ES2929187T3 - Procedimiento y dispositivo para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados - Google Patents
Procedimiento y dispositivo para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados Download PDFInfo
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Abstract
La invención se refiere a un método y a un dispositivo para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de aves fertilizados e incubados (1) que comprende los siguientes pasos: monitorear la progresión temporal de la incubación hasta que se forma al menos un vaso sanguíneo detectable (22). , practicando un orificio (2) en la cáscara de carbonato de calcio (28) del huevo de ave (1), buscando el vaso sanguíneo (22) que se forma en el huevo (1) mediante un sistema de visión (13, 13a), posicionar al menos un vaso sanguíneo (22), irradiar el vaso sanguíneo (22) con al menos una fuente de haz láser (3) que emite una longitud de onda de excitación, registrar la radiación de retrodispersión (5) del vaso sanguíneo irradiado (22) por medio de al menos un detector (8) que está conectado a al menos una unidad de evaluación (19). Estos son seguidos por los pasos de evaluar la radiación de retrodispersión incluyendo la radiación fluorescente (5) en la unidad de evaluación (19) a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación fluorescente (5) en un rango espectral corrido al rojo a la longitud de onda de excitación, donde las características específicas del sexo de la sangre masculina y de la sangre femenina están contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación fluorescente registrada (5) y donde al menos uno de los valores de intensidad determinados a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación fluorescente La intensidad de la radiación (5) con respecto a la sangre del macho tiene un valor diferente evaluable en comparación con al menos uno de los valores de intensidad determinados con respecto a la sangre de la hembra en los vasos sanguíneos (22), determinando el sexo del huevo del ave (1) de la diferencia de al menos uno de los valores de los valores de intensidad fluorescente (5) en la unidad de evaluación (19) y luego al menos mostrar el sexo del embrión (23) en el huevo de ave (1) determinado en la unidad de evaluación (19). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento y dispositivo para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados La invención se refiere a un procedimiento y a un dispositivo para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados.
En las memorias impresas DE 10 2014 010 150 A1 y WO 2016000678 A1 se describe un procedimiento para la determinación del sexo in ovo por espectroscopia Raman de huevos de ave fecundados e incubados, siendo el embrión, incluidas las estructuras extraembrionarias, móvil en el huevo y no estando el mismo aún fijado en la cáscara calcárea en el momento de una medición. En este caso se llevan a cabo los siguientes pasos:
- control del tiempo de incubación hasta la formación de al menos un vaso sanguíneo reconocible,
- generación de un agujero en la cáscara calcárea en las proximidades del vaso sanguíneo detectado por medio de una unidad de perforación,
- búsqueda de los vasos sanguíneos que se forman en el huevo mediante un sistema de visión y una iluminación coaxial o lateral con luz de la gama de longitudes de onda visible,
- posicionamiento de al menos un vaso sanguíneo en el foco láser de una fuente láser, ya sea mediante un movimiento del huevo o mediante un movimiento de un objetivo de un dispositivo para la aplicación de la luz láser y detección de la radiación de dispersión Raman,
- registro de la radiación de dispersión Raman del vaso sanguíneo irradiado mediante el dispositivo para la aplicación de la luz láser y para la detección de la radiación de dispersión Raman, siendo posible evitar durante la medición un movimiento del vaso sanguíneo fuera del foco gracias al seguimiento por medio del sistema de visión,
- evaluación de la radiación de dispersión Raman y determinación del sexo en una unidad de evaluación,
- visualización del sexo del embrión en el huevo de ave.
Los espectros Raman se corrigen, de manera que se eliminen las señales de fondo debidas a la fluorescencia o a otros procesos de dispersión, y los espectros se normalizan de forma predeterminada antes de llevar a cabo el análisis matemático por medio de procedimientos de clasificación asistida y no asistida.
En las memorias impresas US 8364247 B2 y EP 2336751 A1 se describe un procedimiento para la determinación del sexo de huevos de ave en el que se emite con una fuente de radiación una radiación electromagnética sobre el disco germinal de un huevo y en el que, después de desconectar la fuente de radiación, se registra con un detector el comportamiento de decrecimiento de la intensidad de autofluorescencia excitada con resolución temporal y resolución espectral para al menos una longitud de onda de la autofluorescencia en la zona irradiada del disco germinal. Con los valores de medición de intensidad determinados se calcula la dimensión fractal y se compara el valor de la dimensión fractal DF con un valor límite específico de la especie y del sexo; clasificándose el huevo respectivo como hembra si se rebasa el valor límite y como macho si no se alcanza el valor límite.
El procedimiento se aplica a los discos germinales de huevos de ave fecundados, es decir, en el día "cero" de la incubación. El inconveniente de este procedimiento consiste en que la apertura de los huevos en el día "cero" da lugar a tasas de eclosión muy reducidas. También existe el riesgo de posibles daños irreparables en el disco germinal como consecuencia de la radiación ultravioleta utilizada a 337 nm.
En la memoria impresa US 7950349 B1 se describe un procedimiento para la determinación
1) de la fertilidad de un huevo de ave mediante la medición de la luminiscencia y de la intensidad de los biofotones (fotones por segundo) del huevo tras su exposición a una fuente de luz externa y
2) del sexo de un huevo de ave mediante la medición del espectro de fotones de la emisión de biofotones y de la luminiscencia del huevo tras su exposición a una fuente de luz externa.
En este caso, la fuente de luz externa puede ser una lámpara incandescente, una lámpara fluorescente, un LED o una fuente de luz láser monocromática (pulsada o CW) o una fuente de luz láser dicromática. La primera parte del procedimiento resulta del hecho de que, tras la exposición a la fuente de luz, los huevos de ave fértiles emiten una mayor intensidad de fotones que los huevos de ave no fecundados. La segunda parte del procedimiento resulta del hecho de que, tras la exposición a las fuentes de luz citadas, los huevos de ave hembra emiten un espectro de fotones diferente al de los huevos de ave macho.
Los inconvenientes del procedimiento son:
- la luminiscencia es extremadamente débil y las intensidades medidas son sólo de unos pocos a unos cientos de fotones por segundo y por centímetro cuadrado de superficie entre 200 y 800 nm, como se describe en la memoria impresa Popp, Fritz: "Properties of biophotons and their theoretical implications", Indian Journal of Experimental Biology 41,2003, págs. 391-402,
- en este caso es necesario un largo tiempo de exposición (30 s con lámpara halógena), como se describe en el artículo Michael A. Grashorn, Ulrike Egerer: INTEGRATED AS-SESSMENT OF QUALITY OF CHICKEN ORGANIC EGGS BY MEASURE-MENT OF DARK LUMINESCENCE Pol. J. Food Nutr. Sci. 2007, Vol. 57, Núm. 4(A), págs. 191 -194.
En las memorias impresas WO 2010/150265 A3 y US 2013/0044210 A1 se describe un procedimiento para la determinación del sexo de huevos de ave no incubados mediante el análisis hiperespectral de los espectros ópticos, especialmente de los espectros de reflectancia. El análisis se realiza en un rango espectral con longitudes de onda de hasta 2500 nm (MIR) para poder filtrar la señal generada por el carbonato cálcico CaC03 de la cáscara calcárea del huevo a 2340 nm. El procedimiento permite detectar componentes biológicos distintos de la sangre y permite tanto la detección de la fertilidad antes del segundo día de incubación, como también la determinación del sexo de los polluelos en el huevo el duodécimo día de incubación. La sensibilidad puede aumentarse mediante el uso de un análisis de redes neuronales. Por medio del análisis de componentes principales (PCA) se determinan las características espectrales responsables de las variaciones entre los huevos de control no fecundados y los huevos de muestra. A continuación, mediante el análisis de redes neuronales sobre la base de los resultados del PCA se obtienen los cambios pequeños pero significativos entre los huevos de control y los huevos experimentales. El procedimiento permite la determinación de la fecundidad con una precisión superior al 90% en el día "cero" (día de la puesta de huevos) y del sexo de los polluelos con una precisión superior al 75% en el duodécimo día de la incubación.
Un inconveniente consiste en que con el procedimiento la determinación del sexo sólo puede llevarse a cabo el día 12.
En la memoria impresa DE 10 2007 013 107 B4 se analiza un material celular relevante para el ADN mediante espectroscopia vibracional, a fin de determinar el sexo de huevos de aves por medio de las diferencias de ADN: ya sea en el huevo después de abrirlo con una sonda o después de extraer el material del huevo y depositarlo en un sustrato. La espectroscopia Raman de resonancia ultravioleta se establece con longitudes de onda de 244 nm o 254 nm. En este caso se realiza una clasificación de espectros con todos los procedimientos existentes supervisados y no supervisados:
- con un material relevante para el ADN, con especial referencia a la pulpa de la pluma y al disco germinal, y
- con una espectroscopia Raman ultravioleta con una longitud de onda de 244 nm o 257 nm.
Por consiguiente, en el procedimiento se examina con luz el material celular relevante para el ADN del ave, cuyo sexo se va a determinar, y se miden las vibraciones moleculares, detectándose el espectro de las vibraciones moleculares producido por la luz y comparándose con espectros de referencia que representan estructuras de ADN predeterminadas, así como específicas del género de la especie de ave a examinar, y realizándose a partir de esta comparación espectral una asignación de sexo del ave basada en el contenido de ADN del material celular.
Aquí, las vibraciones moleculares se miden mediante la aplicación de la espectroscopia Raman o espectroscopia IR, siendo posible tomar, por ejemplo, el material celular relevante para el ADN del eje de una pluma joven de un pájaro. El material celular se prepara en un soporte y se escanea con luz. En otro procedimiento parcial descrito en la memoria impresa DE 102007013 107 A1, la luz para la medición de las vibraciones moleculares del material celular relevante para el ADN de las aves no eclosionadas se enfoca a través de la cáscara del huevo sobre el embrión o el disco germinal, midiéndose el espectro de la radiación generada por las vibraciones moleculares en el huevo con una sonda guiada a través de su cáscara.
Para el paso de la sonda se perfora al menos un pequeño agujero microscópico en la cáscara del huevo, a fin de medir el espectro. La luz se enfoca a través del pequeño acceso que atraviesa la cáscara del huevo directamente sobre el disco germinal como material celular. A través del mismo o de otro acceso con un pequeño tamaño de orificio se introduce la sonda, mediante la cual se mide el espectro reflejado y registrado por la sonda del movimiento molecular antes citado en el interior del huevo.
En un segundo paso, la información espectral obtenida se compara con datos de referencia específicos del género y se aporta a un algoritmo de clasificación. Éstos representan preferiblemente los datos obtenidos estadísticamente sobre las especies de aves a examinar. A partir de esta comparación se lleva a cabo la asignación del sexo del material de ADN a examinar.
Un problema radica en que se requiere mucho tiempo para la inserción de una sonda en agujeros prefabricados para un número muy elevado de huevos de ave a examinar. Además, cuando la luz de la sonda se enfoca en el disco germinal, es necesario un ajuste considerable para una reproducción óptica con respecto a la ubicación del disco germinal, pudiendo el plano focal presentar una ubicación diferente de huevo a huevo, por lo que no se puede realizar ninguna determinación del sexo.
Estas comprobaciones también tienen el problema de que la generación de los agujeros en la cáscara calcárea, incluida la membrana de la cáscara del huevo, en el día "cero", necesaria para el examen de los discos germinales, da lugar a una alteración del desarrollo embrionario y a un fuerte descenso de las tasas de eclosión, como se describe en los artículos S. Klein: Analysis of chicken embryonic development after removal of blastodermal cells for sexing. British Poultry Science (39), 1998, págs. 482-487; incluida la bibliografía citada en el mismo: J. Brake, T. W. (1997). Egg handling and storage. Poultry science (76), págs. 144-151.
Como tratamiento previo de los datos se llevan a cabo una derivada de 1er orden, así como una normalización del vector, eliminándose toda la información sobre la fluorescencia.
