ES2931313T3 - Microorganismo recombinante para uso en un método con rendimiento incrementado de producto - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una célula de levadura recombinante, en particular una célula de levadura transgénica, que expresa funcionalmente una o más secuencias de ácido nucleico recombinantes, en particular heterólogas, que codifican ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) y fosforibulocinasa (PRK). La invención se refiere además al uso de dióxido de carbono como aceptor de electrones en un microorganismo quimiotrófico recombinante, en particular un microorganismo eucariótico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo recombinante para uso en un método con rendimiento incrementado de producto

La invención se refiere a un microorganismo recombinante que tiene la capacidad de producir un producto de fermentación deseado, a la expresión funcional de péptidos heterólogos en un microorganismo y a un método para producir un producto de fermentación en el que se utiliza dicho microorganismo. En una realización preferida, el microorganismo es una levadura. La invención se refiere, además, a un uso de CO² en microorganismos.

Los procedimientos de fermentación microbiana se aplican para la producción industrial de una amplia gama de compuestos químicos en rápida expansión a partir de materias primas de hidratos de carbono renovables.

Especialmente en los procedimientos de fermentación anaerobia, el equilibrio redox de la pareja de cofactores NADH/NAD+ puede provocar limitaciones importantes en el rendimiento del producto. Este desafío se ejemplifica por la formación de glicerol como subproducto principal en la producción industrial de - por ejemplo - etanol combustible por parte de Saccharomyces cerevisiae, una consecuencia directa de la necesidad de reoxidar el NADH formado en reacciones biosintéticas.

La producción de etanol por parte de Saccharomyces cerevisiae es actualmente, en volumen, el procedimiento de fermentación más grande en biotecnología industrial, pero diversos otros compuestos, incluyendo otros alcoholes, ácidos carboxílicos, isoprenoides, aminoácidos, etc, se producen actualmente en procedimientos biotecnológicos industriales.

Se han propuesto diversos enfoques para mejorar las propiedades fermentativas de los organismos utilizados en biotecnología industrial mediante modificación genética.

El documento WO 2008/028019 se refiere a un método para formar productos de fermentación utilizando un microorganismo que tiene al menos una secuencia génica heteróloga, comprendiendo el método las etapas de convertir al menos un hidrato de carbono en 3-fosfoglicerato y fijar dióxido de carbono, en el que al menos una de dichas etapas es catalizada por al menos una enzima exógena. Además, se refiere a un microorganismo para formar productos de fermentación a través de la fermentación de al menos un azúcar, comprendiendo el microorganismo al menos una secuencia génica heteróloga que codifica al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en fospentosa epimerasa, fosforribulocinasa y ribulosa bisfosfato carboxilasa.

En un ejemplo, se menciona una levadura en donde se incorporan un gen PRK heterólogo y un gen Rubisco heterólogo. En una realización, la levadura se utiliza para la producción de etanol. Los resultados (Figura 24) muestran concentraciones para controles transgénicos y las cepas modificadas. Se nota poca diferencia entre la levadura modificada y su control correspondiente. No hay información aparente con respecto al rendimiento del producto, conversión de azúcar, crecimiento de levadura, tasas de evaporación de etanol. Por lo tanto, es evidente que los resultados no son concluyentes con respecto a una mejora en el rendimiento de etanol.

Además, el documento WO 2008/028019 no menciona el problema de la formación de productos secundarios de glicerol.

Un desafío importante relacionado con la estequiometría de la producción de etanol a base de levadura, pero también de otros compuestos, es que generalmente se forman cantidades sustanciales de productos secundarios dependientes de NADH (en particular, glicerol) como subproducto, especialmente en condiciones anaerobias y condiciones de oxígeno limitado o bajo condiciones en las que la respiración está restringida o ausente. Se ha estimado que, en procedimientos industriales típicos de etanol, hasta aproximadamente el 4 % en peso de la materia prima de azúcar se convierte en glicerol (Nissen et al. Yeast 16 (2000) 463-474). En condiciones ideales para el crecimiento anaerobio, la conversión en glicerol puede ser incluso mayor, hasta aproximadamente del 10 %.

La producción de glicerol en condiciones anaerobias está vinculada principalmente con el metabolismo redox. Durante el crecimiento anaerobio de S. cerevisiae, la disimilación del azúcar se produce a través de la fermentación alcohólica. En este proceso, el NADH formado en la reacción glicolítica de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa se reoxida al convertir el acetaldehído, formado por la descarboxilación de piruvato en etanol a través de la alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD+. La estequiometría fija de esta vía disimilatoria redox-neutral provoca problemas cuando se produce una reducción neta de NAD+ a NADH en otra parte del metabolismo. En condiciones anaerobias, la reoxidación de NADH en S. cerevisiae depende estrictamente de la reducción del azúcar a glicerol. La formación de glicerol se inicia mediante la reducción del compuesto intermedio glicolítico dihidroxiacetona fosfato (DHAP) a glicerol 3-fosfato (glicerol-3P), una reacción catalizada por la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+. Posteriormente, el glicerol 3-fosfato formado en esta reacción es hidrolizado por la glicerol-3-fosfatasa para producir glicerol y fosfato inorgánico. En consecuencia, el glicerol es un subproducto principal durante la producción anaerobia de etanol por parte de S. cerevisiae, lo cual no es deseable ya que reduce la conversión global de azúcar en etanol. Además, la presencia de glicerol en los efluentes de las plantas de producción de etanol puede imponer costos para el tratamiento de las aguas residuales.

En el documento WO 2011/010923, la formación de productos secundarios relacionados con NADH (glicerol) en un procedimiento para la producción de etanol a partir de una materia prima que contiene hidratos de carbono - en particular una materia prima de hidratos de carbono derivada de biomasa lignocelulósica - el problema de la producción secundaria de glicerol se aborda proporcionando una célula de levadura recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico recombinante que codifican una actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10), careciendo dicha célula de la actividad enzimática necesaria para la síntesis de glicerol dependiente de NADH o teniendo la célula una actividad enzimática reducida con respecto a la síntesis de glicerol dependiente de NADH en comparación con su correspondiente célula de levadura de tipo salvaje. Se describe una célula que es eficaz para eliminar esencialmente la producción de glicerol. Además, la célula utiliza acetato para reoxidar NADH, por lo que la producción de etanol puede incrementarse si se utiliza una materia prima que contiene acetato.

Aunque el procedimiento descrito en el documento WO 2011/010923 es ventajoso, existe una necesidad continua de alternativas, en particular alternativas que también permitan la producción de un compuesto orgánico útil tal como etanol, sin necesidad de acetato u otras moléculas orgánicas aceptoras de electrones con el fin de eliminar o al menos reducir la síntesis de productos secundarios dependientes de NADH. En particular, sería deseable proporcionar un microorganismo en el que se reduzca la síntesis de productos secundarios dependientes de NADH y que permita un rendimiento incrementado de producto, también en ausencia de acetato.

Los autores de la invención se dieron cuenta de que puede ser posible reducir o incluso eliminar la síntesis de productos secundarios dependientes de NADH mediante la expresión funcional de una enzima recombinante en una célula de un microorganismo quimiotrófico heterótrofo, en particular una célula de levadura, utilizando dióxido de carbono como sustrato.

Por consiguiente, el dióxido de carbono se puede utilizar como un aceptor de electrones en un microorganismo quimioheterótrofo recombinante, en particular un microorganismo eucariótico. Las clasificaciones quimiotróficas, (quimio)heterótrofas y autótrofas y otras clasificaciones de un microorganismo se relacionan en esta memoria con el microorganismo antes de la recombinación; este organismo también se denomina en esta memoria el huésped. Por ejemplo, a través de la recombinación como se describe en esta memoria, un microorganismo huésped que originalmente es (quimio)heterótrofo y no autótrofo puede convertirse en autótrofo después de la recombinación, ya que la aplicación de lo que se describe en esta memoria hace que el organismo recombinado pueda asimilar dióxido de carbono, resultando con ello en una (quimio)autotrofia (parcial).

Ventajosamente, los autores de la invención han encontrado una manera de incorporar el dióxido de carbono como un co-sustrato en la ingeniería metabólica de microorganismos industriales heterótrofos que se pueden utilizar para mejorar los rendimientos del producto y/o para reducir la formación de productos secundarios.

En particular, los autores de la invención encontraron que era posible reducir o incluso eliminar la síntesis de productos secundarios dependiente de NADH mediante la expresión funcional de al menos dos enzimas recombinantes de dos grupos específicos en un microorganismo eucariótico, en particular una célula de levadura, en donde una de las enzimas cataliza una reacción en la que se utiliza dióxido de carbono y la otra utiliza ATP como un cofactor.

Por consiguiente, la invención proporciona una célula de levadura recombinante, que expresa funcionalmente una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican una ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) y una fosforribuloquinasa (PRK), comprendiendo dicha célula de levadura una o más chaperonas seleccionadas del grupo de GroEL, GroES, homólogos funcionales de GroEL y homólogos funcionales de GroES, en donde dichos homólogos funcionales de una chaperona seleccionada del grupo de GroEL y GroES tienen más del 50 % de identidad de secuencia con GroEL o GroES; y en donde la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) es una Rubisco que comprende la secuencia de proteínas de SECUENCIA ID NO: 2 o un homólogo funcional de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO: 2.

Una célula de levadura de acuerdo con la invención se ha mostrado ventajosa en particular, porque en presencia de Rubisco y PRK, la formación de productos secundarios dependientes de NADH (glicerol) se reduce considerablemente o se elimina esencialmente por completo y se puede aumentar la producción del producto deseado. Se cree que el dióxido de carbono actúa como un aceptor de electrones para el NADH, por lo que hay menos NADH disponible para la reacción hacia el producto secundario (tal como glicerol).

Una célula de levadura de acuerdo con la invención se puede utilizar en un método para preparar un compuesto orgánico, en particular un alcohol. Por consiguiente, la invención se refiere, además, a un método para preparar un alcohol, que comprende fermentar una fuente de carbono, en particular un hidrato de carbono, con una célula de levadura de acuerdo con la invención, formando con ello el alcohol, en el que la célula de levadura está presente en un medio de reacción.

La invención se refiere, además, a uno o más vectores para la expresión funcional de un polipéptido heterólogo en una célula de levadura, en donde dicho vector o vectores comprenden una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican Rubisco y PRK, en donde dicha Rubisco exhibe actividad de fijación de carbono, dicho vector o vectores comprenden, además, una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican una chaperona seleccionada del grupo de GroEL, GroES, homólogos funcionales de GroEL y homólogos funcionales de GroES, en donde dichos homólogos funcionales de una chaperona seleccionada del grupo de GroEL y GroES tienen más del 50 % de identidad de secuencia con GroEL o GroES, y en donde la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) es una Rubisco que comprende la secuencia de proteínas de SECUENCIA ID NO: 2 o un homólogo funcional de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO: 2.

El término "un" o "una", tal como se utiliza en esta memoria, se define como "al menos uno/una" a menos que se especifique lo contrario.

Cuando se hace referencia a un sustantivo (p. ej., un compuesto, un aditivo, etc.) en singular, se debe incluir el plural. Por lo tanto, cuando se hace referencia a un resto específico, p. ej., "compuesto", esto significa "al menos uno" de ese resto, p. ej., "al menos un compuesto", a menos que se especifique lo contrario.

