ES2932606T3 - Streptococcus thermophilus negativa para sacarosa para su utilización en la preparación de productos fermentados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas cepas de Streptococcus thermophilus sacarosa negativo (Suc-), composiciones que comprenden dichas cepas, usos de las mismas, métodos para obtener tales cepas y métodos para la preparación de productos alimenticios fermentados usando tales composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Streptococcus thermophilus negativa para sacarosa para su utilización en la preparación de productos fermentados Campo de la invención

La presente invención se refiere a novedosas cepas de Streptococcus thermophilus negativas para sacarosa (Sac-), a composiciones que comprenden dichas cepas, a utilizaciones de las mismas, a procedimientos para obtener tales cepas y a procedimientos para la preparación de productos alimenticios fermentados.

Estado de la técnica anterior

Streptococcus thermophilus (también denominada Streptococcus salivarius, subsp. thermophilus y en lo sucesivo también denominada S. thermophilus) es una bacteria del ácido láctico grampositiva que se utiliza ampliamente en la preparación de productos lácteos fermentados. S. thermophilus se utiliza habitualmente junto con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (también denominada L. bulgaricus) como cultivo iniciador para preparar yogur y otros tipos de leches fermentadas.

Los yogures y otros productos lácteos fermentados se consumen ampliamente y contribuyen a una dieta sana proporcionando nutrientes esenciales. Sin embargo, los productos lácteos fermentados sin sabor tienen sabores agrios o ácidos característicos, por tanto, los productos lácteos fermentados de sabores y edulcorados son populares. El aumento de la conciencia de los consumidores sobre los beneficios de una dieta baja en azúcar junto con una tendencia hacia lo que el consumidor percibe como productos “naturales” ha llevado a la necesidad de desarrollar productos lácteos fermentados con un contenido reducido de azúcar que utilicen agentes edulcorantes naturales (por ejemplo, estevia). La utilización de cepas que producen un alto contenido de azúcar de las cepas S. thermophilus y L. bulgaricus también se han propuesto como un medio para aumentar el dulzor de los productos lácteos fermentados.

La Patente WO 2013/160413 da a conocer cepas mutantes de S. thermophilus que tienen propiedades edulcorantes debido a su secreción de glucosa. Estas cepas se caracterizan por una mutación en el gen glucocinasa (glcK) y se describen como adecuadas para su utilización en la preparación de productos lácteos fermentados. Sin embargo, también se da a conocer que para tales cepas el procedimiento de fermentación se retrasa 2-5 horas requiriendo, como mínimo, 20 horas de fermentación. Sorensen et al. (Appl Environ Microbiol. 22 de abril de 2016) también dan a conocer cepas de S. thermophilus que secretan glucosa St1-GS-1; St1-GS-2; St2-GS-1; St2-GS-2. Las cepas St1-GS-2 y St2-GS-2 no pudieron acidificar la leche y las cepas mutantes de glucocinasa (es decir, St1-GS-1 y St2-GS-1) mostraron un retraso de 2-3 horas con respecto a las cepas originales en la aparición de la acidificación. La Patente WO 2011/026863 da a conocer cepas de S. thermophilus altamente texturizantes con mutaciones en el gen galK que producen una leche fermentada de alta viscosidad. La Patente WO 2017/103051 da a conocer cepas de S. thermophilus con propiedades mejoradas para edulcorar productos alimenticios en combinación con propiedades texturizantes mejoradas.

La Patente WO 2017/103051 da a conocer una cepa de Streptococcus thermophilus que es fermentadora de galactosa y porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glucocinasa (glcK) que codifica la proteína glucocinasa, para aumentar tanto el dulzor como la textura en productos lácteos fermentados.

La Patente WO 2018/177835 da a conocer una composición útil para producir productos lácteos fermentados, que comprende una cepa de Streptococcus thermophilus que es fermentadora de galactosa y porta una mutación en la secuencia de ADN del gen glcK que codifica la proteína glucocinasa, y una cepa de Lactobacillus delbrueckii, que proporciona productos alimenticios fermentados con un dulzor y sabor naturales aumentados. La Patente Wo 2019/122365 da a conocer una nueva cepa positiva para lactosa, negativa para galactosa de Streptococcus thermophilus útil en composiciones para preparar un producto lácteo fermentado, preferentemente leche fermentada. Fat-free yogurt made using a galactose-positive exopolysaccharide-producing recombinant strain of Streptococcus thermophilus’’, de Robitaill, G. et al., J. Dairy Sci. 92:477-782 da a conocer una cepa recombinante positiva para galactosa de Streptococcus thermophilus que produce exopolisacáridos.

ANBUKKARASI KALIYAPERUMAL ET AL: “Preparation of low galactose yogurt using cultures of Gal+Streptococcus thermophilusin combination with Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus”, JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, SPRINGER (INDIA) PRIVATE LTD, INDIA, vol. 51, n.° 9 dan a conocer una cepa positiva para galactosa de Streptococcus thermophilus.

No obstante, sigue siendo un reto reducir la cantidad de azúcar necesaria para la preparación de productos fermentados y garantizar al mismo tiempo un producto con buenas propiedades organolépticas, bajas cantidades de azúcar añadida y con la denominada “etiqueta limpia” (una lista corta de ingredientes, utilizando tantos ingredientes reconocibles por el consumidor como sea posible). Además, la acidez de los productos fermentados también puede aumentar después de la fermentación láctica por acidificación posterior debido al consumo de otros azúcares por parte de las bacterias. Por consiguiente, a veces es necesario utilizar una mayor cantidad de azúcar en la receta original o añadir azúcar después de la fermentación.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de medios para la preparación de productos fermentados utilizando una cantidad reducida de ingredientes de sacarosa, a la vez que tienen buenas cualidades organolépticas.

Características de la invención

La presente invención se deriva de la hipótesis formulada por los inventores de la presente invención de que las cepas de S. thermophilus que se vuelven deficientes en el metabolismo de la sacarosa podrían reducir la cantidad de azúcar requerida en la preparación de productos alimenticios fermentados, tales como productos lácteos fermentados y limitar una acidificación posterior no deseada, a la vez que se mantienen las propiedades de dichas cepas necesarias para la preparación de productos alimenticios fermentados, por ejemplo, la capacidad para metabolizar lactosa para fermentar de manera eficiente leche de origen lácteo y la capacidad para producir exopolisacáridos (EPS) para texturizar el producto fermentado. Sin embargo, se ha demostrado que la selección de tales cepas es difícil y los intentos significativos realizados por los inventores de la presente invención utilizando una estrategia de cribado no lograron aislar variantes negativas para sacarosa (Sac-) de cepas de S. thermophilus de alto rendimiento.

De manera inesperada, los inventores de la presente invención descubrieron que tales variantes se pueden obtener seleccionando variantes positivas para galactosa (Gal+) antes de la selección de variantes Sac-. Por consiguiente, la presente invención proporciona cepas Sac- Gal+ de Streptococcus thermophilus. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden dichas cepas, utilizaciones de las mismas, procedimientos para obtener tales cepas y procedimientos para la preparación de productos alimenticios fermentados utilizando tales composiciones.

Descripción detallada de la invención

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “negativa para sacarosa” (o Sac-) significa la incapacidad de una bacteria para metabolizar la sacarosa. Según la presente invención, una cepa Sac- de S. thermophilus no puede crecer en un medio que contenga sacarosa como única fuente de carbono. Por el contrario, la expresión “positiva para sacarosa” (o Sac+) significa la capacidad de una bacteria para metabolizar la sacarosa o para crecer en un medio que contiene sacarosa como única fuente de carbono. Estos fenotipos se pueden determinar utilizando técnicas bien conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo, estos fenotipos se pueden evaluar inoculando, en un caldo M17 que contiene el 2 % de sacarosa, un cultivo durante la noche de la cepa S. thermophilus que se va a someter a prueba a un índice del 1 %, e incubando durante 20 horas a 37 °C, en el que un pH de 6 o superior al final de la incubación es indicativo de un fenotipo Sac- y un pH de 5,5 o inferior al final de la incubación es indicativo de un fenotipo Sac+. De manera alternativa, el perfil metabólico de una cepa bacteriana se puede determinar utilizando kits disponibles en el mercado, tales como la galería API (bioMerieux).

La definición anterior también se aplica a los fenotipos relacionados con otros hidratos de carbono fermentables por bacterias del ácido láctico, en particular, lactosa, galactosa, glucosa o fructosa.

