ES2930433T3 - Hidrogel termosensible que contiene micropartículas de polímero para la administración ocular no invasiva de fármaco - Google Patents

Abstract

Un método para la administración sostenida de un agente a un órgano ocular en un sujeto, que comprende administrar tópicamente a la superficie ocular un hidrogel líquido termosensible que comprende micropartículas poliméricas cargadas con agente, en el que el agente se libera de manera sostenida durante un período de al menos cinco días. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Hidrogel termosensible que contiene micropartículas de polímero para la administración ocular no invasiva de fármaco

REIVINDICACIÓN DE PRIORIDAD

La presente reivindica el beneficio de la solicitud de patente de EE. UU. N.° 61/773.076, presentada el 5 de marzo de 2013.

ANTECEDENTES

Se estima que casi 4 millones de adultos serán diagnosticados con glaucoma de ángulo abierto en el año 2020, la mayoría de los cuales serán tratados con una pauta diaria de medicación hipotensora ocular (Friedman et al., 2004). Estos fármacos reductores de IOP se administran como colirios, que deben ser administrados frecuentemente por el paciente para reducir el riesgo de pérdida de visión irreversible. El riguroso programa de administración, la ausencia inicial de síntomas y la difícil administración de las gotas conducen a tasas de cumplimiento del paciente extremadamente bajas (Hermann et al., 2010). Además, la administración de los colirios requiere altas concentraciones de fármaco para vencer las muchas barreras a la absorción en el ojo (Ghate y Edelhauser, 2008).

Uno de los principales factores de riesgo del glaucoma, la segunda causa principal de ceguera en todo el mundo, es la hipertensión ocular sostenida. La reducción de la presión intraocular (IOP) en pacientes con glaucoma normalmente se lleva a cabo a través de la administración de colirios varias veces al día, cuya difícil y frecuente naturaleza contribuyen a tasas de cumplimiento de tan solo el 50 %. El tartrato de brimonidina (BT), una medicación para el glaucoma común que requiere administración cada 8-12 horas, tiene que ser todavía adaptado en una formulación de liberación controlada que podría mejorar espectacularmente el cumplimiento.

El documento de patente US 2011/0189291 A1 describe hidrogeles formados a partir de dendrímeros fotoactivados. Los dendrímeros fotoactivables descritos en ese documento incluyen dendrímeros con los que se ha conjugado una pluralidad de cadenas de polímero, y grupos fotoactivables reactivos unidos a grupos funcionales terminales de las cadenas conjugadas.

SUMARIO

La presente invención se define por las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes representan realizaciones adicionales de la invención.

Una realización en el presente documento desvela un hidrogel termosensible líquido que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente, en donde las micropartículas de polímero comprenden poliglicolida, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), alginato, policaprolactona, celulosa, dextrano, quitosano, o una combinación de los mismos, y en donde el hidrogel termosensible comprende poli(n-isopropilacrilamida), poli(N,N-dimetilacrilamidaco-N-fenilacrilamida), poli(metacrilato de glicidilo-co-N-isopropilacrilamida), poli(óxido de etileno)-b-poli(óxido de propileno)-b-poli(óxido de etileno), copolímero de poli(etilenglicol)-poliéster, o una combinación de los mismos, para su uso en la administración sostenida del agente a un órgano ocular en un sujeto, en donde el hidrogel termosensible líquido que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente se administra por vía tópica a la superficie ocular, el agente es un agente terapéutico, un agente de diagnóstico o un agente de obtención de imágenes, y en donde el hidrogel termosensible líquido que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente se administra a la superficie ocular en forma de un colirio en un intervalo superior a al menos un día, preferentemente en un intervalo de al menos cinco días, entre administraciones.

En algunas realizaciones, las micropartículas de polímero cargadas de agente tienen un diámetro promedio en volumen de 1 a 10 gm. En algunas realizaciones, el agente está encapsulado en las micropartículas de polímero. En algunas realizaciones, el agente es un agente terapéutico que reduce preferentemente la presión intraocular. En algunas realizaciones, el uso incluye tratar una afección ocular en el sujeto, preferentemente glaucoma. En algunas realizaciones, el agente se libera de forma sostenible durante un periodo de al menos un día, preferentemente al menos cinco días.

En el presente documento también se desvela una composición que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente dispersadas dentro de un hidrogel termosensible, en donde las micropartículas de polímero comprenden poliglicolida, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), alginato, policaprolactona, celulosa, dextrano, quitosano, o una combinación de los mismos, en donde el hidrogel termosensible comprende poli(nisopropilacrilamida), poli(N,N-dimetilacrilamida-co-N-fenilacrilamida), poli(metacrilato de glicidilo-co-N-isopropilacrilamida), poli(óxido de etileno)-b-poli(óxido de propileno)-b-poli(óxido de etileno), copolímero de poli(etilenglicol)-poliéster, o una combinación de los mismos, en donde el agente es un agente para tratar una afección ocular y la composición está configurada para liberación ocular tópica sostenida del agente.

En algunas realizaciones, en donde el agente es un agente que reduce la presión intraocular, las micropartículas son biodegradables, y el hidrogel no es biodegradable. En algunas realizaciones, las micropartículas de polímero cargadas de agente tienen un diámetro promedio en volumen de 1 a 10 gm.

Lo anterior será más evidente a partir de la siguiente descripción detallada, que se desarrolla con referencia a las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Imágenes de SEM de micropartículas de PLGA cargadas con tartrato de brimonidina (BTMP). Estas imágenes confirman el tamaño deseado y la morfología de BTMP, de acuerdo con las mediciones de la impedancia en volumen (diámetro promedio en volumen = 7,46 ± 2,86 pm).

Figura 2: Liberación in vitro de brimonidina de MP de PLGA (n=3). También se muestran las cantidades máximas y mínimas teóricas de brimonidina absorbida, basadas en 2 gotas al día de disolución de BT al 0,2 % y 1 -7 % de absorción (Ghate y Edelhauser, 2008), así como 0,66 mg de brimonidina por mg de BT.

Figura 3: Ampolla de BTMP en el espacio subconjuntivo de conejo enano holandés en el día 1 de estudio. Figura 4: Mediciones reales de IOP en cada uno de los tres grupos hechas en A) el ojo derecho (ojo tratado) y B) el ojo izquierdo (ojo no tratado). N=3 para grupos de BTMP y BT tópico; n=2 para el grupo de blanco de MP. Figura 5: Delta de los valores de IOP (nivel basal menos el día en curso) para cada uno de los grupos en A) el ojo derecho (ojo tratado) y B) el ojo izquierdo (ojo no tratado). N=3 para grupos de BTMP y BT tópico; n=2 para el grupo de blanco de MP.

Figura 6: BTMP parcialmente degradadas en el espacio subconjuntivo (teñidas con tricromo de Masson) tras el sacrificio en el día 28 del estudio.

Figura 7A, 7B y 7C: Una representación de una realización de administrar una realización del sistema de administración de micropartículas/hidrogel desvelado en el presente documento.

Figura 8: La liberación del agente no se ve afectada cuando las micropartículas se cargan en el hidrogel. Recuadro: SEM del hidrogel que contiene las micropartículas cargadas con BT (barra de escala = 10 pm). Figura 9: Liberación teórica y real de Gd-DOTA y brimonidina de las micropartículas de polímero (datos de liberación de brimonidina de la Figura 2 y 8 con el eje y modificado para representar el % de liberación total). Figura 10: Imágenes de RM ponderadas en T1 de cerebro completo de NZW 24 h después de la inyección intravítrea de gel termosensible que contiene A) MP cargadas con Gd-DOTA y b) Gd-DOTA soluble solo. Las inyecciones fueron en el ojo derecho solo; barridos realizados en 1 h desde el sacrificio.

Figura 11: Una imagen fotográfica de la resección quirúrgica de la membrana nictitante de conejo antes de la administración de las gotas.

Figuras 12A y 12B: Una imagen fotográfica que muestra la administración de gotas de gel/micropartículas (Figura 12A). No se usó sujeción ni sedación durante este tiempo para ninguno de los conejos. La presencia de la gota de gel en el fondo inferior se confirmó visualmente inmediatamente después de la instilación (Figura 12B). Figura 13: Imágenes fotográficas que muestran la presencia de la gota de gel/micropartículas en el fondo inferior desde los días 7-28. Obsérvese que la visibilidad de los geles fue enormemente reducida desde el día 21-28. Los geles se tiñeron con fluoresceína para confirmar la presencia.

Figuras 14A y 14B: Datos de presión intraocular para gotas de BT (control positivo), micropartículas cargadas con BT (BTMP, tratamiento experimental previo), gel/BTMP (GelMP, tratamiento experimental actual) y blanco de micropartículas (blanco de MP, control negativo). Estos resultados se informaron para el ojo tratado (Figura 14A) y el ojo contralateral no tratado (Figura 14B). La leyenda que indica significancia estadística se aplica tanto a la Figura 14A como a la Figura 14B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Terminología

Se proporcionan las siguientes explicaciones de términos y métodos para describir mejor los presentes compuestos, composiciones y métodos, y para guiar a los expertos habituales en la técnica en la práctica de la presente divulgación. Un "animal" se refiere a organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye, por ejemplo, mamíferos y aves. El término mamífero incluye tanto mamíferos humanos como no humanos. Similarmente, el término "sujeto" incluye tanto sujetos humanos como no humanos, que incluye aves y mamíferos no humanos, tales como primates no humanos, animales de compañía (tales como perros y gatos), ganado (tal como cerdos, ovejas, vacas), así como animales no domesticados, tales como los grandes felinos.

El término "co-administración" o "co-administrar" se refiere a la administración de un agente desvelado en el presente documento con al menos otro agente terapéutico o de diagnóstico dentro del mismo periodo de tiempo general, y no requiere la administración en el mismo momento exacto en el tiempo (aunque la co-administración incluye administrar en el mismo momento exacto en el tiempo). Por lo tanto, la co-administración puede ser el mismo día o en días diferentes, o en la misma semana o en semanas diferentes. En ciertas realizaciones, se puede coadministrar una pluralidad de agentes terapéuticos y/o de diagnóstico por encapsulación de los agentes dentro de las micropartículas desveladas en el presente documento.

"Inhibir" se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o afección. "Inhibir" también se refiere a cualquier reducción cuantitativa o cualitativa en la actividad biológica o unión, con respecto a un control.

"Micropartícula", como se usa en el presente documento, a menos que se especifique de otro modo, se refiere, en general, a una partícula de un tamaño relativamente pequeño, pero no necesariamente en el intervalo de tamaño micrométrico; el término se usa en referencia a partículas de tamaños que pueden ser, por ejemplo, administradas al ojo en forma de un colirio que se puede administrar de un envase con boquilla exprimible, y así pueden ser inferiores a 50 nm a 100 micrómetros o mayores. En una realización, las partículas tienen un diámetro desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 micrómetros, preferentemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 micrómetros, más preferentemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5 micrómetros. Como se usa en el presente documento, la micropartícula engloba microesferas, microcápsulas y micropartículas, a menos que se especifique lo contrario. Una micropartícula puede ser de construcción de material compuesto y no es necesariamente una sustancia pura; puede ser esférica o de cualquier otra forma.

