usarse en ARNi para inhibir la actividad de REV-ERB.

[0084] Usando técnicas conocidas y basándose en un conocimiento de la secuencia de REV-ERB, las moléculas de ARNbc se pueden diseñar para antagonizar REV-ERB mediante el direccionamiento de la secuencia de ARN correspondiente basándose en la homología de secuencia. Dichos ARNbc serán típicamente ARN de interferencia pequeña (ARNip), ARN de horquilla pequeña (ARNhp) o microARN (miARN). La secuencia de dichos ARNbc comprenderá una parte que corresponde a la de una parte de ARNm que codifica REV-ERB. Esta parte generalmente será 100 % complementaria a la parte diana dentro del ARNm transcrito del gen REV-ERB, pero también se pueden usar niveles más bajos de complementariedad (por ejemplo, 90 % o más o 95 % o más). Típicamente, el % de complementariedad se determina sobre una longitud de residuos de ácido nucleico contiguos. Una molécula de ARNbc de la invención puede, por ejemplo, tener al menos un 80 % de complementariedad con la parte diana dentro del ARNm transcrito del gen r EV-ERb medido en al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o más residuos de ácido nucleico, hasta que la molécula de ARNbc tenga al menos el 80 % de complementariedad con el ARNm transcrito del gen REV-ERB de la invención en toda la longitud de la molécula de ARNbc.

[0085] En una realización preferida, el ARNbc es un ARNhp. El ARNhp se puede administrar a precursores de linfocitos NK por cualquier medio apropiado. En la técnica se conocen técnicas adecuadas e incluyen el uso de vectores plásmidos, virales y bacterianos para administrar el ARNhp. Típicamente, el ARNhp se administra usando un sistema de administración de vector viral. En una realización preferida, el vector viral es un vector lentiviral.

[0086] Generalmente, una vez que el ARNhp se ha administrado a una célula precursora de NK, a continuación se transcribe en el núcleo y se procesa. El pre-ARNhp resultante se exporta desde el núcleo y luego se procesa por dicer y se carga en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés). La hebra codificante (pasajera) se degrada. La cadena no codificante (guía) dirige el RISC a ARNm que tiene una secuencia complementaria. En el caso de una complementariedad perfecta, RISC escinde el ARNm. En el caso de complementariedad imperfecta, RISC reprime la traducción del ARNm. En ambos casos, el ARNhp conduce al silenciamiento del gen diana.

[0087] Una secuencia variante puede tener al menos un 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de ARNhp de la invención, medida en cualquier longitud de secuencia adecuada. Típicamente, el % de identidad de secuencia se determina a lo largo de una longitud de residuos de aminoácidos o ácido nucleico contiguos. Una secuencia variante de la invención puede, por ejemplo, tener al menos un 80 % de identidad de secuencia con una secuencia de la invención medida en al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o más residuos de aminoácidos o ácido nucleico.

[0088] Por ejemplo, una molécula de ARNhp variante de la invención puede tener al menos un 80 % de identidad de secuencia con una molécula de ARNhp variante de la invención medida en al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60 o más residuos de ácido nucleico, hasta que la molécula de ARNhp variante tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con la molécula de ARNhp de la invención en toda la longitud de la molécula de ARNhp variante.

ARN antisentido

[0089] Las moléculas de ADN monocatenario (ADNmc), también conocidas como ARN antisentido, se pueden usar para inhibir la actividad de REV-ERB como se describe en esta solicitud.

[0090] Usando técnicas conocidas y basándose en un conocimiento de la secuencia del gen REV-ERB, las moléculas de ARN antisentido se pueden diseñar para antagonizar el gen REV-ERB mediante el direccionamiento del ARN correspondiente basándose en la homología de secuencia. La secuencia de dicho antisentido comprenderá una parte que corresponde a la de una parte del ARNm transcrito del gen REV-ERB. Esta parte generalmente será 100 % complementaria a la parte diana dentro del ARNm transcrito, pero también se pueden usar niveles más bajos de complementariedad (por ejemplo, 90 % o más o 95% o más).

Aptámeros

[0091] Los aptámeros son generalmente moléculas de ácido nucleico que se unen a una molécula diana específica. Los aptámeros se pueden modificar por ingeniería genética completamente in vitro, se producen fácilmente mediante síntesis química, poseen propiedades de almacenamiento deseables y provocan poca o ninguna inmunogenicidad en las aplicaciones terapéuticas. Estas características los hacen particularmente útiles en utilidades farmacéuticas y terapéuticas.

[0092] Como se usa en esta solicitud, "aptámero" se refiere en general a un oligonucleótido monocatenario o bicatenario o una mezcla de dichos oligonucleótidos, donde el oligonucleótido o mezcla es capaz de unirse específicamente a una diana. Los aptámeros de oligonucleótidos se tratarán en este caso, pero el lector experto apreciará que también se pueden usar otros aptámeros que tienen características de unión equivalentes, tales como aptámeros peptídicos.

[0093] En general, los aptámeros pueden comprender oligonucleótidos que tienen al menos 5, al menos 10 o al menos 15 nucleótidos de longitud. Los aptámeros pueden comprender secuencias que tienen hasta 40, hasta 60 o hasta 100 o más nucleótidos de longitud. Por ejemplo, los aptámeros pueden tener de 5 a 100 nucleótidos, de 10 a 40 nucleótidos o de 15 a 40 nucleótidos de longitud. Siempre que sea posible, se prefieren aptámeros de menor longitud, ya que a menudo provocarán menos interferencia con otras moléculas o materiales.

[0094] Los aptámeros se pueden generar usando procedimientos rutinarios tales como el procedimiento de Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX). SELEX es un procedimiento para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con unión altamente específica a moléculas diana. Se describe, por ejemplo, en los documentos US 5.654.151, US 5.503.978, US 5.567.588 y WO 96/38579.

[0095] El procedimiento SELEX implica la selección de aptámeros de ácido nucleico y, en particular, ácidos nucleicos monocatenarios capaces de unirse a una diana deseada, a partir de una colección de oligonucleótidos. Una colección de ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, ADN, ARN o variantes de estos) se pone en contacto con una diana, en condiciones favorables para la unión, los ácidos nucleicos que se unen a dianas en la mezcla se separan de los que no se unen, los complejos ácido nucleico-diana se disocian, los ácidos nucleicos que se habían unido a la diana se amplifican para proporcionar una colección o biblioteca que está enriquecida con ácidos nucleicos que tienen la actividad de unión deseada, y luego se repite esta serie de etapas según sea necesario para producir una biblioteca de ácidos nucleicos (aptámeros) que tienen afinidad de unión específica para la diana relevante.

Peptidomiméticos

[0096] Los peptidomiméticos son compuestos que imitan un péptido o proteína natural con la capacidad de interactuar con la diana biológica y producir el mismo efecto biológico. Los peptidomiméticos pueden tener ventajas sobre los péptidos en términos de estabilidad y biodisponibilidad asociada con un péptido natural. Los peptidomiméticos pueden tener modificaciones de cadena principal o lateral del péptido original diseñado para la función biológica. Los ejemplos de clases de peptidomiméticos incluyen, aunque sin limitación, péptidos y p-péptidos, así como péptidos que incorporan D-aminoácidos.

Anticuerpos

[0097] Los anticuerpos pueden usarse para inhibir la actividad de REV-ERB como se describe en esta solicitud.

[0098] Como se usa en esta solicitud, el término anticuerpo abarca el uso de un anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal, así como los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un péptido que se une a REV-ERB con especificidad. El anticuerpo puede ser un Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd o dAb. Secuencias variantes

[0099] Una identidad de secuencia de al menos un 80 % incluye al menos un 82 %, al menos un 84 %, al menos un 86 %, al menos un 88 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % y un 100 % de identidad de secuencia (con todas y cada una de las secuencias presentadas en esta solicitud y/o con todas y cada una de las SEQ ID NO presentadas en esta invención).

[0100] Se puede usar cualquiera de una variedad de procedimientos de alineación de secuencia para determinar el porcentaje de identidad, que incluye, sin limitación, procedimientos generales, procedimientos locales y procedimientos híbridos, tales como, por ejemplo, procedimientos de estrategia de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica. Los procedimientos generales alinean las secuencias desde el principio hasta el final de la molécula y determinan la mejor alineación sumando las puntuaciones de los pares de residuos individuales e imponiendo penalizaciones por hueco. Los procedimientos no limitantes incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W, véase, por ejemplo, Julie D. Thompson y col., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22 (22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y refinamiento iterativo, véase, por ejemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Los procedimientos locales alinean las secuencias mediante la identificación de uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los procedimientos no limitantes incluyen, por ejemplo, Match-box, véase, por ejemplo, Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, por ejemplo, C. E. Lawrence y col., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262 (5131 ) Science 208-214 (1993); Align-M, véase, por ejemplo, Ivo Van Walle y col., Align-M -A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20 (9) Bioinformatics:1428-1435 (2004). Por lo tanto, el porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 19, 1992.

[0101] Las variantes de las secuencias específicas proporcionadas anteriormente pueden definirse alternativamente mediante la mención de la cantidad de nucleótidos o aminoácidos que difieren entre las secuencias variantes y las secuencias de referencia específicas proporcionadas anteriormente. Por lo tanto, en una realización, la secuencia puede comprender (o consistir en) una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias específicas proporcionadas anteriormente en no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 posiciones de nucleótidos, por ejemplo, en no más de 1 posición de nucleótidos. Se prefieren las sustituciones conservadoras.

[0102] Las moléculas y péptidos de ácido nucleico variantes de la invención típicamente aún conservan la actividad de las moléculas correspondientes de la invención. Por lo tanto, por ejemplo, las moléculas de ARNhp variantes de la invención conservan la capacidad de las moléculas de ARNhp correspondientes para inhibir la expresión de REV-ERB. Las moléculas de ARNhp variantes pueden conservar al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, hasta e incluyendo el 100 % de la actividad moduladora de las moléculas de ARNhp de la invención. Esto se aplica igualmente a cualquier otra variante de los inhibidores de la invención.

