ES2929771T3

ES2929771T3 - Proceso para fabricación de células T mejorado

Info

Publication number: ES2929771T3
Application number: ES19821337T
Authority: ES
Inventors: Thomas Brieva; David Hsiung; Seth Jones; Shiv Mistry; Nayyereh Rajaei
Original assignee: Celgene Corp
Current assignee: Celgene Corp
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2022-12-01
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: SI3880802T1; IL283085B1; HUE060213T2; KR20210092743A; EP3880802A1; PL3880802T3; PT3880802T; BR112021009080A2; EP3880802B1; EP4151722A1; HRP20221200T1; JP2025020128A; IL283085B2; DK3880802T3; SG11202104994PA; LT3880802T; JP2022513045A; AU2019381805B2; AU2019381805A1; WO2020102676A1

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos mejorados de fabricación de células, incluidas las células T y las células CAR T. También se proporcionan en este documento métodos para fabricar células, como células T y células CAR T, que se pueden obtener de la sangre usando un método que incorpora filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK) para aislar las células de otros componentes de la sangre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para fabricación de células T mejorado

REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 62/768,579 presentada el 16 de noviembre de 2018, cuyo contenido completo se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

1. CAMPO

La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular a la producción de terapias celulares para el tratamiento del cáncer.

2. ANTECEDENTES

La inmunoterapia basada en células T que expresan un receptor artificial, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico o un receptor de células T (TCR), polipéptidos que dirigen los linfocitos T a un antígeno particular asociado a un tumor, y proporciona señalización primaria y generalmente coestimuladora para activar y aumentar la proliferación de la célula T, se ha vuelto una modalidad de tratamiento cada vez más prometedora, particularmente para pacientes que han agotado otras líneas de tratamiento. Sin embargo, para la terapia de células T con CAR autóloga, la fabricación de las células sigue siendo laboriosa y requiere mucho tiempo. Como resultado, hay una necesidad en el campo de métodos mejorados de fabricación de células T CAR que reduzcan el tiempo y el gasto de producción de tales células. En la presente se proporciona dicho método mejorado.

3. SUMARIO

En un primer aspecto, en la presente se proporcionan métodos para fabricar células que pueden obtenerse de la sangre usando un método que incorpora filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK) para aislar las células de otros componentes de la sangre. En una primera realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre, que comprende los pasos de: (a) obtener células sanguíneas de la muestra de sangre, por ejemplo, usando leucaféresis o extracción de sangre, para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMC); (b) opcionalmente, congelar las células sanguíneas y obtener las PBMC después de la descongelación, u opcionalmente obtener y congelar las PBMC, seguido de descongelación antes de los pasos posteriores; (c) aislar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (d) lavar las PBMC mediante centrifugación; (e) opcionalmente crioconservar las PBMC; (f) opcionalmente, descongelar las PBMC si las PBMC se crioconservan en el paso (e); (g) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana; (h) fabricar las células a partir de las PBMC; e (i) lavar las células usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(h) en dicho método se realizan en orden. En una realización específica, las células son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR).

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre, que comprende los pasos de: (a) obtener PBMC de la muestra de sangre; (b) aislar las PBMC que se han obtenido de la muestra de sangre usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (c) lavar las PBMC mediante centrifugación; (d) opcionalmente crioconservar las PBMC; (e) opcionalmente, descongelar las PBMC crioconservadas en el paso (d); (f) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana; (g) fabricar las células T CAR a partir de las PBMC del paso (f); y (h) lavar las células T CAR del paso (g) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(h) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre, que comprende los pasos de: (a) aislar las PBMC que se han obtenido de una muestra de sangre del sujeto, en donde dicho aislamiento usa un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) lavar las PBMC mediante centrifugación; (c) opcionalmente crioconservar las PBMC; (d) opcionalmente, descongelar las PBMC crioconservadas en el paso (c); (e) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana; (f) fabricar las células T CAR a partir de las PBMC del paso (f); y (g) lavar las células T CAR del paso (f) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(g) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) aislar las PBMC de una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis o es de una extracción de sangre, usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) opcionalmente crioconservar las PBMC del paso (a); (c) opcionalmente, descongelar las PBMC del paso (b); (d) lavar las PBMC descongeladas del paso (c) usando un sistema de filtración por membrana; (e) fabricar las células a partir de las PBMC del paso (d); y (f) lavar las células del paso (e) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(f) en dicho método se realizan en orden. En una realización específica, las células son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR).

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) aislar PBMC de una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis o es de una extracción de sangre, usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amoniocloruro-potasio (ACK); (b) crioconservar las PBMC del paso (a); (c) descongelar las PBMC del paso (b); (d) lavar las PBMC descongeladas del paso (c) usando un sistema de filtración por membrana; (e) fabricar las células a partir de las PBMC del paso (d); y (f) lavar las células del paso (e) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(f) en dicho método se realizan en orden. En una realización específica, las células son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR)

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) aislar PBMC de una muestra de sangre del sujeto usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) opcionalmente crioconservar y descongelar las PBMC del paso (a); (c) opcionalmente, lavar las PBMC descongeladas del paso (b) usando un sistema de filtración por membrana; (d) fabricar las células a partir de las PBMC; y (e) lavar las células usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(e) en dicho método se realizan en orden. En una realización específica, la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis. En una realización específica, las células son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR).

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) aislar PBMC de una muestra de sangre del sujeto usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) crioconservar y descongelar las PBMC del paso (a); (c) lavar las PBMC descongeladas del paso (b) usando un sistema de filtración por membrana; (d) fabricar las células a partir de las PBMC; y (e) lavar las células usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(e) en dicho método se realizan en orden. En una realización específica, la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis. En una realización específica, las células son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR).

En realizaciones específicas de cualquiera de las realizaciones anteriores, las células son células T (linfocitos T), células asesinas naturales (células NK) o células dendríticas. En realizaciones específicas, las células T son linfocitos T citotóxicos (CTL), células T CD4+, células T CD8+ o células T de memoria central (T^cm). En realizaciones específicas, las células, por ejemplo, células T, se han modificado genéticamente para expresar un polipéptido, por ejemplo, un receptor quimérico. En realizaciones más específicas, el receptor quimérico es un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico. En realizaciones más específicas, las células de cualquiera de los métodos anteriores son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (células T CAR).

En realizaciones específicas de cualquiera de las realizaciones anteriores, por lo menos uno o todos los sistemas de filtración por membrana son un sistema de filtración de flujo tangencial. En realizaciones específicas de cualquiera de las realizaciones anteriores, por lo menos uno o todos los sistemas de filtración por membrana pueden ser un sistema de filtración por membrana giratoria. En una realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, el sistema de filtración por membrana es un sistema de filtración por membrana giratoria como un sistema de procesamiento celular automatizado LOVO. En otra realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el tampón ACK comprende cloruro amónico 50-300 mM, carbonato potásico 5-25 mM y EDTA sódico 0,05-0,25 mM. En una realización más específica, dicho tampón ACK comprende cloruro amónico 150 mM, carbonato potásico 10 mM y EDTA sódico 0,1 mM. En otra realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, dicho método mejora la reducción de plaquetas y glóbulos rojos de dichas PBMC en un 18%-36% en comparación con el mismo método usando centrifugación por gradiente de densidad en lugar de cada uso de filtración por membrana giratoria. En otra realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, dicho método mejora la reducción de plaquetas y glóbulos rojos de dichas PBMC en un 10%-50%, 15%-45%, 20%-40%, 20%-35%, 20%-30%, 25%-35%, 25%-30%, 25%-40% o 30-35% en comparación con el mismo método usando centrifugación por gradiente de densidad en lugar de cada uso de filtración por membrana giratoria. En otra realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, dicho método mejora la recuperación de las células, por ejemplo, células T CAR, después de la fabricación de células T en un 17%-36% en comparación con el mismo método usando centrifugación por gradiente de densidad en lugar de cada uso de filtración por membrana giratoria. En otra realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, dicho método mejora la recuperación de las células, por ejemplo, células T CAR, después de la fabricación de células T en aproximadamente un 10%-50%, 15%-45%, 20%-40%, 20%-35%, 20%-30%, 25%-35%, 25%-30%, 25%-40% o 30-35%, en comparación con el mismo método usando centrifugación por gradiente de densidad en lugar de cada uso de filtración por membrana giratoria.

