ES2930456T3 - Composiciones que comprenden polipéptidos de clado CYP76AD1 y usos de estos - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona polinucleótidos recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un gen CYP76AD6 o relacionado y su uso para producir L-DOPA a partir de tirosina y tratar trastornos sensibles a la dopamina, como la enfermedad de Parkinson. La invención también proporciona polinucleótidos recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y/o CYP76AD6, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), como Beta vulgaris DODA1 y, en algunos casos, un ácido nucleico que codifica glucosiltransferasa relacionada con betalaína, tal como la ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa del gen M. jalapa (cDOPA5GT), y su uso para producir betalaínas. Finalmente, la invención proporciona polipéptidos quiméricos, vectores de expresión, células, composiciones y organismos, incluidas las plantas, y sus usos en diversos métodos de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden polipéptidos de ciado CYP76AD1 y usos de estos
Campo de la invención
La invención proporciona polinucleótidos recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un gen CYP76AD6 o un gen relacionado y su uso para producir L-DOPA a partir de tirosina y tratar trastornos sensibles a la dopamina, tales como la enfermedad de Parkinson. La invención también proporciona polinucleótidos recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un CYP76AD1 y/o CYP76AD6, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), tal como DODA1 de Beta vulgaris y, en algunos casos, un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, tal como un gen de ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa de M. jalapa (cDOPA5GT), y su uso para producir betalaínas. Finalmente, la invención proporciona polipéptidos quiméricos, vectores de expresión, células, composiciones y organismos, lo que incluye plantas, y sus usos en diversos métodos de la invención.
Antecedentes de la invención
Las betalaínas son pigmentos vegetales de color rojo púrpura y amarillo derivados de la tirosina que se encuentran en un solo grupo de angiospermas, el orden Caryophyllales, en el que se encuentran de manera mutuamente excluyente con los pigmentos de antocianina químicamente distintos y generalizados. La clase de las betalaínas contiene una amplia serie de compuestos, que se clasifican generalmente en dos grupos; las betacianinas rojo púrpura y las betaxantinas amarillas.
Una enzima clave en la biosíntesis de las betalaínas, la DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) convierte la L-DOPA en ácido betalámico, que constituye la cadena principal básica de todas las betalaínas (Figura 1). La conjugación espontánea de ácido betalámico con aminas o con derivados de L-DOPA, da como resultado la formación de betaxantinas amarillas o betacianinas rojo púrpura, respectivamente. La glucosiltransferasa relacionada con la betalaína también se ha caracterizado en varias especies de plantas Caryophyllales, donde cataliza la glucosilación 5-O de la ciclo-DOPA o, alternativamente, la glucosilación 5-O o 6-O de la betanidina. Se desconoce la enzima que cataliza la formación de L-DOPA a partir de la tirosina.
Debido a su alta estabilidad, independencia del pH y propiedades antioxidantes, las betalaínas pueden usarse como colorantes alimentarios naturales y suplementos dietéticos.
Si bien las fuentes potenciales de antocianinas en plantas comestibles son numerosas, las betalaínas se encuentran en muy pocas plantas comestibles, la remolacha roja es la única fuente importante para la extracción de betalaína en uso comercial en la actualidad. A pesar de su alto contenido en betacianina, el extracto de remolacha roja tiene varios inconvenientes como fuente de colorantes alimentarios; produce principalmente betanina y, por tanto, tiene una variabilidad de color limitada, tiene sabores terrosos adversos debido a la presencia de geosmina y diversas pirazinas, y conlleva el riesgo de transferencia de microbios transmitidos por el suelo. Actualmente no existen fuentes naturales para el uso a gran escala de las betaxantinas como colorantes alimentarios. La remolacha amarilla, por ejemplo, no se usa probablemente debido a los fenoles coexistentes que se oxidan fácilmente y enmascaran el tono amarillo de las betaxantinas. Evidentemente, es de interés desarrollar fuentes alternativas de betalaínas, particularmente betaxantinas, ya que actualmente no existen pigmentos solubles en agua amarillos naturales disponibles para uso comercial en la industria alimentaria. La producción heteróloga de betalaínas puede proporcionar numerosas nuevas fuentes viables para estos pigmentos, tales como plantas, cultivos de células vegetales, algas y levaduras.
Un intermediario de la vía de la betalaína, la L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), es también un metabolito comercialmente valioso que se usa ampliamente para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
La enfermedad de Parkinson es un trastorno progresivo del sistema nervioso que afecta principalmente al sistema motor del cuerpo. Es el segundo trastorno neurodegenerativo más común y el trastorno del movimiento más común, que afecta a un estimado de 5 millones de personas en todo el mundo. Una característica principal de la enfermedad de Parkinson es la reducción de los niveles de dopamina, una molécula de señalización importante en el sistema nervioso. La terapia más efectiva para la enfermedad de Parkinson es la administración de L-DOPA (3,4-dihidroxifenilalanina), que se convierte en dopamina en el cerebro. La L-DOPA es el fármaco más efectivo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, ya que la dopamina no logra atravesar la barrera hematoencefálica. La L-DOPA también se comercializa ampliamente como suplemento dietético y es un precursor de metabolitos adicionales de alto valor, lo que incluye, entre otros, catecolaminas (por ejemplo, dopamina, epinefrina), alcaloides de bencilisoquinolina (por ejemplo, morfina y otros opiáceos), pigmentos de betalaína y melanina.
Aunque la L-DOPA se produce en muchas especies de plantas y animales, rara vez se acumula en cantidades sustanciales. Esto se debe parcialmente al hecho de que la L-DOPA se forma universalmente por la enzima tirosinasa, que cataliza la hidroxilación de la tirosina a L-DOPA pero también la convierte inmediatamente a su forma oxidada, la dopaquinona.
Actualmente, la L-DOPA para la industria farmacéutica se produce mediante el uso de uno de varios métodos, todos los cuales tienen graves limitaciones, ya que la síntesis química solo puede lograrse en un proceso costoso que implica muchas reacciones químicas y requiere el uso de sustratos costosos y condiciones rigurosas de producción. También se ha explorado la producción biotecnológica de L-DOPA mediante el uso de enzimas tirosinasa (también denominadas polifenol oxidasa- PPO). La reacción dual de la tirosinasa descrita anteriormente es muy problemática para la producción comercial de L-DOPA, ya que el producto de interés se metaboliza directamente a la dopaquinona comercialmente inútil y, por lo tanto, es un cuello de botella importante para su uso en la biosíntesis enzimática para la producción a gran escala de L-DOPA a partir de tirosina. Por tanto, existe una necesidad insatisfecha de un método más eficiente y menos costoso para preparar L-DOPA.
La biosíntesis de la betalaína es aún poco comprendida en comparación con las otras clases principales de pigmentos vegetales, específicamente, antocianinas y carotenoides, especialmente en lo que respecta a la enzima que cataliza la conversión de tirosina en L-DOPA en la vía sintética de la betalaína en Caryophyllales.
Resumen de la invención
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una enzima implicada en la conversión de tirosina en L-DOPA, en donde dicha secuencia de ácido nucleico es un gen CYP76AD6 bajo el control de un promotor o un gen CYP76AD15 bajo el control de un promotor.
En una modalidad, la presente invención proporciona que la secuencia de ácido nucleico del gen CYP76AD6 es como se expone en s Eq ID NO: 31, o en donde la secuencia de ácido nucleico del gen CYP76AD15 es como se expone en SEQ ID NO: 35.
En una modalidad, la presente invención proporciona que el polinucleótido comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen de selección, tal como el gen de la neomicina fosfotransferasa II (nptII).
En una modalidad, la presente invención proporciona que el promotor es un promotor constitutivo o es un promotor inducible.
En una modalidad, la presente invención proporciona que el promotor es un promotor 35S de CaMV, un promotor de ubiquitina 10, un promotor de ubiquitina 10 de Solanum lycopersicum (SlUb10), o un promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis, o en donde dicho promotor inducible es un promotor inducible por galactosa.
En una modalidad, la presente invención proporciona que el polinucleótido es el vector de expresión pDOPA1, que comprende el gen CYP76AD6 impulsado por el promotor 35s de CaMV; o el vector de expresión pDOPA2, que comprende el gen CYP76AD6 impulsado por el promotor de ubiquitina 10 de Solarium lycopersicum.
En una modalidad, la presente invención proporciona que el promotor es un promotor específico de frutas tal como el promotor E8, o es un promotor específico de flores tal como el promotor de la calcona sintasa (CHS) de Petunia x hybrida.
En una modalidad, la presente invención proporciona que el polinucleótido comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen que aumenta la disponibilidad de tirosina en una célula, por ejemplo, un AroG175, o una hidroxilasa de aminoácidos aromáticos (AAH), o una de sus combinaciones.
En una modalidad, la presente invención proporciona que la célula es una célula vegetal.
En una modalidad, la presente invención proporciona que el polinucleótido incluye además una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en donde dicha secuencia de ácido nucleico se inserta en el marco del polinucleótido.
En una modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende el polinucleótido recombinante, o un vector de expresión que comprende el polinucleótido recombinante, o un polipéptido quimérico codificado por el polinucleótido recombinante.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir L-DOPA en una célula que comprende las etapas de: poner en contacto dicha célula con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10; y expresar en dicha célula un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD6 o dicho gen CYP76AD15; lo que produce de esta manera L-DOPA.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método in vitro para producir L-DOPA a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina in vitro con un polipéptido recombinante sintetizado a partir de un gen CYP76AD6 o un gen CYP76AD15, lo que produce de esta manera L-DOPA.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante naranja natural que comprende las etapas de poner en contacto una célula con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), un ácido nucleico; y expresar en dicha célula un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD6 o gen CYP76AD15, y un polipéptido recombinante a partir del gen que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD); en donde se producen betaxantinas en dicha célula, lo que produce de esta manera un colorante amarillo natural.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante naranja natural que comprende las etapas de poner en contacto una célula con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6 o CYP76AD15 y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína; y expresar en dicha célula un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD1, un polipéptido recombinante a partir del gen que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD6 o dicho gen CYP76AD15, y un polipéptido recombinante a partir del gen que codifica la glucosiltransferasa relacionada con la betalaína; en donde se produce una combinación de betacianina y betaxantina, lo que produce de esta manera un colorante naranja natural.
Breve descripción de los dibujos
El objeto considerado como la invención se señala particularmente y se reivindica claramente en la porción conclusiva de la descripción. La invención, sin embargo, tanto en organización como en método de operación, junto con objetivos, características y ventajas de esta, puede entenderse mejor por referencia a la descripción detallada siguiente cuando se lee con las figuras adjuntas en las que:
Figura 1. La vía biosintética de la betalaína. Los genes que participan en la vía se muestran en magenta. Reacciones enzimáticas: EI, hidroxilación de tirosina; EII, DOPA-4,5 dioxigenasa; EIII, oxidación de DOPA; EIV, glucosilación de ciclo-DOPA; EV, glucosilación de betanidina; EVI, glucosilación adicional de betacianinas; EVII, acilación de betacianinas. Reacciones espontáneas predichas: SI, condensación (formación de aldimina). Las reacciones enzimáticas EII y EIII van seguidas de una reacción de ciclación espontánea y, por lo tanto, están marcadas con un asterisco. La EV puede catalizarse alternativamente por una betanidin-6-O-glucosiltransferasa, lo que da lugar a la formación de gonfrenina en lugar de betanina. Las líneas discontinuas designan reacciones de una vía alternativa, que se demostró que se produce en Mirabilis jalapa, en la que la ciclo-DOPA se glucosila primero y después se condensa con ácido betalámico para formar betanina.
Figuras 2A-2G. Identificación de MjCYP76 (SEQ ID NO: 1) como un gen candidato relacionado con la betalaína. La expresión génica en Mirabilis jalapa se analizó en un conjunto de datos de transcriptoma derivado de 24 tejidos, lo que incluye cuatro tipos de órganos florales en cinco etapas de desarrollo, epidermis de tallo rojo o verde, y hojas rojas o verdes. Figura 2A: Pétalos. Figura 2B: Filamentos de estambre. Figura 2C: Epidermis del tallo del nudo o entrenudo. Figura 2D: Estigmas. Figura 2E: Anteras. Figura 2F: Hoja roja-joven o madura-verde. Figura 2G: Los genes ciclo-dopa-5-O-glucosiltransferasa relacionados con la betalaína (cDOPA5GT; SEQ ID NO: 2), DOPA 4,5-dioxigenasa (MjDOD; SEQ ID NO: 3) y el citocromo P450 CYP76AD3 (Núm. acceso a Genbank HQ656026.1; SEQ ID NO: 4) muestran patrones de expresión que son similares a la acumulación de pigmento. El gen MjCYP76 del citocromo P450 (SEQ ID NO: 1) se coexpresa altamente con cDOPA5GT (valor r de correlación de Pearson = 0,90) y en menor medida con MjDOD (valor r = 0,67).
Figura 3. Patrones de expresión génica de los supuestos genes que codifican la polifenol oxidasa MjPPOI (SEQ ID NO: 5); MjPPO2 (SEQ ID NO: 6); MjPPO3 (SEQ ID NO: 7); y MjPPO4 (SEQ ID NO: 8) en el conjunto de datos de seq-ARN de Mirabilis jalapa.
Figura 4A. El análisis por qRT-PCR de cuatro parálogos de CYP76AD muestra una regulación negativa parcial después de la infección con vectores pTRV2:CYP76AD1 o pTRV2:CYP76AD1-CYP76AD6, lo que sugiere un silenciamiento fuera del objetivo. Se observó una regulación positiva de Bv20048 en tejidos infectados con pTRV2:CYP76AD1-CYP76AD6. Los valores de cuantificación relativa (RQ) indican la media de tres réplicas biológicas ± SE. Los asteriscos indican la significación estadística de la expresión diferencial en comparación con el tejido no silenciado. *, P < 0,05; **, P < 0,01.
Figura 4B. Árbol filogenético de máxima probabilidad de parálogos de CYP76AD en B. vulgaris. CYP76AD6 (Núm. de acceso a GenBank KT962274; SEQ ID NO: 30); CYP76AD1 (acceso AET43289.1; SEQ ID NO: 14); BvCYP76new (acceso KU041699; SEQ ID NO: 9); Bv20048 (acceso KU041700); Bv10427 (acceso KU041701); Bv31911 (acceso KU041702); Bv15899 (acceso KU041703); Bv15885 (acceso KU041704).
Figuras 5A-5C. El silenciamiento conjunto de CYP76AD1 y CYP76AD6 inhibe la producción de betalaína. Se usaron ensayos de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) en remolacha roja para silenciar BvDODAl o CYP76AD1. CYP76AD1 conjuntamente se silenció adicionalmente con cada uno de los dos nuevos candidatos BvCYP76new (SEQ ID NO: 9) y CYP76AD6. Mientras que el silenciamiento de CYP76AD1 solo o el silenciamiento conjunto con BvCYP76new bloquea la formación de betacianinas pero no de betaxantinas, el silenciamiento conjunto de CYP76AD1 y CYP76AD6 impide la producción de ambos tipos de pigmentos, lo que da como resultado un fenotipo similar al que se obtiene al silenciar BvDODAl. La reducción de los niveles de betaxantina se observa mediante una disminución visible del color amarillo y la ausencia de fluorescencia bajo la luz azul, típica de las betaxantinas. En la Figura 5A, se presentan imágenes de la planta completa, 3,5 semanas después de la infiltración; en la Figura 5B, imágenes de una sola hoja, campo claro y en la Figura 5C, se muestran imágenes de una sola hoja, luz azul.
Figura 6A. Cuantificación relativa de betaxantina en hojas de remolacha con silenciamiento de VIGS. El contenido relativo de betaxantina se evaluó espectrofotométricamente mediante mediciones de absorción de luz a 475 nm y 600 nm. Los valores indican la media ± SEM de cuatro réplicas biológicas, cada una de las cuales consiste de tejido con genes silenciados de dos a tres plantas. Los asteriscos indican diferencia estadísticamente significativa con respecto a pTRV2:CYP76AD1. **, valor de P < 0,01. RQ, cuantificación relativa.
Figura 6B. Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR) de CYP76AD1 y CYP76AD6. CYP76AD1 está regulado negativamente en tejidos infectados con pTRV2:CYP76AD1 o pTRV2:CYP76AD1-CYP76AD6. CYP76AD6 está significativamente regulado negativamente después de la infección con pTRV2: CYP76AD1-CYP76AD6. Los valores de cuantificación relativa (RQ) indican la media de tres réplicas biológicas ± SE. Los asteriscos indican la significación estadística de la expresión diferencial en comparación con las plantas no infectadas. **, valor de P < 0,01.
Figuras 7A-7F. La expresión recombinante de CYP76AD1 o CYP76AD6 en hojas de Nicotiana benthamiana permite la producción de L-DOPA y betalaína. Figura 7A: La infiltración conjunta de agrobacterias que albergan plásmidos para la expresión de CYP76AD1 con cDOPA5GT (pAD1-GT) y BvDODAl (pDODA) en hojas de Nicotiana benthamiana provoca una pigmentación roja. Figura 7B: El análisis por LC-MS del tejido pigmentado de rojo muestra la aparición de betanina e isobetanina. Figura 7C: La infiltración conjunta del vector de expresión CYP76AD6 (pAD6) y pDODA en hojas de N. benthamiana provoca una pigmentación amarilla. Figura 7D: La infiltración conjunta de pAD1-GT en hojas de N. benthamiana permite la producción de L-DOPA. No se detectó L-DOPA en el experimento de control, donde se expresa YFP (pYFP). Figura 7E: El análisis del tejido pigmentado de amarillo permite la identificación de varios compuestos de betaxantina, lo que incluye la indicaxantina. Figura 7F: La infiltración de pAD6 en hojas de N. benthamiana permite la producción de L-DOPA. No se detectó L-DOPA en el experimento de control (pDODA pYFP). XIC, cromatograma de iones extraídos. Figuras 8A-8C. Los citocromos P450 CYP76AD1 y cYp76AD6 difieren en actividad y filogenia.
Figura 8A: Expresión recombinante de CYP76AD1, CYP76AD6 y BvDODAl en células de levadura. La imagen que se presenta es de un medio en el que se cultivaron las levaduras después de la inducción con galactosa durante la noche. Cada clon de levadura se transformó con tres vectores, para la expresión de CYP76AD1, CYP76AD6, BvDODAl y beta-glucoronidasa (GUS) en diferentes combinaciones, y se cultivaron en medio SD estándar sin suplementación con L-DOPA. La expresión combinada de BvDODAl y CYP76AD1 dio como resultado una pigmentación rojo púrpura de los medios de cultivo, mientras que la expresión de BvDODAl junto con CYP76AD6 dio lugar a la formación de una pigmentación amarilla, lo que indica la diferencia en la actividad catalítica entre CYP76AD1 y CYP76AD6. La expresión de BvDODAl con ambos citocromos P450S dio como resultado una pigmentación rojo-anaranjada del medio. No se observó pigmentación cuando cada uno de los citocromos P450s o BvDODAl se expresó solo.
Figura 8B: El alineamiento de secuencias múltiples de secuencias de proteínas similares a CYP76AD1 de plantas Caryophyllales productoras de betalaína se procesó en un árbol filogenético de máxima probabilidad, lo que dio como resultado la formación de dos clados separados, previamente denominados clados alfa y beta (Brockington y otros, 2015). CYP76AD6 se encuentra en el clado p, mientras que CYP76AD1 se ubica en el clado a. En el clado CYP76AD1-p: B. vulgaris, Beta vulgaris (CYP76AD6; Núm de acceso a GenBank KT962274; SEQ ID NO: 30); Bv. maritima, Beta vulgaris ssp. maritima (acceso AKI33834.1; SEQ ID NO: 10); F. latifolia, Froelichia latifolia (acceso AKI33838.1; SEQ ID NO: 11); A. caracasana, Alternanthera caracasana (acceso AKI33835.1; SEQ ID NO: 12); A. ficoidea, Alternanthera ficoidea (acceso AKI33831.1; SEQ ID NO: 13). En el clado CYP76AD1-a: B. vulgaris, Beta vulgaris (CYP76AD1; acceso AET43289.1; SEQ ID NO: 14); A. cruentus, Amaranthus cruentus (CYP76AD2; acceso AET43291.1; SEQ ID NO: 15); M. jalapa, Mirabilis jalapa (CYP76AD3; acceso AET43292.1; SEQ ID NO: 16); C. cristata, Celosía cristata (CYP76AD4; acceso AGI78466.1; SEQ ID NO: 17).
Figura 8C: El análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de medios de levadura pigmentados reveló la aparición del cromóforo ácido betalámico cuando CYP76AD1, CYP76AD6 o ambos se expresaron con BvDODA1, además de varias betaxantinas, lo que incluye glutamina-betaxantina y valinabetaxantina (Tabla 2; no se muestra en el cromatograma). La aparición de las betacianinas betanidina e isobetanidina se observó solo donde se expresó CYP76AD1. No se encontraron picos correspondientes a compuestos de betalaína donde no se expresó BvDODA1. Los ejes Y (intensidad máxima) de los seis cromatogramas están enlazados. XIC, cromatogramas de iones extraídos de masas correspondientes al ácido betalámico [M H = 212,05] e isómeros de betanidina [M H = 389,10]. Tiempo, tiempo de retención (min). Figura 9. El alineamiento de las secuencias de proteínas de CYP76AD1 (SEQ ID NO: 14) y CYP76AD6 (SEQ ID NO: 18) muestra una identidad del 72 por ciento entre ellas.
Figura 10. Esquema del vector de sobreexpresión pX11 (SEQ ID NO: 19). KanR, gen nptII que confiere resistencia a la kanamicina; DODA1, DOPA 4,5-dioxigenasa de B. vulgaris; CYP76AD1, citocromo P450 de B. vulgaris; cDOPA5GT, ciclo-DOPA-5-O-glucosiltransferasa de M. jalapa; nos, promotor/terminador de nopalina sintasa; 35S, promotor/terminador 35S de CaMV; Act2, terminador de actina 2 de Arabidopsis; Ub10, promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis;
Figuras 11A-11B. Producción de betalaínas en múltiples especies vegetales naturalmente no productoras.
Figura 11A: La transformación mediada por agrobacterias del vector pX11, que sobreexpresa el citocromo P450 CYP76AD1, DOPA 4,5-dioxigenasa (BvDODA1) y ciclo-dopa 5-O-glucosiltransferasa (cDOPA5GT), provoca el desarrollo de callos o brotes de color rojo púrpura en una variedad de especies vegetales de solanáceas, observadas típicamente dentro de 1-2 semanas de cultivo en cultivo de tejidos: Solanum lycopersicum (tomate), Solanum tuberosum (papa), Solanum melongena (berenjena), Nicotiana tabacum (tabaco), Nicotiana glauca (tabaco de árbol), Solanum nigrum (Hierba mora negra europea), Petunia x hybrida (Petunia), Nicotiana benthamiana.
Figuras 11B1-11B2: Los callos de Nicotiana glauca (Figura 11B1) y Nicotiana benthamiana (Figura 11B2) se muestrearon y analizaron con cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), lo que permitió la identificación de las betacianinas betanina e isobetaninina en ambas especies, además de un nuevo compuesto de betacianina no identificado, que se encuentra solo en el tejido de N. glauca (betacianina III; Tabla 2). XIC, cromatogramas de iones extraídos de masas correspondientes a la nueva betacianina [M H = 593,10] e isómeros de betanina [M H = 551,10]. Tiempo, tiempo de retención (min).
Figuras 12A-12C. Identificación y cuantificación de betacianina en especies manipuladas por ingeniería genética y productoras naturalmente.
Figura 12A: El análisis por LC-MS de las hojas de Nicotiana benthamiana agroinfiltradas con el vector pX11 permitieron la identificación de la betanina, que exhibe la misma masa precisa, tiempo de retención, patrones de fragmentación y espectros de absorción UV-VIS que la betanina de extracto de hojas de remolacha roja (Beta vulgaris).
Figura 12B: La agroinfiltración de agrobacterias que albergan el vector pX11 en hojas de N. benthamiana da lugar a una pigmentación roja intensa en el área infiltrada, que se observa típicamente en 2-3 días.
Figura 12C: El contenido de betacianina de N. benthamiana agroinfiltrada con pX11 y Nicotiana tabacum transformada con pX11 se evaluó en comparación con varias especies productoras de betalaína. El contenido de betacianina se evaluó espectrofotométricamente mediante mediciones de la absorción de luz a 535 nm y 600 nm. Los valores indican la media ± SE de la media de cuatro réplicas biológicas, cada una de las cuales consiste de 100 mg de tejido (peso fresco).
Figuras 13A-13E. Fenotipos de pigmentación observados en plantas de tabaco transgénicas manipuladas por ingeniería genética para la producción de betalaína. Tres genes de la vía de la betalaína, específicamente, CYP76AD1, BvDODAl y cDOPA5GT (en el vector binario pX11) se expresaron heterólogamente en Nicotiana tabacum, lo que dio como resultado pigmentación roja en diferentes órganos de la planta, lo que incluye hojas, tallos, raíces y flores. Figura 13A: Izquierda, tabaco de tipo silvestre; derecha, tabaco transformado con pX11. Figura 13B: Fila superior, flor de tabaco de tipo silvestre; fila inferior, flor con pX11. La acumulación de pigmento también fue evidente en las raíces con pX11 (Figura 13C), sección de la epidermis del tallo, con aumento x20 (Figura 13D) y tricomas glandulares de la hoja, con aumento x20 (Figura 13E).
Figuras 14A-14B. Producción de betalaína en cultivos alimentarios de tomate, papa y berenjena.
Figura 14A: La transformación del vector pX11 da como resultado la formación de plantas pigmentadas de rojo en papa (Solanum tuberosum var. Désirée, paneles superiores izquierdos), berenjena (Solanum melongena línea DR2, paneles inferiores izquierdos) y tomate (Solanum lycopersicum var. MicroTom, paneles derechos).
Figura 14B: La betanina y la isobetanina se identificaron como las principales betacianinas en tubérculos de papa, frutos de tomate y frutos de berenjena por análisis de LC-MS. Se muestra el cromatograma de iones extraídos (XIC) de la masa correspondiente a betanina/isobetanina [M+H=551,1] y la absorción UV-VIS del pico de betanina para los tres tejidos.
Figura 15. Esquema de los vectores de sobreexpresión pX11 (SEQ ID NO: 19), pX11(E8) (SEQ ID NO: 20), pX11(CHS) (SEQ ID NO: 21), pX12 (SEQ ID NO: 22) y pX13 (SEQ ID NO: 23). KanR, gen nptII que confiere resistencia a la kanamicina; DODA1, DOPA 4,5-dioxigenasa de B. vulgaris; CYP76AD1/CYP76AD6, citocromo P450 de B. vulgaris; cDOPA5GT, ciclo-DOPA-5-O-glucosiltransferasa de M. jalapa; nos, promotor/terminador de nopalina sintasa; 35S, promotor/terminador 35S de CaMV; Act2, terminador de actina 2 de Arabidopsis; Ub10, promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis; E8, promotor de S. licopersicum E8; CHS, promotor de la calcona sintasa de Petunia x hybrida.
Figuras 16A-16B. Acumulación de betalaínas específicas de frutas en tomate.
Figura 16A: La introducción del vector pX11(E8) en tomate (Solanum lycopersicum var. M-82) da como resultado una pigmentación de betalaína que se restringe a la maduración y la fruta madura.
Figura 16B: Fruta entera y sección transversal de fruta de tomate de tipo silvestre y pX11(E8).
Figuras 17A-17B. La variación de color en las flores de tabaco transgénico que produce betalaína se determina al variar las relaciones de betacianina/betaxantina.
Figura 17A: La introducción de los vectores pX11, pX12 o pX13 en el tabaco da como resultado la formación de flores de diferentes colores. Visto desde arriba (fila superior) o aumentado y visto bajo un campo brillante (fila central) o luz azul (fila inferior), en el que las betaxantinas son típicamente fluorescentes.
Figura 17B: Análisis por LC-MS de pétalos de tabaco pX11, pX12 y pX13. Cromatogramas de iones extraídos (XIC) de masas [M+H= 309,1, 331,1, 340,1, 551,1], correspondientes respectivamente a prolina-betaxantina, tiramina-betaxantina, glutamina-betaxantina y betanina/isobetanina. Los ejes verticales están enlazados.
Figuras 18A-18B. Producción de betalaínas en células BY2 de tabaco.
Figura 18A: La introducción de pX11 o pX13 en células de la línea BY2 de tabaco da como resultado una pigmentación rojo-púrpura o amarilla-anaranjada, respectivamente.
Figura 18B: Análisis por LC-MS de células BY2 pX11 y pX13. Cromatogramas de iones extraídos (XIC) de masas [M+H= 283,1, 340,1, 551,1], correspondientes respectivamente a alanina-betaxantina, glutamina-betaxantina y betanina/isobetanina. Los ejes verticales están enlazados.
Figura 19. Esquema de los vectores de sobreexpresión de pDOPA1-pDOPA4 (SEQ ID NO: 24-27). nptII, gen que confiere resistencia a la kanamicina neomicina fosfotransferasa II; CYP76AD6, citocromo P450 de B. vulgaris; AroG, mutante AroG175 (DAHPS) de E. coli; AAH, hidroxilasa de aminoácidos aromáticos de Physcomitrella patens; 35S, promotor/terminador 35S de CaMV; Ub10, promotor de ubiquitina 10 de Solanum lycopersicum. Figuras 20A-20C. Producción de L-DOPA en plantas de tabaco y células BY2. Figura 20A: Identificación de L-DOPA en extractos de hojas de plantas de tabaco que expresan pDOPA1 y pDOPA3 por análisis LC-MS. Figura 20B: La expresión de pDOPA2 y pDOPA4 en células BY2 provoca el ennegrecimiento de los callos en diversos grados, después de varias semanas de cultivo. Figura 20C: Cuantificación relativa de L-DOPA en células BY2 pDOPA2, pDOPA4 y de tipo silvestre por análisis LC-MS.
Figuras 21A-21 B.Ensayos de germinación de semillas de tabaco productor de betalaína en condiciones de estrés osmótico y de salinidad. Figura 21A: Se fotografiaron plántulas de tabaco de tipo silvestre y pX11 cultivadas en condiciones de estrés por alta salinidad (NaCl 150 mM) y condiciones de control (MS) y se puntuaron las tasas de germinación de las semillas. Figura 21B: Se fotografiaron plántulas de tabaco de tipo silvestre y pX11 cultivadas en condiciones de estrés osmótico (manitol 400 mM) y condiciones de control (MS) y se puntuaron las tasas de germinación de las semillas.
Figuras 22A-22C. Ensayos de resistencia a Botrytis cinerea de plantas de tabaco productoras de betalaína. Figura 22A: Se infectaron hojas de plantas de tabaco de tipo silvestre y pX11 con gotitas de suspensión de B. cinerea y se fotografiaron 5 días después de la infección. Figura 22B: Plantas de tipo silvestre y pX11 infectadas con un total de aproximadamente 500 esporas de B. cinerea por planta se puntuaron según el tamaño de la lesión. Se muestran áreas de lesión promedio de aproximadamente 30 plantas por genotipo. Figura 22C: Las hojas infectadas de las plantas de tabaco de tipo silvestre mostraron mayores signos de necrosis en comparación con las hojas de las plantas pX11.
Figuras 23A-23D. La expresión recombinante de CYP76AD15 en Nicotiana benthamiana permite la producción de betaxantina y L-DOPA. Figura 23A: La coinfiltración de agrobacterias que albergan plásmidos para la expresión de CYP76AD15 y BvDODAl en hojas de Nicotiana benthamiana provocan una pigmentación amarilla en el área infiltrada. Figura 23B: El análisis por LC-MS del tejido pigmentado de amarillo muestra la aparición de varias betaxantinas, lo que incluye la dopamina-betaxantina [M+H=347,1] y la valina-betaxantina [M+H=311,1]. XIC, cromatograma de iones extraídos. Figura 23C: Absorción UV-VIS de picos que representan dopaminabetaxantina y valina-betaxantina en el tejido analizado. Figura 23D: Espectros de masas del pico de L-DOPA identificado en tejido foliar de N. benthamiana que expresan CYP76AD15 muestra fragmentos [M+H=181,05, 152,07] e ion molecular [M+H=198,07] típicos de L-DOPA.
Descripción detallada de la presente invención
En la siguiente descripción detallada se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una mejor comprensión de la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que la presente invención puede practicarse sin estos detalles específicos. En otros casos los métodos, procedimientos y componentes bien conocidos no se describen en detalle para no oscurecer la presente invención.
En una modalidad, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una enzima que cataliza la primera etapa en la síntesis de betalaína en Caryophyllales y usos de la enzima en ingeniería genética de plantas y para la producción de L-DOPA a partir de tirosina. En general, las tirosinasas son oxigenasas con promiscuidad de sustrato que exhiben una actividad de catecol oxidasa no deseada. Un estudio anterior demostró que el citocromo P450 CYP76AD1 de la planta exhibía esta promiscuidad característica y, a pesar de una estrategia de tamizaje para identificar mutaciones que aumentaban la especificidad y la actividad por el sustrato de la enzima, todavía producía productos secundarios no deseados (DeLoache y otros, 2015; Nat Chem Biol. Julio 2015;11(7):465-71). Por lo tanto, no se esperaba que un citocromo P450 de una planta diferente fuera específico de la tirosina y catalizara solo la reacción a L-DOPA, lo que evita de esta manera la acumulación de productos finales no deseados.
CYP76AD6
La presente invención proporciona un gen novedoso (perteneciente a la familia de genes del citocromo P450) que cataliza la hidroxilación de la tirosina para formar L-DOPA. Esta enzima tiene potencialmente una ventaja significativa sobre la enzima tirosinasa que se usa actualmente para la producción de L-DOPA; mientras que la tirosinasa cataliza la formación de L-DOPA a partir de tirosina e inmediatamente la oxida al metabolito no utilizable dopaquinona, la nueva enzima P450 solo cataliza la formación de L-DOPA sin su oxidación. Por lo tanto, esta enzima P450 puede usarse para un método más eficiente para la producción de L-DOPA que el uso de una enzima tirosinasa.
Por tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona una enzima novedosa que puede usarse para la producción biosintética de L-DOPA, un fármaco usado para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y un precursor para los fármacos de importancia económica de alcaloides de bencilisoquinolina (por ejemplo, morfina). Esta enzima puede usarse potencialmente para la producción comercial de L-DOPA de varias formas; su gen codificante puede expresarse en plantas o microorganismos para inducir la producción de L-DOPA in vivo, o, alternativamente, puede expresarse de forma recombinante y usarse para la catálisis enzimática in vitro.
Métodos para la producción de L-DOPA y betalaína
Producción a partir de proteínas
En una modalidad, los métodos de la presente invención se realizan in vitro, de manera que la tirosina y las enzimas necesarias para producir L-DOPA o betalaínas se proporcionan in vitro.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir L-DOPA a partir de tirosina que comprende la etapa de combinar una proteína del clado CYP76ADl-p y tirosina en condiciones suficientes para producir L-DOPA, lo que produce de esta manera L-DOPA.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir L-DOPA a partir de tirosina que comprende la etapa de combinar CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones y tirosina en condiciones suficientes para producir L-DOPA, lo que produce de esta manera L-DOPA.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir L-DOPA a partir de tirosina in vitro que comprende la etapa de combinar CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones y tirosina en condiciones suficientes para producir L-DOPA, lo que produce de esta manera L-DOPA.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de betalaína a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD6, CYP76AD1 o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas. En una modalidad, el método comprende además la etapa de poner en contacto la tirosina y CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, o una de sus combinaciones con una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD).
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de betalaína a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con una proteína del clado CYP76AD1-p y una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, CYP76AD1, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de betalaína a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, CYP76AD1, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una mezcla de betalaínas que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir una combinación de betacianina y betaxantina, lo que produce de esta manera una mezcla de betalaínas.
En una modalidad, la producción de betalaína descrita en la presente invención se realiza sin proveer L-DOPA, lo que nunca antes se había logrado. En una modalidad, las betalaínas comprenden betacianina y betaxantina. En una modalidad, pueden usarse las betalaínas, la betacianina y la betaxantina como colorantes alimentarios u otros colorantes.
En una modalidad, las betacianinas producen un color rojo púrpura. En una modalidad, las betaxantinas producen un color amarillo. En una modalidad, una combinación de betacianina y betaxantina produce un color naranja. En una modalidad, una combinación de betacianina y betaxantina produce un color anaranjado-rosa.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante naranja que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir una combinación de betacianina y betaxantina, lo que produce de esta manera un colorante naranja.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betaxantinas a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en condiciones suficientes para producir betaxantinas, lo que produce de esta manera betaxantinas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante amarillo que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones y una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) en condiciones suficientes para producir betaxantinas, lo que produce de esta manera un colorante amarillo. En una modalidad, dicho colorante amarillo es un colorante alimentario.