El término 'o' tal como se utiliza en esta memoria debe entenderse como 'y/o'.

Cuando se hace referencia a un compuesto del que existen varios isómeros (p. ej., un enantiómero D y un enantiómero L), el compuesto en principio incluye todos los enantiómeros, diastereómeros e isómeros cis/trans de ese compuesto que pueden utilizarse en el método particular de la invención; en particular, cuando se refiere a dicho compuesto, incluye el o los isómeros naturales.

Con el propósito de claridad y una descripción concisa, las características se describen en esta memoria como parte de la misma o de realizaciones separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención puede incluir realizaciones que tengan combinaciones de todas o algunas de las características descritas. A la vista de este pasaje, es evidente para el lector experto que las variantes de la reivindicación 1 tal como se presentó pueden combinarse con otras características descritas en la solicitud tal como se presentó, en particular con las características descritas en las reivindicaciones dependientes, dichas reivindicaciones generalmente se refieren a las realizaciones más preferidas de una invención.

El término 'fermentación', 'fermentativo' y similares se utilizan en esta memoria en un sentido clásico, es decir, para indicar que un procedimiento se lleva a cabo o se ha llevado a cabo en condiciones anaerobias. Las condiciones anaerobias se definen en esta memoria como condiciones sin oxígeno o en las que la célula de levadura, en particular una célula de levadura, no consume esencialmente oxígeno, y habitualmente corresponde a un consumo de oxígeno de menos de 5 mmol/l.h, en particular a un consumo de oxígeno de menos de 2,5 mmol/l.h, o menos de 1 mmol/l.h Más preferiblemente se consume 0 mmol/L/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable). Esto corresponde habitualmente a una concentración de oxígeno disuelto en el caldo de cultivo de menos del 5 % de saturación del aire, en particular a una concentración de oxígeno disuelto inferior al 1 % de la saturación del aire, o inferior al 0,2 % de la saturación del aire.

El término "levadura" o la expresión "célula de levadura" se refiere a un grupo filogenéticamente diverso de hongos unicelulares, la mayoría de los cuales se encuentran en la división de Ascomycota y Basidiomycota. Las levaduras en gemación ("levaduras verdaderas") se clasifican en el orden Saccharomycetales,, siendo Saccharomyces cerevisiae la especie más conocida.

La expresión "(célula) recombinante" o "microorganismo recombinante", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una cepa (célula) que contiene ácido nucleico que es el resultado de una o más modificaciones genéticas utilizando técnica(s) de ADN recombinante y/u otra(s) técnica(s) mutagénica(s). En particular, una célula recombinante puede comprender ácido nucleico que no está presente en una célula de tipo salvaje correspondiente, cuyo ácido nucleico se ha introducido en esa cepa (célula) utilizando técnicas de ADN recombinante (una célula transgénica), o cuyo ácido nucleico no está presente en dicho tipo salvaje es el resultado de una o más mutaciones - por ejemplo utilizando técnicas de ADN recombinante u otra técnica de mutagénesis tal como la radiación UV - en una secuencia de ácido nucleico presente en dicho tipo salvaje (tal como un gen que codifica un polipéptido de tipo salvaje) o en el que la secuencia de ácido nucleico de un gen se ha modificado para fijar como objetivo el producto polipeptídico (que lo codifica) hacia otro compartimento celular. Además, la expresión "(célula) recombinante" en particular se refiere a una cepa (célula) de la que se han eliminado secuencias de ADN utilizando técnicas de ADN recombinante.

La expresión "célula (levadura) transgénica", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una cepa (célula) que contiene ácido nucleico y que no se encuentra de forma natural en esa cepa (célula) y que se ha introducido en esa cepa (célula) utilizando técnicas de ADN recombinante, es decir, una célula recombinante).

El término "mutado", tal como se utiliza en esta memoria con respecto a proteínas o polipéptidos, significa que al menos un aminoácido en la secuencia de proteína o polipéptido de tipo salvaje o de origen natural ha sido reemplazado por un aminoácido diferente, ha sido insertado o eliminado de la secuencia a través de mutagénesis de ácidos nucleicos que codifican estos aminoácidos. La mutagénesis es un método bien conocido en la técnica e incluye, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio por medio de PCR o mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2a ed., Vol. 1-3 (1989). El término "mutado", tal como se utiliza en esta memoria con respecto a los genes, significa que al menos un nucleótido en la secuencia de ácido nucleico de ese gen o una secuencia reguladora del mismo, ha sido reemplazado por un nucleótido diferente, o ha sido eliminado de la secuencia mediante mutagénesis, lo que resulta en la transcripción de una secuencia de proteínas con una función cualitativa o cuantitativamente alterada o la inactivación de ese gen.

El término "gen", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene un molde para una polimerasa de ácido nucleico, en eucariotas, la ARN polimerasa II. Los genes se transcriben en ARNms que luego se traducen en proteínas.

La expresión "ácido nucleico", tal como se utiliza en esta memoria, incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, es decir, un polinucleótido, ya sea en forma de cadena sencilla o doble y, a menos que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en el sentido de que se hibridan con ácidos nucleicos de cadena sencilla de manera similar a los nucleótidos que se producen de formas natural (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos). Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen regulador o estructural nativo o heterólogo. A menos que se indique lo contrario, el término incluye la referencia a la secuencia especificada, así como a la secuencia complementaria de la misma. Por lo tanto, los ADNs o ARNs con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" en el sentido en que se entiende este término en esta memoria. Además, los ADNs o ARNs que comprenden bases inusuales tales como inosina, o bases modificadas tales como las bases tritiladas, por citar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos tal como se utiliza el término en esta memoria. Se apreciará que se ha realizado una gran diversidad de modificaciones en el ADN y el ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término polinucleótido, tal como se emplea en esta memoria, abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluyen, entre otras cosas, células simples y complejas.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a un polímero de residuos aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido que se produce de forma natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de forma natural. La naturaleza esencial de análogos de aminoácidos que se producen de forma natural natural de este tipo es que, cuando se incorporan a una proteína, esa proteína es específicamente reactiva frente a los anticuerpos provocados contra la misma proteína pero que consisten enteramente en aminoácidos que se producen de forma natural. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también son inclusivos de modificaciones que incluyen, pero no se limitan a glicosilación, unión a lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación.

Cuando se menciona una enzima con referencia a una clase de enzimas (EC, por sus siglas en inglés), la clase de enzima es una clase en la que la enzima se clasifica o puede clasificarse, sobre la base de la Nomenclatura de Enzimas proporcionada por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB), cuya nomenclatura se puede encontrar en http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/. Se pretende que se incluyan otras enzimas adecuadas que (todavía) no han sido clasificadas en una clase específica, pero que pueden clasificarse como tales.

Si en esta memoria se hace referencia a una proteína o a una secuencia de ácido nucleico tal como un gen, por referencia a un número de acceso, este número en particular se utiliza para referirse a una proteína o secuencia de ácido nucleico (gen) que tiene una secuencia que se puede encontrar a través de www.ncbi.nlm.nih.gov/ (disponible el 13 de julio de 2009) a menos que se especifique lo contrario.

Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos en esta memoria que codifica un polipéptido también, por referencia al código genético, describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. La expresión "variantes modificadas de forma conservadora" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o modificadas de forma conservadora de las secuencias de aminoácidos debido a la degeneración del código genético. La expresión "degeneración del código genético" se refiere al hecho de que un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que un codón especifica una alanina, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Variaciones de este tipo de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada de forma conservadora.

La expresión "homólogo funcional" (o abreviada "homólogo") de un polipéptido que tiene una secuencia específica (p. ej., SEQ ID NO: X), tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un polipéptido que comprende dicha secuencia específica, con la condición de que uno o más aminoácidos se sustituyan, eliminen, añadan y/o inserten, y qué polipéptido tenga (cualitativamente) la misma funcionalidad enzimática para la conversión de sustrato. Esta funcionalidad puede testarse mediante el uso de un sistema de ensayo que comprende una célula de levadura recombinante que comprende un vector de expresión para la expresión del homólogo en levaduras, comprendiendo dicho vector de expresión una secuencia de ácido nucleico heteróloga enlazada operativamente a un promotor funcional en la levadura y dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica el polipéptido homólogo, cuya actividad enzimática para convertir acetil-coenzima A en acetaldehído en la célula de levadura se ha de testar, y evaluar si dicha conversión se produce en dichas células. Homólogos candidatos pueden identificarse utilizando el análisis de similitud in silico.. Un ejemplo detallado de un análisis de este tipo se describe en el Ejemplo 2 del documento WO2009/013159. La persona experta será capaz de deducir cómo se pueden encontrar homólogos candidatos adecuados y, opcionalmente tras la optimización de codones (pares), será capaz de testar la funcionalidad requerida de homólogos candidatos de este tipo utilizando un sistema de ensayo adecuado como se describe arriba. Un homólogo adecuado representa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos similar a un polipéptido específico de más del 50 %, preferiblemente del 60 % o más, en particular de al menos el 70 %, más en particular de al menos el 80 %, al menos el 90 % , al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % y que tenga la funcionalidad enzimática requerida. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos, la expresión homólogo funcional pretende incluir secuencias de ácidos nucleicos que difieren de otra secuencia de ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético y codifican la misma secuencia polipeptídica.

La identidad de secuencia se define en esta memoria como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácido nucleico (polinucleótido), según se determina comparando las secuencias. Habitualmente, las identidades o similitudes de las secuencias se comparan a lo largo de toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según sea el caso, de acuerdo con lo determinado por la coincidencia entre cadenas de secuencias de este tipo.

Se dice que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son homólogas cuando exhiben un determinado nivel de similitud. Dos secuencias que son homólogas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homólogas están estrechamente relacionadas o más distantes se indica mediante el "porcentaje de identidad" o el "porcentaje de similitud", que es alto o bajo, respectivamente. Aunque se discute, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", "nivel de homología" o "porcentaje de homología" se utilizan con frecuencia de manera indistinta. Se puede lograr una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias utilizando un algoritmo matemático. La persona experta estará al tanto del hecho de que varios programas informáticos diferentes están disponibles para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison En D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Para el propósito de esta invención se utilizó el programa n Ee DLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,I. y Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para las secuencias de proteínas, se utiliza EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos se utiliza EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros opcionales utilizados para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalización de hueco abierto de 10 y una penalización de extensión de hueco de 0,5. La persona experta apreciará que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes, pero que el porcentaje global de identidad de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.

Definición de Homología Global

La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas sobre la región alineada total, incluyendo cualesquiera huecos o extensiones. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula de la siguiente manera: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias, dividido por la longitud total del alineamiento, incluidos los huecos. La identidad definida en esta memoria se puede obtener de NEEDLE y está marcada en la salida del programa como "IDENTIDAD".

Definición de Identidad más Larga

La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula de la siguiente manera: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias, dividido por la longitud total del alineamiento, después de restar el número total de huecos en el alineamiento. La identidad definida en esta memoria se puede obtener de NEEDLE utilizando la opción NOBRIEF y está marcada en la salida del programa como "identidad más larga".

Una variante de una secuencia de nucleótidos o aminoácidos descrita en esta memoria también puede definirse como una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que tiene una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones en comparación con la secuencia de nucleótidos o aminoácidos específicamente descrita en esta memoria (p. ej., en el listado de secuencias).

Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, la persona experta también puede tener en cuenta las llamadas sustituciones de aminoácidos "conservadoras", como quedará claro para la persona experta. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo en las secuencias descritas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácido es conservador. Las sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los aminoácidos naturales son las siguientes: Ala con ser; Arg con lys; Asn con gln o his; Asp con glu; Cys con ser o ala; Gln con asn; Glu con asp; Gly con pro; His con asn o gln; Ile con leu o val; Leu con ile o val; Lys con arg, gln o glu; Met con leu o ile; Phe con met, leu o tyr; Ser con thr; Thr con ser; Trp con tyr; Tyr con trp o phe; y Val con ile o leu.

Secuencias de nucleótidos de la invención también pueden definirse por su capacidad de hibridar con partes de secuencias de nucleótidos específicas descritas en esta memoria, respectivamente, en condiciones de hibridación moderadas o, preferiblemente, estrictas. Condiciones de hibridación estrictas se definen en esta memoria como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 25, de preferencia aproximadamente 50 nucleótidos, 75 o 100 y lo más preferiblemente aproximadamente 200 o más nucleótidos, hibride a una temperatura de aproximadamente 65 °C en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica equiparable, y lavado a 65 °C en una solución que comprenda aproximadamente 0,1 M de sal, o menos, preferiblemente 0,2 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica equiparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas y, preferiblemente, el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones permitirán habitualmente la hibridación específica de secuencias que tengan aproximadamente un 90 % o más de identidad de secuencia.

Condiciones de hibridación moderadas se definen en esta memoria como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, hibride a una temperatura de aproximadamente 45 °C en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica equiparable, y lavado a temperatura ambiente en una solución que comprenda aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica equiparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas y, preferiblemente, el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones permitirán habitualmente la hibridación específica de secuencias que tengan un 50 % de identidad de secuencia. La persona experta en la técnica será capaz de modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar específicamente secuencias que varían en identidad entre el 50% y el 90%.

"Expresión" se refiere a la transcripción de un gen en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARN mensajero (ARNm) con la subsiguiente traducción en una proteína.

Tal como se utiliza en esta memoria, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico o una proteína es un ácido nucleico o una proteína que se origina en una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico por la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor enlazado operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de la que se derivó el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados a partir de su forma original. Una proteína heteróloga puede tener su origen en una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente a partir de su forma original por intervención humana deliberada.

La expresión "expresión heteróloga" se refiere a la expresión de ácidos nucleicos heterólogos en una célula huésped. La expresión de proteínas heterólogas en sistemas de células huésped eucarióticas tales como levaduras es bien conocida por los expertos en la técnica. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de un gen que codifica una enzima con una actividad específica puede expresarse en dicho sistema eucariótico. En algunas realizaciones, las células de levadura transformadas/transfectadas pueden emplearse como sistemas de expresión para la expresión de las enzimas. La expresión de proteínas heterólogas en levadura es bien conocida. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) es un trabajo bien reconocido que describe los diversos métodos disponibles para expresar proteínas en levaduras. Dos levaduras ampliamente utilizadas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, cepas y protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia son conocidos en la técnica y están disponibles de proveedores comerciales (p. ej., Invitrogen). Vectores adecuados tienen habitualmente secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

Tal como se utiliza en esta memoria, "promotor" es una secuencia de ADN que dirige la transcripción de un gen (estructural). Típicamente, un promotor está ubicado en la región 5' de un gen, próximo al sitio de inicio de la transcripción de un gen (estructural). Secuencias de promotor pueden ser constitutivas, inducibles o reprimibles. Si un promotor es un promotor inducible, entonces la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor.

El término "vector", tal como se utiliza en esta memoria, incluye la referencia a un vector de expresión autosómico y a un vector de integración utilizado para la integración en el cromosoma.

La expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) segmentos de ácido nucleico adicionales que proporcionan su transcripción. Segmentos adicionales de este tipo pueden incluir secuencias de promotor y terminador, y pueden incluir opcionalmente uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente de plásmidos o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos. En particular, un vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3' y enlazada operativamente: (a) una región de inicio de la transcripción y traducción reconocida por la levadura, (b) una secuencia codificante de un polipéptido de interés y (c) una región de terminación de la transcripción y traducción reconocida por la levadura. "Plásmido" se refiere a ADN extracromosómico de replicación autónoma que no está integrado en el genoma de un microorganismo y habitualmente es de naturaleza circular.

Un "vector de integración" se refiere a una molécula de ADN, lineal o circular, que se puede incorporar en el genoma de un microorganismo y proporciona una herencia estable de un gen que codifica un polipéptido de interés. El vector de integración comprende generalmente uno o más segmentos que comprenden una secuencia génica que codifica un polipéptido de interés bajo el control de (es decir, enlazado operativamente a) segmentos de ácido nucleico adicionales que proporcionan su transcripción. Segmentos adicionales de este tipo pueden incluir secuencias de promotor y terminador, y uno o más segmentos que impulsan la incorporación del gen de interés en el genoma de la célula diana, habitualmente mediante el proceso de recombinación homóloga. Típicamente, el vector de integración será uno que pueda transferirse a la célula diana, pero que tenga un replicón que no sea funcional en ese organismo. La integración del segmento que comprende el gen de interés puede seleccionarse si se incluye un marcador apropiado dentro de ese segmento.

Por “célula huésped” se entiende una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector. Las células huésped pueden ser células procarióticas tales como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insectos, anfibios o mamíferos. Preferiblemente, las células huésped son células eucarióticas del orden de Actinomycetales.

"Transformación" y "transformar", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, apareamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o, alternativamente, se puede integrar en el genoma de la célula huésped.

La célula de levadura se selecciona preferiblemente del grupo de Saccharomyceraceae, tales como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces beticus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces uvarum y Saccharomyces bayanus;_Schizosaccharomyces tales como Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus y Schizosaccharomyces cryophiius; Torulaspora tales como Torulaspora delbrueckii; Kluyveromyces tales como Kluyveromyces marxianus; Pichia tales como Pichia stipitis, Pichia pastoris o pichia angusta, Zygosaccharomyces tales como Zygosaccharomyces bailii; Brettanomyces tales como Brettanomyces intermedius,.Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis y Dekkera anomala; Metschnikowia, Issatchenkia, tales como Issatchenkia orientalis, Kloeckera tales como Kloeckera apiculata; Aureobasidium tales como Aureobasidium pullulans.

En una realización altamente preferida, la célula de levadura se selecciona del grupo de Saccharomyceraceae. En particular, se han logrado buenos resultados con una célula de Saccharomyces cerevisiae. Se ha encontrado que es posible utilizar una célula de este tipo de acuerdo con la invención en un método para preparar un alcohol (etanol) en el que la formación de productos secundarios dependientes de NADH (glicerol) se redujo en aproximadamente un 90 % y en el que el rendimiento del producto deseado (etanol) se incrementó en aproximadamente un 10 %, en comparación con una célula similar sin Rubisco y PRK.

La Rubisco es una Rubisco que comprende la secuencia proteica de la SECUENCIA ID NO: 2 o un homólogo funcional de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO: 2.

La SECUENCIA ID NO: 2 muestra la secuencia de una Rubisco particularmente preferida de acuerdo con la invención. Está codificada por el gen cbbMde Thiobacillus denitrificans.. Una alternativa a esta Rubisco es un homólogo funcional de esta Rubisco, en particular un homólogo funcional de este tipo que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la SECUENCIA ID NO: 2. Polipéptidos Rubisco naturales adecuados se dan en la Tabla 1.

Tabla 1: Polipéptidos Rubisco

De acuerdo con la invención, la Rubisco se expresa funcionalmente en el microorganismo, al menos durante su uso en un proceso industrial para preparar un compuesto de interés.

Para aumentar la probabilidad de que la actividad enzimática de esta memoria se exprese a niveles suficientes y en forma activa en las células huésped transformadas (recombinantes) de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica estas enzimas, así como la enzima Rubisco y otras enzimas de la invención (véase más adelante), se adaptan preferiblemente para optimizar su uso de codones al de la célula huésped en cuestión. La capacidad de adaptación de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima al uso de codones de una célula huésped puede expresarse como índice de adaptación de codones (CAI, por sus siglas en inglés). El índice de adaptación de codones se define en esta memoria como una medida de la adaptabilidad relativa del uso de codones de un gen hacia el uso de codones de genes altamente expresados en una célula huésped u organismo particular. La adaptabilidad relativa (w) de cada uno de los codones es la relación entre el uso de cada uno de los codones y el del codón más abundante para el mismo aminoácido. El índice CAI se define como la media geométrica de estos valores relativos de adaptabilidad. Se excluyen los codones no sinónimos y los codones de terminación (dependiendo del código genético). Los valores de CAI varían de 0 a 1; indicando los valores más altos una mayor proporción de los codones más abundantes (véase Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; véase también: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res.

31 (8):2242-51). Una secuencia de nucleótidos adaptada tiene preferiblemente un CAI de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9. Las más preferidas son las secuencias que han sido optimizadas por codones para la expresión en la célula huésped fúngica en cuestión tales como, p. ej., células de S. cerevisiae.

Preferiblemente, la Rubisco expresada funcionalmente tiene una actividad, definida por la tasa de incorporación de 14C-bicarbonato dependiente de ribulosa-1,5-bifosfato por extractos celulares de al menos 1 nmol.min-1.(mg de proteína)-1, en particular una actividad de al menos 2 nmol.min-1 (mg de proteína)-1, más en particular una actividad de al menos 4 nmol.min-1 (mg de proteína)-1. El límite superior para la actividad no es crítico. En la práctica, la actividad puede ser de aproximadamente 200 nmol.min-1 (mg de proteína)-1 o menos, en particular 25 nmol.min-1 (mg de proteína)-1, más en particular 15 nmol.min-1 (mg de proteína)-1 o menos, p. ej., aproximadamente 10 nmol.min-1.(mg de proteína)-1 o menos. Cuando se hace referencia en esta memoria a la actividad de Rubisco, se entiende en particular la actividad a 30 °C. Las condiciones para un ensayo para determinar esta actividad de Rubisco son las que se encuentran en los Ejemplos que figuran más adelante (Ejemplo 4).

Una fosforribuloquinasa expresada funcionalmente (PRK, (EC 2.7.1.19)) de acuerdo con la invención es capaz de catalizar la reacción química:

ATP D-ribulosa-5-fosfato ^ ADP D-ribulosa 1,5-blsfosfato (1)

Por lo tanto, los dos sustratos de esta enzima son ATP y D-ribulosa 5-fosfato, mientras que sus dos productos son ADP y D-ribulosa 1,5-bisfosfato.

PRK pertenece a la familia de las transferasas, específicamente a aquellas que transfieren grupos que contienen fósforo (fosfotransferasas) con un grupo alcohol como aceptor. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es ATP:D-ribulosa-5-fosfato 1-fosfotransferasa. Otros nombres de uso común incluyen fospentoquinasa, ribulosa-5-fosfato quinasa, fosfopentoquinasa, fosforribuloquinasa (fosforilante), 5-fosforribulosa quinasa, ribulosa fosfato quinasa, PKK, PRuK y PRK. Esta enzima participa en la fijación de carbono.

La PRK puede ser de un procariota o un eucariota. Se han logrado buenos resultados con una PRK procedente de un eucariota. Preferiblemente, la PRK eucariótica procede de una planta seleccionada de Caryophyllales, en particular de Amaranthaceae, más en particular de Spinacia.

