ES2932990T3 - Procedimiento de prevención del depósito de bioincrustaciones en un material en contacto con un medio acuoso - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para evitar la formación de bioincrustaciones en una superficie de un material que está en contacto con un medio acuoso o con aire que tiene una humedad relativa superior o igual al 90%, comprendiendo dicho método el tratamiento de la superficie con un EPS que se puede obtener por fermentación de una bacteria del género Vibrio parahaemolyticus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de prevención del depósito de bioincrustaciones en un material en contacto con un medio acuoso

[0001] La presente invención se refiere a la prevención del depósito de bioincrustaciones en una superficie sumergida o en contacto con un medio acuoso.

[0002] Cuando un material se coloca en condiciones húmedas o sumergido en un medio acuoso, se observa el depósito de bioincrustaciones en su superficie. La adhesión de las bioincrustaciones se realiza en varias etapas. En primer lugar se forma en la superficie una película primaria, denominada «biopelícula», compuesta por materiales orgánicos presentes en el medio. Esta película permite a continuación la adhesión de microorganismos (bacterias, algas microscópicas), en el llamado «microfouling» en inglés, y después de macroorganismos (a título ilustrativo, algas macroscópicas, percebes, mejillones, etc.), en el llamado «macrofouling» en inglés.

[0003] La presencia de estas bioincrustaciones puede ser molesta, no solo para la estética de la superficie, sino también porque puede estorbar el uso del material utilizados, por ejemplo, obstaculizando el flujo del fluido acuoso, disminuyendo los intercambios térmicos, disminuyendo las propiedades ópticas o mecánicas del material o acelerando la corrosión o la biodegradación del material. Por ejemplo, una terminal de metano o una central térmica comprenden numerosas canalizaciones en las que circula el agua, que permiten especialmente el calentamiento o el enfriamiento de la instalación. El depósito de bioincrustaciones en el interior de estas canalizaciones puede frenar o impedir la circulación del agua y/o disminuir el intercambio térmico entre el agua que circula y la instalación que se calentará o enfriará y, por tanto, perjudicar el rendimiento de la instalación.

[0004] La eliminación del depósito de bioincrustaciones y la prevención de este depósito se realizan habitualmente mediante la protección catódica, el uso de ultrasonidos o el uso de agentes biocidas, especialmente por cloración. Los agentes biocidas tienen, sin embargo, un impacto negativo en el entorno de los materiales tratados. Próximamente deberían entrar en vigor nuevas normas y directivas relativas al uso de agentes biocidas. Por tanto, se investigan procedimientos alternativos poco o nada biocidas.

[0005] La bibliografía refiere el uso de ciertos exopolisacáridos (en lo sucesivo, EPS) que pueden formar una película en superficies de materiales en medio marino para prevenir la adhesión de estas bioincrustaciones.

[0006] La solicitud WO 2012/001164 describe el uso de EPS, preferentemente los obtenidos por fermentación de bacterias extraídas de ecosistemas hidrotermales profundos, especialmente del género Alteromonas o Pseudoalteromonas, para prevenir la formación de la biopelícula microscópica.

[0007] G. Raguenes y col. (Applied and Environmental Microbiology 62(1), 67-73, 1996) proponen el uso de un EPS producido por fermentación de bacterias marinas de las cepas ST 716, HYD 1545 y ^h Y^d 1644 extraídas de ecosistemas hidrotermales profundos y del género Alteromonas macleodii para la biodetoxificación y durante el tratamiento de las aguas residuales.

[0008] Con ello, la toma de muestras de bacterias extraídas de ecosistemas hidrotermales profundos y el procedimiento de fermentación que permite producir los EPS son complejos y, por tanto, costosos. El uso de bacterias extraídas de medios no atípicos sería más sencillo y más económico.

[0009] La solicitud EP 1170359 y Hayase y col. (Journal of Bioscience and Bioengineering, 95(1), 72-76, 2003) describen que la aplicación de una biogelatina que comprende polisacáridos producida por una bacteria marina SHY 1-1 del género Alteromonas en una estructura marina, por ejemplo, un barco o una red de pesca, permite prevenir el ensuciamiento de la estructura por los microorganismos y los macroorganismos. Hayase y col. han aislado también otras cuatro bacterias marinas pero sin llegar a hacerlas producir un EPS por fermentación.

[0010] La solicitud US 2004/0258655 describe un agente producido por una bacteria marina de la cepa DSM 15590 extraída de las aguas costeras del este de Hong Kong y del género Vibrio alginolyticus o Vibrio proteolyticus como agente antiincrustaciones contra los organismos de incrustación Hydroides elegans (gusano tubícola), Bugula neritina (briozoo) y Balanus amphitrite (percebe). La solicitud JP H03 239766 describe un agente de control del depósito de bioincrustaciones obtenido por cultivo de un hongo elegido entre Agrobacterium, Vibrio, Baccilus, Escherichia y Saccharomyces.

[0011] Con ello, es difícil prever qué bacterias marinas pueden formar un EPS, y entre ellas, cuáles pueden formar un EPS que tenga propiedades de prevención del depósito de bioincrustaciones sin poseer una actividad biocida. De hecho, todos los EPS producidos por fermentación de bacterias marinas no pueden prevenir el depósito de bioincrustaciones.

[0012] Existe la necesidad de desarrollar otros procedimientos de prevención del depósito de bioincrustaciones con un agente no biocida.

[0013] Para este fin, la invención se refiere a un procedimiento de prevención del depósito de bioincrustaciones en una superficie de un material en contacto con un medio acuoso o con el aire cuya humedad relativa es superior o igual al 90%, que comprende el tratamiento de esta superficie con un EPS obtenido por fermentación de una bacteria del género Vibrio parahaemolyticus.

[0014] Por «bioincrustaciones» se entiende la biopelícula, los microorganismos (bacterias, algas microscópicas), en el llamado «microfouling» en inglés, y los macroorganismos (algas macroscópicas, percebes, mejillones, etc.), en el llamado «macrofouling» en inglés.

[0015] El EPS usado en el procedimiento según la invención se obtiene por fermentación de una bacteria del género Vibrio parahaemolyticus.

[0016] En general, la bacteria que permite producir por fermentación el EPS es una bacteria extraída de un medio marino no atípico.