En la memoria impresa DE 102010006 161 B3 se describen un procedimiento y un dispositivo para la determinación del sexo de huevos de ave fecundados y no incubados, conteniendo un huevo al menos una cáscara calcárea sólida, una yema de huevo, rodeada por la cáscara calcárea y otras cáscaras de huevo, y un disco germinal asignado a la yema de huevo, guiándose una sonda para la medición de un espectro a través de un agujero de la cáscara calcárea en dirección hacia el disco germinal con células de disco germinal, presentando el procedimiento los siguientes pasos: - posicionamiento de la sonda en la zona del disco germinal,
- caracterización espectroscópica in ovo de las células de disco germinal,
- reconocimiento del sexo mediante la clasificación automática de los espectros de reflexión,
utilizándose como sonda un cristal óptico, con el que se realiza un registro rápido y sin devolución de un espectro infrarrojo y/o infrarrojo cercano mediante la reflexión total atenuada dentro del cristal óptico a través del campo evanescente en la zona del disco germinal, llevándose a cabo la extinción como consecuencia de una absorción espectral de las células del disco germinal específicas del género,
estando el posicionamiento del cristal óptico acompañado de una evaluación automática permanente de los espectros devueltos hasta la determinación de las células de disco germinal específicas del género, hasta que se evalúa el espectro y se indica de forma inequívoca el sexo del huevo fecundado.
Durante el proceso de posicionamiento, los espectros IR y/o NIR devueltos permanentemente se registran y se aportan a una evaluación, realizándose una clasificación automática de los espectros por medio de la huella digital espectral, por ejemplo, en proteínas, lípidos y ácidos nucleicos.
Durante la absorción específica del género de la luz IR y/o NIR incidente, las células de disco germinal se identifican por medio de las bandas de absorción de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), así como de otros compuestos bioquímicos, de manera que se determine y muestre el sexo del huevo analizado.
La medición puede realizarse mediante espectroscopia infrarroja convencional.
El dispositivo correspondiente descrito en la memoria impresa DE 102010006 161 B3 contiene
- al menos un soporte de posicionamiento de huevo para la inmovilización de al menos un huevo,
- al menos un dispositivo de ajuste de altura con al menos un brazo de sujeción,
- al menos un cristal óptico configurado como una sonda y fijado en el brazo de sujeción,
- al menos una unidad de control para el soporte de posicionamiento que inmoviliza el huevo y para el dispositivo de ajuste de altura,
- al menos una fuente de luz espectral relacionada con al menos una gama de longitudes de onda que emite un haz de luz IR y/o NIR,
- al menos un detector para el registro del haz de luz IR y/o NIR devuelto,
- al menos un elemento óptico para el guiado del haz entre la fuente de luz y el cristal óptico y para el guiado del haz devuelto desde el cristal óptico hasta el detector, así como
- una unidad de evaluación conectada al detector y una unidad de visualización, pudiéndose ajustar con el dispositivo de ajuste de altura la altura del brazo de sujeción y, por lo tanto, del cristal óptico con respecto a la ubicación del disco germinal y pudiéndose posicionar el cristal óptico en la zona del disco germinal en una posición de asignación de disco, en la que un campo evanescente, que se configura en caso de una reflexión total en la superficie de partida dirigida hacia el disco germinal, llega al disco germinal a través del cristal óptico y en la que las células del disco germinal que se encuentran en el mismo llevan a cabo, interactuando con el campo evanescente, una absorción específica del género de la luz procedente del haz luminoso incidente, guiándose la luz totalmente reflejada en la superficie de partida a través del haz luminoso devuelto dentro del cristal y, finalmente, a través del elemento óptico para su registro, al detector desde el que se transmiten las señales espectrales registradas para la evaluación y visualización del sexo.
En la memoria impresa WO 2014/021715 A2 se describe una determinación del sexo de embriones de ave, llevándose a cabo el procedimiento mediante
a) una detección de un compuesto marcador de azúcares y aminoácidos, precursores y metabolitos en el líquido alantoideo del huevo en el 8-11 día de incubación,
b) una determinación cuantitativa del marcador mediante espectroscopia de RMN,
c) una determinación del sexo mediante la comparación de la cantidad del marcador con un valor de partida preestablecido.
En este caso se llevan a cabo
- una determinación de las cantidades absolutas o de las proporciones de los compuestos (glucosa, colina, valina), a fin de compararlas con un valor de base, y
- una aplicación de procedimientos quimiométricos no supervisados (como la modelización por mínimos cuadrados o el PCA) a cantidades o proporciones cuantitativas para la determinación del sexo.
Un inconveniente principal del procedimiento consiste en que el mismo conlleva una toma de al menos una muestra del huevo.
En las memorias impresas WO 2010/1031 11 A1 y US 2012/0058052 A1 se describen un procedimiento y un dispositivo no invasivos para la determinación in ovo del sexo de las especies de aves. El procedimiento comprende los pasos de introducción en el huevo de un anticuerpo marcado que se une a un antígeno específico del género del embrión y detección del anticuerpo marcado unido con un dispositivo de detección fuera del huevo.
En la memoria impresa US 7 041 439 B2 se describen un procedimiento y un dispositivo para el tratamiento automatizado de huevos según las características seleccionadas (por ejemplo, el sexo), ejecutándose los siguientes pasos:
a) extracción del material de muestra (líquido alantoideo, clara, yema, cáscara de huevo, albúmina, tejido, membrana y/o sangre),
b) análisis del material extraído para la determinación de las características seleccionadas, y
c) tratamiento selectivo de los huevos identificados.
Aquí se representa, por ejemplo, un procedimiento para el procesamiento de huevos en función del sexo, que presenta los siguientes pasos:
1) identificación de los huevos vivos,
2) extracción del líquido alantoideo de los huevos identificados como vivos,
3) determinación del contenido de estrógenos y de un cambio de color en el líquido alantoideo extraído para la identificación del sexo,
4) inyección selectiva de una vacuna en dependencia del sexo.
Un inconveniente radica en que el examen del líquido alantoideo se lleva a cabo en el día 13 a 18. Aquí también es necesaria una toma de muestras.
En la memoria impresa US 6365339 B1 se describe un procedimiento para la determinación del sexo de embriones de aves en el que se toman muestras del líquido alantoideo del embrión durante el proceso de incubación después de perforar la cáscara calcárea y se analizan en un espectrómetro de movilidad iónica (IMS). Los espectros resultantes contienen picos de marcadores relevantes que se correlacionan con las movilidades específicas del género.
Existe el inconveniente de que aquí también es preciso tomar muestras, lo que requiere un mayor esfuerzo al menos en el entorno para la determinación del sexo.
En la memoria impresa US 6 029 080 B1 se representan un procedimiento y un dispositivo no invasivos para la determinación del sexo de huevos de aves, en el que por medio de la resonancia magnética nuclear (RMN) se determina si el embrión vivo en el huevo presenta órganos sexuales masculinos u órganos sexuales femeninos. Un inconveniente consiste en que la formación de los órganos sexuales sólo tiene lugar en el embrión desarrollado fundamentalmente después de varios días, siendo necesario al menos llevar a cabo un alto gasto financiero.
En la memoria impresa US 6506570 B1, para la determinación del sexo in ovo de huevos de aves se determinan la presencia o la ausencia de un nivel elevado de hormonas específico del género, preferiblemente el nivel de estrógenos, en un fluido extraembrionario, preferiblemente el fluido alantoideo. El procedimiento se aplica preferiblemente a los huevos de gallina y puede llevarse a cabo antes o durante el traslado de la preincubadora a la cabina de incubación. En la memoria impresa DE 102012 023 947 A1 se describe un procedimiento para la exploración de estructuras a través de una barrera ópticamente opaca de un objeto de prueba biológico. En el caso del objeto de prueba se explora una estructura interna con diferentes propiedades dieléctricas mediante el análisis espectral electromagnético, posicionándose el objeto de prueba en un conjunto de transmisores y receptores de impulsos dispuestos en un plano y conectados a un sistema informático de forma conductora de datos, así como de información,
emitiéndose mediante los emisores de pulsos los pulsos electromagnéticos en el rango espectral de 0,01 THz a 1 THz sobre el objeto de prueba posicionado, recibiendo los receptores la radiación emitida por el objeto de prueba y aportándose la misma al ordenador a través de conexiones conductoras de datos, así como de información para un procedimiento de generación de imágenes.
Dado que la radiación THz es muy débil, se producen largos tiempos de medición que son un obstáculo para llevar a cabo una determinación del sexo rápida y automática. Además, una fuerte absorción de vapor de agua asociado en
el rango THz requiere una humedad del aire extremadamente baja o constante en la incubadora, lo que a su vez supone un elevado esfuerzo técnico adicional.
En la memoria impresa DE 202013011 765 U1 se describe un análisis espectrofotométrico del color de las plumas de embriones de pollo. Aquí se utiliza energía electromagnética con una longitud de onda de entre 380 nm y 740 nm aproximadamente para la determinación no invasiva del sexo de embriones de aves, exponiéndose un huevo de ave a la energía electromagnética y determinándose por medio del huevo de ave el valor de absorción, difusión, refracción, reflexión o cualquier combinación de los mismos, de la energía electromagnética. Mediante la presencia o la ausencia de pigmento de color en el huevo de ave se determina, al menos parcialmente, el sexo del embrión de ave.
El análisis espectrofotométrico del color de las plumas de embriones de pollo sólo puede aplicarse a las razas marrones o a las razas con diferencia de color en los polluelos hembra o en los polluelos macho.
A continuación se resumen los inconvenientes de los procedimientos de las memorias impresas citadas:
1. la determinación del sexo en el día "cero" requiere un acceso a la posición fijada del disco germinal, lo que, según experiencias anteriores, perjudica el desarrollo embrionario y disminuye en gran medida las tasas de eclosión, 2. en caso de una determinación del sexo tardía con días de incubación de 7 a 21 días, desempeñan un papel fundamental, en primer lugar, los aspectos legales de protección de animales,
- comenzando el embrión de ave a sentir dolor a partir del 7° día de incubación, y
- llevándose a cabo una matanza tardía de embriones de ave muy desarrollados, ya que, con el aumento de la incubación, el contenido del huevo se compone del propio embrión de ave, y
en segundo lugar, los aspectos económicos
- permaneciendo los huevos macho, en caso de una determinación del sexo tardía, más tiempo en la incubadora, lo que conlleva un grado de utilización mucho peor de las incubadoras y, por consiguiente, mayores costes de electricidad,
3. en caso de una determinación del sexo con una toma de material de muestra pueden surgir los siguientes problemas:
- la limpieza y desinfección adicionales necesarias después de cada medición o la sustitución de equipos o piezas de equipos (por ejemplo, las cánulas) aumentan considerablemente los costes de consumo en curso,
- resulta una automatización complicada en comparación con los procedimientos sin contacto, y
- el riesgo de infección se incrementa en gran medida, por lo que puede resultar un riesgo de reducción de las tasas de eclosión.
A continuación se describe cómo se ha utilizado hasta ahora una fluorescencia endógena de la sangre (independientemente de la determinación del sexo), a fin de caracterizar la sangre:
En la memoria impresa US 2011/053210 se describe un analizador de sangre basado en la medición de la fluorescencia.
El analizador de sangre comprende
- una sección de preparación de muestras,
- una muestra de medición de una muestra de sangre y de un agente hemolítico,
- una unidad de información luminosa que genera información de fluorescencia y al menos dos tipos de información de luz dispersa a partir de la muestra de medición, y
- una unidad de control para una primera clasificación de los glóbulos blancos de la muestra de medición en al menos cuatro grupos (entre otros, monocitos, neutrófilos, eosinófilos) sobre la base de la información de las señales de fluorescencia y de las señales de los dos tipos de luz dispersa.
Los inconvenientes son,
que el análisis de sangre no aporta ninguna información sobre el sexo, sino sólo información sobre las células sanguíneas. El análisis de la sangre no se realiza in situ en el vaso sanguíneo, sino en muestras de sangre separadas. La longitud de onda de excitación es de entre 350 nm y 500 nm. Las señales no se evalúan espectroscópicamente, llevándose a cabo sólo una evaluación de la intensidad de la luz retrodispersada y transmitida.