4. DESCRIPCIÓN DETALLADA

4.1. Proceso mejorado para producir células - Descripción general

En la presente se proporciona un proceso para fabricar células que incorpora un proceso mejorado para producir las células. El proceso de fabricación comienza con el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) autólogas de la leucaféresis de un paciente o de una extracción de sangre.

El proceso de fabricación comienza con el aislamiento de la PBMC de la leucaféresis de un paciente o de una extracción de sangre. Las PBMC autólogas se aíslan de la leucaféresis o de una extracción de sangre a través de un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria, por ejemplo, con un tamaño de poro de 3,6 pm, por ejemplo, para eliminar plaquetas y restos celulares. Después de la eliminación de plaquetas y restos celulares, se usa un tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK) para lisar los glóbulos rojos. Luego, las PBMC se separan de la solución tampón ACK y se lavan mediante centrifugación. Esta combinación de filtración por membrana giratoria seguida de lisis ACK de glóbulos rojos representa una primera mejora con respecto a un proceso anterior, que usaba centrifugación en gradiente de densidad (Cell-Saver 5+ (CS5+; Haemonetics, Braintree, Massachusetts)).

Después del lavado, las PBMC aisladas se vuelven a suspender y luego se formulan en una solución adecuada, por ejemplo, Cryostor. Alternativamente, las células T (o células NK o células dendríticas) pueden aislarse de las PBMC antes de la formulación en dicha solución. Para las células T, pueden usarse perlas magnéticas, como Dynabeads, recubiertas con anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 o anti-CD8 para el aislamiento de células T. Luego, las PBMC formuladas o las células aisladas pueden congelarse usando un congelador de velocidad controlada, almacenarse y liberarse. Este paso puede ir seguido de un paso de cultivo celular. Por ejemplo, puede usarse un baño de agua a 37° C en lo que se define como el Día 0 para descongelar las PBMC crioconservadas o las células aisladas antes de que las células se laven y vuelvan a suspenderse en un medio de crecimiento adecuado para el crecimiento de dichas células, usando un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria, o centrifugación. Un medio de cultivo de células T preferido (TCGM) comprende un 93% (v/v( de medio de cultivo celular X-VIVO-15 (Lonza), HEPES 10mM, GlutaMAX™ 2 mM, suero AB humano al 5% (v/v) y 100 Ul/ml de interleucina-2 humana recombinante (rhIL-2) (ver Hollyman et al, J Immunother 2009, 32:169-180).

El cultivo puede iniciarse y activarse sembrando PBMC aisladas en una bolsa de diferenciación celular permeable a los gases a una concentración de 1 x 106 PBMC/ml en medio, por ejemplo, TCGM, suplementado con reactivos de activación (por ejemplo, para células T, Dynabeads recubiertas con anti-CD3 y anti-CD28). Luego, las células pueden incubarse a 37° C, preferiblemente en aire con un 5% de CO². En el caso de las células T CAR, dicha incubación puede continuar hasta la transducción de las células T con un vector que expresa CAR. La activación de las células T puede medirse por un aumento en el tamaño de las células (explosión de células) y la agrupación de células. Tras el inicio del cultivo puede controlarse el tamaño de las células (un indicador de la activación) usando, por ejemplo, el método Coulter.

Para la fabricación de células T CAR, la transducción con el vector que expresa CAR puede realizarse diluyendo un volumen específico del vector en medio, por ejemplo, TCGM, que luego se añade al cultivo celular. El volumen de vector puede seleccionarse en base al número de PBMC sembradas el día 0, el título viral del lote de vector usado y la multiplicidad de infección (MOI) objetivo. La MOI objetivo en ciertas realizaciones es específica del lote de vector y se selecciona para lograr resultados comparables lote a lote. Luego, las células se incuban a 37° C con CO²al 5%.

Después de la transducción con el vector, el cultivo se incuba y se deja expandir durante un período de tiempo ya una densidad de siembra objetivo. Luego, el cultivo puede volver a sembrarse en, por ejemplo, bolsas de expansión celular permeables a los gases u otra bolsa de cultivo, como un biorreactor WAVE™, e incubarse.

Posteriormente, por ejemplo, en el día 10, las células se recogen y se lavan usando un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria, seguido de una transferencia aséptica, usando un sistema cerrado, del cultivo a una bolsa de procesamiento para la formulación en el producto farmacéutico final. Esto representa una tercera mejora con respecto al proceso de referencia anterior, que usaba un dispositivo CS5+ para realizar este último lavado.

Para cualquiera de los pasos anteriores usando un filtro de membrana giratoria, un aparato preferido es el sistema de procesamiento celular automatizado LOVO (Fresenius Kabi).

En una realización específica, en la presente se proporciona un método para fabricar células T CAR a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre, que comprende los pasos de: (a) obtener células sanguíneas de la muestra de sangre, por ejemplo, usando leucaféresis o extracción de sangre para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMC); (b) opcionalmente, congelar las células sanguíneas y obtener las PBMC después de la descongelación, u opcionalmente obtener y congelar las PBMC, seguido de descongelación antes de los pasos posteriores; (c) aislar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (d) lavar las PBMC mediante centrifugación; (e) opcionalmente crioconservar las PBMC; (f) opcionalmente, descongelar las PBMC si las PBMC se han crioconservado en el paso (e); (g) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria; (h) fabricar las células a partir de las PBMC; y (i) lavar las células usando un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria. En una realización específica, los pasos (a)-(d) y (g)-(i) se realizan en orden. En una realización específica, los pasos (a)-(i) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre, que comprende los pasos de: (a) obtener las PBMC de la muestra de sangre; (b) aislar las PBMC que se han obtenido de la muestra de sangre usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (c) lavar las PBMC mediante centrifugación; (d) opcionalmente crioconservar las PBMC; (e) opcionalmente, descongelar las PBMC crioconservadas en el paso (d); (f) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana; (g) fabricar las células T CAR a partir de las PBMC del paso (f); y (h) lavar las células T CAR del paso (g) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(h) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) aislar las PBMC de una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis o es de una extracción de sangre, usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) crioconservar las PBMC del paso (a); (c) descongelar las PBMC del paso (b); (d) lavar las PBMC descongeladas del paso (c) usando un sistema de filtración por membrana; (e) fabricar las células a partir de las PBMC del paso (d); y (f) lavar las células del paso (e) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(f) en dicho método se realizan en orden. En una realización específica, las células son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR).

