ES2929579T3 - Tratamiento terapéutico de enfermedades cutáneas con microorganismos cutáneos comensales recombinantes - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con métodos para tratar o prevenir condiciones anormales de la piel en un ser humano que lo necesite, que comprende administrar una composición de cultivo celular que comprende un cultivo vivo de bacterias que comprende al menos una cepa diseñada que produce un polipéptido recombinante para el tratamiento terapéutico de la condición anormal de la piel. . La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen, como principio activo, microorganismos modificados genéticamente que expresan polipéptidos terapéuticos recombinantes farmacológicamente activos no vacunagénicos para tratar o prevenir afecciones cutáneas anormales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento terapéutico de enfermedades cutáneas con microorganismos cutáneos comensales recombinantes

Campo

La presente invención se refiere, en líneas generales, al campo de la biología sintética, microbiología, química de proteínas, protección de la piel, transporte de proteínas extracelulares, transporte intracelular, y al tratamiento y a la prevención de enfermedades cutáneas. La divulgación se refiere, en líneas generales, a métodos y composiciones que emplean cepas modificadas por ingeniería de bacterias cutáneas comensales que producen polipéptidos recombinantes, para el tratamiento terapéutico y la prevención de enfermedades cutáneas, en particular empleando una cepa modificada por ingeniería de Staphylococcus epidermidis que produce filagrina recombinante.

Antecedentes

El advenimiento de los compuestos que se generan mediante la tecnología del ADN recombinante ha facilitado el desarrollo de una amplia gama de agentes terapéuticos que tienen el potencial para tratar una gran variedad de estados patológicos en animales, en particular, en seres humanos. Estos agentes son principalmente de naturaleza proteica.

La epidermis, el epitelio estratificado escamoso de la piel, consiste en múltiples subcapas y es una de las barreras más importantes del cuerpo contra el mundo exterior. El estrato córneo es la capa más externa de la epidermis y se desarrolla como resultado de la etapa final anucleada en la diferenciación de los queratinocitos de las células en las capas epidérmicas nucleadas. Aunque se reconoce que el estrato córneo es la barrera física más importante, las capas epidérmicas nucleadas también son importantes en la función de barrera (Proksch, Brandner et al. 2008). En conjunto, la barrera cutánea protege contra la gran pérdida de agua en una dirección (barrera interior-exterior) y contra la invasión de sustancias nocivas del medio ambiente (barrera exterior-interior) (Proksch, Brandner et al. 2008). El mantenimiento de la barrera también es importante para la proliferación equilibrada en la capa basal y la preservación del gradiente de iones de calcio y, por lo tanto, la diferenciación epidérmica adecuada (Lee, Jeong et al. 2006).

Obras recientes sugieren que los microorganismos comensales de la piel son esenciales para mantener una piel sana y mantener la barrera cutánea. Los microorganismos comensales son aquellos que son beneficiosos para su sujeto, por ejemplo, hospedadores humanos. Los estudios también sugieren que ciertas enfermedades cutáneas (como el acné vulgar y la dermatitis atópica) pueden estar asociadas con alteraciones de la microflora normal (Lin, Wang et al.

2007). Por lo tanto, la idea de que la microflora cutánea puede modularse usando comensales cutáneos específicos para promover la salud o inhibir la enfermedad ha recibido cierta atención (Muizzuddin, Maher et al. 2012). Muchas bacterias comensales cutáneas no se consideran patógenas, por lo tanto, estas bacterias pueden potencialmente usarse tópicamente si tienen valor terapéutico (Nakatsuji y Gallo 2014). Hasta ahora, la cantidad limitada de investigaciones en esta área sugiere que las bacterias probióticas convencionales pueden ser de gran valor cuando se usan en la piel. Por ejemplo, se ha demostrado que la aplicación tópica de un lisado de Bifidobacterium longum induce una mejoría clínica de la "piel reactiva" (Gueniche, Bastien et al. 2010). Esta es una piel que es más sensible a los cambios físicos, como la temperatura atmosférica, y a los cambios químicos, como los que se ven con los productos de aplicación tópica (Gueniche, Bastien et al. 2010). Se demostró que la aplicación del lisado de B. longum en la piel de los voluntarios disminuía la sensibilidad y disminuía la pérdida de agua transepidérmica (TEWL) después de retirar la cinta. De forma adicional, se demostró que la aplicación del lisado a la piel ex-vivo disminuye los signos de inflamación como la vasodilatación, edema y liberación de TNF-a (Gueniche, Bastien et al. 2010, Nalcatsuji y Gallo 2014, Volz, Skabytska et al. 2014). También se ha demostrado que la aplicación tópica de Lactobacillus plantarum mejora la reparación de tejidos en un modelo de ratón quemado y previene la infección en úlceras crónicas en las piernas y quemaduras en seres humanos (Peral, Martinez et al. 2009, Peral, Rachid et al. 2010, Brachkova, Marques et al. 2011).

Otro estado de la técnica es Oliver Pusch et al. (AIDS, vol. 20, n.° 15, 1. Octubre de 2006, páginas 1917-1922) que divulga un microbicida anti-VIH modificado por ingeniería en bacterias comensales: secreción de inhibidores de la fusión del VIH-1 por los lactobacilos; Tschachler E. et al. (The LA, the Lancet Publishing Group, Reino Unido, vol. 348, n.° 9028, 7. Septiembre de 1996, páginas 659-663) que divulga enfermedades cutáneas relacionadas con el VIH; Teruraki Nakatsuji et al. The Journal of Investigative Dermatology: Official Journal of the Society for Investigative Dermatology and the European Society for Dermatological Research, vol. 134, n.° 1, 1 de enero de 2014, páginas 11­ 14) que divulga una terapia dermatológica mediante la aplicación tópica de bacterias no patógenas; El documento US 2013/0018000 A1 que divulga polipéptidos recombinantes que incluyen (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina y (b) una secuencia señal de importación celular y métodos para tratar o prevenir enfermedades cutáneas; El documento WO 2014/0259938 A1 que divulga una composición tópica que comprende bacterias transformadas que expresan un compuesto de interés; o el documento WO 2011/150127 ^a 2 que divulga métodos para el suministro de biomoléculas a células eucariotas.

Sin embargo, actualmente existen una serie de limitaciones en el tratamiento de la piel. Muchos tratamientos, como corticosteroides tópicos o productos biológicos caros, no tratan los problemas subyacentes de proteína intrínseca deficiente en la epidermis o desequilibrios en la diversidad microbiana en la piel. Si bien las proteínas recombinantes representan un grupo prometedor de agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades cutáneas, varios problemas acompañan su uso en el contexto. Los métodos tradicionales emplean el uso de la purificación de proteínas recombinantes que se extraen de sistemas bacterianos, se purifican, concentran e incorporan en un sistema de suministro. La purificación de proteínas recombinantes es a menudo un método muy costoso para obtener proteínas. Asimismo, una serie de cuestiones acompañan esto, incluyendo la degradación proteolítica, suministro ineficaz y la necesidad de repetir la aplicación en el tiempo para lograr el efecto terapéutico.

Nuestro método, por el contrario, aborda estos problemas al permitir que las bacterias colonicen la piel y secreten continuamente polipéptidos terapéuticos beneficiosos para la piel. Este enfoque reduce la necesidad de múltiples aplicaciones tópicas mediante la creación de un sistema de suministro sostenible para proteínas terapéuticas.

La mayoría de los microorganismos utilizados hasta ahora para la producción de proteínas recombinantes no pueden administrarse de manera segura a seres humanos y a animales, al no ser componentes habituales de la flora fisiológica o estar desprovistos de cualquier riesgo patógeno. Esto es particularmente cierto para Escherichia coli, que se considera patógena en muchos casos. Sin embargo, en el presente caso, los inventores describen métodos de producción de proteínas recombinantes usando microorganismos que pueden ser administrados de forma segura a seres humanos y a animales, particularmente Staphylococcus epidermidis.

Otras especies, ya utilizadas para la producción de proteínas recombinantes, también pueden utilizarse siempre que cumplan los requisitos de no patogenicidad y capacidad de colonización de mucosas humanas o animales. Por ejemplo, se ha utilizado ampliamente Bacillus subtilis como vector de clonación para producir un gran número de proteínas eucariotas en vista de sus reconocidas propiedades ventajosas (Simonen y Palva 1993). La presente invención permite por lo tanto, seleccionar y adaptar adecuadamente el microorganismo, el polipéptido que se va a expresar y los vectores de expresión, utilizados previamente para la producción en laboratorio o entorno industrial, para tratar enfermedades cutáneas específicas (véase la Figura 1). La presente invención se refiere, por lo tanto, al uso terapéutico de dichos microorganismos modificados por ingeniería y composiciones que los contienen, satisfaciendo así una necesidad sentida desde hace mucho tiempo en el área de suministro terapéutico de fármacos para tratar afecciones cutáneas en seres humanos.

La dermatitis atópica (DA), que también se conoce como eccema, es una enfermedad cutánea inflamatoria crónica que generalmente involucra un defecto en el estrato córneo de la piel, que es la capa protectora que comprende la parte más externa de la piel. Este defecto es causado por una confluencia de factores genéticos, factores ambientales e inmunológicos y se asocia con un crecimiento excesivo de Staphylococcus aureus. La base genética de la DA parece implicar un defecto en el gen de la filagrina (FLG), visto en aproximadamente el 50 % de los pacientes con DA (McAleer 2013). La prevalencia de la dermatitis atópica está aumentando y afecta al 0,1-1 % de la población mundial, con tasas más altas en los países desarrollados. La DA es más común en niños, afectando hasta al 20 % de los niños (McAleer 2013). De estos niños, el 25 % nunca se recupera y continúa sufriendo dermatitis atópica hasta la edad adulta. En muchos casos, la DA puede conducir a afecciones alérgicas más graves, incluyendo asma, a través de un proceso conocido como la "marcha atópica".

