ES2929143T3 - Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex - Google Patents
Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex Download PDFInfo
- Publication number
- ES2929143T3 ES2929143T3 ES14822995T ES14822995T ES2929143T3 ES 2929143 T3 ES2929143 T3 ES 2929143T3 ES 14822995 T ES14822995 T ES 14822995T ES 14822995 T ES14822995 T ES 14822995T ES 2929143 T3 ES2929143 T3 ES 2929143T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- cell
- nucleic acid
- rna
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 62
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 89
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 39
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 23
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 8
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 6
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 12
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 101150028859 TFS1 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101100371494 Caenorhabditis elegans ubc-1 gene Proteins 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 101100247319 Drosophila melanogaster Ras64B gene Proteins 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 5
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 5
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 5
- 102220575589 Synaptotagmin-13_S97A_mutation Human genes 0.000 description 5
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 5
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 101150103592 SCH9 gene Proteins 0.000 description 4
- 101000712539 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) Transcription factor S1 Proteins 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 3
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 101150019218 RAS2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 2
- 101150008604 CAN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 101000608597 Dictyostelium discoideum Ubiquitin conjugating enzyme E2 B Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 241000423296 Gluconacetobacter diazotrophicus PA1 5 Species 0.000 description 2
- 101000644689 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 K Proteins 0.000 description 2
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 2
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 2
- 102100020696 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 K Human genes 0.000 description 2
- 230000008970 bacterial immunity Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001041760 Acidothermus cellulolyticus 11B Species 0.000 description 1
- 241000417230 Actinobacillus succinogenes 130Z Species 0.000 description 1
- 241000778935 Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 Species 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000589941 Azospirillum Species 0.000 description 1
- 241000257169 Bacillus cereus ATCC 10987 Species 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- 241000586987 Bifidobacterium dentium Bd1 Species 0.000 description 1
- 241001209261 Bifidobacterium longum DJO10A Species 0.000 description 1
- 241000589173 Bradyrhizobium Species 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 241001453247 Campylobacter jejuni subsp. doylei Species 0.000 description 1
- 241000941427 Campylobacter lari RM2100 Species 0.000 description 1
- 241001034636 Capnocytophaga ochracea DSM 7271 Species 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 241001509423 Clostridium botulinum B Species 0.000 description 1
- 241001509504 Clostridium botulinum F Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 241001487058 Corynebacterium efficiens YS-314 Species 0.000 description 1
- 241000671338 Corynebacterium glutamicum R Species 0.000 description 1
- 241001525611 Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385 Species 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241001082278 Desulfovibrio salexigens DSM 2638 Species 0.000 description 1
- 241000688137 Diaphorobacter Species 0.000 description 1
- 241000933091 Dinoroseobacter shibae DFL 12 = DSM 16493 Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000448576 Elusimicrobium minutum Pei191 Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000608038 Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes S85 Species 0.000 description 1
- 241000359186 Finegoldia magna ATCC 29328 Species 0.000 description 1
- 241000382842 Flavobacterium psychrophilum Species 0.000 description 1
- 101150106478 GPS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241001453258 Helicobacter hepaticus Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010015268 Integration Host Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 1
- 241001596092 Kribbella flavida DSM 17836 Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 description 1
- 241001427851 Lactobacillus salivarius UCC118 Species 0.000 description 1
- 241001193656 Legionella pneumophila str. Paris Species 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241001378931 Methanococcus maripaludis C7 Species 0.000 description 1
- 241000825684 Mycobacterium abscessus ATCC 19977 Species 0.000 description 1
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 description 1
- 241000107400 Mycoplasma mobile 163K Species 0.000 description 1
- 241001135743 Mycoplasma penetrans Species 0.000 description 1
- 241000051161 Mycoplasma synoviae 53 Species 0.000 description 1
- 101100247323 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ras-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001648684 Nitrobacter hamburgensis X14 Species 0.000 description 1
- 241001037736 Nocardia farcinica IFM 10152 Species 0.000 description 1
- 241000601272 Parvibaculum lavamentivorans DS-1 Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 241000981393 Persephonella marina Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000773205 Pseudarthrobacter chlorophenolicus A6 Species 0.000 description 1
- 241000695265 Pseudoalteromonas atlantica T6c Species 0.000 description 1
- 241000647111 Rhodococcus erythropolis PR4 Species 0.000 description 1
- 241001459443 Rhodococcus jostii RHA1 Species 0.000 description 1
- 241001113889 Rhodococcus opacus B4 Species 0.000 description 1
- 241001303434 Rhodopseudomonas palustris BisB18 Species 0.000 description 1
- 241001303431 Rhodopseudomonas palustris BisB5 Species 0.000 description 1
- 241000134686 Rhodospirillum rubrum ATCC 11170 Species 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000516659 Roseiflexus Species 0.000 description 1
- 241000504328 Roseiflexus castenholzii DSM 13941 Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000933177 Shewanella pealeana ATCC 700345 Species 0.000 description 1
- 241001496704 Slackia heliotrinireducens DSM 20476 Species 0.000 description 1
- 241000756832 Streptobacillus moniliformis DSM 12112 Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241001209210 Streptococcus agalactiae A909 Species 0.000 description 1
- 241001540742 Streptococcus agalactiae NEM316 Species 0.000 description 1
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 description 1
- 241001167808 Streptococcus gallolyticus UCN34 Species 0.000 description 1
- 241001147754 Streptococcus gordonii str. Challis Species 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 241000672607 Streptococcus mutans NN2025 Species 0.000 description 1
- 241000320123 Streptococcus pyogenes M1 GAS Species 0.000 description 1
- 241000103155 Streptococcus pyogenes MGAS10270 Species 0.000 description 1
- 241000103160 Streptococcus pyogenes MGAS10750 Species 0.000 description 1
- 241000103154 Streptococcus pyogenes MGAS2096 Species 0.000 description 1
- 241001520169 Streptococcus pyogenes MGAS315 Species 0.000 description 1
- 241001148739 Streptococcus pyogenes MGAS5005 Species 0.000 description 1
- 241001332083 Streptococcus pyogenes MGAS6180 Species 0.000 description 1
- 241000103156 Streptococcus pyogenes MGAS9429 Species 0.000 description 1
- 241001496716 Streptococcus pyogenes NZ131 Species 0.000 description 1
- 241001455236 Streptococcus pyogenes SSI-1 Species 0.000 description 1
- 241000192593 Synechocystis sp. PCC 6803 Species 0.000 description 1
- 241001496699 Thermomonospora curvata DSM 43183 Species 0.000 description 1
- 241000322994 Tolumonas auensis DSM 9187 Species 0.000 description 1
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000999858 Treponema denticola ATCC 35405 Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000847071 Verminephrobacter eiseniae EF01-2 Species 0.000 description 1
- 241000605939 Wolinella succinogenes Species 0.000 description 1
- 241000883281 [Clostridium] cellulolyticum H10 Species 0.000 description 1
- 241000714896 [Eubacterium] rectale ATCC 33656 Species 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- -1 by co-transformation Chemical class 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 230000009221 stress response pathway Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Se proporcionan métodos de ingeniería genómica múltiplex en células que usan Cas9, que incluyen un ciclo de pasos para introducir en la célula un primer ácido nucleico extraño que codifica uno o más ARN complementarios al ADN objetivo y que guían la enzima hacia el ADN objetivo, en el que uno o más ARN y la enzima son miembros de un complejo de colocalización para el ADN diana, y la introducción en la célula de un segundo ácido nucleico extraño que codifica una o más secuencias de ácido nucleico donante, y donde el ciclo se repite un número deseado de veces para ingeniería de ADN multiplex en células. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los sistemas CRISPR-Cas de bacterias y arqueas se basan en ARN guía cortos en complejos con proteínas Cas para dirigir la degradación de secuencias complementarias presentes en el ácido nucleico extraño invasor. Véase Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. y Siksnys, V. Cas9-ARNcr ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011); y Bhaya, D., Davison, M. y Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011). Una reconstitución in vitro reciente del sistema CRISPR tipo II de S. pyogenes demostró que ARNcr ("ARN de CRISPR") fusionado con un ARNtracr normalmente codificado en trans ("a Rn CRISPR transactivador") es suficiente para dirigir la proteína Cas9 para escindir, de manera específica de secuencia, secuencias de ADN diana que coincidan con el ARNcr. La expresión de un ARNg homólogo a un sitio diana da como resultado el reclutamiento de Cas9 y la degradación del a Dn diana. Véase H. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008).