"Región ocular" o "sitio ocular" significa cualquier área del ojo, que incluye el segmento anterior y posterior del ojo, y que, en general, incluye, pero no se limita a, cualquier tejido funcional (por ejemplo, para la visión) o estructural encontrado en el globo ocular, o tejidos o capas celulares que revisten parcialmente o completamente el interior o exterior del globo ocular. Las regiones oculares incluyen la cámara anterior, la cámara posterior, la cavidad vítrea, la coroides, el espacio supracoroideo, el espacio subrretiniano, la conjuntiva, el espacio subconjuntivo, el espacio epiesclerótico, el espacio intracorneal, el espacio epicorneal, la esclerótica, la parte plana, las regiones avasculares quirúrgicamente inducidas, la mácula y la retina.

"Afección ocular" significa una enfermedad, dolencia o afección que afecta o implica al ojo o a una de las partes o regiones del ojo. En término generales, el ojo incluye el globo ocular y los tejidos y líquidos que constituyen el globo ocular, los músculos perioculares (tales como los músculos oblicuo y recto) y la porción del nervio óptico que está dentro de o es adyacente al globo ocular.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente especificado suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto que está tratándose con ese agente. Idealmente, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente es una cantidad suficiente para inhibir o tratar la enfermedad o afección sin causar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto. La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente dependerá del sujeto que está tratándose, la intensidad de la aflicción y el modo de administración de la composición terapéutica. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" puede ser un nivel o cantidad de agente necesario para tratar una afección ocular, o reducir o prevenir la lesión o daño ocular sin causar efectos adversos negativos o secundarios significativos al ojo o una región del ojo

"Tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica después de que se haya empezado a desarrollar, o administrar un compuesto o composición a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad o solo presenta signos tempranos con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patología o afección, o reducir la intensidad de una patología o afección. Como se usa en el presente documento, el término "mejorar", con referencia a una enfermedad o afección patológica, se refiere a cualquier efecto beneficioso observable del tratamiento. El efecto beneficioso puede ser demostrado, por ejemplo, por una aparición retrasada de los síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, una reducción en la intensidad de algunos o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una mejora en la salud general o bienestar del sujeto, o por otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos de la enfermedad particular. La expresión "tratar una enfermedad" se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad, por ejemplo, en un sujeto que está en riesgo de una enfermedad, tal como glaucoma. "Prevenir" una enfermedad o afección se refiere a la administración profiláctica de una composición a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad o solo presenta signos tempranos con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patología o afección, o reducir la intensidad de una patología o afección. En ciertas realizaciones, "tratar" significa una reducción o resolución o prevención de una afección ocular, lesión o daño ocular, o promover la curación de tejido ocular lesionado o dañado

Las "composiciones farmacéuticas" son composiciones que incluyen una cantidad (por ejemplo, una dosis unitaria) de uno o más de los compuestos desvelados junto con uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables no tóxicos, que incluyen vehículos, diluyentes y/o adyuvantes, y opcionalmente otros principios biológicamente activos. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden preparar por técnicas de formulación farmacéutica habituales, tales como las desveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (19a edición).

Los términos "sal o éster farmacéuticamente aceptable" se refieren a sales o ésteres preparados mediante medios convencionales que incluyen sales, por ejemplo, de ácidos inorgánicos y orgánicos, que incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido málico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido fenilacético, ácido mandélico y similares. "Sales farmacéuticamente aceptables" de los compuestos actualmente desvelados también incluyen las formadas a partir de cationes, tales como sodio, potasio, aluminio, calcio, litio, magnesio, cinc, y de bases, tales como amoniaco, etilendiamina, N-metil-glutamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris(hidroximetil)aminometano e hidróxido de tetrametilamonio. Estas sales se pueden preparar mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, haciendo reaccionar el ácido libre con una base orgánica o inorgánica adecuada. Cualquier compuesto químico citado en esta memoria descriptiva se puede administrar alternativamente como una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las "sales farmacéuticamente aceptables" también incluyen el ácido libre, la base y las formas de ion bipolar. Se pueden encontrar descripciones de sales farmacéuticamente aceptables adecuadas en Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use, Wiley VCH (2002). Cuando los compuestos desvelados en el presente documento incluyen una función de ácido, tal como un grupo carboxi, entonces pares de cationes adecuados farmacéuticamente aceptables para el grupo carboxi son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio, amonio cuaternario y similares. Dichas sales son conocidas por los expertos en la técnica. Para ejemplos adicionales de "sales farmacológicamente aceptables", véase Berge et al., J. Pharm. Sci. 66:1 (1977).

"Ésteres farmacéuticamente aceptables" incluyen los derivados de los compuestos descritos en el presente documento que se modifican para incluir un grupo carboxilo. Un éster hidrolizable in vivo es un éster, que se hidroliza en el cuerpo humano o animal para producir el ácido o alcohol parental. Así, los ésteres representativos incluyen ésteres de ácido carboxílico en los que el resto no de carbonilo de la porción de ácido carboxílico del agrupamiento de éster se selecciona de alquilo de cadena lineal o ramificado (por ejemplo, metilo, n-propilo, t-butilo o n-butilo), cicloalquilo, alcoxialquilo (por ejemplo, metoximetilo), aralquilo (por ejemplo, bencilo), ariloxialquilo (por ejemplo, fenoximetilo), arilo (por ejemplo, fenilo, opcionalmente sustituido con, por ejemplo, halógeno, alquilo C. sub. 1-4 o alcoxi C. sub. 1-4) o amino); ésteres de sulfonato, tales como alquil- o aralquilsulfonilo (por ejemplo, metanosulfonilo); o ésteres de aminoácido (por ejemplo, L-valilo o L-isoleucilo). Un "éster farmacéuticamente aceptable" también incluye ésteres inorgánicos, tales como ésteres de mono-, di- o tri-fosfato. En dichos ésteres, a menos que se especifique de otro modo, cualquier resto de alquilo presente en dichos ésteres contiene ventajosamente desde 1 hasta 18 átomos de carbono, particularmente desde 1 hasta 6 átomos de carbono, más particularmente desde 1 hasta 4 átomos de carbono. Cualquier resto de cicloalquilo presente en dichos ésteres contiene ventajosamente desde 3 hasta 6 átomos de carbono. Cualquier resto arilo presente en dichos ésteres comprende ventajosamente un grupo fenilo, opcionalmente sustituido como se muestra en la definición de carbociclilo anteriormente. Por lo tanto, los ésteres farmacéuticamente aceptables incluyen ésteres C¹-C²² de ácidos grasos, tales como acetilo, t-butilo o ácidos grasos insaturados lineales o ramificados de cadena larga o monoinsaturados omega-6 tales como palmoílo, estearoílo y similares. Los ésteres arílicos o heteroarílicos alternativos incluyen benzoílo, piridilmetiloílo y similares, cualquiera de los cuales se puede sustituir, como se define en carbociclilo anteriormente. Los ésteres farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen ésteres de L-aminoácido alifáticos, tales como leucilo, isoleucilo y especialmente valilo.

Para uso terapéutico, las sales de los compuestos son aquellas en donde el contraion es farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, las sales de ácidos y bases que no son farmacéuticamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o la purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.

El ácido farmacéuticamente aceptable y las sales de adición de base que se mencionaron anteriormente en este documento pretenden comprender las formas de sal de adición de ácido y de base no tóxicas terapéuticamente activas que los compuestos son capaces de formar. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden obtener convenientemente tratando la forma de base con dicho ácido apropiado. Los ácidos apropiados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos, tales como hidrácidos, por ejemplo ácido clorhídrico o bromhídrico, ácidos sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares; o ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, acético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico (es decir, etanodioico), malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico (es decir, ácido hidroxibutanodioico), tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, ptoluenosulfónico, ciclámico, salicílico, p-aminosalicílico, pamoico y ácidos similares. En cambio, dichas formas de sal se pueden convertir mediante tratamiento con una base apropiada en la forma de base libre.

Los compuestos que contienen un protón ácido también se pueden convertir en sus formas de sales de adición de metal o amina no tóxicas mediante tratamiento con bases orgánicas e inorgánicas apropiadas. Las formas de sal de base apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, por ejemplo, las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, sales con bases orgánicas, por ejemplo las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, y sales con aminoácidos, tales como, por ejemplo, arginina, lisina y similares.

El término "sal de adición", como se usa anteriormente en este documento, también comprende los solvatos que los compuestos descritos en el presente documento son capaces de formar. Dichos solvatos son, por ejemplo, hidratos, alcoholatos y similares.

El término "amina cuaternaria", como se usa anteriormente en este documento, define las sales de amonio cuaternario que los compuestos son capaces de formar por reacción entre un nitrógeno básico de un compuesto y un agente de cuaternización apropiado, tales como, por ejemplo, un haluro de alquilo opcionalmente sustituido, haluro de arilo y haluro de arilalquilo, por ejemplo, yoduro de metilo o yoduro de bencilo. También se pueden usar otros reactantes con buenos grupos salientes, tales como trifluorometanosulfonatos de alquilo, metanosulfonatos de alquilo y ptoluenosulfonatos de alquilo. Una amina cuaternaria tiene un nitrógeno positivamente cargado. Los contraiones farmacéuticamente aceptables incluyen cloro, bromo, yodo, trifluoroacetato y acetato. El contraión de elección se puede introducir usando resinas de intercambio iónico.

Sistemas de administración

En el presente documento se desvelan sistemas de administración ocular de micropartículas/hidrogel. Los sistemas de administración desvelados en el presente documento son no invasivos puesto que una suspensión de micropartículas/hidrogel puede ser autoadministrada al fondo inferior y retirada por el sujeto (por ejemplo, con pinzas o una solución salina). Las actuales aplicaciones para micropartículas o hidrogeles para afecciones oculares requieren la inyección a la cámara anterior o vítrea por un profesional clínico. Además, la norma clínica actual es medicación en colirio tópico que dura algunas horas. A diferencia, los sistemas actualmente desvelados podrían proporcionar administración sostenida durante al menos un mes.

El agente para inclusión en los sistemas de administración desvelados puede ser un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, un agente de obtención de imágenes, un agente cosmético, u otros agentes. En una realización, el uno o más agentes terapéuticos son útiles para tratar afecciones oculares. Las clases adecuadas de agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes activos que reducen la presión intraocular, antibióticos (incluyendo antibacterianos y antifúngicos), antiinflamatorios, quimioterapéuticos, agentes que promueven la regeneración nerviosa, esteroides, inmunosupresores, neuroprotectores, agentes de tratamiento del síndrome del ojo seco (por ejemplo, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, esteroides, agente de bienestar, tal como carboximetilcelulosa) y combinaciones de los mismos. Los agentes terapéuticos descritos anteriormente se pueden administrar solos o en combinación para tratar afecciones oculares.

En una realización, las micropartículas contienen uno o más agentes activos que abordan (por ejemplo, reducen) la elevada IOP en el ojo. Los agentes activos adecuados incluyen, pero no se limitan a, análogos de prostaglandinas, tales como travoprost, bimatoprost, latanoprost, unoprostina y combinaciones de los mismos; e inhibidores de la anhidrasa carbónica (CAL), tales como metazolamida y análogos de metazolamida sustituidos con 5-acilimino e imino relacionado; y combinaciones de los mismos. Las micropartículas se pueden administrar solas o en combinación con micropartículas que contienen un segundo fármaco que reduce la IOP.

En una realización adicional, el agente puede ser un antagonista de receptores adrenérgicos beta o un agonista de receptores adrenérgicos alfa.