[0017] Un medio marino no atípico es un medio marino natural cuyas condiciones de temperatura, pH, salinidad, presión y/u oxigenación no son extremas. Un ecosistema hidrotermal profundo no es, por tanto, un medio marino no atípico. En general, en un medio marino no atípico:

- la temperatura está comprendida entre 5 y 40°C, especialmente entre 10 y 35°C, preferentemente entre 15 y 35°C, y/o

- la presión está comprendida entre 0,1 y 5 bares, especialmente entre 1 y 3 bares, preferentemente entre 1 bar y 2 bares, y/o

- el pH está comprendido entre 3 y 10, especialmente entre 4 y 9, preferentemente entre 5 y 8,5, y/o

- la salinidad está comprendida entre 10 y 75 g/l, especialmente entre 12 y 60 g/l, preferentemente entre 15 g/L y 52 g/l, y/o

- la presión parcial de oxígeno disuelto es superior o igual al 10%, normalmente superior o igual al 20%, especialmente superior o igual al 35%, preferentemente superior o igual al 50%.

[0018] La presión parcial de oxígeno disuelto se mide normalmente mediante una sonda a presión parcial de oxígeno disuelto. La salinidad se ajusta normalmente introduciendo la cantidad de sal adecuada en el fermentador.

[0019] El medio marino no atípico puede estar o no expuesto a la luz.

[0020] Normalmente, este medio no atípico es el litoral bretón a una profundidad de 0 a 40 m, especialmente de 0 a 20 m, preferentemente de 0 a 10 m, por ejemplo, a una profundidad de 2 m. De hecho, los fenómenos de marea pueden elevar de manera importante la altura de la columna de agua en un lugar dado.

[0021] Las bacterias extraídas de un medio marino no atípico no son extremófilas. Se trata, por ejemplo, de bacterias mesófilas, bacterias aerobias, bacterias no acidófilas y no alcalinófilas o bacterias no halófilas.

[0022] Preferentemente, la bacteria se elige entre dos bacterias depositadas en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) por la empresa Polymaris Biotechnology, Aéropóle Centre, 29600 Morlaix, Francia:

- el 23 de diciembre de 2015 con el número de orden CNCM I-5036 con la referencia de identificación ENGIE 1-5 PB, o

- el 23 de diciembre de 2015 con el número de orden CNCM I-5037 con la referencia de identificación ENGIE 1-12 PB.

[0023] Estas dos bacterias son extraídas del litoral bretón y pueden encontrarse hacia 2 metros de profundidad en función de la marea en la cual se han realizado las tomas de muestras.

[0024] Posteriormente, el EPS que puede obtenerse por fermentación de la bacteria con el número de orden Cn c M I-5036 se llama EPS F2, y el EPS que puede obtenerse por fermentación de la bacteria con el número de orden CNCM I-5037 se llama EPS F4.

[0025] El EPS usado en el procedimiento según la invención puede prepararse, por ejemplo, siguiendo el protocolo de fermentación siguiente:

Se cultiva la cepa bacteriana en medio 2216E (Oppenheimer, J Mar. Res., 1952, 11, 10-18) enriquecido con glucosa (30 g/l). La producción se lleva a cabo a 30°C y a pH 7,4 en fermentador de 5 litros que contiene 3 litros del medio 2216E-glucosado, tal como describen P. Vincent y col. en Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, 4134-4141. Después de aproximadamente 48 horas de cultivo, la fermentación se detiene.

[0026] El EPS puede recuperarse, por ejemplo, con el tratamiento siguiente:

Después de dilución de la mitad con agua destilada, las bacterias se separan del medio de cultivo por una centrifugación a 20.000 g durante 2 horas. El EPS no está enlazado químicamente con la bacteria que lo produce. Por tanto, es fácil separarlo de la biomasa bacteriana por centrifugación.

[0027] El EPS obtenido de la centrifugación puede usarse sin purificación ulterior. Preferentemente, el EPS se purifica a partir del medio de cultivo por ultrafiltración contra el agua.

[0028] Así, el sobrenadante obtenido de la centrifugación puede someterse a diafiltración contra el agua, por ejemplo, agua destilada, en membranas que presentan un umbral de corte dado, por ejemplo, de 150 kDa. La diafiltración puede controlarse por conductimetría, especialmente hasta alcanzar una conducción del permeado de 30 microsiemens.

[0029] El EPS puede conservarse entonces en solución acuosa. El producto obtenido de la diafiltración también puede ser liofilizado para permitir el almacenamiento del EPS en forma seca.

[0030] En el procedimiento según la invención, el EPS puede usarse en forma de solución, en general de solución acuosa, o en forma seca. Cuando se usa en forma seca, el procedimiento comprende normalmente una etapa de disolución del EPS en una solución, normalmente una solución acuosa. Esta es la solución que comprende el e Ps que servirá para tratar la superficie. Estas soluciones acuosas de EPS pueden estar en una forma «lista para su empleo» (preferentemente con una concentración de EPS tal como se describe a continuación) o en una forma concentrada (preferentemente con una concentración de EPS superior a la descrita a continuación). En este último caso, el procedimiento comprende así, en general, una etapa de disolución de la solución concentrada (solución madre) para obtener la solución a la concentración deseada en EPS (solución hija), y después la etapa de tratamiento de la superficie del material con esta solución.

[0031] En general, en el procedimiento según la invención, la concentración de EPS de la solución de EPS que sirve para tratar la superficie del material es del 10-7% al 0,02% en peso, especialmente del 5*10-7% al 0,01% en peso, normalmente del 10-6% al 5*10-6% en peso, preferentemente del 1 * l0 -6% al 1 * l0 -6% en peso, por ejemplo, del orden del 5*10-6% en peso con respecto al peso de la solución, especialmente acuosa. Además, si el EPS se usa en forma de solución, la solución de e Ps con la que se trata la superficie y/o la solución de EPS introducida en el medio acuoso en contacto con esta superficie tienen preferentemente dicha concentración. Esta concentración puede reducirse por optimización de la frecuencia de tratamiento. Si el EPS es introducido en forma de polvo en el medio acuoso en contacto con el material, la masa de EPS introducida se elige de manera que la concentración de EPS en el medio acuoso sea tal como se define anteriormente. El medio acuoso que comprende el EPS corresponde entonces a la solución acuosa que comprende el EPS a una concentración del 10-7% al 0,02% en peso con respecto al peso del medio acuoso.

[0032] En general, el EPS usado en el procedimiento según la invención tiene una masa molecular pico medida por cromatografía líquida de exclusión estérica de más de 1.000.000 Da. El EPS tiene, por tanto, una masa molar pico medida por cromatografía líquida de exclusión estérica de más de 1.000.000 g/mol. La masa molecular se evalúa normalmente por cromatografía líquida de exclusión estérica (HPSEC) usando una columna de permeación en gel y una evaluación en función de los estándares de Dextrano. Las masas moleculares pico se expresan en equivalente de Dextrano. Los EPS F2 y F4 tienen una masa molecular medida por cromatografía líquida de exclusión estérica de más de 1.000.000 Da.