Por consiguiente, las expresiones “negativa para lactosa” (o Lac-), “negativa para galactosa” (o Gal-), “negativa para glucosa” (o Glu-) o “negativa para fructosa” (o Fru-) se refieren a la incapacidad de una bacteria para metabolizar lactosa, galactosa, glucosa o fructosa, respectivamente. Por el contrario, las expresiones “positiva para lactosa” (o Lac+), “positiva para galactosa” (o Gal+), “positiva para glucosa” (o Glu+) o “positiva para fructosa” (o Fru+) se refieren a la capacidad de una bacteria para metabolizar lactosa, galactosa, glucosa o fructosa, respectivamente. Tal como se ha detallado anteriormente, estos fenotipos se pueden evaluar fácilmente sometiendo a prueba el crecimiento de S. thermophilus en un medio que contenga el azúcar de interés como única fuente de carbono. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “fermentación” significará el metabolismo de una sustancia por microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras u otros microorganismos. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “altamente fermentativas”, tal como se utiliza en referencia a bacterias del ácido láctico, significará una cepa de las mismas que puede reducir de manera significativa el pH de un medio adecuado a una temperatura de cultivo adecuada. En cuanto a una cepa de S. thermophilus, dicha cepa será capaz de reducir el pH de un medio que comprende leche de vaca semidesnatada complementada con extracto de levadura (2 g/l) cuando se inocula con un inóculo al 1 % en volumen, como mínimo, en 1,8 puntos de pH (por ejemplo, desde 6,5 hasta 4,7) en menos de 10 horas, más preferentemente, menos de 9, 8, 7, 6, 5 o 4 horas cuando se cultiva a una temperatura de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 43 °C, más preferentemente, de 37 °C a 43 °C. Dicho inóculo comprende de aproximadamente 105 ufc a aproximadamente 107 ufc de dicha S. thermophilus por gramo de composición de inóculo, más preferentemente, de aproximadamente 106 ufc a aproximadamente 107 ufc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “texturizante” significa que una cepa de S. thermophilus es capaz de aumentar de manera significativa la viscosidad de un producto fermentado mediante la producción de exopolisacáridos (EPS). Los procedimientos para determinar la textura de la leche incluyen medir la tensión de cizalladura (viscosidad) de la leche fermentada y se conocen fácilmente en la técnica y también se describen en los ejemplos a continuación.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “composición estable” significará una composición que no presenta sedimentación y/o separación del suero.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “x % (p/p)” es equivalente a “x g por 100 g”.

Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones “composición láctea”, “composición a base de leche” o “producto lácteo” significarán un producto o una composición que comprenden o consisten esencialmente en leche o componentes de la leche y, opcionalmente, ingredientes adicionales.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “producto lácteo fermentado” significará un producto o una composición que es el producto de la fermentación acidificante de una composición a base de leche por un cultivo iniciador de microorganismos fermentadores, en particular, bacterias, preferentemente, bacterias del ácido láctico. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “leche fermentada” significará un producto o una composición derivada de leche por la acción acidificante, como mínimo, de una bacteria del ácido láctico. Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, un producto lácteo fermentado puede ser, por tanto, una leche fermentada, tal como un yogur (por ejemplo, un yogur firme, batido o para beber), o un queso fresco, tal como queso blanco o un “Petit-suisse”. También puede ser una leche fermentada colada, tal como un yogur colado, (por ejemplo, un yogur concentrado o de estilo griego).

Los términos “leche fermentada” y “yogur” tienen sus significados habituales en el sector técnico de la industria láctea, es decir, productos adecuados para el consumo humano y que se originan de la fermentación láctica acidificante de un sustrato de leche. Estos productos pueden contener ingredientes secundarios, tales como frutas, verduras, azúcar, etc. La expresión “leche fermentada” se puede utilizar para referirse a leches fermentadas distintas de yogures, por ejemplo, “kéfir”, “kumis”, “lassi”, “dahi”, “leben”, “filmjolk”, “villi”, “leche acidófila”.

El término “yogur”, tal como se utiliza en el presente documento, significará leche fermentada obtenida mediante la fermentación láctica acidificante de bacterias del ácido láctico termófilas específicas, tales como Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus (también denominada Streptococcus salivarius subsp. thermophilus), que deben estar en estado vivo en el producto terminado en un mínimo de UFC. En determinados países, las regulaciones permiten la adición de bacterias del ácido láctico adicionales al yogur, tal como, pero sin limitarse a las mismas, cepas de Bifidobacterium y/o Lactobacillus acidophilus y/o Lactobacillus casei. Estas cepas adicionales de bacterias del ácido láctico están destinadas a conferir diversas propiedades al producto acabado, tales como la de aportar cualidades organolépticas, favorecer el equilibrio de la flora intestinal o modular el sistema inmunitario.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “composición láctea fermentada colada” significará una composición láctea fermentada que se ha sometido a un procedimiento de separación de suero ácido tras la fermentación.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “que se puede comer con cuchara” significará un sólido o semisólido que se puede consumir por medio de una cuchara u otro utensilio.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “ufc” o “UFC” significará una abreviatura de la expresión “unidad formadora de colonias”.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “CNCM I-” seguido de un número de 4 dígitos se referirá a una cepa depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) 25 rue du Docteur Roux, París, Francia, según el Tratado de Budapest con un número de registro correspondiente a dicho número de 4 dígitos, por ejemplo, CNCM I-5448.

Tal como se utiliza en el presente documento, la referencia a una cepa o especie bacteriana incluirá bacterias equivalentes funcionalmente derivadas de la misma, tales como, pero sin limitarse a las mismas, mutantes o variantes. Estos mutantes o variantes pueden ser cepas en las que uno o varios genes endógenos de la cepa original se han mutado por medios no dirigidos (mutagénesis al azar inducida, por ejemplo, por radiación UV o agentes alquilantes), por ejemplo, para modificar algunas de sus propiedades metabólicas (por ejemplo, su capacidad para fermentar azúcares, su resistencia a la acidez, su supervivencia para el transporte en el tracto gastrointestinal, sus propiedades posteriores a la acidificación o su producción de metabolitos).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “OMG” significará un organismo, con excepción de los seres humanos, en el cual el material genético se ha alterado de una manera que no se produce de manera natural por apareamiento y/o recombinación natural, dicho término abarcará, por ejemplo, organismos que son objetivo de transformación genética para incluir ADN exógeno, o edición de genes dirigida al sitio, tales como las metodologías CRISPR/Cas9. El término “OMG” excluirá y no abarcará un organismo en el que el material genético se ha alterado por mutagénesis al azar, tales como por medios químicos o de radiación, seguida de una selección fenotípica.

En el presente texto, las cepas, mutantes y variantes derivadas de una especie o cepa original se considerarán abarcadas por referencia a dicha especie o cepa original, por ejemplo, las expresiones “Streptococcus thermophilus” y “CNCM 1-5448” incluirán cepas, mutantes y variantes derivadas de las mismas. Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, la referencia a una cepa bacteriana especificada por un número de registro o de depósito abarcará variantes de la misma que tengan, como mínimo, el 95 % de identidad (véase: Stackebrandt y Goebel, 1994, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849). En una realización particularmente preferente, dicha variante tiene, como mínimo, el 97 % de identidad con la secuencia de ARNr 16S de dicha cepa especificada, más preferentemente, como mínimo, el 98 % de identidad, más preferentemente, como mínimo, el 99 % o más de identidad.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “sustancialmente pura” cuando se utiliza en referencia a una cepa bacteriana se refiere al porcentaje de dicha cepa bacteriana en relación con el contenido total de microorganismos. Sustancialmente pura puede ser, como mínimo, aproximadamente el 99,99 %, como mínimo, aproximadamente el 99,90 %, como mínimo, aproximadamente el 99,50 %, como mínimo, aproximadamente el 99,00 %, como mínimo, aproximadamente el 95,00 %, como mínimo, aproximadamente el 90,00 %, como mínimo, aproximadamente el 85,00 %, o, como mínimo, aproximadamente el 75,00 %.

Tal como se utiliza en el presente documento, una “bacteria del ácido láctico” es una batería grampositiva, tolerante al ácido, en general no esporulante y que no respira, con forma de varilla o coco, que puede fermentar azúcares para dar ácido láctico.

Streptococcus thermophilus

En un aspecto, la presente invención da a conocer una cepa de Streptococcus thermophilus caracterizada por que es positiva para galactosa (Gal+) y negativa para sacarosa (Sac-).

En una realización, la presente invención da a conocer una cepa, tal como se ha definido anteriormente, caracterizada además por que es negativa para fructosa (Fru-).

En una realización, la presente invención da a conocer una cepa, tal como se ha definido anteriormente, caracterizada además por que es positiva para glucosa (Glu+).

En una realización, la presente invención da a conocer una cepa, tal como se ha definido anteriormente, caracterizada además por que es positiva para lactosa (Lac+).

En una realización preferente, la presente invención da a conocer una cepa de Streptococcus thermophilus caracterizada por que es Gal+ Sac- Fru-, preferentemente, Gal+ Sac- Fru- Glu+, lo más preferentemente, Gal+ Sac- Fru- Glu+ Lac+.

Tales cepas son particularmente apropiadas para la preparación de productos fermentados de sabores, ya que limitan o evitan la disminución de la sacarosa y/o fructosa presentes en la mezcla original.