La patogénesis de la DA no se comprende por completo, pero los defectos en la expresión de filagrina se atribuyen a la mayoría de los casos de dermatitis atópica y la patogénensis se relaciona con una respuesta inmunitaria. Se ha demostrado que la DA puede ser causada por una combinación de sequedad cutánea, piel que es propensa a picar más que las infecciones promedio en personas causadas por bacterias, virus, hongos, etc., y factores emocionales y ambientales. La filagrina está codificada por el gen FLG en el complejo de diferenciación epidérmica 1q21. La filagrina es una proteína producida por la diferenciación de queratinocitos y funciona para agregar filamentos de queratina en un citoesqueleto que, en combinación con otros componentes, comprende la envoltura celular cornificada (Brown & McLean 2012). Las mutaciones de pérdida de función de la filagrina (R501X y 2282del4) causan ictiosis vulgar, el trastorno hereditario más común de la queratinización. Las mismas mutaciones también están asociadas con otras afecciones cutáneas y alérgicas, incluida la DA, dermatitis de contacto irritante, asma y alergia alimentaria. Varios estudios han demostrado que el aumento de la filagrina en la piel ayuda a mitigar el fenotipo de DA (por ejemplo, Stout et al. 2014, Otsuka et al. 2014).

Actualmente, las principales terapias para la DA incluyen corticosteroides tópicos y antibióticos, ambos tienen una eficacia limitada en los casos más graves de DA. Los principales inconvenientes de los antibióticos incluyen problemas de resistencia a los antibióticos y desregulación de la ecología del microbioma. El microbioma es el conjunto de microorganismos presentes en un ambiente particular. El microbioma mencionado en el presente documento, es la totalidad de los microorganismos presentes en el órgano humano más grande, la piel. Los corticosteroides tópicos alivian los síntomas de los pacientes con DA leve, pero no abordan las necesidades de las personas con enfermedades crónicas o graves. Si bien se están desarrollando algunas terapias dirigidas para el tratamiento de la DA, el panorama competitivo en este mercado se caracteriza por una necesidad mayoritariamente insatisfecha de una terapia dirigida eficaz para la DA. Una terapia biológica, dupilumab, es un anticuerpo monoclonal anti-receptor IL4/13 que se encuentra en ensayo clínico de Fase II para AD, que está siendo desarrollado por Regeneron Pharmaceuticals y Sanofi. Este fármaco ha demostrado una eficacia prometedora y se espera que llegue a los mercados en los próximos cinco años. Se están desarrollando otras terapias biológicas similares para la inmunomodulación de la DA. Sin embargo, se espera que estos medicamentos cuesten decenas de miles de dólares para los consumidores debido a los altos costes de producción e investigación y desarrollo, y es posible que las compañías de seguros no cubran necesariamente estos costes. Si bien estos fármacos atenúan la respuesta inmunitaria, no tienen efectos directos sobre el restablecimiento de la barrera cutánea y la normalización de la ecología microbiana para prevenir infecciones por S. aureus. Por tanto, se requieren nuevas composiciones y métodos para el tratamiento eficaz y la prevención de afecciones anormales cutáneas tales como AD, mientras que se minimizan los efectos secundarios no deseados.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa un diagrama de flujo de la presente invención, que demuestra la creación de una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produce un polipéptido recombinante para el tratamiento terapéutico o la prevención de una afección anormal cutánea.

La Figura 2 representa un diseño de vector del plásmido y el vector lanzadera pBT-2. El vector pBT-2 es un ejemplo de vectores lanzadera alternativos que se pueden usar para la clonación en E. coli y expresión en Staphylococcus.

La Figura 3 representa un diseño de vector de una versión modificada del vector lanzadera pBT-2 que incluye el inserto del gen FLG (filagrina), descrito en la Figura 4. Esta construcción es un ejemplo de construcciones alternativas para la expresión de filagrina en S. epidermidis y se ha descrito previamente como pAZT-01.

La Figura 4 es un mapa detallado del inserto del gen FLG que se clonó en el plásmido pBT-2, mostrado anteriormente en la Figura 2, y se puede clonar en varios vectores para la expresión en Staphylococcus. Este inserto incluye represor de xilosa (xylR), operador de xilosa (xylO), gen de la xilosa isomerasa (xylA) incluyendo el elemento sensible al catabolito (CRE) que actúa en cis, la señal de exportación Sec (vía de secreción), gen que codifica la filagrina (FLG), y el péptido de penetración celular.

La Figura 5 representa un diseño vectorial del plásmido pJB38 (Cheung, AL., et al. (2004)). Los sitios de restricción están integrados en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector. Insertado en el MCS del vector hay un vector de expresión de filagrina con un promotor inducible por xilosa, sitio de unión al ribosoma, señal de exportación (por ejemplo, señal de exportación SecA), repeticiones parciales de FLG (filagrina) que flanquean el monómero de filagrina y una señal de penetración celular. El inserto de pAZT-01 se construyó y clonó en pJB38 por Bio Basic, Inc, (Markham, ON, Canadá).

La Figura 6 representa la transformación de ATCC12228 de S. epidermidis con pCM11 que contiene una plataforma de expresión de GFP (proteína fluorescente verde) verificada por microscopía de fluorescencia. El plásmido pCM11 (que contiene una plataforma de expresión de GFP) se utilizó para transformar células DH5a de E. coli utilizando un método de choque térmico. A continuación, se usó el plásmido pCM11 aislado de DH5a de E. coli para la transformación de DC10B de E. coli mediante electroporación. A continuación, se aisló el plásmido pCM11 de DC10B de E. coli y se usó para transformar S. epidermidis mediante electroporación. Como control, la Figura 6A demuestra la fluorescencia inherente de S. epidermidis, lo que confirma que la cepa tiene una fluorescencia inherente mínima o nula por sí misma antes de la transformación con un plásmido que expresa GFP. En la figura 6B, S. epidermidis se transforma con pCM11 que contiene el inserto de GFP, que a su vez se expresa, como lo demuestra la fluorescencia. Estas imágenes confirman la transformación de S. epidermidis y la expresión de pCM11 dentro de esa cepa, como lo indica la fluorescencia GFP.

La Figura 7 representa ATCC12228 de S. epidermidis transformado con pCM11 que contiene el inserto de GFP (proteína fluorescente verde), que a su vez se aplicó sobre la piel dorsal de los ratones durante tres días. A continuación, se tomaron secciones de la piel post mortem para microscopía óptica (Figura 7A y 7B). Las secciones que se muestran en este caso se tiñeron con tinción de verde malaquita y se visualizaron a 200x (Figura 7A) y una mayor expansión (Figura 7B). Esta figura demuestra la colonización de S. epidermidis en la piel del ratón después de tres días. (Staph epi se refiere a Staphylococcus epidermidis).

La Figura 8 representa ATCC 12228 de S. epidermidis transformado con pCM11 que contiene el inserto de GFP (proteína fluorescente verde), que a su vez se aplicó sobre la piel dorsal de los ratones durante tres días. A continuación, se tomaron secciones de la piel post mortem para microscopía óptica (Figuras 8A y 8B). La Figura 8A muestra la fluorescencia de GFP que indica no solo que S. epidermidis coloniza la piel después de tres días, sino también que esa expresión de ^g F^p se mantiene en ese momento. La Figura 8A muestra la fluorescencia de GFP, mientras que la Figura 8B muestra una sección de piel teñida con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) y un anticuerpo monoclonal anti-GFP. La Figura 8C demuestra una sección de la piel visualizada mediante microscopía de dos fotones, demostrando el alcance de colonización de S. epidermidis y expresión de GFP, como lo indica la fluorescencia.

Sumario

La invención se refiere a las realizaciones como se definen en las reivindicaciones. Otras realizaciones descritas son ilustrativas.

En particular, la invención se refiere a una composición de cultivo celular o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención del eccema en un ser humano que lo necesite, en donde dicha composición de cultivo celular comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde dicha cepa bacteriana modificada por ingeniería produce una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido recombinante que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina, (b) una señal de secreción, y (c) un péptido de penetración celular, en donde la composición farmacéutica comprende (I) dicha composición de cultivo celular y (II) un portador farmacéuticamente aceptable.

La divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen, como principio activo, microorganismos modificados por ingeniería que expresan polipéptidos terapéuticos recombinantes farmacológicamente activos no vacunogénicos (es decir, proteínas, péptidos o aminoácidos) para tratar afecciones cutáneas. Dichos polipéptidos no vacunogénicos, a diferencia de los empleados en las vacunas, son aquellos que generalmente no provocan una respuesta inmunitaria y sin embargo son terapéuticamente eficaces.