Los antagonistas de receptores adrenérgicos beta ilustrativos incluyen timolol, levobunalol, carteolol, metipranolol, betaxolol, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinaciones de los mismos. Los agonistas de receptores adrenérgicos alfa ilustrativos incluyen brimonidina, apraclonidina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o combinaciones de los mismos. Ejemplos adicionales de agentes antiglaucoma incluyen pilocarpina, epinefrina, dipivefrin, carbacol, acetazolamida, dorzolamida, brinzolamida, latanoprost y bimatoprost.

El agente puede ser un antibiótico. Los antibióticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, cefaloridina, cefamandol, cefamandol nafato, cefazolin, cefoxitin, cefacetrilo sodio, cefalexin, cefaloglicina, cefalosporina C, cefalotina, cafcilina, cefamicinas, cefapirin sodio, cefradina, penicilina BT, penicilina N, penicilina O, feneticilina potasio, pivampicilina, amoxicilina, ampicilina, cefatoxin, cefotaxima, moxalactam, cefoperazona, cefsulodin, ceflizoxima, ceforanida, cefiaxona, ceftazidima, tienamicina, N-formimidoil tienamicina, ácido clavulánico, ácido penemcarboxílico, piperacilina, sulbactam, ciclosporinas, moxifloxacino, vancomicina y combinaciones de los mismos.

El agente puede ser un inhibidor de un receptor del factor de crecimiento. Los inhibidores adecuados incluyen, pero no se limitan a, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), tales como AG1478, e inhibidores de cinasas de EGFR, tales como BIBW 2992, erlotinib, gefitinib, lapatinib y vandetanib.

El agente puede ser un agente quimioterapéutico y/o un esteroide. En una realización, el agente quimioterapéutico es metotrexato. En otra realización, el esteroide es acetato de prednisolona, triamcinolona, prednisolona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, vidarabina, fluorometolona, acetónido de fluocinolona, acetónido de triamcinolona, dexametasona, acetato de dexametasona, etabonato de loteprednol, prednisona, metilprednisona, betametasona, beclometasona, fludrocortisona, desoxicorticosterona, aldosterona y combinaciones de los mismos.

Inmunosupresores ilustrativos incluyen pimecrolimus, tacrolimus, sirolimus, ciclosporina y combinaciones de los mismos.

En ciertas realizaciones, la cantidad de agente cargado en las micropartículas puede ser desde 1 ng hasta 1 mg, más particularmente 1 a 100 |ug, y lo más particularmente 20 a 30 |ug de agente por mg de micropartículas. En ciertas realizaciones específicas, la cantidad de agente cargado en las micropartículas es 25 a 30 pg de agente por mg de micropartículas.

Los polímeros para la incluyen poliglicolida, poli(ácido láctico) (PLA) y poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Otra clase de polímeros biodegradables autorizados es los polihidroxialcanoatos.

Otros polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, poli(óxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(alcoholes vinílicos), polivinil éteres, poli(ésteres vinílicos), poli(haluros de vinilo), polivinilpirrolidona, poliglicolidas, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, alquil celulosa, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato-ftalato de celulosa, carboxiletil celulosa, triacetato de celulosa, sal de sodio de sulfato de celulosa, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno polietilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(tereftalato de etileno), poli(alcoholes vinílicos), poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilo), poliestireno, polivinilpirrolidona, alginato, poli(caprolactona), dextrano y quitosano.

El porcentaje de carga de un agente se puede aumentar "equiparando" la hidrofilia o hidrofobia del polímero con la del agente a encapsular. En algunos casos, tales como PLGA, esto se puede lograr seleccionando las relaciones de monómero de manera que el copolímero sea más hidrófilo para fármacos hidrófilos o menos hidrófilo para fármacos hidrófobos. Alternativamente, el polímero se puede hacer más hidrófilo, por ejemplo, introduciendo grupos carboxilo en el polímero. Una combinación de un fármaco hidrófilo y un fármaco hidrófobo se puede encapsular en micropartículas preparadas a partir de una mezcla de un PLGA más hidrófilo y un polímero hidrófobo, tal como PLA.

El polímero preferido es un copolímero de PLGA o una mezcla de PLGA y PLA. El peso molecular de PLGA es desde aproximadamente 10 kD hasta aproximadamente 80 kD, más preferentemente desde aproximadamente 10 kD hasta aproximadamente 35 kD. El intervalo de peso molecular de PLA es desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 kDa. La relación entre lactida y glicolida es desde aproximadamente 75:25 hasta aproximadamente 50:50. En una realización, la relación es 50:50.

Los polímeros ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA, relación entre ácido láctico y ácido glicólico 50:50, Mn=10 kDa, denominado 502H); poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA, relación entre ácido láctico y ácido glicólico 50:50, Mn=25 kDa, denominado 503H); poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA, relación entre ácido láctico y ácido glicólico 50:50, Mn=30 kDa, denominado 504H); poli(ácido D,L-láctico-co- glicólico) (PLGA, relación entre ácido láctico y ácido glicólico 50:50, Mn=35 kDa, denominado 504); y poli(ácido D,L-láctico-coglicólico) (PLGA, relación entre ácido láctico y ácido glicólico 75:25, Mn=10 kDa, denominado 752).

En ciertas realizaciones, las micropartículas de polímero son biodegradables.

Las micropartículas cargadas de agente pueden tener un diámetro promedio en volumen de 1 a 10 pm. En ciertas realizaciones, las micropartículas cargadas de agente no tienen un diámetro promedio en volumen de 10 pm o mayor puesto que dichas partículas más grandes son difíciles de expulsar de un recipiente en forma de un colirio. Las micropartículas cargadas de agente pueden ser sin poros o pueden contener cantidades variables de poros de tamaños variables, normalmente controlados añadiendo NaCl durante el proceso de síntesis.

El método de micropartículas cargadas de agente puede ser emulsión simple o doble dependiendo de la solubilidad en agua deseada del agente encapsulada, peso molecular de cadenas de polímero usado para hacer las micropartículas (MW puede variar de ~1000 Da a más de 100.000 Da) que controla la tasa de degradación de las micropartículas y posterior cinética de liberación de fármacos.

En ciertas realizaciones, el hidrogel puede responder a un estímulo externo (por ejemplo, condiciones fisiológicas), tales como cambios en la concentración de iones, pH, temperatura, glucosa, estrés por cizallamiento, o una combinación de los mismos. Los hidrogeles ilustrativos incluyen poliacrilamida (por ejemplo, poli-N-isopropilacrilamida), hidrogeles de silicio, como los usados en las lentes de contacto, poli(óxido de etileno)/poli(óxido de propileno) o combinaciones de los dos (por ejemplo, hidrogel Pluronics o hidrogel Tectronics), metacrilato de butilo, diacrilato de polietilenglicol, polietilenglicol de pesos moleculares variables, ácido poliacrílico, poli(ácido metacrílico), poli(ácido láctico), poli(tetrametilen éter glicol), poli(metacrilato de W,W'-dietilaminoetilo), metacrilato de metilo y metacrilato de W,W-dimetilaminoetilo. En ciertas realizaciones, el hidrogel es un hidrogel termosensible.

En ciertas realizaciones, el hidrogel termosensible tiene una menor temperatura de disolución crítica (LCST) por debajo de la temperatura corporal. El hidrogel termosensible sigue siendo líquido por debajo de la temperatura fisiológica (por ejemplo, 37 °C para seres humanos) o a temperatura ambiente o por debajo (por ejemplo, 25 °C), solidifica (en un hidrogel) a temperatura fisiológica y es biocompatible. Por ejemplo, el hidrogel termosensible puede ser un líquido claro a una temperatura inferior a 34 °C que solidifica reversiblemente en una composición gelificada a una temperatura por encima de 34 °C. En general, la transición de bases basada en LCST ocurre tras el calentamiento in situ como resultado de la deshidratación conducida entrópicamente de componentes de polímero, que conducen al colapso del polímero. Se pueden utilizar diversos polímeros derivados de la naturaleza y sintéticos que presentan este comportamiento. Los polímeros naturales incluyen péptidos de tipo elastina y derivados de polisacáridos, mientras que los polímeros sintéticos notables incluyen los basados en poli(n-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), poli(N,N-dimetilacrilamida-co-N-fenilacrilamida), poli(metacrilato de glicidilo-co-N-isopropilacrilamida), poli(óxido de etileno)-bpoli(óxido de propileno)-b-poli(óxido de etileno), copolímero de poli(etilenglicol)-poliéster y copolímeros de bloque anfifílicos. La estructura de PNIPAAm, que contiene tanto enlaces amida hidrófilos como grupos isopropilo hidrófobos, conduce a una brusca transición de fase en LCST. Los estudios sugieren que el número promedio de moléculas de agua de hidratación por grupo NIPAAm disminuye de 11 a aproximadamente 2 tras el colapso hidrófobo por encima de LCST (32-34 °C). En ciertos ejemplos, el copolímero de bloque anfifílico comprende un componente hidrófilo seleccionado de poli(óxido de etileno) (PEO), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(N-isopropilacrilamida), poli(ácido acrílico) (PAA), polivinilpirrolidona (PVP) o mezclas de los mismos, y un componente hidrófobo seleccionado de poli(óxido de propileno) (PPO), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(L-aspartato de .beta.-benzoílo) (PBLA), poli(.gamma.-bencil-L-glutamato) (PBLG), poli(ácido aspártico), poli(L-lisina), poli(espermina), poli(caprolactona) o mezclas de los mismos. Los ejemplos de dichos copolímeros de bloque anfifílicos incluyen copolímeros de bloque de (PEO)(PPO)(PEO), (PEO/PPO) y copolímeros de bloque de poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), tales como los copolímeros de bloque (PEO)(PLGA)(PEO).

En ciertas realizaciones, el hidrogel es no biodegradable (por ejemplo, PNIPAAm). En otras realizaciones, el hidrogel es biodegradable. Por ejemplo, los polímeros biodegradables basados en NIPAAm se pueden preparar conjugando PNIPAAm con segmentos biodegradables naturales, tales como péptido susceptible a MMP, gelatina, colágeno, ácido hialurónico y dextrano. Los copolímeros formados a partir de NIPAAm y monómeros con cadenas laterales degradables comprenden otra categoría de hidrogeles termosensibles bioabsorbibles basados en NIPAAm. La retirada hidrolítica de cadenas laterales hidrófobas aumenta la hidrofilia del copolímero, subiendo la LCST por encima de la temperatura corporal y haciendo que el esqueleto del polímero sea soluble. Debido a la simplicidad relativa del proceso sintético, los monómeros biodegradables más investigados han sido los monómeros basados en HEMA, tales como metacrilato de 2-hidroxietilo-polilactida (HEMA-PLA) (Lee, B. H.; et al. Macromol. Biosci. 2005, 5, 629-635; y Guan, J., et al. Biomacromolecules 2008, 9, 1283-92), metacrilato de 2-hidroxietilo-policaprolactona (h Em A-PCL) (Wang, T., et al. Eur. J. Heart Fail 2009, 11, 14-19 y Wu, D., et al. ACS Appl. Mater. Interf. 2009, 2, 312-327) y metacrilato de 2-hidroxietilo-poli(carbonato de trimetileno) (H^e MA-PTMC) (Fujimoto, K. L., et al. Biomaterials 2009, 30, 4357-4368 y Wang, F., et al. Acta Biomater. 2009, 5, 2901). Sin embargo, el esqueleto que queda tras la hidrólisis, HEMA, presenta grupos laterales hidroxietilo (--CH.sub.2CH.sub.2--OH), que tienen un efecto relativamente limitado sobre la hidrofilia residual del polímero (Cui, Z., et al. Biomacromolecules 2007, 8, 1280-1286). En estudios previos, se ha encontrado que dichos hidrogeles son o parcialmente bioabsorbibles (Wu, D., et al. ACS Appl. Mater. Interf. 2009, 2, 312-327) o completamente bioabsorbibles, pero han requerido la inclusión de comonómeros considerablemente hidrófilos, tales como ácido acrílico (AAc) en la síntesis del hidrogel (Fujimoto, K. L.; et al. Biomaterials 2009, 30, 4357-4368; Wang, F., et al. Acta Biomater. 2009, 5, 2901; y Guan, J., et al. Biomacromolecules 2008, 9, 1283-92).