En una modalidad, los métodos de la presente invención producen una o más betaxantinas. En una modalidad, la betaxantina comprende vulgaxantina I (glutamina-betaxantina). En otra modalidad, la betaxantina comprende indicaxantina (prolina-betaxantina). En otra modalidad, la betaxantina comprende dopaxantina-hexósido. En otra modalidad, la betaxantina comprende betaxantina I (desconocida), como se describe en la Tabla 2 en la presente descripción más abajo. En otra modalidad, la betaxantina comprende histamina-betaxantina. En otra modalidad, la betaxantina comprende alanina-betaxantina. En otra modalidad, la betaxantina comprende dopamina-betaxantina. En otra modalidad, la betaxantina comprende valina-betaxantina.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betacianinas a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD1, una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína en condiciones suficientes para producir betacianinas, lo que produce de esta manera betacianinas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante rojo púrpura que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD1, una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína en condiciones suficientes para producir betacianinas, lo que produce de esta manera un colorante rojo púrpura. En una modalidad, dicho colorante rojo púrpura es un colorante alimentario.
En una modalidad, el método como se describe en la presente descripción proporciona una betalaína glicosilada (betanina) en lugar de una aglicona (betanidina). En una modalidad, existe una ventaja sustancial en que la betanina es más estable que la betanidina. La betanidina es un compuesto altamente lábil y debe añadirse ácido ascórbico para evitar su degradación. La betanidina es mucho más susceptible a la degradación oxidativa tanto enzimática como no enzimática. El extracto de betalaína usado para la coloración de alimentos comprende betanina. La betanidina no sería utilizable para la coloración de alimentos debido a su inestabilidad.
En otra modalidad, los métodos de la presente invención producen una o más betacianinas. En una modalidad, las betacianinas comprenden betanina. En otra modalidad, las betacianinas comprenden isobetanina. En otra modalidad, las betacianinas comprenden betacianina I (desconocida) o betacianina II (desconocida), como se describe en la Tabla 2 en la presente descripción más abajo. En otra modalidad, los métodos de la presente invención producen uno o más fragmentos de betacianina, donde, en una modalidad, el fragmento de betacianina es betanidina.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un pigmento o colorante que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, y una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, CYP76AD1, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas, lo que produce de esta manera un pigmento o colorante. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar los niveles de una o más betalaínas en un organismo, planta o en una parte de una planta que comprende provocar o permitir la expresión de una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína y CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, o una de sus combinaciones, dentro de dicho organismo, planta o parte de la planta, lo que aumenta de esta manera los niveles de una o más betalaínas en dicho organismo, planta o parte de la planta. En una modalidad, dicha planta es una planta ornamental. En otra modalidad, dicha planta es un cultivo alimentario. En una modalidad, el organismo o la planta no produce naturalmente niveles detectables de betalaínas.
Producción a partir de ácidos nucleicos
En otra modalidad, los métodos de la presente invención se realizan in vivo. En una modalidad, la tirosina es endógena a la célula. En otra modalidad, la tirosina se proporciona a la célula. En otra modalidad, la célula se transforma con un gen que potencia la disponibilidad de tirosina. En una modalidad, el gen es AroG175 (Tzin y otros, 2012 New Phytologist 194: 430-439; Núm. de acceso a Genbank JC233128.1, SEQ ID NO: 28), hidroxilasa de aminoácidos aromáticos (AAH) (Pribat y otros, 2010 Plant Cell 22: 3410-3422; Núm. de acceso a Genbank HQ003815.1, SEQ ID NO: 29), o una de sus combinaciones. En una modalidad, las enzimas necesarias para producir betalaínas se proporcionan a una célula mediante la transferencia de un polinucleótido que codifica las enzimas.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de L-DOPA que comprende la etapa de poner en contacto un organismo con un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-p en condiciones suficientes para producir L-DOPA, lo que produce de esta manera L-DOPA.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de L-DOPA que comprende la etapa de poner en contacto un organismo con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir L-DOPa , lo que produce de esta manera L-DOPA.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de L-DOPA que comprende la etapa de poner en contacto un organismo con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir L-DOPA, lo que produce de esta manera L-DOPA.
En una modalidad, el organismo es una planta. En una modalidad, la planta es una planta de tabaco.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de betalaína que comprende la etapa de poner en contacto un organismo con un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-p, un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-a, o una de sus combinaciones, en condiciones suficiente para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de betalaína que comprende la etapa de poner en contacto un organismo con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas.
En una modalidad, el método comprende además la etapa de poner en contacto el organismo que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD).
En una modalidad, los genes que codifican el ácido nucleico descrito en la presente invención, lo que incluye, entre otros, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, y DOD están presentes juntos en un solo polinucleótido recombinante, como se describe con más detalle en la presente descripción más abajo.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de betalaína que comprende la etapa de poner en contacto un organismo con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4.5- dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante naranja que comprende la etapa de poner en contacto un organismo que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera colorante naranja.
En otra modalidad, la producción de betalaína descrita en la presente invención se realiza sin alimentación de sustrato.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betaxantinas que comprende la etapa de poner en contacto un organismo que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína en condiciones suficientes para producir betaxantinas, lo que produce de esta manera betaxantinas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante amarillo que comprende la etapa de poner en contacto un organismo que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4.5- dioxigenasa (DOD) en condiciones suficientes para producir betaxantinas, lo que produce de esta manera un colorante amarillo.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betacianinas que comprende la etapa de poner en contacto un organismo que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína en condiciones suficientes para producir betacianinas, lo que produce de esta manera betacianinas. En una modalidad, el método para producir betacianinas es un método para producir predominantemente betacianinas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante rojo púrpura que comprende la etapa de poner en contacto un organismo que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína en condiciones suficientes para producir betacianinas, lo que produce de esta manera un colorante rojo púrpura.
En una modalidad, los métodos descritos anteriormente en la presente descripción proporcionan métodos para producir un colorante rojo púrpura natural. En otra modalidad, los métodos descritos anteriormente en la presente descripción proporcionan métodos para producir un colorante amarillo natural. En otra modalidad, los métodos descritos anteriormente en la presente descripción proporcionan métodos para producir un colorante naranja natural. En una modalidad, los colorantes pueden usarse para textiles.
En una modalidad, el organismo es una planta. En otra modalidad, el organismo es levadura. En otra modalidad, el organismo es una bacteria. En otra modalidad, el organismo es un alga.
En una modalidad, los métodos de la presente invención se llevan a cabo in planta. En una modalidad, el color del pigmento en la planta depende de otros pigmentos naturales o manipulados por ingeniería genética expresados en la planta. De esta forma, en una modalidad, el método de la presente invención produce un pigmento rojo, un pigmento amarillo, un pigmento naranja, un pigmento marrón y similares, o cualquiera de los colores de pigmentos que se conocen en la técnica.
También debe entenderse que al variar la proporción de CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y/o la expresión de CYP76AD1, también es posible cambiar el color del pigmento.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de producción de betalaína a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante naranja que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera un colorante naranja.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betaxantinas a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en condiciones suficientes para producir betaxantinas, lo que produce de esta manera betaxantinas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante amarillo que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) en condiciones suficientes para producir betaxantinas, lo que produce de esta manera un colorante amarillo.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betacianinas a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en condiciones suficientes para producir betacianinas, lo que produce de esta manera betacianinas.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un colorante rojo púrpura que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76a D1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir betacianinas, lo que produce de esta manera un colorante rojo púrpura.
En una modalidad, un colorante de la presente invención es un colorante alimentario. En una modalidad, los métodos de la presente invención para producir colorantes pueden aplicarse para producir pigmentos y similares. En una modalidad, la presente invención proporciona un tinte, colorante o pigmento alimentario producido mediante los métodos de la presente invención o que comprende las composiciones de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir L-DOPA en una célula que comprende la etapa de poner en contacto dicha célula con un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir L-DOPA, lo que produce de esta manera L-DOPA.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betalaínas, un colorante naranja o una de sus combinaciones en una célula que comprende la etapa de poner en contacto dicha célula con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas, un colorante naranja o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betaxantinas, un colorante amarillo o una de sus combinaciones en una célula que comprende la etapa de poner en contacto dicha célula con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en condiciones suficientes para producir betaxantinas, lo que produce de esta manera betaxantinas, un colorante amarillo o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir betacianinas, un colorante rojo púrpura o una de sus combinaciones en una célula que comprende la etapa de poner en contacto dicha célula con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir betacianinas, lo que produce de esta manera betacianinas, un colorante rojo púrpura o una de sus combinaciones.
En una modalidad, la célula descrita anteriormente en la presente descripción forma parte de una línea celular. En una modalidad, las betalaínas obtenidas mediante los métodos de la presente invención, lo que incluye betaxantinas, betacianinas o una de sus combinaciones, se producen en una línea celular. En una modalidad, la línea celular es una línea celular vegetal. En una modalidad, la línea celular vegetal es BY2 de tabaco o T87 de arabidopsis.
En otra modalidad, la L-DOPA obtenida mediante los métodos de la presente invención se produce en una línea celular. En una modalidad, la línea celular es una línea celular de tabaco. En una modalidad, la línea celular de tabaco es BY2.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un metabolito de L-DOPA que comprende la etapa de producir L-DOPA al poner en contacto una célula con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir L-DOPA, y permitir la formación del metabolito de L-DOPA o poner en contacto adicionalmente dicha célula con un ácido nucleico que codifica una enzima que metaboliza L-DOPA, lo que produce de esta manera un metabolito de L-DOPA. En una modalidad, el metabolito de L-DOPA es una catecolamina, un alcaloide de bencilisoquinolina, betalaína, melanina o una de sus combinaciones. En una modalidad, la catecolamina es dopamina, norepinefrina o una de sus combinaciones. En una modalidad, el alcaloide de bencilisoquinolina es un opiáceo, que en una modalidad es morfina.
En una modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es una DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD). En otra modalidad, la enzima es CYP76AD1. En otra modalidad, la enzima es una glucosiltransferasa. En una modalidad, la glucosiltransferasa es ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa o betanidin-5-O-glucosiltransferasa. En una modalidad, la ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa es gen ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa de M. jalapa (cDOPA5GT).
En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la DOPA descarboxilasa. En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la dopamina beta-hidroxilasa. En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la descarboxilasa de L-aminoácidos aromáticos. En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la catecol-O-metil transferasa. En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la feniletanolamina N-metiltransferasa.
En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la norcoclaurina sintetasa (NCS). En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la norcoclaurina 6-O-metiltransferasa (6OMT). En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la coclaurina-N-metiltransferasa (CNMT). En otra modalidad, la enzima que metaboliza la L-DOPA es la 3'-hidroxi-N-metilcoclaurina 4'-O-metiltransferasa (4'OMT).
Métodos de transformación genética
En una modalidad, la presente invención proporciona métodos que comprenden la etapa de "poner en contacto" una célula con un polinucleótido o vector de expresión como se describe en la presente descripción.
En una modalidad, poner en contacto comprende transformar una célula con la molécula de ácido nucleico o constructo de la invención. Los métodos para transformar una célula vegetal con secuencias de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica. Como se usa en la presente, el término "transformación" o "transformar" puede referirse a un proceso mediante el cual un ADN extraño, tal como un constructo de ADN, lo que incluye un vector de expresión, ingresa y cambia una célula receptora en una célula transformada, manipulada por ingeniería genética o transgénica. La transformación puede ser estable, en donde la secuencia de ácido nucleico se integra en el genoma de la planta y, como tal, representa un rasgo estable y heredado, o transitoria, en donde la secuencia de ácido nucleico se expresa en la célula transformada pero no se integra en el genoma, y como tal representa un rasgo transitorio.
En una modalidad, la presente invención proporciona una planta transgénica. En una modalidad, una planta transgénica de la presente invención se modifica genéticamente con genes extraños o heterólogos. En una modalidad, las plantas transgénicas de la presente invención se usan para biocombustible. En otra modalidad, las plantas transgénicas de la presente invención son plantas de cultivos alimentarios.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una planta cisgénica. En una modalidad, una planta cisgénica de la presente invención es genéticamente modificada, pero no contiene genes extraños o heterólogos. De acuerdo con este aspecto y en una modalidad, las enzimas de betalaínas pueden sobreexpresarse en plantas que ya comprenden enzimas de betalaínas, lo que cambia de esta manera la relación entre betacianinas y betaxantinas. En una modalidad, los cultivos alimentarios de la presente invención son cisgénicos.
Puede usarse cualquier método o sistema de suministro para el suministro y/o transformación (células vegetales)/transfección (células de algas) de los vectores de ácido nucleico que codifican CYP76AD6 y homólogos, parálogos, etc. en la célula huésped, por ejemplo, protoplasto vegetal. Los vectores pueden suministrarse a la célula huésped solos o en combinación con otros agentes. También pueden usarse sistemas de expresión transitoria. También puede usarse la recombinación homóloga.
En una modalidad, los polinucleótidos descritos en la presente descripción se proporcionan a una célula de la presente invención mediante transformación. La transformación puede lograrse por una amplia variedad de medios, como se conoce por los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, transformación mediada por bombardeo de partículas (por ejemplo, Finer y otros, 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240:59), electroporación de protoplastos (por ejemplo, Bates, 1999, Methods Mol. Biol., 111:359), infección viral (por ejemplo, Porta y Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol. 5:209), microinyección e inyección de liposomas. Otros sistemas de suministro ilustrativos que pueden usarse para facilitar la captación por una célula del ácido nucleico incluyen fosfato de calcio y otros mediadores químicos del transporte intracelular, composiciones para microinyección y composiciones para recombinación homóloga (por ejemplo, para integrar un gen en una ubicación preseleccionada dentro del cromosoma de la célula). Los métodos alternativos pueden implicar, por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación o productos químicos que aumentan la captación de ADN libre (o "desnudo"), la transformación mediante el uso de virus o polen y el uso de microproyección. Las técnicas estándar de biología molecular son comunes en la técnica (por ejemplo, Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).
Transformación de plantas
Existen diversos métodos para introducir genes extraños tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas (Ver Potrykus I 1991. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42, 205-225; Shimamoto K. y otros, 1989. Nature 338, 274-276). Los métodos de transformación pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección de ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación mediante el uso de virus y microproyección.
En una modalidad, los polinucleótidos descritos en la presente descripción se proporcionan a una célula mediante agroinfiltración, en una modalidad, mediante transformación mediada por Agrobacterium (por ejemplo, Komari y otros, 1998, Curr. Opin. Plant Biol., 1:161), lo que incluye la transformación por inmersión floral. En una modalidad, la agroinfiltración induce la expresión transitoria de genes en una planta para producir una proteína deseada, mediante la inyección de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens que contiene el gen o genes deseados en una hoja de planta. En una modalidad, la transformación puede realizarse por transferencia de genes mediada por Agrobacterium. El sistema mediado por Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que se integran en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían en dependencia de la especie vegetal y del sistema de suministro de Agrobacterium. La transformación puede realizarse con cualquier explante de tejido adecuado que proporcione una buena fuente para el inicio de la diferenciación de la planta completa (Ver Horsch y otros, 1988. Plant Molecular Biology Manual A5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht).
Los métodos de transformación de plantas se describen completamente en las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos US 20110209247; US 20110113514; US 20100199371; US 20070079396; US 20080307541; US 20030028913; y US 20030196219; y las patentes de Estados Unidos US 5,015,580; US 5,550,318; US 5,538,880; US 6,160,208; US 6,399,861; US 6,403,865; US 5,635,055; US 5,824,877; US 5,591,616; US 5,981,840 y US 6,384,301.
Para el sistema de transformación de plantas basado en Agrobacterium tumefaciens, los elementos adicionales presentes en los constructos de transformación incluirán, en una modalidad, secuencias de los bordes izquierdo y derecho de ADN-T para facilitar la incorporación del polinucleótido recombinante en el genoma de la planta.
En una modalidad, la transformación puede realizarse mediante una captación directa de ADN. Existen diversos métodos de transferencia directa de a Dn a las células vegetales. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un fuerte campo eléctrico, lo que abre miniporos para permitir la entrada del ADN. En la microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente directamente en las células mediante el uso de micropipetas. En el bombardeo de micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles, tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente hacia las células o los tejidos vegetales.
En otra modalidad, los polinucleótidos descritos en la presente descripción se proporcionan a una célula mediante transformación viral (transducción) mediante el uso de un virus vegetal adecuado, mediante el uso de técnicas de pistola de genes o electroporación.
En una modalidad, los genes heterólogos del polinucleótido de la presente invención se integran en el cromosoma de la planta. En otra modalidad, los genes heterólogos del polinucleótido de la presente invención permanecen extracromosómicos. En una modalidad, los genes heterólogos están en un plásmido dentro de la célula. Los plásmidos útiles para cualquier de las aplicaciones se conocen por el experto en la técnica.
En una modalidad, el ADN se inserta aleatoriamente, es decir, en una ubicación no específica, en el genoma de una línea vegetal objetivo. En otra modalidad, la inserción de ADN tiene se dirige para lograr la integración específica del sitio, por ejemplo, para reemplazar un gen existente en el genoma, para usar un promotor existente en el genoma de la planta, o para insertar un polinucleótido recombinante en un sitio predeterminado que se conoce que es activo para la expresión génica. Existen varios sistemas de recombinación específicos de sitio que se conoce que funcionan en plantas, lo que incluye cre-lox y FLP-FRT.
En una modalidad, los métodos de transformación de esta invención se practican en cultivo de tejidos en medios y en un entorno controlado. "Medios" se refiere a las numerosas mezclas de nutrientes que se usan para hacer crecer las células in vitro, es decir, fuera del organismo vivo intacto. Los objetivos en las células receptoras incluyen, pero no se limitan a, células meristemáticas, callos, embriones inmaduros y células gaméticas tales como microsporas, polen, espermatozoides y óvulos. Se contempla que cualquier célula a partir de la cual pueda regenerarse una planta fértil sea útil como una célula receptora. El callo puede iniciarse a partir de fuentes de tejido, lo que incluye, pero no se limita a, embriones inmaduros, meristemos apicales de plántulas, microsporas y similares. Las células capaces de proliferar como callos también son células receptoras para la transformación genética. Se conocen en la técnica métodos y materiales de transformación prácticos para producir plantas genéticamente modificadas de esta invención, por ejemplo, diversos medios y células objetivo receptoras, transformación de embriones inmaduros y posterior regeneración de plantas genéticamente modificadas fértiles.
En otra modalidad en la que se introducen polinucleótidos en células vegetales, las betalaínas pueden expresarse o detectarse en cualquier órgano vegetal, lo que incluye hojas, tallos, raíces, flores, semillas, tubérculos o frutos, o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, los métodos de la presente invención pueden realizarse en una planta completa, de manera que la planta completa exprese las betalaínas como se describe en la presente descripción. Además y en una modalidad, las composiciones de la presente invención pueden describir una planta completa que se ha modificado genéticamente para expresar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención.
Transformación de algas
En una modalidad, el método de transformación de algas comprende cualquiera de los métodos descritos anteriormente en la presente descripción. En una modalidad, la transformación de algas se logra mediante el uso de transformación asistida por perlas de vidrio, transformación mediada por pistola de partículas (biolística), tratamiento con enzimas celulolíticas para debilitar sus paredes celulares o recombinación homóloga.
En otro aspecto, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden transformarse en algas. En una modalidad, el alga es un alga unicelular. En otra modalidad, el alga es un alga multicelular. En una modalidad, el alga es una cianobacteria, diatomea, clamidomona, dunaliella o hematococus. Los genes pueden sobreexpresarse en algas. La betalaína, la DOPA o una de sus combinaciones pueden producirse a través de dichas algas transgénicas. Los métodos para la transformación de algas se conocen bien en la técnica y se describen completamente en las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos US 20150011008; US 20150004704; US 20130130389; US 20120094385; US 20120034698; US 20110300633; y US 20040133937.
En una modalidad, las algas genéticamente modificadas de la presente invención pueden usarse en la producción de biocombustibles.
Transformación de levaduras
En otro aspecto, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden transformarse en levadura. Los genes pueden sobreexpresarse en levadura. La betalaína, la DOPA o una de sus combinaciones pueden producirse a través de dicha levadura transgénica. Los métodos para la transformación de levaduras se describen más abajo en la presente descripción y se conocen bien en la técnica y se describen completamente en las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos US 20090264320; US 20010031724; US 20030049785; US 20050158861; US 20070264716; US 20090325247; y US 20100190223.
Transformación de virus
En otra modalidad, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden transformarse en un virus. En otra modalidad, los ácidos nucleicos pueden sobreexpresarse en un virus. La betalaína, colorantes, pigmentos, DOPA o una de sus combinaciones pueden producirse a través de dicha sobreexpresión viral.
Marcadores de transformación genética
En una modalidad, el ADN se introduce solo en un pequeño porcentaje de células objetivo en cualquier experimento. En una modalidad, las células que comprenden el ADN exógeno transferido pueden identificarse mediante el color, como se describe en el Ejemplo 6 para la levadura. En una modalidad, las células que expresan CYP76AD1 y DODA son rojo púrpuras. En una modalidad, las células que expresan CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y DODA, son amarillas. En una modalidad, las células que expresan CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y DODA, son anaranjadas o rojo-anaranjadas.
En otra modalidad, se usan genes marcadores para proporcionar un sistema eficiente para la identificación de aquellas células que se transforman de manera estable al recibir e integrar un constructo de ADN genéticamente modificado en sus genomas.
En otra modalidad, los genes de selección proporcionan marcadores selectivos que confieren resistencia a un agente selectivo, tal como un antibiótico o un herbicida. Las células potencialmente transformadas se exponen al agente selectivo. En la población de células supervivientes estarán aquellas células en las que, generalmente, el gen que confiere resistencia se ha integrado y expresado a niveles suficientes para permitir la supervivencia celular. Las células pueden analizarse posteriormente para confirmar la integración estable del ADN exógeno.
Los genes marcadores selectivos útiles incluyen aquellos que confieren resistencia a antibióticos tales como la kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV), nptII, hpt, aadA y gentamicina (aac3 y aacC4) o resistencia a herbicidas tales como glufosinato (bar o pat) y glifosato (EPSPS). En otra modalidad, el gen de selección es un antimetabolito. En una modalidad, el antimetabolito es dhf.
También pueden emplearse marcadores detectables que proporcionan la capacidad de identificar visualmente a los transformantes, por ejemplo, un gen que expresa una proteína coloreada o fluorescente tal como una proteína cat, lacZ, uidA, luciferasa o proteína fluorescente verde (GFP) o un gen que expresa un gen beta-glucuronidasa o uidA (GUS) para el que se conocen diversos sustratos cromogénicos. También se contempla que serán útiles combinaciones de marcadores rastreables y seleccionables para la identificación de células transformadas.
En una modalidad, el gen de selección es un gen marcador seleccionable positivo que está condicionado a agentes no tóxicos que pueden ser sustratos para el crecimiento o que inducen el crecimiento y la diferenciación de los tejidos transformados.
En una modalidad, las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las células que se han puntuado como positivas en un ensayo de tamizaje, pueden cultivarse en un medio de regeneración y permitirse que maduren a plantas. Las plántulas en desarrollo pueden transferirse a una mezcla de crecimiento de plantas sin suelo y endurecerse, por ejemplo, en una cámara ambientalmente controlada a aproximadamente 85 % de humedad relativa, 600 ppm de CO2, y 25-250 microeinsteins itt 2 s_1 de luz, antes de transferirlas a un invernadero o cámara de crecimiento para su maduración. Las plantas se maduran preferentemente en una cámara de crecimiento o en un invernadero. Las plantas se regeneran de aproximadamente 6 semanas hasta 10 meses después de que se identifica un transformante, en dependencia del tejido inicial. Durante la regeneración, las células se hacen crecer a plantas en medios sólidos a aproximadamente 19 a 28 °C. Una vez que las plantas en regeneración han alcanzado la etapa del desarrollo de brotes y raíces, pueden transferirse a un invernadero para su posterior crecimiento y pruebas. Las plantas pueden polinizarse mediante el uso de métodos convencionales de cultivo de plantas conocidos por los expertos en la técnica y producirse semillas.
La progenie puede recuperarse a partir de plantas transformadas y analizarse para determinar la expresión del polinucleótido recombinante exógeno. Ensayos útiles incluyen, por ejemplo: ensayos de "biología molecular", tales como transferencia de Southern y Northern y PCR; ensayos "bioquímicos", tales como detección de la presencia de ARN, por ejemplo, ARN bicatenario, o un producto proteico, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA e/o inmunolectrotransferencias) o mediante la función enzimática; ensayos de partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces; y además, mediante el análisis del fenotipo de la planta regenerada completa.
Un experto en la técnica podrá seleccionar un vector apropiado para introducir la secuencia de ácido nucleico codificante en un estado relativamente intacto. Por tanto, cualquier vector que produzca una célula huésped, por ejemplo, un protoplasto vegetal, que porte el ácido nucleico codificante introducido debería ser suficiente. La selección del vector, o si usar un vector, se guía típicamente por el método de transformación seleccionado.
Promotores
En otro aspecto, pueden usarse promotores específicos de células, tejidos u órganos para transformar los genes de la invención y hacer que se expresen en una célula, tejido u órgano específico. Por ejemplo, puede usarse un promotor específico de frutas para transformar los genes de la invención en una planta (por ejemplo, tomate) o célula vegetal para producir betalaínas en frutas (por ejemplo, frutos de tomate).
En una modalidad, un polinucleótido recombinante de la presente invención comprende al menos un promotor. En una modalidad, un polinucleótido recombinante de la presente invención comprende un único promotor que controla la expresión de los ácidos nucleicos en tándem que están en el mismo marco de lectura. En otra modalidad, cada ácido nucleico en el polinucleótido recombinante de la presente invención está bajo el control de un promotor separado.
En una modalidad, el promotor es un promotor constitutivo. En una modalidad, el promotor constitutivo es el promotor 35S de CaMV. En otra modalidad, el promotor constitutivo es un promotor de opina. En otra modalidad, el promotor constitutivo es un promotor de monocotiledóneas. En otra modalidad, el promotor constitutivo es un promotor de ubiquitina vegetal (Ubi). En otra modalidad, el promotor constitutivo es el promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis. En otra modalidad, el promotor constitutivo es el promotor de ubiquitina 10 de Solanum lycopersicum (SlUb10). En otra modalidad, el promotor constitutivo es el promotor de actina 1 de arroz (Act-1). En otra modalidad, el promotor constitutivo es el promotor de alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (Adh-1).
En otra modalidad, el promotor es un promotor inducible. En una modalidad, el promotor inducible es un promotor inducible por galactosa. En otra modalidad, el promotor inducible se selecciona de AlcR/AlcA (inducible por etanol); fusiones GR, GVG y pOp/LhGR (inducible por dexametasona); XVE/OlexA (inducible por beta-estradiol); e inducción por choque térmico. En otra modalidad, el promotor inducible se selecciona de promotores inducibles por tetraciclina, dexametasona, cobre, ácido salicílico y herbicidas. En otra modalidad, pueden usarse mGal4:VP16/UAS o pOp/LhG4 para la transactivación, y pueden usarse los sistemas interruptor de alc, GVE/VGE y XVE para la inducción química. Estos métodos se conocen en la técnica.
En otra modalidad, el promotor es un promotor específico de tejido o específico de etapas del desarrollo. En otra modalidad, el promotor es un promotor sintético, que se produce al reunir los elementos primarios de una región promotora de diversos orígenes.
En algunas modalidades, puede usarse un promotor específico de frutas para transformar los genes de la invención en combinación con uno o más otros genes (por ejemplo, genes de antocianina) en una planta (por ejemplo, tomate) o célula vegetal para producir betalaínas en frutas (por ejemplo, frutos de tomate). En una modalidad, los genes de la invención pueden transformarse en una planta transgénica (por ejemplo, una planta de tomate transgénica ya transformada con genes de antocianina recombinante) o una célula vegetal para producir betalaínas en frutos (por ejemplo, frutos de tomate).
Por tanto, en una modalidad, un promotor para cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente descripción puede ser un promotor específico de frutas. En una modalidad, el promotor específico de frutas es el promotor E8. En otra modalidad, el promotor puede ser un promotor específico de flores. En una modalidad, el promotor específico de flores es un promotor de calcona sintasa (CHS). En una modalidad, el promotor de CHS es un promotor CHS de Petunia x hybrida. En otra modalidad, el promotor puede ser un promotor específico de raíz. En otra modalidad, el promotor puede ser un promotor específico de tallo. En otra modalidad, el promotor puede ser un promotor específico de hojas. En otra modalidad, el promotor puede ser un promotor específico de semillas. En otra modalidad, el promotor puede ser un promotor específico de tubérculo.
En una modalidad, el promotor puede ser específico para una parte del tejido. Por ejemplo y en una modalidad, un promotor puede ser específico del pétalo, estambre, antera, estigma o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, el mismo ácido nucleico puede expresarse bajo el control de diferentes secuencias promotoras no constitutivas para manipular por ingeniería genética un organismo que exhiba dos colores de pigmentación y/o que exprese tanto betacianinas como betaxantinas en diferentes órganos o en diferentes partes del mismo órgano. Por ejemplo, en una modalidad, CYP76AD6 o CYP76AD15 o un homólogo de estos puede expresarse bajo el control de un promotor específico de la flor y CYP76AD1 puede expresarse bajo el control de un promotor específico de la fruta para que la fruta sea de color rojo-púrpura debido a la presencia de tanto betacianinas como betaxantinas, y la flor es amarilla debido a la presencia de solamente betaxantinas. Además, los promotores inducibles pueden usarse para manipular por ingeniería genética un organismo que exhiba dos colores de pigmentación y/o exprese tanto betacianinas como betaxantinas en diferentes órganos o en diferentes partes del mismo órgano.
En otra modalidad, el promotor puede ser específico de una etapa del desarrollo. Por ejemplo y en una modalidad, un promotor puede ser específico de la Etapa 1, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 1 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 2, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 2 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 3, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 3 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 4, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 4 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 5, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 5-6 cm.
En una modalidad, el promotor puede ser específico para un tejido y una etapa del desarrollo. En una modalidad, el promotor E8 específico de fruta se expresa en maduración y en la fruta madura. En otra modalidad, el promotor de CHS específico de la flor se expresa en los pétalos durante la maduración de la flor.
Aplicaciones del silenciamiento de genes
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o suprimir un trastorno sensible a la dopamina en un sujeto que comprende la etapa de administrar un cultivo alimentario, una célula o una línea celular que comprende altos niveles de un polipéptido del clado CYP76AD1-p, lo que proporciona de esta manera a dicho sujeto L-DOPA, lo que trata o inhibe de esta manera dicho trastorno sensible a la dopamina en dicho sujeto. En una modalidad, dicho cultivo alimentario, célula o línea celular produce endógenamente betalaínas. En una modalidad, se ha suprimido la expresión de DOPA 4,5-dioxigenasa, ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa y un gen del clado CYP76AD1-alfa en dicho cultivo alimentario, célula o línea celular.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir partes de plantas amarillas en una planta que comprende betalaínas, que comprende silenciar la expresión del gen CYP76AD1.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir partes de plantas verdes en una planta que comprende betalaínas, que comprende silenciar la expresión génica de CYP76AD1 y CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones.
En una modalidad, las partes de la planta comprenden hojas, tallos, raíces, flores, tubérculos, frutos, semillas o una de sus combinaciones.
En una modalidad, el silenciamiento génico es la atenuación de genes, que en una modalidad es una expresión reducida del gen. En una modalidad, se usa el silenciamiento génico inducido por virus para silenciar los genes que codifican CYP76AD1 y/o CYP76AD6. En una modalidad, el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) es una tecnología que explota un mecanismo de defensa antiviral mediado por ARN. En plantas infectadas con virus no modificados, el mecanismo se dirige específicamente contra el genoma viral. Sin embargo, con vectores virales que portan insertos derivados de genes del huésped, el proceso puede dirigirse adicionalmente contra los ARNm correspondientes. Dichos métodos se ejemplifican en la presente descripción más abajo en los Ejemplos 1 y 3. Otros métodos de silenciamiento génico que pueden usarse en la presente invención incluyen el silenciamiento génico con oligonucleótidos antisentido, ribozimas, ARN de interferencia, tres regiones principales no traducidas/microARN. Dichos métodos se conocen bien en la técnica así como también se describen en el Ejemplo 1 en la presente descripción más abajo.
En otra modalidad, los genes que codifican CYP76AD1 y/o CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, se inactivan mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.
En una modalidad, la planta comprende betalaínas, que en una modalidad es una betacianina y en otra modalidad es una betaxantina.
En una modalidad, los métodos de silenciamiento génico se realizan en plantas que comprenden betalaínas. En una modalidad, las plantas que comprenden betalaínas son del orden de plantas Caryophyllales.
En una modalidad, los métodos de silenciamiento génico se realizan en Caryophyllales que comprende cactus, claveles, amarantos, plantas de hielo, remolachas y muchas plantas carnívoras. En otra modalidad, la planta es del suborden Caryophyllineae. En otra modalidad, la planta es del suborden Polygonineae. En otra modalidad, la planta es de una familia seleccionada de una de las siguientes familias del orden de plantas Caryophyllales: Achatocarpaceae; Aizoaceae; Amaranthaceae; Anacampserotaceae; Ancistrocladaceae; Asteropeiaceae; Barbeuiaceae; Basellaceae; Cactaceae; Caryophyllaceae; Didiereaceae; Dioncophyllaceae; Droseraceae; Drosophyllaceae; Frankeniaceae; Gisekiaceae; Halophytaceae; Kewaceae; Limeaceae; Lophiocarpaceae; Macarthuriaceae; Microteaceae; Molluginaceae; Montiaceae; Nepenthaceae; Nyctaginaceae; Physenaceae; Phytolaccaceae; Plumbaginaceae; Polygonaceae; Portulacaceae; Rhabdodendraceae; Sarcobataceae; Simmondsiaceae; Stegnospermataceae; Talinaceae; y Tamaricaceae.
En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención se preparan mediante el uso de técnicas de PCR mediante el uso de procedimientos y métodos conocidos por un experto en la técnica. En algunas modalidades, el procedimiento implica la ligazón de dos secuencias de ADN diferentes (Ver, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons, 1992).
Polinucleótidos
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6 comprende: tcgatgtgttttcaagaagagcttgagcctacattctacaacaatatattgttcctctcttgcgcaattaagcccttaaacctgcaattatcttagaattttt gggtttctaatttattctctcctttaattagctagcttcttagattattcatatttttccagcattttcaaacaatggataacgcaacacttgctgtgatccttt ccattttgtttgtgttttaccacattttcaaatcctttttcaccaattcttcatctcgtaggcttcctcctggtcccaaacccgtgccaatttttggcaacattt tcgatcttggcgaaaagcctcatcgatcttttgccaatctatctaaaattcacggccctttgattagcctaaagttaggaagtgtaacaactattgttgtt tcctcggcctctgtggccgaggaaatgttccttaaaaatgaccaagcacttgctaaccgaaccattcctgactcggttagggctggtgaccacga caaattatccatgtcgtggttgcctgtttcccaaaaatggagaaatatgagaaaaatctccgctgtccaattactctccaaccaaaaacttgatgcta gtcaacctcttagacaagctaaggtgaaacaacttttatcatacgtacaagtttgttccgaaaaaatgcaacccgtcgatattggacgggccgcatt tacaacgtcacttaatttattatcaaacacatttttctcaatcgaattagcaagtcatgaatctagtgcttcccaagagtttaaacaactcatgtggaata ttatggaggaaattggaaggcctaattatgctgattttttccctattcttggttacattgatccctttggtataagacgtcgtttggctggttactttgataa actcattgatgttttccaagacattattcgtgaaagacaaaagcttcgatcttctaattcttccggcgcaaaacaaacaaatgacattcttgatactctt cttaaactccatgaagataatgagttgagtatgcctgaaattaatcaccttctcgtggatatctttgacgccggaacagacacaacagcaagcacat tagaatgggcgatggccgaacttgtgaaaaacccggaaatgatgactaaagttcaaattgaaatcgaacaagctcttggaaaagattgcttagac atacaagaatccgacatctcaaaactaccttatttacaagccattataaaagaaacgttacgtttacaccctcctactgtgtttttgctgcctcgaaag gcagacaatgacgtagagttatatggctacgttgtaccaaagaatgctcaagtccttgtcaatctttgggcaattggtcgtgatccaaaggtatgga aaaatccggaagtattttctcctgaaaggtttttagattgcaatatcgattataaaggacgagatttcgaacttttaccctttggtgctggtagaaggat atgccctggacttactttggcatatagaatgttgaacttgatgttggctactcttcttcaaaactacaattggaaacttgaagatggtatcaatcctaag gatttagacatggatgagaaatttgggattacattgcaaaaggttaaacctcttcaagttattccagttcccagaaactagctagtgggttgtgccgtt gtgggctgtgggctgattgtgcacttttgtttcctctaattgttgttgcaaacttctctagaagggtattatcttttgtataaataaagcgaaagctacatg tcctattattaaattagtgtatactatattaagtaagtatgagcatatagtatccattattgtttttggttgaatcgtattaaactgataaatcaagtaaatgt ctccaacctaagcattcaattattctgttagtcataacatatgtagagggtaagtatgaagaattaataacggcgtgatcatcctta (SEQ ID NO: 30).