[0033] Preferentemente, el EPS usado en el procedimiento según la invención comprende menos del 5% en masa, especialmente menos del 1% en masa de sulfato con respecto a la masa en seco del EPS. El EPS puede estar desprovisto de grupo sulfato. La proporción en masa en sulfato puede determinarse, por ejemplo, por dosificación colorimétrica siguiendo el procedimiento descrito en el artículo (Craigie, J. S., Wen Z. C., Van der Meer J. P. (1984) Botanica Marina 2555-61).

[0034] Preferentemente, el EPS usado en el procedimiento según la invención comprende unidades de N-acetil glucosamina. Según una primera alternativa, el e Ps usado en el procedimiento según la invención comprende (o incluso consiste en) unidades de N-acetil glucosamina, galactosa y glucosa. Según una segunda alternativa, el EPS usado en el procedimiento según la invención comprende (o incluso consiste en) unidades de N-acetil glucosamina y ácido galacturónico. La composición osídica se determina, por ejemplo, por cromatografía en fase gaseosa después de metanólisis del EPS. El análisis de la composición osídica se efectúa por comparación con patrones tratados en las mismas condiciones experimentales.

[0035] El EPS F2 es un polímero que comprende menos del 1% en masa de sulfato con respecto a la masa en seco del EPS F2 y que comprende unidades de N-acetil glucosamina, galactosa y glucosa.

[0036] El EPS F4 es un polímero que comprende menos del 1% en masa de sulfato con respecto a la masa en seco del EPS F4 y que comprende unidades de N-acetil glucosamina y ácido galacturónico.

[0037] Sin querer verse limitados por ninguna teoría en particular, una primera hipótesis consistiría en que los EPS forman una película en la superficie, que podría entrar en competencia con la película primaria compuesta por materiales orgánicos presentes en el medio que se forma en la superficie del material. Una segunda hipótesis consistiría en que los EPS intervienen sobre los receptores de los microorganismos presentes en el agua tratada y reducen, e incluso impiden, la fijación de estos microorganismos en la superficie del material. Esta segunda hipótesis es la más probable cuando el EPS se introduce en concentración muy baja en el medio acuoso, especialmente a concentraciones inferiores o iguales al 0,0001% en peso con respecto al peso de la solución. Estos dos mecanismos pueden existir ambos. El procedimiento según la invención permite desestabilizar la biopelícula perjudicial que se sitúa en el origen de la formación del macrofouling. Al convertir esta biopelícula en inestable, se impide la formación del macrofouling.

[0038] En general, el tratamiento de la superficie de un material con un EPS tal como se define anteriormente no inhibe la adhesión bacteriana en la superficie. El número de bacterias que se adhieren en una superficie que ha sido tratada con un EPS tal como se define anteriormente es del mismo orden de magnitud que el número de bacterias en una superficie no tratada con dicho EPS. Las bacterias se adhieren en la película de ^e P^s formada. Sin embargo, estas bacterias están en forma «resistente», por ejemplo, en forma encapsulada o en esporas, ya que la película de EPS desestabiliza su desarrollo. Además, la biopelícula no se forma. Como la biopelícula no se forma y su presencia es necesaria para la adhesión de los microorganismos y macroorganismos, los ^e P^s tal como se define anteriormente permiten también prevenir la adhesión de manera estable de los microorganismos y macroorganismos.

[0039] Además, la diversidad microbiológica es, en general, más baja en una superficie que ha sido tratada con un EPS tal como se define anteriormente con respecto a una superficie no tratada con dicho EPS. De hecho se ha observado una diferencia de población bacteriana en una superficie que ha sido tratada con un EPS tal como se define anteriormente con respecto a una superficie no tratada con dicho EPS. Parecería, por tanto, que solo algunas bacterias pueden adherirse en la película de EPS que recubre las superficies, pero que las que llegan a adherirse, sin embargo, no se desarrollan ya que, en general, no se observa ninguna proliferación bacteriana ni formación de biopelícula indeseable.

[0040] Los EPS usados en el procedimiento según la invención son, por tanto, ventajosamente no biocidas y no presentan efecto antimicrobiano.

[0041] Además, los EPS usados en el procedimiento según la invención son ventajosamente biodegradables.

[0042] El procedimiento comprende el tratamiento de la superficie de un material en contacto con un medio acuoso o con el aire cuya humedad relativa es superior o igual al 90% con un EPS tal como se define anteriormente. Como «la superficie de un material en contacto» se sobreentiende que puede tratarse de una parte de la superficie del material o de la totalidad de la superficie del material. En general, el tratamiento de la superficie del material con el EPS tal como se define anteriormente comprende la puesta en contacto de esta superficie con este EPS.

[0043] Cuando el material está en contacto con un medio acuoso, la superficie del material es tratada normalmente con el EPS:

- aislando la superficie del material de dicho medio acuoso y después tratándola con el EPS, en general en forma de solución, y después volviendo a poner la superficie en contacto con dicho medio acuoso.

[0044] Según una primera alternativa, se puede extraer el material del medio acuoso con el que está en contacto, tratar su superficie con una solución de EPS y después volver a poner el material en el medio acuoso. De modo ilustrativo, si la superficie es el casco de un barco, se puede poner el barco en dique seco, tratar su superficie con una solución de EPS y después volver a poner el barco en el agua. Si el material es una piscina, se puede vaciar la piscina, tratar sus paredes internas con una solución de EPS (o bien llenar la piscina de una solución de EPS y a continuación vaciarla), y después llenar la piscina de agua.

[0045] Según una segunda alternativa, se puede sustituir el medio acuoso en contacto con el material por una solución de EPS, motivo por el cual la superficie del material es tratada mediante el EPS, y después sustituir la solución de EPS por el medio acuoso. De modo ilustrativo, si la superficie del material es una canalización, se puede detener la circulación del medio acuoso en la canalización, inyectar en la canalización una solución de EPS y después volver a hacer circular el medio acuoso en la canalización.

- introduciendo el EPS en el medio acuoso. Como el medio acuoso está en contacto con la superficie del material, la superficie del material es tratada mediante el EPS. El EPS puede ser introducido en el medio acuoso en forma de solución, en general acuosa, o en forma seca. Introducir el EPS en forma seca en el medio acuoso requiere tener en cuenta el tiempo de solubilización y de rehidratación del EPS. Por tanto, se prefiere una introducción en forma de solución. De modo ilustrativo, si la superficie del material es una canalización en la que circula un medio acuoso, se puede introducir el EPS en el medio acuoso. Si el material es una piscina, se puede introducir el EPS en el agua de la piscina.

[0046] Naturalmente, es posible tratar la superficie del material con el EPS antes de la puesta en contacto de esta superficie con el medio acuoso. De modo ilustrativo, se pueden tratar las paredes de una piscina con el EPS antes de que se llene con agua, o inyectar una solución de EPS en una canalización antes de que haya circulado por ella el medio acuoso.