La presente divulgación se refiere a un método para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas en un paciente (sujeto humano o animal) que lo necesite, comprendiendo el método administrar a dicho paciente una composición de cultivo celular que comprende una cepa bacteriana seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. epidermidis), Lactobacillus (por ejemplo, L. acidophilus), Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde la composición comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produce una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido recombinante para el tratamiento terapéutico o la prevención de la afección anormal cutánea.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde dicha composición comprende una cepa bacteriana que contiene ADN diana humano recombinado con ADN bacteriano para producir una cepa bacteriana modificada por ingeniería.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la composición comprende una cepa modificada por ingeniería de Staphylococcus epidermidis.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la composición de cultivo celular es una composición de cultivo de células vivas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde dicha afección cutánea es eccema.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde dicho eccema es un eccema leve.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde dicho eccema es un eccema moderado.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde dicho eccema es un eccema grave.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde dicha afección cutánea es eccema de manos.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas en un paciente (sujeto humano o animal) que lo necesite, comprendiendo el método administrar a dicho paciente una composición de cultivo celular que comprende una cepa bacteriana seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. epidermidis), Lactobacillus (por ejemplo, L. acidophilus), Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde la composición de cultivo celular comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produce una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido recombinante que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina, (b) una señal de secreción, y (c) un péptido de penetración celular para el tratamiento terapéutico o la prevención de la afección anormal cutánea.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la composición de cultivo celular comprende Staphylococcus epidermidis.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la composición de cultivo celular es una composición de cultivo vivo.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de filagrina comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 o SEQ ID NO 17, y combinaciones de las mismas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina comprende SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 75 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 80 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 85 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 90 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 95 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 75 % de homología, o un 80 % de homología, o un 85 % de homología, o un 90 % de homología, o un 95 % de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 o SEQ ID NO 17.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método en donde la afección cutánea es el eccema.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas en un paciente (sujeto humano o animal) que lo necesite, que comprende (a) una composición de cultivo celular que comprende una cepa bacteriana seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. epidermidis), Lactobacillus (por ejemplo, L. acidophilus), Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde la composición de cultivo celular comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produce una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido recombinante para el tratamiento terapéutico o la prevención de afecciones anormales cutáneas y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde dicha composición comprende una cepa bacteriana que contiene ADN diana humano recombinado con ADN bacteriano.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde dicha composición comprende una cepa modificada por ingeniería de Staphylococcus epidermidis.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde dicha composición comprende una composición de cultivo de células vivas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde dicha composición comprende del 0 % de agua a no más de aproximadamente el 90 % de agua.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un portador farmacéuticamente aceptable que se selecciona de una solución acuosa, una emulsión, una crema, una loción, un gel o una pomada.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas en un paciente (sujeto humano o animal) que lo necesite, que comprende (I) una composición de cultivo celular que comprende una cepa bacteriana seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. epidermidis), Lactobacillus (por ejemplo, L. acidophilus), Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde la composición de cultivo celular comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produce una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido recombinante que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina, (b) una señal de secreción, y (c) un péptido de penetración celular y (II) un portador farmacéuticamente aceptable para el tratamiento terapéutico o la prevención de la afección anormal cutánea.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la composición de cultivo celular comprende una cepa bacteriana que contiene ADN diana humano recombinado con ADN bacteriano.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la composición de cultivo celular comprende Staphylococcus epidermidis.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la composición de cultivo celular es una composición de cultivo de células vivas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de filagrina comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 o SEQ ID NO 17, y combinaciones de las mismas.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina comprende SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 75 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 80 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 85 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 90 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 95 % de homología con SEQ ID NO 1.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 75 % de homología, o un 80 % de homología, o un 85 % de homología, o un 90 % de homología, o un 95 % de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 o SEQ ID NO 17.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde la composición comprende del 0 % de agua a no más de aproximadamente el 90 % de agua.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en donde el portador farmacéuticamente aceptable es una solución acuosa, una emulsión, una crema, una loción, un gel o una pomada.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de una composición de cultivo celular para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas en un paciente (sujeto humano o animal) que lo necesite, comprendiendo dicha composición de cultivo celular una cepa bacteriana seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. epidermidis), Lactobacillus (por ejemplo, L. acidophilus), Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde la composición de cultivo celular comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produce una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido recombinante para tratar o prevenir la afección anormal cutánea.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de una composición de cultivo celular para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas en un paciente (sujeto humano o animal) que lo necesite, comprendiendo dicha composición de cultivo celular una cepa bacteriana seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (por ejemplo, s. epidermidis), Lactobacillus (por ejemplo, L. acidophilus), Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde la composición de cultivo celular comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produce una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido recombinante que comprende (a) una secuencia de aminoácidos de filagrina, (b) una señal de secreción, y (c) un péptido de penetración celular para el tratamiento terapéutico o la prevención de la afección anormal cutánea.

Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, los siguientes términos tienen los siguientes significados a menos que se indique expresamente lo contrario:

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "afección anormal cutánea" se refiere a un estado o afección de la piel que generalmente es indeseable o perjudicial en comparación con el estado normal o básico de la piel humana. Ejemplos de afecciones anormales cutáneas incluyen: psoriasis, acné, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, hiperqueratosis epidermolítica, dermatitis seborreica, eccema, sequedad cutánea, alergia, erupciones, piel irritada por los rayos UV, piel irritada por detergentes (incluida la irritación causada por enzimas y moléculas utilizadas en detergentes y laurilsulfato de sodio), adelgazamiento de la piel (por ejemplo, piel de ancianos y niños), penfigoide ampolloso, pénfigo vulgar, impétigo, vitíligo, calvicie e hirsutismo.

Como se utiliza en el presente documento, los términos "paciente" o "sujeto", se refieren a un ser humano o animal (en el caso de un animal, más normalmente un mamífero, como los mamíferos domesticados, o animales como las aves de corral y los peces y otros mariscos o criaturas alimenticias de agua dulce), que se sometería a los tratamientos y composiciones de la presente invención. Se consideraría que tal paciente o sujeto necesita las composiciones farmacéuticas de la presente invención o los métodos de tratamiento, prevención o reducción del riesgo de una afección anormal cutánea.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto farmacéutico activo, o una combinación de compuestos, o una cantidad de compuesto farmacéutico activo suministrado por una cepa o cepas bacterianas modificadas por ingeniería, por ejemplo, un agente o agentes para el tratamiento cutáneo, cuando se administra(n) en solitario o en combinación, para tratar, prevenir o reducir el riesgo de un estado de enfermedad o afección, por ejemplo, una afección anormal cutánea. El término también se refiere a una cantidad de una composición farmacéutica que contiene un compuesto activo o una combinación de compuestos o una cepa o cepas bacterianas modificadas por ingeniería que suministra un compuesto farmacéutico activo. Por ejemplo, una cantidad eficaz se refiere a una cantidad del compuesto o una cantidad del compuesto suministrado por una cepa o cepas bacterianas modificadas por ingeniería presentes en una formulación administrada a un paciente receptor o sujeto suficiente para provocar actividad biológica, por ejemplo, actividad para tratar o prevenir una afección anormal cutánea.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos activos, materiales, cepa o cepas bacterianas modificadas por ingeniería, composiciones, portadores y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen criterio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin producir demasiada toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otros problemas o complicaciones, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" se refiere a proporcionar una intervención terapéutica para curar o mejorar una afección anormal cutánea.

Como se utiliza en el presente documento, el término "que previene", se refiere a detener por completo o casi por completo la ocurrencia de una afección anormal cutánea, por ejemplo, cuando el paciente o sujeto está predispuesto a una afección anormal cutánea o corre el riesgo de contraer una afección anormal cutánea. La prevención también puede incluir la inhibición, es decir, la detención del desarrollo, de una afección anormal cutánea.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "reducir el riesgo de", se refiere a reducir la posibilidad o probabilidad de que ocurra una afección anormal cutánea, por ejemplo, cuando el paciente o sujeto está predispuesto a una afección anormal cutánea o corre el riesgo de contraer una afección anormal cutánea.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cepa bacteriana modificada por ingeniería", se refiere a una cepa de bacterias que ha sido "modificada genéticamente" o "modificada por ingeniería" mediante la introducción de ADN preparado fuera del organismo en la cepa bacteriana. Por ejemplo, la introducción de ADN plasmídico que contiene nuevos genes en bacterias permitirá que las bacterias expresen esos genes. Como alternativa, el ADN que contiene nuevos genes puede introducirse en la bacteria y a continuación integrarse en el genoma de la bacteria, donde la bacteria expresará esos genes.

Como se utiliza en el presente documento, los términos "portadores", "sistema portador" o "vehículos" se refieren a sustancias compatibles que son adecuadas para suministrar, contener o "llevar" un principio activo farmacéutico u otros materiales para la administración en una composición aplicada tópicamente a un paciente o sujeto. Los portadores útiles en el presente documento deben ser farmacéuticamente aceptables. Los portadores y vehículos útiles en el presente documento incluyen cualquiera de los materiales conocidos en la técnica, que no son tóxicos y no interactúan con otros componentes de la formulación en la que están contenidos de manera nociva. El término "acuoso" se refiere a una formulación que contiene agua o que se convierte en agua después de la aplicación a la piel o tejido mucoso. Otros ejemplos de "portadores" incluyen agua, alcoholes inferiores, alcoholes superiores, alcoholes polihídricos, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, aceites de hidrocarburos, grasas y aceites, ceras, ácidos grasos, aceites de silicona, tensioactivos no iónicos, tensioactivos iónicos, tensioactivos de silicona y mezclas a base de agua y mezclas a base de emulsión de tales portadores.

Como se utiliza en el presente documento, los términos "polipéptido" o "proteína" se refieren a moléculas biológicas o macromoléculas compuestas de restos de aminoácidos que se unen en una cadena. La definición de polipéptidos utilizada en el presente documento pretende abarcar proteínas (generalmente de mayor peso molecular) compuestas por una o más cadenas largas de restos de aminoácidos y péptidos pequeños (generalmente de menor peso molecular) de unos pocos aminoácidos. En otras realizaciones, un solo aminoácido, aunque técnicamente no es un polipéptido, también se considera dentro del alcance de la invención.

Descripción detallada

La presente invención proporciona bacterias colonizadoras de la piel que se alteran genéticamente para expresar polipéptidos terapéuticos recombinantes para el tratamiento o prevención de enfermedades cutáneas (Figura 1). El uso de bacterias productoras de proteínas modificadas genéticamente por ingeniería tiene varias ventajas sobre el método de la técnica anterior para tratar enfermedades cutáneas. Las proteínas terapéuticas pueden tratar la causa subyacente de los defectos que conducen a la afección cutánea. Además, las bacterias pueden autorreplicarse mientras retienen el gen insertado para producir continuamente la proteína terapéutica.

La presente invención proporciona bacterias colonizadoras de la piel, tal como, por ejemplo, Staphylococcus epidermidis, que se alteran genéticamente para expresar filagrina humana. El uso de bacterias productoras de filagrina modificadas genéticamente por ingeniería tiene varias ventajas sobre el uso de suplementación de filagrina. En primer lugar, las bacterias pueden autorreplicarse conservando el gen de la filagrina insertado. En segundo lugar, S. epidermidis normalmente está presente en la piel y se ha demostrado que inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus, una especie bacteriana del mismo género que domina la flora cutánea en los brotes de DA.