En una realización adicional, el hidrogel termosensible se degrada y disuelve en condiciones fisiológicas en un modo dependiente del tiempo. El copolímero y sus productos de degradación son normalmente biocompatibles. Según una realización, el copolímero consiste esencialmente en residuos de N-isopropilacrilamida (NIPAAm) (un residuo es un monómero incorporado en un polímero), residuos de metacrilato de hidroxietilo (HEMA) y residuos de macrómeros de metacrilato-polilactida (MAPLA) como se desvela en la publicación de patente de EE. UU. 2012/0156176. Alternativamente, el copolímero consiste esencialmente en residuos de N-isopropilacrilamida, residuos de ácido acrílico (AAc) y residuos de macrómeros de metacrilato de hidroxietilo-poli(carbonato de trimetileno) (HEMAPTMC) como se desvela en la publicación de patente de EE. UU. 2012/0156176.

El precursor de base (por ejemplo, un prepolímero, oligómero y/o monómero) para el hidrogel, los reticulantes y los iniciadores se mezclan juntos y se deja que polimericen durante un periodo de tiempo predefinido (desde 1 h hasta 24 h normalmente) para formar el hidrogel. El hidrogel se lava entonces para retirar cualquier exceso de iniciador o material sin reaccionar. El hidrogel en esta etapa es un líquido (por ejemplo, en forma de una disolución acuosa) a temperatura ambiente hasta que esté lista para su uso. Las micropartículas se pueden añadir antes, después o durante la polimerización del hidrogel (el añadir las micropartículas antes o durante la polimerización da como resultado una tasa de liberación de fármaco inicial ligeramente más rápida) para formar una suspensión de micropartículas sólidas en el hidrogel. La cantidad de micropartículas cargadas en el hidrogel puede variar. Por ejemplo, puede haber hasta 10 mg, más particularmente 1 a 5 mg micropartículas por microlitro de hidrogel. En ciertas realizaciones, las micropartículas se dispersan homogéneamente dentro del hidrogel. Se pueden añadir componentes opcionales que permiten una visualización más fácil de la suspensión hidrogel/micropartículas, tal como fluoresceína de sodio u otras moléculas fluorescentes, tales como FITC, rodamina o AlexaFluor, o colorantes tales como dióxido de titanio. El contenido de agua del hidrogel hinchado a temperatura ambiente puede ser 50-80 %. El contenido de agua del hidrogel después de que gelifique in situ en el ojo puede ser del 1 -10 %.

Tras la administración ocular de la suspensión líquida de micropartículas/hidrogel, el sistema de micropartículas/hidrogel libera agua y se puede convertir en un miembro de gel sólido opaco. El miembro gelificado puede ser suficientemente firme, que se puede manipular con pinzas. La Fig. 7A representa la administración de un colirio 1 que comprende la suspensión líquida de micropartículas/hidrogel, la gelificación de la suspensión para formar una matriz reticulada polimérica 2 que encapsula las micropartículas cargadas de agente (Fig. 7B) y el posicionamiento del miembro gelificado resultante 3 en el fondo inferior del ojo (Fig. 7C). En una realización particular, se ha desarrollado un vehículo de hidrogel termosensible para las micropartículas cargada de agente y se caracteriza porque permitirá a los pacientes aplicar una suspensión líquida (que contiene el sistema de liberación) por vía tópica a su ojo como lo harían con una medicación basada en colirio acuoso (Fig. 7A). Cuando la gota se acumula en el fondo de saco conjuntivo, el líquido se calienta hasta la temperatura corporal y se deshincha el hidrogel termosensible, formando un gel estable y opaco (Fig. 7B). La gota también parece adaptarse naturalmente a la forma del fondo inferior durante la gelificación (Fig. 7C), promoviendo la retención del sistema y la administración continua de agente al ojo por la formulación en nanopartículas de agente sostenido incorporado. El sistema de gel/micropartículas podría proporcionar la liberación sostenida de un fármaco ocular durante hasta 30 veces más que cualquier hidrogel que se forme in situ actualmente conocido. Además, la retirada de la gota gelificada sería tan simple como enjuagar el ojo con solución salina fría, a diferencia de los implantes intravítreos o subconjuntivos que requieren la retirada por un profesional clínico. Esta formulación debe reducir la IOP y aumentar la biodisponibilidad en comparación con los colirios tópicos. Esta nueva formulación de administración también podría servir de plataforma modular para la administración local de no solo una variedad de medicaciones para el glaucoma (incluyendo BT), sino también toda una serie de otros terapéuticos oculares.

La forma del miembro gelificado 3 puede variar y depende de la anatomía de la estructura ocular. Normalmente, el miembro gelificado 3 se extiende en una película fina de gel alargada, pero puede adoptar una forma más cilíndrica. En ciertos ejemplos, la película gelificada puede tener un espesor de 10 a 1000, más particularmente 100 a 300 pm. El gel se puede manipular a medida que sufre la transición de fase a la forma deseada. En ciertos ejemplos, el miembro gelificado puede retener la flexibilidad hasta un cierto grado. En ciertos ejemplos, el miembro gelificado 3 puede tener un tiempo de residencia en el fondo inferior de al menos cinco días, más particularmente al menos 10 días, y lo más particularmente al menos 30 días.

El sistema de micropartículas/hidrogel desvelado en el presente documento puede proporcionar la liberación sostenida de un agente. La liberación de agente puede ser lineal o no lineal (liberación inmediata individual o múltiple). En ciertos ejemplos, el agente puede ser liberado sin un efecto de liberación inmediata. Por ejemplo, la liberación sostenida puede presentar una tasa de liberación sustancialmente lineal del agente terapéutico in vivo durante un periodo de al menos 5 días, más particularmente al menos 10 días, y lo más particularmente al menos 30 días. Por tasa de liberación sustancialmente lineal se indica que el agente terapéutico se libera a una tasa que no varía en más de aproximadamente el 20 % con respecto al periodo de tiempo deseado, más normalmente en no más de aproximadamente el 10 %. Se puede desear proporcionar una tasa de liberación relativamente constante del agente del sistema de administración durante la vida del sistema. Por ejemplo, puede ser conveniente que el agente sea liberado en cantidades desde 0,1 hasta 100 pg por día, más particularmente 1 hasta 10 pg por día, durante la vida del sistema. Sin embargo, la tasa de liberación puede cambiar o aumentar o disminuir dependiendo de la formulación de la micropartícula de polímero y/o hidrogel. En ciertos ejemplos, el sistema de administración puede liberar una cantidad del agente terapéutico que es eficaz en proporcionar una concentración del agente terapéutico en el ojo en un intervalo desde 1 ng/ml hasta 200 pg/ml, más particularmente 1 a 5 pg/ml. La tasa de liberación deseada y la concentración de fármaco objetivo pueden variar dependiendo del agente terapéutico particular elegido para el sistema de administración de fármacos, la afección ocular que está tratándose y la salud del sujeto.

En ciertas realizaciones, la liberación del agente depende de la degradación de las micropartículas de polímero. A medida que se rompen las cadenas de polímero, el agente puede difundir de la matriz de micropartículas del polímero inicial donde finalmente alcanzará la matriz de hidrogel. En ese momento, el hidrogel puede ralentizar parcialmente la liberación del agente pero la difusión a través del hidrogel es significativamente más rápida que la degradación del polímero. Por lo tanto, el factor limitante en la liberación del agente es la degradación del polímero.

Es evidentemente más deseable demostrar un método de medir directamente las concentraciones de desmoldeantes que difunden en tejidos diana directamente in vivo para sistemas de administración sostenida. Dicha tecnología ayudaría a los investigadores a garantizar que se administra fármaco suficiente a los tejidos afectados mientras que al mismo tiempo se minimiza el riesgo de posibles efectos secundarios sistémicos. Además, si se fuera a modificar un sistema de liberación controlada (en el futuro) para incorporar otras modalidades (tales como agentes neuroprotectores basados en el factor de crecimiento o antiangiogénicos basados en anticuerpos), el conocimiento de la cantidad de fármaco que llega a los posteriores tejidos agilizaría significativamente el desarrollo de dicha terapia y proporcionaría mucha más información que las mediciones funcionales (como IOP) solas. Desafortunadamente, los métodos disponibles para detectar o visualizar la liberación in vivo son actualmente limitados y poco manejables. Por ejemplo, los métodos de ensayo de detección de fármacos tradicionales (tales como los que usan fármaco radiomarcado) requieren grandes números de animales para los estudios de tipo sacrificio en cadena para medir concentraciones de fármaco in vivo en tejido extirpado. Además, las concentraciones de fármaco reducidas asociadas a la liberación controlada pueden dificultar incluso más la detección del fármaco en el microentorno local, ni que decir en tejidos circundantes o la circulación sistémica.

Por consiguiente, en el presente documento se desvelan realizaciones para encapsular un agente de contraste de IRM, por ejemplo, ácido gadolinio-tetraazociclododecanotetraacético (Gd-DOTA) en las mismas micropartículas de polímero que las usadas para liberar el agente terapéutico y realizar barridos in vivo durante toda la ventana de tratamiento de al menos un mes, representando así el uso de |R^m para visualizar y cuantificar a largo plazo la liberación controlada en el ojo de un depósito tópico. La administración de micropartículas de polímero a largo plazo diseñada de forma racional de agentes de contraste de IRM basados en Gd puede servir de un método fiable y no invasivo para resolver el perfil de liberación espacial y temporal de una variedad de agentes terapéuticos, empezando con BT, de la formulación tópica de gel/micropartículas descrita en el presente documento. BT y Gd-DOTA tienen pesos moleculares muy similares (aproximadamente 440 y 600 Da, respectivamente), lo que significa que se pueden diseñar sistemas de liberación degradables que producen perfiles de liberación prácticamente idénticos para ambos agentes. Además, las semividas oculares de Gd-DTPA (un agente de contraste muy similar en tamaño y estructura a Gd-DOTA) y BT son 28,08 y 28,2 min, respectivamente, lo que apoya aún más el uso de Gd-DOTA como marcador de obtención de imágenes sustituto para BT. Correspondientemente, la medición de concentraciones locales de Gd-DOTA usando IRM puede permitir el seguimiento del comportamiento de liberación in vivo para ambas formulaciones (Gd-DOTA y BT), que se puede confirmar (o validar) usando los métodos de detección del ensayo de BT de alta sensibilidad tradicionales. Los datos de IRM ex vivo preliminares para las micropartículas cargadas de Gd-DOTA sugieren que estos métodos son factibles como un método de cuantificación no invasivo en tiempo real. El sistema de administración único descrito en el presente documento permitiría la cuantificación de la liberación de Gd-DOTA de un depósito tópico, a diferencia de los estudios previamente mencionados que se realizaron usando o implantes o inyecciones en el ojo. Además, si se identifican futuras formulaciones de liberación que requerirían la administración sostenida de grandes proteínas (>>600 Da de Gd-DOTA), también es ahora posible conjugar Gd-DOTA sobre estas proteínas (no aumentando significativamente el tamaño molecular de los agentes de liberación) para seguir su liberación y distribución en el ojo.