[0047] En general, cuando la superficie del material está en contacto con el aire cuya humedad relativa es superior o igual al 90%, la superficie es tratada con EPS en forma de solución, normalmente acuosa, preferentemente a una concentración de EPS tal como se define anteriormente.

[0048] El tratamiento de la superficie con el EPS puede efectuarse mediante cualquier procedimiento, por ejemplo, por nebulización, con rodillo, con cepillo, con pincel, sumergiendo el material o una parte del material en una solución que contiene EPS, inyectando la solución de EPS en el medio acuoso en contacto con la superficie...

[0049] Preferentemente, la temperatura de la superficie del material tratada con el EPS y/o la temperatura del medio acuoso en el que se introduce el EPS está comprendida entre 1 y 90°C, normalmente entre 2 y 45°C, especialmente entre 5 y 35°C, en particular entre 10 y 30°C.

[0050] El tratamiento de la superficie del material con el EPS puede ser puntual o repetido. Preferentemente, este tratamiento es repetido, con el fin de regenerar la película de EPS en la superficie del material que se degrada en el curso del tiempo. El EPS es, de hecho, biodegradable.

[0051] Cuando el tratamiento de la superficie del material con el EPS es repetido, la frecuencia entre dos tratamientos puede ser variable en función de la concentración del EPS en solución y/o de los materiales orgánicos y los microorganismos presentes en el medio acuoso o en el aire y/o de la temperatura del medio acuoso. De hecho, en general, cuanto más materiales orgánicos susceptibles de formar la biopelícula indeseable y microorganismos susceptibles de depositarse y de desarrollarse en esta biopelícula comprende el medio, más elevada deberá ser la frecuencia entre dos tratamientos. Asimismo, en general, cuanto más elevada es la temperatura del medio acuoso, más importante es el depósito de bioincrustaciones. Así, normalmente, cuanto más elevada es la temperatura del medio acuoso, más elevada es la frecuencia de los tratamientos.

[0052] El tratamiento a base de EPS permite prevenir el depósito de bioincrustaciones en la superficie, y hacer disminuir la formación de la biopelícula en curso de formación. Por el contrario, los EPS no permiten suprimir las bioincrustaciones (especialmente, la biopelícula) depositadas con anterioridad al tratamiento con EPS. Dicho de otro modo, los EPS no permiten tratar totalmente una superficie de un material ya contaminado con bioincrustaciones.

[0053] Además, el procedimiento según la invención puede comprender la eliminación parcial o total de las bioincrustaciones presentes en la superficie del material por un agente distinto de un EPS.

[0054] Esta eliminación parcial o total puede efectuarse con un agente biocida, por ejemplo, por cloración (normalmente con dicloro o una sal de hipoclorito, como hipoclorito de sodio, por ejemplo, lejía). El tratamiento mediante un agente biocida puede ser puntual o repetido. El agente biocida se usa normalmente en forma de solución, preferentemente acuosa, por ejemplo, a una concentración del 1*10-5% al 5*10-6 en peso, especialmente del 1*10-4 al 1*10-6% en peso, por ejemplo, del orden del 5*10-4% en peso con respecto al peso de solución.

[0055] Esta eliminación parcial o total se efectúa en general antes del tratamiento de la superficie con el EPS o, cuando los tratamientos son repetidos, entre dos tratamientos sucesivos. Por ejemplo, cuando se depositan bioincrustaciones depositadas en la superficie pese al o a los tratamientos de la superficie con el EPS (por ejemplo, porque dos tratamientos sucesivos se han separado demasiado en el tiempo para poder prevenir completamente el depósito de bioincrustaciones), el procedimiento puede comprender una etapa de eliminación parcial o total de las bioincrustaciones presentes en la superficie del material, que se seguirá de un tratamiento de la superficie con el EPS. Un tratamiento combinado por un EPS y por un agente biocida permite disminuir la cantidad de EPS y por tanto disminuir los costes, pero también disminuir las cantidades de agentes biocidas usadas con respecto a un tratamiento únicamente a base de agente biocida.

[0056] En una realización, el procedimiento comprende:

- el tratamiento repetido de la superficie con un EPS con una frecuencia de tratamiento mediante el EPS de una vez por hora a una vez por semana, preferentemente de una vez cada 12 horas a una vez cada tres días, por ejemplo, una vez al día, y

- el tratamiento repetido de la superficie con un agente biocida con una frecuencia de tratamiento mediante el agente biocida de una vez por hora a una vez por semana, preferentemente de una vez al día a una vez cada cinco días, por ejemplo, una vez cada dos días.

[0057] Estas frecuencias están adaptadas para prevenir el depósito de bioincrustaciones en la superficie, incluso con concentraciones de EPS y/o de agente biocida poco elevadas, por ejemplo, con una concentración de EPS del 1x10-6% al 1 * l0 -6% en peso con respecto al peso de la solución, y/o con una concentración de agente biocida del 1x10-5% al 5*10-6% en peso con respecto al peso de solución. La prevención eficaz de depósito de bioincrustaciones con cantidades tan bajas de EPS y de agente biocida es especialmente sorprendente.

[0058] Además, el procedimiento según la invención puede comprender el seguimiento del depósito de bioincrustaciones, y especialmente la formación de la biopelícula, en la superficie del material. Este seguimiento es especialmente útil para determinar la frecuencia de tratamiento de la superficie con el EPS.

[0059] Este seguimiento puede, por ejemplo, hacerse visualmente o por análisis físico y/o químico de la superficie.

[0060] Cuando la superficie es eléctricamente conductora, normalmente una superficie metálica, el seguimiento puede efectuarse siguiendo:

- la evolución de la densidad de corriente de la superficie eléctricamente conductora en el tiempo, y/o

- la evolución en el tiempo del potencial electroquímico de la superficie eléctricamente conductora con respecto a un electrodo de referencia, por ejemplo, un electrodo de calomelanos saturado (ECS).

[0061] De hecho, el depósito de bioincrustaciones en materiales eléctricamente conductores como el acero inoxidable, en particular la formación de la biopelícula, induce variaciones de la densidad de corriente de la superficie eléctricamente conductora en el tiempo y del potencial electroquímico de la superficie eléctricamente conductora. Por ejemplo, en el agua de mar natural, el desarrollo de la biopelícula en una superficie de acero inoxidable:

- hace variar su diferencia de potencial en circuito abierto hacia el ennoblecimiento (pasando de aproximadamente -100 mV a alrededor de 300 mV con respecto a un electrodo de referencia ECS),

- hace aumentar su eficacia catódica (especialmente la reducción catódica del oxígeno disuelto), lo que favorece el inicio y la propagación de la corrosión. Medir la densidad de corriente de la superficie eléctricamente conductora en el tiempo permite cuantificar la eficacia catódica del material eléctricamente conductor.