Gratz et al., (Genetics, 194, 1029-1035, 2013) dan a conocer la inyección conjunta de Cas9 y dos ARN guía en embriones de drosófila para inducir de manera simultánea roturas bicatenarias en múltiples dianas genómicas. DiCarlo et al., (Nucleic Acids Research, 41, 4336-4343, 2013) dan a conocer la transformación conjunta de un plásmido ARN guía con un ADN donante en células de levadura que expresan Cas9.
CARACTERÍSTICAS
La presente invención se refiere a un procedimiento para realizar múltiples alteraciones en el ADN diana en una célula, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se pueden conseguir múltiples inserciones de ácidos nucleicos exógenos mediante una sola etapa de introducción en una célula, que expresa la enzima, de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de ARN y de una pluralidad de ácidos nucleicos exógenos donantes, tal como mediante transformación conjunta, en la que los ARN se expresan y en la que cada ARN de la pluralidad guía la enzima a un sitio particular del ADN, la enzima corta el ADN y uno de la pluralidad de ácidos nucleicos exógenos se inserta en el ADN en el sitio de corte. Se pueden crear muchas alteraciones o modificaciones del ADN en la célula en un solo ciclo.
Se pueden conseguir múltiples inserciones de ácidos nucleicos exógenos en una célula mediante etapas o ciclos repetidos de introducción en una célula, que expresa la enzima, de uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más ARN o una pluralidad de ARN y de uno o más ácidos nucleicos exógenos o una pluralidad de ácidos nucleicos exógenos, en los que el ARN se expresa y guía la enzima a un sitio particular del ADN, la enzima corta el ADN y el ácido nucleico exógeno se inserta en el ADN en el sitio de corte, para dar como resultado una célula que tiene múltiples alteraciones o inserciones de ADN exógeno en el ADN dentro de la célula. La célula que expresa la enzima puede ser una célula que expresa la enzima de forma natural o una célula que ha sido alterada genéticamente para expresar la enzima, tal como mediante la introducción en la célula de un ácido nucleico que codifica la enzima y que puede ser expresada por la célula. Las etapas de introducir el ARN en una célula que expresa la enzima, introducir ácido nucleico exógeno donante en la célula, expresar el ARN, formar un complejo de colocalización del ARN, la enzima y el ADN, cortar enzimáticamente el ADN por la enzima, e insertar el ácido nucleico donante en el ADN se pueden realizar en ciclos. La realización de ciclos o la repetición de las etapas anteriores da como resultado una modificación genética múltiplex de una célula en múltiples loci, es decir, una célula que tiene múltiples modificaciones genéticas.
El procedimiento en ciclos puede aumentar la tasa de recombinación homóloga. El corte de ADN dirigido por Cas9 genómico estimula el ADN exógeno a través del aumento drástico de la tasa de recombinación homóloga. El ácido nucleico exógeno donante puede incluir secuencias de homología o brazos que flanquean el sitio de corte. El ácido nucleico exógeno donante puede incluir una secuencia para eliminar la secuencia cortada. El ácido nucleico exógeno donante puede incluir secuencias de homología o brazos que flanquean el sitio de corte y una secuencia para eliminar el sitio de corte. De esta manera, se puede utilizar Cas9 como selección negativa respecto a células que no incorporan el ADN exógeno donante.
Entre las proteínas o enzimas de unión al ADN se incluyen una proteína que forma un complejo con el ARN guía, guiando el ARN guía al complejo a una secuencia de ADN bicatenario, en la que el complejo se une a la secuencia de ADN. La enzima puede ser una proteína de unión a ADN guiada por ARN, tal como una proteína de unión a ADN
guiada por ARN de un sistema CRISPR de tipo II que se une al ADN y está guiada por ARN. Según un aspecto, la proteína de unión a ADN guiada por ARN es una proteína Cas9.
Según un aspecto, la célula es una célula eucariota. Según un aspecto, la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal. Según un aspecto, la célula es una célula de mamífero.
Según un aspecto, el ARN tiene entre, aproximadamente, 10 y, aproximadamente, 500 nucleótidos. Según un aspecto, el a Rn tiene entre, aproximadamente, 20 y, aproximadamente, 100 nucleótidos.
Según un aspecto, el uno o más ARN es un ARN guía. Según un aspecto, el uno o más ARN es una fusión ARNtracr-ARNcr.
Según un aspecto, el ADN es ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
Las anteriores y otras características y ventajas de las presentes realizaciones se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción detallada de realizaciones ilustrativas, tomadas junto con los dibujos adjuntos, en los que: La figura 1 es un esquema de la escisión del genoma guiada por ARN mediante Cas9.
La figura 2 es un esquema que representa la ingeniería genómica múltiplex en levadura utilizando Cas9.
La figura 3 es un esquema que representa la sustitución de alelos utilizando oligonucleótidos dirigidos a cuatro loci cruciales para la termotolerancia en la levadura.
La figura 4 es un gráfico que representa el número de modificaciones por célula después de un ciclo y después de dos ciclos.
La figura 5A es una tabla de cepas que tienen mutaciones. La figura 5B muestra la termotolerancia al choque térmico para las diversas cepas.
La figura 6A representa datos gráficos para la frecuencia de transformación. La figura 6B representa datos gráficos para la frecuencia de recombinación individual. La figura 6C representa datos gráficos para la frecuencia de recombinación conjunta en los loci can1 y KanMX.
La figura 7 representa datos gráficos para la incorporación de casetes lineales multiplexados para dos loci.
La figura 8A representa datos gráficos para el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 30 °C. La figura 8B representa datos gráficos para el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 37 °C. La figura 8C representa datos gráficos para el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 42 °C con células inoculadas a partir del cultivo en fase estacionaria tardía. La figura 8D representa datos gráficos para el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 42 °C con células inoculadas a partir del cultivo en fase logarítmica tardía.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Las realizaciones de la presente invención se basan en la utilización repetida de ADN exógeno, enzimas nucleasas, tales como proteínas de unión a ADN y ARN guía para colocalizarse en ADN y digerir o cortar el ADN con la inserción del ADN exógeno, tal como mediante recombinación homóloga. Estas proteínas de unión al ADN son conocidas fácilmente por los expertos en la materia por su unión al ADN para diversos fines. Estas proteínas de unión a ADN pueden existir de forma natural. Entre las proteínas de unión a ADN incluidas dentro del alcance de la presente invención se incluyen aquellas que pueden ser guiadas por ARN, denominadas en el presente documento como ARN guía. Según este aspecto, el ARN guía y la proteína de unión a ADN guiada por ARN forman un complejo de colocalización en el ADN. Estas proteínas de unión a ADN que tienen actividad de nucleasa son conocidas por los expertos en la materia e incluyen proteínas de unión a ADN de origen natural que tienen actividad de nucleasa, tales como las proteínas Cas9 presentes, por ejemplo, en los sistemas CRISPR de tipo II. Estas proteínas Cas9 y los sistemas CRISPR de tipo II están bien documentados en la técnica. Véase Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, vol. 9, junio de 2011, págs. 467-477, incluida toda la información complementaria, que se incorpora en su totalidad al presente documento como referencia.