[0103] Los compuestos de la invención pueden estar etiquetados (o marcados). Se puede usar cualquier etiqueta apropiada. Dichas etiquetas son conocidas en la técnica.

Procedimientos de expansión de linfocitos NK

[0104] La presente invención se refiere a un procedimiento ex vivo o in vitro para expandir una población de linfocitos NK. También se describen procedimientos in vivo. Dicho procedimientos comprende contener HPCs con un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB (como se describe en esta solicitud) y expandir dichas células para producir una población de linfocitos NK. Los procedimientos de la invención permiten la rápida expansión de los linfocitos NK, reduciendo el tiempo necesario para su cultivo y, por ende, el riesgo de agotamiento, mejorando la citotoxicidad de los linfocitos NK cuando se transfunden a un paciente.

[0105] Cuando el procedimiento descrito se lleva a cabo in vivo, dicho procedimiento es un procedimiento terapéutico como se describe en esta solicitud. Toda la descripción de esta solicitud en relación con las indicaciones y aplicaciones terapéuticas de la invención es aplicable a dichos procedimientos.

[0106] Típicamente, el procedimiento de la invención es ex vivo. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento ex vivo para expandir una población de linfocitos NK que comprende las etapas de: (a) cultivar una muestra que comprende células progenitoras hematopoyéticas (HPC) obtenida de un paciente; (b) poner en contacto dicha muestra con un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB; y (c) expandir dichas células in vitro para producir una población de linfocitos NK. El compuesto puede ser cualquier compuesto inhibidor de REV-ERB de la invención como se describe en esta solicitud. Típicamente, dicho compuesto aumenta la expresión de E4bp4 al disminuir la actividad de REV-ERB como se describe en esta invención.

[0107] La muestra que comprende HPC obtenidas de un paciente puede ser una muestra obtenida de médula ósea, sangre de cordón umbilical y/o sangre periférica. Por lo tanto, la muestra puede ser una muestra de sangre de cordón umbilical o periférica, o una muestra de médula ósea o biopsia.

[0108] Según la presente invención, una muestra que comprende HPCs es cualquier muestra de un paciente que comprende una cantidad suficiente de HPCs (como se describe en esta solicitud), de modo que se puede obtener una población de linfocitos NK expandida poniendo en contacto dicha muestra con un compuesto según la presente invención. Típicamente, la muestra comprende HSCs. Preferentemente, dicha muestra está enriquecida para HSCs, tal como una muestra de sangre periférica o de cordón umbilical o una muestra de médula ósea o biopsia como se describe en esta solicitud.

[0109] Las HPC se pueden cultivar en o con células de soporte/estromales o capa celular adecuadas. Se puede usar cualquier célula estromal apropiada, que incluye, aunque sin limitación, células estromales OP9 y/o células estromales EL08-1D2. De manera alternativa y/o adicional, las HPC pueden cultivarse en presencia de citocinas y factores de crecimiento asociados con el desarrollo de células en la ruta de diferenciación de linfocitos NK, incluyendo factores requeridos para el crecimiento de HPC y/o factores requeridos para el crecimiento y/o diferenciación de linfocitos n K. Los ejemplos no limitantes de dichos factores incluyen IL-3, IL-7, Flt3L, factor de células madre (SCF) y/o IL-15, o cualquier combinación de estos.

[0110] En algunas realizaciones, el procedimiento ex vivo comprende una única fase en la que las HPC en una muestra obtenida de un paciente se cultivan, se ponen en contacto con un compuesto de la invención y se expanden para formar una población de linfocitos NK, típicamente en condiciones de cultivo sustancialmente constantes. Típicamente, esto implica incubar las HPC con factores tales como IL-3, IL-7, SCF, Flt3L y/o IL-15, preferentemente todos estos factores. Las HPC también se cultivan preferentemente en o con células estromales/capa celular, tales como células estromales EL08-1D2.

[0111] En algunas realizaciones, el procedimiento ex vivo comprende dos fases. La primera es una fase de producción linfoide, en la que se cultivan las HPC en una muestra obtenida de un paciente. Típicamente esto implica incubar las HPC con citocinas y factores de crecimiento asociados con la producción linfoide, tales como Flt3L, IL-7 y/o SCF. Esta fase puede durar al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más días. En algunas realizaciones preferidas, esta fase dura dos días.

[0112] La segunda fase del procedimiento ex vivo es una fase de expansión de linfocitos NK. Típicamente, esto implica la transferencia de las HSC cultivadas a una capa celular estromal (de soporte) adecuada, tal como células estromales OP9 y el cultivo en citocinas y factores de crecimiento asociados con el desarrollo de linfocitos NK, como IL-15. Un compuesto de la invención se añade típicamente durante esta segunda fase, y preferentemente al comienzo de esta segunda fase. La segunda fase dura el resto del período de cultivo ex vivo (como se definió anteriormente). El medio de cultivo se puede cambiar con la frecuencia que se requiera durante esta segunda fase con el fin de facilitar la expansión de linfocitos NK.

[0113] La muestra que comprende HPCs puede cultivarse ex vivo durante al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días, al menos 8 días, al menos 9 días, al menos 10 días, al menos 11 días, al menos 12 días, al menos 13 días, al menos 14 días, al menos 15 días, al menos 16 días, al menos 17 días, al menos 18 días o más. Típicamente, dicha muestra se cultiva durante al menos 9 días con el fin de producir una población de linfocitos NK expandida. Estos períodos de cultivo son para el período de cultivo total del procedimiento ex vivo, es decir, si hay dos fases, estos períodos son para el total (fase 1 más fase 2).

[0114] El compuesto de la invención se puede añadir a la muestra que comprende HPCs al cabo de una semana, al cabo de seis días, al cabo de cinco días, al cabo de cuatro días, al cabo de tres días, al cabo de dos días, al cabo de un día posteriores al aislamiento de las HPC en la muestra, o en el mismo día del aislamiento de los precursores de linfocitos NK. Típicamente, es el mismo día en que se obtiene la muestra del paciente. Preferentemente, el compuesto de la invención se añade a la muestra al cabo de los dos días posteriores al aislamiento de las HPC en la muestra, incluso más preferentemente el segundo día después del aislamiento de las HPC.

[0115] El procedimiento de la invención puede comprender además modular (aumentar o disminuir la expresión y/o actividad de uno o más genes y/o proteínas adicionales en las HPC con el fin de mejorar la expansión de linfocitos NK. Esta modulación puede ser provocada por un compuesto de la invención, que incluye el mismo compuesto de la invención que se usa para inhibir la actividad de REV-ERB. De manera alternativa, se pueden usar uno o más compuestos adicionales para modular la expresión y/o actividad del uno o más genes y/o proteínas adicionales. Dicha modulación puede ocurrir directa o indirectamente. La modulación indirecta abarca los efectos corriente abajo causados por un compuesto de la invención que inhibe la actividad de REV-ERB.

[0116] Un procedimiento de la invención puede dar como resultado un aumento de la cantidad de linfocitos NK de al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2,3 veces, al menos 2,4 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,6 veces, al menos 2,7 veces, al menos 2,8 veces, al menos 2,9 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces o más con respecto a un control. Típicamente, la cantidad de linfocitos NK aumenta al menos 2 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2,3 veces, al menos 2,4 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,6 veces, al menos 2,7 veces, al menos 2,8 veces, al menos 2,9 veces, al menos 3 veces o más en comparación con el control.

[0117] Típicamente, un procedimiento ex vivo de la presente invención implica una etapa final para purificar la población de linfocitos NK expandida. Esto asegura una población pura para administración terapéutica como se describe en esta invención. La purificación de la población de linfocitos NK expandida puede realizarse por cualquier medio adecuado. En la técnica se conocen procedimientos de purificación celular convencionales, tales como clasificación celular, incluyendo clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y clasificación celular activada magnéticamente (MACS).

Indicaciones terapéuticas

[0118] También se describe un antagonista de REV-ERB para su uso en un procedimiento de terapia al aumentar la producción de linfocitos NK en un paciente.

[0119] El antagonista de REV-ERB para su uso en dicho procedimiento de terapia puede ser cualquier antagonista de REV-ERB como se describe en esta solicitud. Típicamente, el antagonista de REV-ERB para su uso en dicho procedimiento aumenta la expresión de E4bp4 al disminuir la actividad de REV-ERB.

[0120] Típicamente, el procedimiento de terapia comprende administrar un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB (como se describe en esta solicitud) a un paciente o sujeto.

[0121] Como se usa en esta solicitud, se puede entender que la expresión "aumentar la cantidad de linfocitos NK" y "aumentar la producción de linfocitos NK" significa que el compuesto descrito provoca un aumento significativo en la cantidad de linfocitos NK en un paciente. Este aumento en el número de linfocitos NK se puede medir con respecto a un control (como se describe en esta solicitud en el contexto de aumentar la expresión de E4bp4 e inhibir la actividad de REV-ERB).

[0122] Una referencia a un aumento en la cantidad de linfocitos NK y/o aumento de la producción de linfocitos NK se puede cuantificar en términos de un aumento de x veces con respecto a un control. Típicamente, un compuesto descrito puede aumentar la cantidad de linfocitos NK, o dar lugar a un aumento en la producción de linfocitos NK de al menos 1,5 veces, al menos 1,6 veces, al menos 1,7 veces, al menos 1,8 veces, al menos 1,9 veces, al menos 2 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2,3 veces, al menos 2,4 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3 veces o más con respecto a un control.