En otra modalidad, la secuencia codificante de CYP76AD6 comprende la siguiente secuencia:
atggataacgcaacacttgctgtgatcctttccaUUgtltgtgUUaccacaUUcaaalcctUUcaccaattctlcatctcgtaggc UcctcctggtcccaaacccgtgccaautttggcaacaUHcgatcttggcgaaaagcctcatcgatcUUgccaatctalctaaaattcacggccc tttgattagcclaaagttaggaagtgtaacaactattgttgtttcctcggcctctgtggccgaggaaatgUccttaaaaatgaccaagcacttgctaa ccgaaccattcctgactcggttagggctggtgaccacgacaaattatccatgtcgtggttgcctgtttcccaaaaatggagaaatatgagaaaaat ctccgctgtccaattactctccaaccaaaaaettgatgctagtcaacctcuagacaagctaaggtgaaacaacttttatcaiacgtacaagutguc cgaaaanalgcaacccgícgalallggacgggccgcalUacaacglcactlaaUlaUatcaaacacatKUctcaalcgaaüagcaaglcatga atctagtgcttcccaagagtttaaacaactcatgtggaatattatggaggaaattggaaggcctaattatgctgattttttccctattcttggttacattga tcccUtggtataagacgtcglüggctggUactttgataaactcaltgatgltttccaagacattaUcgtgaaagacaaaagcttcgatcttctaaUct tccggcgcaaaacaaacaaatgacattcttgatactcttcttaaactccatgaagataalgagttgagtatgcctgaaattaatcaccttctcgtggat atctltgacgccggaacagacacaacagcaagcacattagaatgggcaatggccgaacttgtgaaaaacccggaaatgatgactaaagucaa attgaaatcgaacaagctcttggaaaagattgcttagacatacaagaatccgacatctcaaaactaccttatttacaagccattataaaagaaacgtt acgtttacaccctcctactgtgtttttgctgcctcgaaaggcagacaatgacgtagagttatatggctacgttgtaccaaagaatgctcaagtccttgt caatcUtgggcaaUggtcgtgatccaaaggtatggaaaaatccggaagtatUtcícclgaaaggtítUagaltgcaatalcgaUataaaggacg agatUcgaactutaccctttggtgctggtagaaggatatgccctggacttactttggcatatagaatgltgaacttgatgttggc(ac(cttc(tcaaa actacaattggaaacitgaagatgglatcaatcctaaggattiagacatggatgagaaatttgggattacattgcaaaaggtlaaacctcucaagu attccagücccagaaactag (SEQ ID NO: 31).
En una modalidad, el ácido nucleico que codifica CYP76AD6 es impulsado por el promotor 35S de CaMV (pDOPAI; Figura 19). En otra modalidad, el ácido nucleico que codifica CYP76AD6 es impulsado por el promotor de ubiquitina 10 de Solanum lycopersicum (SlUb10) (pDOPA2; Figura 19).
En una modalidad, el ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, se expresa junto con AroG175 e hidroxilasa de aminoácidos aromáticos (AAH).
En una modalidad, el polinucleótido que comprende el ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, también comprende el gen de neomicina fosfotransferasa II (nptII), que en una modalidad, confiere resistencia a la kanamicina.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-a. En una modalidad, el gen del clado CYP76AD1-a comprende CYP76AD1. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1 comprende: tactaatgtgcaaatgcataaatttaatttcagatactcttttttataaatattattatactgtgcattcttttaacccaaaaaaaaaactgtcttaatacacc atttaattcctttctctaggatccactatcacatgtagtatataaatataatcctatacagttcacgttatcaaacaccaaagcatcaaaagccttccaca cttgtattattttggggtagttgatttgttagcgtgttatttgtgagatcatcatggatcatgcaacattagcaatgatactagccatttggttcatttcttttc atttcataaaattactttttagccaacaaactaccaaacttcttcctcctggtccaaaaccattgccaataattggtaacatcttagaagttggtaaaaa accccatcgttcatttgctaatcttgctaaaattcacggccctttaatatcgttacgtctaggaagtgtaacaactattgttgtatcatcagcagatgtag ctaaagaaatgttcttaaaaaaagaccaccctctttctaaccgtactattcctaattctgtcacggccggtgaccaccataaactcaccatgtcgtgg ttgcccgtttcgccgaaatggcggaattttcgtaagattacagccgtccatttgctttctcctcaaagacttgatgcttgccaaacctttcgccatgcc aaggtgcaacagctttatgaatatgtacaagaatgtgcacaaaaaggccaagctgttgatattggcaaagctgcatttactacctcccttaatttgtta tctaaactattcttttcagtggaattagcccaccataaatcacacacttctcaagagtttaaggaactaatatggaacattatggaagatattgggaaa cctaattatgctgattattttcctattttaggctgtgttgatccatcaggtattcgtcgaagattagcatgtagttttgacaagttgattgcagtttttcagg gtataatatgtgaaaggcttgcgcctgattcttcaactacaacaacaacgacgactgatgatgtgctagacgttcttcttcagctcttcaaacaaaat gagctcactatgggcgagattaaccatttgctcgtcgacatttttgatgctggaacagacactacatcaagtacttttgagtgggtcatgacagagtt aattaggaatcctgaaatgatggaaaaggctcaagaagaaattaagcaagtattgggcaaagataaacaaattcaggaatcagacattattaacc taccttacttacaagccattatcaaagaaactttgcgactacatccaccaactgtatttcttttgcctcgtaaagccgacactgatgttgaactatatgg ttatattgtgcctaaagatgcacaaatacttgttaacttatgggctattggaagagatcctaatgcatggcaaaatgctgatattttttcgcccgaaaga tttatagggtgtgaaattgatgtcaaaggaagagattttggactcttaccttttggagccggaagaaggatatgtcctgggatgaatttggccattag aatgttaactttgatgctagctactttacttcaattcttcaattggaagcttgaaggagacataagtccaaaagacttagacatggatgagaaatttgg gattgcgttacaaaagacaaagcctttaaaacttattccaatacctaggtattgaaatttgttagacttacgtacaacaattattattgtttgtggttggttt
tttctcatctgtcatctcttttggttggctgtgcaagggagtgagcttgcagcttagcatccttcaagaagatttaattaataatatgtgtatgtgtatgtgt atgtgtggattgtatctcgtcattcattttgcttgttgtaatgattttagttaattattgtaattataaaggatttgatcctcctttgtgttgaaattatatatataa tgtgtagcacgacaataaagtgacagataacttatataatcttattttctatgaaatgttacagacttgctttgtgttttaaaaaaa (SEQ ID NO: 32).
En otra modalidad, el gen del ciado CYP76AD1-a comprende A. cruentus, Amaranthus cruentus (CYP76AD2, acceso AET43291.1; SEQ ID NO: 15); M. jalapa, Mirabilis jalapa (CYP76AD3, acceso AET43292.1; SEQ ID NO: 16); C. cristata, Celosia cristata (CYP76AD4, acceso AGI78466.1; SEQ ID NO: 17); o una de sus combinaciones.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD). En una modalidad, la DOD es DODA1 de Beta vulgaris (BvDODA1). En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica BvDODA1 comprende: aaaacaagaagaaaacaaaacaaccttttatataactagaaagcaacaaaaaaaaaagaatgaaaatgatgaatggtgaagatgctaatgatca aatgatcaaagaaagcttcttcataacacatggaaacccaatattaacagtagaagacacacatccattaagacctttctttgaaacttggagagag aaaatcttttctaagaaacctaaggcaattcttattatttctggtcattgggaaactgttaaacctactgttaatgctgtccatatcaatgatactatccat gattttgatgactatcctgctgctatgtaccagttcaagtatccagctcctggggaaccagaattggcaagaaaagtagaggaaattctgaaaaaat cgggtttcgaaacggcggaaactgatcaaaaacgtgggcttgatcatggtgcatgggtacctctaatgctaatgtatcctgaggctgatataccag tatgtcagctctcagttcagccgcatttagatggaacataccattacaacttaggacgagcattggctcccttgaaaaacgacggcgtattaatcatt ggttcaggaagtgcaactcaccctttggatgaaactcctcattattttgatggagttgcaccttgggcagctgcctttgattcatggcttcgtaaagct ctcattaatggaaggtttgaagaagtgaatatatatgaaagcaaagcaccaaattggaaattagcacatcctttcccagaacatttttatccattgcat gttgttcttggcgctgctggtgaaaaatggaaggcagagcttattcatagcagttgggatcatggcaccttgtgtcatggctcctacaagttcacttc agcctagttttacttttaaacactatgtctacagtctatgttattgtatttggtaatttggtatgtggtgttgtttttgttttattcttttgagttattgtacttggta tttggtgttgttttcatttggtgcataattcttttagtctatatattgctattcttttgaatgaggaataaatcgcgagctcgatgtaatagtttgttttattgtttc aaatctatcattatatatatatatatattattaaaaaaaaattattgtgttactcgcaaaaaaa (SEQ ID NO: 33). En una modalidad, la DOD no es DOD de Mirabilis jalapa.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica la glucosiltransferasa relacionada con la betalaína es la secuencia de ácido nucleico que codifica la ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa (cDOPA5GT). En una modalidad, la cDOPA5GT es de Mirabilis Jalapa. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica cDOPA5GT comprende: cctcacctccataacaaagaaatgaccgccattaaaatgaacaccaatggtgaaggtgaaacacaacatatactaatgatacctttcatggcgca agggcatttacgtcctttccttgagcttgctatgtttctatataaacgaagtcatgttatcattactcttcttactaccccgctcaatgcgggtttcctacg acatctccttcaccaccatagctattctagctcggggatcagaattgtcgagttacctttcaactcaaccaatcatggtcttccacctggcattgaaaa cactgataaacttacactcccacttgtagtatcactttttcattcaaccatttctcttgaccctcaccttagagattatatttcccgccatttctcccctgcg cgccctcctctgtgtgtcatacatgatgtgttccttggttgggttgatcaagttgctaaagacgtgggctcaactggtgttgtttttactacgggtggc gcgtatggtacaagcgcatatgtgtccatttggaatgatctgcctcaccagaattactctgatgatcaagagtttccgcttcctggtttcccggagaa tcataaattccgacgttctcaacttcatcggtttctgaggtatgccgatggatcagatgattggtcgaaatatttccaaccgcaattgaggcaatcaat gaagagttttggatggctatgtaattcagttgaggaaatcgaaacacttgggtttagtatcctcaggaactacactaaactacccatttggggtattg gaccgttgatagcttcacctgtacaacattcatcatctgataataacagtactggtgccgagtttgttcaatggttgagcttgaaagaaccagattctg tattatacatctcatttggatcacagaacacaatttcaccaacccagatgatggaactagcagccggtttggagtcaagtgagaagccgtttttgtg ggtgattcgagcaccatttgggttcgatatcaatgaggaaatgagaccagaatggctaccagagggattcgaggagcgaatgaaggtgaaaaa acaaggaaagttggtgtataagttgggaccacagttggagatacttaaccatgagtcaatcggagggttcttaactcattgtgggtggaattcgatc cttgagtcacttcgagaaggtgtgcctatgttagggtggccattggcagccgaacaagcttataatttgaagtatttggaggacgaaatgggggtt gcagtcgagttagcgaggggattggaaggagagataagtaaagagaaagtgaagagaattgtggagatgattttagagagaaatgaaggaag taaaggatgggaaatgaaaaatagagcagtagaaatggggaagaaacttaaagacgctgtcaatgaggagaaggaactgaagggttcttctgt taaggcaatagatgatttcttagatgcggtcatgcaagctaagttggaaccttctcttcaataataagatcgatagtttatctcgtctcagagactcaa acaattgactactaggatgatcagaaagagagttatgttcagtgttctgttattatgcaagacttcaataataacagaaaaattcgtgattagattcata actt (SEQ ID NO: 2).
En una modalidad, varios ácidos nucleicos se combinan en un único polinucleótido recombinante como se describe en la presente descripción. En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica DOD. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y un ácido nucleico que codifica DOD. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y un ácido nucleico que codifica CYP76AD6. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica DOD.
En otra modalidad, se incorporan varios ácidos nucleicos en una célula, pero cada ácido nucleico es un polinucleótido separado como se describe en la presente descripción.
En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, y una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOD. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOD. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOD. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOD y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOD y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOD y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En otra modalidad, cualquiera de los polinucleótidos recombinantes descritos anteriormente en la presente descripción comprende además una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En una modalidad, la glucosiltransferasa relacionada con la betalaína es ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa o betanidin-5-O-glucosiltransferasa. En una modalidad, la ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa es gen ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa de M. jalapa (cDOPA5GT) (SEQ ID NO: 2).
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) expresados en tándem.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, expresados en tándem.
En una modalidad, los polinucleótidos descritos en la presente descripción comprenden múltiples secuencias de ácidos nucleicos que se encuentran en el mismo marco de lectura. En una modalidad, los polinucleótidos descritos en la presente descripción comprenden múltiples secuencias de ácidos nucleicos que se expresan en tándem. En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura. En una modalidad, el gen DOD está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. En una modalidad, el gen CYP76AD1 está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. En una modalidad, el gen de la glucosiltransferasa relacionado con la betalaína está bajo el control de un promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis. En una modalidad, el polinucleótido comprende además un gen de resistencia a la kanamicina. En una modalidad, el polinucleótido es el vector pX11, como se describe en el Ejemplo 8, más abajo en la presente descripción. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico del vector pX11 comprende (SEQ ID NO: 19).
En otra modalidad, el gen CYP76AD1 está bajo el control de un promotor E8 (pX11(E8), SEQ ID NO: 20; Figura 15). En otra modalidad, el gen CYP76AD1 está bajo el control de un promotor CHS (pX11(CHS) SEQ ID NO: 21; Figura 15).
En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura. En una modalidad, el gen DOD está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. En una modalidad, el gen CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. En una modalidad, el gen de la glucosiltransferasa relacionado con la betalaína está bajo el control de un promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis. En una modalidad, el polinucleótido comprende además un gen de resistencia a la kanamicina. En una modalidad, el polinucleótido es el vector pX13, como se describe en el Ejemplo 14, más abajo en la presente descripción.
En otra modalidad, el gen CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, está bajo el control de un promotor E8. En otra modalidad, el gen CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, está bajo el control de un promotor CHS.
En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura. En una modalidad, el gen DOD está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. En una modalidad, el gen CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. En una modalidad, el gen CYP76AD1 está bajo el control de un promotor 35S de CaMV. En una modalidad, el gen de la glucosiltransferasa relacionado con la betalaína está bajo el control de un promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis. En una modalidad, el polinucleótido comprende además un gen de resistencia a la kanamicina. En una modalidad, el polinucleótido es el vector pX12, como se describe en el Ejemplo 14, más abajo en la presente descripción.
En otra modalidad, el gen CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, está bajo el control de un promotor E8. En otra modalidad, el gen CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, está bajo el control de un promotor CHS. En otra modalidad, el gen CYP76AD1 está bajo el control de un promotor E8. En otra modalidad, el gen CYP76AD1 está bajo el control de un promotor CHS.
En una modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-p bajo el control de un promotor. En una modalidad, el gen del clado CYP76AD1-p es CYP76AD6. En otra modalidad, el gen del clado CYP76AD1-p es CYP76AD15.
En una modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un gen del clado CYP76AD1-p de la remolacha roja. En una modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un gen del clado CYP76AD1-p que no procede de la remolacha azucarera. En una modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un gen del clado CYP76AD1-p pero que excluye la secuencia de ácido nucleico de los parálogos de CYP76AD1 de la remolacha azucarera
(DeLoache y otros, 2015), que no producen betaxantina cuando se transforman en levadura con DOD. En una modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende un gen del clado CYP76AD1-p pero que excluye el ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 34.
En otra modalidad, el gen del clado CYP76AD1-p es un gen del clado CYP76AD1-p como se expone en Brockington y otros, 2015 (New Phytol. Sep 2015;207(4):1l70-80). En una modalidad, el gen del clado CYp76AD1-p es un gen del clado CYP76AD1-p como se expone en la Figura 2 complementaria de Brockington y otros, 2015.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un gen CYP76AD6, un gen CYP76AD15, o una de sus combinaciones bajo el control de un promotor.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-p y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en donde dichos ácidos nucleicos se insertan en el polinucleótido en marco. En una modalidad, el polinucleótido comprende además un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En una modalidad, el ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-p es Bv. marítima, Beta vulgaris ssp. marítima (Núm de acceso a GenBank AKI33834.1; SEQ ID NO: 10); F. latifolia, Froelichia latifolia (acceso AKI33838.1; SEQ ID NO: 11); A. caracasana, Alternanthera caracasana (acceso AKI33835.1; SEQ ID NO: 12); A. ficoidea, Alternanthera ficoidea (acceso AKI33831.1; SEQ ID NO: 13), o una de sus combinaciones.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un gen CYP76AD6, un gen CYP76AD15, o una de sus combinaciones y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en donde dichos ácidos nucleicos se insertan en el polinucleótido en marco. En una modalidad, el polinucleótido comprende además un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En otra modalidad, la presente invención comprende ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que modifican la estructura de la betalaína. En una modalidad, el polipéptido es una enzima glicosilante. En otra modalidad, el polipéptido es una enzima acilante. En otra modalidad, los ácidos nucleicos adicionales codifican polipéptidos implicados en el transporte subcelular. En otra modalidad, los ácidos nucleicos adicionales codifican polipéptidos implicados en la desintoxicación.
Homólogos y variantes
En otra modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es homólogo a una secuencia expuesta en la presente descripción, ya sea expresamente o por referencia a una entrada de GenBank.
Los términos “homología”, “homólogo”, etcétera, cuando hacen referencia a cualquier aminoácido o ácido nucleico, se refieren, en una modalidad, a un porcentaje de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de un polipéptido o polinucleótido natural correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso de ser necesario, para lograr el por ciento máximo de homología, y sin considerar cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los métodos y programas de computadora para el alineamiento se conocen bien en la técnica tales como, por ejemplo, los paquetes BLAST, DOMAIN, BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT y TREMBL.
En una modalidad, puede usarse un homólogo de CYP76AD1 en lugar de CYP76AD1 de acuerdo con las composiciones y métodos de la presente invención.
En otra modalidad, puede usarse un homólogo de CYP76AD6 en lugar de CYP76AD6, de acuerdo con las composiciones y métodos de la presente invención.
En otra modalidad, puede usarse un homólogo de la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) en lugar de la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), de acuerdo con las composiciones y métodos de la presente invención.
La homología puede ser a nivel de secuencia de nucleótidos y/o secuencia de aminoácidos codificada. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos comparte al menos aproximadamente 50 %, o 60 %, o 70 %, u 80 % de homología. En otra modalidad, la secuencia de ácidos nucleicos y/o aminoácidos comparte al menos aproximadamente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología con una secuencia de la presente invención. La homología puede ser a nivel de secuencia de nucleótidos y/o secuencia de aminoácidos codificada. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos comparte al menos aproximadamente 72 % de homología. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos comparte al menos aproximadamente 75 % de homología.
En otra modalidad, la homología se determina mediante la determinación de la hibridación de las secuencias candidatas, cuyos métodos se describen bien en la técnica (Ver, por ejemplo, "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1985); Sambrook y otros, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y).
En una modalidad, el homólogo se aísla de otra planta Caryophyllales. En una modalidad, el homólogo se aísla de un cactus, un clavel, un amaranto, una planta de hielo, una remolacha, una planta carnívora o una de sus combinaciones. En una modalidad, la planta carnívora es una Dionocophyllaceae tal como Triphyophyllum, una Droseraceae, tal como Aldrovanda (planta de rueda de agua), Dionaea (venus atrapamoscas), Drosera (rocío de sol), una Drosophyllaceae tal como Drosophyllum (pino rocío o rocío de sol portugués), o una Nepenthaceae tal como planta jarra tropical o copa de mono.
En una modalidad, el homólogo se aísla basado en la expresión temporal. En una modalidad, el homólogo se aísla basado en la etapa del desarrollo. En una modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 1, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 1 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 2, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 2 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 3, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 3 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 4, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 4 cm. En otra modalidad, la etapa del desarrollo es la Etapa 5, que, en una modalidad, es cuando la longitud de la flor es de aproximadamente 5-6 cm.
En otra modalidad, el homólogo se aísla basado en la expresión tisular. En una modalidad, la expresión tisular de un homólogo de CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, o DOD es en un tejido floral. En una modalidad, el tejido floral es un pétalo. En otra modalidad, el tejido floral es un estambre. En otra modalidad, el tejido floral es una antera. En otra modalidad, el tejido floral es un estigma.
En otra modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es una variante de una secuencia expuesta en la presente descripción. En otra modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es una isoforma de una secuencia expuesta en la presente descripción. En otra modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es un fragmento de una secuencia expuesta en la presente descripción. En una modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es una variante funcional de una secuencia expuesta en la presente descripción. En otra modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es una isoforma funcional de una secuencia expuesta en la presente descripción. En otra modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es un fragmento funcional de una secuencia expuesta en la presente descripción. En otra modalidad, un polinucleótido o polipéptido recombinante de la presente invención es un homólogo funcional de una secuencia expuesta en la presente descripción.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se describe en la presente descripción.
En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6 es como se expone en SEQ ID NO: 30. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico de CYP76AD6 es como se expone en SEQ ID NO: 30. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 30. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 30. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 30. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 30. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 30.
Como se demuestra en el Ejemplo 19, CYP76AD15, un ortólogo de CYP76AD6 en Mirabilis jalapa, tuvo la misma actividad que CYP76AD6 durante la expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. En otra modalidad, CYP76AD15 o un homólogo, isoforma o variante de este, puede usarse en lugar de CYP76AD6 en las composiciones y métodos de la presente invención. En una modalidad, el producto génico CYP76AD15 de Mirabilis jalapa tiene una función similar al producto génico CYP76AD6 de Beta vulgaris. En una modalidad, CYP76AD15 de Mirabilis jalapa es el gen que codifica una enzima implicada en la conversión de tirosina en L-DOPA.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD15. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD15 comprende: tttgtctattattggctcaaaatccctctctctatctttttgtaaaagaaaatagttgttcaacttagggaattattgatatttcattatggaaaacacaatgtt aggtgttatcctagcaaccattttcctcacttttcacataatgaagatgttatttagtccttccaaggttaaactacccccgggtccgagaccattgcca attattggtaatattctcgagcttggggataaaccacatcgttcttttgcaaaccttgcgaaaattcacggtcctttagttactttgaaactcgggagtgt aaccactattgtggtttcctcttctgaagttgctaaagaaatgtttttgaaaaatgaccaacctttggcaaatcgtaccatacctgactcagtaagagc aggtaaccatgacaaactatcaatgtcgtggttgcctgtatcacccaaatggcgaaatcttagaaagatttcagccgtccaattgctctcaactcaa cgacttgatgcaagtcaagctcatagacaagctaaaatcaaacaacttattgagtacgtaaaaaaatgcagtaaaatcggccaatacgtcgatatt ggccaagttgcattcactacatcacttaatttactatcaaacacattcttttcaaaagaactagcatcatttgattcagataatgcacaagagttcaaac aactaatgtggtgcattatggaagaaattggtaggcctaattatgccgattattttcctatcttgggttatgtcgatccattcggtgctagacgtcgactt tctcgttacttcgatcaactaattgaagtatttcaagtgattattcgtgagagacttacacatgataataatattgtgggtaataacaatgatgttttagct acgttgctcgatctttataaacaaaacgagttaactatggatgaaatcaaccatttactagtggacatttttgatgctggtacggatacaacagcaagt acactagaatgggcaatgtcagagctcataaaaaatccacacataatggccaaagctcaagaggaggtccggcgagccaccatgtctcacgg cggagctacggtggcggaaatacaagaatcggatatcaataatcttccatacatacaatctattattaaagaaacacttcgtttacacccaccaact gtgtttttacttcctagaaaagctgacgtggatgtccaattattcggctatgtggtccccaaaaatgctcaagtcctagtcaatttatgggccattggtc gtgacccaaatgtgtggcccgacccggaagtttttagtcccgaaagatttatggattgtgagattgatgtcaagggtcgtgattttgagctattgcctt tcggggcgggtcgtcggatttgtccgggattgtctttggcttatcggatgcttaatttgatgttggctaatatggtacattcttttgattggaaattaccc ggtgttgaaaatggatccgggtcggaaatggatagtttggatatggatgagaaatttggtatcactttgcaaaaggttcaaccccttaaggttattcc tgtctcaaggaaatagatttttggaagatcgatggttgggagataatcatattgtttttaattattgttggtgtattttattgttattattggggacaattttat aataaaagatataaataagttcctaattgtgatttatattgtgaattttctagttaatataaatacatatgaatatttatgatgaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaagg (SEQ ID NO: 35).
En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica BvCYP76new, como se describe en el Ejemplo 3. En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica MjCYP76 de M. jalapa (SEQ ID NO: 1). En una modalidad, pueden usarse CYP76AD15, BvCYP76new o MjCYP76 en las composiciones y métodos de la presente invención. En otra modalidad, en las composiciones y métodos de la presente invención pueden usarse otros genes que codifican el citocromo P450 coexpresados con uno o más de los genes relacionados con la betalaína conocidos usados como cebos. En una modalidad, un similar a CYP82G1 (SEQ ID NO: 36), similar a CYP78A9 (SEQ ID NO: 37), similar a CYP86B1 (SEQ ID NO: 38) o una de sus combinaciones puede usarse en las composiciones y métodos de la presente invención. En una modalidad, puede usarse en lugar de CYP76AD6.
En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1. En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico de CYP76AD1 es como se expone en SEQ ID NO: 32. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 32. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 32. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 32. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 32. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 32.
En otra modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD3 (s Eq ID NO: 4), como se describe en el Ejemplo 9. En una modalidad, puede usarse CYP76AD3 en lugar de CYP76AD1 en las composiciones y métodos de la presente invención.
En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica DODA1 de Beta vulgaris (BvDODA1). En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica BvDODA1. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico de BvDODA1 es como se expone en SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 33.
En otra modalidad, la enzima DOD es PgDOD de Portulaca grandiflora (Núm. acceso AJ580598; SEQ ID NO: 39), MjDOD de Mirabilis jalapa (Núm. acceso AB435372; SEQ ID NO: 3), BgDOD de Bougainvillea glabra (Núm. acceso AB435373; SEQ ID NO: 40), o AmDOD de Amanita muscaria (Núm. acceso P87064; SEQ ID NO: 41).
En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa (cDOPA5GT). En una modalidad, un polinucleótido de la presente invención comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica cDOPA5GT. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico de cDOPA5GT es como se expone en SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 2.
En una modalidad, “variante” se refiere a una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos (o en otras modalidades, un organismo o tejido) que es diferente de la mayoría de la población pero todavía es lo suficientemente similar al modo común para considerarse como una de ellas, por ejemplo, variantes de empalme. En una modalidad, la variante puede ser una variante conservativa de secuencia, mientras que en otra modalidad, la variante puede ser una variante conservativa funcional. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución de 1 aminoácido. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación, sustitución o sus combinaciones, de 2 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 3 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 4 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 5 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 7 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 10 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 2-15 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 3-20 aminoácidos. En una modalidad, una variante puede comprender una adición, eliminación o sustitución, o sus combinaciones, de 4-25 aminoácidos.
En una modalidad, el término “fragmento” se usa en la presente descripción para referirse a una proteína o polipéptido que es más corto o comprende menor cantidad de aminoácidos que la proteína o el polipéptido de longitud completa. En otra modalidad, un fragmento se refiere a un ácido nucleico que es más corto o comprende menor cantidad de nucleótidos que el ácido nucleico de longitud completa. En otra modalidad, el fragmento es un fragmento N-terminal. En otra modalidad, el fragmento es un fragmento C-terminal. En una modalidad, el fragmento es una sección intrasecuencial de la proteína, péptido, o ácido nucleico. En otra modalidad, el fragmento es una sección funcional dentro de la proteína, péptido o ácido nucleico.
En una modalidad, "isoforma" se refiere a una isoforma de proteína o una isoforma de gen. En una modalidad, una isoforma de proteína es una forma diferente de una proteína codificada por el mismo gen, o una proteína de un gen diferente con similitudes de secuencia de aminoácidos y funcionales. En una modalidad, una isoforma de gen es un ARNm que se produce a partir del mismo locus pero que tiene diferentes sitios de inicio de la transcripción (TSS), secuencias de ADN que codifican proteínas (CDS) y/o regiones no traducidas (UTR). En una modalidad, la isoforma del gen tiene actividad alterada, mientras que en otra modalidad, la isoforma del gen no tiene actividad alterada. De esta forma, en una modalidad, una isoforma es una versión alternativa de una molécula, por ejemplo, una proteína, que tiene la misma función que la primera molécula pero que puede tener pequeñas diferencias en su estructura o secuencia. En una modalidad, las isoformas pueden producirse a partir de genes diferentes pero relacionados, o en otra modalidad, pueden surgir del mismo gen mediante procesos de corte y empalme alternativos. En otra modalidad, las isoformas se producen por polimorfismos de nucleótidos simples.
En una modalidad, "funcional" dentro del significado de la invención, se usa en la presente descripción para referirse a la capacidad innata de una proteína, péptido, ácido nucleico, fragmento o una variante de estos para mostrar una actividad o función biológicas. En una modalidad, dicha función biológica es su propiedad de unión a una pareja de interacción, por ejemplo, un receptor asociado a la membrana, y en otra modalidad, su propiedad de trimerización. En el caso de los fragmentos funcionales y las variantes funcionales de la invención, estas funciones biológicas de hecho pueden cambiar, por ejemplo, con respecto a su especificidad o selectividad, pero con retención de la función biológica básica.
En la técnica relacionada se conocen numerosos métodos para medir la actividad biológica de una proteína, polipéptido o molécula, por ejemplo, ensayos de proteínas, que utilizan sustratos marcados, análisis de sustratos mediante métodos cromatográficos, tales como HPLC o cromatografía de capa fina, métodos espectrofotométricos, etc. (ver, por ejemplo, Maniatis y otros (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Vectores de expresión
En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) expresados en tándem. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, expresados en tándem.
En una modalidad, los polinucleótidos de la presente invención se insertan en vectores de expresión (es decir, un constructo de ácido nucleico) para permitir la expresión del polipéptido recombinante. En una modalidad, el vector de expresión de la presente invención incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en procariotas. En otra modalidad, el vector de expresión de la presente invención incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en eucariotas. En una modalidad, el vector de expresión de la presente invención incluye un vector lanzadera que hace que este vector sea adecuado para la replicación y la integración tanto en procariotas como en eucariotas. En algunas modalidades, los vectores de clonación comprenden secuencias de inicio de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación).
En una modalidad, puede usarse una variedad de células procariotas o eucariotas como sistemas de expresión en un huésped para expresar los polipéptidos de la presente invención. En algunas modalidades, estas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vector de expresión de ADN cósmido que contiene la secuencia codificante del polipéptido; levadura transformada con vectores de expresión recombinante en levaduras que contienen la secuencia codificante del polipéptido; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión recombinantes en virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes, tales como el plásmido Ti, que contiene la secuencia codificante del polipéptido.
En una modalidad, los vectores virales de la presente invención sobreexpresan los genes de la vía descritos en la presente descripción. En otra modalidad, la infección viral de células que expresan los genes de la vía descritos en la presente descripción induce a las células a sobreexpresar los genes de la vía.
En algunas modalidades, se usan sistemas de expresión no bacterianos (por ejemplo, sistemas de expresión en mamíferos, tales como células CHO) para expresar los polipéptidos de la presente invención. En una modalidad, el vector de expresión usado para expresar los polinucleótidos de la presente invención en células de mamífero es el vector pCI-DHFR que comprende un promotor de CMV y un gen de resistencia a la neomicina.
En algunas modalidades, en los sistemas bacterianos de la presente invención, puede seleccionarse ventajosamente una serie de vectores de expresión en dependencia del uso previsto para el polipéptido expresado. En una modalidad, se desean grandes cantidades de polipéptido. En una modalidad, se desean vectores que dirigen la expresión de altos niveles del producto proteico, posiblemente como una fusión con una secuencia señal hidrófoba, que dirige el producto expresado hacia el periplasma de las bacterias o el medio de cultivo donde el producto proteico se purifica fácilmente. En una modalidad, ciertas proteínas de fusión se manipulan por ingeniería genética con un sitio de escisión específico para ayudar a recuperar el polipéptido. En una modalidad, los vectores que pueden adaptarse a dicha manipulación incluyen, pero no se limitan a, la serie pET de los vectores de expresión de E. coli (Studier y otros, Methods in Enzymol. 185:60-891990).
En una modalidad, se usan sistemas de expresión en levaduras. En una modalidad, una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles puede usarse en levaduras como se describe en la patente de Estados Unidos Núm.: 5,932,447. En otra modalidad, se usan vectores que promueven la integración de secuencias de ADN extraño en el cromosoma de levadura.
En una modalidad, el vector de expresión de la presente invención puede incluir además secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas a partir de un único ARNm tal como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y secuencias para la integración genómica del promotorpolipéptido quimérico.
En algunas modalidades, los vectores de expresión para mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcADN3.,(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3,1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que están disponibles de Invitrogen, pCI que está disponible de Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles de Strategene, pTRES que está disponible de Clontech, y sus derivados.
En algunas modalidades, en la presente invención se usan vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus de eucariotas tales como retrovirus. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. En algunas modalidades, los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO y p2O5. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor del virus de tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores que han demostrado su efectividad para la expresión en células eucariotas.
En algunas modalidades, los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión in vivo de los polipéptidos de la presente invención ya que ofrecen ventajas tales como infección lateral y especificidad de direccionamiento. En una modalidad, la infección lateral es inherente al ciclo de vida de, por ejemplo, retrovirus y es el proceso mediante el cual una sola célula infectada produce muchos viriones de progenie que brotan e infectan células vecinas. En una modalidad, el resultado es que una gran área se infecta rápidamente, la mayor parte de la cual no estaba inicialmente infectada por las partículas virales originales. En una modalidad, se producen vectores virales que no pueden propagarse lateralmente. En una modalidad, esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico solo en un número localizado de células objetivo.
En una modalidad, pueden usarse diversos métodos para introducir el vector de expresión de la presente invención en las células. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes.
En algunas modalidades, la introducción de ácido nucleico por infección viral ofrece varias ventajas sobre otros métodos tales como la lipofección y la electroporación, ya que puede obtenerse una mayor eficiencia de transfección debido a la naturaleza infecciosa de los virus.
En una modalidad, se apreciará que los polipéptidos de la presente invención también pueden expresarse a partir de un constructo de ácido nucleico administrado al individuo mediante el empleo de cualquier modo de administración adecuado, descrito anteriormente en la presente descripción (es decir, terapia génica in vivo). En una modalidad, el constructo de ácido nucleico se introduce en una célula adecuada mediante un vehículo/método de suministro de genes apropiado (transfección, transducción, recombinación homóloga, etc.) y un sistema de expresión según sea necesario y después las células modificadas se expanden en cultivo y se devuelven al individuo (es decir, terapia génica ex-vivo).
En una modalidad, se usan vectores de expresión de plantas. En una modalidad, la expresión de una secuencia codificante de polipéptido está impulsada por una serie de promotores. En algunas modalidades, se usan promotores virales tales como los promotores ARN 35S y ARN 19S de CaMV [Brisson y otros, Nature 310:511-514 (1984)], o el promotor de la proteína de cubierta a TMV [Takamatsu y otros, EMBO J. 6:307-311 (1987)]. En otra modalidad se usan promotores de plantas tales como, por ejemplo, la subunidad pequeña de RUBISCO [Coruzzi y otros, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); y Brogli y otros, Science 224:838-843 (1984)] o promotores de choque térmico, por ejemplo, hsp17,5-E o hsp17,3-B de soya [Gurley y otros, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]. En una modalidad, los constructos se introducen en células vegetales mediante el uso de plásmido Ti, plásmido Ri, vectores virales de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación y otras técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Weissbach y Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421-463 (1988)]. La presente invención también puede usar otros sistemas de expresión tales como sistemas de células huésped de insectos y mamíferos, que se conocen bien en la técnica.
Se apreciará que aparte de contener los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica al polipéptido), el constructo de expresión de la presente invención puede incluir, además, secuencias manipuladas por ingeniería genética para optimizar la estabilidad, la producción, la purificación, el rendimiento o la actividad del polipéptido expresado.
Pueden usarse diversos métodos, en algunas modalidades, para introducir el vector de expresión de la presente invención en el sistema de la célula huésped. En algunas modalidades, dichos métodos se describen generalmente en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y otros, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega y otros, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y otros [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, ver las patentes de Estados Unidos Núms. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.
En algunas modalidades, las células transformadas se cultivan en condiciones efectivas, que permiten la expresión de grandes cantidades de polipéptidos recombinantes. En algunas modalidades, las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero no se limitan a, medios eficaces, condiciones del biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una modalidad, un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el cual se cultiva una célula para producir el polipéptido recombinante de la presente invención. En algunas modalidades, un medio típicamente incluye una solución acuosa que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes adecuados, tales como las vitaminas. En algunas modalidades, las células de la presente invención pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. En algunas modalidades, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno adecuados para una célula recombinante. En algunas modalidades, las condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto en la técnica.
En algunas modalidades, en dependencia del sistema de vector y huésped usado para la producción, los polipéptidos resultantes de la presente invención o bien permanecen dentro de la célula recombinante, se secretan hacia el medio de fermentación, se secretan hacia un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplasmático en E. coli; o son retenidos en la superficie externa de una membrana celular o viral.
