ES2932536T3 - Nueva cepa de microalgas del género Thraustochytrium y método de producción de ácido graso poliinsaturado mediante el uso de la misma - Google Patents

Nueva cepa de microalgas del género Thraustochytrium y método de producción de ácido graso poliinsaturado mediante el uso de la misma Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva cepa del género Thraustochytrium, que contiene un alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados ya un método de producción de biomasa a partir de los mismos. Dado que la nueva microalga CJM01 del género Thraustochytrium según la presente solicitud tiene una biomasa con altos contenidos en lípidos y ácidos grasos insaturados como el ácido docosahexaenoico, la propia microalga, o una biomasa producida por su cultivo y fermentación, un concentrado de la misma, o una masa seca del mismo es muy útil como composición para alimentos para animales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nueva cepa de microalgas del género Thraustochytrium y método de producción de ácido graso poliinsaturado mediante el uso de la misma
Campo técnico
La presente descripción se refiere a cepas del género Thraustochytrium, que incluyen un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados, una biomasa producida a partir de las cepas, un lípido que incluye las cepas, y un método de producción de ácidos grasos poliinsaturados.
Antecedentes de la técnica
El ácido docosahexaenoico (DHA), que es un ácido graso poliinsaturado, es un ácido graso esencial para el cerebro, los tejidos oculares y el sistema nervioso, y se conoce que desempeña un papel importante en el desarrollo de la agudeza visual y la capacidad de las neuronas motoras de los bebés. Se informó que la cantidad de DHA se reduce significativamente en el cerebro de un paciente con demencia, y se descubrió recientemente que el DHA tiene varias funciones antienvejecimiento, tales como la supresión de la degeneración macular en la presbicia. Además, se informó que el DHA también puede usarse como aditivo alimenticio para peces (Publicación de solicitud de patente coreana núm. 10-2007-0040751). Dado que la mayoría de los animales superiores, que incluye los humanos, no pueden sintetizar sin problemas los ácidos grasos poliinsaturados necesarios para las funciones biológicas normales, deben ingerir ácidos grasos poliinsaturados como nutrientes esenciales, y la Organización Mundial de la Salud recomienda un consumo constante de ácidos grasos poliinsaturados que contienen DHA de al menos 1 g/día. Tradicionalmente, las fuentes de suministro de ácidos grasos poliinsaturados DHA son los peces de aguas profundas, tales como el atún y el salmón, que ocupan el nivel superior del ecosistema marino. Sin embargo, a medida que empeora la contaminación del ambiente marino, aumenta el riesgo de ingestión de peces de aguas profundas debido a la acumulación de contaminantes tales como mercurio, metales pesados, hormonas ambientales y sustancias radiactivas en el cuerpo de los peces de aguas profundas. Por lo tanto, como nuevos medios para suministrar de forma segura y fiable aceite de ácidos grasos poliinsaturados DHA, las microalgas del género Thraustochytrium tienen valores industriales muy importantes.
Se han sugerido varios métodos para la sobreexpresión genética en microalgas del género Thraustochytrium. Las tecnologías de transformación de microalgas del género Thraustochytrium mediante el uso de varios genes de resistencia a los antibióticos como marcadores de selección, se informaron desde que Martec Corporation introdujo por primera vez los métodos de transformación genética de microalgas del género Thraustochytrium mediante el uso de acetolactato sintasa como un marcador de selección. Específicamente, la publicación de solicitud de patente coreana núm. 2015-0084148 describe "un vector recombinante para aumentar la productividad de lípidos y biomasa de microalgas y un uso del mismo".
Sin embargo, hasta ahora, una tecnología de transformación genética desarrollada a partir de microalgas del género Thraustochytrium es un método de integración cromosómica en el que los genes introducidos en común se insertan en el ADN cromosómico, y tiene la ventaja de que los genes insertados se mantienen estables, pero tiene limitaciones en cuanto al número de copias de los genes y al control de la expresión en comparación con un método de expresión genética mediante el uso de un plásmido centromérico o episomal con capacidad de autorreplicación. Descripción
Problema Técnico
En consecuencia, los presentes inventores han desarrollado microalgas que tienen el contenido y la productividad de ácido docosahexaenoico mejorado mediante la mutación de la microalga KC01 del género Thraustochytrium, y han establecido una biomasa que incluye un lípido que contiene ácido docosahexaenoico y un método de producción de un bioaceite mediante el cultivo de estas microalgas. En base a este desarrollo y establecimiento, se ha completado la presente descripción.
Solución Técnica
Un objeto de la presente descripción es proporcionar microalgas CJM01 (número de depósito: KCTC 13538BP) del género Thraustochytrium, por las que aumenta la producción de ácido docosahexaenoico (DHA) y disminuye la producción de aminoácidos, en comparación con las microalgas salvajes.
Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un método de producción de una biomasa, que incluye las etapas de: cultivar microalgas CJM01 del género Thraustochytrium; y recuperar una biomasa que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) de la microalga, un producto cultivado de la misma, un producto seco de la misma o un producto pulverizado de la misma.
Todavía otro objeto de la presente descripción es proporcionar un método de producción de un bioaceite, que incluye las etapas de: cultivar microalgas CJM01 del género Thraustochytrium; y recuperar un lípido que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) de la microalga, un producto cultivado de la misma, un producto seco de la misma o un producto pulverizado de la misma.
Efectos ventajosos
De acuerdo con la nueva microalga CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción, la producción de un aminoácido se reduce notablemente, y el contenido de una grasa en la biomasa y el contenido de un ácido graso insaturado tal como el ácido docosahexaenoico son elevados, por lo que las propias microalgas, la biomasa producida por el cultivo y la fermentación de microalgas, un condensado de la biomasa, y un producto seco de la biomasa son muy útiles como composición alimenticia.