1. Cepas bacterianas

Composiciones de cultivo celular

Una amplia gama de bacterias es adecuada para su uso en la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, bacterias no patógenas y comensales. Las bacterias adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. epidermidis), Lactobacillus (por ejemplo, L. acidophilus), Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus.

Ciertas realizaciones implican el uso de bacterias Staphylococcus epidermidis. La cepa de S. epidermidis que se va a utilizar es incapaz de producir biopelículas. Un ejemplo de esto es la cepa ATCC12228 de S. epidermidis.

Sin embargo, también se pueden usar otras especies relacionadas o similares que se encuentran en la piel.

2. Filagrina y gen de filagrina

Un gen útil seleccionado en una realización para esta invención es un gen de mamífero que codifica la filagrina (FLG). La filagrina es una proteína producida por la diferenciación de queratinocitos y funciona para agregar filamentos de queratina en un citoesqueleto que, en combinación con otros componentes, comprende la envoltura celular cornificada. FLG es un gen grande ubicado en el cromosoma 1q21 y produce profilagrina, una poliproteína insoluble que se proteoliza para liberar monómeros de filagrina funcionales (Armengot-Carbo et al. 2014). El gen de esta invención puede ser de cualquier mamífero. Ejemplos no limitantes incluyen ratón, rata, conejo, cabra, oveja, caballo, vaca, perro, primate, o secuencia génica humana. En realizaciones preferidas, la secuencia génica es una secuencia génica humana. Los ejemplos no limitantes de proteínas de filagrina se exponen en la Tabla 1 y las secuencias se describen adicionalmente en las SEQ ID correspondientes.

Tabla 1.

Ejemplos de secuencias de proteínas de filagrina

Secuencia ^{N.° de registro de}

_GenBank SEQ ID NO.

Filagrina, Homo sapiens NM 002016 1

Filagrina, Homo sapiens NP 002007 2

Filagrina, Homo sapiens AAA52454 3

Filagrina, Homo sapiens CAI19595 4

Filagrina, Homo sapiens P20930 5

Filagrina, Mus musculus AAM23016 6

Filagrina, Mus musculus AAA75559 7

Filagrina, Mus musculus AAA37626 8

Filagrina, Mus musculus AAA37625 9

Filagrina, Mus musculus XP 485270 10

Filagrina, Mus musculus P11088 11

Filagrina, Mus musculus EDL00668.1 12

Filagrina, Rattus norvegicus EDL87862 13

Filagrina, Pan troglodytes XP 001134714 14

Filagrina, Pan troglodytes XP 513808 15

Filagrina, Macaca mulatta XP 001101725.1 16

(continuación)

Ejemplos de secuencias de proteínas de filagrina

N.° de registro de

Secuencia GenBank SEQ ID NO.

Filagrina, Macaca mulatta XP 001109011.1 17

3. Señales de secreción

Las señales de secreción o señales de exportación son péptidos en una proteína que indican que la proteína está destinada a la vía secretora y, por lo tanto, es secretada por la célula. Cualquier señal de secreción que facilite la salida de una proteína tal como una molécula de filagrina fuera de la célula bacteriana se contempla como una señal de secreción. En la Tabla 2 se exponen ejemplos no limitantes de señales de secreción.

____________________________ Tabla 2.____________________________ _________________ Ejemplos de señales de secreción_________________

Secuencia SEQ ID NO.

MKKLAFAITAASGAAA VLSHHDAEA 18

WLDNRAFSKKFVPVVMATSVALFFLNLAFA 19

MAKKFNYKLPSMV ALTLFGTAFTATHAQANA 20

MKKRFLSICTMTIAALAATTTMVNTSYA 21

NLKKQSKLILIFICIFTFFIMIIQSQFLMG 22

MKIFKLTSLTLAALTLAFPFSHVAQA 23

MKTVIASTLA VSLGIAGYGLSGHEAHA 24

MKKNKFL VYLLST ALITPTF A TQT AFA 25

MKTRQNKYSIRKFSVGASSILIAALLFMGGGSAQA 26

MKNNNETRRFSIRKYTVGVVSIITGITIFVSGQHAQA 27

MKKKLSYMITIMLAFTLSLALGLFFNSAHA 28

4. Péptidos de penetración celular

Se puede usar un péptido de penetración celular para mediar en el suministro de la carga in vivo sin usar ningún receptor y sin causar ningún daño significativo a la membrana. Los péptidos de penetración celular que facilitan la entrada en los queratinocitos cutáneos se contemplan como péptidos de penetración celular de la presente invención. Los ejemplos no limitantes se exponen en la Tabla 3.

Tabla 3.

Ejemplos de péptidos de penetración celular

Secuencia SEQ ID NO.

GRKKRRQRRRPPQ 29

GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 30

KLALKLALKALKAALKLA 31

WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA 32

KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 33

RRRRRRRRR 34

LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 35

Referencias para SEQ. ID 29-35 de la Tabla 3: SEQ ID NO: 29. Jeong JG et al. (2011). SEQ ID 30. Ostenson CG et al. (1997). SEQ ID 31.Oehike J et al. (1998). SEQ ID NO: 32. Wyman TB, et al. (1997). SEQ ID NO:33--35. J. Ma et al. (2014).

5. Construcción genética

La invención utiliza técnicas estándar de biología molecular, por ejemplo, las descritas en (Sambrook et al. 2001). Un ejemplo de la construcción genética utilizada para esta invención se basa en un vector plasmídico pBT-2 (Figura 2), un vector lanzadera de intercambio alélico entre especies de E. coli y Staphylococcal (Nakanishi, Oshida et al. 1986). El plásmido de la Figura 3 se construye insertando ADNc de un gen que codifica una proteína terapéutica en un sitio de restricción del MCS de pBT-2. El inserto contiene una secuencia de codificación dirigida por un promotor. Dicho promotor puede ser constitutivo o inducible. Ejemplos de promotores inducibles incluyen aquellos que son activados por compuestos químicos tales como alcoholes, azúcares, metales, o tetraciclina, o por factores físicos como la luz o las altas temperaturas.

La construcción genética puede basarse en un vector plasmídico pJB38, un vector lanzadera de intercambio alélico entre especies de E. coli y Staphylococcal. Véase (Cheung AL, et al. 2004). La secuencia de ARNm de FLG humana tiene un número de registro de Genebank NM_002016, y se reproduce anteriormente como SEQ. ID NO. 1. El plásmido pAZT-01 (Figura 5) se puede construir insertando parte del ADNc de FLG en un sitio de restricción de pJB38. El inserto contiene una secuencia de codificación dirigida por un promotor de xilosa constitutivo. La construcción también codifica una señal de secreción y un péptido de penetración celular, dando así como resultado una proteína de fusión de filagrina.

6. Usos de la cepa bacteriana recombinante

Se entenderá que el trastorno que se va a tratar puede ser cualquier trastorno asociado con la piel. En realizaciones preferidas, el trastorno se selecciona del grupo que comprende psoriasis, acné, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, hiperqueratosis epidermolítica, dermatitis seborreica, eccema, sequedad cutánea, alergia, erupciones, piel irritada por los rayos UV, piel irritada por detergentes (incluida la irritación causada por enzimas y compuestos utilizados en detergentes y laurilsulfato de sodio), adelgazamiento de la piel (por ejemplo, piel de ancianos y niños), penfigoide ampolloso, pénfigo vulgar, impétigo, vitíligo, calvicie e hirsutismo.

Los ejemplos de proteínas que se pueden administrar según la invención son principalmente proteínas eucariotas.

Estos pueden incluir, entre otros, aminoácidos individuales, péptidos pequeños y proteínas grandes. Más particularmente, genes que codifican proteínas que son útiles en la invención como proteínas terapéuticas recombinantes incluyen, pero no se limitan a, los siguientes genes. Miembros de la familia de genes de las interleucinas, que incluyen, pero sin limitación, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 e IL-15 y genes que codifican antagonistas de receptores de las mismas. Genes que codifican factores de crecimiento hematopoyético, que incluyen, pero sin limitación, eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulador de colonias de macrófagos de granulocitos, factor estimulador de colonias de macrófagos, factor de células madre, factor inhibidor de la leucemia y la trombopoyetina también se contemplan en la invención. También se contemplan genes que codifican factores neurotrópicos, que incluyen, pero sin limitación, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrópico derivado del cerebro y factor neurotrópico ciliar. Además, genes que codifican interferones, que incluyen, pero sin limitación IFN-alfa, IFN-beta e IFN-gamma están incluidos. Además, en la invención se contemplan genes que codifican quimiocinas tales como la familia C-C y la familia C-X-C de citocinas, genes que codifican hormonas, como la proinsulina y la hormona del crecimiento, y genes que codifican enzimas trombolíticas, incluyendo activador tisular del plasminógeno, estreptocinasa, uroquinasa u otras enzimas como el inhibidor de tripsina. La invención incluye además genes que codifican factores de reparación de tejidos, factores reguladores y de crecimiento tales como, pero sin limitación, oncostatina M, factores de crecimiento derivados de plaquetas, factores de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de hepatocitos, proteínas morfogenéticas óseas, factores de crecimiento de tipo insulina, calcitonina y factor de crecimiento transformante alfa y beta. Otros genes contemplados incluyen genes que codifican proteínas estructurales como la filagrina, actina, colágeno, fibrilina, elastina o escleroproteína.