[0062] El procedimiento puede comprender el seguimiento del depósito de bioincrustaciones, y especialmente la formación de la biopelícula, en la superficie del material y después el tratamiento de la superficie con el EPS tal como se define anteriormente cuando el depósito de bioincrustaciones supera un umbral dado (o un porcentaje de variación dado durante un tiempo dado).

[0063] Por ejemplo, cuando la superficie es eléctricamente conductora, normalmente una superficie metálica, el procedimiento puede comprender:

- el seguimiento del depósito de bioincrustaciones, y especialmente la formación de la biopelícula, siguiendo:

- la evolución de la densidad de corriente de la superficie eléctricamente conductora en el tiempo, y/o

- la evolución en el tiempo del potencial electroquímico de la superficie eléctricamente conductora con respecto a un electrodo de referencia, y después

- el tratamiento de la superficie con el EPS tal como se define anteriormente cuando la densidad de corriente y/o el potencial electroquímico han alcanzado uno de los umbrales dados.

[0064] En el procedimiento según la invención, al menos una parte de una superficie de un material en contacto con un medio acuoso o con el aire cuya humedad relativa es superior o igual al 90% es tratada con un EPS tal como se define anteriormente.

[0065] La superficie es la superficie de un material orgánico o inorgánico cuya naturaleza puede ser variada, por ejemplo, un metal, un polímero o un material de construcción.

[0066] Los metales preferidos son el cobre, el titanio y el acero, especialmente inoxidable, en particular el acero inoxidable 316L o el acero inoxidable 2507. El polímero preferido es el polietileno, especialmente el polietileno de alta densidad (PEHD). El hormigón, el mortero, el vidrio o la madera son materiales de construcción corrientes.

[0067] Al menos una parte de la superficie del material está en contacto con un medio acuoso, o con el aire cuya humedad relativa es superior o igual al 90%, especialmente superior o igual al 95%, preferentemente igual al 100% (aire saturado en agua). La humedad relativa del aire, o grado higrométrico, denotada habitualmente por 9, corresponde a la relación entre la presión parcial del vapor de agua contenido en el aire y la presión de vapor de saturación (o tensión de vapor) a la misma temperatura. Constituye así una medida de la relación entre el contenido de vapor de agua del aire y su capacidad máxima para contenerlo en estas condiciones. Se mide con ayuda de un higrómetro.

[0068] Cuando al menos una parte de la superficie del material está en contacto con un medio acuoso, el material es normalmente un contenedor o una parte de un contenedor de un medio acuoso, por ejemplo, un depósito de agua, una piscina, una canalización de agua dulce o de mar, como las canalizaciones de una terminal de metano o de una central térmica, o bien un material en contacto con agua, por ejemplo, un casco o una hélice de barco, o las partes sumergidas de una infraestructura, por ejemplo, una terminal de metano o una central térmica... El material puede estar entonces parcial o totalmente sumergido en el medio acuoso.

[0069] El medio acuoso puede, por ejemplo, ser agua dulce o agua de mar. El medio acuoso puede estar estancado (por ejemplo, agua estancada) o en movimiento (por ejemplo, agua agitada o el medio marino natural), especialmente en circulación (por ejemplo, agua que circula en una canalización).

[0070] La invención se ilustra por medio de los ejemplos y las figuras que se ofrecen a continuación.

Figura 1: Proporción de oxígeno disuelto en ppm con respecto al tiempo en días en el tanque que comprende agua de mar (control) (ref.), para el EPS F2 (F2), para el EPS F4 (F4) y para el EPS F5 (comparación) (F5) (ejemplo 1). Figura 2: Diferencia de potencial con respecto a un electrodo de calomelanos saturado en mV con respecto al tiempo en días en el tanque que comprende agua de mar (control) (ref.), para el EPS F2 (F2), para el EPS F4 (F4) y para el EPS F5 (comparación) (F5) (ejemplo 1).

Figura 3: Recuento por microscopia de epifluorescencia de las bacterias para cada tanque: control de agua de mar (ref.), EPS F2, F4 o F5 (comparación) y para cada material de hormigón (histogramas grises), PEHD (histogramas negros) o acero inoxidable 316L (histogramas blancos) (ejemplo 1).

Figura 4: Esquema que ilustra el sistema experimental usado para el ejemplo 2.1.

Figura 5: Densidad de corriente (A/m2) medida en el detector de biopelícula en función del tiempo en días para el agua de mar (control) (ref.) o para el EPS F2 en el agua de mar (F2) (ejemplo 2.1).

Figura 6: Potencial (V) medido en el detector de biopelícula en función del tiempo en días para el agua de mar (control) (ref.) o para el EPS F2 en el agua de mar (F2) (ejemplo 2.1).

Figura 7: Diferencia de ascenso de potencial medida en el tubo de acero inoxidable 316L del circuito experimental tratado mediante el EPS F2 y el que no contiene más que agua de mar (control). Los rectángulos negros en el eje de abscisas corresponden a las introducciones del EPS (ejemplo 2.1).

Figura 8: Esquema que ilustra el sistema experimental usado para los ejemplos 2.2 y 3.

Figura 9: Potencial (V) de la muestra de acero inoxidable 316L presente en el depósito de 45 L en función del tiempo en días en el experimento con agua de mar (control) (ref.), en el experimento con la solución al 0,001% de EPS F2 en agua de mar (F2), en el experimento con la solución de 5 ppm de hipoclorito de sodio en el agua de mar (Cl). Los rectángulos negros en el eje de abscisas corresponden a las introducciones del EPS (únicamente para el experimento con la solución de ^e P^s F2) (ejemplo 2.2).

Figura 10: Potencial (V) del tubo de acero inoxidable 316L del módulo C del circuito en función del tiempo en días en el experimento con agua de mar (control) (ref.), en el experimento con la solución al 0,001% de EPS F2 en agua de mar (F2), en el experimento con la solución de 5 ppm de hipoclorito de sodio en el agua de mar (Cl). Los rectángulos negros en el eje de abscisas corresponden a las introducciones del EPS (únicamente para el experimento con la solución de EPS F2) (ejemplo 2.2).

Figura 11: Potencial (V) de la muestra de acero inoxidable 316L presente en el depósito de 45 L en función del tiempo en días en el experimento con agua de mar (control) (ref.) y en el experimento con la solución de EPS F2 en agua de mar / solución de hipoclorito de sodio en agua de mar (F2-Cl). Los rectángulos negros en el eje de abscisas corresponden a las introducciones del EPS y los asteriscos grises a las introducciones de hipoclorito de sodio (ejemplo 3).