[0123] De manera alternativa, se puede entender que una referencia al aumento de la cantidad de linfocitos NK y/o al aumento de la producción de linfocitos NK significa que la cantidad de linfocitos NK aumenta en al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 %, al menos el 150 %, al menos el 200 %, al menos el 300 % o más en comparación con el control. Típicamente, la cantidad de linfocitos NK aumenta en al menos el 50 %, preferentemente al menos el 70 %, más preferentemente al menos el 80 %, incluso más preferentemente al menos el 90 % o más en comparación con un control.

[0124] Se puede definir un aumento en la cantidad de linfocitos NK y/o un aumento en la producción de linfocitos NK en términos de la cantidad absoluta de linfocitos NK en una muestra o paciente, tal como el porcentaje de linfocitos NK, por ejemplo, el porcentaje de linfocitos NK en la población de linfocitos circulantes. Por ejemplo, un compuesto tal como se describe puede provocar un aumento en el número de NK, lo que resulta en un porcentaje de linfocitos NK de al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 % o más.

[0125] La cantidad de linfocitos NK puede determinarse mediante análisis cuantitativo y/o cualitativo, y puede medirse directa o indirectamente. La cantidad de linfocitos NK con respecto a un control se puede determinar mediante el uso de cualquier técnica adecuada. En la técnica se conocen técnicas convencionales adecuadas, tales como citometría de flujo, FACS y MACS.

[0126] La cantidad de linfocitos NK puede aumentarse en comparación con un control durante al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 30 horas, al menos 36 horas, al menos 42 horas, al menos 48 horas, al menos 54 horas, al menos 60 horas, al menos 72 horas, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes o más. Típicamente, esto se evalúa con respecto a la última administración del compuesto que inhibe la actividad de REV-ERB.

[0127] La cantidad de linfocitos NK se puede cuantificar en términos de la cantidad total de linfocitos NK en una muestra de un paciente o muestra de cultivo (de un procedimiento ex vivo de la invención).

[0128] En el contexto de los usos y procedimientos terapéuticos tal como se describe, un "sujeto" o "paciente" (estos términos se usan indistintamente en esta invención) es cualquier paciente animal que se beneficiaría de un aumento en la cantidad de linfocitos NK. Los pacientes animales típicos son mamíferos, tales como primates. Preferentemente, el paciente es un ser humano.

[0129] Por lo tanto, se describe en esta solicitud un procedimiento de tratamiento mediante el aumento de la cantidad de linfocitos NK en un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB (como se describe en esta solicitud).

[0130] De manera adicional, en esta solicitud se describe el uso de un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB en la fabricación de un medicamento. Dicho medicamento aumenta la cantidad de linfocitos NK en un paciente.

[0131] Dicho uso o procedimiento terapéutico puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto como se describe, ya sea solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, a un sujeto.

[0132] Como se usa en esta solicitud, el término "tratamiento" o "tratar" abarca medidas terapéuticas o preventivas/profilácticas.

[0133] Los compuestos tal como se describen también se pueden usar como una terapia preventiva. Como se usa en esta solicitud, el término "prevenir" incluye prevenir la aparición de síntomas asociados con una enfermedad o trastorno que se puede tratar mediante el aumento de la cantidad de linfocitos NK y/o la reducción de la gravedad o intensidad de dichos síntomas. El término "prevenir" incluye inducir o proporcionar inmunidad protectora frente a dichas enfermedades o trastornos, particularmente enfermedades infecciosas como se describe en esta solicitud. La inmunidad se puede cuantificar usando cualquier técnica apropiada, cuyos ejemplos se conocen en la técnica.

[0134] Un compuesto como se describe puede administrarse a un paciente que ya tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse mediante el aumento del número de linfocitos Nk . Por ejemplo, se puede sospechar que el paciente tiene una enfermedad infecciosa o cáncer como se describe en esta solicitud, y puede o no mostrar síntomas de dicha enfermedad o trastorno. Cuando se administra a tal paciente, un compuesto de la invención puede curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas, y/o prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento.

[0135] De manera alternativa, un compuesto como se describe se puede administrar a un paciente que en última instancia puede estar infectado por una enfermedad infecciosa particular, o desarrollar una enfermedad o trastorno como se describe en esta solicitud, con el fin de curar, retrasar, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas, y/o prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento, o, en el caso de enfermedades infecciosas, ayudar a evitar que ese paciente transmita dicha enfermedad.

[0136] Los tratamientos y terapias preventivas como se describen son aplicables a una variedad de sujetos diferentes de diferentes edades. En el contexto de los seres humanos, las terapias son aplicables a niños (por ejemplo, bebés, niños menores de 5 años, niños de mayor edad o adolescentes) y adultos. En el contexto de otros sujetos animales (por ejemplo, mamíferos como primates), las terapias son aplicables a sujetos inmaduros y sujetos maduros/adultos.

[0137] La presente descripción se refiere al tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que se puede tratar de forma beneficiosa mediante el aumento de la cantidad de linfocitos NK en un paciente. Dichas enfermedades y trastornos incluyen cáncer, enfermedades infecciosas (agudas y crónicas), enfermedades autoinmunitarias y enfermedades o trastornos relacionados con la infertilidad femenina o el embarazo. Las enfermedades infecciosas que se pueden tratar según la presente invención incluyen infección viral e infección por otros patógenos, que incluyen bacterias, protistos, patógenos fúngicos o helmintos. Típicamente dichos patógenos son patógenos intracelulares que tienen al menos una fase intracelular en su ciclo de vida. Las infecciones de particular interés incluyen infecciones virales e infecciones zoonóticas que son de particular importancia desde una perspectiva de salud pública. Los cánceres que se pueden tratar según la presente descripción incluyen cáncer de vejiga, cáncer de sangre, leucemia, cáncer de huesos, cáncer de intestino, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular y cáncer uterino. Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar según la presente invención incluyen lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y resistencia a la insulina inducida por obesidad. Como se usa en esta solicitud, el término enfermedades o trastornos relacionados con la infertilidad femenina o embarazo incluye, aunque sin limitación, restricción del crecimiento fetal, parto prematuro, defectos en el remodelado vascular uterino y preeclampsia.

[0138] Los compuestos tal como se describen pueden usarse en combinación con uno o más agentes o tratamientos terapéuticos adicionales, que típicamente pueden seleccionarse de un tratamiento convencional para la enfermedad o trastorno a tratar. A modo de ejemplo no limitativo, si un compuesto de la invención está destinado para su uso en el tratamiento de un cáncer, tal como cáncer de pulmón, dicho compuesto puede usarse en combinación con tratamientos convencionales para el cáncer de pulmón, tal como radioterapia, quimioterapia o cirugía. Cuando se usa en combinación con uno o más agentes o tratamientos terapéuticos adicionales, un compuesto como se describe se puede administrar antes, simultáneamente o después de la administración del uno o más agentes o tratamientos terapéuticos adicionales.

[0139] Un compuesto como se describe puede estar preferentemente destinado para su uso en combinación con inmunoterapia mediada por anticuerpos. La inmunoterapia mediada por anticuerpos implica la administración de anticuerpos a un paciente para dirigirse a antígenos específicos de la enfermedad. Dichos anticuerpos podrían usarse para aumentar la especificidad y la actividad de destrucción de los linfocitos NK, que expresan receptores para las regiones F^cde los anticuerpos IgG. La activación de estos receptores F^cconduce a la activación de linfocitos NK, lo que resulta en la secreción de citocinas y la liberación de gránulos citotóxicos por parte de los linfocitos NK activados, lo cual provoca la lisis de la célula que expresa el antígeno de la enfermedad. Dicha terapia de combinación es particularmente preferida para el tratamiento del cáncer (usando anticuerpos para antígenos específicos del tumor). Cualquier anticuerpo usado en inmunoterapia puede usarse en combinación con un compuesto de la invención. Los ejemplos no limitantes de dichos anticuerpos incluyen mAbs anti-CD20 (linfoma no Hodgkin, linfoma linfocítico crónico), mAbs antigangliósido D2 (anti-GD2) (neuroblastoma, melanoma), mAbs antifactor de crecimiento epidérmico humano (anti-HER2) (cánceres de mama y gástrico), mAbs del receptor del factor de crecimiento antiepidérmico (anti-EGFR) (cáncer colorrectal y de cabeza y cuello).

[0140] También se describe el uso de una población de linfocitos NK expandida (como se describe en esta solicitud) en un uso o procedimiento terapéutico como se describe en esta solicitud. Cualquiera y todas las descripciones de esta solicitud en relación con las indicaciones terapéuticas de un compuesto de la invención pueden aplicarse de manera igual e independiente a las aplicaciones terapéuticas de las poblaciones de linfocitos NK expandidas de la invención. A modo de ejemplo no limitativo, la descripción incluye una población de linfocitos NK expandida (como se describe en esta solicitud) para su uso en un procedimiento de terapia, por ejemplo, en el tratamiento contra el cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad o trastorno relacionado con la infertilidad femenino o el embarazo. Como otro ejemplo no limitativo, la descripción incluye un procedimiento de tratamiento mediante el aumento de la cantidad de linfocitos NK en un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de linfocitos NK expandida.

Composiciones y formulaciones farmacéuticas

[0141] El término "compuesto" se usa en esta solicitud indistintamente con los términos "composición terapéutica/profiláctica", "formulación" o "medicamento".

[0142] El compuesto o la población de linfocitos NK expandida como se definió anteriormente puede combinarse o administrarse además de un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. De manera alternativa o adicional, el compuesto o la población de linfocitos NK expandida se puede combinar además con uno o más de una sal, excipiente, diluyente, adyuvante, agente inmunorregulador y/o compuesto antimicrobiano.