Las proteínas de unión a ADN de ejemplo que tienen actividad de nucleasa funcionan fragmentando o cortando ADN bicatenario. Esta actividad de nucleasa puede ser el resultado de que la proteína de unión al ADN tenga una o más secuencias polipeptídicas que muestren actividad de nucleasa. Estas proteínas de unión a ADN de ejemplo pueden tener dos dominios de nucleasa separados con cada dominio responsable de cortar o fragmentar una cadena particular del ADN bicatenario. Entre las secuencias polipeptídicas de ejemplo que tienen actividad de nucleasa conocidas por los expertos en la materia se incluyen el dominio relacionado con la nucleasa McrA-HNH y el dominio de nucleasa de tipo RuvC. Por consiguiente, ejemplos de proteínas de unión a ADN son aquellos que en la naturaleza contienen uno o más del dominio relacionado con la nucleasa McrA-HNH y el dominio de nucleasa de tipo RuvC.
Una proteína de unión a ADN de ejemplo es una proteína de unión a ADN guiada por ARN de un sistema CRISPR de tipo II. Una proteína de unión a ADN de ejemplo es una proteína Cas9.
En S. pyogenes, Cas9 genera una ruptura de las dobles cadenas de extremos romos 3 pb en dirección 5’ del motivo adyacente al protoespaciador (PAM, protospacer-adjacent motif) a través de un proceso mediado por dos dominios catalíticos en la proteína: un dominio HNH que escinde la cadena complementaria del ADN y un dominio de tipo RuvC que escinde la cadena no complementaria. Véase Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012). Se sabe que las proteínas Cas9 existen en muchos sistemas CRISPR de tipo II, entre los que se incluyen los siguientes, tal como se identifica en la información complementaria de Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, vol. 9, junio de 2011, págs. 467-477: Methanococcus maripaludis C7; Corynebacterium diphtheriae; Corynebacterium efficiens YS-314; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Kitasato; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Bielefeld; Corynebacterium glutamicum R; Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385; Mycobacterium abscessus ATCC 19977; Nocardia farcinica IFM10152; Rhodococcus erythropolis PR4; Rhodococcus jostii RHA1; Rhodococcus opacus B4 uid36573; Acidothermus cellulolyticus 11B; Arthrobacter chlorophenolicus A6; Kribbella flavida DSM 17836 uid43465; Thermomonospora curvata DSM 43183; Bifidobacterium dentium Bd1; Bifidobacterium longum DJO10A; Slackia heliotrinireducens DSM 20476; Persephonella marina EX HI; Bacteroides fragilis NCTC 9434; Capnocytophaga ochracea DSM 7271; Flavobacterium psychrophilum JIP02 86; Akkermansia muciniphila ATCC BAA 835; Roseiflexus castenholzii DSM 13941; Roseiflexus RS1; Synechocystis PCC6803; Elusimicrobium minutum Pei 191; bacteria de filotipo Rs del grupo de termitas 1 no cultivada D17; Fibrobacter succinogenes S85; Bacillus cereus ATCC 10987; Listeria innocua; Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus GG; Lactobacillus salivarius UCC118; Streptococcus agalactiae A909; Streptococcus agalactiae NEM316; Streptococcus agalactiae 2603; Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124; Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565; Streptococcus gallolyticus UCN34 uid46061; Streptococcus gordonii Challis subst CH1; Streptococcus mutans NN2025 uid46353; Streptococcus mutans; Streptococcus pyogenes M1 GAS; Streptococcus pyogenes MGAS5005; Streptococcus pyogenes MGAS2096; Streptococcus pyogenes MGAS9429; Streptococcus pyogenes MGAS10270; Streptococcus pyogenes MGAS6180; Streptococcus pyogenes MGAS315; Streptococcus pyogenes SSI-1; Streptococcus pyogenes MGAS10750; Streptococcus pyogenes NZ131; Streptococcus thermophiles CNRZ1066; Streptococcus thermophiles LMD-9; Streptococcus thermophiles LMG 18311; Clostridium botulinum A3 Loch Maree; Clostridium botulinum B Eklund 17B; Clostridium botulinum Ba4 657; Clostridium botulinum F Langeland; Clostridium cellulolyticum H10; Finegoldia magna ATCC 29328; Eubacterium rectale ATCC 33656; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma mobile 163K; Mycoplasma penetrans; Mycoplasma synoviae 53; Streptobacillus moniliformis DSM 12112; Bradyrhizobium BTAi1; Nitrobacter hamburgensis X14; Rhodopseudomonas palustris BisB18; Rhodopseudomonas palustris BisB5; Parvibaculum lavamentivorans DS-1; Dinoroseobacter shibae DFL 12; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI; Azospirillum B510 uid46085; Rhodospirillum rubrum ATCC 11170; Diaphorobacter TPSY uid29975; Verminephrobacter eiseniae EF01-2; Neisseria meningitides 053442; Neisseria meningitides alpha14; Neisseria meningitides Z2491; Desulfovibrio salexigens DSM 2638; Campylobacter jejuni doylei 269 97; Campylobacter jejuni 81116; Campylobacter jejuni; Campylobacter lari RM2100; Helicobacter hepaticus; Wolinella succinogenes; Tolumonas auensis DSM 9187; Pseudoalteromonas atlantica T6c; Shewanella pealeana ATCC 700345; Legionella pneumophila Paris; Actinobacillus succinogenes 130Z; Pasteurella multocida; Francisella tularensis novicida U112; Francisella tularensis holarctica; Francisella tularensis FSC 198; Francisella tularensis tularensis; Francisella tularensis WY96-3418 y Treponema denticola ATCC 35405. Por consiguiente, los aspectos de la presente invención se refieren a una proteína Cas9 presente en un sistema CRISPR de tipo II.
La proteína Cas9 puede ser denominada por un experto en la materia en la bibliografía como Csn1. A continuación, se muestra la secuencia de la proteína Cas9 de S. pyogenes que es objeto de los experimentos descritos en el presente documento. Véase Deltcheva et al., Nature 471,602-607 (2011).
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAE
ATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFG
NIVDEVAYHEKYPTIYHFRKKFVDSTDKADFRFIYFAFAHMIKFRGHFFIEGDFNPDNSD
VDKEFIQFVQTYNQEFEENPINASGVDAKAIESARFSKSRRFENFIAQFPGEKKNGEFGN
FIAFSFGFTPNFKSNFDFAEDAKFQFSKDTYDDDFDNFFAQIGDQYADFFFAAKNFSDAI
FFSDIFRVNTEITKAPFSASMIKRYDEHHQDFTFFKAFVRQQFPEKYKEIFFDQSKNGYA
GYIDGGASQEEFYKFIKPIFEKMDGTEEFFVKFNREDFFRKQRTFDNGSIPHQIHFGEFH
AIFRRQEDFYPFFKDNREKIEKIFTFRIPYYVGPFARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE
VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFL
SGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKI
IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWG
RLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSL
HEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRER
MKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKEYEYYLQNGRDMYVDQELDES1RLSDYDVDH
IVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL
TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKS
KLVSDFRKDFQFYKVREINNYFHAFIDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVR
K
MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDF
ATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVA
YSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK
YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE
QHKFrfLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGA PAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD-
Según un aspecto, la proteína de unión a ADN guiada por ARN incluye homólogos y ortólogos de Cas9 que retienen la capacidad de la proteína para unirse al ADN, ser guiada por el ARN y cortar el ADN. Según un aspecto, la proteína Cas9 incluye la secuencia, tal como se establece para la Cas9 natural de S. pyogenes y secuencias de proteínas que tienen, como mínimo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o el 99 % de homología con la misma y que son una proteína de unión a ADN, tal como una proteína de unión a ADN guiada por ARN.