Como alternativa preferida a PRK de Spinacia puede estar presente un homólogo funcional de PRK de Spinacia, en particular un homólogo funcional que comprende una secuencia que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO 4.

Polipéptidos PRK naturales adecuados se dan en la Tabla 2.

Tabla 2: Polipéptidos PRK naturales adecuados para la expresión

En una realización ventajosa, el microorganismo recombinante comprende, además, una secuencia de ácido nucleico que codifica una o más chaperonas moleculares procarióticas o eucarióticas heterólogas que, cuando se expresan, son capaces de interactuar funcionalmente con una enzima en el microorganismo, en particular con al menos una de Rubisco y PRK.

Las chaperoninas son proteínas que proporcionan condiciones favorables para el correcto plegamiento de otras proteínas, evitando así la agregación. Habitualmente, las proteínas recién creadas deben plegarse de una cadena lineal de aminoácidos a una forma tridimensional. Las chaperoninas pertenecen a una gran clase de moléculas que ayudan al plegamiento de proteínas, denominadas chaperonas moleculares. La energía para plegar las proteínas es suministrada por el adenosin trifosfato (ATP). Un artículo de revisión sobre chaperonas que es útil en esta memoria es el escrito por Yébenes (2001); ''Chaperonins: two rings for folding"; Hugo Yébenes et al. Trends in Biochemical Sciences, agosto de 2011, Vol. 36, N° 8.

En una realización preferida, la chaperona o las chaperonas son de una bacteria, más preferiblemente de Escherichia, en particular E. coli GroEL y GroES de E. coli pueden codificarse en particular en un microorganismo de acuerdo con la invención. Otras chaperonas preferidas son chaperonas de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae Hsp10 y Hsp60. Si las chaperonas se expresan de forma natural en un orgánulo tal como una mitocondria (ejemplos son Hsp60 y Hsp10 de Saccharomyces cerevisiae), se puede lograr la reubicación en el citosol, p. ej., modificando la secuencia señal nativa de las chaperoninas.

En eucariotas, las proteínas Hsp60 y Hsp10 son estructural y funcionalmente casi idénticas a GroEL y GroES, respectivamente. Por lo tanto, se contempla que Hsp60 y Hsp10 de cualquier célula eucariótica pueden servir como chaperonas para Rubisco. Véase Zeilstra-Ryalls J, Fayet O, Georgopoulos C (1991). "The universally conserved GroE (Hsp60) chaperonins" Annu Rev Microbiol. 45: 301-25. doi:10.1146/annurev.mi.45.100191.001505. PMID 1683763 y Horwich AL, Fenton WA, Chapman E, Farr GW (2007) "Two Families of Chaperonin: Physiology and Mechanism" Annu Rev Cell Dev Biol. 23: 115-45. doi:10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123555. PMID 17489689.

Se han logrado resultados particularmente buenos con una célula de levadura recombinante que comprende tanto las chaperonas heterólogas GroEL como GroES.

Como una alternativa preferida a GroEL, puede estar presente un homólogo funcional de GroEL, en particular, un homólogo funcional que comprenda una secuencia que tenga al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO: 10.

Polipéptidos de chaperonas naturales adecuados homólogos a SECUENCIA ID NO: 10 se dan en la Tabla 3.

Tabla 4: Chaperonas naturales homologas a SECUENCIA ID NO: 12 polipéptidos adecuados para la expresión

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Como una alternativa preferida a GroES, puede estar presente un homólogo funcional de GroES, en particular, un homólogo funcional que comprenda una secuencia que tenga al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO: 12.

Polipéptidos de chaperonas naturales adecuados homólogos a SECUENCIA ID NO: 12 se dan en la Tabla 4.

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Tabla 3: Chaperonas naturales homologas a SECUENCIA ID NO: 10 polipéptidos adecuados para la expresión

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En una realización, una chaperona de 10 kDa de la Tabla 4 se combina con una chaperona coincidente de 60 kDa de la Tabla 3 del mismo género o especie de organismo para la expresión en el huésped.

Por ejemplo: >gi|189189366|ref|XP_001931022.1|:71-168 chaperonina de 10 kDa [Pyrenophora tritici-repentis] expresada junto con >gi| 189190432|ref|XP_001931555.11 proteína de choque térmico 60, precursor mitocondrial coincidente [Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP].

Todas las demás combinaciones de las Tablas 3 y 4 hechas de manera similar con la misma fuente de organismos también están disponibles para la expresión por parte de la persona experta.

Además, se puede combinar una chaperona de la Tabla 3 de un organismo con una chaperona de la Tabla 4 de otro organismo, o se puede combinar GroES con una chaperona de la Tabla 3, o se puede combinar GroEL con una chaperona de la Tabla 4.

Como se deduce de lo anterior, la célula de levadura se puede utilizar en un método para preparar un compuesto orgánico que comprende convertir una fuente de carbono, formando así el compuesto orgánico. El método puede llevarse a cabo en condiciones aerobias, limitadas en oxígeno o anaerobias.

La invención permite, en particular, una reducción en la formación de un producto secundario dependiente de NADH, especialmente glicerol, hasta en un 100 %, hasta en un 99 % o hasta en un 90 %, en comparación con dicha producción en una cepa de referencia correspondiente. La formación de productos secundarios dependiente de NADH se reduce preferiblemente en más del 10 % en comparación con la cepa de referencia correspondiente, en particular en al menos el 20 %, más en particular en al menos el 50 %. La producción de productos secundarios dependientes de NADH se reduce preferiblemente en un 10-100 %, en particular en un 20-95 %, más en particular en un 50-90 %.

En el método preferido en el que se utiliza Rubisco, u otra enzima capaz de catalizar la formación de un compuesto orgánico a partir de CO² (y otro sustrato) u otra enzima que cataliza la función del CO² como un aceptor de electrones, la concentración de dióxido de carbono en el medio de reacción es al menos el 5 % de la concentración de saturación de CO² en las condiciones de reacción, en particular al menos el 10% de dicha concentración de saturación de CO² , más en particular al menos el 20 % de dicha concentración de saturación de CO². Esto es particularmente ventajoso con respecto al rendimiento del producto. El medio de reacción puede estar sobresaturado en la concentración de CO² , saturado en la concentración de CO² o puede tener una concentración por debajo de la concentración de saturación. En una realización específica, la concentración de CO²es el 75 % de la concentración de saturación o menos, en particular el 50 % de dicha concentración de saturación o menos, más en particular es el 25 % de la concentración de saturación de CO² o menos.

En una realización específica, el dióxido de carbono o parte del mismo se forma in situ por el microorganismo. Si se desea, el método comprende, además, la etapa de añadir CO² externo al sistema de reacción, habitualmente mediante aireación con CO² o una mezcla de gases que contiene CO² , por ejemplo una mezcla de CO² / nitrógeno. La adición de CO² externo en particular se utiliza para (aumentar o) mantener el CO² dentro de un intervalo de concentraciones deseado, si no se forma CO² in situ. o se forma insuficientemente.

La determinación de la concentración de CO² en un fluido está dentro de las habilidades rutinarias de la persona experta en la técnica. En la práctica, se puede determinar rutinariamente la concentración de CO² en la fase gaseosa por encima de un cultivo de la levadura (prácticamente el gas de escape si el medio se purga con un gas). Esto se puede medir de forma rutinaria utilizando un analizador de gases comercial, tal como un analizador de gases RosemountNGA200000 (Rosemount Analytical, Orrvile, EE.UU.). La concentración en la fase líquida (con respecto a la concentración de saturación) puede calcularse entonces a partir del valor medido en el gas, a partir de la concentración de saturación de CO² y los coeficientes de Henri en las condiciones existentes en el método. Estos parámetros están disponibles en manuales o se pueden determinar de forma rutinaria.

Como fuente de carbono, en principio se puede utilizar cualquier fuente de carbono que el microorganismo pueda utilizar como sustrato. En particular, puede utilizarse una fuente de carbono orgánico, seleccionada del grupo de hidratos de carbono y lípidos (incluyendo los ácidos grasos). Hidratos de carbono adecuados incluyen monosacáridos, disacáridos y polisacáridos hidrolizados (p. ej., almidones hidrolizados, hidrolizados lignocelulósicos). Aunque puede estar presente un ácido carboxílico, no es necesario incluir un ácido carboxílico tal como ácido acético, como fuente de carbono.

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En particular es una ventaja de la presente invención que sea factible un rendimiento de etanol mejorado y una producción de glicerol reducida en comparación, p. ej., con una célula de levadura de tipo salvaje, sin necesidad de intervenir en el genoma de la célula mediante la inhibición de una glicerol 3- fosfato fosfohidrolasa y/o que codifica un gen de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa.

Todavía, en una realización específica, una célula de levadura de acuerdo con la invención puede comprender una deleción o alteración de una o más secuencias de nucleótidos endógenas que codifican una glicerol 3-fosfato fosfohidrolasa y/o que codifican un gen de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa:

En esta memoria,.en la célula, se reduce o elimina la actividad enzimática necesaria para la síntesis de glicerol dependiente de NADH. La reducción o deleción de esta actividad enzimática se puede lograr modificando uno o más genes que codifican una actividad de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) dependiente de NAD o uno o más genes que codifican una actividad de glicerol fosfato fosfatasa (GPP), de tal manera que la enzima se expresa considerablemente menos que en el tipo salvaje o de manera que el gen codifica un polipéptido con actividad reducida.

Modificaciones de este tipo pueden llevarse a cabo utilizando técnicas biotecnológicas comúnmente conocidas, y pueden incluir, en particular, una o más mutaciones de inactivación o mutagénesis dirigida al sitio de regiones promotoras o regiones codificantes de los genes estructurales que codifican GPD y/o GPP. Alternativamente, las cepas de levadura que son defectuosas en la producción de glicerol pueden obtenerse mediante mutagénesis aleatoria seguida de la selección de cepas con actividad reducida o ausente de GPD y/o GPP. Los genes GPD1, GPD2, GPP1 y GPP2 de S. cerevisiae se muestran en el documento WO 2011/010923, y se describen en SEQ ID NO: 24-27 de esa solicitud. Los contenidos de esta aplicación se incorporan como referencia, en particular los contenidos relacionados con GPD y/o GPP.

Como se muestra en los Ejemplos que siguen, se encuentra que la invención es particularmente ventajosa en un procedimiento para la producción de un alcohol, especialmente etanol. Sin embargo, se contempla que la idea de que el CO² puede ser utilizado como un aceptor de electrones en microorganismos que no lo permiten de forma natural, tiene un beneficio industrial para otros procedimientos biotecnológicos para la producción de moléculas orgánicas, en particular moléculas orgánicas de un peso molecular relativamente bajo,. particularmente moléculas orgánicas con un peso molecular inferior a 1000 g/mol.

La producción del compuesto orgánico de interés puede tener lugar en una célula de levadura conocida por su utilidad en la producción del compuesto orgánico de interés, con la condición de que la célula de levadura haya sido modificada genéticamente para permitir el uso de dióxido de carbono como aceptor de electrones en el organismo.