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) aislar PBMC de una muestra de sangre del sujeto usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) opcionalmente crioconservar y descongelar las PBMC del paso (a); (c) opcionalmente, lavar las PBMC descongeladas del paso (b) usando un sistema de filtración por membrana; (d) fabricar las células a partir de las PBMC; y (e) lavar las células usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis. En una realización específica, los pasos (a)-(e) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para fabricar células a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de: (a) aislar PBMC de una muestra de sangre del sujeto usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) crioconservar y descongelar las PBMC del paso (a); (c) lavar las PBMC descongeladas del paso (b) usando un sistema de filtración por membrana; (d) fabricar las células a partir de las PBMC; y (e) lavar las células usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis. En una realización específica, los pasos (a)-(e) en dicho método se realizan en orden.

En una realización específica, en la presente se proporciona un método para preparar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR), que comprende los pasos de: (a) obtener células sanguíneas de la muestra de sangre, por ejemplo, usando leucaféresis o extracción de sangre para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMC); (b) opcionalmente, congelar las células sanguíneas y obtener las PBMC después de la descongelación, u opcionalmente obtener y congelar las PBMC, seguido de descongelación antes de los pasos posteriores; (c) aislar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (d) lavar las PBMC mediante centrifugación; (e) opcionalmente crioconservar las PBMC; (f) opcionalmente, descongelar las PBMC si las PBMC se crioconservan en el paso (e); y (g) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana, por ejemplo, un sistema de filtración por membrana giratoria. En una realización específica, los pasos (a) -(d) se realizan en orden. En una realización específica, los pasos (a)-(g) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para preparar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR), que comprende los pasos de: (a) obtener PBMc de la muestra de sangre; (b) aislar las PBMC que se han obtenido de la muestra de sangre usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (c) lavar las PBMC mediante centrifugación; (d) opcionalmente crioconservar las PBMC; (e) opcionalmente, descongelar las PBMC crioconservadas en el paso (d); y (f) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(f) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para preparar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR), que comprende los pasos de: (a) aislar PBMC que se han obtenido de una muestra de sangre del sujeto, en donde dicho aislamiento usa un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) lavar las PBMC mediante centrifugación; (c) opcionalmente crioconservar las PBMC; (d) opcionalmente, descongelar las PBMC crioconservadas en el paso (c); y (e) lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(e) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para preparar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR), que comprende los pasos de: (a) aislar PBM^cde una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis o de una extracción de sangre, usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) opcionalmente crioconservar las PBMC del paso (a); (c) opcionalmente, descongelar las PBMC del paso (b); y (d) lavar las PBMC descongeladas del paso (c) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(d) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para preparar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR), que comprende los pasos de: (a) aislar PBMc de una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis o de una extracción de sangre, usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) crioconservar las PBMC del paso (a); (c) descongelar las PBMC del paso (b); y (d) lavar las PBMC descongeladas del paso (c) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, los pasos (a)-(d) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para preparar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR), que comprende los pasos de: (a) aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre del sujeto usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) opcionalmente crioconservar y descongelar las PBMC del paso (a); y (c) opcionalmente, lavar las PBMC descongeladas del paso (b) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis. En una realización específica, los pasos (a)-(c) en dicho método se realizan en orden.

En otra realización, en la presente se proporciona un método para preparar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR), que comprende los pasos de: (a) aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre del sujeto usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK); (b) crioconservar y descongelar las PBMC del paso (a); y (c) lavar las PBMC descongeladas del paso (b) usando un sistema de filtración por membrana. En una realización específica, la muestra de sangre es una muestra de sangre de leucoféresis. En una realización específica, los pasos (a)-(c) en dicho método se realizan en orden.

Para cualquiera de las realizaciones anteriores, las células T, las células NK o las células dendríticas pueden aislarse de las PBMC antes de la formulación en solución. En realizaciones más específicas, las células de cualquiera de los métodos anteriores son células T que expresan receptores de antígeno quimérico (células T CAR). Para las células T, pueden usarse perlas magnéticas, como Dynabeads, recubiertas con anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 o anti-CD8 para el aislamiento de células T.

A continuación se analizan con más detalle varios aspectos del proceso de fabricación.

4.2. Crioconservación

Las PBMC o las células, por ejemplo, las células T, que se someten al proceso de fabricación de células, por ejemplo, el proceso de fabricación de células T CAR, descrito en la presente, pueden crioconservarse. Como se usa en la presente, "crioconservación" significa la conservación de células enfriándolas a temperaturas bajo cero, por ejemplo, aproximadamente o justo por debajo del punto de ebullición del nitrógeno líquido, o -196° C. Los agentes crioprotectores se usan preferiblemente a temperaturas bajo cero para evitar que las células se conserven de daños debido a la congelación a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente. Los agentes crioprotectores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelock and Bishop, Nature, 1959; ^{1 8 3}: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576), y polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). Una velocidad de enfriamiento preferida es de ~1° C a 3° C por minuto. Después de por lo menos dos horas, las células T han alcanzado una temperatura de -80° C y pueden colocarse directamente en nitrógeno líquido (-196° C) para almacenamiento permanente, como en un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo.

4.3. Inicio y estimulación del cultivo

Las células T, por ejemplo, células T no modificadas, o células T que expresan CD3 y CD28, o que comprenden un polipéptido que comprende un dominio de señalización de CD3Z y un dominio coestimulador de CD28, pueden expandirse usando anticuerpos contra CD3 y CD28, por ejemplo, anticuerpos unidos a perlas; ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.948.893; 6.534.055; 6.352.694; 6.692.964; 6.887.466; y 6.905.681. Pueden usarse perlas magnéticas, como Dynabeads, recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 para la expansión de células T.

4.4. Receptores de antígeno quimérico

En ciertas realizaciones, las PBMC, por ejemplo, células inmunitarias, más específicamente, células T, producidas durante la realización del método descrito en la presente expresan uno o más receptores de antígeno quimérico (CAR) en su superficie. En general, las CAR comprenden un dominio extracelular de una primera proteína (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario y, opcionalmente, uno o más dominios coestimuladores. En realizaciones preferidas, una vez que el dominio extracelular se une a una proteína objetivo, como un antígeno asociado a un tumor (TAA) o un antígeno específico de un tumor (TSA), se genera una señal a través del dominio de señalización intracelular que activa la célula inmunitaria, por ejemplo, para apuntar y matar una célula que expresa la proteína objetivo.

Dominios extracelulares: Los dominios extracelulares de los CAR se unen a un antígeno de interés. En determinadas realizaciones, el dominio extracelular de CAR comprende un receptor, o una parte de un receptor, que se une a dicho antígeno. En ciertas realizaciones, el dominio extracelular comprende, o es, un anticuerpo o una parte que se une al antígeno del mismo. En realizaciones específicas, el dominio extracelular comprende, o es, un dominio Fv de cadena sencilla (scFv). El dominio Fv de cadena sencilla puede comprender, por ejemplo, una V^lenlazada a una V^h mediante un conector flexible, en donde dichas V^ly V^h son de un anticuerpo que se une a dicho antígeno.