[0143] Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o con ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, maleico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

[0144] La administración de composiciones inmunogénicas, formulaciones terapéuticas, medicamentos y formulaciones profilácticas se realiza generalmente por vías convencionales, por ejemplo, vías intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o mucosa. La administración puede realizarse mediante inyección parenteral, por ejemplo, una inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular. Por ejemplo, las formulaciones que comprenden anticuerpos o poblaciones de linfocitos NK expandidas como se describe pueden ser particularmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea. La administración de inhibidores de REV-ERB de moléculas pequeñas puede realizarse por inyección, como por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea, o por administración oral (moléculas pequeñas con un peso molecular de menos de 500 Da que presentan típicamente biodisponibilidad oral).

[0145] Por consiguiente, las composiciones inmunogénicas, formulaciones terapéuticas, medicamentos y formulaciones profilácticas tal como se describen se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. Pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar, o el péptido encapsular en liposomas o microcápsulas.

[0146] Los ingredientes inmunogénicos activos (tal como los compuestos o poblaciones de linfocitos NK expandidas como se describe) a menudo se mezclan con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de estos. Adicionalmente, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH y/o adyuvantes que mejoran la eficacia de la vacuna.

[0147] Generalmente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos no limitantes de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua, una solución salina y una solución salina tamponada con fosfato. En algunas realizaciones, sin embargo, cuando la composición comprende un compuesto como se describe, este puede estar en forma liofilizada, en cuyo caso puede incluir un estabilizador, tal como BSA. En algunas realizaciones, puede ser deseable formular la composición con un conservante, tal como tiomersal o azida de sodio, para facilitar el almacenamiento a largo plazo.

[0148] Los ejemplos de adyuvantes adicionales que pueden ser eficaces incluyen, aunque sin limitación: adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés), adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés), saponina, una fracción de extracto purificado de saponina tal como Quil A, un derivado de saponina tal como QS-21, partículas lipídicas a base de saponina tales como ISCOM/ISCOMATRIX, mutantes de toxina lábil (LT, por sus siglas en inglés) al calor de E. coli tales como LTK63 y/ o LTK72, hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, el lípido monofosforilico A, el dimicolato de trehalosa y el esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión al 2 % de escualeno/Tween 80, la formulación MF59 desarrollada por Novartis, y las formulaciones adyuvantes AS02, AS01, AS03 y AS04 desarrolladas por GSK Bio-logicals (Rixensart, Bélgica).

[0149] Los ejemplos de agentes amortiguadores incluyen, aunque sin limitación, succinato de sodio (pH 6,5) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 6,5 y 7,5).

[0150] Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales o formulaciones adecuadas para su distribución como aerosoles. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de 0,5 % a 10 %, preferentemente 1 %-2 %.

[0151] Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos.

[0152] Los intervalos de dosificación para la administración de los compuestos descritos son aquellos que producen el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa del compuesto, de la vía de administración, de la naturaleza de la formulación, de la edad del paciente, de la naturaleza, extensión o gravedad de la afección del paciente, de las contraindicaciones, si las hubiera, y del juicio del médico tratante. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas convencionales para la optimización. De manera similar, la dosis de un compuesto como se describe para su uso en un procedimiento descrito, particularmente un procedimiento ex vivo de la invención reivindicada, puede ser determinada fácilmente por un experto en la materia, y es cualquier dosis que produce el aumento deseado en el número de linfocitos NK y/o provoca la expansión deseada en linfocitos NK, para producir una población de linfocitos NK expandida. Como ejemplo no limitativo, las dosis de SR8278 según la presente invención pueden dar lugar a una concentración final de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 |iM, de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 |iM, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 |iM, de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 |iM, de aproximadamente 4 a aproximadamente 13 |iM, de aproximadamente 5 a aproximadamente 12 |iM, de aproximadamente 5 a aproximadamente 11 |iM, o preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 |iM.

[0153] También se describe el uso de una población de linfocitos NK expandida (como se describe en esta solicitud) en una formulación farmacéutica. Cualquiera y todas las descripciones de esta solicitud en relación con las formulaciones de un compuesto como se describe pueden aplicarse de manera igual e independiente a las aplicaciones terapéuticas de las poblaciones de linfocitos NK expandidas.

Clave para las SEQ ID NOs

[0154]

SEQ ID NO: 1 - secuencia del gen E4bp4 (X64318.1)

1 gcccctttct ttctcctcgt cggcccgaga gcaggaacac gataacgaag gaggcccaac 61 ttcattcaat aaggagcctg acggatttat cccagacggt agaacaaaag gaagaatatt 121 gatggatttt aaaccagagt ttttaaagag cttgagaata cggggaaatt aatttgttct 181 cctacacaca tagatagggt aaggttgttt ctgatgcagc tgagaaaaat gcagaccgtc 241 aaaaaggagc aggcgtctct tgatgccagt agcaatgtgg acaagatgat ggtccttaat 301 tctgctttaa cggaagtgtc agaagactcc acaacaggtg aggacgtgct tctcagtgaa 361 ggaagtgtgg ggaagaacaa atcttctgca tgtcggagga aacgggaatt cattcctgat 421 gaaaagaaag atgctatgta ttgggaaaaa aggcggaaaa ataatgaagc tgccaaaaga 481 tctcgtgaga agcgtcgact gaatgacctg gttttagaga acaaactaat tgcactggga 541 gaagaaaacg ccactttaaa agctgagctg ctttcactaa aattaaagtt tggtttaatt 601 agctccacag catatgctca agagattcag aaactcagta attctacagc tgtgtacttt

661 caagattacc agacttccaa atccaatgtg agttcatttg tggacgagca cgaaccctcg 721 atggtgtcaa gtagttgtat ttctgtcatt aaacactctc cacaaagctc gctgtccgat 781 gtttcagaag tgtcctcagt agaacacacg caggagagct ctgtgcaggg aagctgcaga 841 agtcctgaaa acaagttcca gattatcaag caagagccga tggaattaga gagctacaca 901 agggagccaa gagatgaccg aggctcttac acagcgtcca tctatcaaaa ctatatgggg 961 aattctttct ctgggtactc acactctccc ccactactgc aagtcaaccg atcctccagc 1021 aactccccga gaacgtcgga aactgatgat ggtgtggtag gaaagtcatc tgatggagaa 1081 gacgagcaac aggtccccaa gggccccatc cattctccag ttgaactcaa gcatgtgcat 1141 gcaactgtgg ttaaagttcc agaagtgaat tcctctgcct tgccacacaa gctccggatc 1201 aaagccaaag ccatgcagat caaagtagaa gcctttgata atgaatttga ggccacgcaa 1261 aaactttcct cacctattga catgacatct aaaagacatt tcgaactcga aaagcatagt 1321 gccccaagta tggtacattc ttctcttact cctttctcag tgcaagtgac taacattcaa 1381 gattggtctc tcaaatcgga gcactggcat caaaaagaac tgagtggcaa aactcagaat 1441 agtttcaaaa ctggagttgt tgaaatgaaa gacagtggct acaaagtttc tgacccagag 1501 aacttgtatt tgaagcaggg gatagcaaac ttatctgcag aggttgtctc actcaagaga 1561 cttatagcca cacaaccaat ctctgcttca gactctgggt aaattactac tgagtaagag 1621 ctgggcattt agaaagatgt catttgcaat agagcagtcc attttgtatt atgctgaatt 1681 ttcactggac ctgtgatgtc atttcactgt gatgtgcaca tgttgtctgt ttggtgtctt 1741 tttgtgcaca gattatgatg aagattagat tgtgttatca ctctgcctgt gtatagtcag 1801 atagtcatat gcgtaaggct gtatatatta agnttttatt tttgttgttc tattataaag 1861 tgtgtaagtt accagtttca ataaaggatt ggtgacaaac acagaaaaaa aaaaaaaaaa 1921 aaa

SEQ ID NO: 2 - secuencia de aminoácidos de E4bp4 (X64318.1)

MQLRKMQTVKKEQASLDASSNVDKMMVLNSALTEVSEDSTTGEDVLLSEGSVGKNKSSACRRKREFIPDEKKDAM YWEKRRKNNEAAKRSREKRRLNDLVLENKLIALGEENATLKAELLSLKLKFGLISSTAYAQEIQKLSNSTAVYFQ DYQTSKSNVSSFVDEHEPSMVSSSCISVIKHSPQSSLSDVSEVSSVEHTQESSVQGSCRSPENKFQIIKQEPMEL ESYTREPRDDRGSYTASIYQNYMGNSFSGYSHSPPLLQWRSSSNSPRTSETDDGWGKSSDGEDEQQVPKGPIH SPVELKHVHATWKVPEWSSALPHKLRIKAKAMQIKVEAFDNEFEATQKLSSPIDMTSKRHFELEKHSAPSMVH SSLTPFSVQVTNIQDWSLKSEHWHQKELSGKTQNSFKTGWEMKDSGYKVSDPENLYLKQGIANLSAEWSLKRL IATQPISASDSG SEQ ID NO: 3 - secuencia del gen REV-ERB-a (NM_021724.4)