Según un aspecto, se da a conocer un sistema Cas9-ARNg diseñado que permite el corte del genoma guiado por ARN de una manera específica del sitio, si se desea, y la modificación del genoma mediante la inserción de ácidos nucleicos exógenos donantes. Los ARN guía son complementarios a los sitios diana o loci diana en el ADN. Los ARN guía pueden ser quimeras ARNcr-ARNtracr. La Cas9 se une al ADN genómico diana o cerca del mismo. Los uno o más ARN guía se unen al ADN genómico diana o cerca del mismo. La Cas9 corta el ADN genómico diana y el ADN exógeno donante se inserta en el ADN en el sitio de corte.
Por consiguiente, los procedimientos se refieren a la utilización de un ARN guía con una proteína Cas9 y un ácido nucleico exógeno donante para realizar inserciones múltiplex de ácidos nucleicos exógenos donantes en ADN dentro de una célula que expresa Cas9 mediante la realización en ciclos de la inserción de ácido nucleico que codifica el ARN y el ácido nucleico exógeno donante, la expresión del ARN, la colocalización del ARN, Cas9 y ADN de una manera para cortar el ADN, y la inserción del ácido nucleico exógeno donante. Las etapas del procedimiento se realizan en ciclos en cualquier número de veces deseado para dar como resultado cualquier número deseado de modificaciones del ADN. Por consiguiente, los procedimientos de la presente invención se refieren a la edición de genes diana utilizando las proteínas Cas9 y los ARN guía descritos en el presente documento para proporcionar ingeniería genética y epigenética múltiplex de células.
Otros aspectos de la presente invención se refieren a la utilización de proteínas o sistemas de unión a ADN, en general, para la inserción múltiple de ácidos nucleicos exógenos donantes en el ADN, tal como el ADN genómico, de una célula, tal como una célula humana. Un experto en la materia identificará fácilmente ejemplos de sistemas de unión a ADN basándose en la presente invención.
Las células, según la presente invención, incluyen cualquier célula en la que se puedan introducir y expresar ácidos nucleicos extraños, tal como se describe en el presente documento. Debe entenderse que los conceptos básicos de la presente invención, descritos en el presente documento, no quedan limitados por el tipo de célula. Entre las células, según la presente invención, se incluyen células eucariotas, células procariotas, células animales, células vegetales, células fúngicas, células de arquea, células eubacterianas y similares. Entre las células se incluyen células eucariotas, tales como células de levadura, células vegetales y células animales. Entre las células particulares se incluyen células de mamífero, tales como células humanas. Además, entre las células se incluyen
cualquiera en la que sería beneficioso o deseable modificar el ADN.
Entre los ácidos nucleicos diana se incluyen cualquier secuencia de ácido nucleico para la que un complejo de colocalización, tal como se describe en el presente documento, puede ser útil para fragmentarla o cortarla. Entre los ácidos nucleicos diana se incluyen genes. Para los propósitos de la presente invención, el ADN, tal como el ADN bicatenario, puede incluir el ácido nucleico diana y un complejo de colocalización se puede unir al ADN o, en cualquier caso, se puede colocalizar con el ADN en el ácido nucleico diana, junto o cerca del mismo, y de una manera en la que el complejo de colocalización puede tener un efecto deseado sobre el ácido nucleico diana. Estos ácidos nucleicos diana pueden incluir ácidos nucleicos endógenos (o de origen natural) y ácidos nucleicos exógenos (o extraños). Un experto, basándose en la presente invención, podrá identificar o diseñar fácilmente ARN guía y proteínas Cas9 que se colocalizan en un ADN que incluye un ácido nucleico diana. Un experto será además capaz de identificar proteínas o dominios reguladores de la transcripción que se colocalizan igualmente en un ADN que incluye un ácido nucleico diana. El ADN incluye ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno. Según un aspecto, entre los materiales y procedimientos útiles en la práctica de la presente invención se incluyen los descritos en Di Carlo, et al., Nucleic Acids Research, 2013, vol. 41, N.° 7 4336-4343, que incluyen cepas y medios de ejemplo, construcción de plásmidos, transformación de plásmidos, electroporación de casette de ARNg transciente y ácidos nucleicos donantes, transformación de plásmidos de ARNg con ADN donante en células que expresan Cas9, inducción de Cas9 con galactosa, identificación de dianas de CRISPR-Cas en el genoma de la levadura, etc. Se proporcionan referencias adicionales que incluyen información, materiales y procedimientos útiles para que un experto lleve a cabo la presente invención en Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J. E., Norville., J. E. y Church, G. M. (2013) RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science, 10.1126fscience.1232033; Storici, F., Durham, C. L., Gordenin, D. A. y Resnick, M. A. (2003) Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficiently targeted for repair by oligonucleotides in yeast. PNAS, 100, 14994-14999 y Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, l., Hauer, M., Doudna, J. A. y Charpentier, E. (2012) A programmable dual-RNA-Guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337, 816-821.
Los ácidos nucleicos extraños (es decir, aquellos que no forman parte de la composición de ácidos nucleicos naturales de una célula) se pueden introducir en una célula utilizando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia para dicha introducción. Entre estos procedimientos se incluyen transfección, transducción, transducción viral, microinyección, lipofección, nucleofección, bombardeo con nanopartículas, transformación, conjugación y similares. Un experto en la materia comprenderá y adaptará fácilmente dichos procedimientos utilizando fuentes bibliográficas identificables fácilmente.
Los siguientes ejemplos se exponen como representativos de la presente invención. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance de la presente invención, dado que estas y otras realizaciones equivalentes resultarán evidentes a la vista de la presente invención, las figuras y las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO I
Proceso general para la edición de genes múltiplex mediante CRISPR-Cas9 en levadura
Se utiliza Cas9 del sistema inmunitario CRISPR de Streptococcous pyogenes para estimular la recombinación homóloga y para seleccionar respecto a células que no recombinan el ADN transformado en Saccharaomyces cerevisiae. En la figura 1 se presenta un procedimiento general de escisión de ADN guiado por ARN utilizando Cas9. Se forma un complejo de colocalización entre Cas9, un ARN guía y el ADN diana. Cas9 crea una rotura bicatenaria en el ADN diana. A continuación, se inserta el ADN donante en el ADN mediante recombinación homóloga. El ADN donante incluye secuencias flanqueantes a cada lado del sitio de corte y una secuencia que elimina el sitio de corte de Cas9. El resultado es la integración del ADN donante en el ADN, que puede ser ADN genómico.
A continuación, se proporciona un procedimiento general para la recombinación de ADN donante de alta frecuencia utilizando ingeniería de ADN múltiplex en levadura, utilizando Cas9 y con referencia a la figura 2. Las células que no tienen una endonucleasa guiada por ARN de Cas9 presente de forma natural se pueden transformar con ADN para permitir que la célula exprese una endonucleasa guiada por ARN de Cas9. Se cultivan células que expresan una endonucleasa guiada por ARN de Cas9. Se crea un plásmido que incluye uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más ARN guía y un marcador de selección conocido por los expertos en la materia para la introducción en una célula y la expresión de uno o más ARN guía. Tal como se muestra en la figura 2, se muestra un grupo de plásmidos, cada uno con un ácido nucleico que codifica un ARN guía que se utilizará para insertar un gen diferente en el ADN genómico de la célula, es decir, el gen A, el gen B, el gen C, el gen D y el gen E. También se proporciona un grupo de ADN donantes que incluye ADN donante bicatenario para el gen A, el gen B, el gen C, el gen D y el gen E.