En una realización más preferente, la presente invención da a conocer una cepa de Streptococcus thermophilus, tal como se ha definido anteriormente, caracterizada por que es altamente fermentativa.

En una realización preferente, la presente invención da a conocer una cepa, tal como se ha definido anteriormente, caracterizada además por que es texturizante.

En una realización preferente, la presente invención da a conocer una cepa, tal como se ha definido anteriormente, caracterizada, además, por que es un organismo no OMG con la excepción de una variante de una cepa que se produce de manera natural que se ha obtenido mediante un procedimiento de mutagénesis al azar mediante medios químicos o de radiación y selección fenotípica. Por tanto, por ejemplo, una cepa de la presente invención puede ser positiva para galactosa (Gal+) y negativa para sacarosa (Sac-) obtenida a partir de una cepa de tipo natural de S. thermophilus por medio de mutagénesis al azar por radiación Uv o un agente alquilante, seguido por una selección basada en el perfil metabólico.

En una realización, la cepa de la presente invención produce un exopolisacárido cuando se cultiva en un medio a base de leche y, en realizaciones preferentes, se puede utilizar para preparar un producto de leche fermentada que tiene una viscosidad mayor que 800 mPa.s, más preferentemente, mayor que 900 mPa.s y, lo más preferentemente, mayor que 1000 mPa.s, a 4 °C. En realizaciones, la composición tiene un intervalo de viscosidad de 800 a 2000 mPa.s, o de 800 a 1500 mPa.s, a 4 °C, midiéndose dicha viscosidad utilizando un reómetro MCR301 refrigerado equipado con un sistema de cilindros concéntricos de 27 mm, según la ecuación I, después de 7 días de almacenamiento a 4 °C.

En una realización, la presente invención da a conocer la cepa de Streptococcus thermophilus CNCM I-5448. Esta cepa se ha depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) (Instituto Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, Paris, Francia) según el Tratado de Budapest el 20 de noviembre de 2019 con el número de referencia CNCM I-5448. El depósito se realizó según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los efectos del Procedimiento de Patentes, según lo dispuesto en el mismo, el solicitante solicita que una muestra de los microorganismos depositados solo se ponga a disposición de un experto independiente hasta la fecha en que se pueda conceder la patente. La cepa de S. thermophilus CNCM I-5448 corresponde al clon 11R15 descrito en los ejemplos a continuación.

En una realización, la presente invención da a conocer la cepa de S. thermophilus CNCM 1-5448, que es sustancialmente pura.

Procedimientos para obtener cepas negativas para sacarosa

La mayoría de cepas de tipo natural de S. thermophilus son positivas para sacarosa y el desarrollo de variantes negativas para sacarosa mediante mutagénesis al azar ha demostrado ser un desafío. Además, la ruta metabólica de los hidratos de carbono y la ruta de biosíntesis de los exopolisacáridos están estrechamente relacionadas en S. thermophilus y una mutación deletérea en el metabolismo de la sacarosa reduce de manera drástica el crecimiento de S. thermophilus. Sin embargo, tal como se muestra en los ejemplos a continuación, esta dificultad de aislar directamente variantes Sac- se supera aislando variantes Gal+ antes de la selección de variantes Sac-.

La mayoría de cepas de tipo natural de S. thermophilus son Gal- y casi todas las cepas texturizantes contienen galactosa en el EPS. Sin querer limitarse a la teoría, por tanto, se planteó la hipótesis de que la ruta de la galactosa podría compensar una deficiencia en la ruta de la sacarosa y permitir el aislamiento de variantes Sac- que también retienen la capacidad texturizante de la cepa de tipo natural.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una cepa de S. thermophilus negativa para sacarosa que comprende:

i) proporcionar una primera cepa de S. thermophilus,

ii) seleccionar, como mínimo, un clon positivo para galactosa de la misma,

iii) mutar dicho clon o clones seleccionados, seleccionados en ii), preferentemente, mediante procedimiento químico o de radiación y seleccionar, como mínimo, una variante negativa para sacarosa del mismo.

En una realización, dicha primera cepa de S. thermophilus es Gal- Sac+.

En una realización preferente, dicha primera cepa de S. thermophilus es Gal- Sac+ Fru-.

En una realización más preferente, dicha primera cepa de S. thermophilus es Gal- Sac+ Fru- Glu+ Lac+.

En una realización, dicha primera cepa de S. thermophilus es una cepa texturizante que produce exopolisacáridos. La etapa ii) se puede llevar a cabo, pero sin limitarse a la misma, subcultivando la primera cepa de S. thermophilus en un medio con galactosa como única fuente de carbono, preferentemente, en medio M17, lo más preferentemente, en un medio M17 modificado (glicerofosfato 9 g/l).

La etapa iii) se lleva a cabo, preferentemente, mediante mutagénesis al azar, preferentemente, mediante exposición a agentes alquilantes o exposición a radiación UV, más preferentemente, mediante exposición a una dosis de radiación UV que proporciona una supervivencia de aproximadamente el 2 %.

En una realización, dicho procedimiento comprende además:

iv) seleccionar una variante negativa para sacarosa que es altamente fermentativa en un medio a base de leche y/o subcultivar una variante negativa para sacarosa en un medio a base de leche. Esta etapa adicional permite el aislamiento, como mínimo, de una cepa que tiene capacidades de fermentación de la leche más rápidas.

El subcultivo de una variante negativa para sacarosa en un medio a base de leche se lleva a cabo, preferentemente, más de una vez, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 veces. Preferentemente, el subcultivo se lleva a cabo, como mínimo, 10 veces, más preferentemente, como mínimo, 15 veces.

Composiciones de la invención

En un aspecto, la presente invención da a conocer composiciones que comprenden una cepa de Streptococcus thermophilus, tal como se ha definido anteriormente.

Preferentemente, la composición comprende, como mínimo, 105, más preferentemente, como mínimo, 106 y, lo más preferentemente, como mínimo, 107 unidades formadoras de colonias (UFC) de una cepa de S. thermophilus de la presente invención por gramo (g) de composición.

En realizaciones, la composición comprende de 105 a 1012 UFC de una cepa de S. thermophilus de la presente invención por gramo (g) de composición. En realizaciones, la composición comprende de 106 a 1011 UFC de una cepa de S. thermophilus de la presente invención por ramo (g) de composición. En realizaciones, la composición comprende, como mínimo, 105, 106, 107, 108, 109 10l0, 1011 o 1012 UFC de una cepa de S. thermophilus de la presente invención por gramo (g) de composición.

En una realización, la composición comprende, como mínimo, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 o 1012 UFC de la cepa de Streptococcus thermophilus CⁿC^m I-5448 por gramo (g) de composición.

La bacteria que se da a conocer en el presente documento es adecuada para su utilización en composiciones comestibles, por consiguiente, en una realización, la presente invención da a conocer una composición adecuada para el consumo o la ingestión humana, preferentemente, por vía oral. Por consiguiente, la composición comprende o consiste en materia comestible. Se prefiere, particularmente, que las composiciones de las realizaciones de la presente invención estén sustancialmente libres de materia patógena o toxicogénica. La composición, según realizaciones de la presente invención, puede ser un medicamento o una composición farmacéutica. En una realización particularmente preferente, la composición, según la presente invención, puede ser una composición no terapéutica, preferentemente, una composición nutracéutica, una composición nutricional y/o una composición alimenticia. Se prefiere, particularmente, que la composición alimenticia sea una composición alimenticia fermentada, preferentemente, una composición láctea fermentada. Composiciones adicionales, según las realizaciones de la presente invención, también incluyen aditivos alimentarios, ingredientes alimentarios, complementos nutricionales, fórmulas nutricionales, alimentos infantiles, fórmulas de leche de inicio y leches de continuación.

La composición puede comprender, además, cepas adicionales de Bifidobacterium y/o bacterias del ácido láctico; normalmente 1, 2, 3, 4 o más cepas adicionales. Entre los ejemplos de Bifidobacterium que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, Bifidobacterium animalis (por ejemplo, Bifidobacterium animalis subsp. animalis o Bifidobacterium animalis subsp. lactis); Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium bifidum. Entre los ejemplos de bacterias del ácido láctico que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, Lactobacilli (por ejemplo, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbrueckii, en particular, L. delbrueckii subsp. bulgaricus o lactis o delbrueckii, Lactobacillus case, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Lactococci (por ejemplo, Lactococcus lactis, normalmente Lactococcus lactis subsp. lactis o Lactococcus lactis subsp. cremoris). Preferentemente, la composición comprende, además, Lactobacillus y/o Streptococcus. Para la preparación de yogur, la composición comprende normalmente Lactobacillus bulgaricus (también denominado Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) y Streptococcus thermophilus, opcionalmente, con microorganismos adicionales tales como, pero sin limitarse a los mismos, especies probióticas u otras especies que pueden proporcionan cualidades organolépticas deseables u otras cualidades a la composición, por ejemplo, cepas adicionales de Lactococcus lactis.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención da a conocer una composición que comprende la cepa de Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 y que comprende, además, como mínimo, una cepa de Lactobacillus bulgaricus y, opcionalmente, una o varias cepas de Lactococcus lactis y/o Bifidobacterium.