En la memoria impresa US 2014/332697 se describe un procedimiento para un procedimiento de detección espectral de componentes sanguíneos tras la talasemia que se basa en los espectros de fluorescencia de las biomoléculas. Las biomoléculas incluyen, entre otros, tirosina, triptófano, nicotinamida adenina dinucleótido y flavina adenina dinucleótido, todos presentes en el plasma sanguíneo, así como porfirina de los eritrocitos. En este procedimiento, las relaciones de los máximos de intensidad entre el triptófano, la nicotinamida adenina dinucleótido, la flavina adenina
dinucleótido, la nicotinamida adenina dinucleótido, la tirosina triptófano y la porfirina se utilizan para diagnosticar a un paciente con talasemia.
Los inconvenientes radican en que
el análisis no se realiza in situ en el vaso sanguíneo, sino en muestras de sangre separadas. La excitación se realiza en el rango ultravioleta y el registro de las señales de fluorescencia se realiza en el rango UV y VIS entre 350 nm y 500 nm.
En la memoria impresa US 2014/0308697 A1 se describen procedimientos y dispositivos para la identificación de eritrocitos infectados por Plasmodium. Los procedimientos comprenden:
- obtención de una señal de luz dispersa frontal, una señal de luz dispersa lateral y una señal de fluorescencia opcional de las células en una muestra de sangre;
- obtención de un diagrama de dispersión bidimensional (señal de luz dispersa frontal y señal de luz dispersa lateral) o un diagrama de dispersión tridimensional (señal de luz dispersa frontal, señal de luz dispersa lateral y señal de fluorescencia);
- identificación de los eritrocitos infectados por Plasmodium como células que se encuentran en una zona predeterminada del diagrama de dispersión bidimensional o del diagrama de dispersión tridimensional.
La invención se basa en el objetivo de proponer un procedimiento y un dispositivo para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados, configurados adecuadamente de manera que el sexo ya se pueda determinar inequívocamente en los huevos de forma rápida y fiable. El embrión femenino debe desarrollarse normalmente y la eclosión del polluelo hembra debe producirse.
La tarea se resuelve con las características de las reivindicaciones 1 y 14.
En el procedimiento para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados se llevan a cabo los siguientes pasos:
- control del tiempo de incubación hasta la formación de al menos un vaso sanguíneo detectable con sangre fluyente, - generación de un agujero en la cáscara calcárea del huevo de ave por medio de una unidad de perforación, - búsqueda de los vasos sanguíneos o del corazón que se forman en el huevo mediante un sistema de visión y una iluminación coaxial o lateral con luz en la gama de longitudes de onda visible,
- posicionamiento de al menos un vaso sanguíneo o del corazón en el foco láser de al menos una fuente de rayos láser, ya sea mediante el movimiento del huevo o mediante el movimiento de un objetivo que genera el foco láser, - irradiación del vaso sanguíneo o del corazón con al menos una fuente de rayos láser que emite una longitud de onda de excitación,
- registro de la radiación de retrodispersión del vaso sanguíneo irradiado o del corazón por medio de al menos un detector que está conectado a al menos una unidad de evaluación conectada posteriormente a una unidad de amplificación y de detección, pudiéndose realizar durante el registro un movimiento del vaso sanguíneo o del corazón fuera del rayo láser mediante el seguimiento de los vasos sanguíneos o del corazón o del objetivo,
siguiendo a continuación, según la parte característica de la reivindicación 1, los pasos adicionales
- evaluación de la radiación de retrodispersión, incluida la radiación de fluorescencia, en la unidad de evaluación a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación de fluorescencia en un rango espectral desplazado al rojo con respecto a la longitud de onda de excitación, estando las propiedades específicas del género de la sangre masculina y de la sangre femenina contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación de fluorescencia registrada y presentando al menos una de las magnitudes de intensidad, determinadas a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación de fluorescencia, o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre masculina, un valor diferente evaluable con respecto a al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas o a sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre femenina en los vasos sanguíneos,
- determinación en la unidad de evaluación del sexo del huevo de ave a partir de la diferencia de al menos uno de los valores de las magnitudes de intensidad de fluorescencia o de sus magnitudes asignadas y, a continuación, al menos - indicación en la unidad de evaluación del sexo del embrión en el huevo de ave determinado.
El diferente valor respectivamente evaluable de las magnitudes de intensidad puede referirse al menos a un valor límite o valor umbral predeterminado almacenado en la unidad de evaluación y asignado a la magnitud de intensidad. En la unidad de evaluación, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas pueden establecerse con respecto a un rango espectral predeterminado como la intensidad integral Ii51 de la radiación de fluorescencia de la sangre masculina y como la intensidad integral Ii52 de la radiación de fluorescencia de la sangre femenina.
En la unidad de evaluación pueden establecerse las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas con respecto a un rango espectral predeterminado como el máximo de intensidad 51 Máx de la radiación de fluorescencia de la sangre masculina y como el máximo de intensidad 52Máx de la radiación de fluorescencia de la sangre femenina.
En caso de uso de una fuente de rayos láser, en la unidad de evaluación se pueden establecer las magnitudes de intensidad determinadas a partir de la curva de intensidad de fluorescencia/número de onda determinada con respecto a un rango espectral predeterminado respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina mediante una combinación lógica.
En caso de uso de al menos dos fuentes de rayos láser, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas pueden establecerse en la unidad de evaluación con respecto a un rango espectral predeterminado como las intensidades integrales II
511
, II
512
de los rayos de fluorescencia de la sangre masculina y como las intensidades integrales 1
1521
, II
522
de los rayos de fluorescencia de la sangre femenina.
En caso de uso de al menos dos fuentes de rayos láser, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas pueden establecerse para la evaluación en la unidad de evaluación con respecto a un rango espectral predeterminado respectivamente de forma combinada para la sangre masculina y para la sangre femenina.
En la unidad de evaluación, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas pueden establecerse para la evaluación con respecto a un rango espectral predeterminado como la intensidad integral I
5
de la radiación de fluorescencia de la sangre masculina y como la intensidad integral Ii52 de la radiación de fluorescencia de la sangre femenina y las radiaciones de dispersión Raman 5051, 5052 que solapan respectivamente las radiaciones de fluorescencia por sí solas o en combinación con las demás magnitudes de intensidad determinadas y las magnitudes asignadas y evaluándose conjuntamente, en caso de una combinación de las magnitudes de intensidad y las magnitudes asignadas, la radiación de dispersión Raman y la radiación de fluorescencia mediante una combinación lógica.
Si se utiliza una radiación láser pulsada de la fuente de rayos láser, la intensidad de fluorescencia generada puede medirse de forma resuelta en el tiempo, pudiendo realizarse una determinación del sexo a partir de la constante de tiempo r de la curva de decrecimiento de la intensidad de fluorescencia resuelta en el tiempo, determinándose para la determinación del sexo a partir de la curva de decrecimiento de la fluorescencia para la sangre masculina y para la sangre femenina respectivamente una constante de tiempo diferente Tmacho, Thembra, siendo Tmacho t Thembra.
Teniendo en cuenta la radiación de dispersión Raman que también se produce y registra, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas pueden establecerse con respecto a un rango espectral predeterminado en la unidad de evaluación para la evaluación como la intensidad integral Ii
51
de la radiación de fluorescencia de la sangre masculina y como la intensidad integral Ii
52
de la radiación de fluorescencia de la sangre femenina y las radiaciones de dispersión Raman 5051, 5052 que solapan respectivamente las radiaciones de fluorescencia.
Un dispositivo para la determinación óptica del sexo in ovo de un huevo de ave fecundado e incubado sobre la base de la radiación de fluorescencia generada comprende
- una unidad de alojamiento de huevos en la que se aloja el huevo,
- un dispositivo de evaluación de posicionamiento conectado a la unidad de alojamiento de huevos,
- un dispositivo de radiación con luz en la gama de ondas visible para irradiar al menos un vaso sanguíneo extraembrionario, un vaso sanguíneo embrionario o el corazón del embrión,
- un detector para la luz visible o verde para la detección de al menos un vaso sanguíneo extraembrionario, un vaso sanguíneo embrionario o el corazón del embrión, estando el detector conectado al dispositivo de evaluación de posicionamiento,
- un dispositivo para la aplicación de la luz láser al huevo que comprende al menos:
- una fuente láser que emite luz láser,
- un detector para la recepción de la radiación de fluorescencia,
- una unidad de control para el posicionamiento xyz del dispositivo en el agujero practicado en el huevo,
- una unidad de evaluación de determinación del sexo conectada a la unidad de amplificación y detección y al dispositivo de evaluación de posicionamiento conectado a la unidad de control,
disponiéndose, según la parte característica de la reivindicación 14, un dispositivo para separar la radiación de fluorescencia de la radiación de retrodispersión entre un colimador para el haz de rayos del rayo láser y el dispositivo para la aplicación del rayo láser al huevo, colocándose entre el dispositivo de separación del rayo y al menos un detector de fluorescencia respectivamente un filtro de detección correspondiente a la trayectoria de los rayos para la transmisión de la radiación de fluorescencia,
llevándose a cabo en la unidad de evaluación de determinación del sexo
- una evaluación de la radiación de retrodispersión incluida la radiación de fluorescencia a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación de fluorescencia en un rango espectral desplazado al rojo con respecto a la longitud de onda de excitación, estando las características específicas del género de la sangre masculina y de la sangre femenina contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación de fluorescencia registrada y presentando al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación de fluorescencia o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre masculina, un valor diferente evaluable en comparación con al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre femenina en los vasos sanguíneos,
- una determinación del sexo del huevo de ave a partir de la diferencia de al menos uno de los valores de las magnitudes de intensidad de fluorescencia o de sus magnitudes asignadas en la unidad de evaluación.
La luz en la gama de longitudes de onda visible con la que está previsto el dispositivo de radiación para la irradiación de al menos un vaso sanguíneo muestra preferiblemente luz verde.
El rayo láser producido en el láser puede transmitirse por medio de espejos o por medio de un fibroscopio. El rayo láser se enfoca con el colimador.
El rayo láser se transmite al huevo y se enfoca con una lente en un vaso sanguíneo extraembrionario, un vaso sanguíneo embrionario o el corazón del embrión.
La radiación de fluorescencia resultante se recoge con la misma lente.
Se utiliza un divisor de haz para separar la señal de fluorescencia de la luz visible de la fuente de radiación.
La luz en el rango espectral visible se transmite a la cámara, separando un filtro los rayos restantes de la luz láser.
Se utiliza un divisor de haz para separar la luz fluorescente que incide en el detector. El detector, normalmente un fotodiodo, preferiblemente un fotodiodo de avalancha de un fotomultiplicador, mide la intensidad de la radiación de fluorescencia.
Al menos un filtro de paso de banda selecciona el rango espectral de fluorescencia a medir.
Una unidad de detección amplifica, filtra y mide la señal del detector, que se envía desde ésta a la unidad de determinación del sexo.
La intensidad medida se evalúa en la unidad de evaluación, por ejemplo, mediante una comparación con un valor umbral medido SW, determinándose así el sexo del huevo.
La realización de un agujero en la cáscara calcárea por medio de una unidad de perforación en forma de un láser o de una perforación mecánica puede llevarse a cabo con diámetros de hasta 18 mm, preferiblemente de entre 4 mm y 15 mm. La luz en la gama de longitudes de onda visible puede ser luz blanca, pero el contraste mejora si se usa luz azul y/o verde de una fuente de luz (por ejemplo, un LED verde o azul, o una lámpara incandescente con filtro azul o verde). Durante la medición puede realizarse un movimiento del vaso sanguíneo o del corazón fuera del rayo láser mediante el seguimiento del vaso sanguíneo o del corazón o del objetivo correspondiente activado por el sistema de visión de control.
Las mediciones de la radiación de fluorescencia se llevan a cabo mediante el uso de sistemas ópticos como lentes u objetivos de microscopio o una sonda de fibra.
El rayo láser enfocado o concentrado se enfoca en el vaso sanguíneo seleccionado o en el corazón, realizándose el seguimiento, en su caso, automáticamente con el movimiento del vaso sanguíneo seleccionado o del corazón por medio de una lente o de un objetivo.
