ES2929637T3 - Complejo de ácido peptidonucleico que tiene permeabilidad celular mejorada y composición farmacéutica que comprende el mismo - Google Patents

Complejo de ácido peptidonucleico que tiene permeabilidad celular mejorada y composición farmacéutica que comprende el mismo Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a una estructura novedosa de complejo de ácido nucleico en la que se puede introducir ácido nucleico bioactivo en las células, a una composición que comprende el complejo de ácido nucleico para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades, y a un método para regular la expresión de un gen diana. usando el mismo y, más específicamente, a un complejo de ácido nucleico en el que un ácido nucleico bioactivo se combina de forma complementaria con un ácido nucleico peptídico portador modificado para tener una carga global positiva, a una composición que comprende el complejo de ácido nucleico para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades , ya un método para regular la expresión de un gen diana usando el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Complejo de ácido peptidonucleico que tiene permeabilidad celular mejorada y composición farmacéutica que comprende el mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un complejo de ácido nucleico que tiene una nueva estructura, que puede introducir un ácido nucleico bioactivo en las células, y más particularmente a un complejo de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico bioactivo complementariamente unido a un ácido peptidonucleico vehículo modificado para generalmente estar cargado de manera positiva, y el uso del complejo de ácido nucleico para tratar y diagnosticar la enfermedad y en un método para regular la expresión de un gen diana usando el mismo.
Antecedentes de la técnica
Convencionalmente, la exploración de nuevos fármacos se basa en un cribado de diferentes compuestos a través de una investigación por ordenador, y la mayoría de los compuestos seleccionados actúan sobre proteínas diana.
A diferencia de los fármacos tradicionales, los fármacos de ácido nucleico inhiben la expresión del ARN mensajero (ARNm) específico de diana (ARNm), haciendo posible que se dirija a las áreas de investigación en las que las enfermedades no podrían tratarse mediante fármacos convencionales que actúan sobre las proteínas diana (Kole R. et al., Nature Rev. Drug Discov. 2012; 11; 125-140., Wilson C. et al., Curr. Opin. Chem. Bio. 2006; 10: 607-614.).
A pesar de los excelentes efectos y las diferentes aplicaciones de la regulación de la expresión génica basada en ácidos oligonucleicos, existe un número de obstáculos por superar en el desarrollo de agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos. Por ejemplo, los ácidos oligonucleótidos tienen el riesgo de ser dañados por la nucleasa y similares, y el paso de los ácidos oligonucleicos a través de la membrana celular mediante la difusión pasiva es imposible debido a las propiedades eléctricas (cargas) y al tamaño de los ácidos oligonucleicos. Para superar estos problemas, se han realizado continuamente esfuerzos para asegurar la estabilidad biológica a través de la modificación del ácido nucleico. Para los ácidos nucleicos artificiales modificados, llega a ser posible aumentar su afinidad para los ácidos nucleicos diana sin la pérdida de actividad biológica.
El ácido peptidonucleico (APN), un tipo de ácido nucleico artificial modificado, es un ácido nucleico que tiene una cadena principal de péptido de (2-aminoetil)-glicina introducida en el mismo, y tiene la propiedad de unirse fuertemente a ARN y ADN, teniendo cada uno una secuencia de nucleótidos complementaria al mismo. En particular, el ácido peptidonucleico es resistente a nucleasa y tiene alta estabilidad biológica y, por tanto, se han llevado a cabo estudios sobre agentes terapéuticos basados en diferentes ácidos oligonucleicos. Sin embargo, el ácido peptidonucleico tiene una desventaja ya que es difícil de introducir en las células, debido a que es eléctricamente neutro en la naturaleza (Joergensen M. et al., Oligonucleotides 2011, 21; 29-37.).
A causa del comportamiento y las ventajas de los ácidos nucleicos como fármacos, diferentes ensayos clínicos que usan ácidos nucleicos están en progreso. A pesar de las aplicaciones crecientes de ácidos terapéuticos basados en ácido nucleico, el uso de vehículos para la introducción intracelular es extremadamente limitado. Por ejemplo, se han realizado ensayos clínicos usando una estrategia (método) que administra fármacos basados en ácido oligonucleico en las células o tejidos mediante el uso de nanopartículas, liposomas catiónicos y nanopartículas poliméricas. Sin embargo, la mayoría de estos ensayos clínicos no incluyen los sistemas de administración, y dependen principalmente de la introducción directa de ácidos nucleicos mediante las vías de administración parental, incluyendo inyección intramuscular, administración intraocular, inyección subcutánea y similares.
Además, la permeabilidad de la membrana celular de los propios ácidos oligonucleicos es considerablemente baja y, en particular, ADN o ARN están negativamente cargados. Por este motivo, estos ácidos oligonucleicos no pueden pasar a través de la bicapa de fosfolípidos hidrófoba de la membrana celular y, por tanto, son difíciles de administrar dentro de las células a través de la difusión simple. El uso de un vehículo vírico tal como retrovirus o AAV (virus adenoasociado) hace posible introducir ácidos oligonucleicos en las células, pero tiene riesgos, tal como una actividad inmunitaria no intencionada y la posible recombinación de oncogenes (Couto L. B. et al., Curr. Opin. Pharmacol. 2010, 5; 534-542.).
Por este motivo, es de creciente importancia el desarrollo de vehículos de ácido nucleico basados en ácidos oligonucleicos no víricos que tengan baja citotoxicidad y baja actividad inmunitaria. Como resultado, se han desarrollado técnicas para introducir ácidos nucleicos usando lípidos catiónicos, liposomas, partículas lipídicas de ácido nucleico estables (SNALP), polímeros y péptidos penetrantes de células (Zhi D. et al., Bioconjug. Chem. 2013, 24; 487-519., Buyens K. et al., J. Control Release, 2012, 158; 362-70., ROSSI, J. J. et al., Gene Ther. 2006, 13: 583­ 584., Yousefi A. et al., J. Control Release, 2013, 170; 209-18., Trabulo S. et al., Curr. Pharm. Des. 2013, 19; 2895­ 923.).
Estas técnicas de administración de ácido nucleico tienen fracciones funcionales mediante la unión directa, incluyen una etapa de formación de complejo y tienen problemas asociados a la eficacia de fuga endosómica de las estructuras de liposoma, la toxicidad in vivo y similares. Por consiguiente, se requiere mejorar la función para introducir los ácidos oligonucleicos y superar los problemas asociados a los procedimientos de producción y los efectos secundarios. Con estos antecedentes técnicos, los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar una nueva estructura que tenga baja citotoxicidad, una capacidad para permitir que un ácido nucleico bioactivo penetre dentro de las células, y una capacidad aumentada para regular la expresión génica, y como resultado, han encontrado que un complejo de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico bioactivo unido de manera complementaria a un ácido peptidonucleico vehículo modificado para generalmente estar cargado de manera positiva tiene una permeabilidad celular sorprendentemente aumentada, y la expresión de un gen diana puede regularse muy eficazmente usando el complejo de ácido nucleico.
El documento US5719262-A divulga ácidos peptidonucleicos (APN) que se unen de manera complementaria a cadenas de ADN y ARN más fuertemente que las correspondientes cadenas de ADN o ARN y presentan especificidad y solubilidad aumentada.
De Costa et al., Bioorg. med. Chem. Lett., 24 (10), 2360 - 2363 (2014) divulga que el APN que tiene cadenas laterales de ácido aspártico negativamente cargadas muestra mayor selectividad con ARN, mientras que el APN que tiene cadenas laterales de lisina positivamente cargadas muestra mayor selectividad con ADN.
Sugiyama & Kittaka, Molecules, 18 (1), 287 - 310 (2012) revisa las modificaciones de la cadena principal de los APN para mejorar las propiedades antisentido y antigénicas de los APN, enfocándose en los APN quirales que portan un sustituyente en la cadena principal de N-(2-aminoetil)glicina.
De Costa & Heemstra, PLoS ONE, 8 (3), e58670 (2013) evalúa el efecto de la fuerza iónica sobre la estabilidad del dúplex para APN que tiene cadenas laterales negativa o positivamente cargadas.
Haaima et al., Anger. Chem. Int. Ed., 35 (17), 1939 - 1942 (1996) divulga que APN con cadenas principales funcionalizadas quirales conservan fuertes propiedades de hibridación de ADN y ARN.
Divulgación de la invención
La presente invención se ha realizado para resolver los problemas anteriormente descritos, y es un objetivo de la presente invención proporcionar un complejo de ácido nucleico que comprenda un ácido nucleico bioactivo unido de manera complementaria a un ácido peptidonucleico vehículo modificado para estar generalmente cargado de manera positiva, y el uso del complejo de ácido nucleico para tratar y diagnosticar la enfermedad o en un método para regular la expresión de un gen diana usando el mismo. La invención es como se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un complejo de ácido nucleico de acuerdo con la invención para su uso en un método para tratar las enfermedades.
Para conseguir el objetivo anterior, la presente invención proporciona un complejo de ácido nucleico que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula estructural (1):
[Fórmula estructural (1)]
[A = C <+> ],
En donde
A representa un ácido nucleico bioactivo que tiene una secuencia capaz de unirse a un gen diana;
C representa un ácido peptidonucleico vehículo capaz de unirse al ácido nucleico bioactivo;
"=" representa unión complementaria entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo; el ácido nucleico bioactivo representado por A es un APN (ácido peptidonucleico), y tiene una carga generalmente negativa; C(+> indica que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está cargado de manera positiva; y
el ácido peptidonucleico vehículo comprende uno o más monómeros de ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa para generalmente estar cargado de manera positiva,
en donde los monómeros del ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa comprenden un mayor número de monómeros que tienen un aminoácido positivamente cargado que de monómeros que tienen un aminoácido negativamente cargado de modo que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está cargado de manera positiva; y
en donde el complejo de ácido nucleico generalmente está cargado de manera positiva.
El tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico de la presente invención puede controlarse mediante el control adecuado del balance de carga entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo.
Específicamente, cuando aumentan las cargas positivas del ácido peptidonucleico vehículo, el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico llega a ser más pequeño, pero si las cargas positivas del ácido peptidonucleico vehículo superan un cierto nivel, entonces, el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico llega a ser mayor. Además, el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico se determina por balance de carga apropiado entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo con las cargas del ácido peptidonucleico bioactivo del complejo.
El número de cargas positivas del ácido peptidonucleico vehículo de acuerdo con la presente invención es de 1 a 7 (indicando que se incluyen 2 a 5 monómeros positivamente cargados), preferentemente de 2 a 5, lo más preferentemente de 2 a 3 y el número de cargas negativas netas del ácido nucleico bioactivo para el balance de carga es de 0 a 5, preferentemente de 0 a 3. Sin embargo, como se expone en las reivindicaciones, el ácido nucleico bioactivo tiene una carga generalmente negativa.
El tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico de acuerdo con la invención es de 5 a 300 nm, preferentemente de 10 a 80 nm, lo más preferentemente de 15 a 70 nm.
Por tanto, en el presente documento se divulga un método para controlar el tamaño de partícula de un complejo de ácido nucleico de la presente invención, que comprende controlar el balance de carga del complejo de ácido nucleico, pero no se reivindica.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, una composición para prevenir y tratar la enfermedad, que comprende el complejo de ácido nucleico de la presente invención, una composición para diagnosticar la enfermedad, que comprende el complejo de ácido nucleico de la presente invención y una composición para regular la expresión de un gen diana, que comprende el complejo de ácido nucleico de la presente invención.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, un kit para diagnosticar la enfermedad, que comprende el complejo de ácido nucleico de la presente invención.
En el presente documento también se describe un método in vitro para regular la expresión de un gen diana que usa un complejo de acuerdo con la presente invención, comprendiendo el método las etapas de: (a) formar el complejo de acuerdo con la presente invención uniendo un ácido nucleico bioactivo a un ácido peptidonucleico vehículo; y (b) introducir el complejo de acuerdo con la presente invención en células diana poniendo en contacto el complejo de acuerdo con la presente invención con las células diana.
La presente invención también proporciona un complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención para su uso en un método para prevenir o tratar la enfermedad.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra una comparación del tamaño de partícula entre un ácido nucleico bioactivo monocatenario y un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico bioactivo unido en paralelo a un ácido peptidonucleico vehículo.
(A) : un ácido nucleico bioactivo solo;
(B) : un complejo de ácido nucleico que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo unido en paralelo a un ácido peptidonucleico vehículo.
Las FIG. 2a y 2b son fotografías de SEM que muestran los resultados de la observación de los cambios en la morfología y el tamaño de las partículas del complejo con una carga en las propiedades eléctricas del ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo del complejo de ácido nucleico.
(A) : El dúplex de APN 1 (un complejo de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 6) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 32));
(B) : El dúplex de APN 2 (un complejo de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 5) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 32));
(C) : El dúplex de APN 3 (un complejo de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 1) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 37));
(D) : El dúplex de APN 4 (un complejo de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 1) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 23)).