Aunque se contempla que una célula de levadura de acuerdo con la invención sea interesante para la producción de una diversidad de compuestos orgánicos industrialmente relevantes, la invención se considera particularmente ventajosa para la producción de un alcohol, en particular un alcohol seleccionado del grupo de etanol, n-butanol y 2,3-butanodiol; o en la producción de un ácido orgánico/carboxilato, en particular un carboxilato seleccionado del grupo de L-lactato, 3-hidroxipropionato, D-malato, L-malato, succinato, citrato, piruvato e itaconato.

Con respecto a la producción de etanol, detalles se encuentran arriba en esta memoria, al describir la célula de levadura que comprende PRK y Rubisco y en los ejemplos. El etanol u otro alcohol se produce preferiblemente en un proceso fermentativo.

Para la producción de varios ácidos orgánicos (carboxilatos), p. ej., ácido cítrico, es útil un proceso aerobio. Para la producción de ácido cítrico, se pueden utilizar, por ejemplo, Aspergillus niger, Yarrowia lipolytica, u otro organismo productor de citrato conocido.

Un ejemplo de un ácido orgánico que se produce preferentemente de forma anaerobia es el ácido láctico. En general, se conocen en la técnica diversas cepas bacterianas productoras de ácido láctico y cepas de levadura que se han diseñado para la producción de lactato.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Construcción del vector de expresión

El ADNc de fosforribuloquinasa (PRK) de Spinacia olerácea (espinaca) (número de acceso de EMBL: X07654.1) se amplificó por PCR utilizando la polimerasa de arranque en caliente Phusion (Finnzymes, Landsmeer, Países Bajos) y los oligonucleótidos Xbal_prk-FW2 y RV1_Xhol_prk (Tabla 5), y se ligó en pCR®-Blunt II-TOPO® (Life Technologies Europe BV, Bleiswijk, Países Bajos).

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Tabla 5. Oligonucleótidos

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Después de la restricción por XbaI y XhoI, el fragmento que contenía PRK se ligó en pTEF424. El TEF1p se reemplazó más tarde por GAL1p del plásmido pSH47 por restricción/ligación con Xbal y SacI, creando el plásmido pUDE046 (véase la Tabla 6).

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Tabla 6: Plásmidos

El gen Rubisco forma II cbbM de Thiobacillus denitrificans (T. denitrificans) flanqueado por los sitios KpnI y SacI se optimizó por codones, se sintetizó en GeneArt (Life Technologies Europe BV) y se ligó en pPCR-Script, a continuación, el plásmido se digirió mediante BamHI y SacI. El fragmento que contenía cbbM se ligó en el vector pGPD_426 restringido por BamHI y Sacl creando el plásmido pBTWW002. El casete de expresión de cbbM se transfirió en pRS416 utilizando KpnI y Sacl, produciendo pUDC098.

El casete de expresión de las queparonas Rubisco forma II específicas de T. denitrificans cbbQ2 y cbbO2 y las chaperonas groEL y groES de E. coli.. fueron optimizados por codones. Los casetes de expresión contenían promotores constitutivos de levadura y un terminador, que flanqueaban el gen optimizado por codones. El casete estaba flanqueado por regiones únicas de 60 pb obtenidas mediante la combinación aleatoria de secuencias de código de barras utilizadas en el Proyecto de Deleción del Genoma de Saccharomyces y un sitio EcoRV (GeneArt). Los casetes de expresión se insertaron en el plásmido pMK-RQ (GeneArt) utilizando los sitios de clonación SfiI, produciendo pUB230 (PGI1p-cbbQ2-TEF2t), pUD231 (PGK1p-cbbO2-ADH1t), pUD232(TEF1p-groEL-ACT1t) y pUDE233 (TPI1p-groES-PGI1t) Tabla 6). El casete de expresión TDH3p-cbbM-CYC1t se amplificó por PCR a partir del plásmido pBTWW002 utilizando Phusion Hot-Start Polymerase (Finnzymes) y los cebadores HR-cbbM-FW-65 y HR-cbbM-RV-65 con el fin de incorporar la región de 60 pb para la clonación por recombinación.

Ejemplo 2. Construcción, aislamiento y mantenimiento de cepas

Todas las cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas (Tabla 7) pertenecen a la familia CEN.PK. Todas las cepas se cultivaron en medio sintético de glucosa al 2% p/v commentado con 150 mg L-1 de uracilo cuando se requería

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hasta que alcanzaron la fase exponencial final, luego se añadió glicerol estéril hasta aprox. 30 % v/v y partes alícuotas de 1 ml se almacenaron a -80 °C.

Tabla 7: Cepas de Saccharomyces cerevisiae

La cepa IMC014 que co-expresó la forma II de Rubisco ccbMy las cuatro chaperonas cbbQ2, cbbO2, groEL y groES se construyó utilizando recombinación asociada a la transformación in vivo. Se agruparon 200 fmol de cada uno de los casetes de expresión con 100 fmol de la cadena principal de pRS416 linearizado con KpnI/SacI en un volumen final de 50 pl y se transformaron en CEN.PK 113-5D utilizando el protocolo de acetato de litio (Gietz, et al., Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method in Yeast Protocol, Humana press, 2006). Las células se seleccionaron en medio sintético. El ensamblaje correcto del fragmento de pUDC075 se realizó mediante PCR multiplex en colonias transformantes utilizando cebadores que permiten la amplificación sobre las regiones utilizadas para la recombinación homóloga (Tabla 5) y mediante análisis de restricción después de la re-transformación del plásmido aislado en E. coli DH5a. PUDC075 fue secuenciado por Next-Generation Sequencing (Illumina, San Diego, California, EE.UU.) (100 lecturas br emparejadas en los extremos, 50Mb) y ensamblado con Velvet (Zerbino, et al., Velvet: Algorithms for De Novo Short Read Assembly Using De Bruijn Graphs, Genome Research, 2008). La secuencia ensamblada no contenía mutaciones en ninguno de los casetes de expresión ensamblados. Las cepas IMC034 e IMC035 que expresaban ccbM/ccbQ2/ccbO2 y ccbM/groEL/groES, respectivamente se construyeron utilizando el mismo método de ensamblaje in vivo con la siguiente modificación. Para construir los plásmidos pUDC099 y pUDC100, se utilizaron un enlazador cbbO2-pRS416 de 120 pb y un enlazador cbbM-GroEL para cerrar el ensamblaje, respectivamente (Tabla 5), se añadieron a la transformación 100 fmol de cada uno de los oligonucleótidos complementarios de 120 pb. La cepa IMC033 que solo expresaba el gen cbbM se construyó transformando CEN.PK113-5D con pUDC098.

Para construir la cepa IMU033 que co-expresaba PRK, ccbM, ccbQ2, ccbO2, GroEL, GroES, se construyó la cepa intermedia IMI229 integrando p Rk , las cuatro chaperonas y KILEU2 (Güldener, et al., A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast, Nucleic Acids Research, 2002) en el locus CAN1 mediante integración homóloga in vivo en CEN.PK102-3A. Los casetes de expresión se amplificaron por PCR utilizando Phusion Hot-Start Polymerase (Finnzymes, Thermo Fisher Scientific Inc. Massachusetts, EE.UU.), los oligonucleótidos correspondientes y moldes de ADN (Tabla 5). Finalmente, la cepa IMI229 se transformó con pUDC100 que lleva la forma II de Rubisco ccbM y las dos chaperonas de E. coli groEL y groES.

La cepa IM1232 se construyó transformando CEN.PK102-3A con el casete KILEU2. Finalmente IMI232 se transformó con el plásmido p426GPD para restaurar la prototrofia, dando como resultado la cepa de referencia IMU032.

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Ejemplo 3. Configuración experimental de quimiostatos y experimentos por lotes

El cultivo de quimiostatos anaeróbobio se realizó esencialmente como se describe (Basso, et al., Engineering topology and kinetics of sucrose metabolism in Saccharomyces cerevisiae for better ethanol yield, Metabolic Engineering 13:694-703, 2011), pero con 12,5 g I-1 de glucosa y 12,5 g I-1 de galactosa como fuente de carbono y, cuando se indique, una mezcla de 10 % de CO2/90 % de N² reemplazó al nitrógeno puro como gas de aspersión. Las concentraciones de glucosa y galactosa residuales se determinaron después de un enfriamiento rápido (Mashego, et al., Critical evaluation of sampling techniques for residual glucose determination in carbon-limited chemostat culture of Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology and Bioengineering 83:395-399, 2003) utilizando ensayos enzimáticos comerciales de glucosa (Boehringer, Mannheim, Alemania) y D-galactosa (Megazyme, Bray, Irlanda). Los cultivos por lotes en biorreactores anaerobios se cultivaron esencialmente como se describe (Guadalupe Medina, et al., Elimination of glicerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Applied and Environmental Microbiology 76:190-195, 2010), pero con 20 g L^-1 de galactosa y un gas de aspersión consistente en un 10 % de CO² y un 90 % de N². Las concentraciones de biomasa y metabolitos en lotes y quimiostatos y cultivos en lotes se determinaron según se describe por Guadalupe et al. (Guadalupe Medina, et al., Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Appl. Environ. Microbiol. 76, 190-195, 2010). En los cálculos de flujos y rendimientos de etanol, la evaporación de etanol se corrigió en función de una constante de velocidad de evaporación de primer orden de 0,008 h^-1 en las configuraciones del biorreactor y bajo las condiciones utilizadas en este estudio.

Ejemplo 4. Ensayos enzimáticos para fosforribuloquinasa (PRK) y Rubisco

Extractos celulares para el análisis de la actividad de la fosforribuloquinasa (PRK) se prepararon como se describió anteriormente (Abbott, et al., Catalase Overexpression reduces lactic acid-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae, Applied and Environmental Microbiology 75:2320-2325, 2009). La actividad de PRK se midió a 30 °C mediante un ensayo espectrofotométrico acoplado (MacElroy, et al., Properties of Phosphoribulokinase from Thiobacillus neapolitanus, Journal of Bacteriology 112:532-538, 1972). Las velocidades de reacción fueron proporcionales a las cantidades de extracto celular añadidas. Las concentraciones de proteína se determinaron por el método de Lowry (Lowry, et al., Protein measurement with the Folin phenol reagent, The Journal of Biological Chemistry 193:265-275, 1951) utilizando albúmina de suero bovino como patrón.

Se prepararon extractos celulares para ensayos de actividad Rubisco como se describe en Abbott, D. A. et al. Catalase overexpression reduces lactic acid-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol.

75:2320-2325, 2009, con dos modificaciones: Tris-HCl (1 mM, pH 8,2) que contiene 20 mM de MgCl^{2 6^} H²O, 5 mM de DTT, 5 mM de NaHCO³ se utilizó como tampón de tratamiento con ultrasonidos y Tris-HCI (100 mM, pH 8,2), 20 mM de MgCl^{2 6^} H²O y 5 mM de DTT como tampón de congelación. La actividad de Rubisco se determinó midiendo la fijación de ¹⁴CO² (PerkinElmer, Groningen, Países Bajos) como se describe (Beudeker, et al., Relations between dribulose-1,5-biphosphate carboxylase, carboxysomes and CO2 fixing capacity in the obligate chemolithotroph Thiobacillus neapolitanus grown under different limitations in the chemostat, Archives of Microbiology 124:185-189, 1980) y midiendo los entos radiactivos en un contador de centelleo líquido TRI-CARB® Serie 2700 ^t R (PerkinElmer, Groningen, Países Bajos), utilizando cóctel de centelleo Ultima Gold™ (PerkinElmer, Groningen, Países Bajos). Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el método de Lowry (Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275, 1951) utilizando soluciones estándares de albúmina de suero bovino disuelta en Tris-HCl 50 mM (pH 8,2).