La composición de micropartículas/hidrogel se puede administrar en forma de un colirio líquido. El (Los) colirio(s) se pueden administrar a cualquier estructura ocular, pero preferentemente se administran al fondo inferior. Los colirios pueden ser autoadministrados por el sujeto. El colirio se adaptará cómodamente al saco conjuntivo y liberará el agente cargado. El colirio se puede administrar en una pauta en donde el intervalo entre colirios sucesivos es mayor de al menos un día. Por ejemplo, puede haber un intervalo de al menos 5 días, al menos una semana o al menos un mes entre las administraciones de un colirio(s). En realizaciones preferidas, los colirios desvelados se pueden usar para la administración mensual sostenida de medicación como una sustitución por la norma clínica actual de administración de colirio de una vez o dos veces al día. Al final del periodo de administración deseado, el miembro gelificado se puede sacar del ojo (por ejemplo, por una pinza o enjuagando). En ciertas realizaciones, el hidrogel puede ser biodegradable de manera que no haya necesidad de retirar el miembro gelificado (esta realización puede ser más útil para tratar una afección aguda). Este sistema desvelado en el presente documento no solo disminuye espectacularmente la frecuencia de administración (por lo que aumenta la probabilidad de cumplimiento del paciente y la recuperación/prevención de síntomas que empeoran), sino que evita la participación del profesional clínico para su administración al ser completamente no invasivo.

Las micropartículas/hidrogel desvelado en el presente documento pueden incluir un componente de excipiente, tal como cantidades eficaces de agentes de tamponamiento y antioxidantes para proteger a un fármaco (el agente terapéutico) de los efectos de la radiación ionizante durante la esterilización. Los agentes de tamponamiento solubles en agua adecuados incluyen, sin limitación, carbonatos alcalinos y alcalinotérreos, fosfatos, bicarbonatos, citratos, boratos, acetatos, succinatos y similares, tales como fosfato de sodio, citrato, borato, acetato, bicarbonato, carbonato y similares. Estos agentes se presentan ventajosamente en cantidades suficientes para mantener un pH del sistema de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9 y más preferentemente aproximadamente 4 y aproximadamente 8. Como tal, el agente de tamponamiento puede ser de hasta aproximadamente el 5 % en peso del sistema total. Los conservantes solubles en agua adecuados incluyen bisulfito de sodio, bisulfato de sodio, tiosulfato de sodio, ascorbato, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, borato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, parabenos, metilparabeno, poli(alcohol vinílico), alcohol bencílico, feniletanol y similares, y mezclas de los mismos. Estos agentes pueden estar presentes en cantidades de desde el 0,001 hasta aproximadamente el 5 % en peso y preferentemente del 0,01 a aproximadamente el 2 % en peso.

El sistema de micropartículas/hidrogel desvelado en el presente documento puede ser útil para tratar una variedad de afecciones oculares, tanto crónicas como agudas. Las afecciones oculares ilustrativas incluyen: maculopatías/ degeneración retiniana: degeneración macular, que incluye degeneración macular senil (DMS), tal como degeneración macular senil no exudativa y degeneración macular senil exudativa, neovascularización coroidea, retinopatía, que incluye retinopatía diabética, neuroretinopatía macular aguda y crónica, corioretinopatía serosa central y edema macular, que incluye edema macular cistoide y edema macular diabético. Uveítis/retinitis/coroiditis: epiteliopatía pigmentaria placoide multifocal aguda, enfermedad de Behcet, retinocoroidopatía en perdigonada, infecciosa (sífilis, Lyme, tuberculosis, toxoplasmosis), uveítis, que incluye uveítis intermedia (pars planitis) y uveítis anterior, coroiditis multifocal, síndrome de múltiples puntos blancos evanescentes (MEWDS), sarcoidosis ocular, escleritis posterior, coroiditis serpiginosa, fibrosis subrretiniana, síndrome de uveítis y síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada. Enfermedades vasculares/ enfermedades exudativas: enfermedad oclusiva arterial retiniana, oclusión de la vena retiniana central, coagulopatía intravascular diseminada, oclusión de rama venosa de la retina, cambios hipertensivos del fondo, síndrome ocular isquémico, microaneurismas arteriales retinianos, enfermedad de Coat, telangiectasia de la parafóvea, oclusión de la vena hemirretiniana, papiloflebitis, oclusión de la arteria retiniana central, oclusión en rama de la arteria retiniana, enfermedad de la arteria carótida (CAD), angeítis de rama congelada, retinopatía de células falciformes y otras hemoglobinopatías, estrías angioides, vitreoretinopatía exudativa familiar, enfermedad de Eales. Traumática/quirúrgica: oftalmia simpática, enfermedad retiniana uveítica, desprendimiento de retina, traumatismo, láser, PDT, fotocoagulación, hipoperfusión durante la cirugía, retinopatía por radiación, retinopatía por trasplante de médula ósea. T rastornos proliferativos: retinopatía proliferativa vítrea y membranas epirretinianas, retinopatía diabética proliferativa. Trastornos infecciosos: histoplasmosis ocular, toxocariasis ocular, presunto síndrome de histoplasmosis ocular (PONS), endoftalmitis, toxoplasmosis, enfermedades de la retina asociadas a infección por el VIH, enfermedad coroidea asociada a infección por el VIH, enfermedad uveítica asociada a infección por el VIH, retinitis vírica, necrosis retiniana aguda, necrosis retiniana externa progresiva, enfermedades retinianas fúngicas, sífilis ocular, tuberculosis ocular, neurorretinitis subaguda unilateral difusa y miasis. Trastornos genéticos: retinitis pigmentosa, trastornos sistémicos con distrofias retinianas asociadas, ceguera nocturna estacionaria congénita, distrofias de conos, enfermedad de Stargardt y fondo flavimaculatus, enfermedad de Best, distrofias del epitelio pigmentario de la retina en patrón, retinosquisis ligada al X, distrofia de Sorsby del fondo, maculopatía concéntrica benigna, distrofia cristalina de Bietti, pseudoxantoma elástico. Desgarros/agujeros de la retina: desprendimiento de retina, agujero macular, desgarro retiniano gigante. Tumores: enfermedad de la retina asociada a tumores, hipertrofia congénita de RPE, melanoma de la úvea posterior, hemangioma coroide, osteoma coroide, metástasis coroide, hamartoma combinado de la retina y epitelio retiniano del pigmento, retinoblastoma, tumores vasoproliferativos del fondo ocular, astrocitoma de la retina, tumores linfoides intraoculares. Diversos: coroidopatía interna puntiforme, epiteliopatía pigmentaria placoide posterior multifocal aguda, degeneración miópica de la retina, epitelitis pigmentaria retiniana aguda y similares.

En ciertas realizaciones, las afecciones oculares incluyen glaucoma, ojo seco crónico, queratitis, inflamación posoperatoria, conjuntivitis e infecciones bacterianas o fúngicas.

En el presente documento también se desvelan métodos de control de la IOP en un sujeto usando los sistemas de administración de fármacos anteriormente descritos. En diversas realizaciones, la IOP se mantiene en o por debajo de aproximadamente 22 mmHg. El fármaco puede ser liberado de forma que la concentración del fármaco sea aproximadamente constante durante un periodo de al menos un día. En otras realizaciones, los métodos anteriores controlan la IOP durante un periodo de al menos 1 día, 2 días, 3 días o 1 semana.

Ejemplos

Formación de micropartículas cargadas de fármaco

Resumen

Se encapsuló BT en micropartículas de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) usando un procedimiento de emulsión doble estándar. La liberación de fármaco in vitro de las micropartículas cargadas con BT se cuantificó usando espectroscopía de UV-Vis. Para estudios in vivo, se aleatorizó a conejos para recibir una inyección subconjuntiva única de blanco (sin fármaco) o micropartículas cargadas con BT o gotas al 0,2 % de BT tópico dos veces al día. La IOP se monitorizó durante 28 días junto con el examen regular con lámpara de hendidura. Además, se tomaron periódicamente muestras de tumor acuoso y se analizaron para la concentración de BT usando cromatografía de líquidos de alta resolución. Tras el sacrificio en el día 28, se enuclearon los ojos y se tiñeron para histología. Las micropartículas cargadas de fármaco mostraron una morfología principalmente sin poros con un diámetro promedio en volumen de 7,5 ± 2,9 pm. Liberaron un promedio de 2,1 ± 0,37 pg de BT/mg de partículas/día en la disposición in vitro. In vivo, la disminución en IOP fue significativamente más baja en el ojo tratado para BT tópico frente a micropartículas de BT. A diferencia, la IOP aumentó continuamente en conejos inyectados con el blanco de micropartículas. Además, los niveles de BT en el humor acuoso se mantuvieron por debajo de los niveles tóxicos durante todo el estudio. No se observó evidencia de migración de micropartículas o respuesta a cuerpos extraños en los ojos enucleados tras el estudio de 28 días. Las micropartículas de PLGA cargadas con BT suministran durante 28 días BT con una dosis única, como se confirmó usando ensayos de liberación in vitro. Esto representa una amplia mejora con respecto al patrón actual de 56-84 dosis. Estas micropartículas demostraron eficacia en reducir la IOP in vivo, sin indicios de irritación o infección.

Materiales y métodos

2.1 Fabricación de micropartículas (MP)

Se fabricaron MP usando un procedimiento en emulsión doble estándar (Sanchez et al., 1993; Zweers et al., 2006). Brevemente, se mezcló 200 mg de ácido poli(láctico-co-glicólico) (MW 24-38 kDa, viscosidad 0,32-0,44 dl/g; Sigma, St. Louis, MO) con 4 ml de diclorometano (DCM) y 12,5 mg de una disolución acuosa de tartrato de brimonidina (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA). La disolución de fármaco/polímero se sonicó durante 10 s (Sonics VibraCell™) antes de la homogenización en 60 ml de 2 % de poli(alcohol vinílico) (PVA-MW ~25.000 Da, 98 % hidrolizado, Polysciences) durante 1 min a aproximadamente 7000 rpm (homogeneizador SilversonL4RT-A). Esta emulsión doble se añadió entonces a 80 ml de 1 % de PVA y se dejó que se mezclara durante 3 h para evaporar cualquier DCM residual. Las MP se lavaron entonces cuatro veces por centrifugación durante 5 min a 1000 rpm. Las MP se resuspendieron en agua DI y se colocaron en un liofilizador (liofilizador Virtis Benchtop K, Gardiner, NY) que funcionaba a 70 mTorr durante 48 horas antes de almacenarse a -20 °C.

2.2 Caracterización de micropartículas

La forma y morfología de las MP se examinó usando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Se tomaron imágenes en un blanco de MP liofilizadas y cargadas de fármaco tras un recubrimiento por pulverización de oro usando un SEM de emisión de campo JEOL 6335F (JEOL, Peabody, MA). Se determinó el diámetro promedio de partículas para un mínimo de 10.000 MP usando las mediciones de impedancia de volumen en un Multisizer 3 Coulter Counter (Beckman Coulter, Indianapolis, IN).