Las FIG. 3a a 3c son fotografías tomadas bajo un microscopio confocal para analizar la permeabilidad celular de un complejo de ácido nucleico de acuerdo con la unión entre un ácido peptidonucleico bioactivo y un ácido peptidonucleico vehículo y sus propiedades eléctricas.
(a): el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ácido peptidonucleico bioactivo no cargado (SEQ ID NO: 13) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 38));
(b) : el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ácido peptidonucleico bioactivo cargado (SEQ ID NO: 13) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 40)); y
(c) : el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ácido peptidonucleico bioactivo que tenía diferentes cargas y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 40)) que tenía tres cargas positivas;
(1) : el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 15) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 40));
(2) : el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 16) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 40));
(3) : el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 14) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 40)); y
(4) : el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 17) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 40)).
La FIG. 4 muestra los resultados de la observación de la presencia o ausencia intracelular de un complejo de ácido peptidonucleico bioactivo con el paso del tiempo cuando se usó APN como un ácido peptidonucleico vehículo en un complejo de ácido nucleico.
Las FIG. 5a a 5f muestran los resultados de la observación de si un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo y un ácido peptidonucleico vehículo, se separaría en las células con el paso del tiempo.
(a) : un complejo de control;
(b) : una figura que muestra que un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 14) y un ácido peptidonucleico vehículo (Se Q ID NO: 39)) mantiene una forma de complejo en las células después de 24 horas;
(c) : una figura que muestra que un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 14) y un ácido peptidonucleico vehículo (s Eq ID NO: 39)) mantiene una forma de complejo o se separa en las células después de 48 horas;
(d) : una figura que muestra que un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 14) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 39)) se separa en el ácido peptidonucleico vehículo y el ácido nucleico bioactivo en las células después de 72 horas;
(e) : una figura que muestra que un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 14) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 39)) se separa en el ácido peptidonucleico vehículo y el ácido nucleico bioactivo en las células después de 96 horas; y
(f) : una figura que muestra que un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 13) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 39)) se separa en el ácido peptidonucleico vehículo y el ácido nucleico bioactivo en las células después de 120 horas y, a continuación, se mantiene en las células.
Las FIG. 6a a 6g muestran los resultados de la microscopia confocal realizada para examinar la eficacia de permeación intracelular cuando se usó un ARNip sencillo solo y cuando se usó un complejo que comprendía un ARNip sencillo y un APN como un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 39).
(a) : el caso en el que se usó un ARNip; y
(b) a (g): el caso en el que se usó un complejo que comprendía un ARNip sencillo y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 39)).
La FIG. 7 muestra que la expresión de la survivina y proteínas posteriores en diferentes líneas celulares cancerosas se inhibe por un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de survivina.
(A) : los resultados de un experimento de uso de la línea celular HeLa;
(B) : los resultados de un experimento de uso de la línea celular SW480; y
(C) : los resultados de un experimento de uso de la línea celular SK-BR-3.
Las FIG. 8a a 8c muestran que la expresión de survivina y sus proteínas posteriores en diferentes líneas celulares cancerosas se inhibe por un complejo de ácido nucleico que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de survivina.
(a) : los resultados de un experimento realizado en la línea celular SW480 usando un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo no cargado (SEQ ID NO: 1) y un ácido peptidonucleico que tiene diferentes cargas;
(b) : los resultados de un experimento realizado en la línea celular SW480 usando un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 2) y un ácido peptidonucleico que tiene diferentes cargas; (c) : los resultados de un experimento realizado en la línea celular SW480 usando un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 6) y un ácido peptidonucleico que tiene diferentes cargas; (d) : los resultados de un experimento realizado en la línea celular SW480 usando un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 12) y un ácido peptidonucleico que tiene diferentes cargas; y (e): los resultados de un experimento realizado en la línea celular SK-BR-3 usando un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 12) y un ácido peptidonucleico que tiene diferentes cargas.
Las FIG. 9a y 9b muestran el cambio en la viabilidad celular con los cambios en las longitudes de un ácido peptidonucleico bioactivo y un ácido peptidonucleico vehículo en el complejo de ácido nucleico.
(a) : el cambio en la viabilidad celular con un cambio en la longitud de un ácido peptidonucleico vehículo; y (b) : el cambio en la viabilidad celular con un cambio en la longitud de un ácido peptidonucleico bioactivo.
Las FIG. 10a y 10b muestran el cambio en la viabilidad celular de una línea celular de cáncer colorrectal por un complejo de ácido nucleico que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de survivina, y muestra que la expresión de survivina y sus proteínas posteriores en la línea celular se inhibe por el complejo de ácido nucleico.
(a) : un cambio en la viabilidad celular; y
(b) : un cambio en la expresión de survivina y sus proteínas posteriores.
Las FIG. 11a a 11e muestran los resultados de la evaluación del efecto inhibidor del crecimiento tumoral de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de survivina, en ratones trasplantados con una línea celular de cáncer colorrectal humana.
(a) : cambios en el peso corporal de ratón;
(b) : cambios en el volumen del tumor;
(c) : cambios en el peso corporal del tumor;
(d) : cambios en el aspecto del tumor; y
(e) : cambios en el marcador de hepatotoxicidad.
Las FIG. 12a a 12c muestran que el uso de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de VEGF, cambia la viabilidad celular de una línea celular de cáncer de mama humana y una línea celular de cáncer de pulmón, inhibe la expresión de VEGF y sus proteínas posteriores, e induce la apoptosis.
(a) : cambios en la viabilidad celular;
(b) : cambios en la expresión de VEGF y sus proteínas posteriores; y
(c) : análisis de la apoptosis inducida por inhibición de VEGF. La FIG. 13 muestra los resultados de la evaluación del efecto farmacológico anticanceroso de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de VEGF, mediante el uso de peces cebra como modelos.
Las FIG. 14a y 14b muestran que el uso de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de VEGF, presenta el efecto de la inhibición de la viabilidad celular de células epiteliales pigmentarias retinianas humanas y la inhibición de la expresión de VEGF y sus proteínas posteriores en las células.
(a) : cambios en la viabilidad celular; y
(b) : cambios en la expresión de VEGF y sus proteínas posteriores.
Las FIG. 15a y 15b muestran que el uso de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de IFI16, presenta los efectos de inhibición de la viabilidad celular de queratinocitos epidérmicos humanos e inhibición de la expresión de IFI16 y sus proteínas posteriores en las células.
(a) : cambios en la viabilidad celular; y
(b) : cambios en la expresión de IFI16 y sus proteínas posteriores.
Las FIG. 16a a 16c muestran los resultados de la evaluación del efecto de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico de IFI16, sobre modelos de ratón inducidos por psoriasis.
(a) : fotografías que muestran los cambios del grosor de oreja y los resultados de la medición del grosor de oreja;
(b) : cambios en la expresión de IFI16 y sus proteínas posteriores; y
(c) : resultados de la biopsia que muestran los cambios en los queratinocitos epidérmicos en el tejido de la oreja.
La FIG. 17 muestra los resultados de la evaluación del efecto de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico a PD-L1, sobre la inhibición de PD-L1 y su proteína posterior en una línea celular de cáncer de mama humana. La FIG. 18 muestra los resultados de un experimento realizado para examinar si el uso de un complejo de ácido nucleico, que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo específico a acpP, inhibe el crecimiento de bacterias.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende generalmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los métodos experimentales, que se describirán a continuación, son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica.
En lo sucesivo en el presente documento, se describirá en detalle la presente invención.
La presente invención se dirige a un complejo de ácido nucleico que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula estructural (1):
[Fórmula estructural (1)]
[A = C <+> ],
En donde
A representa un ácido nucleico bioactivo que tiene una secuencia capaz de unirse a un gen diana;
C representa un ácido peptidonucleico vehículo capaz de unirse al ácido nucleico bioactivo;
"=" representa unión complementaria entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo; el ácido nucleico bioactivo representado por A es un APN (ácido peptidonucleico), y tiene una carga generalmente negativa; C(+> indica que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está cargado de manera positiva; y
el ácido peptidonucleico vehículo comprende uno o más monómeros de ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa para generalmente estar cargado de manera positiva,
en donde los monómeros del ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa comprenden un mayor número de monómeros que tienen un aminoácido positivamente cargado que de monómeros que tienen un aminoácido negativamente cargado de modo que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está cargado de manera positiva; y
en donde el complejo de ácido nucleico generalmente está cargado de manera positiva.
Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico bioactivo" se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria capaz de unirse a un gen diana cuya expresión se va a reducir, particularmente una secuencia complementaria capaz de unirse al ARNm de este gen diana, o que comprende una secuencia que fomenta la expresión de un gen diana que se va a expresar. Específicamente, se refiere a un ácido nucleico que está implicado en la regulación de la expresión génica, por ejemplo, inhibiendo o fomentando la expresión del gen de interés. Puede ser un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a un gen diana cuya expresión se va a disminuir o aumentar, o puede ser un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria de la secuencia de un ARN monocatenario, tal como pre-ARNm, miARN, ARNm o similares.
En particular, el "ácido nucleico bioactivo" en la presente invención puede unirse a un gen diana o una secuencia de nucleótidos que comprende el mismo in vitro o in vivo, activando o inhibiendo de este modo la función característica del gen diana (por ejemplo, la expresión del transcrito o la expresión de la proteína) o regulando el corte y empalme del pre-ARNm (por ejemplo, saltando exones), en donde la secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia reguladora del gen, o una secuencia codificante del gen, o una secuencia reguladora del corte y empalme. La secuencia reguladora del gen puede seleccionarse entre un promotor, un potenciador transcripcional, una región no traducida en 5', una región no traducida en 3', una secuencia de encapsidación vírica y un marcador de selección. La secuencia codificante del gen puede ser un exón o un intrón, y la secuencia codificante del gen puede estar localizada dentro de 10, 5, 3 o 1 kb o 500, 300 o 200 pb desde el sitio de iniciación de la transcripción del gen. Por ejemplo, puede localizarse en dirección 5' o dirección 3' del sitio de iniciación. Asimismo, la secuencia reguladora del corte y empalme puede comprender una secuencia asociada con el salto de exones, el corte y empalme encriptado, la activación del sitio de pseudo corte y empalme, la retención de intrones o la desregulación del corte y empalme alternativo.
Como se usa en el presente documento, el término "ácido peptidonucleico vehículo" se refiere a un ácido nucleico cuyas bases se unen parcial o completamente de manera complementaria al ácido nucleico bioactivo, impartiendo de este modo la funcionalidad.
En la presente invención, cada uno del ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo puede comprender de 2 a 50, preferentemente de 5 a 30, más preferentemente de 10 a 25, lo más preferentemente de 15 a 17 monómeros de ácido nucleico.
En particular, el ácido peptidonucleico vehículo puede comprender una o más bases universales, y el ácido peptidonucleico vehículo también puede estar completamente compuesto de bases universales.
En la presente invención, si un monómero usado en el ácido nucleico bioactivo es APN, entonces, el ácido nucleico bioactivo se denomina ácido peptidonucleico bioactivo.
En la presente invención, el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo pueden comprender además uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en fosfodiéster, 2'-O-metilo, 2'-metoxi-etilo, fosforamidato, metilfosfonato) y fosforotioato.
El término "generalmente", como se usa cuando se expresa la propiedad eléctrica, no significa la propiedad eléctrica de las bases individuales, sino que significa las propiedades eléctricas globales del ácido nucleico bioactivo o el ácido peptidonucleico vehículo cuando se ven externamente.
Por ejemplo, si el número de monómeros negativamente cargados en el ácido nucleico bioactivo es mayor aunque algunos monómeros en el ácido nucleico bioactivo estén positivamente cargados, entonces el ácido nucleico bioactivo está cargado negativamente cuando "generalmente" se ve la propiedad eléctrica.
Si el número de bases y/o cadenas principales positivamente cargadas en el ácido peptidonucleico vehículo es mayor aunque algunas bases y/o cadenas principales en el ácido peptidonucleico vehículo estén negativamente cargadas, entonces el ácido peptidonucleico vehículo está cargado positivamente cuando "generalmente" se ve la propiedad eléctrica. Como se expone en las reivindicaciones, el complejo de acuerdo con la presente invención comprende un ácido peptidonucleico vehículo que generalmente está cargado de manera positiva.
La propiedad eléctrica del ácido peptidonucleico vehículo se imparte usando un monómero de ácido peptidonucleico modificado, como se expone en las reivindicaciones. La propiedad eléctrica del ácido nucleico bioactivo se puede impartir usando un monómero de ácido peptidonucleico modificado. El monómero de ácido peptidonucleico modificado puede comprender uno o más aminoácidos positivamente cargados seleccionados del grupo que consiste en lisina (Lys, K), arginina (Arg, R), histidina (His, H), ácido diamino butírico (DAB), ornitina (Orn) y un análogo de aminoácido, como ácidos peptidonucleicos vehículo positivamente cargados. Además, el monómero de ácido peptidonucleico modificado puede comprender uno o más aminoácidos negativamente cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido glutámico (Glu, E), es decir, un aminoácido negativamente cargado y un análogo de aminoácido, como ácidos peptidonucleicos vehículo negativamente cargados.