En ciertas realizaciones, el antígeno reconocido por el dominio extracelular de un polipéptido descrito en la presente es un antígeno asociado a tumor (TAA) o un antígeno específico de tumor (TSA). En varias realizaciones específicas, el antígeno asociado al tumor o el antígeno específico del tumor es, sin limitación, Her2, antígeno de células madre prostáticas (PSCA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno del cáncer 125 (CA-125), CA19-9, calretinina, MUC-1, antígeno de maduración de células B (BCMA), proteína de membrana epitelial (EMA), antígeno tumoral epitelial (ETA), tirosinasa, antígeno asociado a melanoma 24 (MAGE), CD19, CD22, ^cD27, C^d30, CD34, CD45, CD70, ^cD99, CD117, EGFRvIII (variante III del factor de crecimiento epidérmico), mesotelina, PAP (fosfatasa ácida prostática), prosteína, TARP (proteína de marco de lectura alternativo gamma del receptor de células T), Trp-p8, STEAPI (antígeno epitelial de transmembrana seis de la próstata 1), cromogranina, citoqueratina, desmina, proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína del líquido de la enfermedad quística macroscópica (GCDFP-15), antígeno HMB-45, proteína melan-A (antígeno del melanoma reconocido por los linfocitos T; MART-I), myo-D1, actina específica de músculo (MSA), neurofilamento, enolasa específica de neurona (NSE), fosfatasa alcalina placentaria, sinaptófisis, tiroglobulina, factor de transcripción tiroideo-1, la forma dimérica de la isoenzima piruvato quinasa tipo M2 (tumor M2-PK), una proteína ras anormal o una proteína p53 anormal. En ciertas otras realizaciones, el TAA o TSA reconocido por el dominio extracelular de un CAR es la integrina avp3 (CD61), galactina o Ral-B.

En ciertas realizaciones, el TAA o TSA reconocido por el dominio extracelular de un CAR es un antígeno de cáncer/testículo (CT), por ejemplo, BAGE, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-ESO-1, NY-SAR-35, OY-TES-1, SPANXBI, SPA17, SSX, SYCPI o TPTE.

En ciertas otras realizaciones, el TAA o TSA reconocido por el dominio extracelular de un CAR es un carbohidrato o gangliósido, por ejemplo, fuc-GMI, GM2 (antígeno oncofetal-inmunogénico-1; OFA-I-1); GD2 (OFA-I-2), GM3, GD3 y similares.

En ciertas otras realizaciones, el TAA o TSA reconocido por el dominio extracelular de un CAR es alfaactinina-4, Bage-I, BCR-ABL, proteína de fusión Bcr-Abl, beta-catenina, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, CEA, coa-l, proteína de fusión dek-can, EBNA, EF2, antígenos del virus Epstein Barr, Proteína de fusión ETV6-AML1, HLA-A2, HLA-All, hsp70-2, KIAA0205, Mart2, Mum-1, 2 y 3, neo-PAP, miosina clase I, OS-9, proteína de fusión pml-RARa, PTPRK, K-ras, N-ras, triosafosfato isomerasa, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, gp100 (Pmel17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-l, MAGE-3, RAGE, GAGE-l, GAGE-2, p15(58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, HRas, HER-2/neu, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos E6 y E7 del virus del papiloma humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 13-Catenina, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, C0-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-C0-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TAG72, TLP o TPS.

En una realización específica, el antígeno asociado al tumor o el antígeno específico del tumor es un antígeno tumoral relacionado con la AML, como se describe en S. Anguille et al, Leukemia (2012), 26, 2186-2196.

Los especialistas en la técnica conocen otros antígenos asociados a tumores y específicos de tumores. En una realización específica en donde el antígeno es BCMA, el receptor de antígeno quimérico es BCMA02 (ver Chekmasova et al., Blood 126:3094 (2015)). En una realización más específica, la célula CAR T que expresa BCMA02 es bb2121 o bb21217.

Los receptores, anticuerpos y scFv que se unen a TSA y TAA, útiles en la construcción de receptores de antígeno quimérico, se conocen en la técnica, al igual que las secuencias de nucleótidos que los codifican.

En ciertas realizaciones específicas, el antígeno reconocido por el dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico es un antígeno que generalmente no se considera un TSA o un TAA, pero que, sin embargo, está asociado con células tumorales o daño causado por un tumor. En ciertas realizaciones, por ejemplo, el antígeno es, por ejemplo, un factor de crecimiento, citoquina o interleucina, por ejemplo, un factor de crecimiento, citoquina o interleucina asociados con angiogénesis o vasculogénesis. Tales factores de crecimiento, citoquinas o interleucinas pueden incluir, por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) o interleucina-8 (IL-8). Los tumores también pueden crear un entorno hipóxico local al tumor. Como tal, en otras realizaciones específicas, el antígeno es un factor asociado a la hipoxia, por ejemplo, HIF-1a, HIF-1 p, HIF-2a, HIF-2p, HIF-3a o HIF-3p. Los tumores también pueden provocar daños localizados en el tejido normal, provocando la liberación de moléculas conocidas como moléculas de patrones moleculares asociados al daño (DAMP, también conocidas como alarminas). En ciertas otras realizaciones específicas, por lo tanto, el antígeno es un DAMP, por ejemplo, una proteína de choque térmico, caja 1 del grupo de ^{alta movilidad de la proteína asociada a la cromatina (HMGB 1), S100A8 (MRP8, calgranulina A), S100A9}(^mR^p14, calgranulina B), amiloide sérico A (SAA), o puede ser un ácido desoxirribonucleico, trifosfato de adenosina, ácido úrico o sulfato de heparina.

Dominio transmembrana: En ciertas realizaciones, el dominio extracelular de CAR se une al dominio transmembrana del polipéptido mediante una secuencia polipeptídica conectora, espaciadora o bisagra, por ejemplo, una secuencia de CD28 o una secuencia de CTLA4. El dominio transmembrana puede obtenerse o derivarse del dominio transmembrana de cualquier proteína transmembrana y puede incluir la totalidad o una parte de dicho dominio transmembrana. En realizaciones específicas, el dominio transmembrana puede obtenerse o derivarse de, por ejemplo, CD8, CD16, un receptor de citoquinas y un receptor de interleucinas, o un receptor de factores de crecimiento, o similares.

Dominios de señalización intracelular: En ciertas realizaciones, el dominio intracelular de un CAR es o comprende un dominio o motivo intracelular de una proteína que se expresa en o proximal a la superficie de las células T y desencadena la activación y/o proliferación de dichas células T. Tal dominio o motivo es capaz de transmitir una señal de unión a antígeno primaria que es necesaria para la activación de un linfocito T en respuesta a la unión del antígeno a la parte extracelular de CAR. Típicamente, este dominio o motivo comprende, o es, un ITAM (motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor). Los polipéptidos que contienen ITAM adecuados para CAR incluyen, por ejemplo, la cadena de CD3 zeta (CD3Z) o partes de la misma que contienen ITAM. En una realización específica, el dominio intracelular es o comprende un dominio de señalización intracelular de CD3Z; a un dominio de señalización intracelular de CD3Z puede hacerse referencia como dominio de señalización primario. En otras realizaciones específicas, el dominio intracelular (dominio de señalización primario) es de una cadena receptora de linfocitos, una proteína del complejo TCR/CD3, una subunidad del receptor Fc o una subunidad del receptor IL-2.