Las longitudes de onda de excitación de la luz láser de la fuente de rayos láser son superiores a 400 nm, utilizándose, por ejemplo, un láser HeNe de 633 nm, un láser de estado sólido (basado en Nd, por ejemplo, láser Nd:YAG de 532 nm o 1064 nm, láser de diodo VIS NIR, por ejemplo, de 785 nm). El acoplamiento del rayo de excitación láser puede realizarse directamente con espejos y/o con fibras ópticas. La potencia aplicada de la fuente de rayos láser no debe dar lugar a un calentamiento local y global del huevo por encima de los 40° Celsius.
Un desacoplamiento directo de la radiación de retrodispersión recogida se lleva a cabo con espejos o con fibras ópticas hasta la detección. La radiación de retrodispersión contiene la radiación de fluorescencia como una parte.
La radiación de fluorescencia puede registrarse preferiblemente con un objetivo.
El elemento óptico respectivo para el guiado del haz o para el guiado del haz por retrodispersión puede ser una fibra óptica flexible.
Una detección de la radiación de retrodispersión puede realizarse como sigue mediante:
- la aplicación de dispositivos que miden la intensidad de la luz o el flujo de fotones como, por ejemplo, los fotodiodos, los fotodiodos de avalancha o los fotomultiplicadores,
- la aplicación de divisores de haz y filtros ópticos de paso de banda antes de la detección para seleccionar las zonas espectrales de la fluorescencia, o
- la aplicación de espectrómetros de dispersión para realizar análisis espectrales.
La intensidad y el perfil espectral de la fluorescencia contienen las características específicas del género, aportándose las intensidades de fluorescencia determinadas en una o varias zonas espectrales a un análisis matemático.
La determinación del sexo puede realizarse cualquier día entre la formación de al menos un vaso sanguíneo detectable o la formación del corazón y la eclosión, preferiblemente entre el día 2,5 y el día 5 de incubación. Después del quinto día de incubación, la diferencia entre la autofluorescencia de la sangre de los embriones masculinos y de los embriones femeninos disminuye.
Las ventajas de la determinación del sexo según la invención son:
- ninguna influencia negativa en la eclosión ni en el posterior desarrollo del polluelo, y
- realización de la determinación del sexo con gran precisión en tiempo real en una fase muy temprana y con la ayuda de una determinación sin contacto y sin toma de muestras.
La radiación de retrodispersión espectral registrada es variable en el rango espectral, pero siempre desplazada al rojo en comparación con la longitud de onda de excitación del láser. Normalmente, hay un desplazamiento de frecuencia de entre unos 100 cm-1 y 4000cm-1. En el rango espectral, la autofluorescencia de la sangre es diferente para los embriones masculinos y para los embriones femeninos. La intensidad de la autofluorescencia de la sangre masculina es más fuerte y el máximo de fluorescencia espectral de la intensidad de la sangre masculina se desplaza ligeramente hacia números de onda más altos. La débil radiación Raman se superpone a la radiación de fluorescencia.
A continuación se muestran cuatro configuraciones diferentes del dispositivo según la invención. Las configuraciones se describen para su aplicación a un huevo. Son posibles las paralelizaciones del dispositivo según la invención, es decir, una disposición de varios dispositivos según la invención en un recorrido de determinación del sexo, a fin de poder analizar automáticamente en el mismo tiempo un mayor número de huevos con respecto al sexo.
En otras reivindicaciones dependientes se indican variantes perfeccionadas y configuraciones ventajosas de la invención.
La invención se explica más detalladamente por medio de ejemplos de realización a la vista de los dibujos.
Se muestra en la:
Figura 1 una representación esquemática de un primer dispositivo según la invención para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia producida después de la excitación con medición de la intensidad integral para el sexo masculino y para el sexo femenino del embrión con un dispositivo para la separación de la radiación de fluorescencia y con un detector, representando la figura 1a una vista ampliada de la abertura de agujero con el embrión, con los vasos sanguíneos correspondientes y con los vasos sanguíneos extraembrionarios según la figura 1,
Figura 2 una representación esquemática de un segundo dispositivo según la invención para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia producida tras la excitación con medición en números de onda predeterminados mediante un dispositivo para la separación de la radiación de fluorescencia y un número de detectores,
Figura 3 una representación esquemática de un tercer dispositivo según la invención para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia producida tras la excitación con al menos dos fuentes láser y con la medición de las dos curvas representadas respectivamente en la figura 7 como intensidades integrales para el sexo masculino y para el sexo femenino del embrión en números de onda predeterminados mediante un dispositivo para la separación de la radiación de fluorescencia y un número de detectores,
Figura 4 una representación esquemática de un cuarto dispositivo según la invención para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia producida y de la radiación de dispersión Raman después de la excitación con las mediciones de los dos desarrollos de intensidad mediante un dispositivo para la separación de la radiación de fluorescencia y un espectrómetro,
Figura 5 curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda para el primer dispositivo según la invención de acuerdo con la figura 1 para la determinación del sexo de huevos de aves incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia generada después de la excitación con medición de la intensidad integral (sombreada de forma respectivamente diferente), mostrando la figura 5a las intensidades integrales según la figura 5 para todo el rango espectral, mostrando la figura 5b el desarrollo de intensidad espectral para un rango espectral predeterminado y proporcional y mostrando la figura 5c las intensidades integrales correspondientes a la figura 5b,
Figura 6 curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda para el segundo dispositivo según la invención de acuerdo con la figura 2 para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia generada después de la excitación con medición de la intensidad en las curvas de intensidad registradas en números de onda respectivamente predeterminados, mostrando la figura 6a las intensidades integrales de rangos
espectrales parciales preestablecidos en todo el rango espectral y mostrando la figura 6b la intensidad integral normalizada según la figura 6 y la figura 6a,
Figura 7 curvas de intensidad de fluorescencia/número de frecuencias para el tercer dispositivo según la invención de acuerdo con la figura 3 para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia generada después de la excitación por medio de dos fuentes de rayos láser que emiten diferentes longitudes de onda con medición de las diferentes curvas de intensidad (respectivamente con una línea continua, una línea discontinua),
Figura 8 curvas de intensidad de fluorescencia/número de frecuencias para el cuarto dispositivo según la invención de acuerdo con la figura 4 para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia generada y de la radiación de dispersión Raman después de la excitación con una fuente de rayos láser para la medición de las dos intensidades superpuestas, mostrando la figura 8a las curvas de las intensidades normalizadas según la figura 8.
En la figura 1 se muestra una representación esquemática de un primer dispositivo 30 para la determinación óptica del sexo in ovo de un huevo de ave fecundado e incubado 1 sobre la base de la radiación de fluorescencia generada 5, comprendiendo el dispositivo 30
- una unidad de alojamiento de huevos 16, en la que se aloja el huevo 1,
- un dispositivo de evaluación de posicionamiento 17 conectado a la unidad de alojamiento de huevos 16,
- un dispositivo de radiación 13 con luz en la gama de ondas visible para irradiar al menos uno de los vasos sanguíneos extraembrionarios 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 o el corazón 25 del embrión 23,
- un detector (por ejemplo, una cámara) 14 de luz visible o verde 13a para la detección de al menos un vaso sanguíneo extraembrionario 22, de un vaso sanguíneo embrionario 24 o del corazón 25 del embrión 23, estando el detector 14 conectado al dispositivo de evaluación de posicionamiento 18,
- un dispositivo 6 para la aplicación de luz láser 34 al huevo 1,
conectado a al menos
- una fuente láser 3 que emite luz láser 34,
- un detector 8 para la recepción de la radiación de fluorescencia 5,
- una unidad de control 17 para el posicionamiento xyz del dispositivo 6 en el agujero 2 practicado en el huevo 1,
- una unidad de evaluación de determinación del sexo 19 conectada a la unidad de amplificación y detección 12 y a la unidad de evaluación de posicionamiento 18 conectada a la unidad de control 17.
En la figura 1 se dispone, según la invención, un dispositivo 11 para separar la radiación de fluorescencia 5 de la radiación de retrodispersión entre un colimador 4 para la concentración del rayo láser 34 y el dispositivo para la aplicación de la luz láser 34 al huevo 1, colocándose entre el dispositivo de separación de rayo 11 y al menos un detector de fluorescencia 8 respectivamente un filtro de detección 9 correspondiente a la trayectoria de los rayos para la transmisión de la radiación de fluorescencia 5.
El filtro de detección 9 puede ser un filtro de paso de banda predeterminado adaptado.
En la unidad de evaluación de determinación del sexo 19 se pueden llevar a cabo
- una evaluación de la radiación de retrodispersión 5, 50, 51, 52 que incluye la radiación de fluorescencia 5, 51, 52 a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación de fluorescencia 51, 52 en un rango espectral desplazado al rojo con respecto a la longitud de onda de excitación, estando las propiedades específicas del género de la sangre masculina y de la sangre femenina contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación de fluorescencia registrada 51, 52 y presentando al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación de fluorescencia 51,52 o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre masculina al menos un valor diferente evaluable con respecto a al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas o a sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre femenina en los vasos sanguíneos 22, 24, 25, y llevándose a cabo, por consiguiente
- una determinación del sexo del huevo de ave 1 a partir de la diferencia de al menos uno de los valores de las magnitudes de intensidad de fluorescencia 51,52 o de sus magnitudes asignadas, o a partir de una comparación con un valor umbral SW mediante elementos técnicos de programación y/o combinaciones lógicas opcionales presentes en la unidad de evaluación 19.
La luz en la gama de longitudes de onda visible con la que está dotado el dispositivo de radiación 13 para irradiar al menos un vaso sanguíneo 22, 24 o el corazón 25 puede mostrar preferiblemente luz verde.
El rayo láser producido en el láser 3 puede transmitirse por medio de espejos o por medio de un fibroscopio. El rayo láser 34 se concentra con el colimador 4.
El rayo láser 34 se transmite al huevo y se enfoca con una lente 7 en un vaso sanguíneo extraembrionario 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 o el corazón 25 del embrión 23.
La radiación de fluorescencia generada 5 se recoge con la misma lente 7.
Se utiliza un divisor de haz 6 para separar la señal de fluorescencia 5 de la luz visible 13a de la fuente de radiación 13.
La luz en el rango espectral visible 13a se transmite a la cámara 14 y un filtro 15 separa los rayos restantes de la luz láser.
Se utiliza un divisor de haz 11 para separar la radiación de fluorescencia 5 que incide en el detector 8. El detector 8, normalmente un fotodiodo o un fotodiodo de avalancha o un fotomultiplicador, mide la intensidad de la radiación de fluorescencia.
El filtro de paso de banda 9 selecciona el rango espectral a medir de la fluorescencia.
Una unidad de detección 12 amplifica, filtra y mide la señal del detector que se envía desde la misma a la unidad de evaluación de determinación del sexo 19.
La intensidad medida puede compararse con un valor umbral medido en la unidad de evaluación 19, determinándose así el sexo del huevo.
La figura 1a representa una ampliación del agujero 2 según la figura 1. En ésta se encuentran los vasos sanguíneos extraembrionarios 22, los vasos sanguíneos embrionarios 24 y el embrión 23 con el corazón 25 situado en su interior. La radiación espectral registrada relacionada con el primer dispositivo 30 y representada en la figura 5 es variable en el rango espectral, pero siempre desplazada al rojo en comparación con la longitud de onda de excitación del láser 3. Normalmente, el desplazamiento de frecuencia es de entre 100 cm-1 y 4000 cm-1. En el rango espectral desplazado al rojo indicado en la figura 5, la autofluorescencia de la sangre es diferente para los embriones masculinos y para los embriones femeninos. La autofluorescencia de la sangre masculina presenta un desarrollo de intensidad 51 más alto que el desarrollo de intensidad 52 con respecto a la sangre femenina y el máximo espectral de fluorescencia 51Máx de la sangre masculina está ligeramente desplazado a números de onda más altos con respecto al máximo de fluorescencia 52Máx de la sangre femenina.
En la figura 5 se muestran las curvas de intensidad de fluorescencia/número de frecuencias para el primer dispositivo 30 según la invención de acuerdo con la figura 1 para la determinación del sexo de huevos de ave incubados sobre la base de la radiación de fluorescencia generada después de la excitación con medición de la intensidad integral, como se muestra en la figura 5a (respectivamente sombreadas de un modo distinto).