Composiciones lácteas

Las cepas de la presente invención son particularmente adecuadas para la preparación de composiciones fermentadas. Por consiguiente, en una realización la presente invención da a conocer una composición láctea, preferentemente, una composición láctea fermentada. La composición láctea de la presente invención comprende leche, preferentemente, leche fermentada. Preferentemente, la composición comprende, como mínimo, aproximadamente el 30 % (p/p) de leche, más preferentemente, como mínimo, aproximadamente el 50 % (p/p) de leche, e incluso más preferentemente, como mínimo, aproximadamente el 70% (p/p) de leche. En realizaciones, la composición comprende del 30 % al 100 % (p/p) de leche. En realizaciones, la composición comprende del 50 % al 100 % (p/p) de leche. En realizaciones, la composición comprende del 70% al 100% (p/p) de leche. Preferentemente, dicha leche es leche vegetal y/o animal, más preferentemente, leche de soja, almendra, avena, cáñamo, espelta, coco, arroz, cabra, oveja, camello, yegua o vaca, y, lo más preferentemente, a leche de vaca. Preferentemente, dicha leche o leches se tratan térmicamente, normalmente se pasteurizan, para asegurar la esterilidad. Preferentemente, dicho tratamiento térmico se lleva a cabo antes de la preparación de la composición láctea fermentada.

Preferentemente, dicha leche comprende una o varias de leche desnatada, parcialmente desnatada o no desnatada. Preferentemente, dicha leche o leches pueden estar en forma líquida, en polvo y/o concentrada. En una realización dicha leche comprende, además, componentes de leche, preferentemente, seleccionados entre el grupo que consiste en nata, caseína, caseinato (por ejemplo, caseinato de calcio o sodio), proteínas del suero, en particular, en forma de un concentrado (WPC, whey protein concéntrate), proteínas de leche, en particular, en forma de un concentrado (MPC, milk protein concéntrate), hidrolizados de proteínas de leche, y mezclas de los mismos. En una realización, dicha mezcla comprende zumos vegetales y/o de frutas. En una realización, dicha leche o leches se pueden enriquecer o fortificar con componentes de leche adicionales u otros nutrientes, tales como, pero sin limitarse a los mismos, vitaminas, minerales, oligoelementos u otros micronutrientes.

Preferentemente, la composición láctea comprende por encima de aproximadamente 0,3 g por 100 g en peso de ácido láctico libre, más preferentemente, por encima de aproximadamente 0,7 g o 0,6 g por 100 g en peso de ácido láctico libre. En realizaciones, la composición comprende de 0,3 g a 0,7 gramos por 100 g en peso de ácido láctico libre.

Preferentemente, la composición láctea comprende un contenido de proteínas, como mínimo, equivalente al de la leche o leches de las que se deriva, preferentemente, como mínimo, aproximadamente el 2,5 %, más preferentemente, como mínimo, aproximadamente el 3 % o el 3,5 % (p/p). Preferentemente, la composición tiene un pH igual a o menor que 5, preferentemente, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4,5 y, más preferentemente, entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,5.

Preferentemente, la composición láctea fermentada después de 7 días de almacenamiento a 4 °C tiene una viscosidad mayor que 800 mPa.s, más preferentemente, mayor que 900 mPa.s y, lo más preferentemente, mayor que 1.000 mPa.s, a 4 °C, según la ecuación I. En realizaciones, la composición tiene un intervalo de viscosidad de 800 a 2.000 mPa.s, o de 800 a 1.500 mPa.s, a 4 °C, tal como se mide utilizando un reómetro MCR301 refrigerado equipado con un sistema de cilindros concéntricos de 27 mm según la ecuación I.

La composición láctea fermentada, según las realizaciones de la presente invención, es, preferentemente, un producto seleccionado entre el grupo que comprende yogur, yogur firme, yogur batido, yogur para beber, bebida de yogur, yogur helado, kéfir, lactosuero, requesón, nata agria, queso fresco y queso. En una realización, la composición, según las realizaciones de la presente invención, es una composición bebible, más preferentemente, una bebida de leche fermentada, tal como, pero sin limitarse a los mismos, una bebida de yogur, kéfir etc. En una realización alternativa, la composición, según las realizaciones de la presente invención, es una composición que se puede comer con cuchara, tal como un yogur firme o batido o un equivalente de los mismos.

En una realización, la composición láctea fermentada es una composición láctea fermentada colada. La composición láctea fermentada colada tiene, preferentemente, el siguiente contenido (% en peso):

- desde el 8,5 % hasta el 11,0 % de proteína de leche

- desde el 0,0 % hasta el 8,0% de grasa, por ejemplo, desde el 0,0 % hasta el 3,5 % o desde el 3,5 % hasta el 8,0 % - desde el 0,00 % hasta el 7,00 % de lactosa, por ejemplo, desde el 2,80 % hasta el 6,00 %

El pH de la composición láctea fermentada colada puede ser, por ejemplo, de 3,80 a 4,65.

Preferentemente, la composición, según las realizaciones de la presente invención, se puede almacenar, transportar y/o distribuir a una temperatura desde 1 °C hasta 10 °C durante, como mínimo, aproximadamente 30 días, como mínimo, aproximadamente 60 días o, como mínimo, aproximadamente 90 días desde el envasado y seguir siendo adecuada para el consumo.

En realizaciones, las composiciones lácteas de la presente invención comprenden, como mínimo, 105 ufc/g, más preferentemente, como mínimo, 106 ufc/g, tal como, como mínimo 107 ufc/g, por ejemplo, como mínimo, 10® ufc/g, tal como, como mínimo, 109 ufc/g, por ejemplo, como mínimo, 1010 ufc/g, tal como, como mínimo, 1011 ufc/g de una cepa de S. thermophilus de la presente invención por gramo de composición láctea. En realizaciones, las composiciones de la presente invención comprenden de 105 a 1012 o de 106 a 1010 unidades formadoras de colonias (UFC) de una cepa de S. thermophilus de la presente invención por gramo de composición, preferentemente, S. thermophilus CnCm 1 -5448.

Preferentemente, la composición es un producto envasado que comprende, como mínimo, 106, más preferentemente, como mínimo, 107 y, lo más preferentemente, como mínimo, 108 unidades formadoras de colonias (UFC) de Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 por gramo (g) de composición, según las realizaciones de la presente invención, después del almacenamiento, trasporte y/o distribución a una temperatura de 1 °C a 10 °C durante, como mínimo, aproximadamente 30 días, como mínimo, aproximadamente 60 días o, como mínimo, aproximadamente 90 días desde el envasado.

En realizaciones, la composición es un producto envasado que comprende de 105 a 1012 o de 106 a 1010 unidades formadoras de colonias (UFC) de Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 por gramo (g) de composición, según las realizaciones de la presente invención, después del almacenamiento, transporte y/o distribución a una temperatura de 1 °C a 10 °C durante, como mínimo, aproximadamente 30 días, como mínimo, aproximadamente 60 días o, como mínimo, aproximadamente 90 días desde el envasado.

En realizaciones, la composición láctea comprende, además, una preparación intermedia. Las preparaciones intermedias son conocidas por un experto en la materia. Se utilizan normalmente para modificar el sabor, sensación en boca y/o textura de una composición láctea, por ejemplo, de una composición láctea fermentada. Se pueden utilizar también para introducir algunos aditivos, tales como nutrientes. Comprenden normalmente agentes edulcorantes, aromatizantes, modificadores de color, cereales y/o fruta. Las preparaciones intermedias de frutas son, por ejemplo, suspensiones o preparaciones de frutas. Entre los aromatizantes se incluyen, por ejemplo, aromatizantes de frutas, aromatizantes de vainilla, aromatizantes de caramelo, aromatizantes de café, aromatizantes de chocolate.

Las preparaciones de frutas comprenden normalmente frutas. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “fruta” se refiere a cualquier forma de fruta, que incluyen, por ejemplo, frutas enteras, piezas, purés, concentrados, zumos etc.

La preparación intermedia o suspensión comprende normalmente un agente estabilizante, que tiene, como mínimo, un estabilizador. El agente estabilizante puede comprender, como mínimo, dos estabilizadores. Tales estabilizadores son conocidos por un experto en la materia. Normalmente ayudan a evitar la separación de fases de los sólidos, por ejemplo, de frutas o extractos de frutas y/o a evitar la sinéresis. Normalmente proporcionan algo de viscosidad a la composición, por ejemplo, una viscosidad (viscosidad de Bostwick a 20 °C) de 1 a 20 cm/min, preferentemente, de 4 a 12 cm/min.

El sistema de estabilización o el estabilizador puede ser, por ejemplo, un almidón, una pectina, un agar, un xantano, un carragenano, una goma garrofín, o una mezcla de los mismos. La cantidad de sistema de estabilización es normalmente del 0,5 al 5 % en peso.