Las células se lavan y se acondicionan con acetato de litio. Las células se pueden lavar y mezclar posteriormente con un grupo de ácidos nucleicos exógenos donantes, tal como oligonucleótidos bicatenarios, por ejemplo, un casette de ADN, y los plásmidos que incluyen los ácidos nucleicos que codifican los ARN guía. Tal como se muestra en la figura 2, las células se transforman con los ácidos nucleicos exógenos donantes y los plásmidos utilizando PEG 3350 y acetato de litio.
Tal como se muestra en la figura 2, las células se seleccionan respecto a uno o más ARN guía utilizando el marcador de selección. Las células seleccionadas expresan uno o más ARN guía. Se forman uno o más complejos de colocalización entre un ARN guía, una endonucleasa guiada por ARN de Cas9 y el ADN en la célula. La endonucleasa corta el ADN y se inserta un ácido nucleico donante en la célula mediante recombinación, tal como mediante recombinación homóloga. A continuación, las células se curan para el plásmido y posteriormente las células se someten, de manera opcional, a un ciclo o más ciclos adicionales de las etapas anteriores. Se puede realizar una pluralidad de ciclos. Una célula sometida a una pluralidad de ciclos muestra una elevada frecuencia de recombinación. De manera alternativa, las células se deseleccionan para el mantenimiento del plásmido o, de lo contrario, las células se colocan en medios para seleccionarlas frente a las células con el plásmido. A continuación, se repite el proceso comenzando con la etapa de crecimiento celular. Por consiguiente, los procedimientos incluyen la realización de ciclos de células ya modificadas mediante un ciclo anterior o la selección de células de un ciclo anterior que no han sido modificadas y la posterior realización del ciclo de las células no modificadas para efectuar la modificación del ADN, tal como se describe en el presente documento.
EJEMPLO II
Protocolo detallado de realización de ciclos
Las células se cultivan (auxótrofos de uracilo, con expresión constitutiva de Cas9) hasta una densidad óptica de 0,8 a 1,0 en 5 ml de medio de levadura SC o de SC FOA (100 pg/ml). Las células se centrifugan a 2.250 x g durante 3 minutos y se lavan una vez con 10 ml de agua. Las células se centrifugan y se resuspenden en 1 ml de acetato de litio 100 mM. Las células se sedimentan y se resuspenden en 500 pl de acetato de litio 100 mM. Se crea una mezcla de transformación añadiendo en el siguiente orden, 50 pl de células; mezcla de ADN que incluye 1 nmol del grupo de oligonucleótidos bicatenarios, 5 pg de cada ARN guía (vector p426, con marcador de uracilo) y se rellena hasta 70 pl con agua para conseguir el volumen final deseado, 240 pl de PEG 3350 al 50 % y 36 pl de acetato de litio 1 M. La mezcla se incuba a 30 °C durante 30 minutos. A continuación, la mezcla se agita en un agitador de vórtice y las células se someten a un choque térmico incubando la mezcla a 42 °C durante 20 minutos. A continuación, las células se sedimentan y se elimina el sobrenadante. Las células se inoculan con 5 ml de uracilo-SC para seleccionar el plásmido de ARNg que contiene el gen de uracilo. Se deja que las células se recuperen durante 2 días. Después de dos días, se inoculan 100 pl del cultivo celular en 5 ml de SC fresco y se deja crecer durante 12 horas para la deselección del mantenimiento del plásmido. A continuación, se inoculan 100 pl de las células de cultivo SC en 5 ml de medio SC FOA (100 pg/ml) para seleccionarlas respecto a las células con el plásmido. Esto completa un ciclo del proceso. El proceso se repite para cualquier número de ciclos deseados. El proceso total puede incluir 1 ciclo, 2 ciclos, 3 ciclos, 4 ciclos, 5 ciclos, 6 ciclos, 7 ciclos, 8 ciclos, 9 ciclos, 10 ciclos, 15 ciclos, 20 ciclos, 25 ciclos, etc.
EJEMPLO III
Termotolerancia al choque térmico en mutantes seleccionados
Utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, se ha demostrado la termotolerancia al choque térmico en mutantes seleccionados. Los genes que se ha demostrado que aumentan la termotolerancia en la levadura tras la desactivación o la mutación puntual fueron la diana del sistema ARN guía-Cas9 descrito en el presente documento. Se seleccionaron cuatro genes para la mutación: UBC1, SCH9, TFS1 y RAS2. SCH9 es una proteína cinasa que regula los genes de estrés osmótico, de nutrientes y ambiental. TFS1 inhibe la carboxipeptidasa Y e Ira2p inhibe la actividad de Ras GAP y responde al estrés replicativo del ADN. RAS2 es una proteína de unión a GTP que regula la falta de nitrógeno y está involucrada en las vías de respuesta al estrés. Para cada uno de SCH9, TFS1 y RAS2, se creó un ADN donante que es un alelo que contiene una mutación de serina a alanina en la región codificante. UBC1-E2 es una enzima que se conjuga con ubiquitina. Se creó un ADN donante que incluía una mutación puntual que elimina un sitio de fosforilación que da como resultado la termotolerancia.
Utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, los genes se dirigieron utilizando ARN guía diseñado para dirigir la escisión por Cas9 a los loci de los genes junto con el oligonucleótido bicatenario para proporcionar los cambios. Tal como se muestra en la figura 3, se consiguió la sustitución de alelos utilizando oligonucleótidos dirigidos a cuatro loci responsables de la termotolerancia en la levadura. Según el esquema, se crearon cuatro plásmidos, cada uno de los cuales incorporaba un ácido nucleico que codificaba un ARN guía para uno de los genes: plásmido SRNg UBC1, plásmido ARNg TFS1, plásmido ARNg SCH9 y plásmido ARNg rAs2. Cada plásmido tenía un oligonucleótido bicatenario donante correspondiente: oligonucleótido bicatenario ubc1 (S97A), oligonucleótido bicatenario tfs1 (tag), oligonucleótido bicatenario sch9 (tag) y oligonucleótido bicatenario ras (tag). Los plásmidos y los oligonucleótidos bicatenarios donantes correspondientes se transformaron de manera conjunta en levadura como un grupo. Se realizaron dos ciclos y en la figura 4 se muestra el número de modificaciones por célula en función del porcentaje de células en la población celular. Un número significativo de células incluyeron una y dos modificaciones después del 2° ciclo. Se pudo aislar un mutante triple (datos no mostrados).
La figura 5A es una tabla de las cepas resultantes de los procedimientos descritos en el presente documento que muestra cepas transformadas con un oligonucleótido donante, cepas transformadas con dos oligonucleótidos donantes y una cepa transformada con tres oligonucleótidos donantes. La figura 5B muestra el efecto de la incubación a 42 °C durante tres horas en comparación con la ausencia de incubación y una ligera disminución en el número de células de tipo salvaje. La figura 5B también muestra el efecto de la incubación a 55 °C durante dos horas en comparación con la ausencia de incubación. Los mutantes más tolerantes al choque térmico a 55 °C fueron sch9, sch9 tfs1 y tfs1 ubc1(s97a).
La figura 6 proporciona, en general, información gráfica sobre la optimización de la incorporación de oligonucleótidos múltiplex para dos loci. La figura 6A representa la frecuencia de transformación frente a la cantidad de cada plásmido transformado (|xg). La figura 6B representa la frecuencia de recombinación individual frente a la cantidad de cada plásmido transformado (|xg). La figura 6C representa la frecuencia de recombinación conjunta en los loci can1 y KanMX frente a la cantidad de cada plásmido transformado (|xg).