Formulaciones

Será además evidente que la formulación para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender cualquier cantidad farmacéuticamente eficaz de bacterias recombinantes para producir una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido deseado, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,2%, aproximadamente el 0,3%, aproximadamente el aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,6 %, aproximadamente el 0,7 %, aproximadamente el aproximadamente e

,9%, aproximadamente el 1,0%, aproximadamente el 1,5%, aproximadamente el aproximadamente el 3,0 %, aproximadamente el 4,0 %, aproximadamente el 5,0 %, aproximadamente el aproximadamente el 7,0%, aproximadamente el 8,0%, aproximadamente el 9,0%, aproximadamente el 10,0%, aproximadamente el 11,0 %, aproximadamente el 12,0 %, aproximadamente el 13,0 %, aproximadamente el 14,0 %, aproximadamente el 15,0 %, aproximadamente el 16,0 %, aproximadamente el 17,0 %, aproximadamente el 18,0 %, aproximadamente el 19,0 %, aproximadamente el 20,0 %, aproximadamente el 25,0 %, aproximadamente el 30,0 %, aproximadamente el 35,0 %, aproximadamente el 40,0 %, aproximadamente el 45,0 %, aproximadamente el 50,0 % o más en peso de bacterias recombinantes, cuyo límite superior es aproximadamente el 90,0 % en peso de bacterias recombinantes.

En una realización alternativa, la formulación para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender, por ejemplo, al menos de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 30 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 20 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 30 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 20 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 15 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 0,2 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 0,3 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 0,4 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 % o más en peso de bacterias recombinantes.

La formulación tópica para su uso en la presente invención puede estar en cualquier forma adecuada para aplicación a la superficie del cuerpo, tal como una crema, loción, pulverizaciones, solución, gel, pomada, pasta, apósito, pintura, bioadhesivo, suspensiones, emulsiones o similar, y/o se pueden preparar para contener liposomas, micelas y/o microesferas. Tal formulación se puede usar en combinación con una capa superior oclusiva para que la humedad que se evapora de la superficie del cuerpo se mantenga dentro de la formulación tras la aplicación a la superficie del cuerpo y posteriormente. La formulación puede incluir una composición de cultivo de células vivas y puede comprender al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería que produzca un polipéptido recombinante. Esta composición de cultivo de células vivas modificadas por ingeniería puede suministrar el polipéptido directamente a la piel para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas.

Las formulaciones tópicas incluyen aquellas en las cualquier otro principio activo o principios activos se disuelve(n) o dispersa(n) en un vehículo dermatológico conocido en la técnica (por ejemplo, geles acuosos o no acuosos, pomadas, emulsiones de agua en aceite o de aceite en agua). Los constituyentes de tales vehículos pueden comprender agua, soluciones tampón acuosas, disolventes no acuosos (tales como etanol, isopropanol, alcohol bencílico, 2-(2-etoxietoxi)etanol, propilenglicol, monolaurato de propilenglicol, glicofurol o glicerol), aceites (por ejemplo, un aceite mineral, tal como una parafina líquida, triglicéridos naturales o sintéticos, tales como Miglyol™, o aceites de silicona, tales como dimeticona). Dependiendo, entre otros, de la naturaleza de la formulación, así como de su uso previsto y el sitio de aplicación, el vehículo dermatológico empleado puede contener uno o más componentes (por ejemplo, cuando la formulación es un gel acuoso, componentes además del agua) seleccionados de la siguiente lista: un agente solubilizante o disolvente (por ejemplo, una p-ciclodextrina, tal como hidroxipropil p-ciclodextrina, o un alcohol o poliol, tal como etanol, propilenglicol o glicerol); un agente espesante (por ejemplo, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa o carbómero); un agente gelificante (por ejemplo, un copolímero de polioxietilenopolioxipropileno); un conservante (por ejemplo, alcohol bencílico, cloruro de benzalconio, clorhexidina, clorbutol, un benzoato, sorbato de potasio o EDTA o una sal del mismo); y un agente (o agentes) tamponantes de pH (tal como una mezcla de sales de dihidrógeno fosfato e hidrógeno fosfato, o una mezcla de ácido cítrico y una sal de hidrógeno fosfato).

También se puede incorporar un portador farmacéuticamente aceptable en la formulación de la presente invención y puede ser cualquier portador utilizado convencionalmente en la técnica. Los ejemplos del mismo incluyen agua, alcoholes inferiores, alcoholes superiores, alcoholes polihídricos, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, aceites de hidrocarburos, grasas y aceites, ceras, ácidos grasos, aceites de silicona, tensioactivos no iónicos, tensioactivos iónicos, tensioactivos de silicona y mezclas a base de agua y mezclas a base de emulsión de tales portadores. La expresión "farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéuticamente aceptable" se usa en el presente documento para referirse a un compuesto o composición que se puede incorporar a una formulación farmacéutica sin causar efectos biológicos indeseables o interacciones no deseadas con otros componentes de la formulación, "Portadores" o "vehículos", tal como se usan el presente documento, se refieren a materiales portadores adecuados para incorporar en una composición de aplicación tópica. Los portadores y vehículos útiles en el presente documento incluyen cualquiera de los materiales conocidos en la técnica, que no son tóxicos y no interactúan con otros componentes de la formulación en la que están contenidos de manera nociva. El término "acuoso" se refiere a una formulación que contiene agua o que se convierte en agua después de la aplicación a la piel o tejido mucoso.

Un formador de película, cuando se seca, forma una película protectora sobre el sitio de aplicación. La película inhibe la eliminación del principio activo y lo mantiene en contacto con el sitio que se está tratando. Un ejemplo de un formador de película que es adecuado para su uso en esta invención es el colodión flexible, USP. Tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (Easton, PA: Mack Publishing Co., 1995), en la página 1530, los colodiones son soluciones de éter etílico/etanol que contienen piroxilina (una nitrocelulosa) que se evaporan para dejar una película de piroxilina. Un formador de película puede actuar adicionalmente como portador. Las soluciones que se secan para formar una película a veces se denominan pinturas. Se pueden emplear cremas, como es bien conocido en las técnicas de la formulación farmacéutica, son líquidos viscosos o emulsiones semisólidas, ya sea de aceite en agua o de agua en aceite.

Las bases de crema son lavables con agua y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. La fase oleosa, también denominada fase "interna", generalmente comprende vaselina y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o estearílico. La fase acuosa, por lo general, aunque no necesariamente, supera la fase oleosa en volumen y, generalmente, contiene un humectante. El emulsionante en una formulación de crema es generalmente un tensoactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero.

Las lociones son preparaciones que se aplican a la superficie cutánea sin fricción y son preparaciones líquidas o semilíquidas en las que partículas, incluyendo el agente activo, están presentes en una base de agua o alcohol. Las lociones son normalmente suspensiones de sólidos y, preferentemente, comprenden una emulsión oleosa líquida del tipo aceite en agua. Las lociones son formulaciones preferidas en el presente documento para el tratamiento de grandes áreas del cuerpo, debido a la facilidad de aplicación de una composición más fluida. En general, es necesario que la materia insoluble de una loción esté finamente dividida.

Las lociones normalmente contendrán agentes de suspensión para producir mejores dispersiones, así como compuestos útiles para localizar y mantener el agente activo en contacto con la piel, por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio o similares.

Las soluciones son mezclas homogéneas que se preparan disolviendo una o más sustancias químicas (solutos) en un líquido de manera que las moléculas de la sustancia disuelta se dispersan entre las del disolvente. La solución puede contener otros productos químicos farmacéutica o cosméticamente aceptables para tamponar, estabilizar o conservar el soluto. Ejemplos comunes de disolventes usados en la preparación de soluciones son etanol, agua, propilenglicol o cualquier otro vehículo aceptable. Como es bien sabido, por supuesto, los geles son sistemas semisólidos, de tipo suspensión. Los geles monofásicos contienen macromoléculas orgánicas distribuidas de manera sustancialmente uniforme en todo el portador líquido, que es normalmente acuoso, pero también, preferentemente, contienen un alcohol y opcionalmente, un aceite. Las "macromoléculas orgánicas" preferidas, es decir, agentes gelificantes, son polímeros de ácido acrílico reticulados como la familia de "carbómeros" de polímeros, por ejemplo, carboxipolialquilenos que se pueden obtener comercialmente bajo la marca registrada Carbopol. También se prefieren polímeros hidrófilos tales como óxidos de polietileno, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno y alcohol polivinílico; polímeros celulósicos tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y metilcelulosa; gomas tales como goma de tragacanto y de xantano; alginato de sodio; y gelatina. Con el fin de preparar un gel uniforme, pueden añadirse agentes dispersantes tales como alcohol o glicerina, o el agente gelificante puede dispersarse mediante trituración, mezcla mecánica o agitación, o combinaciones de las mismas. Las pomadas, como también se conoce bien en la técnica, son preparaciones semisólidas que se basan normalmente en vaselina u otros derivados del petróleo. La base de pomada específica que se debe utilizar, como apreciarán los expertos en la materia, es una que proporcionará una serie de características deseables, por ejemplo, emoliencia o similar. Al igual que con otros portadores o vehículos, una base de pomada debería ser inerte, estable, no irritante y no sensibilizante. Como se explica en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (Easton, PA: Mack Publishing Co., 1995), en las páginas 1399-1404, las bases de pomada se pueden agrupar en cuatro clases: bases oleaginosas; bases emulsionables; bases de emulsión; y bases hidrosolubles. Las bases de pomadas oleaginosas incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, grasas obtenidas de animales e hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Las bases de pomadas emulsionables, también conocidas como bases de pomadas absorbentes, contienen poco o nada de agua, e incluyen, por ejemplo, sulfato de hidroxiestearina, lanolina anhidra y vaselina hidrófila.

Las bases de pomadas de emulsión son emulsiones de agua en aceite (W/O) o emulsiones de aceite en agua (O/W), e incluyen, por ejemplo, alcohol acetílico, monoestearato de glicerilo, lanolina y ácido esteárico. Las bases de pomada hidrosolubles preferidas se preparan a partir de polietilenglicoles de peso molecular variable; véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy for further information.

Las pastas son formas de dosificación semisólidas en las que el principio activo está suspendido en una base adecuada. Dependiendo de la naturaleza de la base, las pastas se dividen entre pastas grasas o aquellas preparadas a partir de geles acuosos monofásicos. La base de una pasta grasa es generalmente vaselina o vaselina hidrófila o similar. Las pastas hechas de geles acuosos monofásicos generalmente llevan incorporada carboximetilcelulosa o similares como base.