Ejemplo 5. La actividad de Rubisco y la actividad de PRK en extractos celulares

Con el fin de estudiar un posible requisito de chaperonas heterólogas de Rubisco en S. cerevisiae,, se optimizó por codones el gen cbbMque codifica Rubisco de forma II de T. denitrificansy se expresó a partir de un vector centromérico, tanto solo como en combinación con casetes de expresión para los genes groEL/groES y/o T. denitrificans cbbO2/cbbQ2 de E. coli optimizados por codones. El análisis de la fijación de CO² dependiente de ribulosa-1,5-bifosfato mediante extractos de células de levadura demostró que la expresión funcional de T. denitrificans Rubisco en S. cerevisiae se observó tras la co-expresión de GroEL/GroES de E. coli.

La actividad de Rubisco aumentó de < 0,2 nmol.min^-1 (mg de proteína^{) -1} a más de ⁶ nmol.min^-1 (mg de proteína)-1. Los resultados de estos experimentos se visualizan en la Figura 1, que muestra la actividad específica de ribulosa-I,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) en extractos celulares de S. cerevisiae que expresan Rubisco forma II CbbM de T. denitrificans ya sea solo (IMC033) o en combinación con las chaperonas de E. coli GroEL/GroES (IMC035), las chaperonas de T. denitrificans Cbb02/CbbQ2 [20] (IMC034) o las cuatro chaperonas (IMC014).

Los genes expresados heterólogamente se optimizaron por codones para la expresión en levadura y se expresaron a partir de un único vector centromérico. Se tomaron muestras de biomasa de cultivos en lotes anaerobios en medios sintéticos (pH 5,0, 30 °C), rociados con nitrógeno y que contenían 20 g I ^-1 de glucosa como fuente de carbono. Las actividades de Rubisco, medidas como fijación de 14CO2 en extractos celulares, en una cepa de referencia de tipo salvaje y en cepas de S. cerevisiae que expresan cbbM y cbbM-cbbQ2-cbb02 estuvieron por debajo del límite de detección del ensayo enzimático (0,2 nmol de CO2 min-1 mg de proteína- 1.

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La coexpresión de CbbO2/cbbQ2 no dio como resultado un aumento adicional significativo de la actividad de Rubisco. El efecto positivo de GroEL/GroES en la expresión de Rubisco en S. cerevisiae demuestra el valor potencial de este enfoque para la ingeniería metabólica, especialmente cuando las enzimas procarióticas deben expresarse funcionalmente en el citosol de los eucariotas.

El gen PRK de Spinach olerácea se integró junto con groEL/groES de E. coli y cbbO2/cbbQ2 de T. denitrificans en el genoma de S. cerevisiae en el locus CAN1, bajo el control del promotor GAL1 inducible por galactosa. Esto indujo altas actividades de PRK en extractos celulares de la cepa IMU033 de S. cerevisiae, que además portaba el casete de expresión centromérico para Rubisco de T. denitrificans. Esta cepa de levadura diseñada se utilizó para analizar cuantitativamente los impactos fisiológicos de la expresión de Rubisco y PRK.

Tabla 8

La Tabla 8 muestra rendimientos incrementados de etanol en azúcar de una cepa de S. cerevisiae que expresa fosforibuloquinasa (PRK) y Rubisco. Análisis fisiológico de IMU033 de S. cerevisiae que expresa PRK y Rubisco y la cepa de referencia isogénica IMU032 en cultivos quimiostáticos anaerobios, cultivados a una tasa de dilución de 0,05 h-1 en un medio sintético (pH 5) complementado con 12,5 g I-1 de glucosa y 12,5 g I-1 de galactosa como fuentes de carbono. Para evaluar el impacto de la concentración de CO2, los cultivos de quimiostatos se rociaron con gas nitrógeno puro o con una mezcla de 10 % de CO2 y 90 % de nitrógeno. Los resultados se representan como promedio ± desviaciones medias de los datos de experimentos con quimiostatos duplicados independientes. Los pares de datos marcados con los mismos subíndices (a,a, b,b, etc.) se consideran estadísticamente diferentes en un test-t estándar (p < 0,02).

La expresión de Rubisco y las cuatro chaperonas sin co-expresión de PRK (cepa IMC014) no resultó en un rendimiento disminuido de glicerol (0,13 mol mol-1) en comparación con la cepa de referencia IMU032 (0,12 mol mol-1) en cultivos de quimiostatos limitados en carbono complementado con CO² , lo que indica que se requiere la expresión de un gen de fosforribuloquinasa (PRK) para que la vía funcional en S. cerevisiae disminuya la producción de glicerol. También se investigó el impacto fisiológico de la expresión de PRK y Rubisco en el crecimiento, el consumo de sustrato y la formación de productos en cultivos en lotes anaerobios cultivados con galactosa de S. cerevisiae y se comparó con una cepa de referencia isogénica. Condiciones de crecimiento: T = 30 °C, pH 5,0, 10 % de CO² en gas de entrada. Se llevaron a cabo dos experimentos replicados independientes, cuyos parámetros cinéticos de crecimiento diferían en menos del 5 %. El rendimiento de etanol en galactosa fue un 8 % mayor y la producción de glicerol se redujo un 60 % en la célula de levadura en la que se expresaron funcionalmente PRK y Rubisco, en comparación con la célula de levadura que carecía de estas enzimas. Las diferencias fueron estadísticamente significativas (test-t estándar (valor de p < 0,02). Las actividades de la fosforribuloquinasa y de Rubisco en extractos celulares de la cepa modificada IMU033 (tabla 7) permiten el uso de CO² como aceptor de electrones. Los rendimientos de etanol y los rendimientos de glicerol de la cepa IMU033 con respecto a la cepa de referencia IMU032 (tabla 8) demuestran que esto es posible en una fermentación anaerobia con una producción incrementada de etanol.

SECUENCIAS

SECUENCIA ID NO 1:

gen cbbM de Rubisco (sintético; basado en el gen cbbM de Thiobacillus denitrificans - pBTWW002, Fuente optimizada por codones: Hernandez et al 1996, ID en GenBank: L37437.2)

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ATGGATCAATCTGCAAGATATGCTGACTTGTCTTTAAAGGAAGAAGATTTGATTAAAG GTGGTAGACATATTTTGGTTGCTTACAAAATGAAACCAAAATCTGGTTATGGTTATTTG GAAGCTGCTGCTCATTTTGCTGCTGAATCTTCTACAGGTACAAATGTTGAAGTTTCTA CTACAG AT GATTTT ACAAAAGGTGTT GATGCTTT AGTTT ACT ACATCG AT GAAGCTT CA G AAG AT AT GAG AATT GCTT AT CC ATTGGA ATT ATT CG AC AG AAAT GTTA CT G ACG G AA GATTCATGTTAGTTTCTTTTTTGACTTTGGCTATTGGTAACAATCAAGGAATGGGAGAT ATAGAACATGCAAAAATGATAGATTTTTACGTTCCAGAAAGATGTATTCAAATGTTTGA TGGTCCAGCTACAGATATTTCTAATTTGTGGAGAATTTTGGGTAGACCAGTAGTTAAT GGTGGTTATATTGCTGGTACTATTATTAAGCCAAAATTGGGTTTAAGACCAGAACCAT TTGCTAAAGCTGCTTATCAATTTTGGTTGGGTGGAGATTTTATCAAGAATGACGAACC ACAAGGTAATCAAGTTTTTTGTCCATTGAAAAAAGTTTTGCCATTGGTTTACGATGCTA TGAAAAGAGCACAAGATGATACTGGTCAAGCAAAATTGTTTTCTATGAATATTACTGC AGACGATCATTATGAAATGTGTGCAAGAGCTGATTATGCTTTGGAAGTTTTCGGTCCA GATGCAGATAAATTGGCTTTTTTGGTAGATGGTTACGTTGGAGGTCCAGGAATGGTT ACTACTGCTAGAAGGCAATATCCTGGTCAATATTTGCATTATCATAGAGCAGGTCACG GTGCTGTTACTTCTCCATCTGCTAAAAGAGGTTATACTGCTTTTGTTTTGGCTAAAATG TCTAGATTGCAAGGCGCTTCAGGTATTCATGTTGGTACTATGGGTTATGGAAAAATGG AAGGAGAAGGC GACGAT AAGATT ATTGCTT AT ATGATAGAAAGGG ACG AATGTCAAG GTCCAGTTTATTTTCAAAAATGGTACGGTATGAAACCAACTACTCCAATTATCTCCGG AGGAATGAATGCTTTGAGATTGCCTGGTTTTTTCGAAAATTTGGGTCATGGTAACGTT ATTAATACTGCAGGTGGTGGTTCTTACGGTCATATTGATTCTCCTGCTGCTGGTGCTA TTTCTTTGAGACAATCTTACGAATGTTGGAAACAAGGTGCAGATCCAATTGAATTTGC T AAGGAACATAAGGAATTTGCAAGAGCTTTTGAAT CTTTTCCAAAAGAT GCT GATAAG TTATTT CCAGGATGG AGAGA AAA ATT G GG AG TTC ATTCTTAA

SECUENCIA ID NO 2:

Secuencia de proteína traducida del gen cbbM de Thiobacillus denitrificans

MDQSARYADLSLKEEDLIKGGRHILVAYKMKPKSGYGYLEAAAHFAAESSTGTNVEVSTT DDFTKGVDALVYYIDEASEDMRIAYPLELFDRNVTDGRFMLVSFLTLAJGNNQGMGDIEH AKMIDFYVPERCIQMFDGPATDISNLWRILGRPWNGGYIAGTIIKPKLGLRPEPFAKAAY QFWLGGDFIKNDEPQGNQVFCPLKKVLPLVYDAMKRAQDDTGQAKLFSMNITADDHYE

MCARADYALEVFGPDADKLAFLVDGYVGGPGMVTTARRQYPGQYLHYHRAGHGAVTS PSAKRGYTAFVLAKMSRLQGASGIHVGTMGYGKMEGEGDDKIIAYMIERDECQGPVYFQ KWYGMKPTTPIISGGMNALRLPGFFENLGHGNVINTAGGGSYGHIDSPAAGAISLRQSYE CWKQGADPIEFAKEHKEFARAFESFPKDADKLFPGWREKLGVHS

SECUENCIA ID NO 3:

gen p rkde Spinacea olerácea - pBTWW001, plásmido construido utilizando restricción y ligamiento. Fuente: Milanez y Mural 1988, ID de GenBank: M21338.1