1 gggcacgagg cgctccctgg gatcacatgg tacctgctcc agtgccgcgt gcggcccggg 61 aaccctgggc tgctggcgcc tgcgcagagc cctctgtccc agggaaaggc tcgggcaaaa 121 ggcggctgag attggcagag tgaaatatta ctgccgaggg aacgtagcag ggcacacgtc 181 tcgcctcttt gcgactcggt gccccgtttc tccccatcac ctacttactt cctggttgca 241 acctctcttc ctctgggact tttgcaccgg gagctccaga ttcgccaccc cgcagcgctg 301 cggagccggc aggcagaggc accccgtaca ctgcagagac ccgaccctcc ttgctacctt 361 ctagccagaa ctactgcagg ctgattcccc ctacacactc tctctgctct tcccatgcaa 421 agcagaactc cgttgcctca acgtccaacc cttctgcagg gctgcagtcc ggccacccca 481 agaccttgct gcagggtgct tcggatcctg atcgtgagtc gcggggtcca ctccccgccc 541 ttagccagtg cccagggggc aacagcggcg atcgcaacct ctagtttgag tcaaggtcca 601 gtttgaatga ccgctctcag ctggtgaaga catgacgacc ctggactcca acaacaacac 661 aggtggcgtc atcacctaca ttggctccag tggctcctcc ccaagccgca ccagccctga 721 atccctctat agtgacaact ccaatggcag cttccagtcc ctgacccaag gctgtcccac 781 ctacttccca ccatccccca ctggctccct cacccaagac ccggctcgct cctttgggag 841 cattccaccc agcctgagtg atgacggctc cccttcttcc tcatcttcct cgtcgtcatc 901 ctcctcctcc ttctataatg ggagcccccc tgggagtcta caagtggcca tggaggacag 961 cagccgagtg tcccccagca agagcaccag caacatcacc aagctgaatg gcatggtgtt 1021 actgtgtaaa gtgtgtgggg acgttgcctc gggcttccac tacggtgtgc acgcctgcga 1081 gggctgcaag ggctttttcc gtcggagcat ccagcagaac atccagtaca aaaggtgtct 1141 gaagaatgag aattgctcca tcgtccgcat caatcgcaac cgctgccagc aatgtcgctt 1201 caagaagtgt ctctctgtgg gcatgtctcg agacgctgtg cgttttgggc gcatccccaa 1261 acgagagaag cagcggatgc ttgctgagat gcagagtgcc atgaacctgg ccaacaacca

1321 gttgagcagc cagtgcccgc tggagacttc acccacccag caccccaccc caggccccat 1381 gggcccctcg ccaccccctg ctccggtccc ctcacccctg gtgggcttct cccagtttcc 1441 acaacagctg acgcctccca gatccccaag ccctgagccc acagtggagg atgtgatatc 1501 ccaggtggcc cgggcccatc gagagatctt cacctacgcc catgacaagc tgggcagctc 1561 acctggcaac ttcaatgcca accatgcatc aggtagccct ccagccacca ccccacatcg 1621 ctgggaaaat cagggctgcc cacctgcccc caatgacaac aacaccttgg ctgcccagcg 1681 tcataacgag gccctaaatg gtctgcgcca ggctccctcc tcctaccctc ccacctggcc 1741 tcctggccct gcacaccaca gctgccacca gtccaacagc aacgggcacc gtctatgccc 1801 cacccacgtg tatgcagccc cagaaggcaa ggcacctgcc aacagtcccc ggcagggcaa 1861 ctcaaagaat gttctgctgg catgtcctat gaacatgtac ccgcatggac gcagtgggcg 1921 aacggtgcag gagatctggg aggatttctc catgagcttc acgcccgctg tgcgggaggt 1981 ggtagagttt gccaaacaca tcccgggctt ccgtgacctt tctcagcatg accaagtcac 2041 cctgcttaag gctggcacct ttgaggtgct gatggtgcgc tttgcttcgt tgttcaacgt 2101 gaaggaccag acagtgatgt tcctaagccg caccacctac agcctgcagg agcttggtgc 2161 catgggcatg ggagacctgc tcagtgccat gttcgacttc agcgagaagc tcaactccct 2221 ggcgcttacc gaggaggagc tgggcctctt caccgcggtg gtgcttgtct ctgcagaccg 2281 ctcgggcatg gagaattccg cttcggtgga gcagctccag gagacgctgc tgcgggctct 2341 tcgggctctg gtgctgaaga accggccctt ggagacttcc cgcttcacca agctgctgct 2401 caagctgccg gacctgcgga ccctgaacaa catgcattcc gagaagctgc tgtccttccg 2461 ggtggacgcc cagtgacccg cccggccggc cttctgccgc tgcccccttg tacagaatcg 2521 aactctgcac ttctctctcc tttacgagac gaaaaggaaa agcaaaccag aatcttattt 2581 atattgttat aaaatattcc aagatgagcc tctggccccc tgagccttct tgtaaatacc 2641 tgcctccctc ccccatcacc gaacttcccc tcctccccta tttaaaccac tctgtctccc 2701 ccacaaccct cccctggccc tctgatttgt tctgttcctg tctcaaatcc aatagttcac 2761 agctgagctg gcttcaaaaa aaaaaaaaaa aaa

SEQ ID NO: 4 - secuencia de aminoácidos de REV-ERB-a (NM_021724.4)

MTTLDSNNNTGGVITYIGSSGSSPSRTSPESLYSDNSNGSFQSLTQGCPTYFPPSPTGSLTQDPARSFGSIPPSL SDDGSPSSSSSSSSSSSSFYNGSPPGSLQVAMEDSSRVSPSKSTSNITKLNGMVLLCKVCGDVASGFHYGVHACE GCKGFFRRSIQQNIQYKRCLKNENCSIVRINRNRCQQCRFKKCLSVGMSRDAVRFGRIPKREKQRMLAEMQSAMN LANNQLSSQCPLETSPTQHPTPGPMGPSPPPAPVPSPLVGFSQFPQQLTPPRSPSPEPTVEDVISQVARAHREIF TYAHDKLGSSPGNFNANHASGSPPATTPHRWENQGCPPAPNDNNTLAAQRHNEALNGLRQAPSSYPPTWPPGPAH HSCHQSNSNGHRLCPTHVYAAPEGKAPANSPRQGNSKNVLLACPMNMYPHGRSGRTVQEIWEDFSMSFTPAVREV VEFAKHIPGFRDLSQHDQVTLLKAGTFEVLMVRFASLFNVKDQTVMFLSRTTYSLQELGAMGMGDLLSAMFDFSE KLNSLALTEEELGLFTAWLVSADRSGMENSASVEQLQETLLRALRALVLKNRPLETSRFTKLLLKLPDLRTLNN MHSEKLLSFRVDAQ SEQ ID NO: 5 - secuencia del gen REV-ERB-p (AB307693.1)

1 atggaggtga atgcaggagg tgtgattgcc tatatcagtt cttccagctc agcctcaagc 61 cctgcctctt gtcacagtga gggttctgag aatagtttcc agtcctcctc ctcttctgtt 121 ccatcttctc caaatagctc taattctgat accaatggta atcccaagaa tggtgatctc 181 gccaatattg aaggcatctt gaagaatgat cgaatagatt gttctatgaa aacaagcaaa 241 tcgagtgcac ctgggatgac aaaaaatcat agtggtgtga caaaatttag tggcatggtt 301 ctactgtgta aagtctgtgg ggatgtggcg tcaggattcc actatggagt tcatgcttgc 361 gaaggctgta agggtttctt tcggagaagt attcaacaaa acatccagta caagaagtgc 421 ctgaagaatg aaaactgttc tataatgaga atgaatagga acagatgtca gcaatgtcgc 481 ttcaaaaagt gtctgtctgt tggaatgtca agagatgctg ttcggtttgg tcgtattcct 541 aagcgtgaaa aacagaggat gctaattgaa atgcaaagtg caatgaagac catgatgaac 601 agccagttca gtggtcactt gcaaaatgac acattagtag aacatcatga acagacagcc 661 ttgccagccc aggaacagct gcgacccaag ccccaactgg agcaagaaaa catcaaaagc 721 tcttctcctc catcttctga ttttgcaaag gaagaagtga ttggcatggt gaccagagct 781 cacaaggata cctttatgta taatcaagag cagcaagaaa actcagctga gagcatgcag

841 ccccagagag gagaacggat tcccaagaac atggagcaat ataatttaaa tcatgatcat 901 tgcggcaatg ggcttagcag ccattttccc tgtagtgaga gccagcagca tctcaatgga 961 cagttcaaag ggaggaatat aatgcattac ccanatggcc atgccatttg tattgcaaat 1021 ggacattgta tgaacttctc caatgcttat actcaaagag tatgtgatag agttccgata 1081 gatggatttt ctcagaatga gaacaagaat agttacctgt gcaacactgg aggaagaatg 1141 catctggttt gtccaatgag taagtctcca tatgtggatc ctcataaatc aggacatgaa 1201 atctgggaag aattttcgat gagcttcact ccagcagtga aagaagtggt ggaatttgca 1261 aagcgtattc ctgggttcag agatctctct cagcatgacc aggtcaacct tttaaaggct 1321 gggacttttg aggttttaat ggtacggttc gcatcattat ttgatgcaaa ggaacgtact 1381 gtcacctttt taagtggaaa gaaatatagt gtggatgatt tacactcaat gggagcaggg 1441 gatctgctaa actctatgtt tgaatttagt gagaagctaa atgccctcca acttagtgat 1501 gaagagatga gtttgtttac agctgttgtc ctggtatctg cagatcgatc tggaatagaa 1561 aacgtcaact ctgtggaggc tttgcaggaa actctcattc gtgcactaag gaccttaata 1621 atgaaaaacc atccaaatga ggcctctatt tttacaaaac tgcttctaaa gttgccagat 1681 cttcgatctt taaacaacat gcactctgag gagctcttgg cctttaaagt tcacccttaa

SEQ ID NO: 6 - secuencia de aminoácidos di 5 REV-ERB-P (AB307693.1)

MEWAGGVIAYISSSSSASSPASCHSEGSENSFQSSSSSVPSSPNSSNSDTNGNPKNGDLANIEGILKNDRIDCS MKTSKSSAPGMTKNHSGVTKFSGMVLLCKVCGDVASGFHYGVHACEGCKGFFRRSIQQNIQYKKCLKNENCSIMR MNRNRCQQCRFKKCLSVGMSRDAVRFGRIPKREKQRMLIEMQSAMKTMMNSQFSGHLQNDTLVEHHEQTALPAQE QLRPKPQLEQENIKSSSPPSSDFAKEEVIGMVTRAHKDTFMYNQEQQENSAESMQPQRGERIPKNMEQYNLNHDH CGNGLSSHFPCSESQQHLNGQFKGRNIMHYPXGHAICIANGHCMNFSNAYTQRVCDRVPIDGFSQNENKNSYLCN TGGRMHLVCPMSKSPYVDPHKSGHEIWEEFSMSFTPAVKEWEFAKRIPGFRDLSQHDQWLLKAGTFEVLMVRF ASLFDAKERTVTFLSGKKYSVDDLHSMGAGDLLNSMFEFSEKLNALQLSDEEMSLFTAWLVSADRSGIENWSV EALQETLIRALRTLIMKNHPNEASIFTKLLLKLPDLRSLNNMHSEELLAFKVH

SEQ ID NO: 7 - cebador directo A para la detección del alelo de tipo salvaje E4bp4

CT CT GAGCTT GGCT GAT GT G SEQ ID NO: 8 - cebador inverso para la detección de E4bp4

GCTTCAAGTCTCCACCAAGC SEQ ID NO: 9 - cebador para la detección del alelo nulo E4bp4

EJEMPLOS

[0155] La invención se aclarará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que pretenden ser puramente ejemplares de la invención y de ningún modo limitantes.