Los potenciadores son aquellos copotenciadores lipófilos normalmente denominados potenciadores "plastificantes", es decir, potenciadores que tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 150 a 1000, una solubilidad acuosa de menos de aproximadamente el 1 % en peso, preferentemente menos de aproximadamente el 0,5 % en peso y lo más preferentemente menos de aproximadamente el 0,2 % en peso. El parámetro de solubilidad de Hildebrand 8 de los potenciadores plastificantes está en el intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 10, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. Los potenciadores lipófilos preferidos son los ésteres grasos, alcoholes grasos y éteres grasos. Los ejemplos de ésteres de ácidos grasos específicos y los más preferidos incluyen laurato de metilo, oleato de etilo, monolaurato de propilenglicol, dilaurato de propilenglicerol, monolaurato de glicerol, monooleato de glicerol, n-decanoato de isopropilo y miristato de octildodecilo. Los alcoholes grasos incluyen, por ejemplo, alcohol estearílico y alcohol oleílico, mientras que los éteres grasos incluyen compuestos en donde un diol o triol, preferentemente un diol o triol de alcano C²-C⁴ , están sustituidos con uno o dos sustituyentes de éter graso.

Los potenciadores de la permeación adicionales serán conocidos por los expertos en la técnica de suministro tópico de fármacos, y/o se describen en los textos y la bibliografía pertinentes. Véase, por ejemplo, Percutaneous Penetration Enhancers, eds. Smith et al. (CRC Press, 1995).

Se pueden incluir varios otros aditivos en las composiciones de la presente invención además de los identificados anteriormente. Estos incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, astringentes, perfumes, conservantes, emolientes, pigmentos, colorantes, humectantes, propulsores y agentes de protección solar, así como otras clases de materiales cuya presencia puede ser deseable desde el punto de vista farmacéutico o de otro tipo. Los ejemplos típicos de aditivos opcionales para su inclusión en las formulaciones de la invención son los siguientes: conservantes tales como sorbato; disolventes tales como isopropanol y propilenglicol; astringentes tales como mentol y etanol; emolientes tales como polialquilen metil glucósidos; humectantes tales como glicerina; emulsionantes tales como estearato de glicerol, PEG-100 estearato, poligliceril-3 hidroxilauril éter y polisorbato 60; sorbitol y otros polihidroxialcoholes tales como polietilenglicol; agentes de filtro solar tales como cinamato de octil metoxilo (disponible comercialmente como Parsol MCX) y butil metoxi benzoilmetano (disponible bajo el nombre comercial Parsol 1789); antioxidantes tales como ácido ascórbico (vitamina C), a-tocoferol (vitamina E), p-tocoferol, Y-tocoferol, 8-tocoferol, £-tocoferol, Zi-tocoferol, ZA-tocoferol, n-tocoferol y retinol (vitamina A); aceites esenciales, ceramidas, ácidos grasos esenciales, aceites minerales, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de soja, aceite de palma, fracción líquida de manteca de karité, aceite de girasol), aceites animales (por ejemplo, perhidroescualeno), aceites sintéticos, aceites o ceras de silicona (por ejemplo, ciclometicona y dimeticona), aceites fluorados (generalmente perfluoropoliéteres), alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetílico) y ceras (por ejemplo, cera de abeja, cera de carnauba y cera de parafina); modificadores de la sensación en la piel; y espesantes y estructurantes tales como arcillas expansivas y carboxipolialquilenos reticulados que pueden obtenerse comercialmente bajo la marca registrada Carbopol. Otros aditivos incluyen agentes beneficiosos tales como aquellos materiales que acondicionan la piel (particularmente, las capas superiores de la piel en el estrato córneo) y la mantienen suave retardando la disminución de su contenido de agua y/o protegen la piel. Dichos acondicionadores y agentes humectantes incluyen, a modo de ejemplo, ácido carboxílico de pirrolidina y aminoácidos; agentes antimicrobianos orgánicos tales como 2,4,4'-tricloro-2-hidroxi difenil éter (triclosán) y ácido benzoico; agentes antiinflamatorios tales como ácido acetilsalicílico y ácido glicirretínico; agentes antiseborreicos tales como ácido retinoico; vasodilatadores tales como ácido nicotínico; inhibidores de la melanogénesis tales como ácido kójico; y sus mezclas. Otros agentes activos adicionales que incluyen, por ejemplo, alfa hidroxiácidos, alfa cetoácidos, hidroxiácidos poliméricos, hidratantes, colágeno, extracto marino, y antioxidantes como el ácido ascórbico (Vitamina C), a-tocoferol (vitamina E), p-tocoferol, Y-tocoferol, 8-tocoferol, £-tocoferol, Zⁱ -tocoferol, Z²-tocoferol, n-tocoferol y retinol (vitamina A) y/o sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, amidas u otros derivados de los mismos. Un compuesto de tocoferol preferido es el a-tocoferol. Los agentes adicionales incluyen aquellos que son capaces de mejorar el suministro de oxígeno en el tejido cutáneo, tal como se describe, por ejemplo, en Gross, et al, documento ^w O 94/00098 y Urwin, et al., documento WO 94/00109, ambos cedidos a Lancaster Group AG.

También se pueden incluir protectores solares y compuestos absorbentes de rayos UV. Los ejemplos no limitantes de tales protectores solares y compuestos absorbentes de UV incluyen ácido aminobenzoico (PABA), avobenzona, cinoxato, dioxibenzona, homosalato, antranilato de mentilo, oxtocrileno, metoxicinamato de octilo, salicilato de octilo, oxibenzona, padimato O, ácido fenilbencimidazolsulfónico, sulisobenzona, dióxido de titanio, salicilato de trolamina, óxido de zinc, ensulizol, meradimato, octinoxato, octisalato y octocrileno. Véase Título 21. Capítulo 1. Subcapítulo D. Parte 352. "Sunscreen drug products for over-the-counter human use".

Otras realizaciones pueden incluir una variedad de materiales cicatrizantes no cancerígenos, no irritantes que facilitan el tratamiento con las formulaciones de la invención. Dichos materiales curativos pueden incluir nutrientes, minerales, vitaminas, electrolitos, enzimas, hierbas, extractos vegetales, extractos glandulares o animales, o agentes terapéuticos seguros que se pueden añadir a la formulación para facilitar la curación de trastornos dérmicos.

Las cantidades de estos distintos aditivos son las que se utilizan convencionalmente en el campo cosmético, y oscilan, por ejemplo, desde aproximadamente el 0,01 % hasta aproximadamente el 20 % del peso total de la formulación tópica.

Las formulaciones de la invención también pueden incluir aditivos convencionales tales como opacificantes, fragancia, colorante, estabilizantes, tensioactivos y similares. En determinadas realizaciones, también pueden añadirse otros agentes, tales como agentes antimicrobianos, para evitar el deterioro durante el almacenamiento, es decir, para inhibir el crecimiento de microbios tales como levaduras y mohos. Los agentes antimicrobianos adecuados se seleccionan normalmente del grupo que consiste en los ésteres de metilo y propilo del ácido p-hidroxibenzoico (es decir, metil y propil parabeno), benzoato de sodio, ácido sórbico, imidurea y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, también pueden añadirse otros agentes, como represores e inductores, es decir, para inhibir (es decir, glucosa) o inducir (es decir, xilosa) la producción del polipéptido de interés. Dichos aditivos pueden emplearse siempre que sean compatibles y no interfieran con la función de las formulaciones.

Las formulaciones también pueden contener aditivos mitigadores de la irritación para minimizar o eliminar la posibilidad de irritación cutánea o daño en la piel resultante de la entidad química que se va a administrar, u otros componentes de la composición.

Los aditivos adecuados para mitigar la irritación incluyen, por ejemplo: a-tocoferol; inhibidores de monoamina oxidasa, particularmente alcoholes fenílicos tales como 2-fenil-1-etanol; glicerina; salicilatos; ascorbatos; ionóforos tales como monensina; aminas anfifílicas; cloruro de amonio; N-acetilcisteína; capsaicina; y cloroquina. El aditivo mitigador de la irritación, si está presente, se puede incorporar a las composiciones en una concentración eficaz para mitigar la irritación o el daño de la piel, normalmente representando no más de aproximadamente el 20 % en peso, más normalmente no superior a aproximadamente el 5 % en peso, de la formulación.

Otros agentes farmacológicamente activos adecuados que pueden incorporarse en las presentes formulaciones en ciertas realizaciones y, por tanto, aplicarse tópicamente junto con el agente activo incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: agentes que mejoran o erradican las manchas por la edad pigmentadas o no pigmentadas, queratosis y arrugas; agentes antimicrobianos; agentes antibacterianos; agentes antipruriginosos y antixeróticos; agentes antiinflamatorios; anestésicos locales y analgésicos; corticoesteroides; retinoides; vitaminas; hormonas; y antimetabolitos.

Algunos ejemplos de agentes tópicos farmacológicamente activos incluyen aciclovir, anfotericinas, clorhexidina, clotrimazol, ketoconazol, econazol, miconazol, metronidazol, minociclina, nistatina, neomicina, kanamicina, fenitoína, ésteres del ácido para-aminobenzoico, metoxicinamato de octilo, salicilato de octilo, oxibenzona, dioxibenzona, tocoferol, acetato de tocoferilo, sulfuro de selenio, piritiona de zinc, difenhidramina, pramoxina, lidocaína, procaína, eritromicina, tetraciclina, clindamicina, crotamitón, hidroquinona y sus éteres monometílico y bencílico, naproxeno, ibuprofeno, cromolina, retinol, palmitato de retinilo, acetato de retinilo, alquitrán, griseofulvina, estradiol, hidrocortisona, 21-acetato de hidrocortisona, 17-valerato de hidrocortisona, 17-butirato de hidrocortisona, progesterona, valerato de betametasona, dipropionato de betametasona, acetónido de triamcinolona, fluocinonida, propionato de clobetasol, minoxidil, dipiridamol, difenilhidantoína, peróxido de benzoílo y 5-fluorouracilo.