Breve descripción de las Figuras
La Figura 1 es una fotografía que muestra cepas KC01 del género Thraustochytrium observadas por un microscopio óptico.
La Figura 2 muestra un árbol filogenético entre cepas KC01 del género Thraustochytrium, cepas del género Thraustochytrium, cepas del género Aurantiochytrium y cepas del género Schizochytrium.
Mejor modo para la invención
En lo sucesivo, la presente descripción se describirá en detalle.
Mientras tanto, las descripciones estructurales y funcionales específicas de las modalidades descritas en la presente descripción son solo para fines ilustrativos de otras modalidades. La presente descripción puede llevarse a la práctica de muchas formas diferentes sin apartarse del espíritu y las características significativas de la presente descripción. Por lo tanto, las modalidades de la presente descripción se describen solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de la presente descripción.
Para lograr los objetivos anteriores, un aspecto de la presente descripción proporciona microalgas CJM01 del género Thraustochytrium por las que aumenta la producción de ácido docosahexaenoico (DHA) y disminuye la producción de aminoácidos, en comparación con las microalgas salvajes.
Como se usa en la presente descripción, el término "cepas del género Thraustochytrium" se refiere a microalgas heterótrofas orgánicas, que juegan un papel importante como fuentes de suministro de triacilglicerol que contiene varios ácidos grasos poliinsaturados, que incluye el ácido docosahexaenoico (DHA) en una alta concentración. Además, las "microalgas" se refieren a organismos vivos que solo pueden verse a través de un microscopio porque no pueden verse a simple vista y que flotan libremente en el agua, y también se les llama fitoplancton.
Como se usa en la presente descripción, por ejemplo, las cepas salvajes KC01 del género Thraustochytrium se irradian con rayos gamma para generar cepas mutantes, las cepas que tienen una productividad mejorada de aceite que contienen ácidos poliinsaturados se seleccionan de las cepas mutantes, y estas cepas se denominaron cepas CJM01 del género Thraustochytrium, se depositaron el 30 de mayo de 2018 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC), una organización depositaria internacional bajo el Tratado de Budapest, y se le otorgó el número de depósito KCTC 13538BP.
Además, la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción puede tener un ARNr 18s de SEQ ID NO. 1, pero la presente descripción no se limita a ello.
Como se usa en la presente descripción, el término "ácido docosahexaenoico (DHA)" es uno de los ácidos grasos poliinsaturados representados por la Fórmula C22H32O2, y es un material que se extrae extensamente del pescado azul tal como el atún o la sardina. Además, el ácido docosahexaenoico (DHA) pertenece a los omega 3 junto con el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido a-linolénico (ALA).
Las microalgas CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción pueden incluir una gran cantidad de ácido docosahexaenoico (DHA), en comparación con las cepas KC01 del género Thraustochytrium que son cepas madre. Específicamente, las microalgas CJM01 pueden incluir ácido docosahexaenoico (DHA) en una cantidad de 30 % en peso a 65 % en peso, 30 % en peso a 60 % en peso, 40 % en peso a 65 % en peso, o 40 % en peso a 60 % en peso, en base al peso total de ácidos grasos incluidos en las microalgas, pero la presente descripción no se limita a ellos.
Adicionalmente, las microalgas CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción pueden tener una productividad de ácido docosahexaenoico (DHA) mejorada, en comparación con las cepas KC01 del género Thraustochytrium que son cepas madre. La productividad del ácido docosahexaenoico (DHA) puede medirse por la concentración (g/L) del ácido docosahexaenoico (DHA) producido durante 1 hora. Las microalgas de la presente descripción pueden tener una productividad de ácido docosahexaenoico (DHA) de 0,4 a 0,8 (g/l/h), 0,4 a 0,7 (g/l/h), 0,5 a 0,8 (g/l/h), o 0,5 a 0,7 (g/l/h), pero la presente descripción no se limita a ello.
Mientras tanto, en las microalgas CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción, la producción de un aminoácido puede reducirse, en comparación con las cepas KC01 del género Thraustochytrium que son cepas madre. Específicamente, la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción o una solución de cultivo de la misma puede no incluir al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en aspartato, serina, glutamato, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, lisina, y arginina. Por ejemplo, como puede verse en el Ejemplo 2, puede no detectarse aspartato, serina, glutamato, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, lisina, y arginina a partir de la solución de cultivo de la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción.
Por ejemplo, la producción total de un aminoácido por la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción puede reducirse en un 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, o 99 % o más, en comparación con la cepas KC01 del género Thraustochytrium que son cepas madre. Esto indica que las cepas CJM01 se usan de manera más efectiva en la trayectoria de la biosíntesis del ácido docosahexaenoico en comparación con las cepas madre KC01. Específicamente, dado que las microalgas CJM01 del género Thraustochytrium de la presente descripción rara vez producen aminoácidos, la solución de cultivo de las cepas puede incluir aminoácidos solo en una cantidad de 0,1 a 20 mg/L, 0,1 a 15 mg/L, 0,1 a 10 mg/L, 0,1 a 7 mg/L, o 0,1 a 5 mg/L.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método de producción de una biomasa, que incluye: cultivar microalgas CJM01 del género Thraustochytrium; y recuperar una biomasa que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) de la microalga, un producto cultivado de la misma, un producto seco de la misma o un producto pulverizado de la misma. Además, la biomasa puede prepararse en forma de un cuerpo de hongo seco, pero la presente descripción no se limita a ello.
La presente descripción proporciona una biomasa producida por el método. La biomasa puede incluir ácido docosahexaenoico (DHA) en una cantidad de 15 a 40 % en peso, 20 a 35 % en peso o 25 a 30 % en peso, en base al peso total del mismo, pero la presente descripción no se limita a ello.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método de producción de un bioaceite, que incluye: cultivar microalgas CJM01 del género Thraustochytrium; y recuperar un lípido que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) de la microalga, un producto cultivado de la misma, un producto seco de la misma o un producto pulverizado de la misma.