La figura 7 proporciona, en general, información gráfica sobre la incorporación de casete lineal múltiplex para dos loci. El gráfico muestra para la primera barra más a la izquierda, la frecuencia de transformación para p426 ARNg ADE2 casette HygR; para la siguiente barra, frecuencia de transformación para p426 ARNg CAN1 casette G418R, para las siguientes tres barras, frecuencia de transformación para ARNg p426 ADE2 p426 ARNg CAN1 casette HygR casette G418R.
La figura 8 es, en general, un análisis de la tasa de crecimiento que muestra el tiempo de duplicación en crecimiento exponencial a temperaturas elevadas para mutantes seleccionados. La figura 8A representa gráficamente el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 30 °C para el tipo salvaje y los mutantes identificados. La figura 8B representa gráficamente el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 37 °C para el tipo salvaje y los mutantes identificados. La figura 8C representa gráficamente el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 42 °C para el tipo salvaje y los mutantes identificados como inoculados a partir del cultivo en fase estacionaria tardía. La figura 8D representa gráficamente el factor multiplicador del cambio en el tiempo de duplicación a 42 °C para el tipo salvaje y los mutantes identificados como inoculados a partir del cultivo en fase logarítmica tardía. Los datos gráficos muestran un tiempo de duplicación menor a 37 °C para sch9 tfs1 y tfs1 ubc1(S97A). Los datos gráficos muestran un tiempo de duplicación menor a 42 °C para ras2 tfs1, sch9 ubc1(S97A), tfs1 ubc1(S97A) y ras2 tfs1 ubc1(S97A).
Claims (15)
1. Procedimiento para realizar múltiples alteraciones en ADN diana en una célula que expresa una enzima que forma un complejo de colocalización con el ARN complementario al ADN diana y que escinde el ADN diana de una manera específica del sitio, que comprende
(a) introducir en la célula un primer ácido nucleico extraño que codifica una pluralidad de ARN complementarios a diferentes sitios del ADN diana y que guían la enzima a los diferentes sitios del ADN diana, en el que cada uno de la pluralidad de ARN y la enzima son elementos de un complejo de colocalización para el ADN diana,
introducir en la célula una pluralidad de secuencias de ácido nucleico donante,
en el que se expresa la pluralidad de ARN,
en el que, como mínimo, uno de la pluralidad de ARN y la enzima se colocalizan en un sitio del ADN diana, la enzima escinde el ADN diana y uno de la pluralidad de ácidos nucleicos donantes se inserta en el ADN diana en el sitio de escisión para producir ADN alterado en la célula, y
(b) repetir la etapa (a) para introducir el mismo primer ácido nucleico extraño y la misma pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos donantes para producir múltiples inserciones de secuencias de ácidos nucleicos donantes en el ADN de la célula.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) se repite múltiples veces.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la enzima es una proteína de unión a ADN guiada por ARN.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la enzima es Cas9.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la célula es una célula eucariota y en el que, de manera opcional, la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal.
6. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de ARN tiene entre, aproximadamente, 10 y, aproximadamente, 500 nucleótidos.
7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de ARN tiene entre, aproximadamente, 20 y, aproximadamente, 100 nucleótidos.
8. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de ARN es un ARN guía.
9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de ARN es una fusión de ARNtracr-ARNcr.
10. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el ADN es ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN vírico o ADN exógeno.
11. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico donante se inserta mediante recombinación.
12. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada una de la pluralidad de secuencias de ácido nucleico donante se inserta mediante recombinación homóloga.
13. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la pluralidad de ARN y la pluralidad de secuencias de ácido nucleico donante están presentes en uno o más plásmidos.
14. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos donantes incluye secuencias de homología o brazos que flanquean el sitio de escisión.
15. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos donantes incluye una secuencia para eliminar el sitio de escisión.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361844168P | 2013-07-09 | 2013-07-09 | |
| PCT/US2014/045691 WO2015006290A1 (en) | 2013-07-09 | 2014-07-08 | Multiplex rna-guided genome engineering |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2929143T3 true ES2929143T3 (es) | 2022-11-25 |
Family
ID=52280509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14822995T Active ES2929143T3 (es) | 2013-07-09 | 2014-07-08 | Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11459585B2 (es) |
| EP (2) | EP3019616B1 (es) |
| JP (4) | JP7120717B2 (es) |
| KR (5) | KR20260047646A (es) |
| CN (2) | CN116042726A (es) |
| AU (3) | AU2014287393B2 (es) |
| CA (2) | CA2917638C (es) |
| ES (1) | ES2929143T3 (es) |
| IL (2) | IL243475B2 (es) |
| RU (2) | RU2706562C2 (es) |
| SG (3) | SG10201800111SA (es) |
| WO (1) | WO2015006290A1 (es) |
Families Citing this family (130)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10323236B2 (en) | 2011-07-22 | 2019-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| DK2931891T3 (da) | 2012-12-17 | 2019-08-19 | Harvard College | Rna-styret modificering af menneskelige genomer |
| CA2898184A1 (en) | 2013-01-16 | 2014-07-24 | Emory University | Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto |
| DK3456831T3 (da) | 2013-04-16 | 2021-09-06 | Regeneron Pharma | Målrettet modifikation af rottegenom |
| ES2929143T3 (es) * | 2013-07-09 | 2022-11-25 | Harvard College | Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| CN120574876A (zh) | 2013-08-22 | 2025-09-02 | 纳幕尔杜邦公司 | 使用向导rna/cas内切核酸酶系统的植物基因组修饰及其使用方法 |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| EP3988649B1 (en) | 2013-09-18 | 2024-11-27 | Kymab Limited | Methods, cells and organisms |
| CN106459995B (zh) | 2013-11-07 | 2020-02-21 | 爱迪塔斯医药有限公司 | 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物 |
| KR102170502B1 (ko) | 2013-12-11 | 2020-10-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 게놈의 표적화된 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| US20150165054A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
| EP3690044B1 (en) | 2014-02-11 | 2024-01-10 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Crispr enabled multiplexed genome engineering |
| US11028388B2 (en) | 2014-03-05 | 2021-06-08 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa |
| ES2745769T3 (es) | 2014-03-10 | 2020-03-03 | Editas Medicine Inc | Procedimientos y composiciones relacionados con CRISPR/CAS para tratar la amaurosis congénita de Leber 10 (LCA10) |
| US11339437B2 (en) | 2014-03-10 | 2022-05-24 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| US11141493B2 (en) | 2014-03-10 | 2021-10-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| EP3122880B1 (en) | 2014-03-26 | 2021-05-05 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
| EP3540061A1 (en) | 2014-04-02 | 2019-09-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma |
| BR112016024945A2 (pt) | 2014-04-28 | 2017-10-24 | Recombinetics Inc | edição de gene multiplex em suínos |
| WO2015184259A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods to treat latent viral infections |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| AU2015330699B2 (en) | 2014-10-10 | 2021-12-02 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for promoting homology directed repair |