2.3 Ensayo de liberación in vitro

Se suspendieron masas conocidas de MP liofilizadas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron a 37 °C. Las suspensiones de MP se centrifugaron durante 10 min a 1000 rpm después de intervalos predeterminados de tiempo y el sobrenadante se retiró para el análisis. Se midió la concentración de brimonidina en muestras de PBS por absorción de UV/Vis usando un lector de microplacas SoftMax Pro 5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 320 nm. Las alícuotas de MP se resuspendieron entonces en PBS recién preparado. Los resultados de las MP cargadas con BT se informan como el promedio de tres estudios de liberación y su desviación estándar. Cualquier señal de ruido de fondo obtenida del blanco de MP se restó de cada medición.

Las cantidades máxima y mínima teóricas de la absorción de BT también se calcularon como una base para la comparación de la liberación in vitro de las BTMP. Este intervalo se calculó suponiendo una gota de 50 pl y 2 gotas administradas por día a una tasa de absorción de 1 % (mínimo) o 7 % (máximo) (Ghate y Edelhauser, 2008). Como los métodos de liberación in vitro miden brimonidina base y no la sal de tartrato, se incorporó en estos cálculos un factor de conversión necesario de 0,66 mg de brimonidina por cada 1 mg de BT (Acheampong et al., 2002).

2.4 Estudios in vivo

Se aleatorizó a conejos enanos holandeses pigmentados para recibir o el blanco de MP (sin fármaco), BTMP o gotas al 0,2 % de BT (Alphagan®, Allergan, Irvine, CA), con tres animales en cada grupo inicialmente. Para garantizar que la significación estadística se pudiera lograr con el número mínimo de animales (según se requiera por la IACUC), se realizó un análisis del tamaño de muestra con una potencia de 0,8 basada en resultados previos que comparaban las mediciones de IOP antes y después de la administración de BT tópico al 0,2 % y la inserción de un sistema de administración de inserto ocular experimental en un modelo de conejo (Aburahma y Mahmoud, 2011), que condujo a n=3 conejos por grupo. En el día 0, el ojo derecho de los conejos en los grupos de blanco de MP o cargadas con fármaco recibió una inyección subconjuntiva superior de 5 mg de MP suspensas en 0,050 cm3 de solución salina estéril. Los conejos en el grupo de gotas de BT recibieron una única gota de disolución al 0,2 % de BT en un ojo dos veces al día durante cada día del estudio. El ojo izquierdo siguió sin tratar en todos los animales durante todo el estudio.

Se tomaron muestras de sangre venosa y humor acuoso en los días 0 (antes de la administración del tratamiento), 1, 3, 7, 14, 21 y 28. Estas muestras se almacenaron a -20 °C antes del ensayo de la concentración de brimonidina usando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, véase a continuación). Los ojos se comprobaron regularmente para signos de infección o irritación instilando gotas de fluoresceína de sodio en cada ojo y examinando con una lámpara de hendidura portátil que contiene una luz de azul de cobalto (Reichert Technologies, Depew, NY). La IOP también se midió en ambos ojos usando un neumatonómetro de modelo 30 Classic (Reichert Technologies, Depew, NY). La tonometría siempre se realizó entre las horas de 8 am y 11 am e inmediatamente en la inducción de anestesia intravenosa con una mezcla 1:10 de xilazina y ketamina. Se requirieron aproximadamente 0,09 ml de anestésico.

Los animales se sacrificaron en el día 28, y tanto los ojos tratados como sin tratar se enuclearon para el análisis histológico. Los ojos se incorporaron en parafina antes de ser seccionados y teñidos con hematoxilina y eosina, ácido peryódico-Schiff (PAS) o tinción tricrómica de Masson. Un examinador enmascarado analizó los portaobjetos para cualquier evidencia de anomalías intra- o extraoculares.

2.5 Análisis de HPLC

Se adaptaron los métodos para analizar el contenido de brimonidina en humor acuoso y plasma de aquellos en Karamanos et al. (1999) (Karamanos et al., 1999). Las muestras se analizaron usando un sistema UltiMate 3000 HPLC (Dionex, Sunnyvale, CA) para garantizar que niveles tóxicos de fármaco no eran detectables ni localmente ni por vía sistémica. Brevemente, se tomaron muestras de aproximadamente 20 pl para análisis de HPLC isocrático de fase inversa. Se usó una columna Supelcosil LC-18 (Sigma Aldrich) con 10 % (v/v) de acetonitrilo en tampón TEA como fase móvil. La separación se realizó a temperatura ambiente a un caudal de 1,0 ml/min. El tiempo de retención fue aproximadamente 5-10 min y se detectó brimonidina a una longitud de onda de 248 nm.

2.6 Análisis estadístico

Se realizó análisis unifactorial de la varianza (ANOVA) en mediciones de IOP basal para garantizar que los tres grupos se podrían considerar muestras de una única población. Posteriormente, se calculó AIOP en cada momento de tiempo, definido como el cambio específico de grupo en IOP promedio desde el día 0. Se comparó AIOP en cada momento de tiempo para el grupo de BTMP con el grupo de gotas de BT tópico de control positivo usando una prueba bilateral de la t de Student de dos muestras con un criterio de significancia del 5 %. Este cálculo requiere 3 muestras y, por lo tanto, no se podría realizar frente al grupo de control negativo de blanco de MP debido a una complicación relacionada con la anestesia en un animal en este grupo al principio del estudio.

3. Resultados

3.1 Micropartículas

Para probar las hipótesis, se requirió un sistema de liberación controlada capaz de 1 mes de administración de tartrato de brimonidina (BT). Como se ha descrito anteriormente, esta medicación antiglaucoma se encapsuló satisfactoriamente en micropartículas (MP) de PLGA degradables usando una técnica de emulsión doble. Se realizó una caracterización preliminar in vitro de las MP para confirmar su idoneidad para su uso en un modelo de inyección subconjuntiva antes de empezar los ensayos de liberación de fármaco. Aunque un comportamiento de liberación in vitro de la formulación no es ipso facto análogo a cómo procedería la liberación in vivo, pueden de hecho ser indicativo de o escenarios de liberación locales o tópicos y es, independientemente, una parte importante de la caracterización global de una nueva formulación prototipo.

La Figura 1 muestra imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM) de las MP cargadas con tartrato de brimonidina (BTMP). Estas imágenes confirman que se consiguieron una superficie suave y forma uniforme según las especificaciones de diseño de los presentes inventores. Estas imágenes también están de acuerdo con las mediciones de impedancia en volumen, que determinaron que el diámetro promedio en volumen de BTMP era 7,46 ± 2,86 pm. Esta distribución de tamaño es como era de esperar para las condiciones usadas para fabricar las BTMP. Por último lugar, estas MP son lo suficientemente pequeñas como para ser fácilmente inyectadas con un aguja de calibre 30, aunque todavía son lo suficientemente grandes para evitar la retirada o migración fagocítica del sitio de inyección (Shanbhag et al., 1994).

Habiendo confirmado que el tamaño y las características superficiales de las BTMP fueron adecuadas para su uso en el modelo de conejo, la siguiente etapa en el proceso de diseño racional era determinar el perfil de liberación de 28 días de fármaco de las MP. Por consiguiente, la liberación in vitro de BT de una masa conocida de estas partículas durante más de un mes se representa en la Figura 2. Como el objetivo era liberar una cantidad de fármaco comparable a la medicación de colirio habitual, la cantidad liberada se informa como una concentración en lugar del porcentaje de cantidad total de fármaco encapsulado. También se muestra en la Figura 2 las cantidades mínima y máxima teóricas de disolución tópica de BT al 0,2 % absorbida en la cámara anterior, como se describe en la sección de Métodos. Como era de esperar, la cantidad de BT liberada durante todo el mes estuvo dentro de los límites superior e inferior para la absorción de BT tópica al 0,2 %, con un promedio de 2,1 ± 0,37 pg de brimonidina/día liberada durante 28 días. Esta cantidad promedio incluye los días 24-28, momento en el que la liberación de brimonidina se había ralentizado considerablemente.

3.2 Estudios en animales

Una vez se demostró que la formulación de BTMP liberaba el fármaco localmente según las especificaciones de diseño, se probó la capacidad de este BT liberado (en animales tratados) para reducir la IOP en un modelo de conejo durante un periodo de tiempo de 30 días. Se inyectó aproximadamente 5 mg en 0,05 ml de blanco de MP o cargadas de fármaco en el espacio subconjuntivo superior de conejos enanos holandeses pigmentados en una aguja de calibre 30 (n=3 para cada grupo inicialmente; sin embargo, un conejo en el grupo de blanco de MP se retiró del estudio debido a una reacción adversa a la anestesia no relacionada con la inyección de MP o manipulaciones quirúrgicas). El blanco de MP se usó como control negativo como una indicación de lOP en ausencia de BT, así como el efecto, si lo hubiera, de las micropartículas de PLGA en IOP e inflamación. La Figura 3 muestra un ejemplo de las ampollas de MP en el espacio subconjuntivo en un animal en el día 1 del estudio. Un tercer conjunto de conejos recibió gotas de BT tópico al 0,2 % dos veces al día a la misma hora cada día para servir de control positivo.

La IOP fue medida durante 28 días por un oftalmólogo experto en neumatonometría. Para cada medición, el resultado del neumatonómetro tiene una baja desviación estándar, en general, <0,4 mmHg. Inicialmente, se hizo una medición de la IOP basal en cada conejo antes de empezar el tratamiento. Tras la administración de fármaco o MP (blanco o cargadas con BT), las mediciones de IOP se hicieron a la misma hora del día para cada momento de tiempo en el estudio, justo antes de que los colirios se administraran al grupo de control positivo. Las Figuras 4a y 4b muestran los valores de IOP reales registrados en cada momento de tiempo para los tres grupos (blanco de MP, gotas de BT tópico y BTMP) en el ojo derecho y el ojo izquierdo, respectivamente. Los valores de IOP se informan como la IOP promedio y la desviación estándar para los tres animales en cada grupo.

Para entender mejor los cambios en la IOP durante el transcurso del estudio, se calculó las diferencias relativas en IOP en comparación con cada uno de los valores basales. Las Figuras 5a y 5b representan el cambio en la IOP en cada momento de tiempo en comparación con el día 0 para los tres grupos, nuevamente en el ojo derecho y el ojo izquierdo, respectivamente. Las IOP registradas en el día 0 no fueron significativamente diferentes entre animales en los grupos de blanco de MP, BTMP y de BT tópico por ANOVA unilateral. La reducción de la IOP fue significativamente mayor (p<0,05) en el grupo de BTMP en comparación con el grupo de BT tópico para cada momento de tiempo en el ojo derecho, pero no el izquierdo. Aunque no hubo signos de reducción de IOP en el grupo de blanco de MP, el análisis estadístico no se pudo realizar para los animales después del día 0 debido al reducido tamaño de muestra.