Ejemplo 1 - La adición de antagonista de REV-ERB-a SR8278 aumenta el porcentaje de producción de linfocitos NK

[0156] Inicialmente, se identificaron sistemáticamente un total de siete compuestos (SR8278, Remodelina, GSK343, UNC0638, HKMT-1-005, SGC0946 y (R)-PFI-2) a 5, 10 y 20 _pM junto con D4476 como control positivo. GSK343, UNC0638, HKMT-1-005, SGC0946 y (R)-PFI-2son inhibidores de metiltransferasa. Los inhibidores de metiltransferasa se analizaron basándose en el efecto del inhibidor de EZH2.

[0157] Las células negativas de linaje se enriquecen para las células progenitoras hematopoyéticas (HPCs). Las HPC se aislaron y cultivaron durante un total de 9 días y los fármacos se añadieron el Día 2 (Figura 2). Las células se recolectaron el día 9 y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la cantidad de células NK1.1 CD3' (Figura 2). NK1.1 y CD3' son dos marcadores de superficie celular que pueden definir linfocitos NK de ratón. Las células estromales OP9 se excluyeron con facilidad del análisis, ya que las células estromales OP9 usadas fueron GFP positivas (Figura 3B). Los datos de citometría de flujo se analizaron a medida que aumentaba el número de veces, en relación con el control "Sin fármaco" o sin tratamiento en cada experimento. Esto se debe a que el porcentaje absoluto de producción de linfocitos NK varía entre experimentos.

[0158] De los siete nuevos compuestos analizados, solo 2 compuestos mostraron un aumento significativo en la producción de linfocitos NK (Figura 3a ), donde otros no lo hicieron (datos no mostrados). La adición de D447620 pM, así como de Remodelina 5 pM, mostró un aumento significativo, pero no tan llamativo como SR8278 10 pM (Figura 3A y 3C). Cuando se añadió SR8278 10 pM, la producción de linfocitos NK aumentó más de 2,4 veces en comparación con el control "sin fármaco" (Figura 3A y 3C). Sin embargo, con SR827820 pM, el compuesto fue tóxico y destruyó la mayoría de las células, por lo tanto, hubo una reducción en la cantidad de linfocitos NK detectados (Figura 4). Se realizaron experimentos adicionales usando SR8278 a 2, 5, 10 y 20 pM para confirmar su actividad. Los resultados fueron consistentes con la identificación sistemática anterior. SR827810 pM mostró el mayor aumento en la producción de linfocitos NK, seguido de 5 pM (Figura 4). [

Ejemplo 2 - Optimización del tiempo de adición de SR8278

[0159] Los efectos de SR8278 se examinaron adicionalmente. En particular, se investigó el mejor momento para añadir SR8278 al cultivo celular. SR8278 se añadió el Día 0, 1, 2, 3 y 4 de cultivo de HPC en condiciones de producción de linfocitos NK. El experimento se realizó usando SR8278 5 y 10 _pM. A 5 _pM, la adición de SR8278 mostró el mayor efecto de la producción de linfocitos NK en el Día 0 con más de 1,4 veces (Figura 5A y 5B). Como era de esperar, la adición de SR8278 10 uM mostró un aumento mayor en la producción de linfocitos NK en comparación con 5 uM (Figura 5A y 5B). El aumento_fue significativo en los Días 0, 1 y 2, en más de 1,6 veces (Figura 5A y 5B). Sin embargo, la adición de SR8278 después del Día 2 no mostró ninguna diferencia significativa con respecto al control "Sin fármaco".

[0160] A pesar de que la adición de SR8278 en los Días 0 y 1 mostró el mayor aumento en el porcentaje de linfocitos NK, la cantidad de células vivas fue notablemente baja en comparación con el control "Sin fármaco" (Figura 5C). Es posible que cuando se añadiese SR8278 para mejorar la expresión de E4bp4 en el Día 0 o el Día 1, las células no se cebaron para diferenciarse en CLPs o NKPs. Una dosis demasiado alta o una adición demasiado temprana de SR8278 no es sostenible. A partir de estos resultados, el Día 2 es el momento óptimo para añadir SR8278 al cultivo de HPC, proporcionando producciones máximas de linfocitos NK, así como conservando recuentos altos de células vivas.

Ejemplo 3 - La administración del agonista de REV-ERB, GSK4112, tiene el efecto opuesto a SR8278

[0161] Se predice que el efecto de SR8278 en el aumento de linfocitos NK fue el resultado de la inhibición de REV-ERB, que normalmente inhibe la expresión de E4bp4. Por lo tanto, el agonista de REV-ERB, GSK4112, se analizó para ver si conduciría a una disminución en la producción de linfocitos NK. El cultivo de HPC más la adición de GSK4112 se realizó exactamente como se ha mostrado anteriormente en la Figura 3.

Estructura de GSK4112 (1,1 -dimetiletil N-[(4-dorofenil)metil]-N-[(5-nitro-2-tienil)metil])glicinato, SR6452)

[0162] Como se predijo, la producción de linfocitos NK se redujo en casi el 50%, cuando se administró GSK4112 (Figura 6).

Esto respalda que la regulación de REV-ERB da lugar al control del desarrollo de linfocitos NK a través de la modulación de la expresión de E4bp4 y que GSK4112 y SR8278 actúan en esta ruta que implica REV-ERB-a y E4bp4.

Ejemplo 4 - SR8278 actúa sobre linfocitos NK a través de E4bp4

[0163] Después del experimento con GSK4112, se predijo que SR8278 actúa a través de la ruta que implica REV-ERB y E4bp4. Para confirmar si SR8278 requiere E4bp4 para aumentar la producción de linfocitos NK, se analizó SR8278 en HPC aisladas de ratones de tipo salvaje (WT) (E4bp4+/+), con genes inactivados E4bp4 (KO) (E4bp4'/_) y heterocigotos (Het) (E4bp4+/_). Los cultivos celulares se realizaron como anteriormente (Figura 3), donde se añadió SR8278 en el Día 2 del cultivo y la producción de linfocitos NK se midió mediante citometría de flujo.

[0164] A diferencia de los Ejemplos anteriores en los que los datos se mostraron en diferencia de veces en relación con el control "Sin fármaco", estos datos se muestran como porcentajes reales de linfocitos NK producidos. Esto se debe a que cuando se usaron ratones E4bp4 KO, el porcentaje de linfocitos NK en el control "Sin fármaco" fue prácticamente cero ya que la ausencia de E4bp4 detiene el desarrollo de linfocitos NK (Figura 7C y 7D). El mayor aumento significativo se puede observar cuando se añadió SR8278 5 |iM y 10 |iM a HPCs en el cultivo aislado de ratones WT en comparación con el control "Sin fármaco" (Figura 7A y 7D). Los efectos del cultivo de HPCs de ratones Het fueron similares a los ratones WT (Figura 7A, 7B y 7D). Por otro lado, hubo una ausencia de linfocitos NK en cultivos de HPCs de ratones E4bp4 KO independientemente de la concentración de SR8278 (Figura 7C y 7D).

[0165] Estos datos respaldan la hipótesis de que SR8278 actúa en la ruta en la que E4bp4 es esencial. La presencia de E4bp4 es obligatoria para que SR8278 aumente satisfactoriamente la producción de linfocitos NK. SR8278 puede inhibir la actividad de REVERB, donde REV-ERB normalmente inhibe la expresión de E4bp4. Por lo tanto, la inhibición de REV-ERB por SR8278 reduce la expresión de E4bp4. La activación de E4bp4 tiene como resultado la promoción del desarrollo de linfocitos NK y más linfocitos NK producidos (Figura 1).

Ejemplo 5 - La adición de SR8278 aumenta la expresión de E4bp4, Id2 y Eomes

[0166] Como los datos presentados en los Ejemplos anteriores indican que SR8278 probablemente actúa en la ruta con REV-ERB y E4bp4 , se predijo que los genes que están bajo control transcripcional de E4bp4 tales como Id2 y Eomes deberían ser regulados al alza cuando la expresión de E4bp4 es regulada al alza. Las HPC aisladas de un ratón WT se cultivaron como anteriormente (Figura 2) pero las células se cosecharon y analizaron usando RT-qPCR en los Días 3, 4 y 5. La expresión relativa de los genes E4bp4, Id2 y Eomes se comparó con el gen constitutivo, Hprt. En el Día 4, la expresión de E4bp4, Id2 y Eomes fue mayor en las muestras tratadas con SR8278 en comparación con el control "Sin fármaco" (Figura 8). El aumento en la expresión de E4bp4 desapareció en el Día 5, pero el aumento de la expresión de Id2 permaneció (Figura 8B). La regulación al alza de E4bp4 y sus dianas corriente abajo se produce en cuestión de horas y solo se mantiene elevada durante un período de tiempo definido.