| EP4464338A3 (en) | 2014-11-07 | 2025-02-12 | Editas Medicine, Inc. | Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
| CA2969619A1 (en) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rna with chemical modifications |
| US10787523B2 (en) * | 2015-01-29 | 2020-09-29 | University Of Massachusetts | Nanoparticle-protein complex for intracellular protein delivery |
| US10519205B2 (en) | 2015-03-19 | 2019-12-31 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for use of anion channel rhodopsins |
| KR102888521B1 (ko) | 2015-04-06 | 2025-11-19 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna |
| JP2018522249A (ja) | 2015-04-24 | 2018-08-09 | エディタス・メディシン、インコーポレイテッド | Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価 |
| EP3289080B1 (en) * | 2015-04-30 | 2021-08-25 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Gene therapy for autosomal dominant diseases |
| WO2016179038A1 (en) * | 2015-05-01 | 2016-11-10 | Spark Therapeutics, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRUS-MEDIATED CRISPR-Cas9 TREATMENT OF OCULAR DISEASE |
| CA2986310A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Editas Medicine, Inc. | Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
| US10117911B2 (en) | 2015-05-29 | 2018-11-06 | Agenovir Corporation | Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections |
| CN108025188A (zh) | 2015-06-01 | 2018-05-11 | 天普大学-联邦高等教育系统 | 用于hiv感染的rna导向治疗的方法和组合物 |
| CN108026526B (zh) | 2015-06-09 | 2023-05-12 | 爱迪塔斯医药公司 | 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物 |
| EP3353296B1 (en) | 2015-09-24 | 2020-11-04 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing |
| IL310721B2 (en) | 2015-10-23 | 2025-11-01 | Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| EP4036228A1 (en) | 2015-11-13 | 2022-08-03 | Avellino Lab USA, Inc. | Methods for the treatment of corneal dystrophies |
| US11597924B2 (en) | 2016-03-25 | 2023-03-07 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
| US11512311B2 (en) | 2016-03-25 | 2022-11-29 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency |
| US11236313B2 (en) | 2016-04-13 | 2022-02-01 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof |
| EP3464594A1 (en) | 2016-06-01 | 2019-04-10 | Kws Saat Se | Hybrid nucleic acid sequences for genome engineering |
| US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
| US11293021B1 (en) | 2016-06-23 | 2022-04-05 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems |
| AU2017280353B2 (en) | 2016-06-24 | 2021-11-11 | Inscripta, Inc. | Methods for generating barcoded combinatorial libraries |
| ES2817973T3 (es) | 2016-07-01 | 2021-04-08 | Microsoft Technology Licensing Llc | Almacenamiento a través de la edición iterativa del ADN |
| US11359234B2 (en) | 2016-07-01 | 2022-06-14 | Microsoft Technology Licensing, Llc | Barcoding sequences for identification of gene expression |
| US10892034B2 (en) | 2016-07-01 | 2021-01-12 | Microsoft Technology Licensing, Llc | Use of homology direct repair to record timing of a molecular event |
| WO2018015995A1 (ja) * | 2016-07-19 | 2018-01-25 | 株式会社バイオダイナミクス研究所 | 長鎖一本鎖ｄｎａを調製する方法 |
| BR112019001887A2 (pt) | 2016-08-02 | 2019-07-09 | Editas Medicine Inc | composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290 |
| CN110214183A (zh) | 2016-08-03 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 腺苷核碱基编辑器及其用途 |
| WO2018031683A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| JP2019524149A (ja) * | 2016-08-20 | 2019-09-05 | アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． | 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法 |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| KR102622411B1 (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-10 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
| EP3555297A1 (en) | 2016-12-19 | 2019-10-23 | Editas Medicine, Inc. | Assessing nuclease cleavage |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| JP7229923B2 (ja) | 2017-01-06 | 2023-02-28 | エディタス・メディシン、インコーポレイテッド | ヌクレアーゼ切断を評価する方法 |
| CA3052099A1 (en) * | 2017-01-30 | 2018-08-02 | Mathias LABS | Repair template linkage to endonucleases for genome engineering |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US12390514B2 (en) | 2017-03-09 | 2025-08-19 | President And Fellows Of Harvard College | Cancer vaccine |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| WO2018170184A1 (en) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| KR20240116572A (ko) | 2017-03-23 | 2024-07-29 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 |
| KR102746223B1 (ko) | 2017-04-20 | 2024-12-27 | 이제네시스, 인크. | 유전자 변형 동물의 생성 방법 |
| US11499151B2 (en) | 2017-04-28 | 2022-11-15 | Editas Medicine, Inc. | Methods and systems for analyzing guide RNA molecules |
| EP3622070A2 (en) | 2017-05-10 | 2020-03-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/rna-guided nuclease systems and methods |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| MX2019014640A (es) | 2017-06-09 | 2020-10-05 | Editas Medicine Inc | Nucleasas de repeticiones palíndromicas agrupadas y regularmente interespaciadas de proteina asociada 9 (cas9) genomanipuladas. |
| US9982279B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-05-29 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| US10011849B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-07-03 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| JP2020530979A (ja) | 2017-06-30 | 2020-11-05 | インスクリプタ， インコーポレイテッド | 自動細胞処理方法、モジュール、機器及びシステム |
| US11866726B2 (en) | 2017-07-14 | 2024-01-09 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
| CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
| US20210054404A1 (en) | 2017-08-22 | 2021-02-25 | Napigen, Inc. | Organelle genome modification using polynucleotide guided endonuclease |
| US10738327B2 (en) | 2017-08-28 | 2020-08-11 | Inscripta, Inc. | Electroporation cuvettes for automation |
| EP3676376B1 (en) | 2017-08-30 | 2025-01-15 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| JP6985508B2 (ja) | 2017-09-30 | 2021-12-22 | インスクリプタ， インコーポレイテッド | フロースルーエレクトロポレーション機器編成 |
| KR20250107288A (ko) | 2017-10-16 | 2025-07-11 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 아데노신 염기 편집제의 용도 |
| US12406749B2 (en) | 2017-12-15 | 2025-09-02 | The Broad Institute, Inc. | Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering |
| CN111699254A (zh) | 2018-02-08 | 2020-09-22 | 齐默尔根公司 | 使用crispr在棒状杆菌属中进行基因组编辑 |
| KR102907245B1 (ko) | 2018-03-14 | 2026-01-05 | 에디타스 메디신, 인코포레이티드 | 혈색소병증 치료를 위한 시스템 및 방법 |
| US10443031B1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-15 | Inscripta, Inc. | Methods for controlling the growth of prokaryotic and eukaryotic cells |
| WO2019200004A1 (en) | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges |
| WO2019209926A1 (en) | 2018-04-24 | 2019-10-31 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of peptide libraries |
| US10557216B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-02-11 | Inscripta, Inc. | Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries |
| US10858761B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-12-08 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells |
| KR20210045360A (ko) | 2018-05-16 | 2021-04-26 | 신테고 코포레이션 | 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템 |
| US12157760B2 (en) | 2018-05-23 | 2024-12-03 | The Broad Institute, Inc. | Base editors and uses thereof |
| EP3823633A4 (en) | 2018-06-29 | 2023-05-03 | Editas Medicine, Inc. | SYNTHETIC LEAD MOLECULES, COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO |
| CA3108767A1 (en) | 2018-06-30 | 2020-01-02 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| US12522807B2 (en) | 2018-07-09 | 2026-01-13 | The Broad Institute, Inc. | RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof |
| US11142740B2 (en) | 2018-08-14 | 2021-10-12 | Inscripta, Inc. | Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