En ciertas realizaciones, el CAR comprende adicionalmente uno o más dominios o motivos coestimuladores, por ejemplo, como parte del dominio intracelular del polipéptido. El uno o más dominios o motivos coestimuladores pueden ser, o pueden comprender, uno o más de una secuencia o dominio polipeptídico de CD27 coestimulador, una secuencia o dominio polipeptídico de CD28 coestimulador, una secuencia o dominio polipeptídico de OX40 (CD134) coestimulador, una secuencia o dominio polipeptídico de 4-1BB (CD137) coestimulador, o una secuencia o dominio polipeptídico coestimulador inducible de células T (ICOS) coestimulador, u otro dominio o motivo coestimulador, o cualquier combinación de los mismos.

El CAR también puede comprender un motivo de supervivencia de células T. El motivo de supervivencia de células T puede ser cualquier secuencia o motivo polipeptídico que facilite la supervivencia del linfocito T después de la estimulación por un antígeno. En ciertas realizaciones, el motivo de supervivencia de células T es, o se deriva de, CD3, CD28, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-7 (IL-7R), un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-12, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-15, un dominio de señalización intracelular del receptor de IL-21 o un dominio de señalización intracelular del receptor del factor de crecimiento transformante p (TGFp).

4.5. Células T (linfocitos T)

Las células T producidas mediante los métodos proporcionados en la presente pueden ser linfocitos T vírgenes o linfocitos T restringidos por MHC. En ciertas realizaciones, los linfocitos T son linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En ciertas realizaciones, las células T son células T citotóxicas (linfocitos T citotóxicos o CTL), células T CD4+, células T CD8+, células T efectoras (T^eff) o células T de memoria central (T^cm).

Las células T pueden ser células NKT (células T asesinas naturales), que se refiere a células T restringidas con CD1d, que expresan un receptor de células T (TCR). A diferencia de las células T convencionales que detectan antígenos peptídicos presentados por moléculas de histocompatibilidad principal convencionales (MHC), las células NKT reconocen antígenos lipídicos presentados por CD1d, una molécula MHC no clásica. Actualmente se reconocen dos tipos de células NKT. Las células NKT invariantes o de tipo I expresan un repertorio de TCR muy limitado - una cadena a canónica (Va24-Ja18 en humanos) asociada con un espectro limitado de cadenas p (Vpl1 en humanos). Una segunda población de células NKT, denominadas células NKT de tipo II no clásicas o no invariantes, muestra un uso de TCR ap más heterogéneo. Las células NKT adaptativas o invariantes (tipo I) pueden identificarse con la expresión de por lo menos uno o más de los siguientes marcadores: TCR Va24-Ja18, Vb11, CD1d, CD3, CD4, CD8, aGalCer, CD161 y/o CD56.

Las células T producidas por los métodos descritos en la presente pueden ser células T modificadas genéticamente, por ejemplo, pueden modificarse para expresar un polipéptido como un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, uno de los CAR descritos en la Sección 4.4 anterior. Las células inmunitarias modificadas, por ejemplo, las células T son preferiblemente autólogas para un individuo al que se van a administrar las células inmunitarias modificadas. En ciertas otras realizaciones, las células inmunitarias modificadas son alogénicas para un individuo al que se van a administrar las células inmunitarias modificadas. Cuando se usan células T alogénicas para preparar células T modificadas, es preferible seleccionar células T que reduzcan la posibilidad de enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en el individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las células T específicas de virus se seleccionan para la preparación de células T modificadas; se espera que dichas células T tengan una capacidad nativa muy reducida para unirse a cualquier antígeno receptor y, por lo tanto, ser activadas por él. En ciertas realizaciones, el rechazo mediado por el receptor de células T alogénicas puede reducirse mediante la coadministración al huésped de uno o más agentes inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, ciclofosfamida o similares.

Las células inmunitarias modificadas, por ejemplo, las células T modificadas, pueden comprender opcionalmente un "gen suicida" o un "interruptor de seguridad" que permite destruir sustancialmente todas las células inmunitarias modificadas cuando se desee. Por ejemplo, las células T modificadas, en ciertas realizaciones, pueden comprender un gen de la timidina quinasa del HSV (HSV-TK), que provoca la muerte de las células T modificadas tras entrar en contacto con ganciclovir. En otra realización, las células T modificadas comprenden una caspasa inducible, por ejemplo, una caspasa 9 inducible (iCaspase9), por ejemplo, una proteína de fusión entre la caspasa 9 y la proteína de unión a FK506 humana que permite la dimerización usando un agente framacéutico de molécula pequeña específico. Ver Straathof et al., Blood 105(11):4247-4254 (2005).

4.6. Fabricación de células T CAR

En ciertas realizaciones, cualquiera de los CAR puede introducirse en cualquiera de las células descritas en la presente utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente. En una realización específica, el método comprende: activar las células, por ejemplo, células T, expandir las células, transducir las células usando un vector, por ejemplo, un vector lentiviral, que codifica un CAR. En una realización específica, las células, por ejemplo, las células T, se activan usando anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 se inmovilizan mediante la unión a receptores Fc en células presentadoras de antígenos endógenos como monocitos y células dendríticas. En realizaciones específicas, las células, por ejemplo, las células T, se expanden usando una bolsa estática y/o expansión usando un biorreactor WAVE (GE Healthcare Life Sciences).

4.7. Células dendríticas

Las células dendríticas (DC) producidas mediante los métodos divulgados en la presente pueden identificarse de la siguiente manera. En su estado inmaduro, las DD pueden caracterizarse por niveles bajos de proteínas de MHC y moléculas coestimuladoras B7, y la capacidad de realizar fagocitosis y pinocitosis, y por la ausencia de las moléculas de superficie CD83 y CD25. En el estado maduro, pueden caracterizarse por un patrón alterado de proteínas de la superficie celular, en donde se aumenta la expresión superficial de algunas o todas las siguientes moléculas: proteínas CD25, CD40, CD70, CD80, CD83, CD86 y MHC. Las DC "maduras" son diferentes de las DC "inmaduras", ya que las primeras son inmunoestimuladoramente más activas, habitualmente conservan la capacidad de migrar a los ganglios linfáticos que drenan in vivo y de presentar antígenos exógenos y cada vez más expresados endógenamente en el contexto del MHC. En condiciones fisiológicas, solo las DC "maduras" son capaces de activas células T vírgenes.

4.8. Células asesinas naturales

Las células asesinas naturales (NK) producidas mediante los métodos proporcionados en la presente pueden definirse por la expresión de CD56 o CD16 y la ausencia del receptor de células T (CD3). Las células NK pueden ser "células NK adaptativas" o "células NK de memoria", cuyos términos son intercambiables y que se refieren a un subconjunto de células NK que son fenotípicamente CD3- y CD56+, expresan NKG2C y c D57 y, opcionalmente, CD16, pero carecen de expresión de uno o más de los siguientes: PLZF, SYK, FceRy y EAT-2. Las subpoblaciones aisladas de células NK CD56+ producidas mediante los métodos proporcionados en la presente pueden comprender la expresión de ligandos de CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR, NKp30, NKp40, NKp46, KIR activadores y/o inhibidores, NKG2A y DNAM-1. CD56+ puede ser una expresión tenue o brillante. Las células NK producidas mediante los métodos descritos en la presente pueden ser células NK modificadas genéticamente, por ejemplo, pueden modificarse para expresar un polipéptido como un receptor de células T (TCR) o receptor de antígeno quimérico (CAR).