Composiciones
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende uno o más polinucleótidos recombinantes como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende ácidos nucleicos recombinantes como se describe en la presente descripción. En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) expresados en tándem. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) expresados en tándem.
En una modalidad, se proporciona una composición que comprende un polinucleótido recombinante o un polipéptido quimérico de la presente invención. En una modalidad, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención pueden proporcionarse al individuo per se.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector de expresión o un polinucleótido recombinante como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una célula como se describe en la presente descripción.
Células
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un polinucleótido recombinante como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector de expresión como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) expresados en tándem.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, expresados en tándem.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos están en el mismo marco de lectura.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) expresados en tándem.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, expresados en tándem.
En una modalidad, cuando los genes de la invención pueden transformarse en una célula vegetal, puede producirse un cultivo en suspensión de células vegetales. En una modalidad, la célula vegetal es una célula madre vegetal. La betalaína, la L-DOPA o una de sus combinaciones pueden aislarse a partir de cultivos en suspensión de plantas. Los métodos para fabricar cultivos en suspensión de células vegetales se conocen bien en la técnica y se describen completamente en las publicaciones de solicitudes de patente de Estados Unidos US 2014/0051135; US 2011/0251408; US 2010/0159545; y US 2007/0026506.
En una modalidad, las células vegetales se seleccionan de células de tabaco (Nicotiana tabacum), tomate (Solanum lycopersicum), papa (Solanum tuberosum), berenjena (Solanum melongena), tabaco de árbol (Nicotiana glauca), hierba mora negra europea (Solanum nigrum), Petunia (Petunia x hybrida) y Nicotiana benthamiana. En otra modalidad, las células vegetales proceden de cualquiera de las plantas que se describen más abajo en la presente descripción.
En una modalidad en la que se introducen polinucleótidos en células vegetales, las células vegetales pueden derivarse de cualquier órgano vegetal de interés, como se describe más abajo en la presente descripción. En una modalidad, el polinucleótido se introduce en una porción de un órgano de la planta. En una modalidad, el polinucleótido se introduce en una porción de una flor. En una modalidad, la porción de la flor es el pétalo, el estambre, la antera, el estigma o una de sus combinaciones.
Esta invención también proporciona métodos para fabricar semillas transgénicas que pueden usarse para producir un cultivo de plantas transgénicas con un rasgo potenciado resultante de la expresión de un constructo de ADN recombinante integrado de forma estable.
En otra modalidad, las células de la presente invención son células de un microorganismo. En otra modalidad, la célula es una célula de levadura. En una modalidad, la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae. En otra modalidad, la célula de la presente invención es una célula bacteriana. En una modalidad, la célula bacteriana es una célula de Escherichia coli. En otra modalidad, la célula es una célula de Acremonium rutilum, Aspergillus oryzae, Yarrowia lipolytica, Bacillus sp. JPJ, Brevundimonas sp. SGJ, E. herbicola, Citrobacter freundii, Symbiobacterium, o Pseudomonas aeruginosa. En otra modalidad, la célula bacteriana procede de una bacteria implicada en la fermentación de productos lácteos. En una modalidad, la bacteria es Streptococcus lactis. En otra modalidad, la bacteria es un Lactobacillus. En una modalidad, el Lactobacillus es Lactobacillus bulgaricus. En otra modalidad, la bacteria es un Lactococcus o un Leuconostoc.
Plantas y partes de plantas
En otra modalidad, la presente invención proporciona una planta o parte de esta producida mediante un método para aumentar los niveles de una o más betalaínas o L-DOPA en una planta o en una parte de la planta que comprende provocar o permitir la expresión de una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, o una de sus combinaciones, dentro de dicha planta o parte de la planta. En una modalidad, una planta que expresa DOD y CYP76AD1 y no CYP76AD6 o CYP76AD15, también expresa una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En una modalidad, la planta no produce naturalmente betalaínas. En otra modalidad, la planta produce bajos niveles de betalaínas. En otra modalidad, la planta no produce naturalmente niveles detectables de betalaínas.
En otra modalidad, las plantas o partes de plantas como se describe en la presente descripción producen naturalmente betalaínas; sin embargo, la planta o partes de plantas genéticamente modificadas tienen un nivel alterado de betalaínas o de una betalaína en particular, lo que altera de esta manera el color y/o las propiedades de la planta genéticamente modificada. En una modalidad, los niveles alterados de betalaínas son niveles aumentados. En otra modalidad, los niveles alterados de betalaínas son niveles reducidos.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una planta o parte de esta que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, las betalaínas o la L-DOPA se producen como se describe en la presente descripción en una planta completa. En una modalidad, una semilla se modifica genéticamente de manera que se producen betalaínas o L-DOPA en una planta completa. En otra modalidad, las betalaínas o la L-DOPA se producen en un órgano particular de una planta. En otra modalidad, las betalaínas o la L-DOPA se producen en una sección de un órgano de una planta. Por ejemplo, las betalaínas o la L-DOPA pueden producirse en algunas células vegetales en la hoja u otro órgano de una planta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una planta ornamental producida mediante un método para aumentar los niveles de una o más betalaínas en una planta o en una parte de esta que comprende provocar o permitir la expresión de una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, o una de sus combinaciones, dentro de dicha planta o parte de la planta. En una modalidad, si la planta ornamental expresa CYP76AD1 y DOD y no CYP76AD6 o CYP76AD15, expresa además una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una planta ornamental que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD).
En una modalidad, diferentes partes u órganos de un organismo de la presente invención comprenden una pigmentación diferente debido a la expresión de múltiples citocromos P450 (por ejemplo, CYP76AD6, CYP76AD1) bajo el control de diferentes secuencias promotoras no constitutivas (por ejemplo, específicas de frutas, específicas de flores o promotores inducibles). En una modalidad, el organismo es una planta y las diferentes pigmentaciones se encuentran en diferentes partes de la planta. En una modalidad, la planta es una planta ornamental.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un cultivo alimentario producido mediante un método para aumentar los niveles de una o más betalaínas en una planta o parte de esta que sirve como cultivo alimentario que comprende provocar o permitir la expresión de una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, o una de sus combinaciones, dentro de dicha planta o parte de esta. En una modalidad, si el cultivo alimentario expresa CYP76AD1 y DOD y no CYP76AD6 o CYP76AD15, expresa además una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una planta o parte de esta que sirve como cultivo alimentario que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD).
En una modalidad, las composiciones y el método de la presente invención comprenden una o más partes de la planta. En una modalidad, una parte de la planta como se describe en la presente descripción es un órgano de la planta. En una modalidad, la parte de la planta es una hoja, tallo, raíz, flor, semilla, tubérculo o fruto. En una modalidad, la parte de la planta es la porción comestible de la planta. En una modalidad, las composiciones y el método de la presente invención comprenden una o más porciones de una o más partes de plantas. En una modalidad, la porción de la parte de la planta es una porción de una flor. En una modalidad, la porción de la flor es el pétalo, el estambre, la antera o el estigma.
En una modalidad, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y otros genes de la invención descritos en la presente descripción pueden transformarse en una planta o una célula vegetal. El término "planta", como se usa en la presente, puede referirse a cualquier planta monocotiledónea o dicotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, arroz, caña de azúcar y plátano. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, soya, frijoles, guisantes, lentejas, cacahuetes, tomates, papas, algodón y árboles frutales perennes, lo que incluye uvas, manzanas y naranjas.
En una modalidad, la planta es tabaco (Nicotiana tabacum), tomate (Solanum lycopersicum), papa (Solanum tuberosum), berenjena (Solanum melongena), tabaco de árbol (Nicotiana glauca), hierba mora negra europea (Solanum nigrum), Petunia (Petunia x hybrida) o Nicotiana benthamiana. En otra modalidad, la planta es B. vulgaris. En otra modalidad, la planta es Mirabilis jalapa.
En una modalidad, una planta de la presente invención es una planta de cultivo. En una modalidad, la planta de cultivo es Solanum tuberosum (Papa). En otra modalidad, la planta de cultivo es Zea mays (Maíz). En otra modalidad, la planta de cultivo es Oryza sativa (Arroz). En otra modalidad, la planta de cultivo es Manihot esculenta (Yuca). En otra modalidad, la planta de cultivo es Hordeum vulgare (Cebada). En otra modalidad, la planta de cultivo es Triticum aestivum (Trigo). En otra modalidad, la planta de cultivo es Sorghum bicolor. En otra modalidad, la planta de cultivo es Brassica napus (Colza). En otra modalidad, la planta de cultivo es Ricinus communis (Castor). En otra modalidad, la planta de cultivo es Phaseolus vulgaris (Frijol). En otra modalidad, la planta de cultivo es Gossypium histrum (Algodón). En otra modalidad, la planta de cultivo es Glycine max (Soya). En otra modalidad, la planta de cultivo es Beta vulgaris (Remolacha). En otra modalidad, la planta de cultivo es Musa acuminate (Banana). En otra modalidad, la planta de cultivo es Capsicum annuum (Pimientos dulces y chiles). En otra modalidad, la planta de cultivo es Cicer arietinum (Garbanzo). En otra modalidad, la planta de cultivo es Solanum lycopersicum (Tomate). En otra modalidad, la planta de cultivo es Elaeis guineensis (Palma aceitera africana). En otra modalidad, la planta de cultivo es Setaria italic (Mijo cola de zorra).
En otra modalidad, una planta de la presente invención es un bambú, que en una modalidad es caña de río (Arundinaria gigantea) y caña pequeña (Arundinaria tecta). En otra modalidad, la planta es una Lemna.
En otra modalidad, una planta de la presente invención es un musgo. En una modalidad, el musgo es un Sphagnum. En una modalidad, la especie Sphagnum es cristatum o subnitens. En una modalidad, el musgo se usa para turba. En una modalidad, la turba se usa como combustible, como un aditivo para suelos hortícolas y como malta ahumada en la producción de whisky escocés. En otra modalidad, el musgo se usa con fines decorativos, tal como en jardines y en el comercio de floristería. En otra modalidad, el musgo se usa como aislante. En otra modalidad, el musgo se usa como absorbente de líquidos. En otra modalidad, el musgo se usa para apósitos de primeros auxilios, para pañales o servilletas. En otra modalidad, el musgo es un Physcomitrella patens. En otra modalidad, el musgo es un Fontinalis antipyretica que, en una modalidad, se usa para sofocar incendios.
Las plantas incluidas en la invención son cualquier planta susceptible de técnicas de transformación, lo que incluye gimnospermas y angiospermas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas.
Los ejemplos de angiospermas monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, espárrago, maíz dulce y de campo, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo perla, centeno y avena y otros granos de cereales.
Los ejemplos de angiospermas dicotiledóneas incluyen, pero no se limitan a tomate, tabaco, algodón, semilla de colza, habas, soya, pimientos, lechugas, guisantes, alfalfa, trébol, cultivos de coles o Brassica oleracea (por ejemplo, repollo, brócoli, coliflor, coles de Bruselas), rábano, zanahoria, remolacha, berenjena, espinaca, pepino, calabacín, melones, melón cantalupo, girasol y diversas plantas ornamentales.
En otra modalidad, puede usarse cualquier especie de planta leñosa, ornamental o decorativa, cultivo o cereal, fruta o verdura, y algas (por ejemplo, Chlamydomonas reinhardtii) en las composiciones y métodos proporcionados en la presente descripción. Los ejemplos no limitantes de plantas incluyen plantas del género Arabidopsis o del género Oryza. Otros ejemplos incluyen plantas de los géneros Acorus, Aegilops, Allium, Amborella, Antirrhinum, Apium, Arachis, Beta, Betula, Brassica, Capsicum, Ceratopteris, Citrus, Cryptomeria, Cycas, Descurainia, Eschscholzia, Eucalyptus, Glycine, Gossypium, Hedyotis, Helianthus, Hordeum, Ipomoea, Lactuca, Linum, Liriodendron, Lotus, Lupinus, Lycopersicon, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Nuphar, Pennisetum, Peryea, Phaseolus, Physcomitrella, Picea, Pinus, Poncirus, Populus, Prunus, Robinia, Rosa, Saccharum, Schedonorus, Secale, Sesamum, Solanum, Sorghum, Stevia, Thellungiella, Theobroma, Triphysaria, Triticum, Vitis, Zea o Zinnia.
Ejemplos de especies leñosas incluyen álamos, pinos, secuoyas, cedros, robles, etc.
En ciertas modalidades, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, cereales y legumbres, maíz, trigo, papas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, yuca, cebada, guisantes y otros cultivos de raíces, tubérculos o semillas). Los cultivos de cereales ilustrativos usados en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cualquier especie de hierba o planta de grano (por ejemplo, cebada, maíz, avena, arroz, arroz salvaje, centeno, trigo, mijo, sorgo, triticale, etc.), plantas no herbáceas (por ejemplo, lino de trigo sarraceno, legumbres o soya, etc.). Las plantas de granos que proporcionan semillas de interés incluyen plantas de semillas oleaginosas y plantas leguminosas. Otras semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etcétera. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etcétera. Otros cultivos de semilla importantes son la colza, la remolacha azucarera, el maíz, el girasol, la soya y el sorgo. Las plantas leguminosas incluyen frijoles y guisantes. Los frijoles incluyen guar, algarrobo, fenogreco, soya, frijoles de jardín, caupí, frijol mungo, frijol lima, frijol fava, lentejas, garbanzos, etc.
Las plantas hortícolas a las que puede aplicarse la presente invención pueden incluir lechuga, escarola y brasicáceas vegetales lo que incluye col, brócoli y coliflor, y claveles y geranios. La presente invención también puede aplicarse al tabaco, cucurbitáceas, zanahoria, fresa, girasol, tomate, pimiento, crisantemo, álamo, eucalipto y pino.
La presente invención puede usarse para la transformación de otras especies de plantas, lo que incluye, pero no se limita a, canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa (Medicago sativa), centeno (Secale cereales), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana), tabaco de árbol (Nicotiana glauca), cacahuetes (Arachis hipogaea), algodón (Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), Coco (Cocos nucifera), piña (Ananascomosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Carica papaya), marañón (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), tomate (Solanum lycopersicum), berenjena (Solanum melongena), hierba mora negra europea (Solanum nigrum), Petunia (Petunia x hybrida), avena, cebada, mijo, frutas, verduras, plantas ornamentales, césped y coníferas.
Además de una planta, la presente invención proporciona cualquier clon de dicha planta, semilla, progenie autopolinizada o híbrida y descendientes, y cualquier parte de cualquiera de estos, tales como esquejes, semillas. La invención proporciona cualquier propágulo vegetal que es cualquier parte que puede usarse en la reproducción o propagación, sexual o asexual, lo que incluye esquejes, semillas y así sucesivamente. Se abarca además por la invención una planta que es un vástago, clon o descendiente de una planta propagado sexual o asexualmente de una planta o cualquier parte o propágulo de dicha planta, vástago, clon o descendiente de ese tipo. También se proporcionan extractos de plantas y derivados.
A lo largo de esta solicitud, una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal transformada con, o transformada de manera intercambiable por, un constructo o transformada con o por un ácido nucleico debe entenderse como que significa una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que porta dicho constructo o dicho ácido nucleico como un transgén debido al resultado de una introducción de dicho constructo o dicho ácido nucleico por medios biotecnológicos. La planta, parte de la planta, semilla o célula vegetal comprende por lo tanto dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante. Cualquier planta, parte de planta, semilla o célula vegetal que ya no contenga dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante después de su introducción en el pasado, se denomina segregante nulo, nulizigoto o control nulo, pero no se considera una planta, parte de planta, semilla o célula vegetal transformada con dicho constructo o con dicho ácido nucleico en el sentido de esta solicitud. En una modalidad, la tirosina es endógena a un organismo o parte de un organismo de la presente invención. En otra modalidad, un organismo o parte de un organismo de la presente invención sintetiza tirosina. En otra modalidad, un organismo o parte de un organismo de la presente invención se modifica genéticamente para producir tirosina. En otra modalidad, un organismo o parte de un organismo de la presente invención se proporciona o alimenta con tirosina. En otra modalidad, un organismo o parte de un organismo que comprende tirosina endógena se modifica genéticamente como se describe en la presente descripción para producir mayores cantidades de tirosina, lo que aumenta de esta manera la producción de L-DOPA o betalaína. En otra modalidad, se alimenta tirosina a un organismo o parte de un organismo que comprende tirosina endógena para tener mayores cantidades de tirosina disponible, lo que aumenta de esta manera la producción de L-DOPA o betalaína.
Métodos de extracción de L-DOPA y betalaínas
En una modalidad, los métodos de la presente invención proporcionan además métodos de extracción de L-DOPA o betalaínas como se describe más abajo en la presente descripción en el Ejemplo 1, así como también mediante el uso de otros métodos de extracción de L-DOPA o betalaína conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, Misra y Wagner (Indian J Biochem Biophys. 2007 Feb;44(1):56-60).
En otra modalidad, la L-DOPA o las betalaínas se extraen de cultivos de algas, levaduras o bacterias mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para recolectar L-DOPA o betalaínas que comprende las etapas de producir L-DOPA o betalaínas como se describe en la presente descripción y que comprende además la etapa de extraer dicha L-DOPA o dicha betalaína de la planta, parte de la planta, colonia, órgano, tejido o células que producen dicha L-DOPA o dicha betalaína. En una modalidad, la parte de la planta es una hoja, tallo, raíz, flor, semilla, tubérculo o fruto.
En una modalidad, la L-DOPA o betalaína se extrae de la raíz de una planta. En una modalidad, la L-DOPA o betalaína se secreta a través de las raíces de una planta a un líquido u otro medio y después se recolecta del líquido u otro medio. En otra modalidad, la L-DOPA o betalaína se extrae del medio de una suspensión de células vegetales, tal como tabaco BY2.
En otra modalidad, se extrae L-DOPA o betalaína de una planta de agua. En una modalidad, la planta de agua es una Lemna. En una modalidad, la Lemna es Lemna aequinoctialis; Lemna perpusilla; Lemna; Lemna gibba; Lemna minor; Lemna trisulcaUninerves; Lemna minuta; Lemna valdiviana; Lemna japónica; Lemna obscura; Lemna tenera; Lemna turionifera; Lemna yungensis, o una de sus combinaciones.
Polipéptidos
En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico codificado por un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD6. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6 comprende:
MDNATLA VILSILF VFYHIFKS FFTNS S S RRLPPGPKP VPIFGNIFDLGEKPHRS FANLS KIHG
PLIS LKLGS VTTIV V S S AS V AEEMFLKNDQ AL ANRTIPDS VRAGDHDKLS MS WLP V S QKW
RNMRKISAVQLLSNQKLDASQPLRQAKVKQLLSYVQVCSEKMQPVDIGRAAFTTSLNLLS
NTFFSIELASHESSASQEFKQLMWNIMEEIGRPNYADFFPILGYIDPFGIRRRLAGYFDKLID
VFQDIIRERQKLRSSNSSGAKQTNDILDTLLKLHEDNELSMPEINHLLVDIFDAGTDTTAST
LEW AM AELVKNPEMMTKV QIEIEQ ALGKDCLDIQES DIS KLP YLQ AIIKETLRLHPPT VFLL
PRKADNDVELYGYVVPKNAQVLVNLWAIGRDPKVWKNPEVFSPERFLDCNIDYKGRDFE
LLPFGAGRRICPGLTLAYRMLNLMLATLLQNYNWKLEDGINPKDLDMDEKFGITLQKVK
PLQVIPVPRN (SEQ ID NO: 18).
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico codificado por un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD1 comprende:
MDHATLAMILAIWFISFHFIKLLFSQQTTKLLPPGPKPLPIIGNILEVGKKPHRSFANLAK1H
GPLISLRLGSVTTIVVSSADVAKEMFLKKDHPLSNRTIPNSVTAGDHHKLTMSWLPVSPK
WRNFRKITAVHLLSPQRLDACQTFRHAKVQQLYEYVQECAQKGQAYDIGKAAFTTSLNL
LSKLFFSVELAHHKSHTSQEFKELIWNIMEDIGKPNYADYFPILGCVDPSGIRRRLACSFDK
LIAVFQGIICERLAPDSSTTTTTTTDDVLDVLLQLFKQNELTMGEINHLLVDIFDAGTDTTSS
TFEWVMTELIRNPEMMEKAQEEIKQVLGKDKQIQESDnNLPYLQAIIKETLRLHPPTVFLL
PRKADTDVELYGYIVPKDAQILVNLWAIGRDPNAWQNADIFSPERFIGCEIDVKGRDFGLL
PFGAGRRICPGMNLAIRMLTLMLATLLQFFNWKLEGDISPKDLDMDEKFGIALQKTKPLK
LIPIPRY (SEQ ID NO: 14).
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico codificado por un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD). En una modalidad, la enzima DOD es DODA1 de Beta vulgaris (BvDODA1). En una modalidad, la secuencia de aminoácidos que codifica BvDODA1 comprende:
MKMMNGEDANDQMIKESFFITHGNPILTVEDTHPLRPFFETWREKIFSKKPKAILIISGHWE TVKPTVNAVHINDT1HDFDDYPAAMYQFKYPAPGEPELARKVEEILKKSGFETAETDQKR GLDHGAWVPLMLMYPEADIPVCQLSVQPHLDGTYHYNLGRALAPLKNDGVLIIGSGSAT HPLDETPHYFDGVAPWAAAFDSWLRKALINGRFEEVNIYESKAPNWKLAHPFPEHFYPLH VVLGAAGEKWKAEL1HSSWDHGTLCHGSYKFTSA (SEQ ID NO: 42).
En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico codificado por un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa (cDOPA5GT). En una modalidad, la secuencia de aminoácidos que codifica cDOPA5GT comprende:
MTAIKMNTNGEGETQHILMIPFMAQGHLRPFLELAMFLYKRSHVnTLLTTPLNAGFLRHL FHHHS YS S S GIRIVEFPFN S TNHGFPPGIENTD KFTFPF V V S FFHS TIS FDPHFRD YIS RHF S P ARPPFC VIHD VFFGW VDQV AKD V GS TGV VFTTGGA Y GTS A Y VSIWNDFPHQNY S DD QEF PFPGFPENHKFRRS QFHRFFR Y AD GS DD WS KYF QPQFRQS M KS F GWFCN S VEEIETFGF SI FRNYTKFPIWGIGPFIASPVQHSSSDNNSTGAEFVQWFSFKEPDSVFYISFGSQNTISPTQM MEFAAGFESSEKPFFWVIRAPFGFDINEEMRPEWFPEGFEERMKVKKQGKFVYKFGPQFE IFNHESIGGFFTHCGWN SIFES FREGVPMFGWPFAAEQA YNFKYFED EMGV A VEFARGFE GEIS KEKVKRIVEMIFERNEGS KGWEMKNRA VEMGKKLKD AVNEEKELKGS S VKAIDDF FDAVMQAKFEPSFQ (SEQ ID NO: 43).
En una modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, y una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD1. En otra modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, y una secuencia de aminoácidos que codifica una enzima DOD. En otra modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD1 y una secuencia de aminoácidos que codifica una enzima DOD. En otra modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD1 y una secuencia de aminoácidos que codifica una enzima DOD. En otra modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD1 y una secuencia de aminoácidos que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En otra modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, una secuencia de aminoácidos que codifica una enzima DOD y una secuencia de aminoácidos que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En otra modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD1, una secuencia de aminoácidos que codifica una enzima DOD y una secuencia de aminoácidos que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En otra modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD1, una secuencia de aminoácidos que codifica una enzima DOD y una secuencia de aminoácidos que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En otra modalidad, cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente en la presente descripción comprende además una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En una modalidad, la glucosiltransferasa relacionada con la betalaína es ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa o betanidin-5-O-glucosiltransferasa. En una modalidad, la ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa es gen ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa de M. jalapa (cDOPA5GT) (SEQ ID NO: 43).
En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico codificado por un polinucleótido recombinante como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, o una de sus combinaciones, en donde dichas proteínas se expresan en tándem.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende CYP76AD1, una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichas proteínas se expresan en tándem.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en donde dichas proteínas se expresan en tándem.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, CYP76AD1, o una de sus combinaciones, una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y, opcionalmente, una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichas proteínas se expresan en tándem.
En una modalidad, un polipéptido o proteína "quimérico" o de "fusión" es un polipéptido o proteína creado mediante la unión de dos o más genes que originalmente codificaban proteínas separadas.
Debe entenderse que de acuerdo con la presente invención, los polipéptidos CYP76AD6 y similares a CYP76AD6 de plantas distintas de Beta vulgaris pueden usarse en lugar de CYP76AD6 de Beta vulgaris en las composiciones y métodos descritos en la presente descripción. En una modalidad, el polipéptido similar a CYP76AD6 es de Caryophyllales. En una modalidad, el polipéptido similar a CYP76AD6 es un homólogo dentro del clado CYP76AD1-beta, como se describe en Brockington y otros, (2015) (New Phytol. 2015 Sep;207(4):1170-80).
En una modalidad, puede usarse CYP76AD15 o un homólogo, isoforma o variante de este en lugar de CYP76AD6 en las composiciones y métodos de la presente invención. CYP76AD15 de Mirabilis jalapa tiene una función similar al CYP76AD6 de Beta vulgaris. En una modalidad, CYP76AD15 es una enzima implicada en la conversión de tirosina en L-DOPA. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de CYP76AD15 comprende:
MENTMLGVILATIFLTFHIMKMLFSPSKVKLPPGPRPLPIIGNILELGDKPHRSFANLAK1HG
PFVTFKFGSVTTIVVSSSEVAKEMFFKNDQPFANRTIPDSVRAGNHDKFSMSWFPVSPKW
RNERKISAVQEESTQREDASQAHRQAKIKQFIEYVKKCSKIGQYVDIGQVAFTTSENFESN
TFFS KEFAS FDS DN AQEFKQFMW CIMEEIGRPN Y AD YFPIFG Y VDPFG ARRRFSR YFDQFI
EVFQVIIRERLTHDNNIVGNNNDVLATLLDLYKQNELTMDEINHLLVDIFDAGTDTTASTL
EWAMSELIKNPHIMAKAQEEVRRATMSHGGATVAEIQESDINNLPYIQSIIKETLRLHPPTV
FLLPRKADVDVQLFGYVVPKNAQVLVNLWAIGRDPNVWPDPEVFSPERFMDCEIDVKGR
DFELLPFGAGRRICPGLSLAYRMLNLMLANMVHSFDWKLPGVENGSGSEMDSLDMDEKF
GETLQKVQPLKVIPVSRK (SEQ ID NO: 44).
En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, u otro polipéptido como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido no natural que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, u otro polipéptido como se describe en la presente descripción. En una modalidad, la secuencia CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, es una secuencia modificada. En una modalidad, es una secuencia potenciada. En una modalidad, es una secuencia optimizada.
En una modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende opcionalmente CYP76AD6. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de CYP76AD6 es como se expone en SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 18. En otra modalidad, el CYP76AD6 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 18.
En una modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende opcionalmente CYP76AD15. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de CYP76AD15 es como se expone en SEQ ID NO: 44. En otra modalidad, el CYP76AD15 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 44. En otra modalidad, el CYP76AD15 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 44. En otra modalidad, el CYP76AD15 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 44. En otra modalidad, el CYP76AD15 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 44.
En otra modalidad, el CYP76AD15 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 44.
En una modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende opcionalmente CYP76AD1. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de CYP76AD1 es como se expone en SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoterma de SEQ ID NO: 14.
En otra modalidad, el CYP76AD1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoterma funcional de SEQ ID NO: 14.
En una modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende opcionalmente BvDODAl. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de BvDODAl es como se expone en SEQ ID NO: 42. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 42. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 42. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 42. En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 42.
En otra modalidad, el BVDODA1 usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 42.
En una modalidad, un polipéptido de la presente invención comprende opcionalmente cDOPA5GT. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de cDOPA5GT es como se expone en SEQ ID NO: 43. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo de SEQ ID NO: 43. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es una variante de SEQ ID NO: 43. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es un fragmento de SEQ ID NO: 43. En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es una isoforma de SEQ ID NO: 43.
En otra modalidad, el cDOPA5GT usado en métodos y composiciones de la presente invención es un homólogo funcional, una variante funcional, un fragmento funcional o una isoforma funcional de SEQ ID NO: 43.
En algunas modalidades, "polipéptido", "polipéptido manipulado por ingeniería genética" o "proteína" como se usa en la presente, abarca polipéptidos naturales (productos de degradación, polipéptidos sintetizados sintéticamente o polipéptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, polipéptidos sintetizados sintéticamente), así como también peptoides y semipeptoides que son análogos de polipéptidos, que tienen, en algunas modalidades, modificaciones que hacen que los polipéptidos sean incluso más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar a las células.
En algunas modalidades, las modificaciones incluyen, pero no se limitan a modificación del extremo C terminal, modificación de enlaces polipeptídicos, lo que incluye, pero no se limita a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-Nh , c H=CH o CF=CH, modificaciones de la cadena principal, y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos se conocen bien en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). A continuación se proporcionan más detalles al respecto.
En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos (-CO-NH-) dentro del polipéptido se sustituyen. En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces cetometileno (-CO-CH2-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces tioamida (-CS-NH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por enlaces retro amida (-NH-CO-). En algunas modalidades, los enlaces polipeptídicos se sustituyen por derivados polipeptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", presente naturalmente en el átomo de carbono. En algunas modalidades, estas modificaciones se producen en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena polipeptídica y en una modalidad en varios (2-3 enlaces) al mismo tiempo.
En algunas modalidades, los aminoácidos aromáticos naturales del polipéptido tales como Trp, Tyr y Phe, se sustituyen por ácidos sintéticos no naturales tales como fenilglicina, TIC, naftilelanina (Nol), derivados de Phe metilados en el anillo, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr. En algunas modalidades, los péptidos de la presente invención incluyen uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros que no son aminoácidos (por ejemplo, ácidos grasos, carbohidratos complejos, etcétera).
En una modalidad, "aminoácido" o "secuencia de aminoácidos" se entiende que incluye los 20 aminoácidos naturales; los aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, lo que incluye, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales, lo que incluye, pero no se limita a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, norleucina y ornitina. En una modalidad, "aminoácido" incluye D- y L-aminoácidos.
En algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención se usan en agentes terapéuticos que requieren que los polipéptidos estén en una forma soluble. En algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención incluyen uno o más aminoácidos polares naturales o no naturales, que incluyen, pero no se limita a, serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del polipéptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.
En algunas modalidades, el polipéptido manipulado por ingeniería genética de la presente invención se usa en una forma lineal, aunque un experto en la técnica apreciará que en los casos en los que la ciclación no interfiere severamente con las características de los polipéptidos manipulados por ingeniería genética, también pueden usarse las formas cíclicas de los polipéptidos manipulados por ingeniería genética.
En algunas modalidades, los polipéptidos manipulados por ingeniería genética de la presente invención se sintetizan bioquímicamente tal como mediante el uso de técnicas estándar en fase sólida. En algunas modalidades, estos métodos bioquímicos incluyen síntesis exclusiva en fase sólida, síntesis parcial en fase sólida, condensación de fragmentos, o síntesis clásica en solución.
En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para generar los polipéptidos manipulados por ingeniería genética de la presente invención. En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para la generación de polipéptidos relativamente largos (por ejemplo, más largos que 18-25 aminoácidos). En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para la generación de grandes cantidades de los polipéptidos manipulados por ingeniería genética de la presente invención. En algunas modalidades, las técnicas recombinantes se describen por Bitter y otros, (1987) Methods in Enzymol.
153:516-544, Studier y otros (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson y otros (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu y otros (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi y otros (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli y otros, (1984) Science 224:838-843, Gurley y otros, (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421-463.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido del clado CYP76AD1-p. En una modalidad, el polipéptido del clado CYP76AD1-p es CYP76AD6. En otra modalidad, el polipéptido del clado CYP76AD1-p es CYP76AD15. En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido del clado CYP76AD1-p pero que excluye la secuencia de aminoácidos de los parálogos de CYP76AD1 de la remolacha azucarera conocidos como Bv9_228610_yqeq o Bv9_228860_ickx, que no producen betaxantina cuando se transforman en levadura con DOD. En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido del clado CYP76AD1-p pero que excluye la siguiente secuencia de aminoácidos:
MDN ATLA VILSILF VFYHIFKS FFTNS S S RRLPPGPKP VPIFGNIFDLGEKPHRS FANLS K1HG
PLIS LKLGS VTTIV V S S AS V AEEMFLKNDQ AL ANRTIPDS VRAGDHDKLS MS WLP V S QKW
RNMRKIS A V QLLS NQKLD AS QPLRQTK VKQLLS Y V QDCS KKMQPVDIGR A AFTTS LNLLS
NTFFSIELASHESSASQEFKQLMWNIMEEIGRPNYADFFPILGYIDPFGIRRRLAGYFDKLID
VFQDIIRERQKLRSSNSSGAKQTNDILDTLLKLHEDNELSMPEINHLLVDIFDAGTDTTAST
LEW AM AELVKNPEMMTKV QIEIEQ ALGKDCLDIQES DIS KLP YLQGIIKETLRLHPPT VFLL
PRKADNDVELYGYVVPKNAQVLVNLWAIGRDPKVWKNPEVFSPERFLDCNIDYKGRDFE
LLPFGAGRRICPGLTLAYRMLNLMLATLLQNYNWKLEDGINPKDLDMDEKFGITLQKVK
PLQVIPVPRN (SEQ ID NO: 34).
En una modalidad, la presente invención proporciona métodos que comprenden la etapa de "poner en contacto" la tirosina con uno o más polipéptidos como se describe en la presente descripción. En una modalidad, dicha etapa de poner contacto se realiza in vitro en condiciones que permiten la producción de L-DOPA o betalaínas, como se describe en la presente descripción.
Recuperación de polipéptidos
En una modalidad, los métodos de la presente invención proporcionan además métodos de extracción de betalaínas o L-DOPA a partir de plantas como se describe más abajo en la presente descripción en el Ejemplo 1, así como también el uso de otros métodos de extracción de betalaínas conocidos en la técnica. En otra modalidad, las betalaínas se extraen de cultivos de algas, levaduras o bacterias mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. En una modalidad, el cultivo de algas, levaduras o bacterias se modifica genéticamente para expresar betalaínas o L-DOPA.
En una modalidad, después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recuperación de un polipéptido. En una modalidad, la frase "recuperar el polipéptido" usada en la presente descripción se refiere a recolectar todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no necesariamente implica etapas adicionales de separación o purificación.
En una modalidad, los polipéptidos de la presente invención se purifican mediante el uso de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero no se limita a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía por interacciones hidrofóbicas, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede manipularse por ingeniería genética para codificar el polipéptido de la presente invención y un resto escindible fusionado. En una modalidad, una proteína de fusión puede diseñarse de manera que el polipéptido se pueda aislar fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, mediante inmovilización en una columna específica para el resto escindible. En una modalidad, un sitio de escisión se manipula por ingeniería genética entre el polipéptido genéticamente modificado y el resto escindible y el polipéptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante el tratamiento con una enzima o agente adecuados que escinden específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, ver Booth y otros, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella y otros, J. Biol. Chem.
265:15854-15859 (1990)].
En una modalidad, el polipéptido de la presente invención se recupera en una forma "sustancialmente pura".
En una modalidad, la frase "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso efectivo de la proteína en las aplicaciones descritas en la presente descripción.
En una modalidad, el polipéptido de la presente invención puede sintetizarse, además, mediante el uso de sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro se conocen bien en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.
Los métodos de producción de betaxantinas in vitro mediante el uso de una enzima DOD con su sustrato L-DOPA y la adición de aminoácidos se describieron en Sekiguchi y otros, (2010) (Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 12504-12509). En una modalidad, el presente método de síntesis in vitro de betalaínas es como se describió en Sekiguchi y otros pero con la etapa adicional de sintetizar L-DOPA a partir de tirosina en lugar de proporcionar L-DOPA como se describió en Sekiguchi y otros.
En una modalidad, la producción in vitro de betalaínas rojo púrpura (betacianinas) se realiza mediante el uso de las mismas o similares condiciones que para la producción de betaxantinas, excepto que la enzima CYP76AD1 se proporciona junto con la enzima DOD y el sustrato puede ser tirosina o L-DOPA. En una modalidad, se puede añadir el cofactor NADPH para activar la enzima CYP76AD1.
En algunas modalidades, los polipéptidos recombinantes se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica puede analizarse in vivo o in vitro.
Composiciones Farmacéuticas
En otra modalidad, proporciona una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido recombinante o un polipéptido quimérico de la presente invención. En una modalidad, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención pueden proporcionarse al individuo como parte de una composición farmacéutica donde se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente descripción con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En una modalidad, "ingrediente activo" se refiere al polinucleótido recombinante o al polipéptido quimérico, que es responsable del efecto biológico o bioquímico.
En otras modalidades, la composición comprende componentes adicionales. En una modalidad, dichos componentes adicionales pueden comprender portadores o diluyentes lo que incluye, pero no se limita a, una goma, un almidón (por ejemplo, almidón de maíz, almidón pregelatinizado), un azúcar (por ejemplo, lactosa, manitol, sacarosa, dextrosa), un material celulósico (por ejemplo, celulosa microcristalina), un acrilato (por ejemplo, polimetilacrilato), carbonato de calcio, óxido de magnesio, talco, o mezclas de estos.