La preparación intermedia puede comprender normalmente modificadores organolépticos. Dichos ingredientes son conocidos por el experto en la materia.

Los modificadores organolépticos pueden ser, por ejemplo, agentes edulcorantes diferentes de azúcar, agentes colorantes, cereales y/o extractos de cereales.

Entre los ejemplos de agentes edulcorantes se encuentran ingredientes denominados edulcorantes de alta intensidad, tales como sucralosa, acesulfamo K, aspartamo, sacarina.

Entre los ejemplos de frutas se incluyen, por ejemplo, fresa, melocotón, albaricoque, mango, manzana, pera, frambuesa, arándano, mora, fruta de la pasión, cereza, y mezclas o asociaciones de los mismos, tales como melocotón-fruta de la pasión.

Por ejemplo, las frutas se pueden proporcionar como:

- dados de fruta congelados, por ejemplo, dados de fruta de 10 mm, por ejemplo, dados de fruta de congelación rápida individuales, por ejemplo, dados de fruta de fresa, melocotón, albaricoque, mango, manzana, pera o mezclas de los mismos,

- dados de fruta asépticos, por ejemplo, dados de fruta de 10 mm, por ejemplo, dados de fruta de fresa, melocotón, albaricoque, mango, manzana o pera o mezclas de los mismos,

- purés de frutas, por ejemplo, purés de frutas concentrados de 2 a 5 veces, preferentemente, 3 veces, por ejemplo, purés de frutas asépticos, por ejemplo, purés de frutas de fresa, melocotón, albaricoque, mango, frambuesa, arándano o manzana o mezclas de los mismos,

- purés de frutas asépticos individuales, por ejemplo, purés de frutas asépticos individuales de fresa, frambuesa, melocotón, albaricoque, arándano o manzana o mezclas de los mismos,

- frutas enteras congeladas, por ejemplo, frutas enteras de congelación rápida individuales, por ejemplo, frutas enteras congeladas de arándano, frambuesa o mora, o mezclas de las mismas,

- mezclas de los mismos.

Los ingredientes y/o componentes de la preparación intermedia y la cantidades de los mismos pueden ser normalmente, de manera que la composición tenga un grado Brix de 1 a 65 Brix, por ejemplo, de 1 a 10 Brix, o de 10 a 15 Brix, o de 15 a 20 Brix, o de 20 a 25 Brix, o de 25 a 30 Brix, o de 30 a 35 Brix, o de 35 a 40 Brix, o de 40 a 45 Brix, o de 45 a 50 Brix, o de 50 a 55 Brix, o de 55 a 60 Brix, o de 55 a 60 Brix, o de 60 a 65 Brix.

Una preparación de frutas puede comprender, por ejemplo, fruta en una cantidad del 30 % al 80 % en peso, por ejemplo, del 50 al 70 % en peso.

La preparación intermedia puede comprender agua. Se menciona que una parte del agua puede provenir de los ingredientes utilizados para preparar la preparación de frutas, por ejemplo, de frutas o extractos de frutas o de una solución de ácido fosfórico.

La preparación de frutas puede comprender agentes de modificación del pH, tales como ácido cítrico. La preparación de frutas puede tener un pH de 2,5 a 5, preferentemente, de 2,8 a 4,2.

Normalmente se puede añadir una preparación de frutas en una cantidad del 5-35 % en peso con referencia a la cantidad total de composición. En realizaciones, la composición de la presente invención comprende hasta aproximadamente el 30 % (p/p) de dicha preparación intermedia, por ejemplo, hasta aproximadamente el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 % (p/p). En una realización, la composición, según las realizaciones de la presente invención, comprende del 1 % al 30 % (p/p) de dicha preparación intermedia. En realizaciones alternativas, la composición, según las realizaciones de la presente invención, comprende del 1 % al 25 % (p/p) de dicha preparación intermedia. En realizaciones alternativas adicionales, la composición, según las realizaciones de la presente invención, comprende del 1 % al 20 % (p/p) de dicha preparación intermedia. En realizaciones adicionales, la composición, según las realizaciones de la presente invención, comprende del 1 % al 15 % (p/p) de dicha preparación intermedia. En otras realizaciones adicionales, la composición, según las realizaciones de la presente invención, comprende del 1 % al 10 % (p/p) de dicha preparación intermedia.

Preferentemente, la composición, según las realizaciones de la presente invención, se proporciona en un recipiente sellado o que se puede sellar que contiene aproximadamente 50 g, 60 g, 70 g, 75 g, 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, 100 g, 105 g, 110 g, 115 g, 120 g, 125 g, 130 g, 135 g, 140 g, 145 g, 150 g, 200 g, 300 g, 320 g o 500 g o aproximadamente 1 oz, 2 oz, 3 oz, 4 oz, 5 oz, 6 oz o 12 oz de producto en peso.

En realizaciones, la composición, según las realizaciones de la presente invención, se proporciona en un recipiente sellado o que se puede sellar que contiene aproximadamente de 50 g a 500 g, de 60 g a 500 g, de 70 g a 500 g, de 75 g a 500 g, de 80 g a 500 g, de 85 g a 500 g, de 90 g a 500 g, de 95 g a 500 g, de 100 g a 500 g, de 105 g a 500 g, de 110 g a 500 g, de 115 g a 500 g, de 120 g a 500 g, de 125 g a 500 g, de 130 g a 500 g, de 135 g a 500 g, de 140 g a 500 g, de 145 g a 500 g, de 150 g a 500 g, de 200 g a 500 g, de 300 g a 500 g, de 320 g a 500 g o de 500 g de producto en peso. En realizaciones, la composición, según las realizaciones de la presente invención, se proporciona en un recipiente sellado o que se puede sellar que contiene aproximadamente de 1 oz a 12 oz, de 2 oz a 12 oz, de 3 oz a 12 oz, de 4 oz a 12 oz, de 5 oz a 12 oz, de 6 oz a 12 oz o 12 oz de producto en peso.

Composiciones de inoculo

La cepa de Streptococcus thermophilus de la presente invención es útil como cultivo iniciador en la preparación de composiciones alimenticias, tales como productos lácteos fermentados. Por consiguiente, en una realización, la presente invención da a conocer un inóculo que comprende una cepa de S. thermophilus, tal como se ha definido anteriormente, que es adecuada para la preparación de productos lácteos fermentados. El inóculo de la presente invención es adecuado para la inoculación directa de cepas de S. thermophilus en una composición que comprende leche para proporcionar productos lácteos fermentados de la presente invención, normalmente sin la necesidad de una etapa de cultivo antes de dicha inoculación directa. En una realización preferente, la presente invención da a conocer un inóculo que comprende la cepa S. thermophilus CNCM 1-5448.

Normalmente el inóculo comprende, además, un excipiente o vehículos, cuya selección está dentro del alcance del experto en la materia, pero puede incluir tampones o medios de cultivo. El inóculo puede comprender, opcionalmente, componentes adicionales, tales como crioprotectores, conservantes y/o aditivos que incluyen nutrientes, tales como extractos de levadura, cisteína, azúcares y vitaminas.

Normalmente el inóculo es para su utilización en la preparación de productos lácteos fermentados. Según una realización, el inóculo de la presente invención se puede proporcionar a la composición láctea en cantidades de hasta aproximadamente 500 mg/l.

Normalmente el inóculo es nuevo, congelado, secado o liofilizado. El inóculo puede estar en forma líquida, seca, secada por pulverización o sólida. Se prefiere, particularmente, que el inóculo esté en forma líquida. El inóculo se puede descongelar y/o dispersar en un líquido (por ejemplo, agua) antes de la inoculación en una composición que comprende leche.

En realizaciones, el inóculo comprende, como mínimo, 106 ufc, como mínimo, 107 ufc, como mínimo, 108 ufc, 109 ufc, por ejemplo, como mínimo, 1010 ufc, tal como, como mínimo, 1011 ufc de una S. thermophilus de la presente invención por gramo de composición de inóculo. En realizaciones, el inóculo comprende de 107 a 1012 unidades formadoras de colonias (UFC) o, más preferentemente, de 1010 a 1012 unidades formadoras de colonias (UFC) de una cepa de S. thermophilus de la presente invención por gramo de inóculo.

Preferentemente, el inóculo que comprende una cepa de S. thermophilus de la presente invención es sustancialmente puro.

En una realización adicional, la presente invención da a conocer una mezcla o un kit de partes del inóculo de la presente invención junto con inóculo de Bifidobacterium y/o bacterias del ácido láctico.