Como se expone en las reivindicaciones, el ácido peptidonucleico vehículo comprende uno o más monómeros de ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa para generalmente estar cargado de manera positiva, en donde los monómeros de ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa comprenden un número mayor de monómeros que tienen un aminoácido positivamente cargado que de monómeros que tienen un aminoácido negativamente cargado de modo que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está cargado de manera positiva. En particular, los monómeros de ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa pueden comprender uno o más aminoácidos positivamente cargados seleccionados del grupo que consiste en lisina (Lys, K), arginina (Arg, R), histidina (His, H), ácido diamino butírico (DAB), ornitina (Orn) y un análogo de aminoácido en su cadena principal para ser eléctricamente positivo.
La modificación de los monómeros del ácido peptidonucleico para impartir las cargas puede realizarse usando monómeros del ácido peptidonucleico modificados en nucleobase además de la modificación de la cadena principal.
Preferentemente, el ácido peptidonucleico vehículo puede comprender una fracción de amina, triazol o imidazol en su nucleobase para ser eléctricamente positivo o puede comprender ácido carboxílico en su nucleobase para ser eléctricamente negativo.
Como se expone en las reivindicaciones, los monómeros del ácido nucleico modificados del ácido peptidonucleico vehículo pueden comprender además cargas negativas en la cadena principal o la nucleobase, pero los monómeros del ácido peptidonucleico modificados comprenden un mayor número de monómeros positivamente cargados que de monómeros negativamente cargados de modo que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está positivamente cargado.
Como se expone en las reivindicaciones, el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención generalmente está cargado de manera positiva.
En el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la invención, una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en una fracción hidrófoba, una fracción hidrófila, un anticuerpo específico a antígeno diana, un aptámero, un inhibidor de fluorescencia ("quencher"), y un marcador fluorescente/luminiscente pueden unirse al ácido nucleico bioactivo y/o al ácido peptidonucleico vehículo. Preferentemente, una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en la fracción hidrófoba, la fracción hidrófila, el anticuerpo específico a antígeno diana, el aptámero y el marcador fluorescente/luminiscente para obtener imágenes pueden unirse al ácido peptidonucleico vehículo.
En la presente invención, la unión de una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en una fracción hidrófoba, la fracción hidrófila, el anticuerpo específico a antígeno diana, el aptámero, el inhibidor de fluorescencia, el marcador fluorescente y el marcador luminiscente al ácido nucleico bioactivo y/o el ácido peptidonucleico vehículo puede realizarse mediante un enlace covalente sencillo o un enlace covalente mediado por enlazador, aunque no de forma limitativa (véase la tabla 1). Preferentemente, la permeación celular, la solubilidad, la estabilidad, la administración y las sustancias relacionadas con la obtención de imágenes (por ejemplo, fracción hidrófoba, etc) unidas al vehículo de ácido nucleico están presentes independientemente del ácido nucleico bioactivo que regula la expresión de un gen diana.
En la presente invención, la unión complementaria del ácido nucleico puede en gran parte clasificarse en unión antiparalela y unión paralela. La unión complementaria del ácido nucleico se configura de modo que se libera en presencia de una secuencia identificada por el ácido nucleico bioactivo (una secuencia complementaria al ácido nucleico bioactivo).
La unión antiparalela y la unión paralela se determinan de acuerdo con la orientación 5' y la orientación 3' en la unión ADN-ADN o ADN-APN. La unión antiparalela es un método de unión general ADN-ADN o ADN-APN. Tomando el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como ejemplo, la unión antiparalela significa que el ácido nucleico bioactivo en la dirección 5' a 3' y el ácido peptidonucleico vehículo en la dirección 3' a 5' se unen entre sí, y la unión paralela muestra una afinidad de unión de alguna manera inferior que la unión antiparalela, y significa que el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo se unen entre sí en la dirección 5' a 3' o la dirección 3' a 5'.
Preferentemente, en el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la afinidad de unión (temperatura de fusión (Tm)) entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo puede ser inferior que la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y un gen identificado por el ácido nucleico bioactivo, particularmente el ARNm del gen diana.
Como ejemplo específico para permitir que la afinidad de unión (temperatura de fusión (Tm)) entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo sea inferior que la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y un gen identificado por el ácido nucleico bioactivo, particularmente el ARNm del gen diana, el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo pueden unirse entre sí mediante unión paralela o unión específica parcial de modo que la afinidad de unión (temperatura de fusión (Tm)) entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo es menor que la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y un gen identificado por el ácido nucleico bioactivo, particularmente el ARNm del gen diana, aunque no de forma limitativa.
Como ejemplo adicional, el ácido peptidonucleico vehículo puede tener un enlazador, una base universal, y al menos una nucleobase peptídica seleccionada de las nucleobases peptídicas que no son complementarias a las bases correspondientes del ácido nucleico bioactivo de modo que la afinidad de unión (temperatura de fusión (Tm)) entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo es menor que la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y un gen identificado por el ácido nucleico bioactivo, particularmente el ARNm del gen diana (véase la tabla 1),
La base universal que puede usarse en la presente invención puede ser una o más seleccionadas del grupo que consiste en bases naturales, incluyendo adenina, guanina, citosina, timina y uracilo e inosina APN, indol APN, nitroindol APN y abásica, que son bases que se unen sin selectividad y tienen menor afinidad de unión que la afinidad de unión complementaria. Preferentemente, puede usarse inosina APN como la base universal.
T l 1: E m l ni n nr l i n l i i iv l i i n l i v hí l
Figure imgf000009_0001
continuación
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En la anterior Tabla 1, N representa las nucleobases (ATGC); * representa una secuencia que no es complementaria a una secuencia de ácido nucleico antisentido; $ representa una base universal; = representa un enlazador; y 5' y 3' representa las orientaciones del ácido nucleico (bases).
En el presente documento se divulga una combinación de la forma de unión y la propiedad eléctrica de los ácidos nucleicos para regular la función del complejo de ácido nucleico. Como se divulga en el presente documento, la combinación de la forma de unión y la propiedad eléctrica de los ácidos nucleicos puede controlar el tamaño de partícula y el tiempo de acción y puede aumentar la permeabilidad celular, la solubilidad y la especificidad.
En particular, el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico puede controlarse mediante el control de las cargas del ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo, y el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico puede disminuirse a través de un balance de carga apropiado entre un número adecuado de cargas positivas del ácido peptidonucleico vehículo y las cargas del ácido peptidonucleico bioactivo.
Mientras tanto, el momento en el que el ácido peptidonucleico bioactivo se une a una secuencia diana en presencia de un gen diana (el tiempo de desplazamiento de la cadena del ácido nucleico bioactivo a la secuencia diana, y el tiempo de liberación específica a diana y la unión del ácido nucleico bioactivo) puede controlarse mediante el control de la afinidad de unión entre el ácido peptidonucleico vehículo y el ácido peptidonucleico bioactivo.
En otras palabras, en el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la invención, el tiempo de desplazamiento de la cadena del ácido nucleico bioactivo hacia un gen diana y la liberación específica a diana y la unión del ácido nucleico bioactivo pueden controlarse por las bases no específicas del ácido peptidonucleico vehículo para la unión no específica del complejo, las bases universales, la presencia o ausencia de un enlazador, y el número y la posición de las bases, y también puede controlarse mediante una combinación de estas condiciones con la unión paralela o antiparalela que es la unión complementaria en el complejo.
El complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede prepararse hibridando el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo en condiciones apropiadas.
Como se usa en el presente documento, el término "hibridación" significa que los ácidos nucleicos monocatenarios complementarios forman un ácido nucleico bicatenario. La hibridación puede suceder cuando la complementariedad entre dos cadenas de ácido nucleico es coincidencia perfecta o cuando existen algunos residuos con apareamiento incorrecto. El grado de complementariedad necesario para la hibridación puede variar dependiendo de las condiciones de hibridación, particularmente puede controlarse uniendo la temperatura.
El ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo de acuerdo con la presente invención puede tener un indicador y un inhibidor de fluorescencia unido a ambos extremos. El inhibidor de fluorescencia puede amortiguar la fluorescencia del indicador. El indicador puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en FAM (6-carboxifluoresceína), rojo Texas, HEX (2', 4', 5', 7', -tetracloro-6-carboxi-4,7-diclorofluoresceína), y Cy5. El inhibidor de fluorescencia puede ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en TAMRA (6-carboxitetrametil-rodamina), BHQ1, BHQ2 y Dabcyl, aunque no de forma limitativa.
El ácido peptidonucleico vehículo puede formar un enlace hidrógeno complementario con el ácido nucleico bioactivo y administrar el ácido nucleico bioactivo en las células, y el ácido nucleico bioactivo puede unirse a un gen diana y regular la expresión del gen diana.
Como se usa en el presente documento, la expresión "gen diana" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (secuencia de nucleótidos) a activar, inhibir o marcar, y no es diferente de y se usa indistintamente con la expresión "ácido nucleico diana".
Si el ácido nucleico diana (secuencia de nucleótidos) que comprende el gen diana se pone en contacto (se une) con el complejo in vitro o in vivo, entonces, el ácido nucleico bioactivo se separa del ácido peptidonucleico vehículo y presenta la actividad biológica.
La presente invención también se dirige al complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención para su uso en un método para prevenir o tratar la enfermedad.
En el presente documento también se describe un método in vitro para regular la expresión de un gen diana, que comprende usar el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Las enfermedades que pueden prevenirse, tratarse o diagnosticarse usando el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede determinarse dependiendo de un gen diana al cual se une el ácido nucleico bioactivo en el complejo de ácido nucleico de la presente invención. Preferentemente, las enfermedades son cánceres o tumores, aunque no de forma limitativa.
La expresión "composición para el tratamiento" puede usarse indistintamente con una composición farmacéutica, y la composición comprende, como un principio activo, un complejo de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico bioactivo y un ácido nucleico bioactivo vehículo unido al mismo.
La composición para tratamiento divulgada en el presente documento, pero no reivindicada, puede formularse en una forma farmacéutica oral o parental de acuerdo con las prácticas farmacéuticas convencionales. La formulación puede contener un aditivo tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable, un excipiente, un suplemento, o un diluyente además del principio activo.
La expresión "fisiológicamente aceptable" significa la propiedad de que no altera la actividad biológica y las propiedades físicas de un compuesto.
La expresión "vehículo" se define como un compuesto que facilita la adición del complejo en las células o los tejidos. Por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) es un vehículo que comúnmente se usa para facilitar la penetración de un número de compuestos orgánicos en las células o los tejidos de los organismos.
El término "diluyente" se define como un compuesto que no solo estabiliza la forma biológicamente activa del compuesto diana, sino también un compuesto que se diluye en el agua en el que se disolvió. Las sales disueltas en la solución tampón se usan como diluyentes en la técnica relacionada. Una solución tampón comúnmente usada es solución salina tamponada con fosfato debido a que imita la condición de las sales en una solución humana. Puesto que las sales tampón pueden controlar el pH de la solución a baja concentración, la actividad biológica de los compuestos raramente se alteran por los diluyentes tampón.
Los compuestos que contienen el complejo usado en el presente documento pueden administrarse a un paciente humano por sí solo, o en composiciones farmacéuticas donde se mezclan con otros principios activos, como en terapia de combinación, o vehículos o excipientes adecuados.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en los métodos divulgados, pero no reivindicados, en el presente documento incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir su fin previsto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de un compuesto eficaz para prevenir, estabilizar, aliviar o mejorar los síntomas de la enfermedad, o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión "prevención" o "tratamiento" se refiere a todas las acciones que presentan actividad anticancerosa e inhiben el crecimiento del cáncer o el retraso del desarrollo del cáncer mediante la administración (o aplicación) de una composición farmacéutica que comprende el complejo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Como se usa en el presente documento, la expresión "tratar" o "tratamiento" se refiere a todas las acciones que alivian o curan perfectamente el cáncer mediante la administración (o aplicación) de una composición farmacéutica que comprende el complejo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las enfermedades que pueden prevenirse o tratarse por una composición que comprende el complejo de ácido nucleico de la presente invención no están particularmente limitadas. Ejemplos de las enfermedades pueden incluir preferentemente, pero sin limitación, tumores o cánceres, enfermedades inflamatorias, degeneración macular relacionada con la edad, sordera y dermatopatías.
Las enfermedades que pueden tratarse mediante una composición para el tratamiento que comprende el complejo de ácido nucleico de la presente invención se determinan mediante un gen diana al que se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nucleico. Ejemplos de un gen diana para la terapia contra el cáncer, al cual se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nucleico, incluyen Survivina, VEGF, Receptor de andrógenos, KRAS, Clusterina, TGFpR2, ERBB3, Transglutaminasa 2, ABCB1, Hsp27, STAT3, PD-L1 y similares.