En otras modalidades, los portadores farmacéuticamente aceptables para las formulaciones líquidas son soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, emulsiones o aceites. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen una solución salina y medios tamponados. Los ejemplos de aceites son los de origen animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado de pescado, otro aceite marino, o un lípido de la leche o de huevos.
En otra modalidad, los vehículos parenterales (para la inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial, o intramuscular) incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactato y aceites no volátiles. Los vehículos para administración intravenosa incluyen reabastecedores de fluido y nutrientes, reabastecedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. Los ejemplos son líquidos estériles tales como agua y aceites, con o sin la adición de un surfactante y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En general, agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, y glicoles tales como propilenglicoles o polietilenglicol son portadores líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los ejemplos de aceites son los de origen animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado de pescado, otro aceite marino, o un lípido de la leche o de huevos.
En otras modalidades, las composiciones pueden comprender además aglutinantes (por ejemplo, acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, povidona), agentes desintegrantes (por ejemplo, almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, goma guar, glicolato de almidón sódico), tampones (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) de diversos pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de proteasas, surfactantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio), potenciadores de la permeabilidad, agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietilen glicerol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa), agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de silicio coloidal, etilcelulosa, goma guar), edulcorantes (por ejemplo, aspartamo, ácido cítrico), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, lauril sulfato de sodio), adyuvantes de flujo (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo, ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo, carbómero, hidroxipropilcelulosa, laurilsulfato de sodio), recubrimientos de polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes de recubrimiento y formadores de película (por ejemplo, etilcelulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes. Cada uno de los excipientes anteriores representa una modalidad separada de la presente invención.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción son composiciones de liberación controlada, es decir, composiciones en las que el antígeno se libera durante un período de tiempo después de la administración. Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen formulación en depósitos lipofílicos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites). En otra modalidad, la composición es una composición de liberación inmediata, es decir una composición en la que todo el antígeno se libera inmediatamente después de la administración.
En otra modalidad, la composición farmacéutica se suministra en un sistema de liberación controlada. En otra modalidad, el agente se administra mediante el uso de infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En otra modalidad, se usa una bomba (ver Langer, más arriba; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y otros, Surgery 88:507 (1980); Saudek y otros, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). En otra modalidad, se usan materiales poliméricos; por ejemplo, en microesferas en o un implante.
Las composiciones también incluyen, en otra modalidad, la incorporación del material activo dentro o sobre las preparaciones de partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc, o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, eritrocitos fantasmas, o esferoplastos). Dichas composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de aclaramiento in vivo.
También se incluyen en la presente invención las composiciones de partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra los receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos o acoplado a ligandos de los receptores específicos de tejido.
La invención comprende además compuestos modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina. Se conoce que los compuestos modificados exhiben semividas en sangre sustancialmente más largas después de una inyección intravenosa respecto a los compuestos no modificados correspondientes (Abuchowski y otros, 1981; Newmark y otros, 1982; y Katre y otros, 1987). Dichas modificaciones aumentan además, en otra modalidad, la solubilidad del compuesto en solución acuosa, eliminar la agregación, potenciar la estabilidad física y química del compuesto, y reducir grandemente la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. En otra modalidad, la actividad biológica in vivo deseada se logra mediante la administración de dichos aductos de polímero-compuesto con menos frecuencia o en dosis más bajas que con el compuesto sin modificar.
La preparación de composiciones farmacéuticas que contienen un componente activo, por ejemplo, mediante procesos de mezclado, granulado, o conformación de tabletas, se entiende bien en la técnica. Un componente activo, en otra modalidad, se formula dentro de la composición como formas de sales farmacéuticamente aceptables neutralizadas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácidas (formadas con los grupos amino libres de la molécula de polipéptido o anticuerpo), que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas de los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y similares.
Cada uno de los aditivos, excipientes, formulaciones y métodos de administración anteriores representa una modalidad separada de la presente invención.
En una modalidad, los métodos de la presente invención comprenden administrar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención en un portador farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el polipéptido, en otra modalidad, pueden administrarse a un sujeto mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, tal como por vía parenteral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, intracraneal o intravaginal. En otra modalidad, las composiciones de la presente invención se administran mediante inyección epidérmica, en otra modalidad, inyección intramuscular, en otra modalidad, inyección subcutánea, y en otra modalidad, inyección en la mucosa intrarrespiratoria.
En otra modalidad, de los métodos y composiciones de la presente invención, las composiciones farmacéuticas se administran por vía oral, y por tanto se formulan en una forma adecuada para la administración oral, es decir como una preparación sólida o líquida. Las formulaciones orales sólidas adecuadas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, granulados, gránulos y similares. Las formulaciones orales líquidas adecuadas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En otra modalidad, de la presente invención, la composición se formula en una cápsula. En otra modalidad, las composiciones de la presente invención comprenden una cápsula de gelatina dura.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran mediante inyección intravenosa, intraarterial, o intramuscular de una preparación líquida. Las formulaciones líquidas adecuadas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intravenosa. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intraarterial y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intramuscular y por tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intramuscular.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía tópica a las superficies corporales y por tanto se formulan en una forma adecuada para la administración tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares.
En otra modalidad, la composición farmacéutica se administra como un supositorio, por ejemplo, un supositorio rectal o un supositorio uretral. En otra modalidad, la composición farmacéutica se administra por implantación subcutánea de un gránulo. En otra modalidad, el gránulo proporciona la liberación controlada de un agente antigénico durante un período de tiempo.
En otra modalidad, la composición farmacéutica se suministra en una vesícula, por ejemplo, un liposoma.
Regeneración de plantas
En una modalidad, una planta transgénica de la presente invención se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión del constructo o constructos de ADN recombinante. La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplastos de una sola planta o de diversos explantes transformados se conoce bien en la técnica (ver Weissbach y Weissbach, En.: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), 1988 Academic Press, Inc., San Diego, California.). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye típicamente las etapas de selección de células transformadas, cultivo de esas células individualizadas a través de las etapas habituales de desarrollo embrionario hasta la etapa de plántula enraizada. Los embriones y semillas transgénicos se regeneran de manera similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan después en un medio de crecimiento de plantas apropiado tal como suelo.
Después de la transformación, las células vegetales transformadas con un vector de expresión vegetal pueden regenerarse, por ejemplo, a partir de células individuales, tejido calloso o discos foliares de acuerdo con técnicas estándar de cultivo de tejido vegetal. Casi cualquier planta puede regenerarse completamente a partir de células, tejidos y órganos de la planta mediante el uso de métodos que se conocen en la técnica.
A continuación, las plantas transformadas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante tiene la expresión de la característica fenotípica deseada identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y se herede de manera estable y después se cosechan las semillas para garantizar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada.
En una modalidad, se regenera una célula vegetal para obtener una planta completa a partir del proceso de transformación. El término "cultivo" o "regeneración", como se usa en la presente descripción, significa cultivar una planta completa a partir de una célula vegetal, un grupo de células vegetales, una parte de una planta (lo que incluye las semillas) o una pieza de la planta (por ejemplo, a partir de un protoplasto, callo o parte del tejido).
La regeneración a partir de protoplastos varía de una especie a otra de plantas, pero generalmente se hace primero una suspensión de protoplastos. En ciertas especies, se puede inducir después la formación de embriones a partir de la suspensión de protoplastos. En una modalidad, los medios de cultivo contendrán diversos aminoácidos y hormonas, necesarios para el crecimiento y la regeneración. Los ejemplos de hormonas usadas incluyen auxinas y citoquininas. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si se controlan estas variables, la regeneración es reproducible. La regeneración también se produce a partir de callos, explantes, órganos o partes de plantas.
En los cultivos de propagación de manera vegetativa, las plantas genéticamente modificadas maduras se propagan mediante el uso de esquejes o técnicas de cultivo de tejidos para producir múltiples plantas idénticas. Se realiza la selección de plantas genéticamente modificadas convenientes y se obtienen nuevas variedades y se propagan de manera vegetativa para su uso comercial.
En los cultivos propagados por semillas, las plantas genéticamente modificadas maduras pueden autocruzarse para producir una planta endogámica homocigótica. La planta endogámica resultante produce semillas que contienen la mutación genética. Estas semillas pueden cultivarse para producir plantas que produzcan el fenotipo seleccionado, por ejemplo, mayor crecimiento de raíces laterales, captación de nutrientes, crecimiento general de la planta y/o rendimientos vegetativos o reproductivos.
Las partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, frutos y similares, se incluyen en la invención, siempre y cuando estas partes comprendan células que comprenden el ácido nucleico aislado de la presente invención. La progenie y variantes y mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de la invención, siempre y cuando estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico introducidas. En una modalidad, las plantas genéticamente modificadas que expresan un marcador seleccionable pueden examinarse para detectar la transmisión del ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, mediante técnicas estándar de inmunoelectrotransferencia y detección de ADN. En otra modalidad, las células vegetales genéticamente modificadas pueden evaluarse en los niveles de expresión del ácido nucleico genéticamente modificado. La expresión a nivel de ARN puede determinarse inicialmente para identificar y cuantificar las plantas con expresión positiva. Pueden emplearse técnicas estándar para el análisis de ARN e incluyen ensayos de amplificación por PCR mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos diseñados para amplificar solo las plantillas de ARN genéticamente modificadas y ensayos de hibridación en solución mediante el uso de sondas específicas de ácido nucleico genéticamente modificadas. A continuación, las plantas positivas para el ARN pueden analizarse para determinar la expresión de proteínas mediante análisis de inmunoelectrotransferencia mediante el uso de los anticuerpos específicamente reactivos de la presente invención. Además, la hibridación in situ y la inmunocitoquímica de acuerdo con protocolos estándar pueden realizarse mediante el uso de sondas de polinucleótidos específicos de ácido nucleico modificados genéticamente y anticuerpos, respectivamente, para localizar sitios de expresión dentro del tejido genéticamente modificado. En una modalidad, se analizan varias líneas genéticamente modificadas para detectar el ácido nucleico incorporado para identificar y seleccionar las plantas con los perfiles de expresión más apropiados.
En una modalidad, la presente invención proporciona una planta genéticamente modificada que es homocigótica para el ácido nucleico introducido; es decir, una planta genéticamente modificada que contiene dos secuencias de ácido nucleico añadidas, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta genéticamente modificada homocigótica puede obtenerse mediante el apareamiento sexual (autofecundación) de una planta genéticamente modificada heterocigótica que contiene un solo ácido nucleico genéticamente modificado añadido, la germinación de algunas de las semillas producidas y el análisis de las plantas resultantes producidas para determinar la expresión alterada de un polinucleótido de la presente invención con relación a una planta de control (es decir, natural, no modificada genéticamente). También se contemplan el retrocruzamiento con una planta original y el cruzamiento exogámico con una planta no modificada genéticamente.
Las células vegetales transformadas que se obtienen mediante cualquiera de las técnicas de transformación anteriores pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posee el genotipo transformado. En una modalidad, dichas técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejidos.
Las plantas regeneradas que contienen el gen exógeno extraño que codifica una proteína de interés pueden propagarse posteriormente como se conoce bien en la técnica. El método particular de propagación dependerá del tejido vegetal inicial y de la especie de planta particular que se va a propagar.
En una modalidad, las plantas transformadas generadas se propagan clonalmente. En otra modalidad, las plantas transformadas generadas se propagan mediante técnicas de reproducción clásicas. En una modalidad particular, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas. De cualquier otra manera, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas cultivadas con semillas de líneas agronómicamente importantes, o el polen de plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva mediante el uso de métodos bien conocidos para un experto en la técnica.
Productos de plantas genéticamente modificadas
En una modalidad, la presente invención proporciona un cultivo alimentario que comprende betalaínas. En una modalidad, el cultivo alimentario no comprende de forma endógena betalaínas. En otra modalidad, el cultivo alimentario comprende de forma endógena betalaínas y los métodos de la presente invención sirven para aumentar o potenciar la cantidad de betalaínas presentes en el cultivo alimentario.
En una modalidad, se potencia nutricionalmente un cultivo alimentario que comprende betalaínas o cantidades potenciadas de betalaínas. En una modalidad, un cultivo alimentario que comprende betalaínas o cantidades potenciadas de betalaínas comprende propiedades antioxidantes. En una modalidad, el consumo de un cultivo alimentario que comprende betalaínas o cantidades potenciadas de betalaínas protege a un sujeto de enfermedades o afecciones degenerativas. En una modalidad, el consumo de betalaínas o cultivos alimentarios que contienen betalaínas puede proteger a un sujeto del cáncer (por ejemplo, de piel, pulmón, cuello uterino, ovario y vejiga), cardiopatía o enfermedades neurodegenerativas. Las betalaínas también pueden inhibir la peroxidación de lípidos y la descomposición del hemo; prevenir la hemólisis oxidativa de los glóbulos rojos; y se unen a las lipoproteínas de baja densidad humanas lo que aumenta su resistencia a la oxidación.
En una modalidad, la presente invención proporciona frutas que comprende betalaínas de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona vegetales que comprenden betalaínas de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona órganos subterráneos, tales como papas, que comprenden betalaínas de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona jugos derivados de frutas o vegetales que comprenden betalaínas de la presente invención.
En una modalidad, los órganos de la planta o derivados de estos (tal como el jugo) comprenden, además de las betalaínas de la presente invención, antocianinas, carotenos naturales o manipulados por ingeniería genética, o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un suplemento dietético que comprende una betalaína producida mediante los métodos como se describe en la presente descripción o una planta o parte de una planta como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un aleloquímico que comprende L-DOPA producido mediante los métodos como se describen en la presente descripción o una planta o parte de una planta como se describe en la presente descripción.
Usos adicionales
La producción heteróloga de betalaínas permite la biofortificación y potenciación de las cualidades nutricionales de alimentos esenciales, así como también el desarrollo de nuevas variedades de plantas ornamentales. La vía biosintética simple de estos pigmentos, que se inicia desde el precursor ubicuo tirosina y requiere la expresión de dos o tres genes, permite la producción de estos pigmentos en numerosas especies de plantas u otras especies.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una planta ornamental, que comprende la etapa de: poner en contacto una célula vegetal con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una secuencia de ácido nucleico que codifica DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y en condiciones suficientes para producir betalaínas, en donde si dicha célula se pone en contacto con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y DOD y no con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6 o CYP76AD15, entonces dicha célula se pone en contacto con una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, lo que produce de esta manera una planta ornamental. En una modalidad, la planta no es una planta que expresa betalaína naturalmente. En una modalidad, la planta no es una planta Caryophyllales. En una modalidad, la especie de planta es: Syngonium Podophyllum, Nephrolepis Exaltata 'Bostoniensis", Phoenix Canariensis, Aglaonema, Asplenium Nidus, Rhapis Excelsa, Aspidistra Elatior, Nertera Granadensis, Pteris Cretica, Dieffenbachia Amoena, Chamaerops Humilis, Epipremnum Aureum, Codiaeum Variegatum, Alocasia Amazonica, Fiddle Leaf Fig - Ficus Lyrata, Alocasia Micholitziana, Philodendron Scandens, Dracaena Braunii, Adiantum Raddianum, Chamaedorea Elegans, Howea Forsteriana, Dracaena Marginata, Pachira Aquatica, Calathea Makoyana, Davallia Fejeensis, Calathea Roseopicta, Cycas Revoluta, Dracaena Reflexa, Calathea Lancifolia, Ficus Elastica, Howea Belmoreana, Planta araña-Chlorophytum comosum, Dionaea Muscipula, Peperomia Argyela, Aphelandra Squarrosa, Zamioculcas Zamiifolia, Tradescantia, Ficus Benjamina, Calathea Zebrina, o un cactus.
En una modalidad, cambiar el color de una planta, y en particular el color de una flor de una planta, afectará a la polinización de la planta. En una modalidad, los métodos de la presente invención aumentarán o potenciarán la polinización de una planta. En otra modalidad, los métodos de la presente invención disminuirán la polinización de una planta. En otra modalidad, los métodos de la presente invención cambiarán los organismos que son atraídos por la planta, lo que cambia de esta manera la polinización de una planta. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar la polinización de una planta que comprende la etapa de insertar un polinucleótido recombinante o uno o más ácidos nucleicos de la presente invención en al menos una célula de dicha planta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar la polinización de una planta, que comprende la etapa de: poner en contacto una planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que cambia de esta manera el color de la planta, lo que aumenta de esta manera la polinización de una planta. En una modalidad, la planta no es una planta que expresa betalaína naturalmente. En una modalidad, la planta no es una planta Caryophyllales.
En otra modalidad, los métodos de la presente invención proporcionan métodos para cambiar el color de un organismo. En una modalidad, el organismo es un pez.
En otra modalidad, los métodos de la presente invención proporcionan un método para producir un organismo en el que una o más partes de dicho organismo son de color rojo púrpura que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de dicho organismo con un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos se insertan en el marco del polinucleótido.
En otra modalidad, los métodos de la presente invención proporcionan un método para producir un organismo en el que una o más partes de dicho organismo son amarillas y comprende la etapa de poner en contacto una o más células de dicho organismo con un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un CYP76AD6 y un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en donde dichos ácidos nucleicos se insertan en el polinucleótido en marco.
En otra modalidad, los métodos de la presente invención proporcionan un método para producir un organismo en el que una o más partes de dicho organismo son de color naranja, que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de dicho organismo con un polinucleótido recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica a CYP76AD6, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en donde dichos ácidos nucleicos se insertan en el polinucleótido en marco.
En una modalidad, el organismo es un pez. En una modalidad, el pez es un pez ornamental.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un pez ornamental que comprende poner en contacto una célula de un pez con un polinucleótido que codifica un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, un ácido nucleico que codifica CYP76AD15, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en donde si dicha célula se pone en contacto con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y un ácido nucleico que codifica DOD y no un ácido nucleico que codifica CYP76AD6 o un ácido nucleico que codifica CYP76AD15, dicha célula también se pone en contacto con un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir una planta que expresa una betalaína, que comprende la etapa de: poner en contacto una o más células de dicha planta con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), examinar dicha una o más células para identificar células que comprenden dichas secuencias de ácido nucleico y regenerar plantas o partes de plantas a partir de dichas células, lo que produce de esta manera una planta que expresa una betalaína.
En una modalidad, la planta no expresa naturalmente una betalaína. En otra modalidad, la planta expresa una betalaína y los métodos de la presente invención se usan para aumentar la cantidad de una o más betalaínas que se expresa por la planta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir un cultivo alimentario que expresa una betalaína, que comprende la etapa de: poner en contacto una o más células de una planta de cultivo alimentario con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, y una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), examinar dicha una o más células para identificar células que comprenden dichas secuencias de ácido nucleico, y regenerar plantas o partes de plantas a partir de dichas células, lo que produce de esta manera un cultivo alimentario que expresa una betalaína.
En una modalidad, un "cultivo alimentario" o un "cultivo agrícola" es una planta cultivada intencionalmente con el propósito principal de ser consumida por seres humanos o animales. En una modalidad, el cultivo alimentario es plátano, ñame, sorgo, boniato, soya, yuca, arroz, trigo o maíz. En otra modalidad, el cultivo alimentario es berenjena, pimiento, brócoli, calabresa, trigo sarraceno, maíz, cebada, uvas, bayas, tomates, pepinos, alcachofa, cebolla, ruibarbo, moras, arándanos, calabacín, rábanos, zanahorias, coles de Bruselas, lechuga, melones, frijoles, guisantes, granos, maní, caña de azúcar, sandía, papaya, manzana, pera, durazno, cereza, fresa o calabaza.
En una modalidad, la fuerte actividad antioxidante de las betalaínas es beneficiosa para la salud humana.
Se han estudiado ampliamente por sus posibles propiedades promotoras de la salud, lo que incluye las actividades anticancerígenas, hipolipidémicas, antiinflamatorias, hepatoprotectoras y antidiabéticas. Por tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o suprimir el cáncer, la hiperlipidemia, la inflamación, la enfermedad hepática y la diabetes que comprende la etapa de alimentar a un sujeto que lo necesita con una planta o parte de la planta de la presente invención, que expresa betalaínas, betacianinas y/o betaxantinas, lo que trata o suprime de esta manera el cáncer, la hiperlipidemia, la inflamación, la enfermedad hepática o la diabetes en dicho sujeto.
En una modalidad, la ingestión por un sujeto de un cultivo alimentario de la presente invención que comprende betalaínas o cantidades potenciadas de betalaínas protege a los sujetos contra lesiones inflamatorias-inmunes (lo que incluye, pero no se limita a, glomerulonefritis, vasculitis, enfermedad autoinmune, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, artritis reumatoidea, enfermedad inflamatoria del intestino, pancreatitis); cáncer (lo que incluye, pero no se limita a, cáncer inducido por radiación, carcinoma de cuello uterino, carcinoma hepatocelular, promotores de la carcinogénesis, cáncer en la enfermedad inflamatoria del intestino); isquemia/reoxigenación (lo que incluye, pero no se limita a, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, trasplante de órganos (corazón, pulmón, piel, córnea, riñón), preservación de órganos, reinserción de extremidades amputadas, congelación, contractura de Dupuytren, choque hemorrágico, choque endotóxico, lesión por aplastamiento); sobrecarga de metales (lo que incluye, pero no se limita a, hemocromatosis, talasemia, kwashiorkor, quimioterapia para leucemias, insuficiencia hepática fulminante, enfermedad de Wilson, sobrecarga de hierro inducida por alcohol, carcinogénesis inducida por níquel, envenenamiento por plomo); toxinas (lo que incluye, pero no se limita a, fármacos hemolíticos, plomo, hidrocarburos halogenados, ozono, óxidos de nitrógeno, amianto, otros polvos minerales, dióxido de azufre, paraquat, aluminio, humo de cigarrillo, fármacos diabetogénicos, habas (agentes hemolíticos), antraciclinas (cardiotoxicidad), metales pesados (nefrotoxicidad), medicamentos fotosensibilizantes, dermatitis por contacto); trastornos oculares (lo que incluye, pero no se limita a, desarrollo de cataratas, deterioro después de una hemorragia ocular, daño fotoquímico de la retina, retinopatía del prematuro (fibroplasia retrolental)); enfermedad congénita (lo que incluye, pero no se limita a, porfirias, anemia de células falciformes, anemia de Fanconi, lipofuscinosis ceroide neuronal, talasemia); protección antioxidante insuficiente (lo que incluye, pero no se limita a, enfermedad de Keshan (deficiencia severa de selenio), enfermedad hemolítica del prematuro, retinopatía del prematuro, displasia broncopulmonar, hemorragia intracraneal, degeneración neurológica debido a deficiencia severa de vitamina E (en errores congénitos que afectan la absorción de grasa intestinal), síndrome de inmunodeficiencia adquirida); trastornos del cerebro y del sistema nervioso central (lo que incluye, pero no se limita a, accidente cerebrovascular, traumatismos, neurotoxicidades (por ejemplo, del aluminio), efectos del oxígeno hiperbárico, enfermedad de Parkinson, potenciación de lesiones traumáticas, paludismo cerebral).
En otra modalidad, la presente invención proporciona nuevas formas de producir betalaínas en especies que no expresan betalaínas naturalmente, en las que las betalaínas pueden usarse como un colorante alimentario natural. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un colorante alimentario natural que comprende betalaínas producidas como se describe en la presente descripción. En una modalidad, las betalaínas se extraen de plantas que expresan betalaína como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, las betalaínas se producen in vitro en una línea celular. La producción heteróloga de betalaínas permite la biofortificación y potenciación de las cualidades nutricionales de los alimentos esenciales.
En otra modalidad, los métodos de la presente invención pueden usarse para potenciar la calidad estética de un cultivo o producto alimentario al cambiar su color mediante la manipulación por ingeniería genética de una planta para expresar una o más betalaínas.
Por tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona métodos para tratar o suprimir las enfermedades, los trastornos y las afecciones mencionadas anteriormente que comprenden la etapa de proporcionar a un sujeto un cultivo alimentario que se ha modificado genéticamente para expresar betalaínas, como se describe en la presente descripción. En otra modalidad, la presente invención proporciona usos de polinucleótidos, ácidos nucleicos y otras composiciones descritas en la presente descripción en la preparación de una composición para tratar o suprimir las enfermedades, los trastornos y las afecciones mencionadas anteriormente. En una modalidad preferida, la composición es una composición farmacéutica. En otra modalidad, la presente invención proporciona polinucleótidos, ácidos nucleicos y otras composiciones descritas en la presente descripción para su uso en el tratamiento o supresión de las enfermedades, los trastornos y las afecciones mencionadas anteriormente en la presente descripción.
En otra modalidad, un cultivo alimentario que comprende betalaínas o cantidades potenciadas de betalaínas tiene una mayor vida útil en comparación con el mismo cultivo alimentario que carece de betalaínas o que tiene un nivel más bajo de betalaínas. En otra modalidad, un cultivo alimentario que comprende betalaínas o cantidades potenciadas de betalaínas tiene mayor resistencia a enfermedades fúngicas en comparación con el mismo cultivo alimentario que carece de betalaínas o que tiene un nivel más bajo de betalaínas.
En otra modalidad, las betalaínas producidas mediante los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para la conservación de alimentos.
Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención proporciona métodos para aumentar la vida útil de un cultivo alimentario que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de una planta de cultivo alimentario que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y aumenta la vida útil de dicho cultivo alimentario.
Dentro del reino vegetal, las betalaínas se encuentran en un solo grupo de angiospermas, las Caryophyllales. En este orden, las betalaínas y las antocianinas se presentan de forma mutuamente excluyente, es decir, ninguna especie vegetal produce ambos tipos de pigmentos. Una de las características más destacadas del orden Caryophyllales es su dominancia en regiones áridas y semiáridas, y su asentamiento en suelos salinos y alcalinos. Si bien algunas familias dentro de los Caryophyllales se distribuyen en todo el mundo en una variedad de hábitats, los miembros de varias familias están particularmente adaptados a las regiones áridas o salinas, lo que incluye las Aizoaceae (familia de las plantas de hielo), Portulacaceae (familia de las verdolagas) y, en particular, las Cactaceae (familia de los cactus; www.britannica.com/plant/Caryophyllales). Más abajo en la presente descripción, se usó la producción de betalaína heteróloga en plantas para estudiar las funciones de estos pigmentos en conferir tolerancia a diferentes señales de estrés abiótico que están asociadas con regiones áridas tales como sequía, alta radiación ultravioleta, exceso de luz y alta salinidad y como compuestos de defensa de las plantas que actúan contra hongos patógenos.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para aumentar la resistencia de un organismo o parte de un organismo a uno o más factores de estrés que comprenden la etapa de poner en contacto una o más células de dicho organismo con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y aumenta la resistencia de dicho organismo o dicha parte de un organismo a dichos uno o más factores de estrés. En una modalidad, el organismo es una planta. En una modalidad, el organismo comprende tirosina. En una modalidad, el factor de estrés es un factor de estrés abiótico. En otra modalidad, el factor de estrés es una presión osmótica alta, un estado de salinidad alta o una de sus combinaciones. En otra modalidad, el factor de estrés es la sequía. En otra modalidad, el factor de estrés es el exceso de luz. En una modalidad, la parte de la planta es una semilla. En una modalidad, la planta es un cultivo alimentario.
En una modalidad, el método comprende la etapa de poner en contacto una o más células de una planta o parte de una planta con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para aumentar la resistencia de una planta o parte de una planta a una presión osmótica alta que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de una planta o parte de una planta que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y aumenta la resistencia de dicha planta o parte de la planta a una presión osmótica alta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para aumentar la resistencia de una planta o parte de una planta a condiciones de alta salinidad que comprenden la etapa de poner en contacto una o más células de una planta o parte de una planta que comprende tirosina con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y aumenta la resistencia de dicha planta o parte de la planta a condiciones de alta salinidad.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar las tasas de germinación de semillas en una planta que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de una planta o parte de una planta con un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica DODA1 y un ácido nucleico que codifica cDOPA5GT, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que aumenta de esta manera las tasas de germinación de las semillas en dicha planta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para aumentar la resistencia de un organismo o parte de un organismo a una o más enfermedades fúngicas que comprenden la etapa de poner en contacto una o más células de dicho organismo con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y aumenta la resistencia de dicho organismo o dicha parte de un organismo a dichas una o más enfermedades fúngicas. En una modalidad, el organismo comprende tirosina. En una modalidad, el organismo es una planta. En una modalidad, la planta es un cultivo alimentario.
En una modalidad, el hongo que provoca dicha enfermedad fúngica es un hongo fitopatógeno. En una modalidad, el hongo que provoca dicha enfermedad fúngica es Botrytis cinerea. En una modalidad, la planta es una planta de tabaco. En una modalidad, la parte de la planta es la hoja.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para aumentar la resistencia de una planta o parte de una planta a una o más enfermedades fúngicas que comprenden la etapa de poner en contacto una o más células de una planta o parte de una planta con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y aumenta la resistencia de dicha planta o parte de la planta a una o más enfermedades fúngicas. En una modalidad, la planta es un cultivo alimentario.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para disminuir el área de la lesión debido a una enfermedad fúngica en una planta o parte de una planta que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de dicha planta o parte de la planta con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y reduce de esta manera dicha área de lesión debido a una enfermedad fúngica en dicha planta o parte de la planta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para disminuir la necrosis debida a una enfermedad fúngica en una planta o parte de una planta que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de dicha planta o parte de la planta con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, en condiciones suficientes para producir betalaínas, lo que produce de esta manera betalaínas y disminuye de esta manera la necrosis debida a una enfermedad fúngica en dicha planta o parte de la planta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento de especies de plantas cerca de una primera planta o parte de una planta que comprende la etapa de poner en contacto una o más células de dicha primera planta o parte de una planta con un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-p, en condiciones suficientes para producir y secretar L-DOPA, lo que inhibe de esta manera el crecimiento de especies de plantas cercanas a dicha primera planta o parte de la planta. En una modalidad, la especie de planta es una especie de planta heteróloga a la primera planta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos de crecimiento alelopático de un organismo que comprenden la etapa de poner en contacto una o más células de un organismo o parte de este con un ácido nucleico que codifica un gen del ciado CYP76AD1-p, en condiciones suficientes para que dicho organismo o parte de este produzca y secrete L-DOPA, lo que permite de esta manera el crecimiento alelopático de dicho organismo. En una modalidad, la alelopatía es un fenómeno biológico mediante el cual un organismo produce uno o más compuestos bioquímicos que influyen en la germinación, el crecimiento, la supervivencia y la reproducción de otros organismos.
En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para el control de malezas que comprenden la etapa de poner en contacto una o más células de una planta o parte de una planta con un ácido nucleico que codifica un gen del clado CYP76AD1-p, en condiciones suficientes para que dicha planta o parte de la planta produzca y secrete L-DOPA, lo que inhibe de esta manera el crecimiento de malezas cerca de dicha planta o parte de la planta.
En una modalidad, la etapa de poner en contacto una o más células de una planta o parte de una planta con un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en condiciones suficientes para producir betalaínas comprende poner en contacto dichas una o más células con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, un ácido nucleico que codifica una DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), y un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína. En una modalidad, la dOd es DODA1 de Beta vulgaris. En una modalidad, la glucosiltransferasa relacionada con la betalaína es ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa o betanidin-5-O-glucosiltransferasa. En una modalidad, la ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa es gen ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa de M. jalapa (cDOPA5GT).
En una modalidad, un polinucleótido comprende los ácidos nucleicos. En una modalidad, el polinucleótido es pX11. En otra modalidad, el polinucleótido es pX12. En otra modalidad, el polinucleótido es pX13.
En una modalidad, las especies que expresan pX11 exhibieron un color predominantemente rojo púrpura debido a la producción de mayores cantidades de betacianinas que de betaxantinas.
La invención descrita en la presente descripción tiene numerosas aplicaciones en varias industrias diversas, lo que incluye, por ejemplo, pero no se limita a, la agricultura, los alimentos y bebidas, los productos farmacéuticos, los cosméticos, los textiles y los productos de consumo.
En una modalidad, las aplicaciones de la presente invención incluyen la producción de betalaínas y/o L-DOPA para alimentos para peces. En otra modalidad, la producción de betalaínas y/o L-DOPA es para su inclusión en un suplemento alimenticio. En una modalidad, el suplemento alimenticio es para seres humanos. En otra modalidad, el suplemento alimenticio es para animales no humanos. En otra modalidad, el suplemento alimenticio es para uso veterinario. En otra modalidad, el suplemento alimenticio es para acuicultura. En otra modalidad, el suplemento alimenticio se presenta en forma de una vitamina. En otra modalidad, el suplemento alimenticio se añade a la leche u otros productos lácteos.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar una o más betalaínas en un producto lácteo que comprende las etapas de a) poner en contacto una célula bacteriana con un polinucleótido que codifica un ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD) y un ácido nucleico que codifica CYP76AD6, un ácido nucleico que codifica CYP76AD15, un ácido nucleico que codifica CYP76AD1, o una de sus combinaciones, en donde si dicha célula se pone en contacto con un ácido nucleico que codifica CYP76AD1 y un ácido nucleico que codifica DOD y no un ácido nucleico que codifica CYP76AD6 o un ácido nucleico que codifica CYP76AD15, dicha célula también se pone en contacto con un ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína, y b) fermentar un producto lácteo con bacterias cultivadas a partir de dicha célula, lo que aumenta de esta manera una o más betalaínas en dicho producto lácteo. En una modalidad, la bacteria es una bacteria usada en la fermentación para la preparación de productos lácteos. En una modalidad, la bacteria es un Lactobacillus.
En otro aspecto, los genes de la invención pueden transformarse en una planta o una célula vegetal para proteger contra uno o más factores de estrés biótico tales como, por ejemplo, pero no se limita a, hongos, bacterias y virus y/o uno o más factores de estrés biótico tales como, por ejemplo, pero no se limita a, calor, frío, sal, sequía y exposición ultravioleta.
En una modalidad, un órgano vegetal que expresa un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede servir como tinte, colorante o pigmento alimentario. En otra modalidad, un producto derivado de un órgano vegetal que expresa un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede servir como tinte, colorante o pigmento alimentario.
En otra modalidad, el jugo de la fruta transformada puede extraerse de dicha fruta para hacer bebidas. En otra modalidad, el jugo u otro extracto de un órgano vegetal que expresa un polinucleótido o polipéptido de la presente invención puede servir como tinte, colorante o pigmento alimentario. En una modalidad, dicho jugo puede usarse para teñir yogur, dulces, chicles, helados y similares. Dicho colorante o agente colorante también puede usarse en la industria textil para teñir ropas.
En otra modalidad, un extracto de una planta o célula vegetal transgénica como se describe en la presente descripción puede rociarse sobre plantas vulnerables para protegerlas del estrés biótico y abiótico, como se describió anteriormente en la presente descripción. Por tanto, la presente invención incluye tanto un extracto de una planta o cultivo alimentario como se describe en la presente descripción, así como también un método para proteger una planta del estrés biótico, estrés abiótico o una de sus combinaciones que comprende poner en contacto dicha planta con una planta o extracto vegetal producido mediante los métodos de la presente invención como se describe en la presente descripción.
En otra modalidad, la producción de betalaínas y/o L-DOPA es para usos cosméticos. En una modalidad, la producción de betalaínas y/o L-DOPA es para su inclusión en protectores solares. En otra modalidad, se producen en levadura betalaínas y/o L-DOPA para su uso en protectores solares.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar, inhibir, suprimir o prevenir un trastorno sensible a la dopamina en un sujeto que comprende la etapa de administrar un cultivo alimentario, célula o línea celular que comprende altos niveles de un polipéptido del clado CYP76AD1-p, lo que proporciona de esta manera a dicho sujeto L-DOPA, lo que trata, inhibe, suprime o previene de esta manera el trastorno sensible a la dopamina en dicho sujeto.
En otra modalidad, la presente invención proporciona el uso de un gen del clado CYP76AD1-p o un cultivo alimentario, célula o línea celular que comprende altos niveles de dicho gen del clado CYP76AD1-p en la preparación de una composición para tratar o inhibir un trastorno sensible a la dopamina en un sujeto.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un gen del clado CYP76AD1-p o un cultivo alimentario, célula o línea celular que comprende altos niveles de dicho gen del clado CYP76AD1-p para tratar o inhibir un trastorno sensible a la dopamina en un sujeto.
En una modalidad, el polipéptido del clado CYP76AD1-p es CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones. En una modalidad, dicho trastorno sensible a la dopamina es la enfermedad de Parkinson, la distonía sensible a la dopamina o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar, inhibir, suprimir o prevenir la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en un sujeto, que comprende proporcionar a dicho sujeto una planta que expresa tirosina o una parte de la planta genéticamente modificada para expresar CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, lo que proporciona de esta manera a dicho sujeto L-DOPA, lo que trata, inhibe, suprime o previene de esta manera la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en dicho sujeto.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar, inhibir, suprimir o prevenir la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en un sujeto, que comprende administrar una enzima CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, a dicho sujeto, opcionalmente con fenilalanina o tirosina, lo que produce de esta manera L-DOPA a partir de tirosina, lo que trata, inhibe, suprime o previene de esta manera la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en dicho sujeto.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para suprimir los síntomas, estabilizar los síntomas, retrasar el inicio y/o ralentizar la progresión de la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en un sujeto, que comprende proporcionar a dicho sujeto una planta o parte de la planta genéticamente modificada que expresa tirosina para expresar CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, lo que proporciona de esta manera a dicho sujeto L-DOPA, lo que de esta manera suprime los síntomas, estabiliza los síntomas, retrasa el inicio y/o ralentiza la progresión de la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en dicho sujeto. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para suprimir los síntomas, estabilizar los síntomas, retrasar el inicio y/o ralentizar la progresión de la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en un sujeto, que comprende administrar una enzima CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones, a dicho sujeto, opcionalmente con fenilalanina o tirosina, lo que produce de esta manera L-DOPA a partir de tirosina, lo que de esta manera suprime los síntomas, estabiliza los síntomas, retrasa el inicio y/o ralentiza la progresión de la enfermedad de Parkinson o la distonía sensible a la dopamina en dicho sujeto.