Entre los ejemplos de Bifidobacterium que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, Bifidobacterium animalis (por ejemplo, Bifidobacterium animalis subsp. animalis o Bifidobacterium animalis subsp. lactis); Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium bifidum. Entre los ejemplos de bacterias del ácido láctico que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, Lactobacilli (por ejemplo, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbrueckii, en particular, L. delbrueckii subsp. bulgaricus o lactis, Lactobacillus case, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Lactococci (por ejemplo, Lactococcus lactis, normalmente Lactococcus lactis subsp. lactis o Lactococcus lactis subsp. cremoris). Preferentemente, la mezcla de inóculo comprende, además, Lactobacillus y/o Streptococcus. Para la preparación de yogur, la mezcla de inóculo comprende normalmente Lactobacillus bulgaricus (también denominada Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) y Streptococcus thermophilus, opcionalmente, con microorganismos adicionales, tales como, pero sin limitarse a los mismos, especies probióticas u otras especies que pueden proporcionar cualidades organolépticas deseables u otras cualidades a la composición, por ejemplo, Lactococcus lactis.

Por consiguiente, en una realización la presente invención proporcionar una mezcla de inóculo que comprende un inóculo de Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 y que comprende, además, como mínimo, un inóculo de Lactobacillus bulgaricus y, opcionalmente, uno o varios inóculos adicionales de Lactococcus lactis y/o Bifidobacterium.

Procedimientos para la preparación de productos lácteos fermentados

Las cepas de S. thermophilus de la presente invención son adecuadas para su utilización en la preparación de productos lácteos fermentados. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención también se refiere a la utilización prevista de estas cepas, en particular, de Streptococcus thermophilus CNCM 1-5448, para la preparación de una composición alimenticia, más particularmente para fermentar un producto alimenticio.

La presente invención también da a conocer un procedimiento para la preparación de un producto lácteo fermentado que comprende inocular una composición a base de leche con una cepa de S. thermophilus, tal como se ha definido anteriormente, y fermentar.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención da a conocer un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

i) proporcionar una mezcla que comprende:

a) leche, y

b) una cepa o un inóculo de S. thermophilus, tal como se han definido anteriormente,

ii) fermentar dicha mezcla para proporcionar un producto lácteo fermentado.

En una realización, la mezcla comprende, además, sacarosa. En una realización preferente, la mezcla comprende, como mínimo, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 10 o el 20 % p/p de sacarosa, preferentemente, el 1-15 % p/p, más preferentemente, el 2-10 % p/p. Se prefiere particularmente que el contenido de sacarosa en el producto lácteo fermentado obtenido en la etapa ii) sea, como mínimo, del 90 % o más, preferentemente, como mínimo, del 91 %, del 92 % o del 93 % del contenido de sacarosa en la mezcla de la etapa i). Se prefiere que dicho contenido de sacarosa se mida después de 7 días de almacenamiento a 4 °C.

Preferentemente, se preparan productos lácteos fermentados que utilizan leche que se ha sometido a tratamiento térmico, como mínimo, equivalente a pasteurización. Preferentemente, dicho tratamiento térmico se lleva a cabo antes de la preparación de la composición.

Normalmente, la leche se pasteuriza por medio de las siguientes etapas sucesivas de:

1) normalizar las sustancias grasas de la materia prima para obtener una sustancia normalizada,

2) enriquecer con materia seca la sustancia normalizada obtenida en la etapa anterior, para obtener una sustancia enriquecida,

3) precalentar la sustancia enriquecida obtenida en la etapa anterior, para obtener una sustancia de partida, 4) pasteurizar y mantener la sustancia de partida obtenida en la etapa anterior, para obtener una sustancia pasteurizada y mantenida,

5) una etapa opcional de homogeneizar la sustancia pasteurizada y mantenida obtenida en la etapa anterior, para obtener una sustancia pasteurizada, mantenida y, opcionalmente, homogeneizada,

6) enfriar inicialmente la sustancia pasteurizada, mantenida y, opcionalmente, homogeneizada obtenida en la etapa anterior, para obtener una sustancia de partida pasteurizada que se ha mantenido, opcionalmente, homogenizado y enfriado.

Tal como se utiliza en el presente documento, “normalizar las sustancias grasas” significa una etapa de llevar una cantidad de grasas presentes en la sustancia de partida a un nivel predeterminado. Enriquecer con materia seca implica la adición de proteínas y sustancia grasa para modificar la firmeza de la cuajada.

Tal como se utiliza en el presente documento, “mantener” significa un calentamiento rápido y mantenimiento de la temperatura de la leche y hace posible destruir la flora microbiana vegetativa, que incluye formas patogénicas. Su duración habitual es de 4 a 10 minutos, en particular, de 5 a 8 minutos y, en particular, aproximadamente 6 minutos. Tal como se utiliza en el presente documento, “homogeneizar” significa la dispersión de las sustancias grasas en la sustancia de tipo leche en pequeños glóbulos de grasa. Por ejemplo, la homogeneización se lleva a cabo a una presión de 100 a 280 bar, en particular, de 100 a 250 bar, en particular, de 100 a 200 bar, en particular, aproximadamente 200 bar. Esta etapa de homogeneización es puramente opcional. En particular, está ausente del procedimiento de producción de productos con el 0 % sustancias grasas.

Normalmente un producto lácteo fermentado se prepara mediante el cultivo de leches a una temperatura adecuada con microorganismos adecuados para proporcionar una reducción en el pH, preferentemente, a un pH igual a o menor que 5, preferentemente, entre aproximadamente 3 y 4,7; más preferentemente, entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,7. El pH se puede ajustar controlando la fermentación por el microorganismo y deteniéndola cuando sea apropiado, por ejemplo, mediante enfriamiento.

Según una realización del procedimiento para la preparación de un producto lácteo fermentado, tal como se ha definido anteriormente, la mezcla que comprende leche y una S. thermophilus de la presente invención comprende, además, como mínimo, una, dos, tres o más cepas de Bifidobacterium y/o bacterias del ácido láctico. La selección de cepas de Bifidobacterium adecuadas está dentro del alcance del experto en la materia y son normalmente bacterias probióticas del ácido láctico. Entre los ejemplos de Bifidobacterium que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, Bifidobacterium animalis (por ejemplo, Bifidobacterium animalis subsp. animalis o Bifidobacterium animalis subsp. lactis); Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium bif idum. La selección de cepas de bacterias del ácido láctico adecuadas está dentro del alcance del experto en la materia y son normalmente bacterias del ácido láctico termófilas. Entre los ejemplos de bacterias del ácido láctico que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitarse a los mismos, Lactobacilli (por ejemplo, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbruckeii, en particular, L. delbrueckii subsp. bulgaricus o lactis, Lactobacillus case, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Lactococci (por ejemplo, Lactococcus lactis, normalmente Lactococcus lactis subsp. lactis o Lactococcus lactis subsp. cremoris). Normalmente se puede utilizar una mezcla o asociación de una pluralidad de especies de bacterias del ácido láctico, normalmente una mezcla o asociación de Lactobacillus y Streptococcus. Para la preparación de yogur, esto incluye normalmente Lactobacillus bulgaricus (también denominada Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) y Streptococcus thermophilus, opcionalmente, con microorganismos adicionales, tales como, pero sin limitarse a los mismos, especies probióticas u otras especies que pueden proporcionar cualidades organolépticas u otras cualidades a la composición, por ejemplo, Lactococcus lactis. Por consiguiente, en una realización, la mezcla comprende, además, como mínimo, una cepa de Lactobacillus bulgaricus y, opcionalmente, una o varias cepas de Lactococcus lactis y/o Bifidobacterium.

Las temperaturas adecuadas para la fermentación de la leche son normalmente de aproximadamente 36 °C a aproximadamente 44 °C y la temperatura se mantiene durante un tiempo de incubación suficiente para proporcionar la reducción deseada en el pH. Para la preparación de un producto lácteo fermentado la temperatura al inicio de la fermentación es normalmente de aproximadamente 36 °C a aproximadamente 43 °C, en particular, de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 40 °C, la temperatura al final de la fermentación es normalmente de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 44 °C, en particular, de aproximadamente 38 °C a aproximadamente 41 °C. El tiempo de fermentación es normalmente de aproximadamente 6 a aproximadamente 11 horas.

Posteriormente a la fermentación, se enfría el producto lácteo fermentado. Opcionalmente, se puede realizar una etapa de enfriamiento intermedio de la leche fermentada para proporcionar una leche fermentada enfriada previamente que tiene una temperatura de entre aproximadamente 22 °C y aproximadamente 4 °C. Normalmente el tiempo de enfriamiento intermedio es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas, en particular, de aproximadamente 1 hora 30 minutos a aproximadamente 2 horas. La leche fermentada enfriada previamente se almacena normalmente durante hasta 40 horas o menos.

Preferentemente, se realiza una etapa de enfriamiento final de la leche fermentada, de tal manera que la temperatura al comienzo del enfriamiento final sea de menos de aproximadamente 22 °C y la temperatura al final del enfriamiento final sea de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 10 °C. A continuación, el producto enfriado se puede almacenar, transportar y/o distribuir a una temperatura desde aproximadamente 1 °C hasta aproximadamente 10 °C durante, como mínimo, aproximadamente 30 días, como mínimo, aproximadamente 60 días o, como mínimo, aproximadamente 90 días.