Un gen que marca las enfermedades inflamatorias es DE4B o Pellino-1, un gen que marca las enfermedades raras y enfermedades graves es SMN2, ApoB-100, ICAM-1, ApoCIII, TDR, HTT, GHr, SOD1, ANGPTL3, PKK, miR-21, TMPRSS6, FMR1 o Connexin 26, un gen que marca las enfermedades cardiovasculares es el Factor XI, Apo(a) o ApoCIII, AG, un gen que marca las enfermedades metabólicas es GCGR, ANGPTL3, miR-103/107 o DGAT2 y un gen que marca las dermatopatías es IFI16, TLR6 o TIEG1, pero los ejemplos de los genes no se limitan a los mismos.
La composición para tratamiento divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento puede formularse sola o junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable como se describe a continuación, en una forma farmacéutica parental u oral por un método conocido. Ejemplos específicos de dicha formulación incluyen formulaciones orales tales como una formulación inyectable, una formulación de cápsula blanda, una formulación de cápsula dura, una formulación de comprimido, y una formulación de jarabe, o agentes para las aplicaciones externas.
Preferentemente, la composición para tratamiento divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento que comprende el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede prepararse y usarse en una forma farmacéutica parenteral. Ejemplos de formas farmacéuticas parenterales adecuadas incluyen, pero sin limitación, solución o formulaciones liofilizadas adecuadas para la inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intramuscular o inyección intratorácica.
En aún en otro aspecto, el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede administrarse por vía de administración cutánea. La formulación para la administración cutánea puede seleccionarse del grupo que consiste en solución acuosa, crema y pomada, aunque no de forma limitativa, y pueden usarse todos los tipos de formulaciones para la administración cutánea, que se conocen en la técnica relacionada.
Para formular la composición para tratamiento divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento en una forma farmacéutica parenteral, la composición comprende el complejo de ácido nucleico de la presente invención, y puede ser uno seleccionado de entre solución salina fisiológica, agua estéril, solución de Ringer, solución salina tamponada, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerol, etanol y una mezcla de dos o más de los mismos. Si es necesario, la composición puede contener otros aditivos convencionales tales como un antioxidante, un tampón y un agente bacteriostático. Además, un diluyente, un agente dispersante, un tensioactivo, un aglutinante y un lubricante puede añadirse adicionalmente a la composición que se va a preparar en una formulación inyectable tal como una solución acuosa, una suspensión o una emulsión. Particularmente, la composición preferentemente se proporciona como una formulación liofilizada. Para la preparación de una formulación liofilizada, puede usarse un método convencional conocido en el campo técnico al que pertenece la presente invención, y también puede añadirse un estabilizador para la liofilización. Asimismo, la composición preferentemente puede formularse de acuerdo con las enfermedades o los componentes mediante un método adecuado conocido en la técnica o mediante un método divulgado en Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
Además, la composición para tratamiento divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento puede formularse en formas farmacéuticas orales, incluidos polvos, comprimido, cápsula, líquido, solución inyectable, pomada y formulaciones de jarabe. En este caso, se pueden añadir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables a la composición.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, una composición para tratar cáncer, que comprende el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Los tumores o cánceres que pueden tratarse mediante la composición divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento no están particularmente limitados, pero incluyen tanto cánceres sólidos como cánceres sanguíneos. Preferentemente, los tumores o cánceres incluyen todos los tipos de cánceres en los que se expresa un gen diana (por ejemplo, survivina (una nueva diana para la terapia contra el cáncer. Cáncer Treat Rev. 35(7):553-62, 2009). Más preferentemente, el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer bronquial, cáncer nasofaríngeo, cáncer laríngeo, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de cuello del útero, cáncer de cerebro, cáncer de próstata, cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer paratiroideo, cáncer renal, cáncer de esófago, cáncer del tracto biliar, cáncer de testículos, cáncer rectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer ureteral, osteosarcoma, neurocitoma, melanoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, astrocitoma, neuroblastoma y neuroglioma.
Preferentemente, un gen diana, al cual se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nucleico para tratar el cáncer de acuerdo con la presente invención, puede ser uno cualquiera o más seleccionados del grupo que consiste en Survinina, VEGF, Receptor de andrógenos, KRAS, Clusterina, TGFpR2, ERBB3, Transglutaminasa 2, ABCB1, Hsp27, STAT3 y PD-L, aunque no de forma limitativa.
Preferentemente, la composición para tratar el cáncer divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento comprende: un ácido peptidonucleico bioactivo específico de survivina que tiene una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 18; y un ácido peptidonucleico vehículo complementario a las mismas. El ácido peptidonucleico vehículo preferentemente puede tener una secuencia cualquiera seleccionada entre las SEQ ID NO: 19 a 40 y una porción de la secuencia puede sustituirse por bases universales.
Además, una composición para tratar el cáncer divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento comprende: un ácido peptidonucleico bioactivo específico de VEGF representado por la SEQ ID NO: 41 o un ácido peptidonucleico bioactivo específico de PD-L1 representado por la SEQ ID NO: 49; y un ácido peptidonucleico vehículo complementario a las mismas. El ácido peptidonucleico vehículo preferentemente puede tener una secuencia de SEQ ID NO: 42, 43 (VEGF) o 50 (PD-L1), y una porción de la secuencia puede sustituirse por bases universales.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, una composición para tratar la degeneración macular relacionada con la edad, que comprende el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Un gen diana, al cual se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nuclei degeneración macular asociada a la edad, puede ser VEGF, aunque no de forma limitativa.
Preferentemente, la composición para tratar la degeneración macular relacionada con la edad divulgada, pero no reivindicada, en el presente documento comprende: un ácido peptidonucleico bioactivo específico de VEGF representado por la SEQ ID NO: 41; y un ácido peptidonucleico vehículo complementario a las mismas. El ácido peptidonucleico vehículo preferentemente puede tener una secuencia de SEQ ID NO: 42 o 43 y una porción de la secuencia puede sustituirse por bases universales.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, una composición para prevenir o tratar dermatopatías, que comprende el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Ejemplos de las dermatopatías incluyen, pero sin limitación, psoriasis, dermatopatías relacionadas con la pigmentación y enfermedades atópicas. Un gen diana, al cual se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nucleico, puede ser uno cualquiera o más seleccionados del grupo que consiste en IFI16, TLR6 y TIEG1, aunque no de forma limitativa.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, una composición para tratar psoriasis. La composición para tratar psoriasis comprende: un ácido peptidonucleico bioactivo específico de IFI16 que tiene una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 44 a 47; y un ácido peptidonucleico vehículo complementario a las mismas. El ácido peptidonucleico vehículo preferentemente puede tener una secuencia de SEQ ID NO: 48 y una porción de la secuencia puede sustituirse por bases universales.
Una composición para prevenir o tratar las dermatopatías pueden prepararse en formulaciones tales como solución acuosa, crema, gel, pasta, loción y pomada, aunque no de forma limitativa.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, una composición para tratar enfermedades inflamatorias, que comprende el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Un gen diana, al cual se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nuclei
inflamatorias, puede ser uno cualquiera o más seleccionados del grupo que consiste en PDE4B y Pellino-1, pero sin limitación.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, una composición para tratar enfermedades raras y enfermedades graves, que comprende el complejo de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Un gen diana, al cual se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nucleico para tratar enfermedades raras y enfermedades graves, puede ser uno cualquiera o más seleccionados del grupo que consiste en SMN2, ApoB-100, ICAM-1, ApoCIII, TDR, HTT, GHr, SOD1, ANGPTL3, PKK, miR-21, TMPRSS6, FMR1 o Conexina 26, pero sin limitación.
Preferentemente, las enfermedades raras y las enfermedades graves son la sordera, y un gen diana, al cual se une el ácido nucleico bioactivo contenido en el complejo de ácido nucleico, puede ser Conexina 26.
El complejo de la presente invención pueden administrarse (o aplicarse) por un vehículo tal como liposoma. El liposoma puede ayudar en el direccionamiento del complejo hacia un tejido específico, tal como tejido linfoide, o específicamente el direccionamiento del complejo hacia células infectadas, y pueden ayudar también a aumentar la semivida de la composición que comprende el complejo. Ejemplos del liposoma incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas lamelares y similares. En estas preparaciones, el complejo a administrar se incorpora como parte de un liposoma, solo o junto con una molécula a la que se une, por ejemplo, un receptor prevalente entre las células linfoides, tal como anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas. Por tanto, los liposomas cargados o decorados con un complejo deseado de la invención pueden dirigirse al sitio de las células linfoides.
Los liposomas para su uso en la presente invención se forman a partir de lípidos formadores de vesículas convencionales, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros y cargados negativamente y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía por la consideración de, por ejemplo, el tamaño del liposoma, la labilidad ácida y la estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Diversos métodos disponibles para preparar liposomas. Por ejemplo, pueden usarse métodos como se divulga en la bibliografía [Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng, 9:467, 1980), y las patentes de EE.UU. N.° 4.235.871,4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
En una realización, la presente invención proporciona el complejo de la presente invención para su uso en un método para tratar y suprimir (o aliviar) la enfermedad administrando (o aplicando) el complejo al sujeto.
Un enfermedad que puede tratarse usando el complejo de la presente invención se determina de acuerdo con las características del ácido nucleico bioactivo usado, y está particularmente limitado.
Ejemplos de enfermedades que pueden tratarse usando el complejo de la presente invención incluyen cáncer, enfermedad relacionada con el crecimiento anormal de los vasos sanguíneos tal como la degeneración macular, dermatopatías, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias y similares, aunque no de forma limitativa.
Como se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición que comprende el complejo de acuerdo con la presente invención puede administrarse (o aplicarse) en una cantidad farmacéuticamente eficaz con el fin de tratar enfermedades cancerosas o suprimir (o aliviar) síntomas cancerosos. La cantidad de aplicación/dosis de la composición farmacéutica de la presente invención puede variar dependiendo de diferentes factores tales como el tipo de dermatopatías relacionadas con la pigmentación, la edad, un peso corporal, las características y el grado de los síntomas de un paciente, el tipo de método de tratamiento actual, una frecuencia de tratamiento, una forma de administración (aplicación) y una vía, y similares, y puede ser determinada fácilmente por los expertos en la materia en la técnica relacionada. La composición puede administrarse (aplicarse) junto con el ingrediente farmacológico o fisiológico, o administrarse (aplicarse) secuencialmente. Además, la composición también puede administrarse (aplicarse) junto con agentes terapéuticos adicionales convencionales, y secuencial o simultáneamente con el agente terapéutico convencional. La administración (aplicación) puede ser administración (aplicación) de dosis única o administración (aplicación) de dosis múltiple.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero que padece de una condición o enfermedad que puede aliviarse, suprimirse o tratarse mediante la administración (aplicación) del complejo de la presente invención, o que está en riesgo de desarrollar esta afección o enfermedad. Preferentemente, se refiere a un ser humano.
Además, la dosis (cantidad de aplicación) del compuesto de la invención al cuerpo humano puede variar dependiendo de la edad, el peso corporal, el sexo, la forma de administración (aplicación), el estado de salud y la gravedad de la enfermedad de un paciente. Basándose en un peso de un paciente adulto de 70 kg, generalmente es de 0,001 a 1.000 mg/día, preferentemente de 0,01 a 500 mg/día. Dependiendo del criterio de un doctor o farmacéutico, se puede administrar (aplicar) una vez o varias veces al día en un intervalo de tiempo predeterminado.
Para cualquier compuesto o una mezcla que comprende el mismo usado en los métodos descritos en el presente documento, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluye la CI50 (concentración inhibidora semimáxima) o la CE50 (concentración eficaz semimáxima) como se determina en el cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica del complejo descrito en el presente documento o una mezcla que comprende el mismo puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en los cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis mortal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de DE50 (o CI50)/DL50. Se prefieren compuestos que muestran índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosis para su uso en seres humanos. Las dosificaciones de estos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 (o CI50) con poca o ninguna toxicidad.
En el presente documento también se divulga, pero no se reivindica, un kit para diagnosticar el cáncer o el tumor, que comprende el complejo de la presente invención.
Una muestra para diagnosticar cáncer o tumor puede derivar de tejidos u órganos específicos de mamíferos, incluidos los seres humanos. Ejemplos representativos de los tejidos incluyen tejido conectivo, músculo o tejido nervioso. Ejemplos representativos de órganos incluyen ojos, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino delgado, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso y glándula y vasos sanguíneos internos.
La muestra incluye cualquier célula, tejido o fluido que se deriva de un origen biológico, o cualquier otro medio que puede ser bien analizado por la presente invención. La muestra también incluye una muestra obtenida de alimentos producidos para el consumo de seres humanos y/o animales. Además, la muestra a analizar incluye una muestra de líquido corporal., lo que incluye, pero sin limitación, extractos de sangre, suero, plasma, linfa, leche materna, orina, heces, líquido ocular, saliva, semen, extractos de cerebro (por ejemplo, cerebro pulverizado), líquido espinal, apéndice, bazo y de tejido de amígdalas.