La presente descripción proporciona un bioaceite producido por el método. El bioaceite puede incluir ácido docosahexaenoico (DHA) en una cantidad de 30 a 65 % en peso, 30 a 60 % en peso, 40 a 65 % en peso o 40 a 60 % en peso, con base en el peso total de ácidos grasos, pero la presente descripción no se limita a ello.
Específicamente, el método de producción de un bioaceite de acuerdo con la presente descripción puede incluir las etapas de: cultivar la microalga CJM01 del género Thraustochytrium; producir una biomasa que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) a partir de microalgas, un producto cultivado de las mismas, un producto seco de las mismas, o un producto pulverizado de las mismas; y recuperar un lípido que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) de la biomasa producida. Sin embargo, la presente descripción no se limita a ello.
El "género Thraustochytrium " y el ácido docosahexaenoico son como se describió anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, el "bioaceite" se obtiene de una biomasa mediante un proceso de extracción biológico, termoquímico, o fisicoquímico. El bioaceite producido de acuerdo con la presente descripción puede incluir ácidos grasos poliinsaturados, específicamente, ácido docosahexanoico, pero la presente descripción no se limita a ellos.
Adicionalmente, la "biomasa" se refiere a organismos tales como plantas, animales y microorganismos que pueden usarse como energía química, es decir, fuentes de energía de bioenergía. Además, la biomasa ecológicamente también se refiere al peso o cantidad de energía de un organismo específico que existe dentro de la unidad de tiempo y espacio. Además, aunque la biomasa incluye compuestos secretados por las células, también puede incluir materiales extracelulares así como también células y/o contenidos intracelulares. Como se usa en la presente descripción, la biomasa puede ser la propia microalga CJM01 del género Thraustochytrium, un producto cultivado de la misma, un producto seco de la misma, un producto pulverizado de la misma, un producto producido mediante cultivo o fermentación de la microalga, o puede ser un condensado de la biomasa o un producto seco de la biomasa. Sin embargo, la biomasa no se limita a ello.
Como se usa en la presente descripción, el producto cultivado de la microalga CJM01 del género Thraustochytrium se refiere a un producto obtenido mediante el cultivo de la microalga y, específicamente, puede ser una solución de cultivo que incluye las microalgas o una solución de cultivo que no incluye las microalgas, pero la presente descripción no se limita a ello. Como se usa en la presente descripción, el producto cultivado de la microalga CJM01 del género Thraustochytrium se refiere a un producto obtenido mediante la eliminación de la humedad de la microalga, y específicamente, puede prepararse en forma de un cuerpo de hongo seco, pero la presente descripción no se limita a ello. Como se usa en la presente descripción, el producto pulverizado de las microalgas CJM01 del género Thraustochytrium se refiere colectivamente a un producto obtenido mediante la pulverización de las microalgas, y puede prepararse en forma de sobrenadante o gránulo, pero la presente descripción no se limita a ello. La propia microalga CJM01 del género Thraustochytrium, el producto cultivado de la mismas, el producto seco de la misma, o el producto pulverizado de la misma incluye ácido docosahexaenoico, y puede usarse para producir una biomasa o un bioaceite.
Como se usa en la presente descripción, el término "cultivo" significa que las microalgas crecen bajo condiciones ambientales moderadamente controladas. El proceso de cultivo de acuerdo con la presente descripción puede realizarse en dependencia del medio de cultivo y las condiciones de cultivo apropiados. Tal proceso de cultivo puede ser fácilmente ajustado por los expertos en la técnica de acuerdo con las microalgas seleccionadas.
Específicamente, el cultivo de la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de acuerdo con la presente descripción puede realizarse bajo condiciones heterótrofas, pero la presente descripción no se limita a ello.
Como se usa en la presente descripción, la "nutrición heterotrófica" es una forma nutricional que depende de la materia orgánica obtenida de una fuente de energía (nutrición) in vitro, y es un término que corresponde a la nutrición independiente. La microalga CJM01 del género Thraustochytrium de acuerdo con la presente descripción puede mejorar la cantidad y productividad del ácido docosahexaenoico mediante la optimización de la composición de un medio de cultivo de una fuente de carbono o una fuente de nitrógeno bajo condiciones heterótrofas. Además, como se usa en la presente descripción, el término "nutrición heterotrófica" puede usarse de manera intercambiable con "cultivo oscuro".
Adicionalmente, la etapa de cultivar las microalgas no está particularmente limitado y puede realizarse mediante un método de cultivo descontinuo conocido, un método de cultivo continuo conocido, un método de cultivo discontinuo, o similar. El medio de cultivo y otras condiciones de cultivo usadas en el cultivo de las microalgas de la presente descripción pueden usarse sin limitaciones siempre que puedan usarse generalmente para cultivar las microalgas. Específicamente, las microalgas de la presente descripción pueden cultivarse en un medio de cultivo general que incluye una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, un compuesto inorgánico, aminoácidos, y/o vitaminas mientras se ajusta la temperatura, el pH, y similares bajo condiciones aeróbicas.
Específicamente, un pH óptimo (por ejemplo, un pH de 5 a 9, específicamente un pH de 6 a 8, y más específicamente un pH de 6,8) puede ajustarse mediante el uso de un compuesto básico (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, o amoniaco) o un compuesto ácido (por ejemplo, un ácido fosfórico o un ácido sulfúrico), pero la presente descripción no se limita a ello.
Además, puede inyectarse oxígeno o gas que contiene oxígeno en un cultivo para mantener el estado aeróbico del cultivo, o puede inyectarse nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono en el cultivo sin inyectar oxígeno o gas que contiene oxígeno para mantener el estado anaeróbico o no aeróbico del cultivo, pero la presente descripción no se limita a ello.