| US10752874B2 (en) | 2018-08-14 | 2020-08-25 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| US10532324B1 (en) | 2018-08-14 | 2020-01-14 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| WO2020081149A2 (en) | 2018-08-30 | 2020-04-23 | Inscripta, Inc. | Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
| WO2020086475A1 (en) | 2018-10-22 | 2020-04-30 | Inscripta, Inc. | Engineered enzymes |
| US11214781B2 (en) | 2018-10-22 | 2022-01-04 | Inscripta, Inc. | Engineered enzyme |
| WO2020092453A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | The Broad Institute, Inc. | Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof |
| US12351837B2 (en) | 2019-01-23 | 2025-07-08 | The Broad Institute, Inc. | Supernegatively charged proteins and uses thereof |
| CN113728106A (zh) | 2019-03-08 | 2021-11-30 | 齐默尔根公司 | 微生物中的迭代基因组编辑 |
| KR20210137009A (ko) * | 2019-03-08 | 2021-11-17 | 지머젠 인코포레이티드 | 미생물에서 풀링 게놈 편집 |
| US11053515B2 (en) | 2019-03-08 | 2021-07-06 | Zymergen Inc. | Pooled genome editing in microbes |
| WO2020191233A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| AU2020247900A1 (en) | 2019-03-25 | 2021-11-04 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
| US11001831B2 (en) | 2019-03-25 | 2021-05-11 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
| US12473543B2 (en) | 2019-04-17 | 2025-11-18 | The Broad Institute, Inc. | Adenine base editors with reduced off-target effects |
| AU2020288623A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-01-06 | Inscripta, Inc. | Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing |
| US10907125B2 (en) | 2019-06-20 | 2021-02-02 | Inscripta, Inc. | Flow through electroporation modules and instrumentation |
| WO2020257395A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Inscripta, Inc. | Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli |
| US10927385B2 (en) | 2019-06-25 | 2021-02-23 | Inscripta, Inc. | Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast |
| US12435330B2 (en) | 2019-10-10 | 2025-10-07 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing RNA |
| US11203762B2 (en) | 2019-11-19 | 2021-12-21 | Inscripta, Inc. | Methods for increasing observed editing in bacteria |
| CA3157131A1 (en) | 2019-12-10 | 2021-06-17 | Inscripta, Inc. | Novel mad nucleases |
| US10704033B1 (en) | 2019-12-13 | 2020-07-07 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| AU2020407048A1 (en) | 2019-12-18 | 2022-06-09 | Inscripta, Inc. | Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells |
| US10689669B1 (en) | 2020-01-11 | 2020-06-23 | Inscripta, Inc. | Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems |
| US11225674B2 (en) | 2020-01-27 | 2022-01-18 | Inscripta, Inc. | Electroporation modules and instrumentation |
| US20210332388A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Inscripta, Inc. | Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells |
| IL297761A (en) | 2020-05-08 | 2022-12-01 | Broad Inst Inc | Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence |
| US11787841B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-10-17 | Inscripta, Inc. | Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli |
| US11299731B1 (en) | 2020-09-15 | 2022-04-12 | Inscripta, Inc. | CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells |
| US11512297B2 (en) | 2020-11-09 | 2022-11-29 | Inscripta, Inc. | Affinity tag for recombination protein recruitment |
| AU2021415461A1 (en) | 2021-01-04 | 2023-08-17 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| EP4274890A4 (en) | 2021-01-07 | 2024-11-27 | Inscripta, Inc. | MAD-NUCLEASES |
| US11884924B2 (en) | 2021-02-16 | 2024-01-30 | Inscripta, Inc. | Dual strand nucleic acid-guided nickase editing |
| JP2024534945A (ja) | 2021-09-10 | 2024-09-26 | アジレント・テクノロジーズ・インク | 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4935357A (en) | 1986-02-05 | 1990-06-19 | New England Biolabs, Inc. | Universal restriction endonuclease |
| US6326204B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-12-04 | Maxygen, Inc. | Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination |
| AU3391900A (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-21 | Maxygen, Inc. | Encryption of traits using split gene sequences |
| WO2003012036A2 (en) * | 2001-07-27 | 2003-02-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides |
| US20100076057A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
| CN102858985A (zh) | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| CA2776757A1 (en) * | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Shital Tripathi | Positive and negative selectable markers for use in thermophilic organisms |
| CA2773879A1 (en) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same |
| WO2011109031A1 (en) | 2010-03-05 | 2011-09-09 | Synthetic Genomics, Inc. | Methods for cloning and manipulating genomes |
| AU2013266968B2 (en) * | 2012-05-25 | 2017-06-29 | Emmanuelle CHARPENTIER | Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription |
| AU2013335451C1 (en) * | 2012-10-23 | 2024-07-04 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof |
| EP2931899A1 (en) * | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| CN105263312A (zh) | 2013-04-05 | 2016-01-20 | 美国陶氏益农公司 | 用于在植物基因组内整合外源序列的方法和组合物 |
| ES2929143T3 (es) * | 2013-07-09 | 2022-11-25 | Harvard College | Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex |
-
2014
- 2014-07-08 ES ES14822995T patent/ES2929143T3/es active Active
- 2014-07-08 RU RU2016104056A patent/RU2706562C2/ru active
- 2014-07-08 US US14/903,719 patent/US11459585B2/en active Active
- 2014-07-08 AU AU2014287393A patent/AU2014287393B2/en active Active
- 2014-07-08 CN CN202211491551.3A patent/CN116042726A/zh active Pending
- 2014-07-08 SG SG10201800111SA patent/SG10201800111SA/en unknown
- 2014-07-08 EP EP14822995.8A patent/EP3019616B1/en active Active
- 2014-07-08 KR KR1020267009678A patent/KR20260047646A/ko active Pending
- 2014-07-08 SG SG10201913026TA patent/SG10201913026TA/en unknown
- 2014-07-08 CA CA2917638A patent/CA2917638C/en active Active
- 2014-07-08 RU RU2019135885A patent/RU2764637C2/ru active
- 2014-07-08 KR KR1020167003073A patent/KR20160029112A/ko not_active Ceased
- 2014-07-08 EP EP22200652.0A patent/EP4166669A1/en active Pending
- 2014-07-08 CN CN201480048643.1A patent/CN105518144A/zh active Pending
- 2014-07-08 KR KR1020227004950A patent/KR20220025922A/ko not_active Ceased
- 2014-07-08 KR KR1020267009674A patent/KR20260047645A/ko active Pending
- 2014-07-08 IL IL243475A patent/IL243475B2/en unknown
- 2014-07-08 IL IL303973A patent/IL303973A/en unknown
- 2014-07-08 WO PCT/US2014/045691 patent/WO2015006290A1/en not_active Ceased
- 2014-07-08 SG SG11201600059QA patent/SG11201600059QA/en unknown
- 2014-07-08 CA CA3192673A patent/CA3192673A1/en active Pending
- 2014-07-08 JP JP2016525411A patent/JP7120717B2/ja active Active
- 2014-07-08 KR KR1020237027175A patent/KR20230122182A/ko not_active Ceased
-
2019
- 2019-12-27 JP JP2019238862A patent/JP7201294B2/ja active Active
-
2021
- 2021-01-18 AU AU2021200288A patent/AU2021200288B2/en active Active
-
2022
- 2022-06-10 US US17/837,089 patent/US20220380811A1/en active Pending
- 2022-12-19 JP JP2022202204A patent/JP7676351B2/ja active Active
-
2023
- 2023-04-18 AU AU2023202363A patent/AU2023202363B2/en active Active
-
2024
- 2024-05-30 JP JP2024087738A patent/JP2024109929A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2929143T3 (es) | Ingeniería genómica guiada por ARN múltiplex | |
| JP7036512B2 (ja) | 巨大遺伝子の切除および挿入 | |
| US9074199B1 (en) | Mutant Cas9 proteins | |
| EP3019204B1 (en) | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing | |
| HK40092154A (en) | Multiplex rna-guided genome engineering | |
| NZ754833B2 (en) | Multiplex rna-guided genome engineering | |
| NZ716604B2 (en) | Multiplex rna-guided genome engineering | |
| HK1217967B (en) | Multiplex rna-guided genome engineering | |
| BR112016000564B1 (pt) | Método de produzir múltiplas alterações ao dna alvo | |
| Church et al. | Multiplex RNA-guided genome engineering | |
| HK1229380A1 (en) | Large gene excision and insertion |