Según las figuras 5, 5b y 5c, al menos las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas 51, 52 pueden establecerse para la determinación del sexo en la unidad de evaluación 19 con respecto al rango espectral predeterminado de entre aproximadamente 2400 y 2750 cm-1 como la intensidad integral Im de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como la intensidad integral Ii52 de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina según la figura 5c.
En la configuración 1 según la figura 1 se llevan a cabo las siguientes operaciones:
- la excitación se realiza con una longitud de onda de un láser 3,
- todo el rango espectral o un rango espectral parcial de la radiación de fluorescencia y de la radiación de retrodispersión se registran con un detector/sensor 8 y con un filtro de paso de banda predeterminado 9,
- la señal se amplifica eventualmente,
- se establece un valor de umbral adaptado SW para la intensidad registrada y eventualmente amplificada, a fin de distinguir los embriones femeninos de los embriones masculinos. La sangre de los embriones femeninos se caracteriza por un valor de intensidad Ii52 inferior al valor umbral adaptado SW, la sangre de los embriones masculinos se caracteriza por un valor de intensidad Ii51 superior al valor umbral adaptado SW.
Además, según la figura 5, en la unidad de evaluación 19 las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda 51, 52 se pueden establecer para la determinación del sexo con respecto a un rango espectral predeterminado como el máximo de intensidad 51Máx de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como el máximo de intensidad 52Máx de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina.
En la figura 2, correspondiente a la configuración 2, se muestra en una representación esquemática un segundo dispositivo 31 para la determinación in ovo del sexo de un huevo de ave fecundado e incubado 1 sobre la base de una radiación de fluorescencia detectada 5, comprendiendo el dispositivo 31
- una unidad de alojamiento de huevos 16, en la que se aloja el huevo 1,
- un dispositivo de evaluación de posición 17 conectado a la unidad de alojamiento de huevos 16,
- un dispositivo de radiación 13 con luz en la gama de longitudes de onda visible, preferiblemente en la gama verde, para irradiar al menos un vaso sanguíneo, como el vaso sanguíneo extraembrionario 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 o el corazón 25 del embrión 23,
- un detector (por ejemplo, una cámara) 14 de luz visible o verde 13a para la detección de al menos un vaso sanguíneo extraembrionario 22, de un vaso sanguíneo embrionario 24 o del corazón 25 del embrión 23, estando el detector 14 conectado al dispositivo de evaluación de posicionamiento 18,
- un dispositivo 6 para la aplicación de luz láser 34 al huevo 1,
conectado a al menos
- una fuente láser 3 que emite luz láser 34 y
- dos o más detectores 8/representándose en la figura 2 cinco o en la figura 6 de forma correspondiente ocho, para la recepción de la radiación de fluorescencia 5 en dos o más rangos espectrales D1 a D8, que se seleccionan mediante filtros de paso de banda predeterminados 9/representándose en la figura 2 cinco o en la figura 6 de forma correspondiente ocho (sólo cinco dibujados) y
- una unidad de control 17 para el posicionamiento xyz del dispositivo 6 en el agujero 2 practicado en el huevo 1, - una unidad de evaluación de determinación del sexo 19 conectada a la unidad de amplificación y detección 12 y al dispositivo de evaluación de posicionamiento 18 conectado a la unidad de control 17.
En la configuración 2 según la figura 2 se realizan las siguientes operaciones:
- la excitación se lleva a cabo con una longitud de onda (fuente de rayos láser 3),
- todo el rango espectral o un rango espectral parcial de la fluorescencia y de la retrodispersión se registra con más de un detector/sensor 8 y filtros de paso de banda predeterminados 9 que seleccionan diferentes gamas espectrales D1 a D8,
- eventualmente, la señal se amplifica,
- para obtener el sexo del embrión 23, las intensidades de señal registradas y eventualmente amplificadas se aportan a una evaluación matemática. La evaluación matemática puede basarse en la evaluación de intensidades, proporciones, sumas o diferencias de intensidad, así como en métodos de clasificación supervisados como el análisis discriminante, las máquinas de vectores de apoyo o las redes neuronales. Las intensidades de señal registradas pueden evaluarse sin un tratamiento previo de los datos o normalizarse antes de la evaluación, por ejemplo, mediante una normalización de vectores o áreas.
Con esta finalidad, según la figura 6, en la unidad de evaluación 19 las magnitudes de intensidad Id1 a Ids determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas 51,52 pueden establecerse para la determinación del sexo con respecto a los ocho rangos espectrales predeterminados D1 a D8 como intensidades integrales de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como intensidades integrales de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina, en las que, por ejemplo, la diferencia de las respectivas intensidades integrales es mayor.
El rayo láser representado en la figura 2, que se produce en el láser 3, puede transmitirse por medio de espejos o por medio de un fibroscopio. El rayo láser 34 se concentra con el colimador 4.
El rayo láser 34 se transmite al huevo y se enfoca con una lente u objetivo 7 en un vaso sanguíneo extraembrionario 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 o el corazón 25 del embrión 23.
La radiación de fluorescencia 5 se recoge con la misma lente/el mismo objetivo 7.
Se utiliza un divisor de haz 6 para separar la señal de fluorescencia 5 de la luz visible 13a de la fuente de radiación 13.
La luz en el rango espectral visible 13a se transmite a la cámara 14 y un filtro 15 separa los rayos restantes de la luz láser.
El divisor de haz 11 como dispositivo para la separación de la radiación de fluorescencia se utiliza para separar la radiación de fluorescencia 5 que incide en el detector 8. Un detector 8, normalmente un fotodiodo o un fotodiodo de avalancha o un fotomultiplicador, mide la intensidad de la radiación de fluorescencia.
Los ocho (sólo cinco dibujados) filtros de paso de banda 9 presentados según la figura 6 seleccionan los rangos espectrales D1 a D8 de la fluorescencia que se registran con cada uno de los ocho (sólo cinco dibujados) detectores 8 presentados.
Una unidad de detección 12 amplifica, filtra y mide la señal de los detectores 8 que se envía a la unidad de evaluación de determinación del sexo 19.
Para determinar el sexo, las intensidades de señal se evalúan en la unidad de evaluación 19 con uno de los siguientes procedimientos o con una combinación de los siguientes procedimientos:
- las intensidades se comparan con valores umbral,
- las proporciones de intensidad se comparan con valores umbral,
- las sumas o diferencias de intensidad se comparan con valores umbral,
- a los valores de intensidad se les aplican métodos de clasificación supervisados como, por ejemplo, análisis discriminantes, máquinas de vectores de apoyo o redes neuronales.
Las intensidades de señal Id1 a Id8 pueden normalizarse, como se muestra en la figura 6b, por ejemplo, mediante una normalización vectorial o de área, y a continuación evaluarse matemáticamente con uno de los siguientes procedimientos o con una combinación de los siguientes procedimientos, a fin de obtener el sexo:
- las intensidades normalizadas en la figura 6b se comparan, por ejemplo, con valores umbral,
- las relaciones entre las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- las sumas o diferencias de las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- a los valores de intensidad normalizados se les aplican métodos de clasificación supervisados como, por ejemplo, análisis discriminantes, máquinas de vectores de apoyo o redes neuronales.
En la figura 3 correspondiente a la configuración 3 se muestra en una representación esquemática un tercer dispositivo 32 para la determinación óptica del sexo in ovo de un huevo de ave fecundado e incubado 1 sobre la base de la radiación de fluorescencia, comprendiendo el dispositivo 32
- una unidad de alojamiento de huevos 16, en la que se aloja el huevo 1,
- un dispositivo de evaluación de posición 17 conectado a la unidad de alojamiento de huevos 16,
- un dispositivo de radiación 13 con luz en la gama de longitudes de onda visible o verde para irradiar al menos uno de los vasos sanguíneos extraembrionarios 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 y el corazón 25 del embrión 23, - un detector (por ejemplo, una cámara) 14 para la luz visible o verde 13a para detectar al menos un vaso sanguíneo extraembrionario 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 o el corazón 25 del embrión 23, estando el detector 14 conectado al dispositivo de evaluación de posicionamiento 18,
- un dispositivo 6 para aplicar la luz láser 34 al huevo 1,
conectado a al menos
- dos o más fuentes de rayos láser 35, 36 que emiten luz láser 34,
- dos o más colimadores 41,42 para respectivamente cada fuente de rayos láser 35, 36,
- al menos uno o más acopladores de haz 26 o espejos/espejos semipermeables 10 para la fuente de rayos láser 35, 36,
- dos o más detectores 8 para registrar la radiación de fluorescencia 5 en dos o más rangos espectrales que se seleccionan mediante filtros de paso de banda 9,
- una unidad de control 17 para el posicionamiento xyz del dispositivo 6 en el agujero 2 practicado en el huevo 1, - una unidad de evaluación de determinación del sexo 19 conectada a la unidad de amplificación y detección 12 y a la unidad de evaluación de posicionamiento 18 conectada a la unidad de control 17.
En la configuración 3 según la figura 3 se pueden llevar a cabo las siguientes operaciones:
- la excitación se realiza con dos o más longitudes de onda. Dos o más láseres 35, 36 generan la radiación de excitación,
- todo el rango espectral o un rango espectral parcial de la fluorescencia generada por cada longitud de onda de excitación se registran con dos o más detectores/sensores 8 y filtros de paso de banda preestablecidos 9,
- las intensidades de señal registradas y eventualmente amplificadas I se evalúan matemáticamente para obtener el sexo. La evaluación matemática puede basarse en la evaluación de intensidades, proporciones, sumas o diferencias de intensidad, así como en el uso de métodos de clasificación supervisados, como el análisis discriminante, las máquinas de vectores de apoyo o las redes neuronales.
Según la figura 7, en la unidad de evaluación 19, en caso de uso de al menos dos fuentes de rayos láser 35, 36, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda medidas 51,52 se establecen con respecto a un rango espectral predeterminado de entre aproximadamente 500 cm-1 y aproximadamente 3500 cm-1 como las intensidades integrales Iish, II512 de las radiaciones de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como las intensidades integrales II521, II522 de las radiaciones de fluorescencia 52 de la sangre femenina en dependencia de la longitud de onda emitida de las fuentes de rayos láser 35, 36.
De este modo se pretende aumentar la fiabilidad para la determinación rápida del sexo a partir de las mediciones simultáneas de la radiación de fluorescencia de la sangre respectiva.
Finalmente, si se utiliza al menos una fuente de rayos láser 3 o varias fuentes de rayos láser 35, 36, es posible establecer en la unidad de evaluación 19 las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas 51, 52 con respecto a un rango espectral predeterminado respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina de forma combinada, por ejemplo, mediante una combinación lógica en la unidad de evaluación 19 para evaluar y determinar rápidamente el sexo de los huevos de ave 1.
Los rayos láser 34 producidos en los láseres 35, 36 pueden transmitirse por medio de espejos o por medio de un fibroscopio. Los rayos láser 34 se concentran con los colimadores 41,42.
Los rayos láser 34 se superponen con un acoplador de haz 26.
Los rayos láser 34 se transmiten al huevo 1 y se enfocan con una lente/objetivo 7 en un vaso sanguíneo extraembrionario 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 o en el corazón 25 del embrión 23.
La radiación de fluorescencia 5 se recoge con la misma lente que genera el foco láser/con el mismo objetivo 7 que genera el foco láser.
Se utiliza un divisor de haz 6 para separar la señal de fluorescencia 5 de la luz visible 13a de la fuente de radiación 13.
La luz en el rango espectral visible 13a se transmite a la cámara 14 y un filtro 15 separa los rayos restantes de la luz láser.
Se utiliza un divisor de haz 11 para separar la radiación de fluorescencia 5 que incide en los detectores 8. Los detectores 8, por general respectivamente un fotodiodo o un fotodiodo de avalancha o un fotomultiplicador, miden las intensidades de la radiación de fluorescencia 5.
Dos o más filtros de paso de banda predeterminados 9 seleccionan las gamas espectrales de la radiación de fluorescencia registradas con cada uno de los detectores 8.