Además de determinar la eficacia de BTMP in vivo, se investigó la seguridad y compatibilidad de las MP de PLGA en el entorno local en todo el estudio de 28 días. La brimonidina no se detectó ni en el humor acuoso ni el plasma usando un método de HPLC extremadamente sensible. Aunque se espera que esto sea para niveles terapéuticos (0,53-3,7 ug/día según los cálculos en la Sección 2.3), que implica que la cantidad liberaba estaba por debajo del límite de detección de incluso HPLC, esto sugiere de hecho que no se producen mayores niveles de BT tóxico. Como una medida adicional de la seguridad de las BTMP, se inspeccionaron la córnea, la conjuntiva, la cámara anterior y los tejidos perioculares usando una lámpara de hendidura portátil durante todo el estudio para signos de inflamación. La única evidencia de inflamación pareció que se relacionó con las manipulaciones quirúrgicas realizadas como parte del estudio, dando como resultado adherencias focales iridocorneales en la primera semana para todos los animales en el estudio. La localización de estas adherencias fue coherente con el taponamiento del iris en las vías de paracentesis con aguja de calibre 30 que se usaron para recoger las muestras acuosas. Esta inflamación se curó antes del día 14 del estudio. Los ojos se enuclearon y se tiñeron usando H&E, PAS y tricromo de Masson para el análisis histológico tras el sacrificio de los conejos en el día 28. Los portaobjetos resultantes revelaron cantidades mínimas de tejido fibroso que rodeaba al área de inyección (1-2 capas de células de espesor). No estuvo presente inflamación aguda o crónica sugerente de una respuesta a cuerpos extraños o infección. Además, ninguna de las histologías evaluadas mostró evidencia de migración de partículas desde el lugar de inyección original. Las MP parcialmente degradadas en el espacio subconjuntivo se pueden observar en la Figura 6. Imágenes similares para los restantes conejos que recibieron o blanco de MP o cargadas con fármaco mostraron que el tejido que rodea las MP parecía normal.

Suspensiones de hidrogel/micropartículas

Las micropartículas se añaden al hidrogel líquido después de que se haya lavado minuciosamente y mezclado suavemente para suspenderlas homogéneamente. Los tiempos de incubación de aproximadamente 20-30 minutos son ideales para la adecuada suspensión de partículas. Normalmente, los presentes inventores suspenden 10-50 mg de partículas en aproximadamente 50 ul de disolución de gel.

El gel termosensible desarrollado para administración ocular como se describe en el presente documento se ajustó para tener una temperatura de transición de fase inferior a 37 °C con densidad de reticulación suficiente para formar reversiblemente un gel opaco. En esta realización, el gel basado en pNIPAAm pasa de un líquido a un gel durante aproximadamente 5 segundos a 34 °C. Además, los geles termorreversibles se diseñaron para ser no degradables, como se confirma deshidratando y pesando muestras de gel/micropartículas junto con el estudio de liberación. La prueba de citotoxicidad inicial de la suspensión de gel/partículas en la estripe celular de conjuntiva de Chang (ATCC) no mostró efectos perjudiciales in vitro con un mínimo de 5 lavados, necesarios para retirar los agentes iniciadores usados durante la polimerización del gel. Las micropartículas de liberación de BT diseñadas a medida proporcionan eficazmente la liberación durante un mes también cuando se suspenden en el gel como lo hacen en disolución libre (véase Fig. 8). En otras palabras, la incorporación de las micropartículas manipuladas en el gel no afecta significativamente el perfil de liberación previsto de BT del sistema.

Las suspensiones de micropartículas/hidrogel se pueden administrar a un conejo para probar si el miembro gelificado puede quedar en el fondo inferior durante un mínimo de 30 días, si el miembro gelificado produce o no inflamación, y la capacidad del miembro gelificado para reducir la presión intraocular en conejos que tienen hipertensión ocular (un modelo de glaucoma experimental). Las suspensiones de micropartículas/hidrogel también se pueden cargar con un agente de contraste basado en gadolinio para imagen por resonancia magnética para cuantificar la cantidad de agente de contraste que llega a diferentes áreas del ojo, tal como la córnea, la retina, el nervio óptico y la circulación sistémica. Esto proporcionará información sobre la utilidad de este sistema para administrar fármacos para enfermedades distintas del glaucoma, tales como degeneración macular senil y edema macular.

La eficacia de la gelificación de la formulación de colirio se puede probar en un estudio convencional de tipo sacrificio en cadena usando un modelo de conejo de glaucoma crónico adaptado de métodos similares usando primates no humanos. Se pueden usar conejos blancos de Nueva Zelanda para este estudio debido a que sus ojos son similares en tamaño a los ojos humanos. Para inducir hipertensión ocular, se puede inyectar un volumen de 50 pl de perlas de látex de 20 pm en la cámara anterior, que se ha mostrado que da como resultado una elevada IOP durante hasta 5 semanas, con un máximo de casi dos veces la IOP basal. Para lograr una elevada IOP durante todo el estudio, los presentes inventores inyectarán las microperlas dos veces separadas 5-6 semanas y el aumento de IOP será validado primero en animales de control. Este modelo también se ha mostrado que provoca la muerte de axones RGC, que hace que sea un modelo adecuado para determinar el efecto neuroprotector, si lo hay, de nuestro método de tratamiento. Tras la inducción confirmada de hipertensión ocular, se aleatorizará a un ojo de los conejos para recibir una de las tres terapias: disolución de BT 2 veces al día (control positivo), sistema de administración de vehículo solo de gel que contiene micropartículas sin BT (control negativo) y la gota de micropartículas/hidrogel cargada de BT. La IOP se medirá usando tanto neumatonometría como tonometría de rebote (usando el tonómetro portátil TonoVet®) varios días antes de empezar el tratamiento para establecer un nivel basal. Las mediciones de IOP se harán un mínimo de tres veces por semana desde el inicio de la terapia hasta el final del estudio, que dura hasta tres meses. Se tomarán periódicamente muestras acuosas de la cámara anterior en esos días para medir los niveles de fármaco en el ojo, y se tomarán muestras de sangre de la vena marginal de la oreja para medir las concentraciones sistémicas de fármaco. Como las concentraciones sistémicas de BT serán probablemente bastante bajas, los presentes inventores usarán métodos establecidos de purificación y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para realizar estos ensayos. Las principales medidas del resultado serán 1) reducción en IOP, 2) niveles acuosos medios de fármaco, y 3) concentración sistémica del fármaco en muestras de sangre. Se espera que el sistema de administración experimental probado en este estudio demuestre reducción de IOP comparable (o mejor) y concentración acuosa de BT cuando se compara con el grupo de control positivo con una concentración sistémica de fármaco significativamente más baja. También se usará examen de lámpara de hendidura para evaluar la condición de los ojos antes y durante la terapia para evaluar cualquier evidencia de efectos secundarios.

Tras completarse el estudio in vivo, todos los ojos se enuclearán y prepararán para el análisis histológico usando incorporación en parafina y técnicas de tinción. Se examinarán la salud general y el aspecto del tejido que rodea al colirio (córnea, esclerótica, conjuntiva y párpado), así como otros tejidos de interés, particularmente la retina y el nervio óptico para determinar la toxicidad in vivo después de la exposición a largo plazo. Más específicamente, los presentes inventores determinarán si ha ocurrido una pérdida apreciable de axones de las células ganglionares de la retina (RGC) usando técnicas histopatológicas comunes. Cualquier área de daño posible se identificará usando microscopía óptica y se usará software de análisis de imágenes (ImageJ, NIH) para contar el número de axones en cada área de daño para comparación entre ojos tratados y de control.

Los siguientes grupos y números de animales, basados en un análisis de potencia de los datos preliminares in vivo de IOP, se usarán para demostrar una reducción de IOP estadísticamente significativa en cada momento de tiempo en los estudios in vivo de los presentes inventores:

Aunque los presentes inventores ya han visto el éxito del uso de tanto las micropartículas como el hidrogel in vivo, es posible que los presentes inventores tengan problemas con la retención del colirio en algunos de los conejos durante un mes. Por ejemplo, la presencia de la membrana nictitante en conejos puede hacer que la gota se desprenda con el tiempo, que, aunque no es un problema para los pacientes humanos, afectaría a la prueba de eficacia. En el trabajo inicial de los presentes inventores, han sido capaces de mejorar la retención de las gotas de gel/micropartículas incorporando una forma mucoadhesiva soluble en agua de quitosano en el gel. Si la retención todavía demuestra ser un problema en momentos de tiempo posteriores (particularmente en la formulación de tres meses), hay una variedad de opciones mínimamente invasivas para mitigar este efecto, que incluyen la sutura de la gota gelificada al fondo inferior, la amputación de la membrana nictitante, o una inyección única de toxina botulínica (tal como Botox®, comúnmente usada para tratar estrabismo en adultos) para reducir temporalmente la funcionalidad de la membrana nictitante. Otro posible problema puede ser el insuficiente o incoherente aumento de IOP en los conejos que reciben la inyección de microperlas y la consiguiente falta de efecto del tratamiento. Se usarán dos tipos de tonometría para garantizar mediciones precisas, pero si la validación inicial del modelo de glaucoma in vivo de los presentes inventores no muestra un aumento adecuado en la IOP (definida como IOP significativamente mayor en comparación con el nivel basal durante al menos 4 semanas), los presentes inventores incorporarán una tercera entre las inyecciones de microperlas al principio y el punto medio del estudio. Con la experiencia de los presentes inventores y en estudios independientes del modelo de oclusión de microperlas en roedores, se ha mostrado que múltiples inyecciones producen una duración coherente más larga del aumento de IOP. Por lo tanto, los presentes inventores prevén que el uso de estas técnicas y una validación inicial exhaustiva trataría suficientemente las insuficiencias con su modelo experimental.

Prueba in vivo de las suspensiones de hidrogel/micropartículas

Se probó la gota de gel/micropartículas en un modelo de conejo durante 28 días. Se cortó la membrana nictitante (tercer párpado) antes de administrar la gota para representar mejor la retención en un ojo humano (véase la Figura 11). La gota se administró sin necesidad de sujeción, sedación o anestesia local previa (Figura 12A). Los resultados fueron los siguientes:

Las gotas no produjeron irritación ni infección en ninguno de los conejos, como se evalúa usando el examen de lámpara de hendidura. Las gotas se identificaron como intactas durante 21 días, momento en el que la aparición del gel/micropartículas pareció indicar que se había roto en trozos más pequeños (o que la gota se había caído parcialmente o migrado lejos del fondo inferior). La Figura 13 muestra las gotas de gel/micropartículas en diversos momentos de tiempo. La presencia de los geles se confirmó usando tinción con fluoresceína y luz de azul de cobalto, que diferencia el gel de los tejidos de alrededor dándole un color verde brillante.

Independientemente del aspecto de los geles, los datos indican una vez más que la presión intraocular con respecto al grupo de control negativo fue significativamente más baja en cada momento de tiempo, excepto uno (supuestamente debido a una presión anormalmente baja en el grupo de control negativo en ese día, como se observa en la Figura 14A). Estos resultados se corresponden bien con los observados con tanto las micropartículas solas como el control positivo (medicación de colirio tópica), con la excepción de que ambos tratamientos experimentales superaron en realidad a las gotas en el momento de medición en el día 14.

En el ojo de control, se observó de poco ningún efecto sobre la presión intraocular. Esto indica de nuevo que el tratamiento experimental tuvo una captación sistémica notablemente reducida en comparación con el grupo de medicación de colirio tradicional (Figura 14B).