Figura 12: Potencial (V) del tubo de acero inoxidable 316L del módulo B del circuito en función del tiempo en días en el experimento con agua de mar (control) (ref.) y en el experimento con la solución de EPS F2 en agua de mar / solución de hipoclorito de sodio en agua de mar (F2-Cl). Los rectángulos negros en el eje de abscisas corresponden a las introducciones del EPS y los asteriscos grises a las introducciones de hipoclorito de sodio (ejemplo 3).

Figura 13: Potencial (V) del tubo de acero inoxidable 316L del módulo C del circuito en función del tiempo en días en el experimento con agua de mar (control) (ref.) y en el experimento con la solución de EPS F2 en agua de mar / solución de hipoclorito de sodio en agua de mar (F2-Cl). Los rectángulos negros en el eje de abscisas corresponden a las introducciones del EPS y los asteriscos grises a las introducciones de hipoclorito de sodio (ejemplo 3).

Figura 14: Potencial (V) de la muestra de acero inoxidable 316L presente en el depósito de 150 L del módulo D en función del tiempo en días en el experimento con agua de mar (control) (ref.) y en el experimento con la solución de EPS F2 en agua de mar / solución de hipoclorito de sodio en agua de mar (F2-Cl). Los rectángulos negros en el eje de abscisas corresponden a las introducciones del EPS y los asteriscos grises a las introducciones de hipoclorito de sodio (ejemplo 3).

[0071] En los ejemplos mostrados a continuación se han usado los EPS F2 y F4 obtenidos a partir de las bacterias depositadas respectivamente con los números de orden CNCM I-5036 y CNCM I-5037 por un procedimiento de fermentación tal como se define anteriormente.

[0072] A modo comparativo, se ha usado también un EPS, denominado EPS F5, producido por fermentación (según el protocolo descrito anteriormente) de una bacteria del género Cobetia Marina depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) el 23 de diciembre de 2015 con el número de orden CNCM I-5038 con la referencia de identificación ENGIE 2-68 PB por la empresa Polymaris Biotechnology, Aéropóle Centre, 29600 Morlaix, Francia. Este EPS F5 es un polímero:

- que comprende del 10 al 20% en masa de sulfato con respecto a la masa en seco total del EPS,

- que comprende unidades de ramnosa, ácido galacturónico, galactosa, glucosa y N-acetil glucosamina, y

- de masa molecular pico medida por cromatografía líquida de exclusión estérica de más de 1.000.000 Da.

[0073] Las superficies sometidas a ensayo eran de PEHD (PE 80, SIMONA), acero inoxidable 316L y hormigón.

[0074] Se llevó un seguimiento del potencial electroquímico del acero inoxidable 316L con respecto a electrodos Ag/AgCl calibrados antes de los ensayos con respecto a un electrodo de referencia de calomelanos saturado. La medida en modo continuo del potencial estaba asegurada por un sistema de adquisición EPC8 de NKE.

[0075] Para los tres tipos de superficie se evaluó la colonización bacteriana mediante observaciones microscópicas usando técnicas de epifluorescencia.

Ejemplo 1: Prevención del depósito de bioincrustaciones en agua de mar no circulante

[0076] Se disolvió cada uno de los tres EPS en un tanque que contenía 15 litros de agua de mar natural a una concentración del 0,05% en masa con agitación (200 revoluciones por minuto). El agua de mar de los tanques no se renovó durante el experimento, se mantuvo la agitación. El agua de mar provenía de la rada de Brest y presenta las características resumidas en la tabla 1 siguiente:

Tabla 1: Características del a ua de mar de la rada de Brest usada en los ensa os

[0077] Se usaron 4 tanques: 3 tanques que contenían cada uno un EPS en el agua de mar y 1 tanque de control que contenía únicamente agua de mar. En cada uno de los tanques se expusieron 9 muestras: 3 muestras de acero inoxidable, 3 muestras de hormigón y 3 muestras de PEHD. La dimensión de cada muestra fue de aproximadamente 5 cm x 5 cm.

[0078] Para evitar que las muestras de PEHD flotaran en la superficie, se engancharon en un soporte mediante un cordel.

[0079] Las muestras de acero inoxidable monitorizadas de modo continuo se suspendieron mediante un cable de titanio para asegurar un contacto eléctrico para las medidas de potencial electroquímico.

• Seguimiento de pH, temperaturas y contenidos de oxígeno disuelto en el agua de los tanques

[0080] Se midió todos los días el pH, la temperatura y el contenido de oxígeno disuelto (sumergiendo de modo continuo una sonda de oxígeno) en el agua de los tanques.

[0081] La temperatura en los tanques estuvo comprendida entre 16 y 18°C durante los 14 días del ensayo.

[0082] Los pH de los tanques que contenían los EPS evolucionan globalmente entre 7,25 y 8,00, como el agua de mar. Se observó una ligera acidificación del medio que contenía el EPS F5 en torno al pH 7,30 al final del ensayo a 14 días.

[0083] La figura 1 presenta la evolución del oxígeno disuelto en cada uno de los medios sometidos a ensayo.

[0084] A partir de los resultados de la figura 1, para el agua de mar y para los medios F2 y F4, el contenido de oxígeno disuelto se mantiene constante (cerca de la saturación) durante todo el tiempo del ensayo. En el medio F5, se aprecia una disminución del contenido de oxígeno disuelto iniciada a partir del 6° día para alcanzar 3,5 ppm después de 14 días. Esta disminución podría estar relacionada con la ligera acidificación del medio observada.

• Potencial electroquímico del acero inoxidable

[0085] El experimento duró 7 días para el conjunto de los materiales antes de la toma de muestras.

[0086] Sin embargo, una de las tres muestras de acero inoxidable se dejó más tiempo y se midió su potencial de corrosión durante 14 días con respecto a los electrodos Ag/AgCl calibrados antes del ensayo con respecto a un electrodo de referencia de calomelanos saturado (ECS).

[0087] La presencia de una biopelícula sobre una superficie metálica tal como el acero inoxidable 316L tiene como consecuencia una evolución del potencial de corrosión según una cinética variable y en función de las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas del medio. Esta evolución induce un riesgo de corrosión, especialmente una corrosión por picadura y ruptura de la película pasiva en el acero inoxidable 316L. La presencia de esta biopelícula es la primera etapa del depósito de las bioincrustaciones microscópicas y macroscópicas.

[0088] En general, el potencial del acero inoxidable en agua de mar renovada se mide entre -100 y -200 mV/ECS en la inmersión. Normalmente es estable durante 3 a 15 días según la temperatura o la estación, y después aumenta hasta valores cercanos a 300 mV/ECS. De hecho, la formación de una biopelícula no deseable en la superficie provoca un aumento del potencial de corrosión. El riesgo de inicio y de propagación de la corrosión localizada en el acero inoxidable se hace así más importante.