El kit divulgado, pero no reivindicado, en el presente documento incluye opcionalmente reactivos requeridos para la realización de una reacción de amplificación de ácido nucleico diana (por ejemplo, reacción de PCR), tales como tampón, cofactor de ADN polimerasa, y desoxirribonucleótido-5-trifosfato. Como alternativa, el kit también puede incluir un anticuerpo que presenta las actividades de diferentes moléculas de polinucleótido, una transcriptasa inversa, tampones y reactivos y una ADN polimerasa. Además, en el kit, la cantidad óptima del reactivo usado en una reacción específica puede ser determinada fácilmente por el experto en la materia que ha adquirido la divulgación expuesta en el presente documento. Normalmente, el kit puede fabricarse como un envase separado o compartimentos que contienen los ingredientes anteriormente mencionados.
En un ejemplo, se analizó el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico formado mediante la unión. Como resultado, como se muestra en la FIG. 1, se confirma que el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico se redujo a varios decenas de nm en comparación con un ácido nucleico monocatenario (véase el Ejemplo 2).
En otro ejemplo, se analizó la permeabilidad celular del complejo de ácido nucleico. Como resultado, como se muestra en las FIG. 2a y 2b, se confirmó que la fluorescencia de Cy3 intracelular (marcador) era la más alta debido a la introducción intracelular de un complejo de ácido nucleico cargado, y un complejo en el que un ácido peptidonucleico bioactivo no cargado y el ácido peptidonucleico vehículo no formaron un dúplex mostró baja permeabilidad intracelular (véase el Ejemplo 3).
En otro ejemplo más, se analizó la eficacia de la inhibición de la expresión de un gen diana en una línea celular tumoral por el complejo de ácido nucleico. Como resultado, como se muestra en las FIG. 3a a 3c, el análisis de los patrones de expresión de la proteína diana y sus proteínas posteriores indicó que se inhibió la expresión de survivina y sus proteínas posteriores en el grupo de ensayo tratado con el complejo de ácido nucleico (véase el Ejemplo 4).
En otro ejemplo más, se confirmó que el momento en el que se controló la expresión del gen diana de la proteína survivina mediante el control de la afinidad de unión del complejo de ácido nucleico, y un experimento realizado en una línea celular tumoral usando complejos de ácido nucleico que comprenden ácidos nucleicos bioactivos específicos de survivina y VEGF indicaron que los complejos de ácido nucleico presentaban actividad anticancerosa (véase los Ejemplos 5 a 8).
En otro ejemplo más, se confirmó que el uso de la estructura de complejo podría inhibir el crecimiento de las bacterias y los hongos (véase el Ejemplo 12).
El ácido peptidonucleico vehículo modificado del complejo de ácido nucleico de acuerdo con la invención supera un problema de precipitación causado por la propiedad de autoagregación de un APN desnudo no modificado convencional y puede aumentar la permeabilidad celular, la solubilidad y los efectos de difusión intracelular.
En el presente documento se describe también un método in vitro para regular la expresión de un gen diana que usa un complejo de la presente invención, comprendiendo el método las etapas de: (a) formar el complejo de la presente invención mediante la unión de un ácido nucleico bioactivo a un ácido peptidonucleico vehículo; y (b) introducir el complejo de la presente invención en células diana poniendo en contacto el complejo de la presente invención con las células diana.
En la presente invención, las células diana pueden ser las células cancerosas o tumorales anteriormente descritas, aunque no de forma limitativa. En la presente invención, después de que se introduzca el complejo de la presente invención en las células en la etapa (b) y se mueva, el ácido nucleico bioactivo puede unirse a un ácido nucleico diana que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria al mismo y puede separase del ácido peptidonucleico vehículo, y el ácido nucleico bioactivo puede unirse al gen diana y regular la expresión del gen diana.
De acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo del complejo mantiene la unión complementaria entre los mismos en ausencia de un ácido nucleico diana (secuencia diana), mientras que la presencia de un ácido nucleico diana complementario a la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico bioactivo, el ácido nucleico bioactivo se separa del ácido peptidonucleico vehículo y se une al ácido nucleico diana por "desplazamiento de cadena del ácido nucleico bioactivo a la secuencia diana" y "la liberación y unión específica a diana". El tiempo de la liberación y la unión puede controlarse mediante el control de la fuerza del puente de hidrógeno entre las nucleobases del ácido nucleico bioactivo de acuerdo con la complementariedad entre la secuencia de nucleótidos del ácido peptidonucleico vehículo y la secuencia de nucleótidos de la secuencia diana.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida de la presente invención, pueden lograrse la liberación y la unión específica a diana: i) construyendo "polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)" o "una secuencia más corta que el ácido nucleico bioactivo" como una estructura de ácido peptidonucleico vehículo que tiene una secuencia específica parcial; ii) reemplazando una porción de la secuencia de ácido peptidonucleico vehículo con bases universales; iii) reemplazando una porción de la secuencia de ácido peptidonucleico vehículo con un enlazador; o vi) proporcionando una estructura de ácido peptidonucleico vehículo que se une en paralelo al ácido nucleico bioactivo de modo que la afinidad de unión entre el ácido peptidonucleico vehículo y el ácido nucleico bioactivo es inferior que la afinidad de unión entre el ácido nucleico diana y el ácido nucleico bioactivo. Estos métodos pueden usarse en combinación de dos o más, y preferentemente se usa el método de unión paralela.
La base universal que puede usarse en la presente invención puede ser una o más seleccionadas del grupo que consiste en bases naturales, incluyendo adenina, guanina, citosina, timina y uracilo e inosina APN, indol APN, nitroindol APN y abásica, que son bases que se unen sin selectividad y tienen menor afinidad de unión que la afinidad de unión complementaria. Preferentemente, puede usarse inosina APN como la base universal.
Existe una ventaja en la que el tiempo de separación entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo y el tiempo de unión entre el ácido nucleico bioactivo y el gen diana del ácido nucleico bioactivo puede controlarse mediante el control de la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo.
Ejemplos
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en más detalle con referencia a los ejemplos. Será obvio para un experto habitual en la técnica que estos ejemplos solo tienen fines ilustrativos y no debe considerarse que limitan o cambian el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1: Ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo y producción del complejo usándolos Con el fin de verificar la eficacia del complejo de ácido nucleico descrito en este Ejemplo, se usó survivina como gen diana. La survivina es una proteína que se expresa comúnmente en la mayoría de los tumores neoplásicos o líneas celulares transgénicas, ensayadas hasta ahora, y se espera que sea una diana importante en la terapia contra el cáncer (survivina: una nueva diana para la terapia contra el cáncer. Cáncer Treat Rev. 35(7):553-62, 2009).
Para suprimir la survivina, se usaron APN antisentido y ARN como ácidos nucleicos bioactivos contra la survivina. El APN y ARN antisentido frente a survinina usados en este Ejemplo tienen las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 1 a 18. Los ácidos nucleicos bioactivos basados en ácido peptidonucleico usados en este ejemplo se etiquetaron con Cy3 para la obtención de imágenes en el extremo 3' y las secuencias de nucleótidos, las modificaciones de monómero y sus estructuras se muestran en la siguiente Tabla 2.
Todos los ácidos peptidonucleicos usados en la presente invención se sintetizaron usando un método de purificación por HPLC por PANAGENE (Corea).
Los ácidos peptidonucleicos vehículo usados en este Ejemplo para la administración de ácido nucleico bioactivo que se dirige al gen de survivina en las células tienen secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 19 a 40. Las secuencias de nucleótidos, las modificaciones de monómero y las estructuras de los ácidos peptidonucleicos vehículo usados en este Ejemplo se muestran en la siguiente Tabla 2.
Para el análisis del tamaño de partícula, la permeabilidad celular y la eficacia inhibidora de la expresión del gen diana de los complejos, se usaron combinaciones de los ácidos nucleicos bioactivos y los ácidos peptidonucleicos vehículo mostrados en la siguiente Tabla 2 para la producción de los complejos.
Tabla 2: Secuencias de los ácidos nucleicos bioactivos para la inhibición de la actividad de survivina y los ácidos e tidonucleicos vehículo
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continuación
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continuación
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continuación
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Para la modificación de monómero, se construyeron una cadena principal de ácido peptidonucleico para estar positivamente cargada usando lisina (Lys, K; indicado por (+)) y una cadena principal peptídica modificada para estar negativamente cargada usando ácido glutámico (Glu, E; indicado por (-)).
Cada ácido nucleico bioactivo y cada ácido peptidonucleico vehículo se hibridaron entre sí en DMSO, y como resultado, se sintetizaron, complejos, comprendiendo cada uno el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo.
Ejemplo 2: Unión del ácido peptidonucleico bioactivo al ácido peptidonucleico vehículo y análisis del tamaño de partícula de los complejos con diferentes propiedades eléctricas
Se analizó el tamaño de partícula de cada uno de los complejos ácido peptidonucleico bioactivo/ácido peptidonucleico vehículo, preparados para tener las estructuras mostradas en la anterior Tabla 2 en el Ejemplo 1.
Ejemplo 2-1: Análisis por microscopia electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM)
Los tamaños de partícula de los complejos producidos en el Ejemplo 1 se analizaron por microscopia electrónica de barrido de emisión de campo. Para la microscopia electrónica de barrido de emisión, se echó gota a gota 3 ^l de cada complejo producido hibridando 250 nM de cada ácido peptidonucleico vehículo con 250 nM de cada ácido nucleico bioactivo sobre una oblea de silicio y, a continuación, se congeló a -70 °C durante 1 hora, seguido de liofilización durante 20 minutos. El complejo secado se recubrió sobre osmio durante 10 minutos y, a continuación, se analizó por microscopia electrónica de barrido de emisión de campo a 5 kV a 10 kV.
Ejemplo 2-2: Análisis por microscopia electrónica de barrido de emisión de campo de estructuras de complejo con diferentes propiedades eléctricas
Se produjeron complejos con diferentes propiedades eléctricas de acuerdo con el método del Ejemplo 1 y se analizaron sus tamaños de partícula de acuerdo con el método del Ejemplo 2-1.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 1, se confirmó que el tamaño de partícula, del complejo producido por la unión paralela del ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo, que tenían diferentes propiedades eléctricas, era similar que el tamaño de partícula del ácido nucleico bioactivo monocatenario. Asimismo, como se muestra en las FIG. 2a y 2b, se analizaron los tamaños de partícula de los siguientes dúplex de APN (complejos): El dúplex de APN 1 compuesto de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 6) y un ácido peptidonucleico vehículo (s Eq ID NO: 32); El dúplex de APN 2 compuesto de un ácido peptidonucleico bioactivo (s Eq ID NO: 5) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 32)) que tenía tres cargas positivas; El dúplex de APN 3 compuesto de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 1) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 37); y el dúplex de APN 4 compuesto de un ácido peptidonucleico bioactivo no cargado (SEQ ID NO: 1) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 23). Cuando el número de cargas positivas del ácido peptidonucleico vehículo aumenta de 2 a 3, disminuye el tamaño de partícula, pero cuando el número de cargas positivas supera 5, aumenta el tamaño de partícula. Además, con respecto a otros factores que determinan el tamaño de partícula, se confirmó que el tamaño de partícula del complejo variaba dependiendo de las propiedades eléctricas apropiadas del ácido peptidonucleico vehículo y el ácido peptidonucleico bioactivo con las cargas del ácido peptidonucleico bioactivo del complejo.
Ejemplo 3: Análisis de la permeabilidad celular de acuerdo con las características del ácido peptidonucleico vehículo
Se analizó la permeabilidad celular de cada uno de los complejos ácido nucleico bioactivo/ácido peptidonucleico vehículo, preparados para tener las estructuras mostradas en la anterior Tabla 2 en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3-1: Cultivo celular
Se cultivaron células cancerosas uterinas humanas (HeLa) obtenidas del ATCC (American Type Culture Collection, EE.UU:) en medio DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco, Welgene, Corea) que contenía suero fetal bovino al 10 % (v/v), 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37 °C bajo CO2 al 5 %.
Ejemplo 3-2: Introducción intracelular del complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Las células HeLa (5x103 células/pocillo) cultivadas en el Ejemplo 3-1 se cultivaron en una placa de 8 pocillos durante 24 horas en las mismas condiciones de cultivo y, a continuación, se trataron con 500 nM del complejo preparado uniendo el ácido peptidonucleico bioactivo al ácido peptidonucleico vehículo en el Ejemplo 1. Las células tratadas se incubaron a 37 °C bajo CO2 al 5 % (v/v) durante 24, 48, 72 y 96 horas y, a continuación, se midió la introducción intracelular del complejo.
Ejemplo 3-3: Análisis de la permeabilidad intracelular del complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
El grado de introducción intracelular del complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo se observó por microscopia confocal. Los núcleos se tiñeron con DAPI y el ácido peptidonucleico bioactivo se etiquetó con Cy3 con el fin de confirmar si se introduciría en las células.
Ejemplo 3-4: Análisis de si el complejo de ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo se separaría en presencia del gen diana en las células
Con el fin de examinar si el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo se introducen en las células, encuentran un gen diana y se separan uno del otro, se observó por microscopia confocal si la señal del ácido nucleico bioactivo etiquetado con Cy3 solaparía con la señal del ácido peptidonucleico vehículo etiquetado con Alexa488.