Además, la temperatura de cultivo puede mantenerse de 20 °C a 45 °C, específicamente, de 25 °C a 40 °C, y el cultivo puede realizarse durante aproximadamente 10 a 160 horas, pero la presente descripción no se limita a ello. Además, durante el cultivo, puede inhibirse la formación de burbujas mediante el uso de un agente deformante tal como éster de poliglicol de ácido graso, pero la presente descripción no se limita a ello.
El cultivo de la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de acuerdo con la presente descripción puede realizarse mediante el uso de un medio de cultivo que incluya una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno. Como se usa en la presente descripción, el término "medio de cultivo" se refiere a un medio para cultivar las microalgas de la presente descripción y/o un producto obtenido después de cultivar las microalgas. El medio de cultivo puede tener tanto una forma que incluye las microalgas como una forma obtenida mediante la eliminación de las microalgas de una solución de cultivo que incluye las microalgas mediante centrifugación, filtración, o similar. Adicionalmente, en el medio de cultivo usado en la presente descripción, como fuentes de carbono, azúcares y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, galactosa, manosa, maltosa, arabinosa, xilosa, melaza, almidón, y celulosa), grasas y aceites (aceite de soya, aceite de semilla de girasol, aceite de maní, y aceite de coco), ácidos grasos (por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, y ácido linoleico), alcoholes (por ejemplo, glicerol y etanol), y ácidos orgánicos (por ejemplo, ejemplo, ácido acético) pueden usarse individualmente o en combinación. Específicamente, la fuente de carbono puede ser al menos una seleccionada del grupo que consiste en glucosa, fructosa, maltosa, galactosa, mañosa, sacarosa, arabinosa, xilosa, y glicerol, pero no está limitada siempre que pueda usarse para cultivar microalgas. Además, en el medio de cultivo usado en la presente descripción, como fuente de carbono, puede usarse glucosa que tiene una concentración de 10 a 50 g/L, 10 a 40 g/L, 20 a 50 g/L, 20 a 40 g/L, o de 25 a 35 g/L, pero la presente descripción no se limita a ello.
Las fuentes de nitrógeno del medio de cultivo usado en la presente descripción pueden clasificarse en fuentes de nitrógeno orgánico y fuentes de nitrógeno inorgánico, pero estas fuentes de nitrógeno orgánico y fuentes de nitrógeno inorgánico pueden usarse individualmente o en combinación. Específicamente, la fuente de nitrógeno puede ser una fuente de nitrógeno orgánico seleccionada del grupo que consiste en un extracto de levadura, un extracto de carne de res, peptona, y triptona, o puede ser una fuente de nitrógeno inorgánico seleccionada del grupo que consiste en acetato de amonio, nitrato de amonio, amonio cloruro, sulfato de amonio, nitrato de sodio, urea, y glutamato monosódico (MSG).
Además, en el medio de cultivo usado en la presente descripción, los ejemplos de la fuente de nitrógeno pueden incluir un extracto de levadura, sulfato de amonio, nitrato de sodio, y m Sg , pero no se limitan a ello siempre que pueda usarse para cultivar microalgas.
Específicamente, el extracto de levadura puede incluirse en el medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 10 g/L, 0,5 a 10 g/L, 0,5 a 7 g/L, 0,5 a 5 g/L, 0,5 a 3 g/L, 0,5 a 2 g/L, o 0,5 a 1,5 g/L, el sulfato de amonio puede incluirse en el medio de cultivo en una concentración de 1 a 5 g/L, 1 a 4 g/L, 2 a 5 g/L, o de 2 a 4 g/L, el nitrato de sodio puede incluirse en el medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 10 g/L, 0,5 a 9 g/L, 1 a 9 g/L, 2 a 9 g/L, 3 a 9 g/L, 5 a 9 g/L, o 7 a 9 g/L, y el MSG puede incluirse en el medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 2 g/L, 0,1 a 1,5 g/L, 0,5 a 2 g/L, o 0,5 a 1,5 g/L. Sin embargo, la presente descripción no se limita a ello.
Para los propósitos de la presente descripción, dado que las cepas CJM01 se caracterizan porque no tienen inhibición de amoníaco y pueden crecer en una amplia concentración de sal, las fuentes de carbono y las fuentes de nitrógeno pueden ajustarse adecuadamente en consideración con estas características.
En el medio de cultivo usado en la presente descripción, como fuente de fósforo, pueden usarse individualmente o en combinación, dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, y las sales correspondientes que contienen sodio, pero la presente divulgación no se limita a ello. El medio de cultivo puede incluir otras sales metálicas (por ejemplo, sulfato de magnesio y sulfato de hierro), aminoácidos, y un material promotor del crecimiento esencial, tal como una vitamina.
En la etapa de recuperación de una biomasa de las microalgas cultivadas en la etapa de cultivo, el producto cultivado de la misma, el producto seco, o el producto pulverizado de la misma, puede recolectarse una biomasa deseada mediante el uso de un método adecuado conocido en la técnica.
En la etapa de recuperación del ácido docosahexaenoico producido en la etapa de cultivo, el ácido docosahexaenoico deseado puede recolectarse de la propia microalga o del producto cultivado de la misma mediante el uso de un método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, una biomasa deseada o ácido docosahexaenoico deseado puede recuperarse de las microalgas cultivadas mediante un método adecuado conocido en la técnica, el producto cultivado de las mismas, el producto seco de las mismas, o el producto pulverizado de las mismas, y, en este caso, puede usarse centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio de aniones, cristalización, HPLC, o similares. La etapa de recuperación de la biomasa o docosahexaenoico puede incluir adicionalmente una etapa de separación y/o una etapa de purificación.