Una unidad de detección 12 amplifica, filtra y mide las señales de los detectores 8 que se envían a la unidad de evaluación de determinación del sexo 19. Para determinar el sexo, las intensidades de señal Iish, II512,11521, II522 pueden evaluarse con uno de los siguientes procedimientos o con una combinación de los siguientes procedimientos:
- las intensidades se comparan con valores umbral,
- las relaciones de intensidad se comparan con valores umbral,
- las sumas o diferencias de intensidad se comparan con valores umbral,
- a los valores de intensidad se les aplican métodos de clasificación supervisados como, por ejemplo, el análisis discriminante, las máquinas de vectores de apoyo o las redes neuronales.
Aquí, las intensidades de señal también pueden normalizarse, por ejemplo, mediante una normalización de vectores o de áreas, y a continuación evaluarse matemáticamente con uno de los siguientes métodos o con una combinación de los siguientes procedimientos, a fin de obtener el sexo:
- las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- las relaciones entre las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- las sumas o diferencias de las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- a los valores de intensidad normalizados se les aplican métodos de clasificación supervisados como, por ejemplo, el análisis discriminante, las máquinas de vectores de apoyo o las redes neuronales.
Como procedimientos de clasificación pueden utilizarse los procedimientos SVM (Supporting Vector Machine), LDA (Análisis discriminante lineal), KNN (Clasificación Nearest-Neighbour) o ANN (Artificial Neural Networks). También pueden utilizarse otros procedimientos como, por ejemplo, los procedimientos/métodos no lineales o los dispositivos de apoyo o SIMCA. Los algoritmos clasifican los valores de intensidad,
- siendo necesario para ello un conjunto de intensidades de referencia con intensidades de referencia "masculinas" y con intensidades de referencia "femeninas" con asignación de género conocida. El algoritmo compara el conjunto de intensidades de referencia con otros conjuntos de intensidades de referencia de la clase de género y comprueba la similitud del conjunto de intensidades de referencia desconocido con los conjuntos de intensidades de referencia conocidos y almacenados,
- siendo el siguiente paso la emisión de los resultados de la determinación del sexo respectivo de los huevos de ave, descartándose el huevo 1 si la certeza mínima de huevo "macho" es igual o inferior al 45%. En caso contrario, hay un huevo hembra 1 que se sigue incubando.
En la figura 7 correspondiente se muestran las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda para el tercer dispositivo según la invención de acuerdo con la figura 3 para la determinación del sexo de los huevos de ave incubados 1 sobre la base de la radiación de fluorescencia 5 generada después de la excitación por medio de dos fuentes de rayos láser 35, 36 que emiten diferentes longitudes de onda con medición de las diferentes curvas de intensidad integrales 51,52 (respectivamente con una línea continua, una línea discontinua).
En la figura 4 correspondiente a la configuración 4 se muestra en una representación esquemática un cuarto dispositivo 33 para la determinación óptica del sexo in ovo de un huevo de ave fecundado e incubado 1 sobre la base de la radiación de retrodispersión, incluida la radiación de fluorescencia 5, comprendiendo el dispositivo 33
- una unidad de alojamiento de huevos 16, en la que se aloja el huevo 1,
- un dispositivo de evaluación de posición 17 conectado a la unidad de alojamiento de huevos 16,
- un dispositivo de radiación 13 con luz en la gama de longitud de onda visible o verde para irradiar al menos uno de los vasos sanguíneos extraembrionarios 22, un vaso sanguíneo embrionario 24 o el corazón 25 del embrión 23,
- un detector (por ejemplo, una cámara) 14 de luz visible o verde 13a para la detección de al menos un vaso sanguíneo extraembrionario 22, de un vaso sanguíneo embrionario 24 o del corazón 25 del embrión 23, estando el detector 14 conectado al dispositivo de evaluación de posicionamiento 18,
- un dispositivo 6 para la aplicación de luz láser 34 al huevo 1,
conectado a al menos
- una fuente láser 3 que emite luz láser 34,
- una unidad de control 17 para el posicionamiento xyz del dispositivo 6 en el agujero 2 practicado en el huevo 1,
- un espectrómetro 20 para la recepción de la radiación de fluorescencia 5 y la radiación de dispersión Raman superpuesta, disponiéndose un filtro de muesca/de paso corto 21 antes del espectrómetro 20, y
- una unidad de evaluación de determinación del sexo 19 conectada a la unidad de detección 12 y al dispositivo de evaluación de posicionamiento 18 conectado a la unidad de control 17.
Fundamentalmente, los dispositivos 30, 31, 32, 33 según la invención se diferencian en los componentes y piezas utilizados para la separación de la radiación de retrodispersión, incluida la radiación de fluorescencia 5 y también la radiación de dispersión Raman 50, especialmente también en el número de filtros de paso de banda 8, el número de detectores 8 y la unidad de evaluación 19, en función de la intensidad espectral o de la magnitud asignada, especialmente de la radiación de fluorescencia 5 que se evalúa en la unidad de evaluación 19, y de los elementos técnicos de programación contenidos en la unidad de evaluación 19 para la determinación del sexo prevista.
En la configuración 4 según la figura 4, con el registro de la radiación de fluorescencia 5, 51, 52 y de la radiación de dispersión Raman 50 se llevan a cabo las siguientes operaciones:
- la excitación se realiza con una longitud de onda (láser 3),
- todo el rango espectral o un rango espectral parcial de la fluorescencia y de la retrodispersión se registra y se aporta a un espectrómetro 20,
- del espectro registrado, que se compone de una superposición de fluorescencia y retrodispersión Raman inelástica, se extrae la información sobre el sexo. El espectro registrado en el rango espectral de unos 100 cm-1 - 4000 cm-1 o un rango espectral parcial del mismo se evalúan directamente o se realiza una normalización de los datos. A continuación se aplican métodos de clasificación supervisados como el análisis discriminante, las máquinas de vectores de apoyo o las redes neuronales, a fin de obtener la información sobre el sexo.
Teniendo en cuenta la radiación de dispersión Raman que también se produce y se registra, según la figura 8, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda 51,52 medidas pueden establecerse en la unidad de evaluación 19 para la evaluación con respecto a un rango espectral predeterminado como la intensidad integral Ii51 de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como la intensidad integral Ii52 de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina y las radiaciones de dispersión Raman 5051, 5052 respectivamente superpuestas a las radiaciones de fluorescencia 51, 52 para la determinación rápida del sexo de la sangre del ave.
El rectángulo 53 dibujado en la figura 8 representa el rango espectral seleccionado que se utiliza para la clasificación en el ejemplo indicado.
En la figura 8 correspondiente se muestran las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda para el cuarto dispositivo 33 según la invención para la determinación del sexo de los huevos de ave incubados 1 sobre la base de la radiación de fluorescencia generada 5 y de la radiación de dispersión Raman inelástica 50 después de la excitación con una fuente de rayos láser 3 para la medición de las dos intensidades superpuestas 51 y 50, 52 y 50.
La radiación de retrodispersión inelástica espectral registrada relacionada con el cuarto dispositivo 33 y representada en la figura 8 es variable en el rango espectral, pero siempre desplazada al rojo en comparación con la longitud de
onda de excitación del láser 3. Normalmente es un desplazamiento del número de onda de entre unos 500 cm-1 y 3500 cm-1. En el rango espectral indicado 53 (rectángulo), la autofluorescencia de la sangre es diferente para los embriones masculinos y para los embriones femeninos. La autofluorescencia de la sangre masculina presenta un desarrollo de intensidad 51 más alto que el desarrollo de intensidad 52 con respecto a la sangre femenina.
La radiación de dispersión Raman considerablemente más débil 5051, 5052 de los embriones masculinos y de los embriones femeninos se superpone respectivamente a las radiaciones de fluorescencia 51,52.
La evaluación espectroscópica se realiza en la unidad de evaluación 19 mediante algoritmos de clasificación matemática.
Para la realización de la clasificación espectral y de su emisión de resultados se indica un proceso de varios pasos: 1. paso de medición de los espectros del huevo 1 a examinar,
2. paso de pretratamiento de datos con
- una reducción del rango espectral de la reflexión a un rango espectral de entre 500 cm-1 y 4000 cm-1 o menor, - una normalización de los espectros a una intensidad integral por normalización de área o vectorial que eventualmente puede llevarse a cabo, pero que no es absolutamente necesaria,
3. paso de clasificación espectral con
la aplicación de una clasificación supervisada (en inglés, supervised). Como procedimientos de clasificación se pueden utilizar los procedimientos SVM (Supporting Vector Machine), LDA (Análisis discriminante lineal), KNN (Clasificación Nearest-Neighbour) o ANN (Artificial Neural Networks). También pueden utilizarse otros procedimientos como, por ejemplo, los procedimientos/métodos no lineales o los dispositivos de apoyo o SIMCA. El LDA clasifica varios rangos espectrales, es decir, los valores de intensidad de estos rangos,
en su caso con un paso de verificación, siendo para ello necesario un conjunto de espectros de referencia con espectros de referencia "masculinos" y con espectros de referencia "femeninos" con asignación de género conocida. El algoritmo compara el espectro con otros espectros de la clase de género y comprueba la similitud del espectro desconocido con los espectros de referencia conocidos almacenados.
Después del paso de emisión y visualización de los resultados para la determinación del sexo respectivo de los huevos de ave, el huevo 1 se descarta si la certeza mínima de huevo "macho" es igual o inferior al 45%. En caso contrario, hay un huevo hembra 1 que se sigue incubando.
En la figura 8a se representan las intensidades normalizadas de ambas radiaciones de fluorescencia 51,52. Mediante la normalización se puede ver que los espectros de la sangre masculina presentan un perfil espectral diferente en comparación con los espectros de la sangre femenina.
A continuación se explican detalladamente los ejemplos de realización llevados a cabo y los resultados:
Se practicó un orificio de 15 mm en el polo puntiagudo de 165 huevos de gallina el día 3,5 de incubación. El sexo de referencia de los huevos 1 se obtuvo mediante la posterior determinación PCR. La determinación PCR reveló que 80 huevos contenían un embrión masculino y 85 huevos contenían un embrión femenino. Se seleccionó un vaso sanguíneo extraembrionario 22 bajo iluminación LED verde (500 nm - 550 nm) por medio de una cámara 14 con gran aumento.
Un rayo láser CW de la fuente de rayos láser 3 (potencia: 200 mW; longitud de onda de excitación: 785 nm) se enfocó en un vaso sanguíneo extraembrionario 22 por medio del objetivo 7 (apertura numérica NA=0.4).
Los dispositivos antes citados 30, 31, 32, 33 funcionan según al menos uno de los procedimientos que se citan a continuación:
En los procedimientos según la invención para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados 1 se llevan a cabo los siguientes pasos:
- control del transcurso del tiempo de incubación hasta la formación de al menos un vaso sanguíneo detectable 22, 24 o del corazón 25 con sangre fluyente,
- creación de un agujero 2 en la cáscara calcárea 28 del huevo de ave 1 mediante una unidad de perforación, - búsqueda de los vasos sanguíneos 22, 24 o del corazón 25 que se forman en el huevo 1 por medio de un sistema de visión 13, 13a y de una iluminación coaxial o lateral con luz en la gama de longitudes de onda visible,
- posicionamiento de al menos un vaso sanguíneo 22, 24 o del corazón 25 en el foco láser de al menos una fuente de rayos láser 3; 35, 36 bien mediante el movimiento del huevo 1 o bien mediante el movimiento del objetivo 7 que genera el foco láser,
- irradiación del vaso sanguíneo 22, 24 o del corazón 25 con al menos una fuente de rayos láser 3, 35, 36 que emite una longitud de onda de excitación,
- registro de la radiación de retrodispersión 5, 50, 51, 52 del vaso sanguíneo irradiado 22, 24 o del corazón 25 por medio de al menos un detector 8 conectado a al menos una unidad de evaluación 19 conectada posteriormente a una unidad de amplificación y detección 12, siendo posible durante el registro, en caso de un movimiento del vaso sanguíneo seleccionado 22, 24 o del corazón 25 fuera del rayo láser 3b, llevar a cabo un seguimiento de los vasos sanguíneos 22, 24 o del corazón 25 o del objetivo/lente 7 que genera el foco láser.