Ejemplo 3-5: Análisis de la permeabilidad intracelular del ARNip antisentido sencillo usando ácido peptidonucleico vehículo
El grado de introducción intracelular de un complejo que comprende un ARNip antisentido sencillo bioactivo unido al ácido peptidonucleico vehículo se analizó por microscopia confocal. Los núcleos se tiñeron con DAPI y el ARNip antisentido sencillo bioactivo se etiquetó con Cy3 con el fin de confirmar si se introduciría en las células.
Como resultado, como se muestra en las FIG. 3a a 3c, se confirmó que la fluorescencia de Cy3 intracelular era la más alta debido a la introducción intracelular del complejo compuesto del ácido peptidonucleico bioactivo cargado (SEQ ID NO: 14) y el ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 32) y que cuando el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo no formaron un dúplex o el complejo no tenían carga eléctrica, la permeabilidad intracelular del complejo compuesto del ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 1) y el ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 19) era bajo. Además, se pudo ver que la permeabilidad intracelular del complejo variaba dependiendo de su propiedad eléctrica y el tipo de complejo. Como se puede ver en la FIG. 4, se confirmó que el complejo compuesto del ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 14) que mostraba estabilidad biológica y el ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 32) mostraba alta permeabilidad intracelular y también estaba presente en las células durante un largo periodo de tiempo. Como se muestra en las FIG. 5a a 5f, se observó que el complejo compuesto del ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 14) y el ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 39), que tenían la misma carga, estaba presente en un estado unido después de la introducción intracelular y, a continuación, se separó después de 48 horas. Como se muestra en las FIG. 6a a 6g, se observó que el ARNip sencillo que tenía la misma secuencia que la del ácido nucleico bioactivo mostrado en la Tabla 2 no penetraba las células por sí mismo, pero el complejo compuesto del ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 39) y el ARNip sencillo penetraba las células con alta eficacia.
Ejemplo 4: Inhibición de la expresión del gen diana en las líneas celulares tumorales por el complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Usando cada uno de los complejos ácido peptidonucleico bioactivo/ácido peptidonucleico vehículo preparados para tener las estructuras mostradas en la anterior Tabla 2 en el Ejemplo 1, se analizó la eficacia de inhibición de la expresión del gen diana en las líneas celulares tumorales por el complejo.
Ejemplo 4-1: Cultivo celular
Se cultivaron células de cáncer colorrectal humanas (SW480) y células de cáncer de mama humanas (SK-BR-3), obtenidas de ATCC, en el medio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute, Welgene, Corea) que contenían suero fetal bovino al 10 % (v/v), 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37 °C bajo CO2 al 5 %.
Ejemplo 4-2: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Las condiciones de cultivo para las células cancerosas humanas y un método para tratar las células con el complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo eran como se describe en el Ejemplo 3. Sin embargo, se cultivaron 1x105 células/pocillo en placas de 6 pocillos y se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 72 y 96 horas, después de lo cual se examinó la expresión del gen diana que se inhibiría.
Ejemplo 4-3: Análisis de la expresión génica por ensayo de transferencia Western
A partir de cada línea celular tratada en las condiciones descritas en el Ejemplo 4-2, se extrajo la proteína total y se cuantificó por BCA (ensayo de ácido bicinconínico). La proteína se separó por tamaño sobre el gel de SDS-PAGE y la proteína separada sobre el gel se transfirió a una membrana. La membrana se incubó con anticuerpo antisurvivina (Cell Signaling, EE.UU.) y anticuerpo de conejo anti-ciclinaDI (Santa Cruz, EE.UU) como anticuerpos primarios y se incubó con anticuerpo anti de conejo (Santa Cruz, EE.UU) como anticuerpo secundario. A continuación, la membrana se trató con solución ECL (quimioluminiscencia aumentada, Amersham, EE.UU). Después de la finalización del tratamiento con anticuerpo y los procedimientos de lavado, se analizaron los patrones de expresión proteica de survivina y su gen posterior Ciclina D1 sobre la membrana en LAS.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 7, APN 1 y APN 2 son complejos de un ácido peptidonucleico bioactivo, que tiene la misma secuencia que la mostrada en la Tabla 2 pero tiene una diferente propiedad eléctrica, y un ácido peptidonucleico vehículo que tiene la misma propiedad eléctrica. Específicamente, APN 1 es un complejo compuesto de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 3) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 32), y APN 2 es un complejo compuesto de un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 6) y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 32). Se confirmó que los complejos que tenían diferentes propiedades eléctricas inhibían la expresión de survivina y su proteína posterior en el análisis del patrón de expresión, aunque el tiempo de inhibición de la expresión génica no difería dependiendo de las propiedades eléctricas de los complejos.
Ejemplo 5: Inhibición de la expresión génica diana en la línea celular tumoral por control del complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Usando el control de los complejos ácido peptidonucleico bioactivo/ácido peptidonucleico vehículo que tenían diferentes propiedades eléctricas, preparados para tener las estructuras mostradas en la anterior Tabla 2 en el Ejemplo 1, se analizó la eficacia de inhibición de la expresión del gen diana en las líneas celulares tumorales por cada complejo.
Ejemplo 5-1: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Las condiciones de cultivo para las células SW480 y SK-BR-3 y un método para tratar las células con un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo unido a un ácido peptidonucleico vehículo eran como se describe en el Ejemplo 2. Sin embargo, se cultivaron 1x105 células/pocillo en placas de 6 pocillos y se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 24, 48, 72 y 96 horas, después de lo cual se examinó la expresión del gen diana que se inhibiría.
Ejemplo 5-2: Análisis de la expresión génica por ensayo de transferencia Western
Se realizó un experimento en las condiciones del Ejemplo 4-1 y se analizó la eficacia de inhibición de la expresión del gen diana en la línea celular mediante el control del complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 8, se usaron los ácidos peptidonucleicos bioactivos y los ácidos peptidonucleicos vehículo que tenían las mismas secuencias que las mostradas en la anterior Tabla 2, pero los complejos usados estaban compuestos del mismo ácido peptidonucleico vehículo positivamente cargado y cada uno de los diferentes ácidos peptidonucleicos bioactivos que tenían diferentes propiedades eléctricas. En la FIG. 8, A representa un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 1); B representa un complejo que comprende un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 2); y C y D representan complejos que comprenden un ácido peptidonucleico bioactivo (SEQ ID NO: 12). Se analizaron los patrones de expresión de la proteína survivina y sus proteínas posteriores por estos complejos. Se confirmó que el tiempo de inhibición de la expresión de survivina y sus proteínas posteriores cambiaron dependiendo de la estructura de los complejos ácido peptidonucleico bioactivo/ácido peptidonucleico vehículo que tenían diferentes propiedades eléctricas.
Ejemplo 6: Análisis de la viabilidad celular en la línea celular tumoral usando complejos ácido peptidonucleico bioactivo/ácido peptidonucleico vehículo que tenían diferentes longitudes
Usando diferentes complejos ácido peptidonucleico bioactivo/ácido peptidonucleico vehículo que tenían la misma propiedad eléctrica y diferentes longitudes, preparados para tener las estructuras mostradas en la anterior Tabla 2 en el Ejemplo 1, se analizó la inhibición de la viabilidad celular en las líneas celulares tumorales.
Ejemplo 6-1: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Las condiciones de cultivo para la línea celular SW480 y un método para tratar las células con el complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo unido a ácido peptidonucleico vehículo eran como se describe en el anterior Ejemplo 2. Sin embargo, se cultivaron 6 x 103 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 24, 48, 72 y 96 horas, después de lo cual se analizó la viabilidad celular y cada tiempo de incubación.
Ejemplo 6-2: Análisis de la viabilidad celular en la línea celular tumoral por el ensayo MTT
La línea celular tratada bajo las condiciones del Ejemplo 6-1 se trató con 5 mg/ml de solución de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) en 1x PBS y se añadieron 20 pl de la solución celular a cada pocillo y se incubaron durante 4 horas y, a continuación, se midió la DO (densidad óptica) mediante un espectrofotómetro y se analizó.
Como resultado, como se muestra en las FIG. 9a y 9b, se confirmó que la viabilidad celular cargada dependiendo de la longitud del complejo que comprende cada uno de los ácidos peptidonucleicos bioactivos (SEQ ID NO: 6 a 11) unidos a cada uno de los ácidos peptidonucleicos vehículo (SEQ ID NO: 23 a 36).
Ejemplo 7: Evaluación de la eficacia anticancerosa del complejo candidato que comprende ácido peptidonucleico bioactivo que se dirige al gen de survivina y ácido peptidonucleico vehículo
Usando los complejos candidatos, que comprenden cada uno un péptido bioactivo que se dirige al gen de survivina y un ácido peptidonucleico vehículo, preparados para tener las estructuras mostradas en la anterior Tabla 2 en el Ejemplo 1, se analizó la inhibición de los tumores mediante la inhibición de la expresión del gen diana en los modelos animales trasplantados con las células tumorales.
Ejemplo 7-1: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Las condiciones de cultivo para la línea celular SW480, un método para tratar las células con el complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo unido al ácido peptidonucleico vehículo y los contenidos experimentales eran como se describe en los anteriores Ejemplos 4 y 5.
Ejemplo 7-2: Análisis de la viabilidad celular en la línea celular tumoral por el ensayo MTT
La línea celular tratada bajo las condiciones del Ejemplo 6-1 se trató con 5 mg/ml de solución de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) en 1x PBS y se añadieron 20 pl de la solución celular a cada pocillo y se incubaron durante 4 horas y, a continuación, se midió la DO (densidad óptica) mediante un espectrofotómetro y se analizó.
Ejemplo 7-3: Análisis de la expresión génica por ensayo de transferencia Western
Se analizaron los patrones de expresión proteica de la línea celular tratada en las condiciones del Ejemplo 4-1 en las condiciones experimentales del Ejemplo 4-3.
Ejemplo 7-4: Evaluación de la eficacia anticancerosa mediante la administración en la vena de la cola del complejo candidato que comprende ácido peptidonucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo en los ratones trasplantados con línea celular de cáncer colorrectal humana (SW480)
Para la evaluación de la eficacia anticancerosa, se cultivaron células de cáncer colorrectal humanas (SW480) y se ajustaron a una concentración celular de 3x107 células/ml. Se inyectaron 0,3 ml (9x106 células/ratón) del cultivo celular subcutáneamente en la región axilar entre la parte escapular derecha y la pared del pecho de cada uno de los ratones nude hembras BALB/C sin patógeno específico (SPF) (Nara Biotech Co, Corea). Se administró cada una de las muestras del complejo candidato 1, 2 y 3 (1 y 2 mg/kg), comprendiendo cada una el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo y un control negativo (1 y 2 mg/kg), en la vena de la cola de cada ratón en una cantidad de 0,1 ml, dos veces a la semana (días 0, 3, 7, 10, 14 y 17). Para todos los animales, se midieron las condiciones generales y el peso corporal en el inicio de la inyección e inmediatamente antes de la administración durante el periodo de ensayo. Después del trasplante de célula cancerosa, se midieron tres direcciones (largo x ancho x alto) de cada tumor usando los calibradores Vernier para cada animal, se calculó un total de 9 veces hasta el día 18 desde un momento cuando el volumen del tumor medio de cada grupo alcanzó 44,1 mm3 y, a continuación, se calculó el volumen del tumor usando la ecuación "largo x ancho x alto/2". A los 18 días después del inicio de la administración del fármaco, se extrajo sangre de la vena orbitaria por un tubo de heparina y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos, se aisló el plasma sobrenadante y se dispensó en viales y se almacenó a -70 °C. A continuación, los ratones se sometieron a eutanasia con gas de CO2 y, a continuación, el tumor se aisló y se pesó en un equilibrio químico, y se obtuvo una imagen del tejido tumoral.
Ejemplo 7-5: Análisis del marcador de hepatoxicidad en la sangre de ratones trasplantados con células de cáncer colorrectal humanas (SW480)
El plasma se separó de la sangre extraída de los ratones usados en la evaluación de la eficacia anticancerosa y, se diluyó a una relación adecuada en la solución de ensayo de un kit de ensayo de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) (Biovision, EE.UU:), y se añadió 20 pl de la dilución a cada pocillo. Además, los materiales estándar que ayudan a cuantificar las cantidades de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en suero también se prepararon y se añadieron a cada pocillo. A continuación, se preparó una solución de reacción (una mezcla de enzima/agente colorante que incluye la solución de ensayo) de acuerdo con el método proporcionado en el kit de ensayo y se añadió 100 pl de la solución de reacción a cada pocillo y se agitó bien. A continuación, se midió la DO a 570 nm por un espectrofotómetro.