4.9. Vectores de expresión y transducción celular

Típicamente, las secuencias de polinucleótidos que expresan un receptor de antígeno quimérico se transportan al interior de la célula (por ejemplo, células T o células Nk ) en un vector de polinucleótidos. Los vectores derivados de retrovirus como los lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. La expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican CAR puede lograrse enlazando operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido de CAR o partes del mismo con un promotor, e incorporando el constructo en un vector de expresión adecuado para la expresión en una célula eucariota, por ejemplo, una célula T.

El vector de expresión generalmente puede proporcionarse a una célula en forma de un vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, lentivirus, virus de la viruela, virus del herpes simple I y similares. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.350.674 y 5.585.362.

En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en por lo menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; y Patente de Estados Unidos N° 6.326.193).

Se han desarrollado una serie de sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la técnica. A continuación, el virus recombinante puede aislarse y administrarse a las células del sujeto ex vivo. Alternativamente, pueden usarse vectores de adenovirus.

Un vector puede comprender un promotor y, opcionalmente, uno o más elementos promotores, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de inicio de la transcripción. Típicamente, estos están localizados en la región 30-110 pb en sentido ascendente del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que una serie de promotores también contienen elementos funcionales en sentido descendente del sitio de inicio. El espacio entre los elementos promotores suele ser flexible, de tal manera que la función promotora se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven unos con respecto a otros. En el promotor de la timidina quinasa (tk), por ejemplo, el espacio entre los elementos del promotor puede aumentarse a 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir. Puede usarse la secuencia promotora de citomegalovirus temprano inmediato (CMV) para impulsar la expresión del CAR. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia de polinucleótidos enlazada operativamente a la misma. Otro ejemplo de un promotor adecuado es el factor de crecimiento de elongación-la (EF-1a). Sin embargo, también pueden usarse otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), promotor de MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor inmediato temprano del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como pero no limitados a, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de la creatina quinasa. Además, la invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. También pueden usarse promotores inducibles, incluyendo pero no limitados a, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona o un promotor de tetraciclina.

Para evaluar la expresión de un polipéptido de CAR en la célula CAR T, el vector de expresión que se introducirá en una célula también puede contener o un gen marcador seleccionable o un gen informador o ambos para facilitar la identificación y selección de las células que se expresan de la población de células buscadas para ser transfectadas o infectadas a través de vectores virales. El marcador seleccionable puede transportarse en un polinucleótido separado y cotransfectarse en la célula T junto con el vector que codifica el CAR. Los marcadores seleccionables y los genes informadores pueden estar flanqueados con secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células huésped. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, como neo y similares.

Pueden usarse genes informadores para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de secuencias reguladoras. En general, un gen informador es un gen que no está presente ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen informador se analiza en un momento adecuado después de que el polinucleótido que lo codifica haya sido introducido en las células receptoras. Los genes informadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse usando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, el constructo con la región flanqueante 5' mínima que muestra el nivel más alto de expresión del gen informador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden estar enlazadas con un gen informador y usarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción impulsada por el promotor.

Los métodos para introducir y expresar genes en células eucariotas, por ejemplo, células T, son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, el vector puede introducirse fácilmente en una célula T mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos físicos para introducir un polinucleótido, por ejemplo, un vector que codifica un CAR, en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación o similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula huésped es la transfección con fosfato de calcio.

5. EJEMPLOS

5.1. Ejemplo 1: Proceso mejorado para la fabricación de células CAR-T

5.1.1. Proceso de referencia

Se desarrolló un proceso de fabricación de células T CAR de referencia para una célula T que expresa receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido por BCMA (ver Hollyman et al., J. Immunother. 2009, 32:169-180). Los parámetros del proceso de fabricación, como el aislamiento de las PBMC, la activación de células T, la transducción y la expansión, se desarrollaron y optimizaron inicialmente usando un proceso basado en matraces T a pequeña escala. Una vez que se establecieron y optimizaron los parámetros del proceso, se amplió a escala el proceso para la fabricación clínica. El proceso comenzó con la leucaféresis, seguido del aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad usando un Cell-Saver 5+ (CS5+; Haemonetics, Braintree, Massachusetts); un lavado de precultivo usando un cultivo de centrifugación por lotes de las PBMC resultantes en medio TCGM-HABS (medio de crecimientos de células T que comprende medio de células hematopoyéticas definidas químicamente X-VIVO-15™ (Lonza, Basilea, Suiza) sin rojo de fenol, suplementado con 5% v/v de suero AB humano GlutaMAX™ 2 mM (Gibco), HEPES 10 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (Thermo Fisher Scientific) y 300 UI/ml de interleucina-2 humana recombinante (rhIL2)). También se probó el mismo medio, suplementado adicionalmente con piruvato de sodio al 1% y vitaminas esenciales mínimas al 1%, y se descubrió que dio como resultado un número equivalente de duplicaciones de población durante ocho días. Por simplicidad, para el proceso se seleccionó TCGM-HABS. Después de la comparación con medios adicionales, se redujo la concentración de rhIL2 de 300 UI/ml a 100 UI/ml.

Luego, las células T dentro de las PBMC se activaron usando anticuerpos solubles anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados mediante la unión a receptores Fc en células presentadoras de antígenos endógenos, como monocitos y células dendríticas. La activación de las células T se confirmó determinando el tamaño de las células; las células T en reposo tienen un volumen de ~180 a 200 fL, mientras que las células T fuertemente activadas aumentan de tamaño hasta >500 fL. El paso de activación fue seguido de expansión en una bolsa estática seguido de expansión en un biorreactor WAVE (G^eHealthcare Life Sciences). La expansión fue seguida por la transducción de las células T expandidas con un vector lentiviral que codifica el CAR dirigido a BCMA. En base a estudios que utilizan un intervalo de multiplicidades de infección de 0.625 a 40, y monitorizan las duplicaciones de población, el tamaño celular y la expresión del CAR anti-BCMA, se usó un intervalo de 10-30 MOI para el proceso de fabricación clínica base. Las células resultantes se recogieron y lavaron después de la recogida usando un dispositivo CD5+.

Sin embargo, los pasos iniciales en el proceso de referencia, desde la leucaféresis hasta la activación de las células T, requirieron algunos pasos laboriosos, en particular, se modificaron el aislamiento inicial de PBMC y el lavado dependiente de la centrifugación en gradiente de densidad para mejorar la eficiencia.

5.1.2. Proceso mejorado

La consistencia del proceso de fabricación de células T es clave para la consistencia en la producción de productos farmacéuticos de células T CAR. Con este fin, se buscó mejorar el proceso de referencia mediante la sustitución de un paso de aislamiento LOVO-ACK, un lavado de inicio de precultivo LOVO y un paso de lavado LOVO final, en lugar de los pasos dependientes del dispositivo CS5+ del proceso de referencia.

El proceso de aislamiento de PBMC LOVO-ACK consistía en dos pasos realizados en secuencia: un lavado usando el sistema de procesamiento celular automatizado LOVO (Fresenius Kabi, Lake Zurich, Illinois; al que se hace referencia en la presente "LOVO"), seguido de incubación con tampón de lisis ACK (amonio-cloruro-potasio). El tampón ACK es NH4Cl 150 mM, KHCO³10 mM y EDTA sódico 0,1 mM en agua (por ejemplo, agua desionizada). El paso de lavado LOVO usa el sistema de procesamiento celular automatizado LOVO, que presenta un sistema de filtración por membrana giratoria diseñado para eliminar de manera eficaz las plaquetas y los restos celulares a la vez que retiene las poblaciones de PBMC en el material de leucaféresis inicial. El paso de lavado se lleva a cabo dentro de un kit desechable LOVO de un solo uso preesterilizado cerrado que cuenta con un dispositivo de separación celular (sistema de filtración por membrana giratoria) para facilitar la eliminación de plaquetas, restos celulares y plasma.