[0167] Por lo tanto, estos datos respaldan la conclusión de que SR8278 activa la expresión del gen del factor de transcripción E4bp4, ya que las dianas corriente abajo conocidas de E4bp4 (21) también se regularon al alza conjuntamente.

Ejemplo 6 - SR8278 también mejora el desarrollo de linfocitos NK a partir de células CD34+ humanas [0168] La hipótesis de que SR8278 aumenta la producción de linfocitos NK no tendría ningún valor terapéutico potencial si esto tampoco lo tendría para la producción de linfocitos NK humanos. Por lo tanto, se examinó el efecto de SR8278 en la producción de linfocitos NK humanos a partir de HPC humanas. Las HPC humanas se obtuvieron como la población de CD34+ purificada de sangre del cordón umbilical de colaboradores en el Anthony Nolan Research Institute, Londres. El desarrollo de linfocitos NK humanos pasa por una ruta de desarrollo similar al desarrollo de linfocitos NK de ratón. A diferencia del cultivo de HPC de ratón, las células CD34+ humanas se cultivaron directamente sobre células estromales EL08-1D2 en presencia de citocinas IL-3, IL-7, Flt3L, SCF e IL-15 durante 14 y 16 días antes de la recolección y el análisis por citometría de flujo. Para tratar de optimizar la producción de linfocitos NK humanos, se añadió SR82785 o 10 iiM ya sea en el día 2, 4 o 6 del cultivo.

[0169] Los datos mostraron que las células CD34+ humanas eran más sensibles a SR8278 que las HPC de ratón, ya que la adición de SR8278 10 |iM era completamente tóxica para las células. Sin embargo, el efecto de SR8278 5 |iM no fue tóxico y la adición de SR8278 5 |iM en el Día 2 mostró un claro aumento en el número de linfocitos NK (Figura 9). Los datos se muestran como porcentaje de linfocitos NK puesto que desde el Día 14 hasta el Día 16, el número de linfocitos NK aumentó exponencialmente de 5 % a 20 % en el control "Sin fármaco" (Figura 9). La adición de SR82785 |iM en el Día 4 casi triplicó el porcentaje de linfocitos NK cuando se cosecharon las células en el Día 14, aumentando de 5,53 % a 13,7 % (Figura 9). Por otro lado, el porcentaje de linfocitos NK se duplicó cuando se cosecharon en el Día 16, aumentando de 21,8 % a 44,3 % (Figura 9).

Ejemplo 7 - E4bp4 puede ser inhibido tanto por REV-ERB-a como por REV-ERB-B

[0170] El trabajo anterior ha enfatizado la acción de REV-ERB-a en la inhibición de la expresión de E4bp4, pero el papel del REV-ERB homólogo REV-ERB-p no se ha investigado. Por lo tanto, en la presente investigación se decidió examinar directamente el efecto de la eliminación del gen REV-ERB-a en la producción de linfocitos NK. Los Ejemplos anteriores sugieren que los ratones REV-ERB-a KO mejorarían la expresión de E4bp4 y, por lo tanto, mejorarían el desarrollo de linfocitos NK. Las HPC extraídas de médula ósea, así como los esplenocitos tomados de ratones WT (Rev-erb-a /+) y REV-ERB-a KO (Rev-erb-a V') se analizaron mediante citometría de flujo. Si REV-ERB-a es responsable de la regulación de la producción de linfocitos NK, debe haber un mayor número de células NKP y NK en la médula ósea y, potencialmente, también en el bazo.

[0171] Sin embargo, como se muestra en la Figura 10 , en ratones REV-ERB-a KO, el porcentaje de células NK y NKP no fue diferente del WT. Estos hallazgos sugieren que tanto REV-ERB-a como REV-ERB-p, que es un homólogo de REV-ERB-a, pueden estar inhibiendo la expresión de E4bp4. Cuando falta REV-ERB-a, REVERB-p puede compensar la actividad de REV-ERB-a. Respaldando esta hipótesis, los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina en REV-ERB-a y REV-ERB-p han demostrado que tanto REV-ERB-a como REV-ERB-p se unen al locus de E4bp4 en exactamente las mismas regiones. Por otra parte, SR8278 es en realidad un inhibidor doble, que inhibe tanto REV-ERB-a como REV-ERB-p. Por lo tanto, el aumento de linfocitos NK cuando se administró SR8278 puede ser el resultado de la inhibición de ambos REV-ERB.

[0172] Esto se ve respaldado por los datos reportados en la Figura 11A, que demuestran que los ratones deficientes tanto de REV-ERB-a como de REV-ERB-p tienen un aumento muy significativo en la cantidad de linfocitos NKP. La Figura 11B proporciona evidencia adicional en apoyo de la función conjunta de REV-ERB-a y REV-ERB-p. La Figura 11B muestra que en ratones mutantes con ambos genes de REV-ERB eliminados (DKO) hay un aumento constante en las cantidades de linfocitos NKP en comparación con otros ratones de "control" (WT, ratones con solo un alelo de REV-ERB-a y REV-ERB-p eliminado (aHet/pHet), y ratones con ambas copias de REV-ERB-p eliminadas (pKO)), mientras que otras células progenitoras no se ven afectadas.

[0173] Por lo tanto, los presentes inventores han proporcionado la primera evidencia de que la inhibición de REV-ERB-a y REV-ERB-p, tiene potencial terapéutico para aumentar el número de linfocitos NK, y que dicha inhibición se puede lograr usando compuestos de la invención tales como SR8278.

Materiales y procedimientos

Ratones

[0174] Se usaron ratones de tipo salvaje, ratones heterocigotos E4bp4 (E4bp4*/-), ratones con genes inactivados E4bp4 (E4bp4V’), ratones con genes inactivados REV-ERB-a (Rev-erb-a-/), ratones con genes inactivados REV-ERB-p (Rev-erb-p-/ o pKO), ratones con genes inactivados doble REV-ERB-a y p (Rev-erb-a’/’ p’/’ o DKO) y ratones heterocigotos REV-ERB-a y p (Rev-erb-a+/ p+/- o aHet/pHet). Todos los ratones estaban en un fondo C57BL/6, entre 6 y 12 semanas de edad y emparejados por edad y sexo. Los ratones Rbpjflox/flox estaban en un fondo de FVB. Todos los procedimientos experimentales y de cría de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y las directrices locales. Se genotipificaron ratones E4bp4 con el cebador directo 5'CTCTGAGCTGGCTGATGTG3' (cebador A) y el cebador inverso 5'GCTTCAAG^tC^tCCACCAAGC3' (cebador B) para la detección del alelo de tipo salvaje o 5'CCATGCTCCTGTCTTGATGA3' para la detección del alelo nulo.

Células y cultivo celular

[0175] Las células estromales OP9-GFP se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) (Sigma Aldrich) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 20 % y penicilina/estreptavidina (P/S). Para los experimentos realizados en placas de 96 pocillos, las células estromales OP9 se sembraron en placas a la concentración de 2000 células/pocillo y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 1 día antes de la adición de HPCs. Para los experimentos realizados en placas de 24 pocillos, las células estromales OP9 se sembraron en placas a la concentración de 4000 células/pocillo y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 2 días antes de la adición de HPCs. Las células estromales EL08.1D2 se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle - modificación alfa (Alfa-MEM) complementado con 50 % de Myelocult M5300 (Stem Cell Technologies), 7,5 % de FBS, 50 pM de p-Mercaptoetanol, 1 pM de hidrocortisona y 1 % de P/S (Sigma Aldrich). Para los experimentos con células progenitoras CD34+ humanas, se irradiaron EL08.1D2 a 3000 rads/30 Gy y se sembraron en placas recubiertas con gelatina EmbryoMax de 96 pocillos (Millipore) a la concentración de 20.000 células/pocillo. Se cultivaron a 32 °C, CO2 al 5 % durante la noche, antes de que las células CD34+ se transfirieran a ellas.

Aislamiento de HPCs de ratón

[0176] Las HSC negativas de linaje se purificaron a partir de médula ósea de ratón triturando los huesos de las patas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con suero de ternera fetal (FCS) al 2 % (STEMCELL Technologies), se llenaron hasta 40 ml con tampón de clasificación celular activada magnéticamente (MAC) (PBS, EDTA 2 mM, o 5 % de BSA, estéril y filtrado) y se centrifugaron a 800 g durante 2 minutos. Las células se volvieron a suspender en un cóctel conjugado con PE, (20 pl de anti-B220 (RA3-6B2), anticuerpos anti-CD2 de ratón (RM2-5, anti-Ter119 (TER119) y anti-NK.1.1 (PK136) y 5 pl de anti-CD11b (M1/70) y anti-GR-1 (RB6-8C5) (todos de Bioscience)) incubados durante 5 minutos a 4 °C, centrifugados y resuspendidos en microperlas anti-PE durante 15 minutos a 4 °C. Las células se lavaron en un tampón MACS y se pasaron a través de columnas MACS. Esto permitió la selección negativa de HPCs. Después de la eliminación del linaje, se analizaron 50 pl de las células mediante citometría de flujo para verificar la pureza.