Por ejemplo, los lípidos y los derivados de lípidos tales como los aldehídos grasos, los alcoholes grasos y los hidrocarburos (por ejemplo, los alcanos) pueden extraerse con un solvente hidrófobo tal como el hexano (Frenz y otros, 1989, Enzyme Microb. Tecnología, 11:717). Los lípidos y derivados de lípidos también pueden extraerse mediante el uso de licuefacción (Sawayama y otros, 1999, Biomass and Bioenergy 17: 33-39 y Inoue y otros, 1993, Biomass Bioenergy 6 (4): 269-274); licuefacción de petróleo (Minowa y otros, 1995, Fuel 74 (12): 1735-1738); y extracción con CO2 supercrítico (Mendes y otros, 2003, Inorganica Chimica Acta 356: 328-334). Además, el protocolo de recuperación de lípidos de microalgas conocido describe un método que incluye las etapas de i) recolectar células mediante el uso de la centrifugación, lavar las células recolectadas con agua destilada y luego liofilizar las células lavadas para obtener polvo de células, y ii) pulverizar el polvo de células obtenidas en un mortero y luego extracción de lípidos mediante el uso de n-hexano [Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846]. Otro aspecto más de la presente descripción proporciona una composición que incluye microalgas CJM01 del género Thraustochytrium, un producto cultivado de las mismas, un producto seco de las mismas, o un producto pulverizado de las mismas. La composición puede incluir una biomasa o bioaceite producido mediante el uso de las microalgas.
Las microalgas CJM01 del género Thraustochytrium, el producto cultivado de las mismas, el producto seco de las mismas, y el producto pulverizado de las mismas son como se describió anteriormente. La biomasa o el bioaceite producido mediante el uso de las microalgas también son como se describió anteriormente. Con el propósito de preparar una composición que incluya un alto contenido de ácido docosahexaenoico, pueden usarse las microalgas de la presente descripción. La composición puede prepararse en forma de solución, un polvo, o una suspensión, pero la presente descripción no se limita a ello. Más específicamente, puede proporcionar una composición alimenticia, una composición alimenticia o un aditivo alimenticio, que incluye microalgas CJM01 del género Thraustochytrium, el producto cultivado de las mismas, el producto seco de las mismas, o el producto pulverizado de las mismas.
Como se usa en la presente descripción, el término "alimenticio" se refiere al alimento de un animal para comer, ingerir y digerir, o se refiere a cualquier dieta natural o artificial adecuada, una comida o un ingrediente de una comida. El alimento de acuerdo con la presente descripción, que incluye una composición para prevenir o tratar enfermedades metabólicas como ingrediente activo, puede convertirse en varios tipos de alimentos conocidos en la técnica, y los ejemplos específicos de los mismos pueden incluir alimento concentrado, alimento grueso, y/o alimentación especial.
Como se usa en la presente descripción, el término "aditivo alimenticio" se refiere a un material que se añade a un alimento con el propósito de varios efectos, tales como la reposición de nutrientes, la prevención de la pérdida de peso, la mejora en la utilización digestiva de la celulosa en el alimento, la mejora de la calidad del aceite, la prevención del trastorno reproductivo, la mejora de la tasa de concepción, y la prevención del estrés por altas temperaturas en verano. El aditivo alimenticio de la presente descripción corresponde a un alimento complementario bajo la ley de gestión alimenticio, y puede incluir además preparados minerales tales como hidrogenocarbonato de sodio, bentonita, óxido de magnesio, o minerales complejos; un preparado mineral que es un mineral traza tales como zinc, cobre, cobalto, o selenio; un preparado de vitaminas tales como caroteno, vitamina E, vitaminas A, vitamina D, vitamina E, ácido nicotínico, o complejo de vitamina B; un preparado de aminoácidos protectores tales como metionina o lisina; un preparado de ácidos grasos protectores tal como sal de calcio de ácidos grasos; un preparado de bacterias vivas tales como bacterias probióticas (bacterias del ácido láctico), cultivos de levadura, o productos de fermentación de moho; y un preparado de levadura.
Como se usa en la presente descripción, el término "composición alimentaria" incluye todos los tipos de alimentos, tales como alimentos funcionales, complementos nutricionales, alimentos saludables, y aditivos alimentarios. La composición alimenticia anterior puede producirse en varias formas de acuerdo con los métodos comúnmente conocidos en la técnica.
La presente descripción proporciona un método de producción de una composición que incluye la biomasa o el bioaceite. La biomasa, el bioaceite, y la composición son como se describió anteriormente.
En el anterior método de producción de un bioaceite, puede producirse un bioaceite que incluye un alto contenido de ácido docosahexaenoico mediante la etapa de cultivo de la microalga CJM01 del género Thraustochytrium, que tiene una alta productividad de ácido docosahexaenoico, en un medio de cultivo que incluye un fuente de carbono de una composición específica y una fuente de nitrógeno de una composición específica bajo condiciones heterótrofas. Modo para la Invención
En lo sucesivo, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son únicamente ilustrativos de la presente descripción, y el alcance de la presente descripción no se limita a estos ejemplos.
Las microalgas CJM01 de la presente descripción son microalgas que pertenecen a la familia Thraustochytrid y tienen la capacidad de producir ácidos grasos poliinsaturados que incluyen un alto contenido de ácido docosahexaenoico. Las microalgas CJM01 de la presente descripción tienen una secuencia de nucleótidos de ADN del gen 18S rRNA representado por SEQ ID NO. 1, y tienen un alto contenido de biomasa bajo condiciones heterótrofas, no bajo condiciones de crecimiento en cultivo ligero.
En los siguientes ejemplos, los métodos experimentales se describirán con más detalle.