A continuación se llevan a cabo, según la invención, los siguientes pasos:
- evaluación de la radiación de retrodispersión 5, 50, 51, 52, incluida la radiación de fluorescencia 5, 51, 52, en la unidad de evaluación 19 a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación de fluorescencia 51, 52 en un rango espectral desplazado al rojo con respecto a la longitud de onda de excitación, estando las propiedades específicas del género de la sangre masculina y de la sangre femenina contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación de fluorescencia registrada 51, 52 y presentando al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación de fluorescencia 51, 52 o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre masculina un valor diferente evaluable con respecto a al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas o a sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre femenina en los vasos sanguíneos 22, 24 o en el corazón 25,
- determinación del sexo del huevo de ave 1 en la unidad de evaluación 19 a partir de la diferencia de al menos uno de los valores de las magnitudes de intensidad de fluorescencia 51, 52 o de sus magnitudes asignadas y, a continuación, al menos
- una indicación del sexo del embrión 23 en el huevo de ave 1 determinado en la unidad de evaluación 19.
La luz en la gama de longitudes de onda visible prevista en el dispositivo de radiación 13 del sistema de visión para irradiar al menos un vaso sanguíneo 22, 24 o el corazón 25 puede mostrar preferiblemente una luz verde.
El valor diferente respectivamente evaluable de las magnitudes de intensidad puede referirse al menos a un valor límite/umbral predeterminado almacenado en la unidad de evaluación 19 y asignado a la magnitud de intensidad.
En la unidad de evaluación 19, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda 51, 52 pueden establecerse con respecto a un rango espectral predeterminado como la intensidad integral Ii51 de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como la intensidad integral Ii52 de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina.
En la unidad de evaluación 19, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda 51,52 también pueden establecerse con respecto a un rango espectral predeterminado como el máximo de intensidad 51 Máx de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como el máximo de intensidad 52Máx de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina.
Además, en la unidad de evaluación 19, las magnitudes de intensidad Id1 a Ids determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas 51, 52 pueden establecerse con respecto a rangos espectrales predeterminados y ordenados unos junto a otros como la intensidad integral de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como la intensidad integral de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina dentro de los rangos espectrales predeterminados en los que, por ejemplo, las diferencias de las respectivas magnitudes de intensidad ID151 a Id852 son mayores.
Si se utiliza una fuente de rayos láser 3, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de la curva de intensidad de fluorescencia/número de onda determinada 51, 52 pueden establecerse con respecto a un rango espectral predeterminado de forma combinada para la evaluación en la unidad de evaluación 19 respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina por medio de una combinación lógica.
En este caso, si se utilizan al menos dos fuentes de rayos láser 35, 36, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas 51,52 pueden establecerse con respecto a un rango espectral predeterminado en la unidad de evaluación 19 como las intensidades integrales Ie h , Ii512 de las radiaciones de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como las intensidades integrales II521, II522 de las radiaciones de fluorescencia 52 de la sangre femenina.
En caso de uso de al menos dos fuentes de rayos láser 35, 36, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas 51, 52 pueden establecerse de forma combinada con respecto a un rango espectral predeterminado para la evaluación en la unidad de evaluación 19 respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina.
En la unidad de evaluación 19, las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda 51, 52 pueden establecerse con respecto a un rango espectral predeterminado como la intensidad integral Ii51 de la radiación de fluorescencia 51 de la sangre masculina y como la intensidad integral Ii52 de la radiación de fluorescencia 52 de la sangre femenina y las radiaciones de dispersión Raman 5051, 5052 que solapan las radiaciones de fluorescencia 51, 52 para la evaluación por sí solas o en combinación con las demás magnitudes de intensidad y magnitudes asignadas determinadas, evaluándose conjuntamente, en caso de una combinación de las magnitudes de intensidad y de las magnitudes asignadas, la radiación de dispersión Raman y la radiación de fluorescencia mediante una combinación lógica o mediante hardware por medio de elementos lógicos.
Para la combinación lógica de las magnitudes de intensidad y de las magnitudes asignadas o de las magnitudes derivadas de las magnitudes de intensidad, la unidad de evaluación (19) puede presentar elementos técnicos de programación para la realización de al menos una combinación lógica y/o elementos de combinación lógica (AND y otros) configurados como hardware para realizar al menos una combinación lógica.
En caso de uso de una radiación láser pulsada de la fuente de rayos láser 3, la intensidad de fluorescencia generada puede medirse de forma resuelta en el tiempo y puede llevarse a cabo una determinación del sexo a partir de la constante de tiempo t de la curva de decrecimiento de la intensidad de fluorescencia resuelta en el tiempo, determinándose para la determinación del sexo una constante de tiempo diferente Tmacho, Thembra con Tmacho ^ Thembra respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina.
A continuación se indican finalmente ejemplos (ej.) de fiabilidad en el reconocimiento del género:
Evaluación ej. 1:
La intensidad de fluorescencia 51, 52 (5) se registró en el rango de entre 807 nm - 1000 nm (correspondiente a un desplazamiento de frecuencia en el rango de entre 350 cm-1 - 2750 cm-1), como se muestra en la figura 5.
El valor umbral adaptado SW para la intensidad a la que se pueden separar los sexos resultó ser de 1,06 * 10A7 conteos/s (señales de contador/segundo) en el detector 8. El 70% de los embriones masculinos tenían una intensidad por encima del valor umbral adaptado SW y el 81% de los embriones femeninos se encontraban por debajo del valor umbral adaptado SW, como se muestra en la figura 5a.
Evaluación ej. 2:
El rango de fluorescencia registrado se limitó a un rango de 970 nm - 1000 nm (correspondiente a un desplazamiento de frecuencia en el rango de 2430 cm-1 - 2750 cm-1), según la figura 5b y la figura 5c.
El valor umbral SW para la intensidad a la que se pueden separar los sexos se encontró en 8.25 * 10A5 conteos/s (señales de contador/segundo) en el detector 8. El 73% de los embriones masculinos tenían una intensidad superior a este valor umbral SW y el 84% de los embriones femeninos tenían una intensidad inferior a este valor umbral SW, según la figura 5c.
Evaluación ej. 3:
La radiación de fluorescencia 5 se registró, como se muestra en la figura 6, en ocho rangos espectrales separados D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8 respectivamente con una anchura de 300 cm-1 en el rango de entre 350 cm-1 y 2750 cm-1. Las intensidades registradas según la figura 6a se aportaron a un análisis discriminante lineal. El 75% de los embriones masculinos y el 95% de los embriones femeninos se clasificaron correctamente.
Evaluación ej. 4:
Como se muestra en la figura 6 y la figura 6a, la radiación de fluorescencia 5, 51, 52 se registró en ocho rangos espectrales separados D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8 respectivamente con una anchura de 300 cm-1 en el rango de frecuencia de entre 350 cm-1 y 2750 cm-1. Las intensidades registradas se normalizaron vectorialmente y se aportaron a un análisis discriminante, como se muestra en la figura 6b. El 86% de los embriones masculinos y el 91% de los embriones femeninos se clasificaron correctamente.
Evaluación ej. 5
La radiación de fluorescencia 5, 51, 52 y la radiación de dispersión Raman 50 se registraron y enviaron a un espectrómetro 20. Los espectros en el rango espectral de 600 cm-1 - 1500 cm-1 (rectángulo 53) se aportaron a un análisis discriminante lineal según la figura 8. El 94% de los embriones masculinos y el 88% de los embriones femeninos se clasificaron correctamente.
Evaluación ej. 6:
La radiación de fluorescencia 5, 51, 52 según la figura 8 y la radiación de dispersión Raman 50 se registraron y enviaron a un espectrómetro 20. Los espectros en el rango espectral de 600 cm-1 - 1500 cm-1 se normalizaron según la figura 8a y se aportaron a un análisis discriminante lineal. El 85% de los embriones masculinos y el 80% de los embriones femeninos se clasificaron correctamente.
Las ventajas de la determinación del sexo según la invención son:
- no se influye negativamente en la eclosión ni en el posterior desarrollo del polluelo, y
- una realización de la determinación del sexo con una gran precisión en tiempo real en una fase muy temprana y con la ayuda de una determinación sin contacto y sin toma de muestras.
Lista de referencias
1 Huevo
2 Agujero en la cáscara calcárea del huevo 28
3 Fuente de rayos láser
3b Luz láser aplicada al agujero 2 de la cáscara calcárea 28
4 Colimador
5 Radiación para la detección/Radiación de fluorescencia
6 Dispositivo para la aplicación de la radiación láser al huevo (divisor de haz)
7 Lente/Objetivo para el enfoque de la radiación láser y para la recogida de la radiación de fluorescencia
8 Detector/es
9 Filtro de detección/Filtro de paso de banda
10 Divisor de haz de detección/espejo
11 Dispositivo para la separación de la fluorescencia (divisor de haz)
12 Unidad de amplificación y detección
13 Fuente de luz/Dispositivo de radiación del sistema de visión VIS 13a, luz visible transmitida o dispersada
14 Detector/Cámara para la detección de luz 13a
15 Filtro de cámara
16 Unidad de posicionamiento xyz para el control de la posición de los huevos
16a Unidad de posicionamiento xyz para el control de la posición de la lente
17 Unidad de control
18 Unidad de evaluación de posicionamiento
19 Unidad de evaluación/Unidad de evaluación de determinación del sexo
20 Espectrómetro
21 Filtro de muesca/Filtro de paso corto
22 Vaso sanguíneo extraembrionario
23 Embrión
24 Vaso sanguíneo embrionario
25 Corazón
26 Acoplador de haz
28 Cáscara calcárea
30 Primer dispositivo
31 Segundo dispositivo
32 Tercer dispositivo
33 Cuarto dispositivo
34 Luz láser
35 Primera fuente de rayos láser
36 Segunda fuente de rayos láser
41 Primer colimador
42 Segundo colimador
50 Radiación de dispersión Raman
5051 Radiación de dispersión Raman de la sangre masculina
5052 Radiación de dispersión Raman de la sangre femenina
51 Desarrollo de intensidad de fluorescencia de la sangre masculina 52 Desarrollo de intensidad de fluorescencia de la sangre femenina 53 Rectángulo
1151, I|51 Intensidades integrales
I|511, I|512, 11521, 11522 Intensidades integrales
51 Máx, 52Máx Máximos de intensidad de las curvas de intensidad de fluorescencia D1 ... D8 Rangos espectrales proporcionales preestablecidos
T Constante de tiempo
7 Macho
? Hembra
Claims (23)
1. Procedimiento para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados (1) con los siguientes pasos:
- control del tiempo de incubación hasta la formación de al menos un vaso sanguíneo reconocible (22, 24) o del corazón (25) con sangre fluyente,
- creación de un agujero (2) en la cáscara calcárea (28) del huevo de ave (1) por medio de una unidad de perforación, - búsqueda de los vasos sanguíneos (22, 24) o del corazón (25) que se forman en el huevo (1) mediante un sistema de visión (13, 13a) y una iluminación coaxial o lateral con luz de la gama de longitudes de onda visible,
- posicionamiento de al menos un vaso sanguíneo (22, 24) o del corazón (25) en el foco láser de una fuente de rayos láser (3; 35, 36), ya sea mediante un movimiento del huevo (1) o mediante un movimiento de un objetivo (7) que genera el foco láser,
- irradiación del vaso sanguíneo (22, 24) o del corazón (25) con al menos una fuente de rayos láser (3, 35, 36) que emite una longitud de onda de excitación,
- registro de la radiación de retrodispersión (5, 50, 51,52) del vaso sanguíneo irradiado (22, 24) o del corazón (25) por medio de al menos un detector (8) conectado a al menos una unidad de evaluación (19) conectada posteriormente a una unidad de amplificación y de detección (12), pudiéndose realizar durante el registro un movimiento del vaso sanguíneo (22, 24) o del corazón (25) fuera del rayo láser (3b) mediante el seguimiento de los vasos sanguíneos (22, 24) o del corazón (25) o del objetivo (7),
caracterizado por los siguientes pasos:
- evaluación de la radiación de retrodispersión (5, 50, 51, 52), incluida la radiación de fluorescencia (5, 51, 52), en la unidad de evaluación (19) a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación de fluorescencia (51,52) en un rango espectral desplazado al rojo con respecto a la longitud de onda de excitación, estando las propiedades específicas del género de la sangre masculina y de la sangre femenina contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación de fluorescencia registrada (51, 52) y presentando al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación de fluorescencia (51, 52) o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre masculina un valor diferente evaluable con respecto a al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas o a sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre femenina en los vasos sanguíneos (22, 24) o en el corazón (25),
- determinación del sexo del huevo de ave (1) en la unidad de evaluación (19) a partir de la diferencia de al menos uno de los valores de las magnitudes de intensidad de fluorescencia (51, 52) o de sus magnitudes asignadas y, a continuación, al menos
- una indicación en el huevo de ave (1) del sexo del embrión (23) determinado en la unidad de evaluación (19).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que como luz en la gama de longitudes de onda visible, con la que está dotado un dispositivo de radiación (13) del sistema de visión para irradiar al menos un vaso sanguíneo (22, 24) o el corazón (25), se utiliza luz verde.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las intensidades de fluorescencia Iish, II512, II521, II522 se evalúan en la unidad de evaluación (19) con uno de los siguientes procedimientos o con una combinación de los siguientes procedimientos, a fin de obtener el sexo:
- las intensidades se comparan con valores umbral (SW),
- las relaciones de intensidad se comparan con valores umbral (SW),
- las sumas o diferencias de intensidad se comparan con valores umbral (SW),
- a los valores de intensidad se les aplican métodos de clasificación supervisados como, por ejemplo, el análisis discriminante, las máquinas de vectores de apoyo o las redes neuronales.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las intensidades de fluorescencia se normalizan, por ejemplo, mediante una normalización vectorial o de área, evaluándose las mismas a continuación matemáticamente en la unidad de evaluación (19) con uno de los siguientes métodos o con una combinación de los siguientes procedimientos, a fin de obtener el sexo:
- las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- las relaciones entre las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- las sumas o diferencias de las intensidades normalizadas se comparan con valores umbral,
- a los valores de intensidad normalizados se les aplican métodos de clasificación supervisados como, por ejemplo, el análisis discriminante, las máquinas de vectores de apoyo o las redes neuronales.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el valor diferente respectivamente evaluable de las magnitudes de intensidad se refiere al menos a un valor umbral medido (SW) o a un valor umbral predeterminado (SW) almacenado en la unidad de evaluación (19) y asignado a la magnitud de intensidad.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado que en la unidad de evaluación (19), las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas (51,52) se establecen con respecto a un rango espectral predeterminado como la intensidad integral Ii51 de la radiación de
fluorescencia (51) de la sangre masculina y como la intensidad integral I152 de la radiación de fluorescencia (52) de la sangre femenina.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que en la unidad de evaluación (19), las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas (51,52) se establecen con respecto a un rango espectral predeterminado como el máximo de intensidad 51Máx de la radiación de fluorescencia (51) de la sangre masculina y como el máximo de intensidad 52Máx de la radiación de fluorescencia (52) de la sangre femenina.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que en la unidad de evaluación (19), las magnitudes de intensidad Id1 a Ids determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas (51, 52) se establecen con respecto a varios rangos espectrales predeterminados (D1 a D8) dispuestos unos al lado de otros como la intensidad integral de la radiación de fluorescencia (51) de la sangre masculina y como la intensidad integral de la radiación de fluorescencia (52) de la sangre femenina dentro de los rangos espectrales predeterminados (D1 a D8).