Después del paso de lavado LOVO, se añadió tampón ACK a la suspensión celular restante para lisar los glóbulos rojos. Este paso se realizó en una bolsa de transferencia con una superficie de contacto celular compuesta de cloruro de polivinilo. Luego, las PBMC empobrecidas en RBC se separaron de la solución tampón ACK y se lavaron mediante centrifugación.

Luego, las PBMC aisladas y lavadas se crioconservaron opcionalmente (si se iban a enviar antes de su uso) usando técnicas estándar de crioconservación y congelación a velocidad controlada. Las células se descongelaron en un baño a 37° inmediatamente antes de su uso posterior. En tres lotes de prueba, las células crioconservadas produjeron cantidades adecuadas de células T y, después de la fabricación de CAR T, células T CAR+.

Después de la descongelación, las PBMC se sometieron a un proceso de cultivo celular que comprendía el inicio del cultivo y la estimulación con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (Día 0); transducción de células T con un vector lentiviral que lleva secuencias codificantes para el receptor de antígeno quimérico anti-BCMA (Día 1); el recuento de células y resiembra en bolsas de cultivo celular permeables al gas (Días 2-5); el recuento de células y la resiembra en un WAVE™ Bioreactor (Días 6-9); seguido de la recogida de células y un lavado final usando el dispositivo LOVO (Día 10).

Por lo tanto, los pasos finales en el proceso LOVO-ACK mejorado son los siguientes:

a. Leucaféresis;

b. Aislamiento LOVO-ACK de PBMC;

c. Lavado de PBMC por centrifugación;

d. Crioconservación de PBMC (si se va a enviar);

e. Descongelación de PBMC (si se envió);

f. Lavado de PBMC usando LOVO

g. Activación, expansión y recogida de células T;

h. Lavar usando LOVO.

El proceso mejorado tenía las ventajas sobre el proceso de referencia de pasos de proceso cerrados (reduciendo la probabilidad de contaminación); robustez y reproducibilidad mejoradas de la preparación de PBMC; reducción del tiempo de procesamiento de productos farmacéuticos; y reducción en la complejidad general del proceso.

5.2. Ejemplo 2: Estudios de superioridad de procesos mejorados

Comparación del proceso de aislamiento de referencia y proceso de aislamiento LOVO-ACK

Este ejemplo muestra que, para algunos parámetros, el proceso mejorado es superior al proceso de referencia.

Se llevó a cabo un estudio de viabilidad que comparó el proceso de aislamiento de PBMC CS5+ de referencia con el proceso de aislamiento de PBMC LOVO-ACK con unidades de leucaféresis de 3 donantes sanos y 2 sujetos con mieloma múltiple (MM). Después del aislamiento de PBMC lado a lado con el proceso de referencia y el proceso LOVO ACK, las PBMC aisladas se crioconservaron y procesaron usando los mismos métodos de cultivo celular, formulación de DP y crioconservación. Como se resume a continuación, la viabilidad y composición fenotípica de las PBMC, los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ de las PBMC, la caracterización del cultivo celular y los resultados de las pruebas de liberación del producto farmacéutico demostraron que el proceso de aislamiento LOVO-ACK es un reemplazo factible para el procedimiento de aislamiento de PBMC CS5+.

Aislamiento y recuperación de PBMC

El paso de aislamiento de PBMC está diseñado para eliminar los glóbulos rojos (RBC) y las plaquetas (PLT) del material de partida de la leucaféresis. Como se ilustra en la Tabla 1, el método de aislamiento de PBMC actualizado dio como resultado una reducción más extensa y constante de glóbulos rojos (RBC) y el agotamiento de plaquetas (PLT), mejorando por lo tanto la calidad de las PBMC para el inicio del cultivo celular.

Tabla 1 - Com aración de antes des ués del cambio de RBC/WBC PLT/WBC de PBMC

continuación

Como los dos procesos de PBMC utilizaron diferentes dispositivos para el aislamiento de PBMC, se evaluó y comparó el rendimiento celular obtenido del paso de aislamiento de PBMC. Como se muestra en la Tabla 2, las recuperaciones de PBMC del valor de referencia y los rendimientos de los procesos actualizados fueron muy similares, con una diferencia media antes y después del cambio de -2 puntos porcentuales.

Tabla 2 - Com aración de recu eraciones de aislamiento de PBMC

Por tanto, el proceso mejorado mostró aislamiento y recuperación de PBMC y eliminación de RBC; y eliminación de plaquetas superior, en comparación con el proceso de referencia.

Caracterización de cultivos celulares en proceso - Comparación de crecimiento de células T y activación máxima de células T

Los resultados de la caracterización del cultivo celular se presentan en la Tabla 3. Las células T fabricadas a partir de los procesos de referencia y actualizados mostraron cinéticas de crecimiento comparables, como lo demuestra el grado similar de crecimiento de las células T (la diferencia media antes y después del cambio en el crecimiento de las células T es -1 duplicación de la población) y el perfil de activación (la media del día de activación máxima antes y después del cambio en el cultivo celular es la misma).

Tabla 3 - Crecimiento de células T día de activación de células T máximo en cultivo celular

Resultados de caracterización de productos farmacéuticos en proceso - Recuperaciones de lavado después de la recogida

Como los dos procesos de productos farmacéuticos utilizaron diferentes dispositivos para el paso de lavado después de la recogida del Día 10, se evaluó y comparó el rendimiento celular obtenido en el paso de lavado posterior a la recogida. Como se muestra en la Tabla 4, las recuperaciones de producto farmacéutico (células T CAR) del lavado después de la recogida que resultaron del proceso actualizado mejoraron notablemente con respecto al proceso de referencia, con un aumento medio observado de 30 puntos porcentuales.

-

Por tanto, el proceso mejorado muestra una recuperación marcadamente superior de las células T CAR, en comparación con el proceso de referencia.

5.3. Ejemplo 3: Estudios de comparabilidad de procesos mejorados

Este ejemplo demuestra que, con respecto a otros parámetros, el proceso mejorado es comparable al proceso de referencia.

Se compararon los procesos de aislamiento de PBMC de referencia y mejorados y se determinaron para producir resultados equivalentes, de la siguiente manera. Las condiciones de cambio del proceso se describen en la Tabla 5. Para cada donante sano, la unidad de leucaféresis se dividió uniformemente para el dispositivo CS5+ de referencia y los métodos de aislamiento de PBMC "LOVO-ACK" actualizados. Después del paso de aislamiento de PBMC, los lotes de PBMC se crioconservaron o se usaron para iniciar el cultivo celular sin crioconservación. Antes del inicio del cultivo celular, las PBMC se lavaron mediante centrifugación por lotes o el dispositivo de procesamiento celular LOVO. Se usaron bolsas de cultivo celular permeables al gas durante toda la duración del cultivo celular. En el día 10, la sustancia farmacéutica después de la recogida se lavó con el dispositivo CS5+ o el dispositivo de procesamiento celular LOVO. El producto farmacéutico formulado se crioconservó en bolsas para la evaluación de comparabilidad in vivo y el ensayo de estabilidad en uso posterior a la congelación o en viales para la evaluación de la comparabilidad in vitro.