Se prefiere, particularmente, que la cantidad de sacarosa en el producto lácteo fermentado sea, como mínimo, del 90 % o más, preferentemente, como mínimo, del 91 %, del 92 % o del 93 % del contenido de sacarosa en la mezcla de producto antes de la fermentación. Se prefiere que dicha sacarosa se mida después de 7 días de almacenamiento a 4 °C. Según una realización adicional, el procedimiento para la preparación de un producto lácteo fermentado, tal como se ha definido anteriormente, comprende, opcionalmente, una etapa de agitar a una presión, como mínimo, de 20 bar, o realizar un suavizado dinámico, para obtener una composición que tenga la viscosidad deseada, normalmente una viscosidad de hasta 20 mPa.s. Las operaciones de agitación o suavizado dinámico proporcionan algo de cizalladura a la composición que permite normalmente una caída de la viscosidad. Dichas operaciones son conocidas por el experto en la materia, y se pueden llevar a cabo con un equipo convencional apropiado. Esta etapa se realiza normalmente a temperatura fría, por ejemplo, a una temperatura desde 1 °C hasta 20 °C. Sin pretender restringirse a ninguna teoría, se cree que aplicar algo de cizalladura a temperatura fría, normalmente agitando a alta presión o realizando un suavizado dinámico, puede conducir a la formación de un gel fluido dentro de la composición, que proporciona una estabilidad mejorada incluso a una baja viscosidad de hasta 20 mPa.s.

De manera alternativa, según una realización adicional, el procedimiento para la preparación de un producto lácteo fermentado, tal como se ha definido anteriormente, comprende, opcionalmente, una etapa de extracción del suero ácido para proporcionar una “composición láctea fermentada colada”. En esta etapa, se separa una composición de suero ácido de la cuajada resultante de la coagulación de proteínas debido a la acidificación durante la fermentación. Por tanto, se obtiene:

- un producto lácteo fermentado, que comprende normalmente el coágulo de proteínas, denominado composición láctea fermentada colada, y

- un subproducto de suero ácido.

Dichas etapas de separación son conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, en procedimientos de elaboración de “yogures griegos”. Por ejemplo, la separación se puede llevar a cabo mediante ósmosis inversa, ultrafiltración o separación centrífuga. Por ejemplo, la etapa de separación se puede realizar a una temperatura desde 30 °C hasta 45 °C.

Según una realización adicional, el procedimiento para la preparación de un producto lácteo fermentado, tal como se ha definido anteriormente, comprende, opcionalmente, una etapa de adición de una preparación intermedia, tal como se ha descrito anteriormente, antes o después de la fermentación, comprendiendo normalmente dicha preparación intermedia una preparación de frutas y/o cereales y/o aditivos, tales como aromatizantes y/o colorantes. La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

Descripción de las figuras

Figura 1. Crecimiento de cepa de tipo natural y clones Gal+ G9 a G16 en M17m con lactosa como única fuente de carbono.

Figura 2. Crecimiento de cepa de tipo natural y clones Gal+ G9 a G16 en M17m con galactosa como única fuente de carbono.

Figura 3. Fermentación de leche UHT semidesnatada por la cepa de tipo natural o por los clones deficientes en sacarosa 1-13.

Figura 4. Crecimiento de cepa de tipo natural y clones deficientes en sacarosa 1-13 en M17m con lactosa como única fuente de carbono.

Figura 5. Crecimiento de cepa de tipo natural y clones deficientes en sacarosa 1-13 en M17m con sacarosa como única fuente de carbono.

Figura 6. Fermentación de leche UHT semidesnatada por la cepa de tipo natural, el clon 11 o el clon 11R15 (CNCM 1-5448).

Ejemplos

Los inventores de la presente invención tenían como objetivo identificar una cepa de S. thermophilus negativa para sacarosa (Sac-) adecuada para la preparación de productos lácteos fermentados, tales como yogur, siendo dicha cepa negativa para sacarosa (Sac-) para asegurar un dulzor mejorado en productos que contienen azúcar con una acidificación posterior mínima.

Adicionalmente, se requirió que dicha cepa tuviera propiedades texturizantes (es decir, que produjera EPS) y, además, se prefirió que la cepa fuera negativa para fructosa (Fru-) para asegurar un dulzor mejorado y una acidificación posterior reducida en los productos que contienen fruta.

Por consiguiente, los inventores de la presente invención llevaron a cabo un programa de cribado de 655 cepas de S. thermophilus de la Colección de Cultivos de Danone del solicitante. Se analizó cada cepa utilizando la prueba con API 50CH después de 48 horas de incubación at 37 °C con MRS API. Esto hizo posible determinar el perfil de fermentación para galactosa, sacarosa y fructosa.

De todas las cepas probadas, 654 eran Sac+, 13 eran Gal+, 84 eran Fru+. Todas las cepas Gal+ (13) eran también Fru+. De todas las cepas probadas no se identificó ninguna Sac-Gal+. La única cepa Sac- identificada era Glu+, Fru+, Lac+, Gal-.

I. Selección de una variante de S. thermophilus Gal+

La cepa de tipo natural (Wt) muestra el fenotipo Lac+ Glu+ Sac+ Gal- Fru- y lleva a cabo de manera eficiente la fermentación de lactosa con altas propiedades texturizantes. Se subcultivó con éxito la cepa de tipo natural en medio M17 modificado (M17m, la concentración de beta-glicerofosfato es de 9 g/l en lugar de 19 g/l en M17) en presencia de galactosa como única fuente de carbono. Después de 12 subcultivos, se aislaron algunos clones en placas que contenían M17m-galactosa. Se aislaron ocho clones (G9 a G16) y se cultivaron en M17m-galactosa a 5 g/l.

Se analizó el crecimiento de los ocho clones seleccionados y se monitorizó utilizando un dispositivo Bioscreen C a una longitud de onda de 600 nm (Bioscreen C es un espectrofotómetro que permite la monitorización del crecimiento midiendo la densidad óptica a 600 nm en microplacas) en dos medios diferentes. Se analizó el crecimiento en presencia (i) de lactosa como única fuente de carbono o (ii) de galactosa como única fuente de carbono. Se llevaron a cabo los cultivos previos en M17m-gal para las colonias y en M17m-lac para la cepa de tipo natural. La tasa de inoculación fue del 1 % de los cultivos previos.

La cepa de tipo natural y los ocho clones aislados crecen de manera eficiente en el medio que contiene lactosa (figura 1), mientras que, en el medio que contiene galactosa, solo los ocho clones aislados pueden crecer (figura 2). Estos resultados muestran el aislamiento de variantes Gal+ a partir de la cepa de tipo natural Gal-.

Se seleccionó el clon G15 porque mostró el mejor crecimiento tanto en galactosa como en lactosa.

II. Mutagénesis de la variante de S. thermophilus Gal+

Se realizó una mutagénesis mediante radiación ultravioleta en el clon G15 Gal+ derivado de la cepa de tipo natural. Para la mutagénesis, se utilizó una dosis de radiación UV que proporcionó aproximadamente una supervivencia del 2 %.

Se probaron cuatro mil clones obtenidos de la mutagénesis para determinar su capacidad para acidificar el medio M17m en presencia de galactosa a 5 g/l como fuente de carbono y para acidificar el medio M17m en presencia de sacarosa a 5 g/l como fuente de carbono. Se utilizó púrpura de bromocresol como indicador de pH, que se vuelve amarillo en medio ácido, mientras que es púrpura en un medio no inoculado.

Trece de los 4000 clones probados mostraron una capacidad reducida para acidificar el medio en presencia de sacarosa, manteniendo a la vez una buena acidificación en presencia de galactosa como fuente de carbono.

III. Caracterización de los mutantes de S. thermophilus Gal+ con una deficiencia en el metabolismo de la sacarosa Se probaron 13 clones en leche UHT semidesnatada complementada con extracto de levadura a 2 g/l. Se inoculó la leche enriquecida con extracto de levadura al 1 % a partir de un cultivo previo elaborado en leche UHT semidesnatada enriquecida con extracto de levadura a 2 g/l. Se incubaron los cultivos a 38 °C y se detuvo la fermentación a pH 4,7 mediante enfriamiento hasta 4 °C.

Se monitorizó la fermentación mediante el sistema iCinac que hace posible obtener los valores de pH de manera continua. Todos los clones mostraron una capacidad reducida para acidificar la leche (figura 3).

También se evaluó la capacidad de los clones para crecer en un medio que contenía sacarosa como fuente de carbono monitorizando la densidad óptica a 600 nm con Bioscreen C.

Se llevó a cabo la monitorización del crecimiento en presencia (i) de lactosa como única fuente de carbono o (ii) de sacarosa como única fuente de carbono. Se llevaron a cabo los cultivos previos en M17m gal para las colonias y en M17m Lac para la cepa de tipo natural. La tasa de inoculación fue del 1 % de los cultivos previos.