[0089] La figura 2 presenta la evolución del potencial electroquímico del acero inoxidable en los diferentes medios durante todo el tiempo del ensayo.

[0090] Según la figura 2, en agua de mar, el aumento característico del potencial de -100 a 250 mV debido a la formación de la biopelícula no deseable tuvo lugar después de 6 días.

[0091] En los medios en los que se introdujeron los EPS, solo las muestras de acero inoxidable expuestas en el medio F5 presentaron un ascenso del potencial de corrosión de -50 a 150 mV después de 8 días. Las bruscas variaciones de potencial observadas en la curva F5 podrían estar relacionadas con el inicio de la corrosión y después con una repasivación de la superficie.

[0092] Para las muestras expuestas en los medios F2 y F4, el potencial del acero inoxidable permanece estable durante los 14 días de ensayos entre -100 y -50 mV/ECS.

[0093] La estabilidad de los potenciales observada para los EPS F2 y F4 está relacionada con la presencia de EPS en el tanque en el que se sumergen las diferentes superficies.

• Evaluación visual de las superficies

[0094] Después de la inmersión durante 7 días se realizó una evaluación visual de las muestras.

[0095] Para las muestras de control expuestas en agua de mar (control) no es observable ningún depósito macroscópico, ya sea acero inoxidable, hormigón o PEHD.

[0096] En lo que se refiere a las muestras sumergidas en los tanques que contenían F2 y F4, es observable una película muy fina, que es probablemente una película de EPS, en todas las superficies y en particular en el acero inoxidable y el PEHD. Estas superficies presentan rugosidades bastante bajas en comparación con el hormigón, lo que podría permitir un enganche mayor del EPS.

[0097] Para las muestras expuestas en el tanque que contenía F5, una cantidad importante de aglomerados viscosos cubre una gran parte de la superficie de las muestras, las superficies de los tanques y los electrodos de medida. Se trata muy probablemente de aglomerados de EPS.

• análisis microbiológico de las superficies por microscopia de epifluorescencia

[0098] Las muestras tomadas después de 7 días se someten a un análisis microbiológico de sus superficies por microscopia de epifluorescencia. Esta técnica permite una medida del entorno microbiano por adición de fluorocromo diaminidofenilindol (DAPI). El fluorocromo marca el ADN de los microorganismos que emiten fluorescencia entonces en azul. Después de las observaciones de las muestras al microscopio, se contaron las células presentes en la superficie de la muestra y se realizó un análisis de las bacterias a partir de su forma y de su estado general.

[0099] La figura 3 representa los resultados del recuento de las bacterias para cada tanque de control de agua de mar (ref.), EPS F2, F4 o F5.

[0100] Los EPS puestos en solución en los tanques usados en el curso de estos ensayos no son bactericidas. De hecho, en ningún caso se produce la disminución del número de bacterias en la superficie de los diferentes materiales.

[0101] Además, para un mismo tanque, el número de bacterias es poco variable en función de la naturaleza de la superficie. La naturaleza de la superficie influye poco o nada en la actividad de los EPS.

[0102] La colonización bacteriana en las superficies de los diferentes materiales sumergidos en los tanques que comprenden los EPS F2 y F4 es idéntica a la del control de agua de mar.

[0103] En el tanque que contenía el EPS F5, la colonización de las superficies es idéntica a la del control de «agua de mar» para los materiales de hormigón y PEHD. Sin embargo, la colonización es más intensa en la superficie de acero inoxidable 316L: el acero inoxidable 316L tratado con el EPS F5 es colonizado aproximadamente 2,5 veces más por las bacterias que el acero inoxidable 316L sumergido en el tanque de control de agua de mar.

[0104] También se estudió la morfología de las bacterias.

[0105] En el conjunto, los poblamientos bacterianos están medianamente diversificados: se observan algunas formas filamentosas; dan fe en general de un grado de jerarquización más avanzado de la biopelícula.

[0106] La colonización en las superficies de acero inoxidable y de hormigón tratadas con el EPS F2 o F4 es dispersa (con algunas formas filamentosas en redes para las superficies de acero inoxidable y de hormigón en contacto con el EPS F2). En las superficies de plástico tratadas con el EPS F2 o F4, las bacterias aparecen más apagadas y se evidencian algunas grandes bacterias: podría tratarse de formas capsuladas.

Ejemplo 2: Prevención del depósito de bioincrustaciones en agua de mar circulante

Ejemplo 2.1.: Sistema experimental que comprende un depósito y un circuito

[0107] Se sometieron a ensayo 4 sistemas experimentales: un control que comprendía únicamente del agua de mar, un sistema experimental que comprendía el EPS F2 en agua de mar, un sistema experimental que comprendía el EPS F4 en agua de mar y un sistema experimental que comprendía el EPS F5 en agua de mar, en los que cada EPS está a una concentración del 0,01% (p/v).

[0108] Un sistema experimental comprendía:

- un depósito de 150 L provisto de una bomba que permitía la agitación y en el que se sumergía un electrodo de referencia y un detector de biopelícula, y

- un circuito hecho de un tubo de 40 mm de diámetro en PVC interrumpido por un tubo de acero inoxidable 316L, comprendiendo la superficie del tubo probetas que contenían cada una un material envuelto en una resina epoxídica bicomponente (MécapreX IP) y pulido. Los diferentes materiales de las probetas eran: acero inoxidable 316L, acero inoxidable 2507, PEHD (dos probetas) y hormigón (dos probetas). El circuito estaba provisto de una bomba y de una válvula.

[0109] El tubo de acero inoxidable 316L, y cada probeta de acero inoxidable 316L estaban conectados con un potenciómetro para medir la diferencia de potencial con respecto al electrodo de referencia.

[0110] El sistema experimental usado se recoge esquemáticamente en la figura 4.

[0111] Cada probeta comprende el material sometido a ensayo (acero inoxidable, PEHD u hormigón) envuelto en una resina epoxídica de manera que la superficie del material sometido a ensayo esté al mismo nivel que el resto de la superficie interna del tubo de PVC, es decir, que la superficie del material sometido a ensayo no sobresalga o no retroceda con respecto al resto de la superficie interna del tubo de PVC.

[0112] El detector de biopelícula era un detector SCPC® que comprendía un ánodo de aleación de zinc galvánico (de BAC Corrosion Control A/S), un cátodo de superaleación dúplex UNS S32750 y un electrodo de seudorreferencia de zinc (ASTM B418 tipo 1). Este detector de biopelícula permite medir el potencial relacionado con la formación de biopelícula y la corriente de reducción que permite cuantificar la actividad de la biopelícula.