T l - n i i n m i r r l v l i n m r ili

El estudio de comparabilidad se realizó con cinco unidades de leucaféresis de donantes sanos, a partir de las cuales se generaron diez lotes de células T CAR anti-BCMA (antes y después del cambio de método para cada uno).

Cada una de las unidades de leucaféresis de partida se dividió y procesó para el aislamiento de las PBMC con los procesos de referencia y actualizados en paralelo. Se crioconervaron tres de los cinco lotes de PBMC, seguido de descongelación e inicio del cultivo celular, mientras que los dos lotes de PBMC restantes se procesaron inmediatamente para el inicio del cultivo celular sin congelación. La comparabilidad de PBMC crioconservadas (paso de retención de PBMC) y frescas (sin paso de retención de PBMC) en el proceso de fabricación de células T CAR anti-BCMA se había establecido previamente. Al final del cultivo celular, los procesos de referencia y actualizados continuaron con los pasos de recogida y procesamiento del producto farmacéutico, incorporando sus métodos de lavado celular respectivos. Las muestras de prueba de productos farmacéuticos en proceso y crioconservadas generadas con los procesos de referencia y actualizados se evaluaron de acuerdo con un plan de prueba analítico comparativo como se describe a continuación.

Pruebas analíticas comparativas

En la Tabla 6 se proporcionan los resultados de la comparación de viabilidad de las PBMC. No hubo una diferencia constante en la viabilidad, con una diferencia media antes y después del cambio de 2 puntos porcentuales.

Tabla 6 - Com aración de viabilidad de PBMC antes des ués del cambio

Comparación de la composición de PBMC

Los resultados de la comparación de la composición de PBMC se proporcionan en la Tabla 7 para leucocitos CD45+, células T CD3+CD56-, monocitos CD14+ y en la Tabla 8 para células B CD19+, células NK C^d3-CD56+ y granulocitos CD56-CD16+, respectivamente. Las composiciones de PBMC fueron comparables, ya que las diferencias medias antes y después del cambio en leucocitos CD45+, células T CD3+CD56-, monocitos CD14+, células B CD19+ y células NK CD3-CD56+ fueron de 1, 2, 1, -1 y -1 puntos porcentuales respectivamente. No hubo presencia significativa de granulocitos CD56-CD16+ (no detectados) con ninguno de los procesos. En conjunto, las composiciones de PBMC fueron consistentes a lo largo de los procesos de referencia y actualizados.

Tabla 7 - Com osición de PBMC: leucocitos CD45+ células T CD3+CD56- monocitos CD14+

Tabla 8 - Com osición de PBMC: células B CD19+ células NK CD3-CD56+ ranulocitos CD56-CD16+

Comparación de expresión de células T CD4+ y CD8+ de PBMC

La población de células T de PBMC se caracterizó adicionalmente para la expresión de CD4+ y CD8+. Como se muestra en la Tabla 9, la distribución del subconjunto de CD4+/CD8+ de las células T de PBMC fue comparable entre los dos procesos, siendo la diferencia media antes y después del cambio para las células CD4+ y CD8+ dentro de la población de células T de -3 y 3 puntos porcentuales, respectivamente.

T l - n n l l T D4+ D PBM

Se observaron diferencias entre los datos de composición de leucocitos de PBMC de donantes normales generados para esta evaluación de comparabilidad de cambio de proceso y los datos de PBMC de pacientes con mieloma múltiple (MM) de un estudio anterior. En comparación con los donantes sanos, las PBMC de pacientes con MM comprenden cantidades más bajas de células B y células T, y cantidades más altas de monocitos.

Además, la proporción de CD4+/CD8+ dentro de la población de células T también fue diferente. Usando el proceso de referencia, los porcentajes medios (N=5) de células B, células T y monocitos en lotes de PBMC de donantes sanos fueron del 9,7% ± 4,2%, 40,6% ± 13,1%, 30,0% ± 7,8%, respectivamente. La proporción media (N=5) de células T CD4+/CD8+ de los lotes de PBMC de donantes sanos fue del 58,8%/32,7% de células T. Usando el mismo proceso de PBMC de referencia, los porcentajes medios (N=24) de células B, células T y monocitos en lotes de Pb MC de CRB-401 fueron del 1,9% ± 1,5%, 29,9% ± 15,7%, 56,4% ± 19,4%, respectivamente. La proporción media (N=24) de células T CD4+/CD8+ de los lotes de PBMC de CRB-401 fue del 40,8%/54,4% de células T. Tales diferencias observadas en los dos conjuntos de datos no estaban relacionadas con el cambio del proceso y eran consistentes con las informadas en la bibliografía científica.

Por tanto, según los parámetros anteriores, el proceso mejorado es comparable al proceso de referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto del que se obtiene una muestra de sangre, que comprende los pasos de:

a. obtener PBMC de la muestra de sangre;

b. aislar las PBMC que se han obtenido de la muestra de sangre usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK);

c. lavar las PBMC mediante centrifugación;

d. lavar las PBMC usando un sistema de filtración por membrana;

e. fabricar las células T CAR a partir de las PBMC del paso (d); y

f. lavar las células T CAR del paso (e) usando un sistema de filtración por membrana.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además crioconservar las PBMC del paso (c).

3. El método de la reivindicación 2, en donde el método comprende además descongelar las PBMC crioconservadas.

4. Un método para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de leucaféresis de un sujeto, que comprende los pasos de:

a. aislar las PBMC de la muestra de sangre de leucaféresis usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amonio-cloruro-potasio (ACK);

b. crioconservar las PBMC del paso (a);

c. descongelar las PBMC del paso (b);

d. lavar las PBMC descongeladas del paso (c) usando un sistema de filtración por membrana giratoria;

e. fabricar las células T CAR a partir de las PBMC del paso (d); y

5. Un método para fabricar células T que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) (células T CAR) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una muestra de sangre de un sujeto, que comprende los pasos de:

a. aislar las PBMC de la muestra de sangre usando un sistema de filtración por membrana y tampón de amoniocloruro-potasio (ACK);

b. crioconservar y descongelar las PBMC del paso (a);

C. lavar las PBMC descongeladas del paso (b) usando un sistema de filtración por membrana;

d. fabricar las células T CAR a partir de las PBMC; y

e. lavar las células T CAR usando un sistema de filtración por membrana giratoria.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde cualquiera o todos los sistemas de filtración por membrana son un sistema de filtración por membrana giratoria.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el sistema de filtración por membrana giratoria es un sistema de procesamiento celular automatizado LOVO.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el tampón ACK comprende cloruro amónico 50 300 mM, carbonato potásico 5-25 mM y EDTA sódico 0,05-0,25 mM.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho tampón ACK comprende cloruro amónico 150 mM, carbonato potásico 10 mM y EDTA sódico 0,1 mM.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho método mejora la reducción de plaquetas y glóbulos rojos de dichas PBMC en un 18%-36% en comparación con el mismo método usando centrifugación en gradiente de densidad en lugar de cada uso de filtración por membrana.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho método mejora la recuperación de células T CAR después de la fabricación de células T CAR en un 17%-36% en comparación con el mismo método usando centrifugación en gradiente de densidad en lugar de cada uso de filtración por membrana.