Como resultado, como se muestra en las FIG. 10a y 10b, se confirmó que el uso del complejo candidato que comprendía el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo inhibía la viabilidad celular en las células de cáncer colorrectal humanas y también inhibía la expresión del gen diana survivina y sus proteínas posteriores. Como se muestra en las FIG. 11a a 11e, en el experimento animal por administración en la vena de la cola en los ratones trasplantados con las células de cáncer colorrectal humanas, no se observaron condiciones generales inusuales y una pérdida estadísticamente significativa en el peso corporal en todos los grupos administrados con la muestra, a diferencia del grupo de control negativo, durante el periodo de ensayo desde el día después de la administración hasta el último día. Además, observando el volumen del tumor en el último día (día 18), los grupos administrados con 1 mg/kg de las muestras 1,2 y 3 mostraron tasas de inhibición del crecimiento del tumor del 18,9 % (p<0,01), 8,2 % y 8,9 %, respectivamente, en comparación con el grupo administrado con 1 mg/kg del control negativo, y los grupos administrados con 2 mg/kg de las muestras 1, 2 y 3 mostraron tasas de inhibición del crecimiento del tumor del 40,1 % (p<0,001), 28,0 % (p<0,001) y 31,7 % (p<0,001), respectivamente, en comparación con el grupo administrado con 2 mg/kg del control negativo. En el caso del peso del tumor en el último día, se midió el peso del tumor SW480 aislado 18 días después del inicio de la administración del fármaco y, como resultado, se pudo ver que los grupos administrados con 1 mg/kg de muestras 1, 2 y 3 mostraban reducciones del peso tumoral del 18,9% (p<0,01), 8,9 % y 8,5 %, respectivamente, en comparación con el grupo administrado con 1 mg/kg del control negativo, y los grupos administrados con 2 mg/kg de las muestras 1,2 y 3 mostraron reducciones del peso del tumor del 40,7 % (p<0,001), 28,9 % (p<0,001) y 32,7% (p<0,001), respectivamente, en comparación con el grupo administrado con 2 mg/kg del control negativo. Por último, se extrajo la sangre de los ratones usados en la evaluación de la eficacia anticancerosa, y se analizó la presencia o ausencia de los marcadores de la hepatotoxicidad en la sangre. Como resultado, no se detectó marcador de hepatotoxicidad específico en todos los grupos administrados con las muestras.
Ejemplo 8: Evaluación del efecto farmacológico anticanceroso del nuevo complejo mediante la inhibición del factor del crecimiento endotelial vascular en células de cáncer de mama y células de cáncer de pulmón humanas
Se sabe que el factor de crecimiento endotelial vascular VEGF que se expresa altamente en muchos tipos de células cancerosas induce el crecimiento vascular en las células cancerosas, se evaluó el efecto farmacológico anticanceroso por la inhibición de VEGF del nuevo complejo.
Ejemplo 8-1: Cultivo celular
Se cultivaron células de cáncer de mama humanas (MDA-MB-231) y células de cáncer de pulmón humanas (A549), obtenidas de la ATCC (American Type Culture Collection, EE.UU.), en medio DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco, Welgene, Corea) que contenían suero fetal bovino al 10 % (v/v), 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37 °C bajo CO2 al 5 %.
Ejemplo 8-2: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido peptidonucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Para producir un nuevo complejo para inhibir el factor de crecimiento endotelial, se construyó un ácido peptidonucleico bioactivo que tenía una secuencia (SEQ ID NO: 41) complementaria al ARNm de VEGF, un gen esencial para el crecimiento vascular, y se construyeron ácidos peptidonucleicos vehículo (SEQ ID NO: 42 y 43) complementarios al ácido peptidonucleico bioactivo. El ácido peptidonucleico bioactivo se hibridó con la misma cantidad de cada uno de los ácidos peptidonucleicos vehículo, produciendo de este modo complejos (véase la Tabla 3). Un método para tratar células con el complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo unido al ácido peptidonucleico vehículo era como se describe en el Ejemplos 2.
Tabla 3: Secuencias del ácido nucleico bioactivo para la inhibición de la actividad de VEGF y los ácidos e tidonucleicos vehículo
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Ejemplo 8-3: Análisis de la viabilidad celular en células de cáncer de mama y células de cáncer de pulmón humanas
Para analizar el alcance al cual se inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular por el nuevo complejo, se añadieron las células cultivas en el Ejemplo 8-1 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos a una densidad celular de 6x103 células/pocillo, se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 24, 48, 72 y 96 horas, después de lo cual se analizó la viabilidad celular después de cada tiempo de incubación en las condiciones experimentales del Ejemplo 6-2.
Ejemplo 8-4: Análisis de la expresión génica por ensayo de transferencia Western
Para analizar el alcance al cual se inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular por el nuevo complejo, se añadieron las células cultivas en el Ejemplo 7-1 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1x105 células/pocillo, se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 24, 48, 72 y 96 horas. A continuación, en las condiciones experimentales del Ejemplo 4-3, se analizó la expresión proteica usando el anticuerpo anti-VEGF (Santa Cruz, EE.UU) y anti-p-Aktl (Cell signaling, EE.UU).
Ejemplo 8-5: Análisis de la apoptosis por citometría de flujo (FACS)
Con el fin de analizar si el nuevo complejo induce apoptosis mediante la inhibición del factor de crecimiento endotelial vascular, se añadieron las células cultivas en el Ejemplo 7-1 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1x105 células/pocillo y se cultivaron durante 72 horas. A continuación, se recogieron las células y se disolvieron en 500 ^l del tampón de unión a anexina V del kit de detección de apoptosis de anexina V de FITC (BD, EE.UU.) y, a continuación, se trataron con 5 ^l de cada uno de anexina V de FITC y solución de tinción de yoduro de propidio. A continuación, la solución celular se transfirió en un tubo de citometría de flujo y, a continuación, se analizó por FACS Canto II (BD, EE.UU.).
Ejemplo 8-6: Evaluación de la eficacia anticancerosa usando peces cebra
Usando los huevos de pez cebra obtenidos por 2 días de incubación en una incubadora, las células de cáncer de mama humanas (MDA-MB-231) cultivadas en el Ejemplo 8-1 se tiñeron en verde con CellTrace™ CFSE (Thermoscientific, EE.UU.) durante 30 minutos y se recogieron. A continuación, se inyectaron 150 células de cáncer de mama humanas teñidas por pez cebra en larvas de pez cebra por microinyección. Los peces cebra inyectados con las células de cáncer de mama humanas se dispensaron en una placa de 96 pocillos que contenían una solución acuosa del complejo y, a continuación, se incubaron en una incubadora durante 4 días. Después de 4 días de incubación, los peces cebra se anestesiaron con tricaína al 0,04 % y, a continuación, se analizaron con un microscopio de fluorescencia (OLYMPUS, Japón).
Como resultado, como se muestra en las FIG. 12a a 12c, se confirmó que el nuevo complejo inhibía la viabilidad celular inhibiendo el factor de crecimiento endotelial vascular en células de cáncer de mama humanas y células de cáncer de pulmón y también inhibían la expresión proteica del factor de crecimiento endotelial vascular VEGF y su gen posterior p-Akt1. Además, con el fin de examinar si la apoptosis sería inducida por la inhibición del factor de crecimiento endotelial vascular, se realizó citometría de flujo. Como resultado, se confirmó que los complejos, que comprenden el ácido peptidonucleico bioactivo y cada uno de los ácidos peptidonucleicos vehículo que tienen diferentes longitudes y propiedades de carga, mostraban índices de apoptosis de un 3,2 % y 2 %, respectivamente. Por último, los peces cebra usados como modelos animales para la evaluación de la eficacia anticancerosa se trasplantaron con las células de cáncer de mama humanas y, a continuación, se analizaron. Como resultado, como se muestra en la FIG. 13, se pudo ver que el complejo presentaba el efecto de la inhibición del crecimiento de las células de cáncer de mama trasplantadas.
Ejemplo 9: Examen de la inhibición del factor de crecimiento endotelial vascular en células epiteliales pigmentarias retinianas humas por el nuevo complejo
Usando el nuevo complejo frente al factor de crecimiento endotelial vascular VEGF en mácula conocido por causar la degeneración macular relacionada con la edad, se trataron células epiteliales pigmentarias retinianas humanas con el complejo y se examinó si el complejo inhibiría la formación vascular.
Ejemplo 9-1: Cultivo celular
Se cultivaron células epiteliales pigmentarias retinianas humanas (ARPE-19), obtenidas de la ATCC (American Type Culture Collection, EE.UU.), en medio DMEM (mezcla medio Eagle modificado de Dulbecco/nutriente F-12, gibco, EE.UU.) que contenían suero fetal bovino al 10 % (v/v), 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37 °C bajo CO2 al 5 %.
Ejemplo 9-2: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido peptidonucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Se usó un nuevo complejo para inhibir el factor de crecimiento endotelial vascular de la misma manera que en el Ejemplo 7-2 y un método para tratar células con el nuevo complejo era como se describe en el Ejemplo 2.
Ejemplo 9-3: Análisis de la viabilidad celular en las células epiteliales pigmentarias retinianas humanas
Para analizar el alcance al cual se inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular por el nuevo complejo, se añadieron las células cultivas en el Ejemplo 9-1 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos a una densidad celular de 6x103 células/pocillo, se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 24, 48, 72, 96 y 120 horas, después de lo cual se analizó la viabilidad celular después de cada tiempo de incubación en las condiciones experimentales del Ejemplo 6-2.
Ejemplo 9-4: Análisis de la expresión génica por ensayo de transferencia Western
Para analizar el alcance al cual se inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular por el nuevo complejo, se añadieron las células cultivas en el Ejemplo 9-1 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1x105 células/pocillo, se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 24, 48, 72, 96 y 120 horas. A continuación, en las condiciones experimentales del Ejemplo 4-3, se analizó la expresión proteica usando anticuerpo anti-VEGF (Santa Cruz, EE.UU.), anti-p-Aktl (Cell signaling, EE.UU.) y anti-p-ERK-1 (Cell signaling, EE.UU.).
Como resultado, como se muestra en las FIG. 14a y 14b, se confirmó que el tratamiento con el nuevo complejo inhibía la viabilidad celular en las células epiteliales pigmentarias retinianas humanas y también inhibieron la expresión proteica de VEGF y sus genes posteriores, p-Akt-1 y p-ERK-1.
Ejemplo 10: Examen del efecto farmacológico inflamatorio del nuevo complejo frente a psoriasis
Con el fin de verificar el efecto del nuevo complejo frente a la psoriasis de dermatopatía, se examinó si el nuevo complejo presentaría un efecto antiinflamatorio inhibiendo el gen diana IFI16 (proteína 16 inducible por gamma interferón).
Ejemplo 10-1: Cultivo celular
Se cultivaron queratinocitos epidérmicos humanos (HaCaT), obtenidos del CLS ("Cell Line Service", Alemania), en medio DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco, Welgene, Corea) que contenían suero fetal bovino al 10 % (v/v), 100 unidades/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina a 37 °C bajo CO2 al 5 %.
Ejemplo 10-2: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido peptidonucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Para producir un nuevo complejo para inhibir IFI16, se construyeron ácidos peptidonucleicos bioactivos (SEQ ID NO: 44 a 47) complementarios a ARNm de IFI16, y un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 48) complementario al ácido peptidonucleico bioactivo. Cada uno de los ácidos peptidonucleicos bioactivo se hibridó con la misma cantidad del ácido peptidonucleico vehículo, construyendo de este modo los complejos (véase la Tabla 4). Un método para tratar células con el complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo unido al ácido peptidonucleico vehículo era como se describe en el anterior Ejemplo 2.
Tabla 4: Secuencias de los ácidos nucleicos bioactivos para la inhibición de la actividad de IFI16 y el ácido i n l i v hí l
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Ejemplo 10-3: Análisis de la viabilidad celular en queratinocitos epidérmicos humanos
Para analizar el grado de inhibición de IFI16, las células cultivadas en el Ejemplo 10-1 se cultivaron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 6x103 células/pocillo durante 24 horas, y se trataron con el complejo que comprendía el ácido peptidonucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo. A continuación, para inducir una reacción inflamatoria, los queratinocitos epidérmicos humanos se trataron con 20 ng/ml de IL-17A y se incubaron durante 72, 96 y 120 horas. A continuación, se analizó la viabilidad celular en las condiciones experimentales del Ejemplo 6-2.
Ejemplo 10-4: Análisis de la expresión génica por ensayo de transferencia Western
Para analizar el alcance al cual se inhibe IFI16 por el nuevo complejo, se añadieron las células cultivas en el Ejemplo 10-1 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1x105 células/pocillo, se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 72, 96, 120 y 144 horas. A continuación, en las condiciones experimentales del Ejemplo 4-3, se analizó la expresión proteica usando el anticuerpo anti-IFI16 (Cell Signaling, EE.UU.) y anti-p-NF-kB (Cell signaling, EE.UU.).
Ejemplo 10-5: Inducción de los modelos de psoriasis de ratón Balb/C mediante Imiquimod y análisis del cambio en el fenotipo de modelos de psoriasis por Imiquimod por el complejo que comprende ácido nucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Se aplicaron 20 mg de imiquimod diariamente a la oreja derecha de ratones machos Balb/C de 6 semanas de vida durante 12 días para inducir la psoriasis. A los modelos de ratón inducidos por psoriasis, se aplicó el nuevo complejo en forma de líquido o crema a intervalos de 2 días durante 12 días (un total de 6 veces). El grosor de la oreja derecha se midió por un micrómetro y se analizaron el grosor de la oreja derecha antes de la inducción de la psoriasis inicial y la diferencia en el grosor de la oreja entre el grupo tratado con el nuevo complejo y el grupo control.