Ejemplo 1: Separación de las microalgas KC01 de la familia Thraustochytrid
Para separar las cepas de microalgas de la familia Thraustochytrid, se llevaron a cabo los siguientes experimentos. Específicamente, se recolectaron muestras ambientales de agua de mar, suelo, y hojas de 20 áreas costeras de las áreas de Geoje y Tongyeong de Gyeongsangnam-do, Corea. Luego, las muestras se almacenaron en una caja de hielo a 10 °C y se llevaron a un laboratorio. Las muestras se usaron en un trabajo de separación de bacterias en un plazo de 2 a 3 días. Estas muestras se untaron directamente en un medio de agar, y luego las cepas de Thraustochytrid se separaron mediante el uso de un método de aplicación de polvo de pino líquido. Las muestras, cada una que incluye una forma similar de microalga observada al microscopio, se untaron en un medio de cultivo IYP para la separación microbiana (1 g/L de extracto de levadura, 1 g/L de peptona, 2 g/L de MgSO4 7H2O, 20 g/L de L de sal marina, 5,0 mg/L de H3BO3, 3,0 mg/L de MnCh, 0,2 mg/L de CuSO4, 0,05 mg/L de NaMo4 2H2O, 0,05 mg/L de C0SO4, 0,7 mg/L de ZnSO4-7H2O, y 15 g/L de agar) para obtener colonias. Las colonias obtenidas se sometieron varias veces a subcultivos para ser purificadas y separadas, y luego solo se seleccionaron y separaron las cepas formadoras de zoosporangios que son características típicas de las microalgas Thraustochytrid. Las muestras ambientales que no pueden confirmarse a través de la observación microscópica se diluyeron y lavaron mediante el uso de agua de mar esterilizada con una salinidad del 1,5 %, y luego estas muestras se rociaron con polvo de pino y se cultivaron. Las comunidades microbianas obtenidas mediante el cultivo bajo condiciones de temperatura y pH similares a las de cada entorno de recolección se untaron en un medio de cultivo IYP para la separación microbiana y se subcultivaron para purificarlas y separarlas. En este caso, una solución mixta de cóctel de antibióticos (0 a 500 mg/L de sulfato de estreptomicina, 0 a 500 mg/L de ampicilina, 0 a 500 mg/L de penicilina G, y 0 a 500 mg/L de sulfato de kanamicina) se introdujo mientras se ajustó la concentración del mismo, y por lo tanto se controló el crecimiento y la contaminación de otros microbios.
Las colonias separadas se cultivaron en un matraz de 500 mL a una temperatura de 15 °C a 28 °C y una velocidad de rotación de 50 a 200 rpm durante aproximadamente 7 días mediante el uso de un medio de cultivo IGGYP (glicerol 10 g/L, glucosa 10 g/ L, extracto de levadura 1 g/L, peptona 1 g/L, MgSO4-7H2O 2 g/L, sal solar 20 g/L, H3BO3 5,0 mg/L, MnCh 3,0 mg/L, CuSO4 0,2 mg/L, NaMo4'2H2O 0,05 mg/L, CoSO4 0,05 mg/L, ZnSO4-7H2O 0,7 mg/L, y solución mixta de vitaminas 10 ml/L). Finalmente se seleccionó un tipo de microalgas, cuya tasa de crecimiento era rápida y cuyas condiciones de cultivo no eran complicadas, y se recuperaron los cuerpos de los hongos. Las formas de las cepas seleccionadas se observaron mediante el uso de un microscopio óptico (se muestra en la Figura 1). Los cuerpos de los hongos seleccionados se lavaron con una solución tamponada de fosfato (PBS, pH 7,5) y luego se secaron en un horno seco a 55 °C durante 16 horas para obtener cuerpos de los hongos secos.
Se analizó la secuencia del gen 18s rRNA para la identificación molecular de las cepas de las microalgas finalmente seleccionadas. El ADN se separa de las colonias puramente separadas de las especies seleccionadas, y luego se amplifica el ARNr 18s mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante el uso de cebadores para la amplificación genética en una región de ARNr 18s. Los cebadores para la amplificación genética se resumen en la Tabla 1 más abajo.
[Tabla 1]
Figure imgf000008_0001
En este caso, después de la desnaturalización a 95 °C durante 5 minutos, se llevó a cabo la PCR por un total de 25 ciclos bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 52 °C durante 30 segundos, y polimerización a 72 °C durante 1 minuto y 30 segundos. A continuación, se llevó a cabo la reacción de polimerización a 72 °C durante 7 minutos.
Como resultado del análisis de la secuencia de nucleótidos mediante el uso de la solución de reacción amplificada, se obtuvo la secuencia de nucleótidos 1 (SEQ ID NO. 1) con un tamaño de aproximadamente 1792 pb. Como un resultado de la búsqueda NCBI BLAST, se encontró que la secuencia de nucleótidos 1 tenía aproximadamente 99 % de homología con las cepas del género Thraustochytrium informadas anteriormente y tenía aproximadamente 84 % de homología con las cepas del género Aurantiochytrium y el género Schizochytrium.
Por lo tanto, se expresa el árbol filogenético entre cepas, y los resultados del mismo se muestran en la Figura 2. Las cepas correspondientes se identificaron como microalgas del género Thraustochytrium de la familia Thraustochytrid y, por lo tanto, se denominaron KC01 del género Thraustochytrium.
Ejemplo 2: Desarrollo de microalgas mutantes
Ejemplo 2-1: Selección de microalgas mutantes mediante un método de mutación artificial
En la presente descripción, se llevó a cabo el siguiente experimento para separar cepas que tienen una productividad mejorada de ácido docosahexaenoico (DHA) mediante la mutación por irradiación con rayos gamma de las cepas KC01 del género Thraustochytrium, que se separaron en el Ejemplo 1.