En presencia de lactosa, todos los clones pudieron crecer (figura 4). En presencia de sacarosa, la mayoría de los clones mostraron un crecimiento que se redujo en comparación con el crecimiento de la cepa de tipo natural, pero solo el clon 11 mostró una incapacidad para crecer en presencia de sacarosa (figura 5).

Estos resultados muestran el aislamiento con éxito de un clon Sac- de la variante Gal+.

IV. Mejora del crecimiento de la cepa Gal+ Sac- en leche.

El clon 11 mostró un claro fenotipo Sac-, pero también mostró una reducción de su eficiencia fermentativa en leche. Para recuperar una eficiencia similar a la de la cepa de tipo natural, se llevaron a cabo 15 subcultivos sucesivos en leche UHT semidesnatada complementada con extracto de levadura a 2 g/l. Se obtuvo el clon 11R15 y se depositó posteriormente como cepa CnCm 1-5448, tal como se ha descrito anteriormente. Se midió la fermentación con la cepa de tipo natural, el clon 11 o el clon 11R15 en leche UHT semidesnatada con 2 g/l de extracto de levadura mediante el sistema iCinac.

El clon 11R15 (CNCM 1-5448) mostró una capacidad para acidificar la leche mejor que la del clon 11 y similar a la de la cepa de tipo natural (figura 6).

Estos resultados muestran el aislamiento de una variante Sac- con la misma capacidad para fermentar la leche en comparación con la cepa de tipo natural.

V. Caracterización del clon 11R15 (CNCM 1-5448)

V.1. Dosificación de sacarosa

Se prepararon mezclas utilizando leche UHT semidesnatada con 2 g/l de extracto de levadura y 55 g/l de sacarosa y se inocularon con clon 11R15 o con la cepa de tipo natural, se llevó a cabo la fermentación a 38 °C y se detuvo cuando el pH era de 4,7 mediante enfriamiento rápido.

Como control, se preparó un producto lácteo ácido (pH 4,7) no fermentado (sin cepas) utilizando leche UHT semidesnatada con 2 g/l de extracto de levadura y 55 de g/l sacarosa y glucono-delta-lactona (GDL) al 1,5 % p/p como agente acidificante. Se calentó dicho producto de control hasta 38 °C durante 4 horas, para asegurar la comparabilidad para someter a prueba los productos.

Se almacenaron los productos durante 7 días a 4 °C, a continuación, se centrifugaron los productos a 5.000 g durante 5 minutos a 4 °C. Se realizó la determinación de sacarosa en los sobrenadantes en 3 muestras en 2 experimentos utilizando un kit de ensayo de glucosa-fructosa-sacarosa de Biosentec. Los resultados se proporcionan en la tabla 1.

Tabla 1. Nivel de sacarosa en los productos después de la fermentación con cepa de tipo natural o con clon 11R15

CNCM I-5448.

En el primer experimento, el producto fermentado con la cepa de tipo natural ha perdido 7,3 ± 1,8 g, mientras que el producto fermentado con el clon 11R15 ha perdido solo 2,1 ± 1,8 g. En el segundo experimento, el producto fermentado con la cepa de tipo natural ha perdido 10,9 ± 2 g, mientras que el producto fermentado con el clon 11R15 ha perdido solo 2 ± 2,1 g.

Estos resultados muestran que el clon 11R15 (CNCM 1-5448) puede lograr la fermentación a la vez que mantiene de manera significativa el nivel de sacarosa en los ingredientes, al contrario que la cepa de tipo natural. La ligera reducción en la sacarosa durante la fermentación se puede atribuir razonablemente a la degradación inherente de la sacarosa en el pH ácido, ya que es comparable a la del control de GDL en el segundo experimento.

V.2. Viscosidad

Se prepararon mezclas utilizando leche UHT semidesnatada con 2 g/l de extracto de levadura y 55 g/l de sacarosa y se inocularon con clon 11R15, con clon 11 o con cepa de tipo natural. Se llevó a cabo la fermentación a 38 °C y se detuvo cuando el pH era de 4,7 mediante enfriamiento rápido. Se almacenaron los productos durante 7 días a 4 °C, a continuación, se midió la viscosidad mediante medición de la tensión de cizalladura.

Este procedimiento consiste en la determinación de la viscosidad de los productos después de la agitación manual y la incubación durante 30 minutos a 4 °C. Se llevaron a cabo tres mediciones a 4 °C en tres recipientes de leche fermentada por la misma cepa y en las mismas condiciones. El aparato utilizado para este análisis fue un reómetro MCR301 refrigerado equipado con un sistema de cilindros concéntricos de 27 mm. Este sistema giratorio hace posible observar una desestructuración del producto en función de un gradiente de cizalladura lineal, es decir, una tensión a un gradiente determinado. Los resultados se obtienen en forma de una curva de flujo continuo, una rampa ascendente y descendente entre 0 y 20 s-1. El producto se somete a un gradiente de cizalladura creciente desde 0 hasta 20 s-1 durante 1 minuto. Esta fase corresponde a la rampa ascendente. A continuación, se somete a un gradiente de cizalladura decreciente desde 20 hasta 0 s-1 durante 1 minuto, correspondiente a la rampa descendente.

A continuación, se modela cada curva descendente según el modelo de Casson (ecuación I).

t : Tensión (Pa)

To : Límite de elasticidad del producto (Pa)

n : Viscosidad del producto (Pa.s)

D : Gradiente de cizalladura (s-1)

La viscosidad de los productos después de 7 días de almacenamiento a 4 °C se proporciona en la tabla 2.

Tabla 2. Visc i l r f rm n n i n r l n l n 11 n clon 11R15.

Estos resultados muestran que el clon 11R15 (CNCM 1-5448) tiene propiedades texturizantes similares en comparación con la cepa de tipo natural.

V.3. Prueba de API (índice de perfil analítico)

Se obtuvo el perfil de fermentación del clon 11R15 (CNCM 1-5448) llevando a cabo la prueba de API 50CH después de 48 horas de incubación a 37 °C con MRS API. Esto hizo posible determinar el perfil de fermentación para galactosa, sacarosa y fructosa.

El clon 11R15 (CNCM 1-5448) es positivo para galactosa (Gal+), negativo para sacarosa (Sac-), negativo para fructosa (Fru-), positivo para lactosa (Lac+), positivo para glucosa (Glu+), tal como se determina utilizando dicha prueba y, además, es altamente fermentativo y texturizante (produciendo EPS de manera significativa).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Cepa de Streptococcus thermophilus, caracterizada por que es positiva para galactosa y negativa para sacarosa.

2. Cepa, según la reivindicación 1, caracterizada además por que es una cepa texturizante.

3. Cepa, según la reivindicación 1 o 2, caracterizada, además, por que es positiva para glucosa.

4. Cepa de S. thermophilus depositada en la CNCM con el número de referencia CNCM 1-5448.

5. Composición que comprende una cepa, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4.

6. Composición, según la reivindicación 5, que comprende, como mínimo, 105 UFC/g de dicha cepa.

7. Composición, según la reivindicación 5 o 6, en la que dicha composición es un producto alimenticio, opcionalmente, un producto alimenticio fermentado.

8. Composición, según la reivindicación 7, en la que dicho producto alimenticio es un producto lácteo o un producto alternativo a los lácteos.

9. Procedimiento para la preparación de un producto alimenticio fermentado, que comprende:

i) proporcionar una mezcla que comprende:

a) leche, y

b) , como mínimo, una cepa de S. thermophilus, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, ii) fermentar dicha mezcla para proporcionar un producto alimenticio fermentado.

10. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, o producto, tal como se obtiene con el procedimiento, según la reivindicación 9, que tiene una viscosidad, como mínimo, de 800 mPa.s

a 4 °C, tal como se mide utilizando un reómetro MCR301 refrigerado equipado con un sistema de cilindros concéntricos de 27 mm.

11. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, o producto, tal como se obtiene con el procedimiento, según la reivindicación 9, que tiene un pH de 4,7 o menor.

12. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, o producto, tal como se obtiene con el procedimiento, según la reivindicación 9, que comprende, además, como mínimo, una cepa de Bifidobacterium o bacterias del ácido láctico.

13. Utilización de una cepa, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, para fermentar un producto alimenticio.

14. Procedimiento para obtener una cepa de S. thermophilus, según la reivindicación 1, que comprende:

i) proporcionar una primera cepa de S. thermophilus,

ii) seleccionar, como mínimo, un clon positivo para galactosa de la misma,

iii) mutar dicho clon o clones seleccionados, seleccionados en ii), preferentemente, mediante procedimiento químico y/o de radiación y seleccionar, como mínimo, una variante negativa para sacarosa del mismo.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, que comprende, además:

iv) seleccionar una variante negativa para sacarosa que es la más fermentativa en un medio a base de leche y/o subcultivar una variante negativa para sacarosa en un medio a base de leche.