En una modalidad, la enfermedad de Parkinson es enfermedad de Parkinson idiopática, parkinsonismo postencefalítico o parkinsonismo sintomático.
En una modalidad, al sujeto se le administra adicionalmente un inhibidor de la DOPA descarboxilasa periférica (DDCI). En una modalidad, el DDCI es carbidopa, una benserazida o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, al sujeto se le administra adicionalmente piridoxina.
En una modalidad, la administración de la enzima CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, y/o la L-DOPA producida por la enzima CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, como se describe en la presente descripción, es mediante la administración oral. En otra modalidad, la administración es mediante un catéter. En otra modalidad, la enzima se administra por vía epidural, intracerebral o intracerebroventricular. Más abajo en la presente descripción se describen otros métodos de administración adecuados.
De acuerdo con cualquiera de los métodos de la presente invención y en una modalidad, el sujeto es un ser humano. En otra modalidad, el sujeto es murino, que en una modalidad es un ratón, y, en otra modalidad, es una rata. En otra modalidad, el sujeto es canino, felino, bovino, ovino o porcino. En otra modalidad, el sujeto es un mamífero. En otra modalidad, el sujeto es cualquier organismo susceptible a la enfermedad de Parkinson.
En una modalidad, los métodos de la presente invención se emplean en medicina veterinaria. En una modalidad, la presente invención proporciona el tratamiento de mamíferos domésticos que se mantienen como compañeros de los humanos (por ejemplo, perros, gatos, caballos), que tienen un valor comercial significativo (por ejemplo, vacas lecheras, ganado vacuno, animales deportivos), que tienen un valor científico significativo (por ejemplo, especímenes cautivos o libres de especies en peligro de extinción), o que tienen valor de cualquier otra manera. En una modalidad, los métodos de la presente invención incluyen el uso de las composiciones para tratar y/o prevenir una enfermedad, trastorno o afección. En una modalidad, los métodos de la presente invención incluyen tanto un tratamiento terapéutico como medidas preventivas o profilácticas, en donde el objetivo es prevenir o aliviar la afección o trastorno patológico objetivo como se describió anteriormente en la presente descripción. Por tanto, en una modalidad, los métodos de la presente invención pueden incluir directamente afectar o curar, suprimir, inhibir, prevenir, reducir la gravedad de, retrasar el inicio de, reducir los síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o afección, o una de sus combinaciones. Por tanto, en una modalidad, “tratar” se refiere, entre otros, a retrasar la progresión, acelerar la remisión, inducir la remisión, aumentar la remisión, acelerar la recuperación, aumentar la eficacia de, o disminuir la resistencia a agentes terapéuticos alternativos, o una de sus combinaciones. En una modalidad, "prevenir" se refiere, entre otros, a retrasar el inicio de los síntomas, prevenir la recaída a una enfermedad, disminuir el número o frecuencia de los episodios de recaída, aumentar la latencia entre episodios sintomáticos, o una de sus combinaciones. En una modalidad, “suprimir” o “inhibir”, se refiere, entre otros, a reducir la gravedad de los síntomas, reducir la gravedad de un episodio agudo, reducir la cantidad de síntomas, reducir la incidencia de los síntomas relacionados con la enfermedad, reducir la latencia de los síntomas, aliviar los síntomas, reducir los síntomas secundarios, reducir las infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente, o una de sus combinaciones.
En una modalidad, los síntomas son primarios, mientras que en otra modalidad, los síntomas son secundarios. En una modalidad, “primario” se refiere a un síntoma que es un resultado directo de la enfermedad, trastorno o afección, mientras que en una modalidad, “secundario” se refiere a un síntoma que se deriva o es consecuencia de una causa primaria. En una modalidad, los polinucleótidos, polipéptidos, composiciones, células y su uso en la presente invención tratan o inhiben síntomas primarios o secundarios o complicaciones secundarias relacionadas con la enfermedad de Parkinson.
En otra modalidad, "síntomas" pueden ser cualquier manifestación de la enfermedad de Parkinson, que comprende temblores, bradicinesia, músculos rígidos, postura y equilibrio alterados, pérdida de movimientos automáticos, cambios en el habla, cambios en la escritura o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para marcar una transformación genética que comprende la etapa de poner en contacto una célula con un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica a) CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, o una de sus combinaciones, b) una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD); y c) una secuencia de ácido nucleico adicional de interés, en condiciones suficientes para producir betalaínas en dicha célula, en donde el color producido por la producción de betalaína en dicha célula marca de esta manera dicha transformación genética en dicha célula. En una modalidad, la etapa de poner en contacto comprende además poner en contacto una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína.
En una modalidad, el método comprende además poner en contacto un medio de cultivo con ácido ascórbico como agente reductor para prevenir la oxidación espontánea de betanidina, que provoca que el pigmento se polimerice y pierda su color violeta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para identificar genes relacionados con betalaínas en un organismo que comprende la etapa de buscar en una base de datos de genomas de plantas los genes con patrones de expresión que se correlacionan altamente con los de los genes relacionados con betalaínas descritos en la presente descripción. En una modalidad, el gen es MjDOD, cDOPA5GT, CYP76AD3 o una de sus combinaciones. En otra modalidad, el gen es CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15 o una de sus combinaciones.
Combinaciones
En una modalidad, las betalaínas producidas mediante el uso de composiciones y métodos de la presente invención pueden administrarse o proporcionarse por sí mismas. En otra modalidad, las betalaínas producidas mediante el uso de composiciones y métodos de la presente invención pueden administrarse o proporcionarse junto con un suplemento dietético adicional. En otra modalidad, las betalaínas producidas mediante el uso de composiciones y métodos de la presente invención pueden administrarse o proporcionarse junto con un terpeno, que en una modalidad es una astaxantina. En otra modalidad, las betalaínas producidas mediante el uso de composiciones y métodos de la presente invención pueden administrarse o proporcionarse junto con antocianinas, carotenoides o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, las betalaínas producidas mediante el uso de composiciones y métodos de la presente invención pueden producirse junto con un componente adicional, que en una modalidad puede servir como un suplemento dietético. En otra modalidad, las betalaínas producidas mediante el uso de composiciones y métodos de la presente invención pueden producirse junto con un terpeno, que en una modalidad es una astaxantina. En otra modalidad, las betalaínas producidas mediante el uso de composiciones y métodos de la presente invención pueden producirse junto con antocianinas, carotenoides o una de sus combinaciones.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un cultivo alimentario que comprende un polinucleótido de la presente invención. En una modalidad, el cultivo alimentario que comprende un polinucleótido de la presente invención comprende además antocianina, caroteno o una de sus combinaciones. En una modalidad, el cultivo alimentario que comprende un polinucleótido de la presente invención se modifica genéticamente para comprender antocianina, caroteno o una de sus combinaciones. En una modalidad, el cultivo alimentario son tomates de antocianina púrpuras.
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente las modalidades preferidas de la invención. Sin embargo, no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del amplio alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Materiales y Métodos (1)
Material vegetal y condiciones de cultivo
Las plantas de Mirabilis jalapa se cultivaron en suelo en un invernadero con condiciones de luz de día largo (25 °C). Las plantas de Beta vulgaris y Nicotiana benthamiana se cultivaron en suelo en cuartos climatizados (22 °C; 70 % de humedad; 18/6 horas de luz/oscuridad). El material vegetal para la secuenciación del ARN de M. jalapa se recolectó de flores rojas en cinco etapas del desarrollo (etapa 1- longitud de la flor aprox. 1 cm; etapa 2- 2 cm; etapa 3- 3 cm; etapa 4- 4 cm; etapa 5- 5-6 cm), hojas rojo-joven o verde-madura y epidermis de las áreas del nudo del tallo (rojo) o del entrenudo (verde). El material vegetal para la secuenciación del ARN de B. vulgaris se recolectó de hipocótilos de plántulas de 10 días de edad de tres variedades (remolacha roja, remolacha dorada Burpees y remolacha 'rayada' Chioggia). El tejido recolectado se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se mantuvo a -80 °C hasta su procesamiento.
Secuenciación, ensamblaje y análisis del transcriptoma
Las bibliotecas de M. jalapa y B. vulgaris para Seq-ARN específicas de cadena de alto rendimiento de Illumina se prepararon de la siguiente manera: el ARN total se extrajo de las muestras de tejidos con el método TRIzol basado en el manual del usuario del reactivo TRI (Sigma-Aldrich). Se usaron cinco pg de ARN total de cada muestra para la preparación de bibliotecas para seq-ARN mediante el uso de métodos conocidos en la técnica con modificaciones menores. Brevemente: el ARN poli(A) se aisló del ARN total mediante el uso de Dynabeads Oligo (dT)25 (Invitrogen), se fragmentó a 94 °C durante 5 minutos y se eluyó. El ADNc de la primera cadena se sintetizó mediante el uso de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) con cebadores aleatorios y dNTP, y el ADNc de la segunda cadena se generó mediante el uso de ADN polimerasa I (Enzymatics) y dUTP. Después de la reparación de extremos (Enzymatics), la adición de cola dA con Klenow 3'-5' (Enzymatics) y la ligazón del adaptador (ligasa de ADN de T4 Quick, NEB), la segunda cadena que contenía dUTP se digirió por uracil ADN glicosilasa (Enzymatics). El ADNc ligado al adaptador de la primera cadena resultante se usó durante 13-15 ciclos de enriquecimiento de PCR con mezcla maestra de PCR de alta fidelidad NEBNext (NEB). Las bibliotecas indexadas se combinaron y secuenciaron con un instrumento Illumina HiSeq2000. El ensamblaje de novo y el cálculo de valores de recuentos normalizados para el conjunto de datos de M. jalapa se realizó con el software Trinity versión Trinityrnaseq_r2013-02-25 y se siguió el procedimiento estándar. Las anotaciones de cóntigos se asignaron mediante el uso de Blast2GO. El ensamblaje de novo guiado por el genoma del conjunto de datos de B. vulgaris se realizó con la versión de Trinity Trinityrnaseq_r2014-07-17, mediante el uso del recurso del genoma de B. vulgaris (remolacha azucarera) como referencia (http://bvseq.molgen.mpg.de). La anotación de genes se obtuvo con el módulo Trinotate inclusivo.
Generación de constructos de ADN
Secuencias de genes usadas en este estudio; cDOPA5GT (Núm. de acceso a GenBank AB182643.1; SEQ ID NO: 2), DODA1 (acceso HQ656027.1; SEQ ID NO: 33), CYP76AD1 (acceso HQ656023.1; SEQ ID NO: 32). Otras secuencias se proporcionan en Materiales y Métodos. CYP76AD6 se nombró por el Dr. David R. Nelson, Universidad de Tennessee, Memphis, Estados Unidos, para mantener la consistencia en la nomenclatura. Los transcriptos cDOPA5GT de M. jalapa y CYP76AD1, BvDODAl, BvCYP76new y CYP76AD6 de B. vulgaris se amplificaron a partir de bibliotecas de ADNc de pétalo rojo de M. jalapa y de hipocótilo rojo de B. vulgaris, que se prepararon mediante el uso de un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Life Technologies). La amplificación por PCR se realizó mediante el uso de la ADN polimerasa 'Phusion' (Finnzyme) y los oligonucleótidos especificados en la Tabla 1. Para el ensayo de VIGS, todos los fragmentos de genes se clonaron en un vector pTRV2 mediante el uso de restricción XhoI y SacI. Los vectores para el silenciamiento conjunto se construyeron mediante la clonación de un fragmento CYP76AD1 en pTRV2: BvCYP76new y pTRV2:CYP76AD6 mediante el uso de restricción EcoRI y BamHI. Los constructos de ADN usados para la agroinfiltración de N. benthamiana y la transformación de plantas mediada por agrobacterias se construyeron con clonación Goldenbraid. CYP76AD1, BvDODAl, CYP76AD6 y cDOPA5GT se clonaron en un vector pUPD mediante el uso de los oligonucleótidos especificados en la Tabla 1. pDODA, pAD1-GT, pYFP, pAD6 y pX11 son respectivamente los vectores 2a2, 2Q2, 2a1, 2a1 y 3a1, todos los cuales se basan en una cadena principal de pCAMBIA.
Tabla 1. Oligonucleótidos usados en este estudio
SEQ ID NO: Nombre del oligonucleótido Secuencia (5' a 3')
PCR cuantitativa en tiempo real
45 CYP76AD1 qPCR Dir TGTGCTAGACGTT CTTCTTCAGCT
46 CYP76AD1 qPCR Inv AAAATGTCGACGAGCAAATG
47 CYP76AD6 qPCR Dir CTTCATCTCGTAGGCTTCCTCC
48 CYP76AD6 qPCR Inv GATGAGGCTTTTCGCCAAGA
49 Bv15885 qPCR Dir CCTGTATCGGCTAAATGGCG
50 Bv15885 qPCR Inv CAATTGCACAGCGGAGATTTT
51 Bv20048 qPCR Dir TTGATGCTGTTTGCGCAGTC
52 Bv20048 qPCR Inv TGCGAAGATTTCGCCATTTT
53 BvGAPDH qPCR Dir TGGTGCTGATTTTCGTCGTAGAG
54 BvGAPDH qPCR Inv TGGCACCACCCTTCAAGTG
55 Bv10427 qPCR Dir TAAAGCTCCCTCCTGGTCCA
56 Bv10427 qPCR Dir CCGCAGAACGATGAGGTTTG
57 BvCYP76new qPCR Dir TCAAACTCGGAAGCATCACTACA
58 BvCYP76new qPCR Inv GGGCTAAGTCGTGCTCGAGG
clonación pTRV2
59 A A A A A C T C G A G G T T A A A C C T A C T G T T A
BvDODAl Dir XhoI
A T G C T G T C
60 A A A A A G A G C T C G C T G C C C A A G G T G C A A
BvDODAl Inv SacI
CTCC
61 A A A A A C T C G A G G C T A A T C T T G C T A A A A
CYP76AD1 Dir XhoI
T T C A C G G
62 A A A A A G A G C T C T T A T G G T G G G C T A A T T
CYP76AD1 Inv SacI
C C A C T G
63 CYP76AD1 Dir BamHI A A A A A G G A T C C G C T A A T C T T G C T A A A A
T T C A C G G
64 CYP76AD1 Inv EcoRI A A A A A G A A T T C T T A T G G T G G G C T A A T T
C C A C T G
65 BvCYP76new Dir XhoI A A A A A C T C G A G C T G C A A G A G T C A A T G A
T C T C A
66 BvCYP76new Inv SacI A A A A A G A G C T C T C A T C T G G G A A T T G G A
A T T G C T
67 CYP76AD6 Dir XhoI A A A A A C T C G A G C A C A A C A G C A A G C A C A
T T A G A
68 CYP76AD6 Inv SacI AAAAAGAGCTCAGTCCAGGGCATATCC
TTCTAC
SEQ ID NO: Nombre del oligonucleótido Secuencia (5' a 3')
PCR cuantitativa en tiempo
____________ real______________________
Clonación Goldenbraid
69 BvDODAl Dir GCGCCGTCTCGCTCGAATGAAAATGATG
AATGGTGAAGATG
70 BvDODAl Inv GCGCCGTCTCGCTCGAAGCCTAGGCTGA
AGTGAACTTGTA
71 CYP76AD1 Dir GCGCCGTCTCGCTCGAATGGATCATGCA
ACATTAGCAATG
72 CYP76AD1 Inv GCGCCGTCTCGCTCGAAGCTCAATACCT AGGTATTGGAATAAG
73 CYP76AD6 Dir1 GCGCCGTCTCGCTCGAATGGATAACGCA
ACACTTGCT
74 CYP76AD6 Inv 1 GCGCCGTCTCGTTGCCCATTCTAATGTG
CTTG
75 CYP76AD6 Dir2 GCGCCGTCTCGGCAATGGCCGAACTTGT
GAA
76 CYP76AD6 Inv2 GCGCCGTCTCGCTCGAAGCCTAGTTTCT
GGGAACTGGAAT
77 cDOPA5GT Dir1 GCGCCGTCTCGC TC GA ATG ACC GCC ATT
AAAATGAACAC
78 cDOPA5GT Inv1 GCGCCGTCTCGGCCTCATTTCCTCATTG
ATATC
79 cDOPA5GT Dir2
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000054_0002
80 cDOPA5GT Inv2 GCGCCGTCTCGCTCGAAGCTTATTGAAG AGAAGGTTCCAACTT
Clonación Gateway para la expresión en levaduras
81 BvDODAl Dir ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGAAAAT GATGAATGGTGAAGAT
82 BvDODAl Inv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCTAGGCTGA AGTGAACTTGTAGGAG
83 CYP76AD1 Dir ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGATCA TGCAACATTAGCAA
84 CYP76AD1 Inv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcTCAATACCT AGGTATTGGAATAAGTTT
85 CYP76AD6 Dir ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGATAA CGCAACACTTGCTGTGATCC
86 CYP76AD6 Inv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCTAGTTTCT GGGAACTGGAAT AACTTGAAGAG
Silenciamiento de genes inducido por virus en Beta vulgaris
Se clonaron fragmentos de BvDODAl (407 pb), CYP76AD1 (418 pb), BvCYP76new (471 pb) y CYP76AD6 (420 pb) en un vector pTRV2, se transformaron en la cepa de agrobacteria GV3101 y se introdujeron en plántulas de 10 días de edad de la variedad 'sangre de toro' de B. vulgaris mediante el uso del método de infiltración al vacío descrito previamente. Las agrobacterias se llevaron a una D.O.600 de 2,0 en tampón de infiltración VIGS (MES 10 mM, MgCl2 10 mM, acetosiringona 200 j M), se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas y se mezclaron en una relación 1:1 con agrobacterias portadoras de pTRV1 antes de la infiltración. Para cada experimento, se infectaron 48 plántulas. En los experimentos que dieron como resultado fenotipos visibles, se observaron típicamente manchas de despigmentación en más de la mitad de las plántulas infectadas dentro de 2-3 semanas. Se tomaron muestras de tejidos para el análisis espectrofotométrico 3,5 semanas después de la infección.
Análisis de PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR)
El análisis qRT-PCR se llevó a cabo en plantas de remolacha roja infectadas con VIGS. Se analizaron tres réplicas biológicas de cada experimento, donde cada réplica consiste en tejido de hojas de dos a tres plantas, muestreadas 3,5 semanas después de la infección. El ARN se extrajo con el método TRIzol (de acuerdo con el manual de usuario de Sigma-Aldrich para el reactivo TRI), se trató con ADNasa y se transcribió inversamente a ADNc con un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los oligonucleótidos se diseñaron mediante el uso del software PRIMEREXPRESS (Applied Biosystems) (Tabla 1). La qRT-PCR se realizó con el reactivo Fast SYBR Green y un instrumento StepOnePlus (Applied Biosystems) en las siguientes condiciones: etapa inicial en el termociclador durante 20 s a 95 °C, seguido de amplificación por PCR durante 40 ciclos de 3 s a 95 °C y 30 s a 59 °C, y finalmente análisis de disociación para confirmar la especificidad de los productos de PCR. Cada reacción consiste de un volumen total de 10 jl, que contenía 2,5 j M de cada cebador. Los niveles relativos de transcritos se calcularon de acuerdo con el método AACt (Livak & Schmittgen, 2001), mediante el uso del gen GAPDH de 'mantenimiento' como referencia.
Expresión transitoria en Nicotiana benthamiana
Los ensayos de expresión génica transitoria en N. benthamiana con los vectores pDODA, pAD1-GT, pYFP, pAD6 y pX11 se basaron en un método de agroinfiltración descrito previamente. Todos los constructos se transformaron en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens, excluyendo pX11 que se transformó en la cepa EHA105 de A. tumefaciens. En todos los casos, las agrobacterias se cultivaron durante la noche en medio LB y se llevaron a una D.O.600 final de 0,2 en tampón de infiltración. Cuando se infiltraron conjuntamente, las agrobacterias que portaban constructos separados se llevaron cada una a D.O.600 de 0,2 y se mezclaron en una relación 1:1 antes de la infiltración. Las muestras de tejidos usadas para el análisis de LC-MS subsecuente se tomaron de las hojas 7 días después de la infiltración. Para el análisis de LC-MS de L-DOPA y betalaínas, se tomaron muestras de 3-4 réplicas biológicas para cada experimento, cada una de las cuales consiste de tejidos infiltrados de 2-3 hojas diferentes.
Extracción y análisis de metabolitos
Para el análisis de betalaína, se añadió solución de extracción (80 % de etanol y 0,1 % de ácido fórmico en DDW) a tejido vegetal triturado y congelado (0,1-0,25 g) en una relación de 200 j l 0,1 g-1 de tejido. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min seguido de sonicación durante 5 min, centrifugación por 5 min y filtración a través de filtros PVDF de 0,22 jm (Millipore). Las muestras diluidas 3 veces en DDW se analizaron mediante el uso de un sistema UPLC/PDA-qTOF de alta resolución que comprende un UPLC (Waters Acquity) conectado en línea a un detector Acquity PDA (200-700 nm) y un detector qTOF (espectrómetro de masas cuadrupolo/tiempo de vuelo en tándem, XEVO, Waters) equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI). Se usó ESI en modo de ionización positiva en el intervalo m/z de 50 a 1600 Da. Se usaron los siguientes ajustes: capilar - 1 kV, cono - 27 V, energía de colisión - 6 eV. Para las corridas de MS/MS o MSE, se usó una rampa de energía de colisión de 15 a 40 eV. La separación de los compuestos se realizó en una columna UPLC HSS T3 (Waters Acquity, 1,8 jm, 2,1 x 100 mm) mediante el uso de los eluyentes A (1 % de acetonitrilo, 0,1 % de ácido fórmico) y B (100 % de acetonitrilo, 0,1 % de ácido fórmico) de la siguiente manera: los primeros 3 min - elución isocrática al 100 % de A; 3,0-22,0 min - un gradiente lineal al 75 % de A, 22,0-22,5 min - un gradiente lineal al 100 % de B, 22,5-25,5 min - lavado al 100 % de B, 25,5-26,0 min - retorno al 100 % de A y 26,0­ 28,0 min - equilibrio al 100 % de A. La temperatura de la columna se ajustó a 35 °C, flujo - 0,3 ml/min. La betanina y la isobetanina se asignaron mediante el uso de extracto de hoja de remolacha roja como referencia. Se identificaron supuestamente otros compuestos de betalaína basado en la masa precisa, los espectros UV-VIS y la fragmentación MS/MS o MSE (detallada en la Tabla 2).
Tabla 2. ComDuestos de betalaína identificados mediante el análisis LC-MS.
Núm. Nombre Composición [M+H]+, Error de Rt, MS fragmentos UV/VI elemental Da masa, min S, ppm nm Betacianinas
1 Betaninaacde, f C24H26N2O 551,1513 0 8,31 389,10 [M+H-Hex] 345,11 534
13 [M+H-Hex-COO]- 343,0
[M+H-Hex-H2COO] 297,09 [M+H-Hex-2H2COO] 194,05 150,1 [M+H-Hex-H2COO-C9H7NO4]
2 Isobetaninaa C24H26N2O 551,1502 2 9,06 389,10 [M+H-Hex] 343.0 534
13 [M+H-Hex-H2COO] 150.1
[M+H-Hex-H2COO-C9H7NO4]
3 Betacianina IC C31H31N3O 670,189 0,9 12,67 626,20 [M+H-COO] 582,21 532 (desconocida) 14 [M+H-2xCOO] 538,22 [M+H-3xCOO]
389,10 [M+H-281,0902 (C13H15NO6) ] 345,11 [M+H-281-COO] 301,11 [M+H-281-2xCOO] 282,09 [M+H-389,10 (Betanidina)] 264,09 [M+H-389,1 (Betanidina)-H2O]257,13
[M+H-281-3xCOO] 247,08 180,10138,06
4 Betacianina IIC C31H30N2O 655,1771 0,8 15,68 389,10 [M+H-266,0790 533 (desconocida) 14 (C13H14O6)] 345,10 [M+H-266-COO] 343,10 [M+H-266-H2COO] 301,12 [M+H-266-2xCOO] 299,10 [M+H-266-H2COO-COO] 196,06 [M+H-C9H7NO4] 194,04 [M+H-C9H9NO4] 150,05 [M+H-266,0790-H2COO-C9H7NO4]
5 Betanidinagi C18H16N2O8 389,0991 1,5 9,89 343,09 [M+H-H2CO2] 297,09 539
[M+H-2H2CO2]
255,1 [M+H-2H2CO2-CO2] 253,08 [M+H-3H2CO2] 150.05 [M+H-Hex-H2CO2-C9H7NO4]
6 Isobetanidinagi C18H16N2O8 389,0988 0,8 10,83 343,09 [M+H-H2CO2] 297,09 539
[M+H-2H2CO2] 255,1 [M+H-2H2CO2-CO2] 253,08 [M+H-3H2CO2] 150,05 [M+H-Hex-H2CO2-C9H7NO4]
7 Betacianina NIe C26H28N2O1 593,1618 0,2 10,72 547,11 [M+H-H2COO]511,17 534 (desconocida) 4 [M+H-2xH2O] 389,09 [M+H-C8H12O6] 345,11 [M+H-C8H12O6-COO] 325,07 [M+H-C8H12O6-H2COO-H2O] 301,11 [M+ H-C8H12O6-2xCOO] 299,10 [M+H-C8H12O6-H2COO-COO] 297,08 [M+H-C8H12O6-2xH2COO] 194,04 [M+H-C8H12O6-C9H9NO4] 178.05 [M+H-C8H12O6-C9H7NO4-H2O] 176,03 [M+H-C8H12O6-C9H9NO4-H2O] 150,05 [M+H-C8H12O6-H2CO2-C9H7NO4]
Núm. Nombre Composición [M+H]+, Error de Rt, MS fragmentos UV/VI elemental Da masa, min S, nm ppm
Betaxantinas
1 Vulgaxanthi n C14H17N3O7 340,114 0,6 2,21 323,08 [M+H-NH3] 277,08 476 If’ghi (glutamina- 7 [M+H-NH3-H2CO2] 231,07 betaxantina) [M+H-NH3-2xH2CO2]
194.04 185,07 [M+H-3H2CO2-NH3] 157,06
[M+H-3H2CO2-NH3-CO]
150.05 [M+H-COO-C5H10N2O3] 148,05 [M+H-H2CO2-C5H10N2O3]
132.1086,1
2 Indicaxantinabc C14H16N2O6 309,109 1,0 7,69 263.10 [M+H-H2COO] 478 (prolina- 0 217.10 [M+H-2xH2COO] betaxantina) 219.11 [M+H-COO-H2COO] 189,10 175,12
[M+H-H2COO-2COO]
173.11 [M+H-2xH2COO-COO] 150,05 [M+H-COO-C5H9NO2] 145,07 106,07
[M+H-2COO-C5H9NO2]
3 Dopaxanthi n- C24H28N2O1 553,166 0,5 7,97 391.11 (C18H19N2O8) 478 hexósidob 3 7 [M+H-Hex] 357,13 [M+H-Hex-2xOH] 347,13 [M+H-Hex-COO] 345,11 [M+H-Hex-H2COO] 303,13 [M+H-Hex- 2xCOO] 299,10 [M+H-Hex-2xH2COO] 255,11
[M+H-Hex-COO-2xH2COO] 211,07 [M+H-Hex-C9H8O4] 208.05 194,04 181,05
[M+H-C9H10N2O4] 165,05
[M+H- Hex-C9H8O4-H2COO] 150,05 [M+H-Hex-H2COO-C9H9NO4] 106,06
[M+H-Hex-H2COO-COO-C9H9NO4]
4 Betaxantina Ib C18H19N3O4 342,144 2,6 6,67 298.15 [M+H-COO] 254,16 476 (desconocida) 5 [M+H-2xCOO]
252.15 [M+H-H2COO-COO] 237,14 [M+H-2xCOO-NH3] 225,14 196.10 159,09 132,08 117.05106,06
5 Valina- C14H18N2O6 311,124 0,6 10,6 267.11 [M+H-COO] 265,11 469 betaxantinaghi 5 9 [M+H-H2COO] 221,13
[M+H-COO-H2COO]
219.13 [M+H-2xH2COO] 193.13 175,12 [M+H-COO-2xH2COO] 166,05 150,05
[M+ H-H2CO2-C5H9NO2] 132.05 [M+H-H2CO2-C5H9NO2-H2O] 119,06 104.05 [M+H-2xH2CO2-C5H9NO2] 94,05
6 Ácido C9H9NO5 212,055 0,5 8,79 166.05 [M+H-H2COO] 408 betalámicoghi 8 148.04 [M+H-H2COO-H2O] 138.05 [M+H-H2COO-CO] 120.05 [M+H-2x(H2COO)]
92.05 [M+H-2x(H2COO)-CO] 65,04
Compuestos de betalaína identificados mediante análisis de LC-MS en experimentos de agroinfiltración de N. benthamiana de apAD1-GT+pDODA1, bpAD6+pDODA1 y cpX11, dN.benthamiana callus, eN. glauca callus, fpX11 transformado de N. tabacum, experimentos de expresión en levadura de gCYP76AD1+DODA1, hCYP76AD6+DODA1 y CYP76AD1/AD6+DODA1. Todos los fragmentos se obtuvieron en el modo MS/MS excluyendo betanidina e isobetanidina, cuyos fragmentos se determinaron en el modo MS(E). Rt, tiempo de retención; MS fragmentos, masas de fragmentos obtenidos en modo de ionización positiva; UV/VIS, máximos de absorción en el intervalo UV/visible; Hex, Hexosa.
Para el análisis de L-DOPA, las muestras se extrajeron como se describió anteriormente y se analizaron mediante el uso de un instrumento UPLC/PDA-MSMS, donde se conectó un módulo de separación UPLC (Waters Acquity) a un detector de matriz de fotodiodos (Waters Acquity 2996, 190-800 nm), y (en línea) a un detector MS de triple cuadrupolo (Waters Xevo TQ MS), equipado con una fuente ESI. Los compuestos se separaron con una columna Phenomenex Luna (2x150 mm, 3 pm) mediante el uso del siguiente gradiente: el primer 1 min - gradiente lineal de 100 hasta 90 % de A, 1-4 min - 90-75 % de A, 4-5 min - 75-0 % de A, 5-9,5 min - lavado al 100 % de B, 9,5-10 min - retorno a 100 % de A, y 10-12 min - equilibrado al 100 % de A, donde A es 0,1 % de ácido fórmico en agua y B es 0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo. La temperatura de la columna se ajustó a 35 °C, flujo - 0,25 ml/min. Las muestras se analizaron en modo de ionización positiva, mediante el uso de los siguientes ajustes: capilar - 2 kV, cono - 26 eV, con dos transiciones 198,1 > 152,1 (colisión - 15 eV) y 198,1 > 181,1 (colisión - 10 eV) usadas para la asignación de compuestos. La L-DOPA se identificó mediante comparación con un estándar comercial de L-DOPA (Sigma-Aldrich), se disolvió en DDW (5 pM) y se inyectó con las mismas condiciones de LC-MS.
Para la cuantificación relativa de betaxantinas en hojas de remolacha silenciadas con VIGS mediante espectrofotometría, las muestras se extrajeron mediante el uso del mismo procedimiento que se detalló anteriormente, excepto que se usó metanol al 80 % en lugar de etanol al 80 %. Los extractos se diluyeron 4 veces en solución de extracción, se colocaron en una placa de 96 pocillos y se analizaron con un lector de microplacas Biotek Synergy HT. El contenido relativo de betaxantina de cada muestra se evaluó al medir la absorción a 475 nm y restar el valor de absorción a 600 nm.
Para la estimación del contenido de betacianina por espectrofotometría, se usó el mismo método de extracción que anteriormente. Las muestras se diluyeron en DDW para obtener soluciones de D.O.535 < 2,0. La cuantificación de betacianina se basó en mediciones de absorción a 535 nm y 600 nm, y se calculó mediante el uso de un método descrito previamente.
Expresión recombinante en levaduras
Las secuencias codificantes de CYP76AD1, CYP76AD6 y BvDODA1 se amplificaron mediante PCR y se clonaron en los sitios BP de un vector pDONR207 mediante el uso de la clonación Gateway (Life Technologies, Invitrogen) de acuerdo con el manual del fabricante, y después se recombinaron en los sitios LR de los vectores pAG423GAL-ccdB (para CYP76AD6), pAG425GAL (para BvDODA1), y pYES-DEST52 (para CYP76AD1, Invitrogen). Además, se introdujo la secuencia codificante de beta-glucuronidasa (GUS) en estos vectores para ensayos de control. Los vectores de destino se transformaron mediante el uso del método PEG/LiAc a la cepa BY4742 de S. cerevisiae, en transformación secuencial. Cada clon de levadura se transformó finalmente con los tres vectores de destino, que expresan diferentes combinaciones de CYP76AD1, CYP76AD6, BvDODAl y GUS. Las cepas de levadura se cultivaron en medio SD estándar durante la noche, que contenía glucosa al 2 % y carecía de histidina, leucina y uracilo. La levadura se sedimentó, se resuspendió a D.O.600 de 1,0 en 2 ml de medio SD con ascorbato 2 mM, rafinosa al 1 % y galactosa al 2 %, carecía de histidina, leucina y uracilo, y se cultivó durante la noche. Las imágenes en la Figura 8 son de los medios en los que se cultivaron las levaduras, seguido de la inducción con galactosa durante la noche. Para el análisis de LC-MS, se secó 1 ml de medio líquido en un evaporador y se resuspendió en 100 pl de DDW.
Análisis bioinformáticos
Para el análisis de expresión conjunta, los cóntigos correspondientes a DOPA 4,5-dioxigenasa (MjDOD), ciclo-DOPA-5-O-glucosiltransferasa (cDOPA5GT) y CYP76AD3 se usaron por separado como 'cebos'. Los genes que se expresan conjuntamente con cualquiera de los 'cebos' se identificaron mediante el uso de un script R para calcular los valores de correlación de Pearson, basado en los valores de recuento normalizados de cada gen en las 24 bibliotecas.
Para la generación del árbol filogenético de proteínas similares a CYP76AD1, la secuencia de proteína CYP76AD6 se usó primero para una consulta BLASTp de la base de datos NCBI nr. Las cuatro coincidencias principales de BLASTp con la identidad de secuencia más alta y la secuencia de proteína completa se seleccionaron para el alineamiento de secuencias múltiples, junto con la proteína CYP76AD1 y sus ortólogos descritos previamente CYP76AD2, CYP76AD3 y CYP76AD4. El alineamiento de secuencias múltiples se realizó con Clustal Omega y se procesó en un árbol filogenético de unión de vecinos con el software MEGA versión 6.06. Se usó muestreo con reemplazamiento de 100 repeticiones para la validación. El alineamiento por pares de CYP76AD6 y CYP76AD1 se realizó con Clustal Omega mediante el uso de parámetros predeterminados y se editó con el software GeneDoc. Transformación y regeneración de plantas
La transformación y regeneración de plantas mediada por agrobacterias se realizó en discos de hojas de tabaco, berenjena, N. benthamiana, tomate, papa, petunia, Nicotiana glauca de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Un protocolo usado para la transformación de Solanum nigrum se proporciona más abajo en la presente descripción. Todas las especies de plantas se transformaron mediante el uso de la cepa de agrobacteria GV3101. El cultivo de tejidos vegetales se llevó a cabo en cuartos climatizados (22 °C; 70 % de humedad; 16/8 horas de luz/oscuridad, 2500 lux de intensidad de luz).
Secuencias de genes usados en este estudio
Las secuencias proporcionadas son secuencias de cóntigos obtenidas del ensamblaje de novo de los datos del transcriptoma (seq-ARN) de Beta vulgaris y Mirabilis jalapa. Todas las secuencias se presentan en la dirección 5 '+ 3 '.