Específicamente, las cepas KC01 del género Thraustochytrium se cultivaron en medio de cultivo GYEP (glucosa 2 %, peptona 1 %, extracto de levadura 0,5 % y sal solar 2 %) durante 24 horas para activar las cepas. Las cepas activadas se inocularon en un medio de subcultivo (glucosa 5 %, peptona 1 %, extracto de levadura 0,5 % y sal solar 2 %) que se esterilizan a 121°C durante 15 minutos y se cultivan durante 14 horas, y luego los cuerpos de los hongos se recuperaron. Los cuerpos de los hongos recuperados se suspendieron en 50 mL de un tampón PBS, se irradiaron con rayos gamma a una dosis de 1 a 5 kGy durante 1 hora y luego se cultivaron en 50 mL de un medio de cultivo básico (glucosa 5 %, peptona 1 %, extracto de levadura 0,5 %, y sal solar 2 %) mediante el uso de un matraz de 500 mL a una temperatura de 28 °C y una revolución de 120 rpm durante 2 días. Luego, los cuerpos de los hongos suspendidos se diluyeron adecuadamente cuando la tasa de mortalidad es 99 % y se subcultivaron dos veces en un medio de cultivo de placa plana GYEP (glucosa 2 %, peptona 1 %, extracto de levadura 0,5 %, y sal solar 2 %, agar 2 %, pH 7,0).
Principalmente, se seleccionaron colonias, cuyo color se vuelve blanco, para seleccionar cepas que se predice que reducen los pigmentos sulfatados producidos además de aceites que contienen ácidos grasos poliinsaturados. Las cepas mutantes obtenidas por el método anterior se denominaron cepas CJM01 del género Thraustochytrium, depositadas el 30 de mayo de 2018 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC), una organización depositaria internacional bajo el Tratado de Budapest, y se les otorgó el número de depósito KCTC 13538BP.
Ejemplo 2-2: Análisis de la capacidad de microalgas recién separadas y cepas mutantes para producir aceite que contiene ácidos grasos poliinsaturados.
Las cepas CJM01 y KC01 seleccionadas del Ejemplo 2-1 se cultivaron como sigue para comparar la capacidad de las cepas CJM01 para producir aceites que contienen ácidos grasos poliinsaturados con la capacidad de las cepas KC01 para producir aceites que contienen ácidos grasos poliinsaturados.
Específicamente, para el cultivo de las cepas CJM01 y KC01, que son microalgas del género Thraustochytrium de acuerdo con la presente descripción, se cultivaron las cepas CJM01 y KC01 en medio de cultivo MJW01 (glucosa 30 g/L, MgSO4-7H2O 3,0 g/L, Na2SO410 g/L, NaCl 1,0 g/L, extracto de levadura 9,0 g/L, MSG1H2O 1,0 g/L, NaNOa 1,0 g/L, KH2PO40,1 g/L, K2HPO40,5 g/L, CaCh 0,5 g/L, y solución mixta de vitaminas 10 ml/L) bajo condiciones de medio de cultivo básico de 28 °C, 300 rpm, 1 vvm, y pH 7,5 durante 4 días. Los cuerpos de los hongos se recuperaron por centrifugación, se lavaron tres veces con tampón PBS, y luego se secaron a 55 °C durante 12 horas para medir el peso de los cuerpos de los hongos.
El contenido de aceite que contiene ácido docosahexaenoico utilizando los cuerpos de los hongos secos se midió como sigue. Específicamente, se aplicó una solución de ácido clorhídrico 8,3M a 2 g de los cuerpos de los hongos secos para hidrolizar las paredes celulares de los cuerpos de los hongos de microalgas a 80 °C, se añadieron 30 mL de éter etílico y 20 mL de éter de petróleo a los cuerpos de los hongos secos y se agitó durante 30 segundos, y luego la mezcla se separó por centrifugación 3. Este procedimiento se repitió tres veces o más. Luego, la capa de solvente separada se recuperó, se colocó en un matraz redondo cuyo peso se había medido previamente, se purgó con nitrógeno para eliminar un solvente, y luego el resultante se colocó en un contenedor, cuya humedad se había eliminado, y se secó. Se midió el peso del aceite seco para calcular el contenido total de aceite. El contenido de DHA en el aceite se midió por cromatografía después de pretratar el aceite con NaOH metanólico 0,5 N y metanol trifluorobórico al 14 % (BF3).
El rendimiento del cultivo de las cepas KC01 del género Thraustochytrium, cultivadas por el método anterior, y el rendimiento del cultivo de las cepas mutantes CJM01 seleccionadas por irradiación con rayos gamma se dan en las Tablas 2 y 3. Se encontró a partir de las Tablas 2 y 3 que se produjo DHA, que es un aceite omega-3 altamente funcional.
La "biomasa" en las Tablas 2 y 3 se refiere a la concentración de los cuerpos de los hongos en una solución de cultivo y puede usarse en combinación con el peso celular seco (DCW). El contenido de DHA se expresa como el contenido del mismo con respecto a la biomasa o a los ácidos grasos totales (TFA).
Como se muestra en los siguientes resultados, se encontró que la producción de DHA por las cepas mutantes CJM01 mejoraba en comparación con la de las cepas madre (cepas KC01 del género Thraustochytrium) (véase las Tablas 2 y 3). Específicamente, la producción de DHA por las cepas mutantes CJM01 aumentó aproximadamente 1,3 veces en comparación con las cepas KC01. Además, se encontró que la productividad de DHA por las cepas mutantes CJM01 aumentó aproximadamente 1,7 veces en comparación con las cepas KC01 porque el tiempo de cultivo se acortó significativamente sin una disminución en los cuerpos de los hongos obtenidos.
[Tabla 2]
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[Tabla 3]
Figure imgf000010_0001
A partir de los resultados anteriores, se encontró que las cepas CJM01, que son cepas mutantes, tenían un mayor contenido de DHA y una conductividad de DHA mejorada en comparación con las cepas KC01, que son cepas madre.