Pruebas in vitro de micropartículas de GD-DOTA

Los presentes inventores utilizaron el comportamiento de liberación de BT (Figuras 2 y 8) para generar especificaciones de diseño y construir la formulación de Gd-DOTA personalizada. Para confirmar que las especificaciones para el comportamiento de liberación se cumplieron en la nueva formulación de Gd-DOTA, los presentes inventores incubaron una masa conocida de esta formulación en una disolución de tampón y midieron la liberación de Gd-DOTA con el tiempo usando tanto barridos de IRM en momentos de tiempo predefinidos como también mediciones de fluorescencia resuelta en el tiempo (como método secundario para confirmar la concentración de Gd-DOTA). Aunque los datos mostrados en la Figura 9 indican que se puede requerir algún ajuste menor de la formulación, el comportamiento de la formulación preliminar de Gd-DOTA de los presentes inventores ya se corresponde extremadamente bien con el de la formulación de liberación de BT, lo que aumenta la probabilidad de lograr satisfactoriamente los objetivos propuestos de los presentes inventores. Similarmente, estos resultados muestran además la fiabilidad de los métodos informáticos de los presentes inventores en la preparación de este tipo de formulaciones de liberación. También se midió la carga global de Gd-DOTA usando espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) (y se confirmó usando el método espectrofotométrico de TRF) y se determinó que era 5,6 ug/mg de micropartículas. Estos resultados de carga están de acuerdo con los de Doiron et al. (2008) durante la liberación de 5 h de Gd-DTPA, un agente de contraste alternativo con tamaño y estructura similares a Gd-DOTA, atrapado en microesferas de PLGA.

Para demostrar la factibilidad de la cuantificación de la liberación controlada local de un depósito de gel/micropartículas usando IRM, los presentes inventores realizaron barridos de IRM ponderados en T1 cadavéricos de ratones blancos de Nueva Zelanda 24 h después de la inyección intravítrea (en el ojo derecho solo) del depósito de MP cargadas con Gd-DOTA (Figura 10a) y Gd-DOTA soluble (Figura 10b), ambos contenidos dentro de la matriz termosensible de hidrogel. Los barridos se realizaron en una hora desde el sacrificio. Gd-DOTA soluble sin encapsulación de MP se depuró en gran medida del lugar de inyección a las 24 h, con solo 56 % y 59 % de intensidad de señal (con respecto al tejido muscular cercano) en la cámara vítrea y anterior, respectivamente. A diferencia, las MP cargadas con Gd-DOTA de liberación controlada generaron una intensidad de señal el 690 % y 347 % mayor con respecto a la de músculo en la cámara vítrea y anterior, respectivamente (Figura 10a). Estos resultados demuestran la capacidad de los presentes inventores para seguir la liberación y depuración de Gd-DOTA en el ojo en barridos de cerebro completo, así como la liberación más lenta de Gd como se indica por el aumento significativo en la intensidad de señal a las 24 h en el depósito de gel/MP cargado con Gd-DOTA. Esta colocación nos permitió demostrar que estos agentes se podrían localizar en barridos de animal completos y la liberación correspondiente de Gd-DOTA se puede cuantificar en diversos tejidos oculares. Los presentes inventores prevén que, similares a sus resultados cadavéricos, los estudios propuestos in vivo demostrarán un patrón de liberación controlada del depósito de gel/micropartículas en el entorno local análogo a los datos de liberación in vitro en la Figura 9. La distribución espaciotemporal de Gd-DOTA en el resto del ojo también proporcionará datos valiosos para futuras formulaciones de liberación controlada de otros terapéuticos oculares, tales como los que se dirigen al segmento posterior del ojo.

Los presentes inventores desarrollarán al menos dos formulaciones de micropartículas cargadas con Gd-DOTA siguiendo un programa de liberación de un mes (análogo a la actual formulación de nanopartículas cargadas con BT) y también un programa de liberación de tres meses (análogo a la formulación de micropartícula cargada con BT propuesta). Aunque la actual formulación de micropartículas con Gd-DOTA ya muestra una buena concordancia con el anterior programa de liberación in vitro, los presentes inventores harán ajustes en el tamaño de poro y el tamaño de partículas para disminuir la liberación inmediata inicial observada en los tres primeros días para lograr una mejor concordancia con la liberación de BT de un mes. Los presentes inventores usarán IRM y espectrofotometría para detectar la liberación in vitro de Gd-DOTA de las micropartículas. Las eficiencias de carga se determinarán nuevamente usando TRF y se confirmarán con ICP-MS y la morfología superficial y el tamaño de las partículas será determinado in vitro antes de su uso in vivo.

Los candidatos a micropartículas cargadas con Gd-DOTA durante las pruebas in vitro se probarán en un modelo de conejo sano, similarmente a los colirios de gelificación cargados con BT. La administración de los colirios de gelificación que contienen agente de contraste se hará de la misma forma que con la versión cargada de fármaco, a diferencia de los estudios preliminares en los que las MP se inyectaron por vía intravítrea. Los presentes inventores escanearán a los conejos en diversos momentos de tiempo usando técnicas de mapeo de T1 de alta resolución en un escáner 3T de IRM en el Centro de Obtención de Imágenes de Neurociencia en la Universidad de Pittsburgh durante todo el estudio (que dura un máximo de tres meses) para determinar la localización y la concentración de agente de contraste liberado. La concentración de agente de contraste en diversos componentes oculares, por ejemplo la cámara anterior y el vítreo, se comparará con la concentración de BT en los mismos tejidos. Por lo tanto, los presentes inventores serán capaz de determinar cómo de bien la concentración de BT en diversos compartimentos del ojo sigue la concentración de agente de contraste. Las medidas de éxito de estos experimentos serán la liberación de Gd-DOTA al área local del depósito de gel/micropartícula que equipare la concentración de BT en las mismas áreas (como se determina por muestras acuosas tomadas de conejos en el estudio de sacrificios en cadena). Tras la finalización de los estudios de IRM in vivo, los presentes inventores realizarán una vez más el examen con lámpara de hendidura y las mediciones de tonometría para evaluar la salud ocular de los conejos. Los presentes inventores también tomarán periódicamente muestras de humor acuoso y humor vítreo, así como muestras de sangre venosa de la vena marginal de la oreja, como confirmación secundaria de la liberación local y sistémica de agente de contraste. Los datos de concentración de Gd-DOTA por IRM y espectrofotométrico se compararán con los datos de concentración de BT in vivo. Tras finalizar los estudios in vivo, los ojos serán enucleados y evaluados para su aspecto global y salud usando técnicas comunes de análisis histopatológico.

Liberación de tres meses

Esta realización describe una "receta" de formulación que sería adecuada para la liberación lineal y sostenida de BT durante un periodo de tres meses. Más específicamente, se pueden realizar 90 días de liberación lineal de BT usando los siguientes parámetros de fabricación: 1) Rp (radio de partícula global) = 10 gm, 2) Rocc (oclusión interna o tamaño de poro) = 0,03 gm, 3) Mwd = 256 kDa, 4) kCw (constante de velocidad de degradación) = 1,00^e-6 días-1, y 5) una relación de aproximadamente 2 % de poli(láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) de MW bajo, 27 % de MW medio y 71 % de MW alto que contiene 50 % de cada uno de los monómeros de lactida y glicolida. Las micropartículas se fabricarán usando un procedimiento de emulsión doble estándar de una disolución orgánica de PLGA (un polímero traducible, biocompatible y biodegradable) que es microemulsionado junto con una disolución acuosa de BT. La liberación de BT in vitro durante tres meses se probará incubando una masa de micropartículas conocida en una disolución de tampón a 37 °C. Se tomarán muestras a intervalos regulares y el tampón se sustituirá para mantener condiciones de tipo sumidero. Las muestras de tampón que contienen BT se ensayarán para la concentración de BT usando absorbancia espectrofotométrica a una longitud de onda de 320 nm.

Modificación de las propiedades de transición de fase del gel

La densidad de reticulación y la concentración de otros reactivos desempeñan funciones clave en la determinación del tiempo de transición de fase y la temperatura del gel. La adición de poli(etilenglicol) PEG (400 Da) permite a la gota ser opaca (y, por lo tanto, fácilmente visible a simple vista) y lo suficientemente firme como para ser retirada con pinzas. Los presentes inventores pueden ajustar además la cantidad de PEG añadida y el peso molecular de PEG para reducir la temperatura de transición de fase más cerca de un valor ideal de 27 °C (tan baja como sea posible mientras que todavía esté suficientemente por encima de la temperatura ambiente). La máxima carga de micropartículas en las gotas será determinada realizando pruebas de estabilidad de las gotas de gelificación in vitro. Las muestras de gel/micropartículas se pesarán en momentos de tiempo variables para garantizar que, al igual que con la formulación de gel original, la degradación de la gota sea despreciable durante el intervalo de tiempo de administración.

Hidrogel/micropartículas con otros fármacos

También se ha confirmado la carga y liberación de otros fármacos (moxifloxacino y vancomicina) con las micropartículas incorporadas dentro del gel. Estos datos indican el uso de esta terapia para otras enfermedades oculares (en este caso, para tratar infección ocular o para el uso profiláctico tras la cirugía ocular).

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un hidrogel termosensible líquido que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente,

en donde las micropartículas de polímero comprenden poliglicolida, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-coglicólico), alginato, policaprolactona, celulosa, dextrano, quitosano, o una combinación de los mismos, y en donde el hidrogel termosensible comprende poli(n-isopropilacrilamida), poli(N,N-dimetilacrilamida-co-N-fenilacrilamida), poli(metacrilato de glicidilo-co-N-isopropilacrilamida), poli(óxido de etileno)-b-poli(óxido de propileno)-b-poli(óxido de etileno), copolímero de poli(etilenglicol)-poliéster, o una combinación de los mismos, para su uso en la administración sostenida del agente a un órgano ocular en un sujeto,

en donde el hidrogel termosensible líquido que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente se administra por vía tópica a la superficie ocular, el agente es un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, o un agente de obtención de imágenes, y en donde el hidrogel termosensible líquido que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente se administra a la superficie ocular en forma de un colirio en un intervalo superior a al menos un día, preferentemente en un intervalo de al menos cinco días, entre administraciones.

2. El hidrogel para el uso de la reivindicación 1, en donde las micropartículas de polímero cargadas de agente tienen un diámetro promedio en volumen de 1 a 10 pm.

3. El hidrogel para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el agente está encapsulado en las micropartículas de polímero.

4. El hidrogel para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente es un agente terapéutico, y preferentemente en donde el agente es un agente que reduce la presión intraocular.

5. El hidrogel para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el uso comprende tratar una afección ocular en el sujeto, preferentemente glaucoma.

6. El hidrogel para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el agente se libera de forma sostenida durante un periodo de al menos un día, preferentemente de al menos cinco días.

7. Una composición que comprende micropartículas de polímero cargadas de agente dispersado dentro de un hidrogel termosensible,

en donde las micropartículas de polímero comprenden poliglicolida, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-coglicólico), alginato, policaprolactona, celulosa, dextrano, quitosano, o una combinación de los mismos, en donde el hidrogel termosensible comprende poli(n-isopropilacrilamida), poli(N,N-dimetilacrilamida-co-N-fenilacrilamida), poli(metacrilato de glicidilo-co-N-isopropilacrilamida), poli(óxido de etileno)-b-poli(óxido de propileno)-b-poli(óxido de etileno), copolímero de poli(etilenglicol)-poliéster, o una combinación de los mismos, en donde el agente es un agente para tratar una afección ocular y la composición está configurada para liberación ocular tópica sostenida del agente.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde el agente es un agente que reduce la presión intraocular, las micropartículas son biodegradables y el hidrogel no es biodegradable.

9. La composición de la reivindicación 7, en donde las micropartículas de polímero cargadas de agente tienen un diámetro promedio en volumen de 1 a 10 pm.