Desarrollo in vitro de linfocitos NK a partir de HPCs

[0177] Las HPC se sembraron en placas y se cultivaron en placas de 24 pocillos a una concentración de 5x105 HPC/pocillo en 1 ml de medio de citocina completo (medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Sigma Aldrich), 10% FCS, 50 pM de p-Mercaptoetanol, 10 ng/ml de ligando Flt3 (Flt3L) (R&D Systems), 10 ng/ml de IL-7 (R&D Systems), 100 ng/ml de factor de células madre (SCF) (R&D Systems) y 1 % de P/S) durante 2 días a 37 °C, CO2 al 5 %. Luego, las HPC se transfirieron a células OP9 a 4500 células/pocillo para experimentos en placas de 96 pocillos y 3x104 células/pocillo para experimentos en placas de 24 pocillos en medio de diferenciación de linfocitos NK de ratón (Alfa-MEM (Sigma Aldrich) más 20 % de Fc S, 1 % de P/S y 30 ng/ml de IL-15). Las células se dejaron en cultivo a 37 °C, 5 % de CO2 durante 7 días con un cambio de medio de diferenciación de linfocitos NK de ratón en el día 3 o 4. Desarrollo in vitro de células progenitoras de sangre de cordón umbilical humano

[0178] Las células progenitoras de sangre de cordón umbilical CD34+fueron proporcionadas por Anthony Nolan Research Institute, University College, Londres. Estas células se aislaron de sangre de cordón umbilical y se crioconservaron en nitrógeno líquido para su almacenamiento y transporte. Las células se descongelaron, se contaron y luego se sembraron en placas en placas EL08.1D2 preparadas previamente a una concentración de 1000 células/pocillo en medio de diferenciación de linfocitos NK humanos (alfa-MEM más seroAB humana al 20 % (Invitrogen), 50 pM de p-Mercaptoetanol y 1 % de P/S junto con 5 ng/ml de IL-3 humana (Peprotech), 20 ng/ml de IL-7 humana (Peprotech), 10 ng/ml de FLT3-L humano (Peprotech), 20 ng/ml de SCF humano (Peprotech) y 10 ng/ml de IL-15 humana (Peprotech). Tenga en cuenta que la IL-3 humana solo es necesario para la primera semana de cultivo. Las células se dejaron en el cultivo a 37 °C, CO2 al 5 % durante 14 o 16 días con un cambio del medio de diferenciación de NK humanos en los días 7 y 12.

Citometría de flujo

[0179] Las células que se analizarán mediante citometría de flujo se pasaron a través de tamices celulares de 40 pm para eliminar los aglutinamientos y se lavaron con tampón PBS, se centrifugaron a 800 g durante 2 minutos y se volvieron a suspender en un tampón de clasificación de celular activado por fluorescencia (FACS) de 100 pl (PBS más BSA al 1 %) con anticuerpos conjugados con fluorocromo adecuados a una dilución de 1 en 300. Las células se tiñeron con los siguientes anticuerpos, todos los cuales eran anti-ratón y son de eBioscience a menos que se especifique: 2B4 (clon m2B4(B6)458.1; BioLegend), CD2 (RM2-5),CD3 (17A2), CD11b (M1/70), CD19 (1D3), CD27 (LG.7F9), CD122 (TM-b1), CD127 (A7R34), B220 (RA3-6B2), ckit (ACK2), Flt3 (A2F10), Gr1 (RB6-8C5), NK1.1 (PK136), Sca1 (D7), Ter119 (TER119), NKp46 (29A1.4) anti-CD45 humano (HI30), anti-CD2 humano (RPA-2.10) y anti-CD56 humano (CMSSB). El cóctel de linaje contenía B220, CD2, CD11b, Gr1, NK1.1 y Ter119. Las células se tiñeron en la oscuridad a 4 °C durante 30 minutos y luego se lavaron con 2 ml de tampón FACS, se centrifugaron y volvieron a suspender en 300 pl de tampón FACS más yoduro de propidio (PI) también a una dilución de 1 en 300. La citometría de flujo se realizó usando el analizador de células LSRFortessa™ (Becton Dickinson Bioscience), se clasificó usando FACSAria (Becton Dickinson) como se indica y se realizó un análisis de datos completo usando FlowJo Software.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

[0180] Las reacciones de PCR individuales contenían 200 pM de dNTPS, 1 pM de cebador directo (cebador A), 1 pM de cebador inverso (cebador B o C) y 0,5 U de polimerasa Taq. Las reacciones de PCR se establecieron en las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 minutos (1 ciclo); 94 °C durante 30 segundos, 59 °C durante 3 segundos, 72 °C durante 45 segundos (40 ciclos); 72 °C durante 3 minutos (1 ciclo); mantener a 4 °C.

Electroforesis de ADN

[0181] La electroforesis de ADN se realizó usando agarosa al 1 % (Sigma) disuelta en tampón TAE más 500 ng/ml de bromuro de etidio (Sigma). El ADN obtenido de las reacciones de PCR se analizó mediante electroforesis en gel y se realizó a 100 voltios durante aproximadamente 45 minutos. Los geles se obtuvieron por imágenes usando EC3 Imaging System (Ultra Violet Products Ltd).

Purificación de ARN

[0182] El ARN se extrajo usando el kit Qiagen RNeasy Micro según el protocolo del fabricante (Qiagen). La centrifugación se realizó a 8000 g durante 15 segundos y el flujo continuo se descartó. En resumen, se añadieron 350 pl de tampón RLT 10 % (p-mercaptoetanol a las células recolectadas. El ARN se precipitó adicionalmente usando 300 pl de etanol al 70 % y se transfirió a la columna de centrifugación RNeasy MinElute y se centrifugó. A continuación, se añadieron 350 pl de tampón RW1 a la columna de centrifugación MinElute y se centrifugaron. A esto le siguió por la adición de 10 pl de DNasa I (Qiagen) y 70 pl de tampón RDD (Qiagen) y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 350 pl de tampón RW1 para lavar la DNasa I y se centrifugaron. Se añadieron 500 pl de tampón RPE a la columna y se centrifugaron, seguido de la adición de 500 pl de etanol al 80 % y se centrifugaron durante 2 minutos. Finalmente, se añadieron 14 pl de agua libre de RNasa para eluir el ARN y la columna se centrifugó durante 1 minuto a velocidad máxima. La concentración de ARN en cada muestra se midió usando Nanodrop, y todas las muestras se diluyeron a la misma concentración de trabajo.

Transcripción inversa (conversión de ARN en ADNc)

[0183] La transcripción inversa se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena transcriptor (Roche). Siguiendo el protocolo del fabricante, se preparó una mezcla plantilla-cebador para una reacción de 20 pl, donde todos los reactivos se proporcionan en el kit: ARN (1 pg a 5 pg), 2 pl de cebador hexámero aleatorio, recubrir la reacción hasta 13 pl con agua (calidad PCR). A continuación, la mezcla de plantilla-cebador se desnaturalizó calentando el tubo durante 10 minutos a 65 °C para eliminar las estructuras secundarias de ARN. A esa mezcla de plantilla-cebador, se añadieron 4 pl de tampón de reacción de transcriptasa inversa transcriptor, 0,5 pl de inhibidor de RNasa protector, 2 pl de mezcla de desoxinucleótidos y 0,5 pl de transcriptasa inversa transcriptor. Los reactivos se mezclaron y se colocaron en un ciclador de bloque térmico con los siguientes ajustes: 25 °C durante 10 minutos; 55 °C durante 30 minutos; 85 °C durante 5 minutos y almacenar a 4 °C.

Cuantificación de ARN expresado diana usando qPCR en tiempo real [0184]

Condiciones usadas para RT-qPCR

[0185] Se construyó una curva estándar usando ADNc de esplenocitos diluido a 1, 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000. A los 2 ml de ADNc producidos en la etapa anterior, se añaden 5 pl de mezcla maestra de Taqman (Applied Biosystem), 0,5 pl de kit de ensayo de expresión génica de Taqman de Hprt, Nfil3, Id2 o Eomes (Applied Biosystem) y 2,5 pl de agua libre de RNasa. El programa usado se muestra en la Tabla 1 y la reacción se analizó durante 47 ciclos.

Análisis estadístico

[0186] El análisis estadístico se realizó usando la prueba de Mann-Whitney en GraphPad Prism 7 Análisis

[0187] Los linfocitos NK son linfocitos que son capaces de producir citocinas, influir en otras células inmunitarias, así como destruir células cancerosas, infectadas por patógenos o dañadas directamente. Debido a estas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento ex vivo para expandir una población de linfocitos NK, que comprende las etapas de: a) cultivar una muestra que comprende células progenitoras hematopoyéticas (HPC) obtenida de un paciente; b) poner en contacto dicha muestra con un compuesto que inhibe la acción de REV-ERB; y

c) expandir dichas células in vitro para producir una población de linfocitos NK.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, donde dicho compuesto aumenta la expresión de E4bp4 al disminuir la actividad de REV-ERB.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, donde dicho compuesto disminuye la actividad de (a) REV-ERB-a y/o REV-ERB-p, preferentemente REV-ERB-p; o

(b) REV-ERB-a y REV-ERB-p.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto es: (a) un antagonista de REV-ERB, preferentemente un antagonista de REV-ERB-a y REV-ERB-p; y/o

(b) seleccionado de entre una molécula pequeña, un reactivo PROTAC, un ARN bicatenario (ARNbc), un ARN de interferencia pequeña (ARNip), un ARN de horquilla pequeña (ARNhp), un microARN, un ARN antisentido, un aptámero, un anticuerpo, una ribozima, un péptido o un peptidomimético, donde preferentemente el compuesto es una molécula pequeña.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto es SR8278, ARN5187, 2-(5-metilfuran-2-carbonil)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato de etilo, 4-((4-clorobencil)((5-nitrotiofen-2-il)metil)amino)-N-fenilpiperidin-1-carboxamida, 4-(((1-(4-fluorofenil)ciclopentil)amino)metil)-2-((4-metilpiperazin-1 -il)metil)fenol, 1-(2-fluorofenil)-N-(3-((1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina o 1-(4-fluorofenil)-N-(3-(1-metilpiperidin-4-il)metil)bencil)ciclopentan-1-amina, preferentemente SR8278.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la muestra de HPCs se obtiene de médula ósea, sangre de cordón umbilical y/o sangre periférica.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el compuesto se añade dentro de los 2 días posteriores al aislamiento de las HPCs en la muestra de la reivindicación 1(a).