Una crema, loción, gel, pomada, pasta o similar se puede esparcir sobre la superficie afectada y frotar suavemente. Se puede aplicar una solución de la misma manera, pero más normalmente se aplicará con un gotero, hisopo, o similar, y se aplicará con cuidado a las áreas afectadas.

El régimen de aplicación dependerá de una serie de factores que pueden determinarse fácilmente, como la gravedad de la afección y su respuesta al tratamiento inicial, pero normalmente implicará una o más aplicaciones por día de forma continua. Un experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad óptima de la formulación tópica que se debe administrar, metodologías de administración y tasas de repetición. En general, se contempla que las formulaciones de la invención se aplicarán en el intervalo de una o dos veces por semana hasta una o dos veces al día.

Como se describe en el presente documento, la especie de bacteria seleccionada para la composición se transforma usando técnicas recombinantes conocidas para expresar un compuesto de interés.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen y demuestran adicionalmente realizaciones dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitaciones de la presente invención.

Ejemplo 1 Staphylococcus epidermidis que expresa el elemento filagrina usando el vector pAZT-01

A. Bacterias

Se usaron bacterias de la cepa RN4220 de Staphylococcus aureus en la preparación del vector (Kreiswirth, BN., et al.

1983). Se almacenó una solución madre de la cepa a -20 °C en glicerol al 50 % en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI).

Se usaron las bacterias de la cepa ATCC12228 de Staphylococcus epidermidis (Zhang, YQ., et al. 2003). Se almacenó una solución madre de la cepa a -20 °C en glicerol al 50 % en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Las bacterias se cultivaron en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Después de 16 horas de incubación, las bacterias se recogieron por centrifugación y se concentraron 10 veces en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) a 2x109bacterias/100 pl. Se preparó una preparación madre de bacterias mediante la inoculación de 5 ml de caldo con células del cultivo inclinado. Las células se dejaron crecer durante la noche a 30 °C. A continuación, se añadieron 3 ml de cultivo completamente desarrollado a 1 ml de glicerol al 60 % y se almacenaron a -80 °C.

B. Integración genómica en el vector

El plásmido AZT-01 consiste en el vector lanzadera pJB38 con un inserto de expresión de filagrina (Figura 5) (Cheung, AL., et al. 2004). El inserto en pJB38 contiene el operón completo para una secuencia de ADN de filagrina (número de registro de Genbank NM_002016), un promotor inducible por xilosa y se usó en la producción del compuesto de interés. El vector pJB38-FLG (Figura 5) fue construido y clonado por Bio Basic, Inc. (Markman, ON, Canadá).

C. Transformación

Un vector que albergaba la secuencia de la filagrina, o cualquier vector construido con el fin de tratar terapéuticamente la piel humana anormal, se transformó en la cepa de S. epidermidis, de acuerdo con el siguiente protocolo, que incluye las siguientes etapas: preparación de células bacterianas de S. aureus, transformación de S. aureus, aislamiento de ADN plasmídico de S. aureus, preparación de células bacterianas de S. epidermidis, transformación de S. epidermidis, crecimiento de bacterias y almacenamiento de bacterias transformadas. También se pueden usar cepas intermedias alternativas para la transformación y el aislamiento del ADN plasmídico en preparación para la transformación en S. epidermidis. Estas cepas incluyen pero no se limitan a cepas de S. aureus y E. coli, incluyendo aquellas deficientes en metilación.

Preparación y transformación de S. aureus: Preparación de las células: Las células RN4220 de S. aureus se volvieron electrocompetentes dejando crecer 50 ml de cultivo durante la noche en medio BHI a 37 °C, a continuación inoculando 100 ml de medio BHI fresco con 10 ml de cultivo durante la noche. Cuando la OD⁶⁰⁰ alcanzó 0,2-0,3, las células se sedimentaron y se resuspendieron con 1x volumen de sacarosa al 10% a 4 °C. Este proceso se repitió 3x, a continuación, las células se resuspendieron con 0,1x volumen de sacarosa al 10% a 4 °C, se sedimentaron y resuspendieron con 1 ml de sacarosa al 10 %.

Para la transformación de RN4220, se mezclaron 200-500 mg de pAZT-01 con células electrocompetentes previamente preparadas y transformadas mediante electroporación a temperatura ambiente a 2,5 kV utilizando el Electroporador MicroPulser (BioRad, Hercules, CA). Las células transformadas se colocaron en placas a 28 °C durante la noche en medio BHI selectivo, se dejaron crecer durante la noche en medio BHI selectivo y a continuación se utilizaron para aislar el ADN.

Preparación y transformación de S. epidermidis: ATCC12228 de S. epidermidis electrocompetentes se realizaron utilizando los siguientes métodos. En primer lugar, 50 ml de cultivo durante la noche de ATCC12228 de una solución madre de -80 °C se dejaron crecer a 37 °C en medio B2 (triptona al 1,0 %, extracto de levadura al 2,5 %, glucosa al 0,5 %, NaCl al 2,5 %, K²PO⁴ al 0,1 %, pH a 7,5). Se diluyeron 10 ml de cultivo de una noche en medio B2 precalentado fresco y se agitó hasta que la DO⁶⁰⁰ alcanzó 0,5-0,6, y a continuación se sedimentaron durante 10 min a 4 °C. Después, las células se lavaron con 1, ^ , 1/20 y 1/50 volúmenes de glicerina fría al 10 %, sedimentando a 4 °C entre lavados. El sedimento final se resuspendió en 700 ul de glicerol frío al 10 %.

ATCC12228 electrocompetentes se transformaron con pAZT-01, aislado de S. aureus, usando electroporación a 2,5 kV, 25 uF, 100 O. (la lectura normal es de 4,5 a 5 ms usando el Micropulser Electroporator (Bio-Rad, Hercules, CA)). A continuación, las células se sembraron en placas a 28 °C en medio BHI selectivo.

La transformación de las bacterias también se puede realizar a través de métodos alternativos de transformación que incluyen, entre otros, cepas intermedias alternativas, transducción de bacteriófagos y choque térmico.

D. Inducción de la expresión de proteínas

La expresión de filagrina se indujo en ATCC12228 transformado con pAZT-01 de la siguiente manera. En primer lugar, se tomaron 5 ml de un cultivo de una noche a 28 °C de ATCC12228 transformada en medio BHI selectivo para inocular 100 ml de BHI fresco con antibiótico. Las células se cultivaron hasta que la OD⁶⁰⁰ alcanzó 0,5-0,65, a continuación, las células se indujeron utilizando una concentración final de xilosa al 1,5 % durante 4,5 horas.

E. Análisis de expresión y secreción de proteínas

Para el análisis, las células se fraccionaron y analizaron mediante electroforesis SDS-PAGE y transferencia Western. Las células bacterianas de las muestras no inducidas y las muestras inducidas se sedimentaron y lisaron con CelLytic B Cell Lysis Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El sobrenadante de la muestra inducida también se recogió y concentró. Las muestras se resuspendieron en un tampón de muestra reducido y a continuación se sometieron a electroforesis en un gel Tris al 4-15 % con tampón de funcionamiento Tris-HCL. Después de la electroforesis, el gel se transfirió a una membrana de PVDF y se probó secuencialmente con un anticuerpo monoclonal primario de cabra contra la filagrina (sc-25897, Santa Cruz Biotechnology, Inc). A continuación, se probó un anticuerpo anti-cabra de burro conjugado con peroxidasa de rábano picante (sc-2020) y los anticuerpos secundarios se detectaron mediante autorradiografía (Syngene GeneGnome Bio Imaging System) utilizando un sustrato de quimioluminiscencia mejorado (SuperSignal West Pico, Thermo Scientific).

El análisis del sobrenadante y del lisado celular demuestra la expresión y secreción satisfactorias del polipéptido terapéutico tras la transformación con el plásmido que contiene la proteína de interés, seguido de la inducción de la expresión de proteínas.

La detección de la expresión y secreción de proteínas también es posible utilizando métodos alternativos y el presente ejemplo no debe interpretarse como una limitación de la presente invención.

F. Tratamiento de sujetos humanos con la composición anterior

Aproximadamente 1x109 unidades formadoras de colonias (UFC) de S. epidermidis que contiene pAZT-01 se puede añadir a un portador farmacéuticamente aceptable. La composición anterior es útil para tratar o prevenir afecciones anormales cutáneas en un sujeto que lo necesite, por ejemplo, un sujeto humano que tiene una afección anormal cutánea tal como eccema. La composición se puede aplicar al menos una vez al día, hasta, por ejemplo, aproximadamente 3 o 4 veces al día, o según sea necesario o prescrito. La composición se puede usar durante el tiempo que sea necesario para asegurar el tratamiento de la afección o para continuar previniendo la afección. La duración del tratamiento puede variar desde aproximadamente 1 día hasta aproximadamente 10 a 14 días o más. En ciertos casos, se puede administrar un tratamiento a largo plazo o crónico.

Ejemplo 2 Staphylococcus epidermidis que coloniza la capa epidérmica y expresa GFP

A. Bacterias

Las bacterias de las cepas DH5a y DC10B de Escherichia coli se utilizaron en la construcción y preparación de plásmidos (Sambrook, J., et al. 1989; Monk, I., et al. 2012). Las bacterias de la cepa ATCC12228 de Staphylococcus epidermidis se utilizó para la expresión heteróloga de GFP en los estudios de expresión y colonización murina. Se almacenó una solución madre de la cepa a -20 °C en glicerol al 50 % en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Las bacterias se cultivaron en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Después de 16 horas de incubación, las bacterias se recogieron por centrifugación y se concentraron 10 veces en BHI a 2x109 bacterias/100 pl. Se preparó una preparación madre de bacterias mediante la inoculación de 5 ml de caldo con células del cultivo inclinado. Las células se dejaron crecer durante la noche a 30 °C. A continuación, se añadieron 3 ml de cultivo completamente desarrollado a 1 ml de glicerol al 60 % y se almacenaron a -80 °C.