Ejemplo 2-3: Análisis de la capacidad de las microalgas recién separadas y cepas mutantes para producir aminoácidos.
Para evaluar las características de cultivo de las cepas CJM01, se determinó el contenido total de aminoácidos en la solución de cultivo anterior.
Específicamente, se recolectaron 10 mL de muestra de cada una de las soluciones de cultivo anteriores, se diluyeron con agua destilada 20 veces, y se filtraron, y luego se analizó el contenido total de aminoácidos mediante el uso de cromatografía líquida. Como resultado del análisis de la concentración total de aminoácidos, se detectaron; aspartato, serina, glutamato, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, lisina, y arginina, respectivamente, en la solución de cultivo de las cepas madre KC01 en una cantidad de 10 mg/L, mientras que la mayoría de los aminoácidos no se detectaron en la solución de cultivo de las cepas CJM01 que tienen un contenido de DHA mejorado.
Específicamente, se encontró que, en el caso de las cepas mutantes CJM01, la concentración total de aminoácidos como productos secundarios distintos de DHA se reduce en aproximadamente 99 % o más, en comparación con las cepas madre KC01 (véase la Tabla 4).
Por lo tanto, se encontró que, en el caso de las cepas mutantes CJM01, el crecimiento de los cuerpos de los hongos está en un nivel equivalente, en comparación con las cepas madre KC01, y el contenido total de lípidos no se reduce mucho en comparación con el contenido de los cuerpos de los hongos, y por lo tanto, las cepas mutantes CJM01 usan la fuente de carbono suministrada para un mecanismo biosintético de DHA de manera más efectiva en comparación con las cepas madre KC01.
[Tabla 4]
Análisis de aminoácidos totales en solución de cultivo de acuerdo con el cultivo de cepas madre KC01 del género Thraustochytrium y cepas mutantes CJM01 del género Thraustochytrium
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Ejemplo 3: Optimización de las condiciones del medio de cultivo
Para mejorar aún más el contenido y la productividad de DHA mediante el uso de las cepas CJM01 que tienen un contenido de aminoácidos reducido y un contenido de DHA mejorado, se seleccionan las cepas del Ejemplo 2, se optimizaron las condiciones del medio de cultivo.
Específicamente, en base al medio de cultivo MJW01 usado en el Ejemplo 2-2, para aumentar el contenido de fuentes de nitrógeno en el medio de cultivo y reducir los costos de producción, se disminuyó la concentración de extracto de levadura como una fuente de nitrógeno orgánico, se añadió (NH^SO4 como fuente de nitrógeno inorgánico, y se aumentó la concentración de NaNO3 para convertir el medio de cultivo MJW01 en un medio de cultivo MJW02 (glucosa 30 g/L, MgSO4-7H2O 5,0 g/L, Na2SO43 g/L, NaCl 0,5 g/L, extracto de levadura 1,0 g/L, MSG IH2O 1,0 g/L, NaNO38,0 g/L, (NH4)2SO43,0 g/L, KH2PO40,1 g/L, K2HPO40,5 g/L, CaCh 0,1 g/L, y solución mixta de vitaminas 10 ml/L).
Para comparar las condiciones del medio de cultivo MJW01 con las condiciones del medio de cultivo MJW02, las cepas CJM01 se cultivaron respectivamente en los medios de cultivo anteriores. Como resultado, como se muestra en la Tabla 5 a continuación, la cantidad de cuerpos de los hongos disminuyó a medida que disminuyó la concentración de extracto de levadura, pero el tiempo de cultivo se redujo significativamente con un aumento de una fuente de nitrógeno inorgánico. En consecuencia, se encontró que el contenido de DHA en el medio de cultivo MJW02 es igual o mayor que el contenido de DHA en el medio de cultivo MJW01, y la productividad de DHA en el medio de cultivo MJW02 se incrementó en 1,13 veces con respecto a la productividad de DHA en el medio de cultivo MJW01.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. La microalga CJM01 con número de depósito KCTC 13538BP del género Thraustochytrium, que aumenta la producción de ácido docosahexaenoico (DHA) y disminuye la producción de aminoácidos en comparación con la cepa madre.
2. La microalga de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la microalga CJM01 del género Thraustochytrium incluye ácido docosahexaenoico en una cantidad de 40 % en peso a 60 % en peso en base al peso total de ácidos grasos.
3. La microalga de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la microalga CJM01 del género Thraustochytrium tiene una productividad de ácido docosahexaenoico de 0,5 a 0,7 g/L/h.
4. Un método de producción de una biomasa, que comprende:
cultivar la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de acuerdo con la reivindicación 1; y recuperar una biomasa que contiene ácido docosahexaenoico de la microalga, un producto cultivado de la misma, un producto seco de la misma o un producto pulverizado de la misma.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el cultivo se realiza bajo condiciones heterótrofas.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el cultivo se realiza mediante el uso de un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la fuente de carbono es al menos una seleccionada del grupo que consiste en glucosa, fructosa, maltosa, galactosa, manosa, sacarosa, arabinosa, xilosa y glicerol.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la fuente de nitrógeno es i) una fuente de nitrógeno orgánico seleccionada del grupo que consiste en un extracto de levadura, un extracto de carne, peptona y triptona, o ii) una fuente de nitrógeno inorgánico seleccionada del grupo que consiste en acetato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, sulfato de amonio, nitrato de sodio, urea y glutamato monosódico (MSG).
9. Un método de producción de un bioaceite, que comprende: cultivar la microalga CJM01 del género Thraustochytrium de acuerdo con la reivindicación 1; y recuperar un lípido que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) de la microalga, un producto cultivado de la misma, un producto seco de la misma o un producto pulverizado de la misma.
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