9. Procedimiento según las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado por que, en caso de uso de una fuente de rayos láser (3), las magnitudes de intensidad determinadas a partir de la curva intensidad de fluorescencia/número de onda determinada (51, 52) se establecen para la evaluación en la unidad de evaluación (19) con respecto a un rango espectral predeterminado respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina mediante una combinación lógica de forma combinada por medio de una combinación lógica.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que, en caso de uso de al menos dos fuentes de rayos láser (35, 36), las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas (51,52) se establecen en la unidad de evaluación (19) con respecto a un rango espectral predeterminado como las intensidades integrales II 511, II 512 de las radiaciones de fluorescencia (51) de la sangre masculina y como las intensidades integrales 11521, II 522 de las radiaciones de fluorescencia (52) de la sangre femenina.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 2 a 10, caracterizado por que, en caso de uso de al menos dos fuentes de rayos láser (35, 36), las magnitudes de intensidad determinadas a partir de varias curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas (51,52) se establecen para la evaluación en la unidad de evaluación (19) con respecto a un rango espectral predeterminado respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina de forma combinada mediante una combinación lógica.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las curvas de intensidad de fluorescencia/número de onda determinadas (51,52) se establecen con respecto a un rango espectral predeterminado para la evaluación en la unidad de evaluación (19) como la intensidad integral Ii51 de la radiación de fluorescencia (51) de la sangre masculina y como la intensidad integral I152 de la radiación de fluorescencia (52) de la sangre femenina y las radiaciones de dispersión Raman (5051, 5052) que solapan respectivamente las radiaciones de fluorescencia (51,52) por sí solas o en combinación con las otras magnitudes de intensidad establecidas y las magnitudes asignadas, evaluándose, en caso de combinación de las magnitudes de intensidad y las magnitudes asignadas, la radiación de dispersión Raman y la radiación de fluorescencia de forma conjunta por medio de una combinación lógica.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que, en caso de uso de una radiación láser pulsada de la fuente de rayos láser (3), la intensidad de fluorescencia generada se mide de forma resuelta en el tiempo, llevándose a cabo una determinación del sexo a partir de las constantes de tiempo t de la curva de decrecimiento de la intensidad de fluorescencia resuelta en el tiempo, determinándose para la determinación del sexo una constante de tiempo diferente Tmacho, thembra con Tmacho t Thembra respectivamente para la sangre masculina y para la sangre femenina.
14. Dispositivo (30, 31,32, 33) para la determinación óptica del sexo in ovo de huevos de ave fecundados e incubados (1) sobre la base de la radiación de retrodispersión producida mediante la aplicación del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 13, comprendiendo el dispositivo (30)
- una unidad de alojamiento de huevos (16), en la que se aloja el huevo (1),
- un dispositivo de evaluación de posición (17) conectado a la unidad de alojamiento de huevos (16),
- un dispositivo de radiación (13) con luz en la gama de longitudes de onda visible para irradiar al menos un vaso sanguíneo (22, 24) o el corazón (25) del embrión (23),
- un detector (14) para luz visible o verde (13a) para la detección de al menos un vaso sanguíneo (22, 24) o del corazón (25) del embrión (23), estando el detector (14) conectado al dispositivo de evaluación de posicionamiento (18), - un dispositivo (6) para la aplicación de luz láser (34) al huevo (1),
que comprende al menos
a) al menos una fuente láser (3) que emite luz láser (34),
b) al menos un detector (8) para la recepción de la radiación de fluorescencia (5),
c) una unidad de control (17) para el posicionamiento xyz del dispositivo (6) en el agujero (2) practicado en el huevo (1),
d) una unidad de evaluación de determinación del sexo (19) conectada a la unidad de amplificación y detección (12) y a la unidad de evaluación de posicionamiento (18) conectada a la unidad de control (17),
caracterizado por que un dispositivo (11) para separar la radiación de fluorescencia (5) de la radiación de retrodispersión se dispone entre un colimador (4) para la concentración del haz del rayo láser (34) y el dispositivo para la aplicación de la luz láser (34) al huevo (1), colocándose entre el dispositivo de separación de rayo (11) y al menos un detector de fluorescencia (8) respectivamente un filtro de detección (9) correspondiente a la trayectoria de los rayos para la transmisión de la radiación de fluorescencia (5),
realizándose en la unidad de evaluación de determinación del sexo (19)
- una evaluación de la radiación de retrodispersión (5, 50, 51,52), incluida la radiación de fluorescencia (5, 51, 52), a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación de fluorescencia (51,52) en un rango espectral desplazado al rojo con respecto a la longitud de onda de excitación, estando las propiedades específicas del género de la sangre masculina y de la sangre femenina contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación de fluorescencia registrada (51, 52) y presentando al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación de fluorescencia (51,52) o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre masculina al menos un valor diferente evaluable con respecto a al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas o a sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre femenina en los vasos sanguíneos (22, 24) o en el corazón (25),
- una determinación del sexo del huevo de ave (1) en la unidad de evaluación (19) a partir de la diferencia de al menos uno de los valores de las magnitudes de intensidad de fluorescencia (51, 52) o de sus magnitudes asignadas y/o de una comparación con un valor umbral predeterminado (SW).
15. Dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado por que el rayo láser (34) producido en el láser (3) se transmite mediante espejos o mediante un fibroscopio, concentrándose el rayo láser (34) con un colimador (4).
16. Dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado por que el dispositivo (6) para la aplicación de la luz láser (34) al huevo (1) está equipado con dos o más detectores (8) para la recepción de la radiación de fluorescencia (5) en dos o más rangos espectrales que se seleccionan por medio de filtros de paso de banda predeterminados (9) asignados a la trayectoria de los rayos.
17. Dispositivo según la reivindicación 14 y 16, caracterizado por que el dispositivo (6) para la aplicación de la luz láser (34) al huevo (1) está conectado a
- dos o más fuentes láser (35, 36) que emiten luz láser (34), - dos o más colimadores (41, 42) para cada fuente de rayos láser (35, 36) respectivamente,
- al menos un acoplador de haz (26) con respectivamente uno para cada fuente de rayos láser (35, 36),
- dos o más detectores (8) para la recepción de la radiación de fluorescencia (5) en dos o más rangos espectrales que se seleccionan por medio de filtros de paso de banda (9) correspondientes a la trayectoria de los rayos.
18. Dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado por que el dispositivo (6) para la aplicación de la luz láser (34) al huevo (1) está conectado a un espectrómetro (20) para la recepción de la radiación de fluorescencia (5) y de la radiación de dispersión Raman superpuesta, disponiéndose un filtro de muesca (21) antes del espectrómetro (20).
19. Dispositivo según las reivindicaciones 14 a 18, caracterizado por que la luz en la gama de longitudes de onda visible con la que está dotado el dispositivo de radiación (13) del sistema de visión para irradiar al menos un vaso sanguíneo (22, 24) o el corazón (25), muestra luz verde.
20. Dispositivo según las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado por que el detector (14) para la luz (13a) en la gama de longitudes de onda visible o en la gama de longitudes de onda verde constituye una cámara.
21. Dispositivo según las reivindicaciones 14 a 20, caracterizado por que el dispositivo (11) para separar la radiación de fluorescencia (5, 51,52) de la radiación de retrodispersión es un divisor de haz.
22. Dispositivo según las reivindicaciones 14 a 21, caracterizado por que en la unidad de evaluación (19) se llevan a cabo
- una evaluación de la radiación de retrodispersión (5, 50, 51, 52), incluida la radiación de fluorescencia (5, 51,52), a partir de la intensidad espectral registrada de la radiación de fluorescencia (5, 51,52) en un rango espectral desplazado al rojo con respecto a la longitud de onda de excitación, estando las propiedades específicas del género de la sangre masculina y de la sangre femenina contenidas en la intensidad y en el perfil espectral de la radiación de fluorescencia registrada (5, 51, 52) y presentando al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas a partir de las intensidades espectrales medidas de la radiación de fluorescencia (5, 51, 52) o sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre masculina al menos un valor diferente evaluable con respecto a al menos una de las magnitudes de intensidad determinadas o a sus magnitudes asignadas con respecto a la sangre femenina en los vasos sanguíneos (22, 24) o en el corazón (25),
- una determinación del sexo del huevo de ave (1) a partir de la diferencia de al menos uno de los valores de las magnitudes de intensidad de fluorescencia (51, 52) o de sus magnitudes asignadas y/o de una comparación con un valor umbral predeterminado (SW) mediante elementos técnicos de programación y/o combinaciones lógicas opcionales presentes en la unidad de evaluación (19).
23. Dispositivo según las reivindicaciones 14 a 22, caracterizado por que, para la combinación lógica de las magnitudes de intensidad y de las magnitudes asignadas o de las magnitudes derivadas de las magnitudes de intensidad, la unidad de evaluación (19) presenta elementos técnicos de programación para la realización de al menos una combinación lógica y/o elementos de combinación lógica (AND) configurados como hardware para la realización de al menos una combinación lógica.
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