B. Vector

El plásmido pCM11 consiste en un vector lanzadera con un inserto de expresión de sGFP (Lauderdale et al. 2010).

C. Transformación

Un vector que alberga la secuencia GFP (por ejemplo, pCM11 (Lauderdale et al. 2010)), o cualquier vector construido con el propósito de expresión heteróloga se transformó en la cepa ATCC12228 de S. epidermidis, de acuerdo con el siguiente protocolo, que incluye las siguientes etapas: transformación en DH5a, aislamiento de ADN plasmídico de DH5a, transformación de DC10B, aislamiento de ADN plasmídico de DC10B, preparación y transformación de S. epidermidis, crecimiento y aplicación de S. epidermidis transformada.

DH5a de E. coli se transformó con pCM11 utilizando el método de choque térmico y se sembró en LB selectivo (caldo Luria) durante la noche a 37 °C. El ADN plasmídico se purificó a partir de cultivos de la noche a 37 °C con medio LB selectivo de transformantes de DH5a utilizando el kit Zymo Research Plasmid Miniprep (Irvine, CA). A continuación, se utilizaron 200-500 ng de ADN de pCM11 para transformar DC10B mediante electroporación a temperatura ambiente a 2,5 kV utilizando el electroporador MicroPulser (Bio-Rad, Hercules, CA). Las células transformadas se sembraron en placas durante la noche a 37 °C y a continuación se purificó el ADN utilizando dicho método.

A continuación, ATCC12228 de S. epidermidis electrocompetentes se realizaron utilizando los siguientes métodos. En primer lugar, se cultivaron 50 ml durante la noche de ATCC12228 a 37 °C en medio B2 (triptona al 1,0 %, extracto de levadura al 2,5 %, glucosa al 0,5 %, NaCl al 2,5 %, K²PO⁴ al 0,1 %, pH a 7,5). Se diluyeron 10 ml de cultivo de una noche en medio B2 precalentado fresco y se agitó hasta que la DO⁶⁰⁰ alcanzó 0,5-0,6, y a continuación se sedimentaron durante 10 min a 4 °C. Después, las células se lavaron con 1, ^ , 1/20 y 1/50 volúmenes de glicerina fría al 10 %, sedimentando a 4 °C entre lavados. El sedimento final se resuspendió en 700 ul de glicerol frío al 10 %. ATCC12228 electrocompetentes se transformaron con pCM11, se aislaron de DC10B, usando electroporación a 2.5 kV usando el Micropulser Electroporator (Bio-Rad, Hercules, CA). A continuación, las células se sembraron en placas a 37 °C en medio BHI selectivo.

La transformación y la expresión del inserto de GFP se confirmaron usando microscopía como se ve por la fluorescencia de ATCC12228 de S. epidermidis transformada en la Figura 6.

D. Estudios murinos con ATCC12228 transformado con pCM11

Para visualizar la colonización de ATCC12228 en la piel del ratón, los ratones se trataron con ATCC12228 que expresaba GFP (ATCC12228 transformado con pCM11). Una pequeña cohorte de ratones (n = 5) se cortó para eliminar el pelo y se trató la piel dorsal con ATCC12228 de S. epidermidis que expresaba GFP en pCM11. Aproximadamente 1x109 UFC de S. epidermidis se aplicaron con un bastoncillo con punta de algodón. Después del inicio del tratamiento, los ratones fueron supervisados en busca de signos de colonización de S. epidermidis.

Se tomaron secciones de piel de la piel post mortem para estudios de imágenes. Se tomaron imágenes de las secciones mediante microscopía fluorescente (Figura 7), incluida la tinción con DAPI y un anticuerpo monoclonal anti-GFP (Figura 8). Se visualizaron imágenes adicionales usando microscopía de dos fotones (Figura 8).

La Figura 7 representa ATCC12228 de S. epidermidis transformada con pCM11 que contiene el inserto de GFP, que a su vez se aplicó sobre la piel dorsal de los ratones durante tres días. A continuación, se tomaron secciones de la piel post-mortem para microscopía óptica (Figura 7A y 7B). Las secciones que se muestran en este caso se tiñeron con tinción de verde de malaquita y se visualizaron a 200x (Figura 7A), y una mayor expansión en la Figura 7B. Esta figura demuestra la colonización de S. epidermidis en la piel del ratón después de tres días.

La Figura 8 representa ATCC12228 de S. epidermidis transformada con pCM11 que contiene el inserto de GFP, que a su vez se aplicó sobre la piel dorsal de los ratones durante tres días. A continuación, se tomaron secciones de la piel post-mortem para microscopía óptica (Figuras 8A y 8B). La Figura 8A muestra la fluorescencia de GFP que indica no solo que S. epidermidis coloniza la piel después de tres días, sino también que esa expresión de GFP se mantiene en ese momento. La Figura 8A muestra la fluorescencia de GFP, mientras que la Figura 8B muestra una sección de piel teñida con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) y un anticuerpo monoclonal anti-GFP. La Figura 8C muestra una sección de la piel visualizada mediante microscopía de dos fotones. Esta imagen demuestra el alcance de colonización de S. epidermidis y expresión de GFP, como lo indica la fluorescencia.

Aunque se han analizado anteriormente varios aspectos ilustrativos y realizaciones, los expertos en la materia reconocerán determinadas modificaciones, permutaciones, adiciones y subcombinaciones de los mismos.

Todos los listados de secuencias, o SEQ. ID. NO, descritos en el presente documento se incorporan en el presente documento en su totalidad.

EQUIVALENTES

La invención puede realizarse de otras formas específicas.

Las realizaciones anteriores deben considerarse en todos los aspectos ilustrativas en lugar de limitantes de la invención descrita en el presente documento. En las diversas realizaciones de los métodos y las composiciones de la presente invención, donde el término comprende se usa con respecto a las etapas o componentes enumerados, se contempla que los métodos y composiciones también pueden consistir esencialmente en, o consistir en, las etapas o componentes enumerados. Además, debe entenderse que el orden de las etapas o el orden para realizar determinadas acciones es irrelevante mientras la invención permanezca operativa. Asimismo, se pueden realizar dos o más etapas o acciones simultáneamente.

En la memoria descriptiva, las formas singulares también incluyen las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención.

Todos los porcentajes y proporciones utilizados en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, están en peso.

REFERENCIAS

Armengot-Carbo, M. et al. (2014) "The role of filaggrin in the skin barrier and disease development". Actas Dermosifiliogr Mar; 106 (2):86-95.

Brachkova, M. I., P. Marques, J. Rocha, B. Sepodes, M. A. Duarte y J. F. Pinto (2011). "Alginate films containing Lactobacillus plantarum as wound dressing for prevention of burn infection". J Hosp Infect 79(4): 375-377.

Brown, SJ., & McLean, WH. (2012) J. Invest. Dermatol. 132, 751-62

Chen, YE., & Tsao, H. (2013) J. Am. Acad. Dermatol. 69, 143-155

Cheung AL, et al. (2004) "Regulation of virulence determinants in vitro and in vivo in Staphylococcus aureus". FEMS Immunological Medical Microbiology 40(1): 1-9

"DNA Recombination". Methods in Molecular Biology 745(XI V): 1-565.

Gross, et al., WO 94/00098 cedida a Lancaster Group AG

Gross, et al., WO 94/00109 cedida a Lancaster Group AG

Gueniche, A., P. Bastien, J. M. Ovigne, M. Kermici, G. Courchay, V. Chevalier, L. Breton y I. Castiel-Higounenc (2010). "Bifidobacterium longum lysate, a new ingredient for reactive skin". Exp Dermatol 19(8): 1-8.

Jeong JG et al. (2011). A Tat-grafted anti-nucleic acid antibody acquires nuclear-localization property and a preference for Ta R Rn A. Biochem Biophys Res Commun. Mar 18;406(3):403-7.

Kreiswirth, BN., et al. (1983). The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage. Nature 305:709-712.

Lauderdale, et al. (2010). Biofilm dispersal of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus on orthopedic implant material. J. Orthop. Research. 28:55-61

Lee, SH., Jeong, SK. and Ahn, SK. (2006). "An update of the defensive barrier function of skin". Yonsei Med J 47(3): 293-306.

Lin, YT., Wang, CT., y Chiang, BL. (2007). "Role of bacterial pathogens in atopic dermatitis". Clin Rev Allergy Immunol 33(3): 167-177.

Ma, J., et al. (2014) Cell-penetrating peptides mediated protein cross-membrane delivery and its use in bacterial vector vaccine. Fish & Shellfish Immunology 398-16

McAleer, MA., & Irvine, AD. (2013) J. Allergy Clin. Immunol. 131,280-91.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de cultivo celular o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención del eccema en un ser humano que lo necesite, en donde dicha composición de cultivo celular comprende al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería seleccionada de Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc u Oenococcus, y sus mezclas, en donde dicha cepa bacteriana modificada por ingeniería produce una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión recombinante que comprende (a) una señal de secreción, (b) una proteína filagrina y (c) un péptido de penetración celular, y en donde dicha composición farmacéutica comprende (I) dicha composición de cultivo celular y (II) un portador farmacéuticamente aceptable.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha al menos una cepa bacteriana modificada por ingeniería comprende al menos una cepa modificada por ingeniería de Staphylococcus epidermidis.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la composición de cultivo celular es una composición de cultivo de células vivas.

4. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho eccema es un eccema leve, un eccema moderado, un eccema grave, o un eccema en las manos.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de aminoácidos de filagrina comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 o SEQ ID NO 17, y combinaciones de las mismas.

6. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina comprende SEQ ID NO 1.

7. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de aminoácidos de la filagrina tiene al menos aproximadamente un 75 % de homología, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % de homología con SEQ ID NO 1.

8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el portador farmacéuticamente aceptable se selecciona de una solución acuosa, una emulsión, una crema, una loción, un gel o una pomada.