>MjCYP76 de M. jalapa
CTTCAAATCCTCCCACGTATATATCAACAAAAACCAAAAACATCATCTCATT ACA AT A ATGG AGT ATCATCTTCTCTTCCTTCTCCTCCTGCCGATC ATCCTT ATCTTCGTG TTCCTCAATCACAAGCCCAAGCAAACCAAACTCGAACCACCAGGACCACGTCCATGG CCCATCATAGGCCACACCAACCTCGTCGGCTCCAAACCTCATCAGTCCATTGCCAAAC T AGCTCAT ATTT ACGGTCCCATA ATGTC ACTTA AGCT AGGGAGAATCACT ACT ATTGT CATATCTTCCCCTGAAGCAGCCAAAGACTTGTTCCTGAAACATGACCTTACTTTCTCA AGTAGGCAAGTTCCTCACGCTTCAACCGCTACAAACCATCiACAAACTATCCATGGTTT GGCTCCCTGT ATGTCCCA A ATGGCGCT ATCTT AG A A AGATCGCGCiCC ATCC A ACT ATT CACCAACCAACAACTTGATGGTGGTCAGGTACTAAGGCGTAAGAAAGTGGACGAGTT GATCCAATTTGTGACTCGTTGTAGTAAACAAGGGCAAGTCATTGATATTGGAGAGGCT GTTTTT ATT ACT ACTCTT A ACTT AATGTCAA AT ACCTTTTTTTCC A AGGATTTGTGT AGT TATGGTTTGGCCGAATCACGAGAGTTTAAGGATCTATTTTGGGAGTTCATGAAAGTGC TAGCGAGTCCTAATGTTTCTGATTATTTTCCATGGTTAAGATGGTTGGATTTGCAAGGC
a t c a a g a g a a g a a g c g a g g g t t g t t a t c g c a a g a t g t t g g g t t t t t t t g g g g a g a t t a TTGATCAGAGATTGAGAGATCCAATGTCATGTAAGAACGATGTATTGGACACTCTACT CAAACTTGTCGACCAAAAAGAGTTGAGCTTTGAGGATGTCAAACATATGCTTGTGGAT TTGTTTGTTGCAGGGACGGATACAACTTCGAACACATTGGAATGGACAATGGTAGAA CTTTT ACGCC ACCCT A AC AT ATTG ACT A A AGC AC A A ACTGA ACTCAGCC A AGTC AT AG GCAAGGACAAGTTAGTCCAAGAATCATGTATCACCAAGTTGCCATATCTTCAATCAAT ATTGAAAGAAACATTCAGGTTGCACCCACCGACTCCTTTTTTACTTCCACACAAAGCA ATCGAGAACGTTGA ACT ATGCAACT ATC ACAT ACCT A A AGGTGCTCA AGTTTGGGTGA ATGTGTGGTCTATTGGCCGCGATCCCAACATTTGGTCAAGCCCGGACTTATTTTCCCCA GAGAGATTTTT AGGTACCGAC ATTGAT AT AAAAGGT AACC ATTTCGAGCTC AT ACC AT TCGGAGCAGGAAGAAGGATTTGCCCCGGGTTGTCACTAGCTTACAGGATGCTTCATTT GATTTTGGCCACTCTCCTTCATTCATTCAATTGGAACCTTCCTAATGACGTATGTCCGG AAAATATGGATATTGAAGAAAAATTTGGGATTACACTTCAAAAGATCATGCCACTCA AAGTCATACCAAGCTCTAGGTGTCTGGATCACGACAACTAACTGGTGTTAATCTTTTA CAACATATTGAATGATATATATCACGTTAAGGTACATGCGTCTAGATGCAGAAACTTG CAT ACGTTTCCTTTTC AAT AAAGTCTTGC AT ATGT ATGGTTT AT AGGGTGATGT AATTT
TCATT AAAAT ATTGGAAC AT AT AC AAAATTTT AT ATGTTTT AGAT AAAATT AT AC AGG TTTT AATTTT AGGAACTT ACC ACTTGTTC AC ACTGCGAGACTT AAAT AGTC AAAATAG AAAAT AC AC ACT ATTAAAAAGT ACTC ACT ATTT ATC AAATTT AT (SEQ ID NO: 1).
>BvCYP76new de Beta vulgaris
CAGTCATTTAAAATCCTGTAAATTACTCACATACATAACCAAATTAAAGTTG CCGCCGT ACTGATTTCC A A AGGTCCT AC ATCT ATC A ATGGAGT ATT ACACC AT A ACGC TATTATTCATCATCTTCACAATATCAATATTCGGTACAAAAATTTTGAGCAAGTCCAA ACTTCCTCCAGGACCAACACCATGGCCTATCATAGGCAACATCCTCGAGCTAGGCAAG TT ACCTC ATC AGGC AGTTGAC A AGCTCTC A A A A ACCT ATGGCCCT AT ATT ATCTCTCA AACTCGGAAGCATCACTACAATAGTAATATCATCCCCTGAAATCGTTAAAGAAATGTT CCTCGAGCACGACTTAGCCCTTTCTAGTAGGCCTTCCCCGGATGCTTCGAGGGTGGGA AACCATAACAAATTTTCCATTGTTTGGCTCCCAGTGTCCCCCAAATGGCGGGACCTTA GA A A A ATTGCT ACT ATCCA ATTGTTT ACT ACTC A ACGCCT AGATTCT AGCC A AGA ACT ACGGCAGATCAAGGTGAACGAGCTGGTTGATTATGTACGACAGTGTTGTGAAAAGGG TCTACCTGTTGATGTTGGTAAAGCCGGGTTTACTACCACGTTAAATATGTTGTCTAACA CGTTTTTCTCCATGGATTTGGCTAGCCATGCTTCrTCGAATTCGCAAGAGTTCAAGGAT CTTGTTTGGAGTCTTTTGGAAGAGGGTGCAAAGCCTAATGTGTCGGATTTTTTCCCGAT AGTTAGAGAATTGGATTTGCAGGGAGTATCGAAAAATAGAAGGGTGCACATGAAGAA GCTAATGGGAATTTTCGAGGAAATCATTGATGGAAGGTTGACAAAGTTAAAGGATGT GAAGGATGATGTTCTAAGTACTTTACTCAAACTTGTTAAGGATGAAGAATTGAACCTT GACG ACGTC A AAC AT ATGCTC ATGGATTT ATTTTT AGCGGGAACAGAT ACA ACCTCT A TCACATTGGAGTGüGCGATüACAGAATrAdTCGCAATCCAüAAAAGATGGAAAAGG TTCAAATTGAGTTGGACAAAGTACTTGGCAAGGATAGTTCTCTGCAAGAGTCAATGAT CTC A A A ATT ACC AT ATATTCA AGC AAT AGTG A A AGA A AC ATT A AGATT AC ACCCACC AACTCCTTTCTTGATTCCTCACAAAGCAGAAAAAGATGTATTGTTATGCAACTATTTA GTGCCCAAAAACTCAATTATTTGGGTTAATTTATGGTCGATCGCTCGTAGTCCAAGTG TGTGGCCAAATCCAGAATCATTTTCTCCTGAAAGGTTTTTGGAGATGGAAATTGATAT TAAAGGACGAGATTTCAAACTCATACCCTTTGGATCAGGAAGAAGAATGTGTCCTGG AATGCCACTTGCTTATAGGATGACACATATGTTGTTGGCTACTCTTCTTCATTCATTTA ACTGGAAGTATGGTGAGGCAAGTCCAAAAGATATAGACATGAAAGAAAAGTTTGGGT TGACGTTGCAAAAGGCTCAGCCACTTCAAGCAATTCCAATTCCCAGATGATCAATCTC TTTTGAGGAGTTAGACGATTTCTTTGTGTCAACCAACTAGTACTTATCGGAACATTTAT TGTTAAATGTGTCTGTTAGATGTACATATGATGTTGTTATACTAAGAAATAACGGTGTT TAAGTGCAACATGGGACAAGAGGATTATGTAAAGTATCCTAGATTTTATTAGGTGCTC CTACACCTATGTATTGGTGCATTTGCACCAAGTCGTCTGTAGAAAACTTGAGACTTGG GAGGCAAGAACTTTACCTCTGTAAAAAAAACGCGTTTTTTGCATTCTCCTTGTATCTTT TGC AAGAG ATTGT ACGC ATTC AC AAAAC ATC AAAT AC ATTTGTGTTT AC AC AAT AAGA ATCGCCAACACTGA (SEQ ID NO: 9).
>similar a CYP82G1 de M. jalapa
TACGTCTATTCTTGCCTCCCATTTCCTCCCTGCAAAAAGGAAGAAAATGGAA AT ACCCTTTA ATTTGCA ACCT ATTTTTCTA ATT ATTGT ACT ATCT ACCTTC ATTCT AACC CACCTAATAACAAAAAACACAAGAAAGTTCAACCAATGCAAATCAAAAACCAAGCCA ATACCAAAACCACCTGGCTCACTACCCATAATAGGTCACTTGCACCTCCTAAGAGGTC ATGGAACCACCCTAGGTCGCACCCTCGGAGCCATGGCCGACAAGTCCGGACCCATTTT CGGCCTC AAGCT AGGCC AAC ACAAGGCT ATAGTCATT AGTAACTGGGAGAT AGTCAA GGATTGTTTCACCAATAATGACATGAACCTTGCAACTAGACCTAGCATGGCTATTAGC AAATATATTGG1TATGACTTTGCCTCTTTCTCTATCTCACCTTATGGCCGATATTGGCG TGAGATTCGTAAGATCTCTACTGTTGAGCTCTTGTCAAACAAACGCCTTGAGAAAATG AAGCATG'ITCGAACmTGAGGTGAACTCTTGCCITCAAATCTTCTATGAAAAATGTG TCAAATCAGAGGATAATGAAAGTAATAAAGTAGCAAAAATTTGTCTTAAAAAGTGGT T AGA ATAT ATTGGTTTT AAT ATCGC ACT ATCT ATGAT AGTTGGCA AG AG ATTCTCCT AC GACCAGTATT ATAAAA A AAATACTGTTGCATCG AGATTT ATGAAGGCAAT AGAAAGA GCAACCCACTTAGCAGGACTTCCTATACCCTCGGATTTTTTACCATGGGTTGAATGGA TGGATTTGGTGGGTTACATTGGTGCTATGAAGGAAACTCATAAGGAAATTGATGTGAT TATTGGACATTGGCTTGATGAGCATATTCAAAAGAGGAAAGAGACGTTAGAAAGGCG AGGTACAAGCATTGATGATAGTGACTTCATGGATGTAATGTTATCTAACATTACTGAA CAATTTGCCAAGTCAACCTACTCTAAAAACACCATCATTAAAGCAACAGCTTTGACAC TACTTCTAACAGGTTCAGAAAGCACCTCAATCACACTAACATGGGCCATATCACTACT TCTAAACAACCCTACGGCCCAAAATTTGGCCCAACAAGAAATGGACAAACAAGTTGG TAAACAAAGATGGGTTGAAGAATCTGACATCACCAATCTACCATACCTCCAAGCCATC AT AAAGGAAACTTT ACGTTTGT ATCCACC AAGCCC ATT AGCAGGCCC AAGAGTGGCCC AAGAAGACTGCCAAATCAATGGACATTGTATCACAAAAGGAACCCGGGTGATTGTTA ACATATGGAAGTTGCATCGTGATCCGATGGTTTGGTCCGACCCAGATAAGTTCCGACC CGAAAGGTTT ATTGGGG AGC AT AAGGAT ATTGATTTT AAGGGTCAAT ACTTTGGGT AT AT ACCTTTT AGCTTGGGT AGG AGGGGTTGTCCTGGGATGA ATTTTGGGCT AC AAGTGG TCCATTTGATGTTAGCTCGTTTGGTCCAAGGGTTCGATATTTGGGCTCAAAATGGTGG CCTAATTGATTTGAAGGAAGGGTTGGGCTTGGCTTTGCCCAAGGCTGGTCCATTGGAT GTCATTCTTGCACCACGTTTGTCCAGTGAGCTTTATGGAGCTTTATCAAAGGTGAATGT T ACTT ATGGTCGGGCAATGAATGAACT AGCTTTGT ATTT AT AATTTT AC AAAT AATTTG T AAGAT ATGAACTGTTT ATCT AGTC ACTTTTCCGCGTCTT AGAAT ATC AAT AAGC AAA AAGTTTTATGTAATAATATGTATTAGTGTGTTATTGTATCATGATTCGTCGGTATACTG AAAAT ATTTT ACGTCT AGGAG AATGTGC AC AC ATTT AATCTT ATTTGCTT ATAAGT ATT AT AT AC AT AAAATTTTCT ACTTT AT AATTTAGGT AT ATTG AGCTTTCGACC AAAACCC A AAAACT AAAGAAGTTTTTTTT AAAAC AT AC AAGTTGGT ATTGTTT AGATTTTT ATTT AT TTTT ATT ATCTCTTTTATTTGT ACTT AGTGGGTGTGTT AAT AATGTAAAGAAGT ATT AA AT ATTT AT AG AGTTGGAAAAACCC AAT ATTTT AC ATTGGAAAAA (SEQ ID NO: 36).
>similar a CYP78A9 de M. jalapa
TACGTCTCTAACCTCCTTCTCCTCACCATCATCATCTTATTTCTCTCTCTAACT TCCTATTTCTCTCTCTAGAATGGTCTCAACTAGTGACTCACTCTGGCTTTTCACCTACTT AGCTTCAAAATATGATCATTTTACGACCCCTAACTTTATTTATTCTTTGTTTTGTTTCGT AAT ATTTTTT ATTTTGATTCATCT ACTGT ACTGGTCCCACCCAGGTGGTCCGGCATGGG GGAAGTATTCATGGACTCATCTCTCGGGATGGGCCGGGAAGCCCATCCCCiGGCCCAA GAAGTTGGCCCATTATAGGTGGTTTGGACCTGAAGATGGGACTGGCTCATCGGAAGTT AGCCACAATGGCTGAGAAATACGGGACCATGGCTAAGAGGCTCATGGCTTTTAGCCT AGGAGAAACACGCGTGATTGTCACGTGCAATCCCGACGTGGCGAAAGAAATACTAAA TAGCCCGGTTTTCTTGGACCGACCCGACCAGGAGTCGGCTTATGGGTTGATGTTTAAC CGGTCT AT AGGGTTCGC ACCCTATGGGACCT ACTGGCGA ACCCTAAGGA AA AT AACA TC AACCCATTT ATTAAGCCCT AA AC ACGT AAA AGAAT AT GAG AACCT ACGT AGGGA A ATAATGGAACAAATGGTTGACTCGATATCGAACCAAGCCGGACCGGTTCGGGTCCGG GAAATACTAAGGAGGGCTTCATTGGATAATATGATGGGGTCAGTGTTTGGTGGGCCCC
Figure imgf000063_0001
ATGTTCCATCATCTAAGGCTCTAGATGTTGCTGAAGAAGTCATACTTCTTCGTCATTTA GTACCTACAAGTGTTTGGAAGTTTCAAAGATGGTTAGGTGTAGGGATGGAAAAGAAG CATAAGATAGCTTGGCAAGTACTTGATGATTTCATTTATGAGTGCATATCAAGGAAAA GAGAAGAGATGAGAGATAGTTTGTCCTATGAGAATAAGGACAATGAGATGGGTGTTG ATTTAATGACATTGTATATGAATGAAATCAAAAGTAATGAACTTGTCAAGGATGATCC T AAC AAGTTTTTGAGGGAT ACT ATTCTT AACTTTTTT ATTGC AGGTCGAGAT AC AACT A
GATT AGAC AAGAGTT ATCTT GGATCGTTTC AC A AG AA AA A ACT AA AA ATT AT GCT A AT TTGATTGATAAACTTGTTTATCTTCATGCCGCATTATGTGAAGCTTTAAGATTATATCC TCCGGTGGTATTTGAAGCAAAGTCTCCGATTGAATCGGACACTTTACCAAGTGGTCAT AAGATTGATCCTGACACACAAATAATCTTAAATATGTACGCAATGGCGAGGATGAAA ACAATATGGGGCGATGATTGCGATCAATTTAAACCTGAGAGGTGGATATCATCAACA ACAGGAAAGATTAAGCATGAACCTTCGTACAAGTTCTTGGCTTTTAATGCAGGACCAA GAACTTGTGTAGGAAAAAATATGGCTTTTACTCAAATGAAAGCAATAGCAATAGCTA T ATT AC A AAACTATCAT AT AC ATGGT ATTGATGGAC AAGTT ATTGAACCTGATCT ATC CATAATTCTCCATATGAAGAATGGATTCAGAGTAACTGTTTCACCGTGTAACGTTTCT AT AT AACC ATCGAGAGAACCAAGTTTCCTCGATCTCTTTT AAAC ATTGT AATGTTT AAT T ATC AACT AAAAAATCGT AT ATTCTCTTCGTTTC ATTTTTTTCTTTTTCTTTTT ATC AAA GATCAAGGTAACGTCGGAAATAACCATATTGTTTTCTTTGGTTAAATGAAAAGACAAT GT AAGTTGT AAAAGT ATGT AAGTGT AAAAAT AAATTT AAAAAATTGTGTGAAAAT AA GTTGT AAT AAAT AAAGAAT AATGTTGGT ATTTT ATTGTTT ACT ATTTTGAT AAAC AGAA AAAATAAAATAAAACTGTTTAAAAATAAAAGTGAGAAGAAAAAAAATAAAAGAAAA
T (SEQ ID NO: 38).
Transformación de hipocótilo de Solanum nigrum
Medio
Jones Líquido (pH 5,2)
Medios basales (pH a 5,8 con NaOH antes de añadir el agar)
MS con vitaminas (cat M0222) = 4,41 g/l
Sacarosa 3 % = 30 g/l
Agarosa (agar vegetal) 0,6 % = 6 g/l
T l . IND1 rim r m i in i n ll
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T l 4. IND2 n m i in i n ll
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
T l . BR TE m i in i n r
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T l . MAT m i m r i n
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T l 7. RAÍZ m i nr iz mi n n m n
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Procedimiento
•Trabaje siempre en una campana de flujo, cerca de una llama
•Use fórceps y bisturí esterilizados con EtOH y flameados
•Selle las placas con parafilm antes de retirarlas de la campana de flujo
Prepare las Agrobacterium:
Elija una colonia de una nueva transformación en GV3101 de Agrobacterium e inocule 7,5 ml de tampón LB en un tubo falcon de 50 ml
Cultive, agite a 28 °C durante la noche
Añada Jones líquido (pH 5,2) hasta un volumen total de 25 ml
Manejo del explante:
Mediante el uso de plántulas que tienen cotiledones expandidos, pero sin hojas verdaderas, retire las plántulas individuales con pinzas esterilizadas y colóquelas en una placa de Petri estéril (aprox. 30 hipocótilos por placa). Corte el hipocótilo mediante el uso de un bisturí estéril, sumerja el bisturí en la mezcla de Agrobacterium antes de cada incisión.
Para el control, sumerja el bisturí en Jones líquido antes de cada incisión.
Coloque todos los explantes en placas IND1 y colóquelos en el cuarto de cultivo en la oscuridad durante 3 días (envuélvalos en papel de aluminio).
Subcultivo subsecuente:
Traslade los explantes a las placas IND2 (espaciándolos más -20 por placa) y colóquelos en el cuarto de cultivo con ciclos de luz/oscuridad
•Compruebe las placas cada dos días en busca de contaminación y transfiera los explantes sanos a medios frescos antes si la contaminación es visible.
Después de 2-3 semanas, se formarán callos en los extremos de los explantes (donde se cortaron). Corte los callos del resto del tejido y transfiéralos al medio BROTE.
Si los callos no se han formado, traslade a medios IND2 frescos.
Después de 1-2 semanas, los brotes verdes comenzarán a desarrollarse a partir de los callos. Transfiera estos callos a los medios MAT.
Si no se han formado brotes, traslade a medios de brotes frescos.
Después de 1-2 semanas, los brotes deben ser lo suficientemente grandes como para separarlos del callo y transferirlos al medio RAÍZ (en magentas).
Si los brotes aún son pequeños, traslade a medios MAT frescos.
Traslade las plántulas a un medio RAÍZ fresco cada 2-3 semanas hasta que tengan suficientes raíces para trasladarlos al suelo.
Ejemplo 2
El perfilado del transcriptoma y análisis de expresión conjunta en Mirabilis Jalapa sugiere la implicación de un miembro de la subfamilia CYP76AD1 en la biosíntesis de Betalaína
El objetivo principal de este estudio fue dilucidar la primera etapa comprometida en la biosíntesis de betalaínas en plantas, que comienza con el aminoácido aromático tirosina. Alcanzar esto cerraría la brecha en nuestro conocimiento actual con respecto a las enzimas vegetales y los genes que actúan en la vía central de la betalaína (Figura 1). Dado que los datos de la secuencia del genoma y el transcriptoma de las plantas productoras de betalaína son actualmente muy limitados, generamos un conjunto completo de datos de transcriptoma a partir de la planta de Mirabilis jalapa pigmentada con betalaína (es decir, las cuatro en punto). Se secuenciaron las bibliotecas de 24 tejidos de M. jalapa, lo que incluye los productores como los no productores de betalaína. El conjunto de tejidos seleccionado proporcionó una representación temporal y espacial de la síntesis de betalaína, ya que se tomaron muestras de cuatro partes florales diferentes (es decir, pétalos, estambres, anteras y estigmas) en cinco etapas del desarrollo, cada una de las cuales exhibió una pigmentación creciente durante el desarrollo (Figura 2 A a F).
Los datos del transcriptoma se analizaron primero mediante el examen de los patrones de expresión génica de los genes relacionados con la betalaína previamente identificados en M. jalapa, específicamente, DOPA 4,5-dioxigenasa (MjDOD), ciclo-DOPA-5-O-glucosiltransferasa (cDOPA5GT) y el citocromo P450 CYP76AD3. Se encontró que estos tres genes exhiben patrones de expresión que son similares a la acumulación de pigmento (es decir, aumento de la expresión durante el desarrollo de la flor y mayor expresión en tejidos rojos frente a verdes) (Figura 2G). Por tanto, se podrían encontrar potencialmente genes adicionales relacionados con la betalaína mediante análisis de expresión conjunta, en busca de genes con patrones de expresión que se correlacionen altamente con los de MjDOD, cDOPA5GT o CYP76AD3.
Se cree comúnmente que la hidroxilación de la tirosina en plantas productoras de betalaína es catalizada por una enzima tirosinasa (polifenol oxidasa). Por lo tanto, inicialmente buscamos un gen que codifique tirosinasa que se exprese conjuntamente con MjDOD, cDOPA5GT o CYP76AD3, sin embargo, no se encontró ninguno. Tampoco pudo detectarse una polifenol oxidasa expresada en un patrón paralelo a la acumulación de betalaína mediante el examen manual de los genes anotados como polifenol oxidasas en el conjunto de datos de M. jalapa (Figura 3). Alternativamente, la formación de L-DOPA podría, en teoría, ser catalizada en M. jalapa mediante una enzima del tipo citocromo P450. Se encontró que cuatro genes que codifican el citocromo P450 se expresan conjuntamente con uno o más de los genes conocidos relacionados con la betalaína usados como cebos, específicamente, similar a CYP82G1 (SEQ ID NO: 36), similar a CYP78A9 (SEQ ID NO: 37), similar a CYP86B1 (SEQ ID NO: 38) y similar a CYP76AD1 (SEQ ID NO: 1). Este último, en lo adelante denominado MjCYP76, se destacó como un candidato prometedor, ya que exhibe altos valores de expresión en todo el conjunto de datos, en un patrón que se correlacionó altamente con la acumulación de betalaína (Figura 2G).
Ejemplo 3
El silenciamiento conjunto de CYP76AD1 y CYP76AD6 inhibe la producción de betalaína en Beta vulgaris
Para examinar si MjCYP76 está realmente implicado en la biosíntesis de betalaína, se necesitó un ensayo de silenciamiento génico. Dado que no se dispone de un procedimiento de transformación robusto y estable para ninguna planta productora de betalaína, decidimos aplicar el silenciamiento de genes inducido por virus (VIGS), un método ampliamente usado para el silenciamiento de genes transitorio en plantas que es altamente adecuado para rastrear los fenotipos de pigmentación. Sin embargo, se demostró previamente que el silenciamiento de genes con el método VIGS era particularmente desafiante en M. jalapa, muy probablemente debido a la actividad inhibidora de la proteína antiviral de Mirabilis (MAP), y solo podría lograrse cuando el gen MAP se silencia conjuntamente con el gen de interés. Los intentos de silenciamiento génico en M. jalapa mediante el uso de VIGS no tuvieron éxito en nuestras manos, lo que incluye el intento de silenciamiento de cDOPA5GT, lo que debería dar como resultado una pérdida parcial de la pigmentación de betalaína en la planta. Por lo tanto, procedimos a tratar de identificar un ortólogo MjCYP76 en una especie de planta productora de betalaína diferente, en la que los ensayos de silenciamiento génico pueden implementarse de manera efectiva. Se describió previamente un método VIGS eficiente mediante el uso de infiltración al vacío en remolacha roja, que se usó con éxito para silenciar genes relacionados con betalaína. La identificación de un ortólogo MjCYP76 en la remolacha roja podría, por tanto, ayudar en la evaluación de la relevancia de este gen para la biosíntesis de betalaína.
Con este fin, secuenciamos los transcriptomas de tejidos de hipocótilo de tres variedades de remolacha; una variedad de 'remolacha dorada' que produce únicamente betaxantinas amarillas, así como también una variedad de remolacha roja y una 'remolacha rayada', las cuales tienen hipocótilos pigmentados de rojo. Se esperaba que un ortólogo MjCYP76 en la remolacha, que supuestamente desempeñaría un papel clave en la biosíntesis de betalaína, se expresara altamente en los tres tejidos. Los homólogos se identificaron mediante la consulta tBLASTx del conjunto de datos del transcriptoma de remolacha con la secuencia codificante MjCYP76. Se encontraron cóntigos que representan ocho genes diferentes del citocromo P450 con alta homología de secuencia con MjCYP76 (más del 50 % de identidad en el nivel de proteína), lo que incluye el CYP76AD1 previamente caracterizado (Figura 4A). El gen con la puntuación más alta, BvCYP76new, se seleccionó como un candidato potencial para ser un ortólogo funcional de MjCYP76 en la remolacha. Un gen adicional dentro de este grupo, denominado en lo adelante CYP76AD6, que contiene una identidad del 60 % con MjCYP76 a nivel de nucleótidos y del 53 % a nivel de aminoácidos, exhibió valores de expresión marcadamente más altos en comparación con los otros parálogos y, por lo tanto, también se seleccionó para análisis subsecuentes.
Los fragmentos de BvCYP76new y CYP76AD6 se clonaron en el vector VIGS pTRV2 y se introdujeron en plántulas de la variedad de remolacha roja 'sangre de toro', que produce plantas con hojas de color rojo oscuro altamente pigmentadas y, por lo tanto, es particularmente compatible para ensayos de silenciamiento génico para genes relacionados con la betalaína. Dado que la reacción de la tirosina hidroxilasa para formar L-DOPA es esencial para la formación de todos los compuestos de betalaína, lo que incluye las betacianinas rojas y las betaxantinas amarillas, se esperaba que el silenciamiento de BvCYP76new o CYP76AD6 produjera plantas que exhibieran manchas verdes, debido a la carencia de pigmentación de betalaína. pTRV2:BvDODA1 y pTRV2:CYP76AD1 también se introdujeron en plántulas de remolacha y sirvieron como controles positivos para el ensayo. El silenciamiento de BvCYP76new o CYP76AD6 no dio como resultado ningún fenotipo visible (datos no mostrados), mientras que el silenciamiento de BvDODAl y CYP76AD1 produjo manchas de color verde o amarillo, respectivamente, como se informó previamente. Una posible explicación de la carencia de fenotipo visible al silenciar un gen que supuestamente codifica la enzima responsable de la producción de L-DOPA, fue que esta enzima puede ser redundante con otra enzima o enzimas que también catalizan la misma reacción. Uno de esos candidatos es CYP76AD1, que posiblemente podría catalizar la etapa de hidroxilación de la tirosina además de su actividad demostrada experimentalmente de conversión de L-DOPA a ciclo-DOPA. CYP76AD1 tendría que actuar de forma redundante con otra enzima, ya que el silenciamiento de CYP76AD1 no previene la formación de betaxantinas, de las que la L-DOPA es un precursor esencial (Figura 1). Esta hipótesis podría examinarse mediante el silenciamiento conjunto de BvCYP76new o CYP76AD6 junto con CYP76AD1.
Por lo tanto, construimos vectores pTRV2 que albergan fragmentos de CYP76AD1 con cualquiera de los candidatos BvCYP76new o CYP76AD6, en tándem. Se llevó a cabo un experimento subsecuente de silenciamiento de BvDODAl, CYP76AD1, BvCYP76new o CYP76AD6, como se hizo en el experimento con VIGS mencionado anteriormente, además del silenciamiento conjunto de CYP76AD1 con cada uno de los candidatos a CYP76. Las plantas en las que se silenciaron conjuntamente CYP76AD1 y BvCYP76new produjeron manchas amarillas en las hojas, de manera similar a las plantas en las que solo se silenció CYP76AD1. Sin embargo, el silenciamiento conjunto de CYP76AD1 y CYP76AD6 provocó un fenotipo claramente evidente de manchas verdes, que carecen tanto de betacianinas como de betaxantinas, de manera similar al fenotipo obtenido mediante el silenciamiento de BvDODAl (Figura 5A, B). Las diferencias en los niveles de acumulación de betaxantina también podrían observarse mediante imágenes de luz azul (Figura 5C), en las que las betaxantinas típicamente exhiben una fuerte fluorescencia. La acumulación reducida de betaxantina en tejido silenciado conjuntamente con CYP76AD1-CYP76AD6 frente a tejido silenciado con CYP76AD1 se demostró adicionalmente mediante análisis espectrofotométrico (Figura 6A). Estos hallazgos respaldaron la noción de redundancia en la etapa de hidroxilación de la tirosina de la biosíntesis de betalaína en remolacha roja, por lo que esta etapa puede ser catalizada por CYP76AD1 o CYP76AD6. Adicionalmente, el hecho de que el silenciamiento de CYP76AD1 solo bloquee la producción de betacianinas pero no de betaxantinas, sugirió que CYP76AD6 no cataliza la conversión de L-DOPA a ciclo-DOPA, sino solo la formación de L-DOPA a partir de tirosina.
Se realizó un análisis de qRT-PCR para examinar la expresión de CYP76AD1 y CYP76AD6 en plantas infectadas con los vectores pTRV2:CYP76AD1 o pTRV2:CYP76AD1-CYP76AD6. CYP76AD1 se encontró que estaba regulado negativamente tras la infección con ambos vectores, mientras que CYP76AD6 solo mostró una regulación negativa después de la infección con pTRV2:CYP76AD1-CYP76AD6 (Figura 6B). También se examinó la expresión de cuatro parálogos de CYP76AD1 y CYP76AD6. Tres de los cuatro parálogos examinados mostraron una regulación negativa en los tejidos infectados con al menos uno de los vectores pTRV2:CYP76AD1 o pTRV2:CYP76AD1-CYP76AD6 (Figura 4A). Por tanto, la posible implicación de uno o más de estos parálogos en la biosíntesis de betalaína no puede descartarse en la actualidad. Sin embargo, la irrelevancia de uno de los tres parálogos, BvCYP76new, en la biosíntesis de betalaína puede inferirse de los resultados de los experimentos de silenciamiento, ya que el silenciamiento de BvCYP76new solo no provocó cambios visibles en el fenotipo, y el silenciamiento de este gen junto con CYP76AD1 produjo el mismo fenotipo que se observó cuando CYP76AD1 se silenció solo.
Ejemplo 4
La expresión transitoria de CYP76AD1 en N. Benthamiana permite la producción de L-Dopa y betacianinas
51 CYP76AD1 de hecho cataliza tanto la formación de L-DOPA como su conversión a ciclo-DOPA, entonces la expresión heteróloga de CYP76AD1 junto con una enzima DOD y una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína (por ejemplo, ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa o betanidin-5-O-glucosiltransferasa) debería ser suficiente para la biosíntesis de la betacianina glicosilada ampliamente común, la betanina. Para probar esto, generamos constructos de sobreexpresión para los genes de remolacha BvDODAl y CYP76AD1 y el gen ciclo-DOPA 5-O-glucosiltransferasa (cDOPA5GT) de M. jalapa, que se usará para la sobreexpresión transitoria mediada por agroinfiltración en hojas de Nicotiana benthamiana. Se fabricaron dos vectores para este propósito; uno para la sobreexpresión de BvDODAl bajo el control del promotor 35S de CaMV (pDODA) y otro vector para la expresión en tándem de CYP76AD1 y cDOPA5GT, impulsados por los promotores 35S de CaMV y ubiquitina-10 de Arabidopsis, respectivamente (pAD1-GT). La infiltración conjunta de agrobacterias (Agrobacterium tumefaciens) que albergan los vectores pDODA y pAD1-GT en las hojas de N. benthamiana provocaron la aparición de una pigmentación de color rojo oscuro en las áreas infiltradas dentro de los 2-3 días posteriores a la infiltración (Figura 7A). El análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) reveló que el tejido foliar pigmentado contenía altos niveles de betanina, así como también del isómero isobetanina de betanina (Figura 7B; Tabla 2). Este resultado proporcionó una primera prueba de concepto para la posibilidad de producción in-planta de betalaína manipulada por ingeniería genética sin alimentación de sustrato. Adicionalmente, la formación de betacianinas sin necesidad de alimentación con L-DOPA o sobreexpresión de una enzima hidroxilante de tirosina (por ejemplo, tirosinasa) indicó que CYP76AD1 cataliza la formación de L-DOPA además de su actividad previamente conocida de convertir L-DOPA en ciclo-DOPA.
Sin embargo, la producción de betalaínas puede haber sido posible alternativamente debido a la presencia de L-DOPA en hojas de N. benthamiana como resultado de actividad tirosina hidroxilasa por una enzima endógena. Para examinar si la producción de L-DOPA era posible debido a la expresión de CYP76AD1, se infiltró pAD1-GT en hojas de N. benthamiana sin pDODA. La introducción de un vector que sobreexpresa la proteína YFP (pYFP) se usó como control para este experimento. El análisis de LC-MS confirmó la presencia de L-DOPA en tejidos infiltrados con pAD1-GT pero no en tejidos infiltrados con pYFP (Figura 7C).
Ejemplo 5
La expresión transitoria de CYP76AD6 en N. benthamiana permite la producción de L-DOPA y betaxantinas La actividad de tirosina hidroxilasa de CYP76AD6 también se evaluó mediante la sobreexpresión transitoria en hojas de N. benthamiana. Se construyó un vector de sobreexpresión para CYP76AD6 bajo el control del promotor 35S de CaMV (pAD6) y se insertó en agrobacterias. La infiltración conjunta de pAD6 y pDODA dio como resultado la aparición de una pigmentación amarilla en las áreas infiltradas, visible dentro de varios días posteriores a la infiltración. (Figura 7D). El análisis de LC-MS del tejido pigmentado de amarillo reveló la presencia de un compuesto principal de betaxantina, identificado como indicaxantina (prolina-betaxantina) (Figura 7E). Se encontró que dos compuestos adicionales exhibían espectros típicos de absorción de luz de betaxantina, uno de los cuales supuestamente se identificó como dopaxantina-hexósido, basado en la masa precisa y la fragmentación (Tabla 2). En particular, las betaxantinas glicosiladas no se producen, hasta donde tenemos conocimiento, en especies productoras de betalaína natural. El hecho de que la infiltración conjunta de CYP76AD6 y BvDODAl indujera la producción de betaxantinas pero no de betacianinas coincide con los datos obtenidos en los ensayos de silenciamiento génico mencionados anteriormente, lo que confirma que CYP76AD6 cataliza solo la etapa única de formación de L-DOPA y no su conversión subsecuente a ciclo-DOPA. La agroinfiltración del vector pAD6 solo dio como resultado la producción de L-DOPA en las hojas de N. benthamiana, verificado mediante LC-MS (Figura 7F). Ejemplo 6
La expresión recombinante de CYP76AD1 y CYP76AD6 permite la síntesis de betalaínas en levaduras
La actividad de CYP76AD1 y CYP76AD6 se evaluó posteriormente mediante la expresión recombinante de cada una de las dos enzimas en levadura, junto con BvDODAl. Con este fin, las secuencias codificantes completas de BvDODAl, CYP76AD1 y CYP76AD6 se clonaron en vectores de sobreexpresión de levadura inducibles por galactosa y se transformaron en células Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras se cultivaron subsecuentemente en medio SD estándar, sin suplementación con L-DOPA. De manera similar a los ensayos de expresión transitoria en N. benthamiana analizados anteriormente, se observó pigmentación rojo púrpura en medios de levadura que expresaban CYP76AD1 y BvDODAl, mientras que la pigmentación amarilla fue evidente en medios de levadura que expresaban CYP76AD6 y BvDODAl. La expresión de cada una de las enzimas del citocromo P450 sin BvDODAl o la expresión de BvDODAl solo no dio como resultado la formación de pigmentos rojos o amarillos. Adicionalmente, la expresión conjunta de CYP76AD1, CYP76AD6 y BvDODAl dio como resultado la formación de una pigmentación anaranjada en el medio (Figura 8A). Se utilizó el análisis LC-MS para verificar la presencia de betalaínas en los medios pigmentados de amarillo, rojo-púrpura y anaranjado (Figura 7C; Tabla 2).