ATGTCACAACAACAAACAATTGTGATTGGTTTAGCAGCAGATTCAGGTTGTGGTAAGA GTACATTCATGAGGAGGTTAACAAGTGTTTTCGGTGGCGCGGCCGAGCCACCAAAG GGTGGTAACCCAGATTCAAACACATTGATTAGTGACACTACTACTGTTATCTGTTTGG AT GATTTT CATT CCCTT GATAGAAATGGCAGGAAAGT GGAAAAAGTT ACTGCTTTAGA CCCAAAAGCTAATGATTTTGATCTTATGTATGAACAAGTTAAGGCTTTGAAAGAAGGT AAAGCT GTT GAT AAACCT ATTT AT AAT C AT GTTTCTGGTTTGTTGGACCCTCCT GAGCT TATTCAACCTCCTAAGATCTTGGTCATTGAAGGGTTACACCCCATGTATGACGCACGT GTGAGGGAATTGCTAGACTTCAGCATCTACTTGGACATTAGCAATGAAGTTAAATTTG CCTGGAAAATTCAGAGAGACATGAAAGAAAGAGGACACAGTCTTGAAAGCATCAAAG CCAGTATTGAATCCAGAAAGCCAGATTTTGATGCTTACATTGACCCACAAAAGCAGCA TGCTGATGTAGTGATTGAAGTATTGCCAACTGAACTCATTCCTGATGATGATGAAGGC AAAGTGTTGAGAGTAAGGATGATTCAGAAAGAAGGAGTCAAGTTTTTCAACCCAGTTT ACTTGTTT GAT GA AGG AT CT ACC ATTT C AT GGATT CCAT GTGGT AG AAA ATT A ACAT G TTCTTACCCTG GTATCAAATTTTCCTATGGCCCAG ACACCTTCTATGG CAACGAGGTG ACAGTAGTAGAGATGGATGGGATGTTTGACAGATTAGACGAACTAATCTACGTCGAA AGCCATTTGAGCAATCTATCAACCAAGTTTTATGGTGAAGTCACTCAACAAATGTTGA AGCACCAAAATTTCCCAGGAAGCAACAATGGAACTGGTTTCTTCCAAACCATAATTGG ATTGAAGATCAGAGACTTGTTCGAGCAGCTCGTTGCTAGCAGGTCTACAGCAACTGC AACAGCTGCTAAAGCCTAG

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SECUENCIA ID NO 4:

Secuencia de proteína traducida del gen prk de Spinacea olerácea

MSQQQTIVIGLAADSGCGKSTFMRRLTSVFGGAAEPPKGGNPDSNTLISDTTTVICLDDF HSLDRNGRKVEKVTALDPKANDFDLMYEQVKALKEGKAVDKPIYNHVSGLLDPPELIQPP KILVIEGLHPMYDARVRELLDFSIYLDISNEVKFAWKIQRDMKERGHSLESIKASIESRKPD FDAYIDPQKQHADVVIEVLPTELIPDDDEGKVLRVRMIGKEGVKFFNPVYLFDEGSTISWI PCGRKLTCSYPGIKFSYGPDTFYGNEVTVVEMDGMFDRLDELIYVESHLSNLSTKFYGEV TQQMLKHQNFPGSNNGTGFFQTIIGLKIRDLFEQLVASRSTATATAAKA

SECUENCIA ID NO 5:

Gen cbbQ2 (sintético, basado en el gen cbbQ2 de Thiobacillus denitrificans -optimizado por codones, secuencia original obtenida de Beller et al 2006, GenBank ID del Gen: 3672366, ID de la Proteína: AAZ98590.1

ATGACTACTAACAAGGAACAATACAAGGTTCACCAAGAACCATACTACCAAGCTCAAG GTAGAGAAGTTCAATTGTACGAAGCTGCTTACAGAAACAGATTGCCAGTTATGGTTAA GGGTCCAACTGGTTGTG GTAAGTCTAGATTCGTTGAATACATGGCTTG GAAGTTGAA CAAGCCATTGATCACTGTTGCTTGTAACGAAGACATGACTGCTTCTGACTTGGTTGGT AGAT ACTT GTT GGAAGCT AACGGTACTAGAT GGTTGGACGGTCCATTGACTACTGCT GCTAGAATCGGTGCTATCTGTTACTTGGACGAAGTTGTTGAAGCTAGACAAGACACT ACTGTTGTTATCCACCCATTGACTGACCACAGAAGAACTTTGCCATTGGACAAGAAG GGTGAATTGATCGAAGCTCACCCAGACTTCCAATTGGTTATCTCTTACAACCCAGGTT ACCAATCTTTGATGAAGGACTTGAAGCAATCTACTAAGCAAAGATTCGCTGCTTTCGA

CTTCGACTACCCAGACGCTGCTTTGGAAACTACTAT CTT GGCT AG AGAAACT G GTTT GGACGAAACTACTGCTGGTAGATTGGTTAAGATCGGTGGTGTTGCTAGAAACTTGAA GGGTCACGGTTT GGACGAAGGT ATCT CTACT AGATT GTTGGTTT ACGCT GCTACTTT G AT G AAGGACGGT GTT GACGCT GGT GACGCTT GT AG AATGG CTTT GGTT AGACCAAT CACTGACGACGCTGACATCAGAGAAACTTTGGACCACGCTATCGACGCTACTTTCGC TTAA

SECUENCIA ID NO 6:

Secuencia de proteína traducida del gen cbbQ2 de Thiobacillus denitrificans

MTTNKEQYKVHQEPYYQAQGREVQLYEAAYRNRLPVMVKGPTGCGKSRFVEYMAWKL NKPLITVACNEDMTASDLVGRYLLEANGTRWLDGPLTTAARIGAICYLDEVVEARQDTTV VIHPLTDHRRTLPLDKKGELIEAHPDFQLVISYNPGYQSLMKDLKQSTKQRFAAFDFDYP DAALETTILARETGLDETTAGRLVKIGGVARNLKGHGLDEGISTRLLVYAATLMKDGVDAG DACRMALVRPITDDADIRETLDHAIDATFA

SECUENCIA ID NO 7:

Gen cbbO2 (sintético, basado en el gen cbbO2 de Thiobacillus denitrificans -optimizado por codones, secuencia original obtenida de Beller et al 2006, GenBank ID del Gen: 3672365, ID de la Proteína: YP 316394.1

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ATGGCTGCTTACTGGAAGGCTTTGGACACTAGATTCGCTCAAGTTGAAGAAGTTTTC GACGACTGTATGGCTGAAGCTTTGACTGTTTTGTCTGCTGAAGGTGTTGCTGCTTACT TGGAAGCTGGTAGAGTTATCGGTAAGTTGGGTAGAGGTGTTGAACCAATGTTGGCTT TCTTGGAAGAATGGCCATCTACTGCTCAAGCTGTTGGTGAAGCTGCTTTGCCAATGG TTATGGCTTTGATCCAAAGAATGCAAAAGTCTCCAAACGGTAAGGCTATCGCTCCATT CTTG CAA ACTTTGG CTCC AGTT GCT AG AAG ATT G CA ATC TGCT G A ACA ATT G CA AC AC T ACGTT GACGTT ACTTTGGACTTCATGACTAGAACTACT GGTTCT ATCCACGGTCACC ACACTACTTTCCCATCTCCAGGTTTGCCAGAATTCTTCGCTCAAGCTCCAAACTTGTT GAACCAATT GACTTT GGCT GGTTT GAG AAACT GGGTT GAAT ACGGT ATCAG AAACT A CGGT ACT CACCCAGAAAGACAACAAGACT ACTT CT CTTTGCA AT CT GCTGACGCT AG AGCTGTTTTGCAAAGAGAAAGACACGGTACTTTGTTGGTTGACGTTGAAAGAAAGTT GGACTT GTACTT GAGAGGTTTGTGGCA AGACCACGACCACTT GGTT CCAT ACTCT AC TGCTTTCGACGAAATCAGAAAGCCAGTTCCATACTACGACAAGTTGGGTATGAGATT GCCAGACGTTTACGACGACTTGGTTTTGCCATGTCCAGCTGGTAGAGGTGGTGCTG GTGGTGAAGACGTTTTGGTTTCTGGTTTGGACAGATACAGAGCTACTTTGGCTCACA TGGTTGGTCACAGAAGATGGTCTGAAGCTCAAATCGCTGACAACTGGTCTCCATTCC AAAG AATG G CTGTT GAATT CTTCG AAG ACT GTAG AGTT G AAACTTT GTTG AT G AGAGA ATACCCAGGTTTGGCTAGAATCTTCAGAGCTTTGCACCCAAAGCCAGTTGAAGCTGC TTGTGACGGTGAAACTACTTCTTGTTTGAGACACAGATTGGCTATGTTGTCTAGAGCT TTCATCGACCCAGACCACGGTTACGCTGCTCCAGTTTTGAACGACTTCGTTGCTAGA TTCCACGCTAGATTGGCTGACGGTACTTCTTCTACTTCTGAAATGGCTGACTTGGCTT TGTCTTACGTTGCTAAGACTAGAAGACCATCTGACCAATTCGCTAAGGTTCACTTCGA CG ACACT GTT GTT G ACT ACAG AG ACGACAACAGACAATT GTGGAAGTT CAT CGAAGA AGGTGACGAAGAAGAAGCTTTCGACGCTAAGAGAAAGATCGAACCAGGTGAAGAAAT CCAAGGTTTGCCACCAAGACACTACCCAGAATGGGACTACACTTCTCAAACTTACAG ACCAGACTGGGTTTCTGTTTACGAAGGTTTGCACAGATCTGGTAACGCTGGTGACAT CGACAGATTGTTGGCTAAGCACGCTGCTTTGGCTAAGAGATTGAAGAAGATGTTGGA CTTGTTGAAGCCACAAGACAAGGTTAGAGTTAGATACCAAGAAGAAGGTTCTGAATT GGACTTGGACGTTGCTATCAGATCTTTGATCGACTTCAAGGGTGGTGCTACTCCAGA CCCAAGAATCAACATGTCTCACAGATCTGACGGTAGAGACATCGCTGTTATGTTGTT GTTGGACTTGTCTGAATCTTTGAACGAAAAGGCTGCTGGTGCTGGTCAAACTATCTT GG AATT GTCTC A AG A AG CT GTTT CTTT GTT GGCTTGGTCTAT CGA AA AGTTGGGT G AC CCATTCGCTATCGCTGGTTTCCACTCTAACACTAGACACGACGTTAGATACTTCCACA TCAAGGGTTACTCTGAAAGATGGAACGACGACGTTAAGGCTAGATTGGCTGCTATGG

AAGCTGGTTACTCTACTAGAATGGGTGCTGCTATGAGACACGCTGCTCACTACTTGT CTGCTAGACCAGCTGACAAGAAGTTGATGTTGATCTTGACTGACGGTAGACCATCTG ACGTT GACGCT GCT G ACGAAAGATTGTTGGTT GAAG ACGCT AGACAAGCTGTT AAGG AATTGGACAGACAAGGTATCTTCGCTTACTGTATCTCTTTGGACGCTCAATTGAAGGC TGGTGCTGACGACTACGTTGCTGAAATCTTCGGTAGACAATACACTGTTATCGACAG AGTT GAAAGATTGCCAGAAAGATTGCCAGAATTGTTCAT GGCTTT GACTAAGT AA