Ejemplo 10-6: Inhibición de la expresión génica por el nuevo complejo en modelos de ratón Balb/C con psoriasis inducida por Imiquimod
El nuevo complejo se aplicó en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplos 10-5 y, a continuación, se hizo una biopsia de la oreja derecha del ratón. La proteína total se extrajo del tejido de la biopsia y se cuantificó por BCA (ensayo de ácido bicinconínico) y se analizó la expresión proteica de acuerdo con el método del Ejemplo 10-4.
Ejemplo 10-7: Inhibición del crecimiento anormal de los queratinocitos de tejido por el complejo que comprende ácido peptidonucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo en modelos de ratón Balb/C con psoriasis inducida por Imiquimod
El nuevo complejo se aplicó en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplos 10-5 y, a continuación, se hizo una biopsia de la oreja derecha del ratón, se fijó en solución de paraformaldehído al 4 % y se incrustó en parafina. El bloque de parafina se seccionó con un microtomo y se desparafinó. El tejido desparafinado se montó en un portaobjetos de vidrio y se tiñó con hematoxilineosina.
Como resultado, como se muestra en las FIG. 15a y 15b, se confirmó que el tratamiento de los queratinocitos epidérmicos humanos con el nuevo complejo que se dirige al gen diana IFI16 redujo la viabilidad celular y también inhibió la expresión proteica del gen diana IFI16 y su gen posterior p-NF-kB. Además, se realizó un experimento animal para confirmar el efecto anti-inflamatorio del nuevo complejo frente a psoriasis. Como resultado, como se muestra en la FIG. 16, el grosor de la oreja derecha del ratón era mayor en el grupo de control positivo con psoriasis inducida por imiquimod que en el grupo control negativo sin psoriasis, y el grosor de la oreja en el grupo tratado con el nuevo complejo que se dirige a IFI16 disminuyó hasta un nivel similar a aquel en el grupo control negativo. Además, el tejido sometido a biopsia en el experimento animal se usó para examinar si se inhibiría la expresión del gen diana. Como resultado, se confirmó que disminuyó la expresión de IFI16 en el grupo tratado con el nuevo complejo, a diferencia del grupo control positivo en el que aumentó la expresión de IFI16. Por último, el tejido de biopsia de ratón se tiñó con H&E y como resultado, se confirmó que la proliferación de los queratinocitos epidérmicos en el grupo control positivo aumentó en comparación con la del grupo control negativo y la proliferación de los queratinocitos epidérmicos en el grupo administrado con el nuevo complejo disminuyó.
Ejemplo 11: Examen del efecto anticanceroso inmunitario del nuevo complejo en células de cáncer de mama humanas
Se sabe que el gen PD-L1 que se expresa sobre la superficie de muchos tipos de células cancerosas no es destruido por las células inmunitarias mediante la unión a PD-1 de los linfocitos T y continua induciendo la proliferación de las células cancerosas. Por tanto, se examinó si un nuevo complejo que se dirige a PD-L1 en células de cáncer de mama humanas que muestran alta expresión de PD-L1 presentarían un efecto anticanceroso inmunitario al inhibir PD-L1.
Ejemplo 11-1: Cultivo celular
Las células se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 8-1.
Ejemplo 11-2: Cultivo celular e introducción intracelular del complejo que comprende ácido peptidonucleico bioactivo y ácido peptidonucleico vehículo
Para producir un nuevo complejo para inhibir PD-L1, se construyó un ácido peptidonucleico bioactivo que tenía una secuencia (SEQ ID NO: 49) complementaria al ARNm de PD-L1 que se expresó sobre la superficie de las células cancerosas y se construyó un ácido peptidonucleico vehículo (SEQ ID NO: 50) complementario al ácido peptidonucleico bioactivo. A continuación, el ácido peptidonucleico vehículo se hibridó con la misma cantidad del ácido peptidonucleico bioactivo, construyendo de este modo un complejo (véase la Tabla 5). Un método para tratar células con el nuevo complejo que comprende el ácido peptidonucleico bioactivo unido al ácido peptidonucleico vehículo era como se describe en el Ejemplo 2.
Tabla 5: Secuencias de ácido nucleico bioactivo para la inhibición de la actividad de PD-L1 y el ácido peptidonucleico vehículo
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Ejemplo 11-3: Análisis de la expresión génica por ensayo de transferencia Western
Para analizar el alcance al cual se inhibe PD-L1 por el nuevo complejo, se añadieron las células cultivas en el Ejemplo 11-1 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1x105 células/pocillo, se trataron con el complejo y, a continuación, se incubaron durante 96, 120 y 144 horas. A continuación, en las condiciones experimentales del Ejemplo 4-3, se analizó la expresión proteica usando anticuerpo anti-PD-L1 (Abcam, Inglaterra). Como resultado, como se muestra en la FIG. 17, se puedo confirmar que el tratamiento con el nuevo complejo inhibía la expresión proteica del gen diana PD-L1 en las células de cáncer de mama humanas en comparación con el grupo control negativo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un complejo de ácido nucleico que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula estructural (1):
[Fórmula estructural (1)]
[ A = C <+> ],
en la que
A representa un ácido nucleico bioactivo que tiene una secuencia capaz de unirse a un gen diana;
C representa un ácido peptidonucleico vehículo capaz de unirse al ácido nucleico bioactivo;
"=" representa unión complementaria entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo; el ácido nucleico bioactivo representado por A es un APN (ácido peptidonucleico), y tiene una carga generalmente negativa; C(+> indica que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está cargado de manera positiva; y
el ácido peptidonucleico vehículo comprende uno o más monómeros del ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa para generalmente estar cargado de manera positiva,
en donde los monómeros del ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa comprenden un mayor número de monómeros que tienen un aminoácido positivamente cargado que de monómeros que tienen un aminoácido negativamente cargado, de modo que el ácido peptidonucleico vehículo generalmente está cargado de manera positiva; y
en donde el complejo de ácido nucleico generalmente está cargado de manera positiva.
2. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde cada uno del ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo comprende de 2 a 50 monómeros de ácido nucleico.
3. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el ácido peptidonucleico vehículo tiene una secuencia de nucleótidos que es parcial o completamente complementaria al ácido nucleico bioactivo,
en donde el ácido peptidonucleico vehículo que tiene una secuencia de nucleótidos que es parcialmente complementaria al ácido nucleico bioactivo comprende una o más bases universales.
4. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde los monómeros del ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa comprenden uno o más aminoácidos positivamente cargados seleccionados del grupo que consiste en lisina (Lys, K), arginina (Arg, R), histidina (His, H), ácido diamino butírico (DAB), ornitina (Orn) y un análogo de aminoácido en la cadena principal para ser eléctricamente positivo.
5. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 4, en donde los monómeros del ácido peptidonucleico modificados en la cadena principal gamma o alfa comprenden uno o más aminoácidos negativamente cargados seleccionados del grupo que consiste en ácido glutámico (Glu, E), ácido aspártico (Asp, D) y un análogo al aminoácido en la cadena principal.
6. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la unión entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo es una unión antiparalela o una unión paralela de acuerdo con la orientación 5' y la orientación 3' de cada uno de los ácidos nucleicos.
7. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo están unidos entre sí mediante una unión paralela o una unión específica parcial de modo que la afinidad de unión (temperatura de fusión (Tm)) entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo es inferior que la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y un gen identificado por el ácido nucleico bioactivo.
8. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el ácido peptidonucleico vehículo tiene un enlazador, una base universal, y al menos una nucleobase peptídica seleccionada de las nucleobases peptídicas que no son complementarias a las bases correspondientes del ácido nucleico bioactivo, de modo que la afinidad de unión (temperatura de fusión (Tm)) entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo es inferior a la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y un gen identificado por el ácido nucleico bioactivo.
9. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el tiempo de separación entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo y el tiempo de unión entre el ácido nucleico bioactivo y el gen diana del ácido nucleico bioactivo se controla mediante el control de la afinidad de unión entre el ácido nucleico bioactivo y el ácido peptidonucleico vehículo.
10. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico bioactivo y/o el ácido peptidonucleico vehículo se unen a una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en una fracción hidrófoba, una fracción hidrófila, un anticuerpo específico a antígeno diana, un aptámero, un inhibidor de fluorescencia, un marcador fluorescente y un marcador luminiscente.
11. El complejo de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico se controla mediante el control del balance de carga del complejo de ácido nucleico,
en donde el tamaño de partícula del complejo de ácido nucleico es de 5 nm a 300 nm.
12. El complejo de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un método para regular la expresión de un gen diana.
13. El complejo de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un método para prevenir o tratar enfermedades.
14. El complejo de ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las enfermedades son cánceres, enfermedades inflamatorias, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades raras y enfermedades graves, enfermedades cardiovasculares, enfermedades metabólicas o dermatopatías.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102484332B1 (ko) * 2018-02-08 2023-01-04 주식회사 시선테라퓨틱스 핵산 복합체를 함유하는 피부 투과성 전달체 및 이의 용도
KR102262260B1 (ko) * 2018-02-08 2021-06-09 주식회사 시선테라퓨틱스 엔도좀 탈출능을 갖는 펩티드 핵산 복합체 및 이의 용도
AU2019375245B2 (en) * 2018-11-07 2023-12-07 Seasun Therapeutics Composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising skin-penetrating nucleic acid complex as effective component
KR102156324B1 (ko) * 2019-01-21 2020-09-15 주식회사 시선테라퓨틱스 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생관련 질환 치료용 약학 조성물
KR102156323B1 (ko) * 2019-01-21 2020-09-15 주식회사 시선테라퓨틱스 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 건선의 예방 또는 치료용 조성물
KR102320650B1 (ko) * 2019-10-16 2021-11-04 주식회사 시선테라퓨틱스 혈뇌장벽 투과능을 가지는 펩티드 핵산 복합체 및 이를 포함하는 조성물
EP4088742A4 (en) * 2020-01-06 2024-07-10 Seasun Therapeutics COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MACULAR DEGENERATION CONTAINING A CELL-PERMEABLE NUCLEIC ACID COMPLEX AS ACTIVE SUBSTANCE
KR102259402B1 (ko) * 2020-06-04 2021-06-01 주식회사 아임뉴런바이오사이언스 개선된 안정성을 갖는 핵산 분자 및 이의 용도
KR20220026197A (ko) * 2020-08-25 2022-03-04 주식회사 시선테라퓨틱스 세포 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물
KR102526733B1 (ko) * 2020-09-25 2023-04-28 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 또는 치료용 조성물
KR102574253B1 (ko) * 2020-12-15 2023-09-07 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 교모세포종 예방 또는 치료용 조성물
KR102574252B1 (ko) * 2020-12-15 2023-09-07 주식회사 시선테라퓨틱스 펩티드 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방 또는 치료용 조성물
KR20230106325A (ko) * 2022-01-06 2023-07-13 주식회사 시선테라퓨틱스 핵산 복합체를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20230106326A (ko) * 2022-01-06 2023-07-13 주식회사 시선테라퓨틱스 핵산 복합체를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20230128690A (ko) * 2022-02-28 2023-09-05 주식회사 시선테라퓨틱스 핵산 복합체를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물
WO2025159488A1 (ko) * 2024-01-26 2025-07-31 주식회사 나이벡 질병 진단을 위한 펩타이드 기반 프로브 및 이의 용도

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US6228982B1 (en) 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
DE69734783T2 (de) * 1996-07-24 2006-08-17 Buchardt, Dorte Peptidnukleinsäuren mit erhöhter bindungsaffinität, sequenzspezifität und löslichkeit
US6960439B2 (en) 1999-06-28 2005-11-01 Source Precision Medicine, Inc. Identification, monitoring and treatment of disease and characterization of biological condition using gene expression profiles
JP2008220366A (ja) * 2007-02-16 2008-09-25 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 修飾型ｐｎａ／ｒｎａ複合体
EP2520649A3 (en) 2007-11-23 2013-02-20 Panagene, Inc. MicroRNA antisense PNAs, compositions comprising the same, and methods for using and evaluating the same
KR101557545B1 (ko) 2009-09-17 2015-10-06 에프. 호프만-라 로슈 아게 암 환자에서 진단 용도를 위한 방법 및 조성물
KR102012690B1 (ko) * 2011-07-12 2019-08-21 주식회사 파나진 평행 결합 구조의 이중 혼성화 ｐｎａ 프로브 시스템
DE102012017841A1 (de) 2012-09-08 2014-03-13 Kiekert Aktiengesellschaft Verfahren zur Herstellung eines einteiligen Schlosshalters
KR20160110465A (ko) * 2014-01-21 2016-09-21 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 ｃＧＡＰ－ＰＮＡ 다가 펩티드 핵산 리간드 디스플레이

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