Ejemplo 7
CYP76AD6 pertenece a un clado filogenético que no se asoció previamente con la biosíntesis de betalaína
En un estudio publicado recientemente, los análisis filogenéticos a gran escala de las plantas Caryophyllales sugirieron la presencia de varios eventos de duplicación de genes del locus CYP76AD1 al principio de la historia evolutiva de Caryophyllales. Se sugirió que estos eventos dieron lugar a tres clados dentro del linaje CYP76AD1, denominados CYP76AD1-a, CYP76AD1-p y CYP76AD1-Y. Los inventores dedujeron que el clado CYP76AD1-a está directamente asociado con la biosíntesis de betalaína, ya que incluye, entre otros, el gen CYP76AD1 caracterizado funcionalmente de B. vulgaris y su ortólogo CYP76AD3 de M. jalapa, que también se ha implicado en desempeñar un papel similar en la biosíntesis de betalaína. Sin embargo, actualmente no se conoce nada con respecto a la función de los genes pertenecientes a los clados CYP76AD1-p y CYP76AD1-Y. Curiosamente, el gen CYP76AD6 informado aquí [acceso 'Bv9_228610_yqeq.t1' en el genoma de B. vulgaris] está posicionado en el clado CYP76AD1-p, como se demuestra en los análisis filogenéticos presentados por Brockington y colaboradores, y presentado además aquí en un árbol filogenético de máxima probabilidad (Figura 8B). El alineamiento por parejas de las secuencias de las proteínas CYP76AD6 y CYP76AD1 mostró una identidad del 72 % (Figura 9). Sus genes correspondientes exhiben una identidad de secuencia del 70 % a nivel de nucleótidos.
Ejemplo 8
La ingeniería metabólica de pigmentos de betalaína roja en plantas transgénicas requiere la expresión heteróloga de tres genes biosintéticos
Como se analizó anteriormente, pudimos generar betacianinas rojas y betaxantinas amarillas mediante la sobreexpresión transitoria de genes en hojas de N. benthamiana. Subsecuentemente, intentamos manipular por ingeniería genética la producción de betalaína en especies de plantas naturalmente no productoras mediante una transformación estable. Con este fin, se usó la clonación de Goldenbraid para generar un constructo de cuatro genes (denominado en lo adelante pX11), en el que CYP76AD1, BvDODAl y cDOPA5GT se expresan en tándem y están impulsados por promotores constitutivos, además de un gen de resistencia a la kanamicina para la selección de transgenes (Figura 10). El vector pX11 se sometió a prueba inicialmente mediante agroinfiltración en N. benthamiana. De manera similar a la infiltración conjunta de pDODA y pAD1-GT, la introducción de pX11 dio como resultado una pigmentación roja del tejido infiltrado (Figura 12B). Se realizó un análisis de LC-MS del tejido infiltrado con pX11 para determinar la composición de betalaínas. Se encontraron picos correspondientes a betanina e isobetanina, como se observó previamente mediante la infiltración conjunta de los vectores de sobreexpresión pDODA y pAD1-GT (Figura 1lA). También se identificó el compuesto de betaxantina indicaxantina (prolinabetaxantina), lo que indica algún nivel de flujo hacia la formación de betaxantina. Se reconocieron dos metabolitos adicionales como betacianinas, basado en los espectros de absorción de la luz y la fragmentación, que incluían el casi ubicuo fragmento de betacianina, betanidina (m/z = 389; Tabla 2). El tejido de la hoja infiltrado con pX11 apareció intensamente pigmentado de rojo, aparentemente con producción de betacianinas en grandes cantidades (Figura 12B). Por lo tanto, se evaluó el tejido infiltrado para determinar el contenido total de betacianina mediante análisis espectrofotométrico, y se encontró que contenía un estimado de 330 mg kg-1, más alto que las brácteas rojas de Bougainvillea glabra y los pétalos rojos de M. jalapa, que contenían 120 mg kg-1 y 250 mg kg-1 de betacianinas, respectivamente, y 2,3 veces menor que la raíz de remolacha roja, que se estimó que contenía 760 mg kg-1 (Figura 12C).
El vector pX11 se usó después para la transformación estable de varias especies de plantas, lo que incluye el tabaco (Nicotiana tabacum), tomate (Solanum lycopersicum), papa (Solanum tuberosum), berenjena (Solanum melongena), tabaco de árbol (Nicotiana glauca), hierba mora negra europea (Solanum nigrum), Petunia (Petunia x hybrida) y Nicotiana benthamiana. Se cultivaron conjuntamente los explantes de las diferentes especies con agrobacterias y se colocaron en medios selectivos. En N. benthamiana, N. glauca, Petunia y tomate, se observaron pequeñas manchas de pigmentación rojo-púrpura en la superficie del explante a los dos días de cultivo conjunto con agrobacterias. En todas las especies transformadas, la introducción de pX11 provocó la formación de callos de color rojo-púrpura, que generalmente aparecieron dentro de 1-2 semanas de cultivo (Figura 11A). Se encontró con LC-MS que los tejidos de callos de N. benthamiana y N. glauca pigmentados contenían betanina e isobetanina. Adicionalmente, se encontró un nuevo compuesto de betacianina no identificado en el callo de N. glauca (Figura 10B, Tabla 2).
El cultivo de tejidos de tabaco transformado con pX11 (Nicotiana tabacum L cv. Samsun-NN) condujo eventualmente a la generación de plantas maduras, intensamente pigmentadas de rojo, que mostraron acumulación de betalaína en todos los órganos principales de la planta, lo que incluye tallos, hojas, raíces y flores (Figura 13). El análisis de LC-MS de hojas de tabaco pX11 transgénico validó la presencia de betacianinas, betanina e isobetanina, así como también del compuesto de betaxantina vulgaxantina I (glutamina-betaxantina) (Tabla 2). El contenido de betacianina de las hojas de tabaco pX11 se midió adicionalmente mediante espectrofotometría en 135 mg kg-1 (Figura 12C). Ejemplo 9
Discusión
CYP76AD1 y CYP76AD6 catalizan de manera redundante la hidroxilación de tirosina, la primera etapa comprometida en la biosíntesis de betalaína en plantas
En este estudio, hemos demostrado la implicación de CYP76AD1 en la hidroxilación de la tirosina a L-DOPA en la remolacha roja, además de su función previamente informada en la catálisis de la reacción subsecuente que conduce a la formación de ciclo-DOPA. Además, identificamos una enzima citocromo P450 adicional de remolacha, CYP76AD6, que cataliza la primera etapa de hidroxilación en redundancia con CYP76AD1 (Figura 1). Un ortólogo CYP76AD6, MjCYP76, se identificó principalmente en Mirabilis jalapa, que exhibe un patrón de expresión que es similar a la acumulación de betalaína. Es probable que MjCYP76 y el CYP76AD3 previamente identificado, respectivamente, cumplan las mismas funciones en M. jalapa como lo hacen CYP76AD6 y CYP76AD1 en la remolacha roja, aunque esto aún debe verificarse de manera concluyente mediante análisis funcionales, principalmente ensayos de silenciamiento génico en M. jalapa.
La implicación de CYP76AD6 en la formación de L-DOPA se demostró inicialmente mediante ensayos de silenciamiento génico; mientras que silenciar CYP76AD1 por sí solo inhibe la formación de betacianinas pero no de betaxantinas, silenciar CYP76AD1 y CYP76AD6 en paralelo bloquea la formación de ambos grupos de betalaína. El silenciamiento de CYP76AD6 solo no produce un fenotipo visible, ya que la formación de L-DOPA y ciclo-DOPA continúa catalizada por CYP76AD1. Esta carencia de fenotipo visible puede explicar parcialmente por qué CYP76AD6 y la etapa de hidroxilación de la tirosina fueron los últimos en descubrirse dentro de la vía central de biosíntesis de la betalaína. Si bien los genes similares a DOD y CYP76AD1 pudieron identificarse en especies productoras de betalaína mediante mutaciones naturales o inducidas artificialmente que provocan fenotipos claramente visibles, CYP76AD6 no pudo, debido a su redundancia funcional con CYP76AD1. Las funciones sugeridas de CYP76AD1 y CYP76AD6 en la biosíntesis de betalaína se corroboraron adicionalmente mediante la expresión recombinante en N. benthamiana y células de levadura, que condujeron a la formación de betacianinas o betaxantinas, respectivamente, cuando se acoplaron a la expresión de BvDODAl. Adicionalmente, la formación de L-DOPA en N. benthamiana se detectó cuando CYP76AD1 o CYP76AD6 se sobreexpresaron sin BvDODAl.
CYP76AD1 y CYP76AD6 pertenecen a dos clados separados dentro de la subfamilia CYP76AD1, denominados clados CYP76AD1-a y CYP76AD1-p. Es concebible que las dos enzimas de citocromo P450 compartan algún grado de relación estructural, ya que catalizan redundantemente una reacción enzimática idéntica. Además, se informó previamente que los citocromos P450 que pertenecen a una sola subfamilia catalizan etapas subsecuentes en la misma vía biosintética. Es plausible que mientras el clado CYP76AD1-a puede comprender enzimas que poseen actividad dual de formación de L-DOPA y ciclo-DOPA, el CYP76AD1-p puede incluir enzimas que catalizan solo la formación de L-DOPA. Sin embargo, se necesitarán análisis funcionales de los genes correspondientes de especies productoras de betalaína adicionales para respaldar esta hipótesis.
Las enzimas tirosinasas catalizan tanto la ortohidroxilación de monofenoles como la oxidación de o-difenoles a o-quinonas, por tanto, convierten directamente la tirosina a la forma oxidada de L-DOPA, dopaquinona. CYP76AD1, en un mecanismo de reacción actualmente desconocido, también cataliza tanto la hidroxilación de la tirosina como la conversión de L-DOPA a ciclo-DOPA. Nuestros resultados experimentales sugieren que CYP76AD6 es único en el sentido de que cataliza la ortohidroxilación de la tirosina pero no la conversión de L-DOPA a dopaquinona o ciclo-DOPA. La actividad única de la enzima CYP76AD6 puede aprovecharse para la producción a gran escala de L-DOPA que es altamente ventajosa e inesperada en comparación con los métodos de producción actuales. CYP76AD6 forma directamente L-DOPA a partir del sustrato tirosina. La naturaleza ubicua de la tirosina permite la posibilidad de expresión de CYP76D6 en una variedad de plataformas biológicas, lo que incluye plantas y microbios. El descubrimiento de una nueva clase de enzimas hidroxilantes de tirosina también podría facilitar la identificación de genes adicionales del citocromo P450 que pueden catalizar la formación de L-DOPA en la biosíntesis de otros metabolitos derivados de L-DOPA. Por ejemplo, el gen responsable de la hidroxilación de la tirosina en la biosíntesis de alcaloides de bencilisoquinolina (BIA) continúa desconocido hasta la fecha, en una vía, de cualquier otra manera, bien caracterizada. Es posible que en las plantas productoras de BIA, la L-DOPA también sea catalizada por un citocromo P450 similar a CYP76AD1 y CYP76AD6.
El descubrimiento de las funciones de CYP76AD1 y CYP76AD6 en la formación de L-DOPA avanza en nuestra comprensión de la biosíntesis de betalaínas en las plantas y esencialmente completa la identificación de genes y enzimas que forman las estructuras principales de betalaína. Sin embargo, la vía de la betalaína continúa relativamente poco conocida con respecto a la modificación de la estructura de la betalaína a través de enzimas 'decoradoras' (por ejemplo, enzimas glicosiladoras y acilantes), transporte subcelular y detoxificación. Se espera que la elucidación de la vía central y la mayor disponibilidad de datos de secuencias de plantas productoras de betalaína faciliten la caracterización adicional de los genes y los factores reguladores implicados en la biosíntesis de estos pigmentos.
Ingeniería metabólica de la producción de betalaína en plantas
Mientras que las antocianinas y los carotenoides prevalecen en todo el reino vegetal, las betalaínas son pigmentos específicos del orden de las plantas Caryophyllales, en el que se producen en un orden filogenético y mutuamente excluyentes con las antocianinas. Su enigmática historia evolutiva, así como también sus cualidades nutricionalmente beneficiosas y su valor económico como colorantes alimentarios naturales, han llevado a un creciente interés en estos pigmentos en los últimos años, lo que incluye la perspectiva de sintetizarlos en microorganismos y plantas.
En este estudio, hemos demostrado por primera vez la manipulación por ingeniería genética de la producción de betalaína en plantas, sin alimentación de sustrato, tanto por expresión génica transitoria como por transformación estable. Esto fue posible mediante la identificación de la actividad tirosina hidroxilasa adicional de CYP76AD1. Por lo tanto, se encontró que la expresión de CYP76AD1, en combinación con BvDODAl y cDOPA5GT, era suficiente para la biosíntesis de la betanina, sin necesidad de un suministro exógeno de L-DOPA. El uso del vector pX11 que incluye los genes CYP76AD1, BvDODAl y cDOPA5GT se demostró por primera vez mediante la expresión transitoria mediada por agroinfiltración en N. benthamiana, lo que dio como resultado la producción de betalaínas en grandes cantidades, visible dentro de los dos días posteriores a la infiltración. Los intentos de transformación estable de pX11 en plantas y su cultivo subsecuente en cultivo de tejidos dieron como resultado la pigmentación de los explantes y la formación de callos y brotes de color rojo-púrpura en una variedad de especies de plantas dentro de varios días, lo que demuestra el uso potencial de las betalaínas como marcadores de transformación genética visibles. La transformación estable de plantas de tabaco con pX11 condujo finalmente a la generación de plantas maduras completamente pigmentadas. El análisis de LC-MS de las plantas de tabaco productoras de betalaína confirmó la presencia de la betanina como la principal betalaína producida.
Por lo tanto, los hallazgos de este estudio abren el camino para la producción heteróloga de betalaínas en especies de plantas adicionales, lo que podría dar como resultado el desarrollo de cultivos alimentarios potenciados nutricionalmente, así como también nuevas variedades de plantas ornamentales. Aparte de las plantas productoras de betacianina pigmentadas de rojo manipuladas por ingeniería genética, la producción de betalaína podría modificarse principalmente para limitarse a las betaxantinas que expresen CYP76AD6 en lugar de CYP76AD1, como lo demuestran los experimentos de expresión transitoria en N. benthamiana. La manipulación por ingeniería genética de plantas que exhiben tanto pigmentación roja como amarilla también podría lograrse hipotéticamente mediante la expresión de ambos citocromos P450 en diferentes secuencias promotoras no constitutivas (por ejemplo, promotores específicos de frutas, específicos de flores o inducibles). Las plantas productoras de betalaína manipuladas por ingeniería genética también servirán como un recurso genético excepcional para examinar la atracción basada en pigmentos de los polinizadores hacia las flores y los frugívoros hacia las frutas, así como también el papel de los pigmentos para ayudar a los órganos de las plantas a resistir señales abióticas y bióticas. Ejemplo 10
Materiales y métodos (2)
Generación de constructos de ADN
Secuencias de genes usados en este estudio; cDOPA5GT (Núm de acceso a GenBank AB182643.1), BvDODA1 (acceso HQ656027.1), CYP76AD1 (HQ656023.1). CYP76AD6 (KT962274), AroG175 (JC233128.1), AAH (HQ003815.1). La secuencia CYP76AD15 se proporciona en la presente descripción. Los transcriptos de cDOPA5GT, CYP76AD15 de M. jalapa y CYP76AD1, BvDODA1, y CYP76AD6 de B. vulgaris se amplificaron a partir de bibliotecas de ADNc de pétalos rojos de M. jalapa y de hipocótilo rojo de B. vulgaris. Los constructos de ADN usados para la agroinfiltración de N. benthamiana y para la transformación de plantas mediada por agrobacterias se construyeron con clonación Goldenbraid (Sarrión-Perdigones y otros, 2013; GoldenBraid 2.0: A Comprehensive ADN Assembly Framework for Plant Synthetic Biology. Plant Physiology 162: 1618-1631). BvDODA1, CYP76AD1, CYP76AD6, CYP76AD15, cDOPa 5gT, AroG175 y AAH se clonaron inicialmente en un vector pUPD. pX11, pX11(E8), pX11(CHS), pX13, pDOPA3 y pDOPA4 son vectores 3a1. pX12, pDOPA1 y pDOPA2 son vectores 301. Todos los vectores se basan en una cadena principal pCAMBIA (Roberts y otros, 1997; A Comprehensive Set of Modular Vectors for Advanced Manipulations and Efficient Transformation of Plants. En pCAMBIA Vector Release Manual Rockefeller Foundation Meeting del International Program on Rice Biotechnology, 15-19 de Septiembre, Malaca, Malasia).
Transformación y regeneración de plantas
La transformación y regeneración de plantas mediada por agrobacterias se realizó de acuerdo con los siguientes métodos; discos de hojas de tabaco (Horsch y otros, 1985; Science 227: 1229-1231), berenjena (Van Eck y Snyder, 2006; berenjena (Solanum melongena L.). En K Wang, ed, Agrobacterium Protocols. Springer, págs. 439-448), tomate (McCormick, 1997; Transformation of tomato with Agrobacterium tumefaciens. En K Lindsey, ed, Plant tissue culture manual. Springer, págs. 311-319), papa (Perl y otros, 1992; Plant Molecular Biology 19: 815-823) y Petunia (Conner y otros, 2009; Transformation and regeneration of Petunia. En T Gerats, J Strommer, eds, Petunia. Springer, págs. 395-409). La transformación y cultivo de BY2 se realizó de acuerdo con An, 1985 (Plant Physiology 79: 568-570). Todas las especies de plantas se transformaron mediante el uso de la cepa de agrobacteria GV3101. El cultivo de tejidos vegetales se llevó a cabo en cuartos climatizados (22 °C; 70 % de humedad; 16/8 horas de luz/oscuridad, 2500 lux de intensidad de luz).
Expresión transitoria en Nicotiana benthamiana
Los ensayos de expresión génica transitoria en N. benthamiana para los genes BvDODA1 y CYP76AD15 y la toma de muestras subsecuente para el análisis de LC-MS se realizaron como se describió anteriormente.
Extracción y análisis de metabolitos
Para el análisis de LC-MS, la extracción de tejido vegetal de frutos de tomate (pulpa y cáscara), frutos de berenjena (pulpa), tubérculo de papa (pulpa), pétalos de N. tabacum y hojas de N. benthamiana se realizó como se describió previamente (Polturak y otros, 2016). Para la extracción de células BY2, los callos extraídos de placas de Petri (aprox. 500 mg) se lisaron mediante dos ciclos de congelación y descongelación con nitrógeno líquido, seguidos de ruptura con perlas de metal. El extracto celular se centrifugó para eliminar los restos celulares y el sobrenadante se recolectó y filtró a través de filtros PVDF de 0,22 pm (Millipore) antes del análisis. El análisis de LC-MS de L-DOPA y betalaínas se realizó como se describió previamente (Polturak y otros, 2016). La cuantificación relativa de L-DOPA en células BY2 se determinó mediante el área del pico, basado en la transición 198->152.
Ensayo de germinación de semillas
Se sembraron semillas de plantas de tabaco pX11 y de tipo silvestre (WT) en placas de Petri que contenían medio Murashige-Skoog (MS) completo (4,4 g/litro) y agar al 1 %. Para los ensayos de condiciones de estrés, los medios de MS contenían adicionalmente NaCl 150 mM o manitol 400 mM. Las semillas se sembraron en tres placas petri, cada una contenía 50 semillas por genotipo. Las placas selladas se mantuvieron en la oscuridad durante 1 semana y después se trasladaron a cuartos climatizados (22 °C; 70 % de humedad; 16/8 horas de luz/oscuridad, 2500 lux de intensidad de luz). Las tasas de germinación de semillas se examinaron durante un período de 26 días.
Material vegetal y condiciones de cultivo
Las plantas de Mirabilis jalapa, N. tabacum, S. tuberosum, S. melongena y S. licopersicum se cultivaron en suelo en un invernadero con condiciones de luz de día largo (25 °C). Las plantas de Beta vulgaris y Nicotiana benthamiana se cultivaron en suelo en cuartos climatizados (22 °C; 70 % de humedad; 18/6 horas de luz/oscuridad).
Ejemplo 11
La expresión de pX11 en tomate, papa y berenjena da como resultado plantas pigmentadas de rojo
Para inspeccionar la viabilidad de la producción de betalaína heteróloga en cultivos alimentarios, se introdujo el vector pX11 en tomate (Solanum lycopersicum var. MicroTom), papa (Solanum tuberosum var. Désirée) y berenjena (Solanum melongena línea DR2) mediante transformación estable mediada por agrobacterias. Se observaron signos de pigmentación rojo-púrpura en los explantes transformados de las tres especies dentro de varios días después del cultivo conjunto con agrobacterias. Como se observó previamente con las plantas de tabaco que expresan pX11, los explantes transformados finalmente evolucionaron hasta plantas completamente pigmentadas de rojo. Los frutos de tomate y berenjena, así como también los tubérculos de papa exhibieron una fuerte coloración rojo-púrpura (Figura 14) . El análisis de LC-MS de frutos de tomate, frutos de berenjena y tubérculos de papa verificó la presencia de betalaínas, con la betanina y la isobetanina identificadas como las principales betacianinas presentes (Figura 14). Ejemplo 12
Acumulación de betalaínas específicas de frutas en plantas de tomate
En todas las especies de plantas que expresan pX11, la acumulación de betalaína fue visible en prácticamente todos los tejidos y órganos de las plantas, debido a las secuencias promotoras de expresión constitutiva usadas para la expresión génica, específicamente, 35S de CaMV para los genes BvDODA1 y CYP76AD1, y el promotor ubiquitina-10 de Arabidopsis para cDOPA5GT. Inicialmente planteamos la hipótesis de que la producción constitutiva de compuestos que contienen nitrógeno puede conducir a una carga metabólica significativa en las plantas transgénicas. Por lo tanto, construimos un vector binario para expresarse en tomate, lo que daría como resultado la restricción de la acumulación de pigmentos a la maduración y la fruta madura. Con este fin, se modificó pX11 para tenerCYP76AD1 impulsado por el promotor E8 específico de fruta en lugar de 35S de CaMV (Figura 15). La transformación del vector pX11(E8) a var. M-82 de tomate dio como resultado de hecho la generación de plantas que tienen una pigmentación de betalaína limitada a la fruta madura (Figura 16), aunque con una concentración de betalaína más baja que la fruta de los tomates MicroTom que expresan pX11. En particular, las plantas de tomate, papa y berenjena que expresan pX11 finalmente no exhibieron ningún fenotipo de desarrollo aparente o retraso en el crecimiento.
Ejemplo 13
Acumulación de betalaínas específicas de flores en Petunias
En un enfoque similar, se construyó una versión adicional del vector pX11, en el que CYP76AD1 es impulsado por el promotor de CALCONA SINTASA (CHS) de Petunia x hybrida específico de flores en lugar de 35S de CaMV (Figura 15) . Se espera que la transformación de pX11(CHS) en plantas de Petunia x hybrida dé como resultado la generación de plantas que acumulan betalaínas solo en los pétalos, durante la maduración de las flores.
Ejemplo 14
La expresión de pX11, pX12 y pX13 en tabaco da como resultado flores de diferentes colores
Las plantas que expresan pX11 mostraron un color predominantemente rojo púrpura debido a la acumulación de altas cantidades de betacianinas frente a betaxantinas. pX11 incorpora la expresión de CYP76AD1que codifica una enzima con doble actividad en la biosíntesis de betalaína, que cataliza tanto la hidroxilación de la tirosina a L-DOPA como la conversión de L-DOPA a ciclo-DOPA. Como se describió en la presente descripción anteriormente y en Polturak y otros, 2016 (New Phytol. 2016 Abr;210(1):269-83), una enzima relacionada en la remolacha roja, CYP76AD6, exhibe únicamente actividad de 3-hidroxilación de tirosina, para formar L-DOPA. Dado que se requieren derivados de ciclo-DOPA para la formación de betacianinas, la expresión in-planta de CYP76AD6 en lugar de CYP76AD1 da como resultado la formación de betaxantinas pero no de betacianinas, como se observó previamente por la expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. Para explorar la posibilidad de generar plantas transgénicas que acumulen únicamente betalaínas del tipo betaxantina, se construyó un vector binario para la expresión de BvDODA1 y CYP76AD6, en lo adelante denominado pX13. Se diseñó un vector adicional, pX12, para la expresión de ambos genes del citocromo P450 CYP76AD1 y CYP76AD6, junto a BvDODA1 y cdOpA5GT (Figura 15). A continuación se introdujeron pX12 y pX13 en tabaco mediante transformación estable. Mientras que las plantas de tabaco que expresaban pX13 producían únicamente betaxantinas, lo que daba como resultado la formación de flores pigmentadas de amarillo, la expresión de pX12 en las plantas de tabaco generaba plantas con flores de un tono anaranjado-rosa (Figura 17). El análisis de LC-MS de los pétalos de las plantas pX11, pX12 y pX13 verificó que los diferentes colores observados en las flores de las tres líneas son el resultado de relaciones variables de betacianina/betaxantina; los extractos de flores pX11 contenían predominantemente betacianinas, los extractos pX13 solo contenían betaxantinas, mientras que los extractos de pX12 contenían ambos grupos de betalaínas, con una relación betacianina/betaxantina más baja que pX11 (Figura 17). Las diferencias en la acumulación de betaxantina frente a la betacianina también se pudieron observar mediante imágenes de luz azul, bajo las cuales las betaxantinas tienen una fuerte fluorescencia típica (Gandia-Herrero y otros, 2005). Por tanto, el flujo hacia la biosíntesis de betacianinas rojo púrpura o betaxantinas amarillas puede manipularse mediante la expresión de CYP76AD1, CYP76AD6 o una combinación de ambos.
Ejemplo 15
Expresión de pX11 y pX13 en células BY2
La producción biotecnológica de pigmentos de betalaína puede proporcionar nuevas fuentes viables para su uso como colorantes naturales para las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética. Hasta la fecha, la mayor parte de la investigación se ha centrado principalmente en el desarrollo del cultivo de raíces pilosas o cultivo de células de Beta vulgaris para la producción de betalaínas.
La manipulación por ingeniería genética para la producción de betalaína heteróloga permite el desarrollo de numerosas fuentes nuevas para estos pigmentos. Una fuente viable puede ser el cultivo de líneas de células vegetales bien estudiadas, tales como las líneas BY2 de tabaco o T87 de arabidopsis. Un intento previamente informado de usar estas líneas para la producción de betalaína implicó la expresión del gen DOD de Mirabilis jalapa MjDOD junto con un gen de tirosinasa del hongo Shiitake. Se demostró la producción de betaxantinas en células BY2 y T87. Sin embargo, al cabo de varias semanas, las células cultivadas se volvieron marrones y atrofiadas, muy probablemente debido a la acumulación tóxica de dopaquinona y sus derivados, como resultado de la actividad de la tirosinasa exógena (Nakatsuka y otros, 2013).
Para explorar el uso potencial del cultivo de células vegetales para la producción de betalaína a través de la expresión de genes relacionados con la betalaína únicamente, expresamos los vectores pX11 y pX13 en la línea celular de tabaco BY2, lo que dio como resultado la generación de células rojo púrpura o amarillas, respectivamente (Figura 18). El análisis de LC-MS del extracto celular de las células que expresan pX11 mostró la betanina y la isobetanina como las principales betacianinas. Se identificaron varias betaxantinas en ambas líneas celulares pX11 y pX13, lo que incluye glutamina-betaxantina y alanina-betaxantina (Figura 18). En particular, las líneas celulares pX11 y pX13 no mostraron signos de pardeamiento o retraso en el crecimiento como se informó previamente para los callos que expresan tirosinasa (Nakatsuka y otros, 2013).
Ejemplo 16
Producción de L-DOPA en tabaco y células BY2 por la expresión de CYP76AD6
La L-DOPA es un compuesto económicamente importante que se ha usado para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y es un precursor de metabolitos de alto valor, lo que incluye, entre otros, catecolaminas, alcaloides de bencilisoquinolina y betalaínas. Los métodos actuales para la producción a escala industrial de L-DOPA muestran limitaciones críticas. La actividad tirosina 3-hidroxilasa de la enzima CYP76AD6 puede implementarse para la producción de L-DOPA que es ventajosa en comparación con los métodos de producción actuales, mediante el cual la L-DOPA se formaría directamente a partir de tirosina. Exploramos la implementación de CYP76AD6 para la producción de L-DOPA mediante la expresión en plantas de tabaco y en la línea celular de tabaco BY2. Con este fin, se construyeron cuatro vectores diferentes para la expresión de CYP76AD6 (Figura 19); en un vector, CYP76AD6 está impulsado por el promotor 35S de CaMV (en lo adelante denominado pDOPAI). En otro vector, pDOPA2, CYP76AD6 es impulsado por el promotor de la ubiquitina 10 de Solanum lycopersicum (SlUb10). En el vector pDOPA3, CYP76AD6 bajo el control del promotor 35S se expresa junto con dos genes adicionales, AroG175 (Tzin y otros, 2012) e hidroxilasa de aminoácidos aromáticos (AAH) (Pribat y otros, 2010), los cuales se utilizan para aumentar la disponibilidad de tirosina. En el vector pDOPA4, CYP76AD6 bajo el control del promotor SlUb 10 se expresa junto con AroG175 y AAH. Los cuatro vectores expresan adicionalmente el gen de la neomicina fosfotransferasa II (nptII) para conferir resistencia a la kanamicina para la selección de transformantes. pDOPA1, pDOPA2, pDOPA3 y pDOPA4 se introdujeron en plantas de tabaco mediante transformación estable mediada por agrobacterias. El análisis por LC-MS de plantas de primera generación (t0) confirmó que la L-DOPA se produce en líneas que expresan los cuatro vectores diferentes. El análisis de las plantas de tabaco pDOPA1 y pDOPA3 se presenta en la Figura 20. Los cuatro vectores pDOPA también se introdujeron en líneas de células BY2. Las células BY2 que expresan vectores pDOPA2 o pDOPA4 exhibieron diversos grados de pigmentación gris a negra después de varias semanas de cultivo, probablemente debido a la formación de derivados de L-DOPA, posiblemente como resultado de la oxidación enzimática o no enzimática de la L-DOPA. El análisis de LC-MS de extractos obtenidos de callos que expresan pDOPA2 y pDOPA4 mostró la presencia de L-DOPA en concentraciones variables (Figura 20). Ejemplo 17
Las betalaínas confieren resistencia a las plantas a condiciones de alto estrés osmótico y alta salinidad Teniendo en cuenta las funciones sugeridas de las betalaínas para conferir resistencia en las plantas a diversos factores de estrés abiótico, como la sequía, la alta salinidad y el exceso de luz, permitir la producción de betalaínas en plantas que naturalmente no las producen puede servir para aumentar su tolerancia a los factores de estrés abiótico. Por lo tanto, procedimos a examinar esta suposición mediante ensayos de germinación de semillas de plantas de tabaco productoras de betalaínas. Se colocaron semillas de tabaco pX11 y de tipo silvestre (WT) en placas de Petri que contenían medios Murashige-Skoog (MS) suplementados con manitol 400 mM o NaCl 150 mM, para imitar condiciones de alto estrés osmótico o estrés por salinidad alta, respectivamente. Se usaron como control placas Petri que contenían medio MS sin suplementación adicional. Se determinaron las tasas de germinación de las semillas sembradas en todas las placas durante un período de 26 días. Mientras que las semillas de tabaco pX11 y WT exhibieron tasas de germinación similares en los medios MS de control, las semillas pX11 exhibieron una germinación significativamente mayor frente a las semillas WT en placas que contenían manitol 400 mM durante todo el período de tiempo del experimento. En placas que contenían NaCl 150 mM, las semillas pX11 mostraron tasas de germinación significativamente mayores después de una semana de incubación, pero las semillas WT obtuvieron tasas de germinación similares dentro de dos semanas y en adelante (Figura 21). Por lo tanto, las plantas de tabaco productoras de betalaína exhiben una mayor tolerancia a las condiciones de alta osmótica y alta salinidad en comparación con las plantas de tipo silvestre, con una mayor tasa de germinación en condiciones de alto estrés osmótico y una germinación más rápida en condiciones de alta salinidad.
Ejemplo 18
Las betalaínas confieren resistencia a la infección de Botrytis cinerea en hojas de tabaco
Se ha sugerido previamente que las betalaínas desempeñan un papel en la defensa contra los hongos patógenos, pero la evidencia de la actividad antifúngica de las betalaínas en la literatura científica es escasa. La producción de betalaínas heterólogas en plantas proporciona una plataforma excelente para estudiar las actividades antifúngicas de las betalaínas in-planta, y también puede implementarse para conferir resistencia a hongos fitopatógenos en especies de cultivos objetivo. Para examinar los posibles efectos antifúngicos de las betalaínas, plantas de tabaco de tipo silvestre y pX11 se sometieron a la infección de las hojas por el hongo del moho gris (Botrytis cinerea), un patógeno necrotrófico de plantas que es responsable de pérdidas importantes en los productos agrícolas tanto en las etapas de precosecha como de postcosecha. Se aplicaron gotitas de suspensión de esporas de B. cinerea en diferentes concentraciones sobre las hojas de las plantas, con un total de aproximadamente 100, 250 o 500 esporas por planta. El grado de infección de B. cinerea se estimó después mediante mediciones diarias del tamaño de la lesión alrededor de los puntos de infección. Las hojas de tabaco pX11 exhibieron un área de lesión significativamente más pequeña tras la infección en comparación con las hojas de tabaco de tipo silvestre (Figura 22). Las hojas de tabaco de tipo silvestre infectadas también exhibieron mayores signos de necrosis en comparación con las hojas pX11 dentro de varios días después de la infección (Figura 22). Juntos, estos resultados indican un aumento de la resistencia hacia la infección por B. cinerea de plantas productoras de betalaína.
Ejemplo 19
CYP76AD15 es un ortólogo funcional de CYP76AD6 en Mirabilis jalapa
Teniendo en cuenta la presencia natural de especies de plantas productoras de betalaína adicionales que consisten en variedades de color rojo o amarillo, es plausible que estas especies tengan un mecanismo molecular similar al observado en la remolacha roja, donde una enzima del citocromo P450 cataliza solo la hidroxilación de la tirosina, mientras que otra cataliza tanto la hidroxilación de la tirosina como la formación de ciclo-DOPA. También es posible

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima implicada en la conversión de tirosina en L-DOPA, en donde dicha secuencia de ácido nucleico es un gen CYP76AD6 bajo el control de un promotor o un gen CYP76AD15 bajo el control de un promotor.
2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico del gen CYP76AD6 es como se expone en SEQ ID NO: 31, o en donde la secuencia de ácido nucleico del gen CYP76AD15 es como se expone en SEQ ID NO: 35.
3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho polinucleótido comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen de selección, tal como el gen de neomicina fosfotransferasa II (nptII).
4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho promotor es un promotor constitutivo o es un promotor inducible.
5. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho promotor constitutivo es un promotor 35S de CaMV, un promotor de ubiquitina 10, un promotor de ubiquitina 10 de Solanum lycopersicum (SlUb10), o un promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis, o en donde dicho promotor inducible es un promotor inducible por galactosa.
6. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde dicho polinucleótido es el vector de expresión pDOPA1, que comprende el gen CYP76AD6 impulsado por el promotor 35S de CaMV; o el vector de expresión pDOPA2, que comprende el gen CYP76AD6 impulsado por el promotor de ubiquitina 10 de Solarium lycopersicum.
7. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho promotor es un promotor específico de frutas tal como el promotor E8, o es un promotor específico de flores tal como el promotor de la calcona sintasa (CHS) de Petunia x hybrida.
8. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho polinucleótido comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen que aumenta la disponibilidad de tirosina en una célula, por ejemplo, un AroG175, o una hidroxilasa de aminoácidos aromáticos (AAH), o una de sus combinaciones.
9. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula es una célula vegetal.
10. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), en donde dicha secuencia de ácido nucleico se inserta en el polinucleótido en marco.
11. Una composición que comprende el polinucleótido recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o un vector de expresión que comprende el polinucleótido recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o
un polipéptido quimérico codificado por el polinucleótido recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. Un método para producir L-DOPA en una célula que comprende las etapas de
(a) poner en contacto dicha célula con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10;
(b) expresar en dicha célula un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD6 o dicho gen CYP76AD15;
lo que produce de esta manera L-DOPA.
13. Un método in vitro para producir L-DOPA a partir de tirosina que comprende la etapa de poner en contacto la tirosina in vitro con un polipéptido recombinante sintetizado a partir de un gen CYP76AD6 o un gen CYP76AD15, lo que produce de esta manera L-DOPA.
14. Un método para producir un colorante amarillo natural que comprende las etapas de
(a) poner en contacto una célula con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6 o CYP76AD15, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD); (b) expresar en dicha célula un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD6 o gen CYP76AD15, y un polipéptido recombinante a partir del gen que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD);
en donde se producen betaxantinas en dicha célula, lo que produce de esta manera un colorante amarillo natural.
15. Un método para producir un colorante naranja natural que comprende las etapas de
(a) poner en contacto una célula con una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD1, una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), una secuencia de ácido nucleico que codifica CYP76AD6 o CYP76AD15 y una secuencia de ácido nucleico que codifica una glucosiltransferasa relacionada con la betalaína;
(b) expresar en dicha célula un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD1, un polipéptido recombinante a partir del gen que codifica la enzima DOPA 4,5-dioxigenasa (DOD), un polipéptido recombinante codificado por dicho gen CYP76AD6 o dicho gen CYP76AD15, y un polipéptido recombinante a partir del gen que codifica la glucosiltransferasa relacionada con la betalaína;
en donde se produce una combinación de betacianina y betaxantina, lo que produce de esta manera un colorante naranja natural.
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