La SECUENCIA ID NO: 8

Secuencia de proteína traducida del gen cbbO2 de Thiobacillus denitrificans

MAAYWKALDTRFAQVEEVFDDCMAEALTVLSAEGVAAYLEAGRVIGKLGRGVEPMLAFL EEWPSTAQAVGEAALPMVMALIQRMQKSPNGKAIAPFLQTLAPVARRLQSAEQLQHYVD VTLDFMTRTTGSIHGHHTTFPSPGLPEFFAQAPNLLNQLTLAGLRNWVEYGIRNYGTHPE RQQDYFSLQSADARAVLQRERHGTLLVDVERKLDLYLRGLWQDHDHLVPYSTAFDEIRK PVPYYDKLGMRLPDVYDDLVLPCPAGRGGAGGEDVLVSGLDRYRATLAHMVGHRRWS EAQIADNWSPFQRMAVEFFEDCRVETLLMREYPGLARIFRALHPKPVEAACDGETTSCL RHRLAMLSRAFIDPDHGYAAPVLNDFVARFHARLADGTSSTSEMADLALSYVAKTRRPS DQFAKVHFDDTVVDYRDDNRQLWKFIEEGDEEEAFDAKRKIEPGEEIQGLPPRHYPEWD YTSQTYRPDWVSVYEGLHRSGNAGDIDRLLAKHAALAKRLKKMLDLLKPQDKVRVRYQE EGSELDLDVAIRSLIDFKGGATPDPRINMSHRSDGRDIAVMLLLDLSESLNEKAAGAGQTI LELSQEAVSLUWVSIEKLGDPFAIAGFHSNTRHDVRYFHIKGYSERWNDDVKARLAAMEA GYSTRMGAAMRHAAHYLSARPADKKLMLILTDGRPSDVDAADERLLVEDARQAVKELDR QGIFAYCISLDAQLKAGADDYVAEIFGRQYTVIDRVERLPERLPELFMALTK

La SECUENCIA ID NO: 9

Gen GroEL (sintético, basado en GroEL de E. coli - optimizado por codones, secuencia original obtenida de Durfee et al 2008, ID del Gen: 6061450, ID de la Proteína: YP_001732912.1

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ATGGCTGCTAAGGACGTTAAGTTCGGTAACGACGCTAGAGTTAAGATGTTGAGAGGT GTTAACGTTTTGGCTGACGCTGTTAAGGTTACTTTGGGTCCAAAGGGTAGAAACGTT GTTTTGGACAAGTCTTTCGGTGCTCCAACTATCACTAAGGACGGTGTTTCTGTTGCTA G AG A AATCG AATT G G AAG ACAAGTT C GAAAAC ATGG GTG CT CAAATGGTT AAGGAAG TTGCTTCTAAGGCTAACGACGCTGCTGGTGACGGTACTACTACTGCTACTGTTTTGG CTCAAGCTATCATCACTGAAGGTTTGAAGGCTGTTGCTGCTGGTATGAACCCAATGG ACTTGAAGAGAGGTATCGACAAGGCTGTTACTGCTGCTGTTGAAGAATTGAAGGCTT TGTCTGTTCCATGTTCTGACTCTAAGGCTATCGCTCAAGTTGGTACTATCTCTGCTAA CTCT GACGAAACT GTT GGT AAGTT GATCGCT GAAGCT ATGG ACAAGGTTGGTAAGGA AGGTGTTAT CACT GTT GAAGACGGTACT GGTTT GC AAGACGAATTGG ACGTT GTT GA AGGTATGCAATTCGACAGAGGTTACTTGTCTCCATACTTCATCAACAAGCCAGAAACT GGTGCTGTTGAATTGGAATCTCCATTCATCTTGTTGGCTGACAAGAAGATCTCTAACA T CAGAGAAAT GTTGCC AGTTTTGG AAGCTGTT GCTAAGGCTGGT AAGCCATT GTT GA T C AT CGCT GA AG ACGTTG AAGGTG AAGCTTTGG CT ACTTT GGTT GTT AACACT AT GAG AGGTATCGTTAAGGTTGCTGCTGTTAAGGCTCCAGGTTTCGGTGACAGAAGAAAGGC TATGTTGCAAGACATCGCTACTTTGACTGGTGGTACTGTTATCTCTGAAGAAATCGGT AT GG AATT GGAAAAGGCTACTTTGGAAGACTTGGGT CAAGCTAAGAG AGTTGTT AT C AACA AGGACACTACTACT ATCATCGACGGTGTTGGT G AAG AAGCTGCT AT CCAAGGT AGAGTTGCTCAAATCAGACAACAAATCGAAGAAGCTACTTCTGACTACGACAGAGAA AAGTTGCAAGAAAGAGTTGCTAAGTTGGCTGGTGGTGTTGCTGTTATCAAGGTTGGT GCTGCTACTGAAGTTGAAATGAAGGAAAAGAAGGCTAGAGTTGAAGACGCTTTGCAC GCTACTAGAGCTGCTGTTGAAGAAGGTGTTGTTGCTGGTGGTGGTGTTGCTTTGATC AGAGTTGCTTCTAAGTTGGCTGACTTGAGAGGTCAAAACGAAGACCAAAACGTTGGT AT CAAGGTTGCTTT GAGAGCT AT GGAAGCT CC ATT GAGACAAATCGTTTT GA ACT GT G GTGAAGAACCATCTGTTGTTGCTAACACTGTTAAGGGTGGTGACGGTAACTACGGTT

ACAACGCTGCTACTGAAGAATACGGTAACATGATCGACATGGGTATCTTGGACCCAA CTAAGGTTACTAGATCTGCTTTGCAATACGCTGCTTCTGTTGCTGGTTTGATGATCAC TACTGAATGTATGGTTACTGACTTGGCAAAGAACGACGCTGCTGACTTGGGTGCTGC TGGTGGTATGGGTGGTATGGGTGGTATGGGTGGTATGATGTAA

La SECUENCIA ID NO: 10

Secuencia de proteína traducida del gen GroEL de E. coli

MAAKDVKFGNDARVKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNWLDKSFGAPTITKDGVSVARE IELEDKFENMGAQMVKEVASKANDAAGDGTTTATVLAQAIITEGLKAVAAGMNPMDLKR GIDKAVTAAVEELKALSVPCSDSKAIAQVGTISANSDETVGKLIAEAMDKVGKEGVITVED GTGLQDELDVVEGMQFDRGYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADKKISNIREMLPVLEAV AKAGKPLUIAEDVEGEALATLVVNTMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDIATLTGGTVI SEEIGMELEKATLEDLGQAKRVVINKDTTTIIDGVGEEAAIQGRVAQIRQQIEEATSDYDRE KLQERVAKLAGGVAVIKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGWAGGGVALIRV ASKUDLRGQNEDQNVGIKVALRAMEAPLRQIVLNCGEEPSVVANTVKGGDGNYGYNA ATEEYGNMIDMGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKNDAADLGAAGGMG GMGGMGGMM

La SECUENCIA ID NO: 11

Gen GroES (sintético, basado en GroES de E. coli - optimizado por codones, secuencia original obtenida de Durfee et al 2008, ID del Gen: 6061370, ID de la Proteína: YP_001732911.1

ATGAACATCAGACCATTGCACGACAGAGTTATCGTTAAGAGAAAGGAAGTTGAAACT AAGTCTGCTGGTGGTATCGTTTTGACTGGTTCTGCTGCTGCTAAGTCTACTAGAGGT GAAGTTTTGGCTGTTGGTAACGGTAGAATCTTGGAAAACGGTGAAGTTAAGCCATTG GACGTTAAGGTTGGTGACATCGTTATCTTCAACGACGGTTACGGTGTTAAGTCTGAA AAGATCGACAACGAAGAAGTTTTGATCATGTCTGAATCTGACATCTTGGCTATCGTTG AAGCTTAA

La SECUENCIA ID NO: 12

Secuencia de proteína traducida del gen GroES de E. coli

33



Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una célula de levadura recombinante, que expresa funcionalmente una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) y fosforribuloquinasa (PRK), comprendiendo dicha célula de levadura una o más chaperonas seleccionadas del grupo de GroEL, GroES, homólogos funcionales de GroEL y homólogos funcionales de GroES, en donde dichos homólogos funcionales de una chaperona seleccionada del grupo de GroEL y GroES tienen más del 50 % de identidad de secuencia con GroEL o GroES; y

en donde la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) es una Rubisco que comprende la secuencia de proteínas de SECUENCIA ID NO: 2 o un homólogo funcional de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO: 2.

2. Una célula de levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha célula de levadura comprende una o más chaperonas moleculares procarióticas, originándose dichas chaperonas preferiblemente de una bacteria, más preferiblemente de Escherichia coli (E. coli).

3. Una célula de levadura recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho homólogo funcional de una chaperona seleccionada del grupo de GroEL y GroES tiene un 60 % o más, en particular al menos un 70 %, más en particular al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con GroEL o GroES.

4. Una célula de levadura recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho Rubisco es una única subunidad de Rubisco.

5. Una célula de levadura recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho Rubisco es un Rubisco de forma II procariótico.

6. Una célula de levadura recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha célula de levadura se selecciona del grupo de Saccharomyceraceae, tal como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces beticus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces uvarum y Saccharomyces bayanus;_Schizosaccharomyces tal como Schizosaccharomyces pornbe, Schizosaccharomyces japonicus, Schizosaccharomyces octosporus y Schizosaccharomyces cryophilus; Torulaspora tal como Torulaspora delbrueckii; Kluyveromyces tal como Kluyveromyces marxianus; Pichia tal como Pichia stipitis, Pichia pastoris o Pichia angusta, Zygosaccharomyces tal como Zygosaccharomyces bailii; Brettanomyces tal como Brettanomyces intermedius, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus, Dekkera bruxellensis y Dekkera anomala; Metschnikowia, Issatchenkia, tal como Issatchenkia orientalis, Kloeckera tal como Kloeckera apiculata; Aureobasidium tal como Aureobasidium pullulans, preferiblemente la célula de levadura se selecciona del grupo de Saccharomyceraceae, más preferiblemente del grupo de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces beticus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces uvarum y Saccharomyces bayanus, en particular Saccharomyces cerevisiae.

7. Célula de levadura de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la PRK es una PRK procedente de un eucariota, preferiblemente de una planta seleccionada de Caryophyilales, en particular de Amaranthaceae, en particular de Spinacia.

8. Una célula de levadura de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Rubisco tiene una actividad, definida por la tasa de incorporación de bicarbonato 14C dependiente de ribulosa-1,5-bifosfato por extractos celulares, de al menos 1 nmol.min-1.mg de proteína, a 30 °C, según se determina por el método al que se alude en el Ejemplo 4.

9. Uno o más vectores para la expresión funcional de un polipéptido heterólogo en una célula de levadura, en donde dicho vector o vectores comprenden una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican Rubisco y PRK, en donde dicha Rubisco exhibe actividad de fijación de carbono, dicho vector o vectores comprenden, además, una o más secuencias de ácido nucleico heterólogas que codifican una chaperona seleccionada del grupo de GroEL, GroES, homólogos funcionales de GroEL y homólogos funcionales de GroES, en donde dichos homólogos funcionales de una chaperona seleccionada del grupo de GroEL y GroES tienen más del 50 % de identidad de secuencia con GroEL o GroES, y

en donde la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) es una Rubisco que comprende la secuencia de proteínas de SECUENCIA ID NO: 2 o un homólogo funcional de la misma que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SECUENCIA ID NO: 2.

10. Un método para preparar un alcohol, que comprende fermentar una fuente de carbono, en particular un hidrato de carbono, con una célula de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, formando con ello el alcohol, en donde la célula de levadura está presente en un medio de reacción.

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11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medio de reacción comprende dióxido de carbono, en donde la concentración de dióxido de carbono en el medio de reacción es al menos el 5 % de la concentración de saturación de dióxido de carbono, en particular al menos el 10 %, más en particular al menos el 20 %.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que se forma etanol.

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