[0113] La velocidad de circulación en el circuito era de 0,8 m/s.

[0114] El agua de mar se renovaba de manera continua a razón de 1 L/min.

[0115] En cada sistema experimental, se midieron las diferencias de potencial siguientes:

- la diferencia de potencial entre la probeta de acero inoxidable 316L con respecto al electrodo de referencia sumergido en el depósito,

- la diferencia de potencial entre la probeta de acero inoxidable 2507 con respecto al electrodo de referencia sumergido en el depósito,

- la diferencia de potencial entre el tubo de acero inoxidable del circuito con respecto al electrodo de referencia sumergido en el depósito,

- la diferencia de potencial medida por el detector de biopelícula que comprende su propio electrodo de referencia ECS.

[0116] La comparación de las diferencias de potencial medidas entre las probetas de acero inoxidable (situadas en el circuito) o el tubo de acero inoxidable del circuito con respecto al electrodo de referencia sumergido en el depósito, por una parte, y la diferencia de potencial medida por el detector de biopelícula (situado en el depósito) permite comparar la formación de biopelícula en el circuito en el que el agua de mar circulaba a una velocidad de 0,8 m/s y en el depósito.

[0117] En el depósito que contenía agua de mar (control) se observó:

- una evolución de la diferencia de potencial medida por el detector de biopelícula en el depósito de -0,7 a 0 V el 3° día, y después una estabilización de la diferencia de potencial hacia -0,25 V, y

- una evolución de la diferencia de potencial medida entre el tubo de acero inoxidable del circuito con respecto al electrodo de referencia sumergido en el depósito el 4° día, de manera que la diferencia de potencial evoluciona de -0,25 V al principio del experimento hasta 0,25 V al cabo de 17 días.

[0118] La formación de la biopelícula no deseable es así más rápida en el depósito que en el circuito, probablemente por motivos hidrodinámicos (agitación homogénea en el depósito y circulación a 0,8 m/s en el circuito).

[0119] En los tres depósitos que comprendían el EPS F2, F4 o F5 en agua de mar se aplicó el protocolo experimental siguiente.

[0120] Cada EPS se introdujo en forma de polvo en una concentración del 0,01% en masa en las frecuencias siguientes:

- a t = 0 (inicio del experimento), introducción del EPS, después agitación durante 12 h sin circulación de agua en el circuito (para permitir la rehidratación del EPS), y después apertura del circuito,

- a t = 3,5 días, introducción del EPS, y después agitación durante 12 h sin circulación de agua en el circuito, y después apertura del circuito,

- a t = 7 días, introducción del EPS, y después agitación durante 12 h sin circulación de agua en el circuito, y después apertura del circuito, y después

- a t = 10,5 días, introducción del EPS, y después agitación durante 12 h sin circulación de agua en el circuito, y después apertura del circuito.

[0121] Las figuras 5 y 6 representan respectivamente la densidad de corriente y el potencial medidos en el detector de biopelícula situado en el depósito de los tanques que comprenden agua de mar (control) (ref.) o el EPS F2 en el agua de mar.

[0122] Las figuras 5 y 6 muestran que la inyección del EPS F2 permitió ralentizar la formación de la biopelícula no deseable al 3° día. Por el contrario, se observa que una vez que se forma la biopelícula no deseable, la introducción del EPS F2 ya no tiene efecto en ella. El EPS F2 no permite destruir una biopelícula ya formada.

[0123] La figura 7 representa la diferencia de potencial medida entre el tubo de acero inoxidable 316L del circuito con respecto al electrodo de referencia ECS sumergido en el depósito para los tanques que comprenden agua de mar (control) (ref.) o el EPS F2 en el agua de mar.

[0124] La figura 7 muestra que la introducción del EPS F2 antes del ascenso de potencial (y, por tanto, antes de la formación de la biopelícula no deseable) permitió impedir la formación de biopelícula que condujera al ennoblecimiento (es decir, la obtención de un potencial superior a 200 mV/ECS característico de la formación de una biopelícula en el agua de mar natural).

[0125] Al final de los experimentos se recuperaron y analizaron las probetas.

[0126] El número de bacterias que se adhieren en las probetas de los tanques que comprenden el EPS F2 o F4 es del mismo orden de magnitud que el número de bacterias en las probetas del tanque de control de agua de mar. Las superficies menos colonizadas son las tratadas con el EPS F2, y las superficies más colonizadas son las tratadas con el EPS F4. No obstante, hay más bacterias en el agua de mar de los tanques que comprenden F2 y F4 que en el agua de mar en solitario. Los EPS limitan la formación de la biopelícula de las bacterias, pero como no son biocidas, no limitan la multiplicación de las bacterias. Así, en las superficies de las probetas de los experimentos con EPS F2 o F4, no hay significativamente más bacterias que en las superficies de las probetas en contacto con el agua de mar sin EPS.

[0127] La diversidad microbiana disminuye en las probetas de los tanques que fueron tratados con los EPS F2 o F4 con respecto a las probetas del tanque de control de agua de mar. Se observó una diferencia de población bacteriana en las probetas de los tanques que fueron tratadas con los EPS F2 o F4 con respecto a las probetas del tanque de control de agua de mar.

Ejemplo 2.2.: Sistema experimental que comprende un depósito y un circuito

[0128] Se realizaron experimentos en otro sistema experimental de estructura más cercana a la estación de refrigeración de una terminal de metano.

[0129] Este sistema experimental, representado esquemáticamente en la figura 8, comprendía:

- un depósito de 150 L (módulo A en la figura 8) provisto de una bomba que permitía la agitación y en el que se sumergieron un electrodo de referencia ECS y un detector de biopelícula, de manera que este depósito servía para renovar el agua de mar,

- un depósito de 45 L, situado entre el depósito de 150 L y el circuito, y que comprendía muestras de acero inoxidable 316L, de acero inoxidable 2507, de PEHD, de hormigón y un electrodo de referencia ECS, siendo este depósito aquel en el que se introducen las soluciones de EPS y de hipoclorito de sodio,

- un circuito provisto de una bomba y de una válvula, con el circuito formado por un tubo de 40 mm de diámetro en PVC interrumpido por:

- un primer tubo de acero inoxidable 316L (módulo B en la figura 8), de manera que la superficie del tubo comprendía probetas que contenían, cada una, un material envuelto en una resina epoxídica bicomponente (MécapreX ⁱP) y pulido. Los diferentes materiales de las probetas eran: acero inoxidable 316L, acero inoxidable 2507, PEHD (tres probetas), hormigón (tres probetas) y resina SVR de vidrio estratificado (tres probetas), - un segundo tubo de acero inoxidable 316L (módulo C en la figura 8), cuya superficie estaba equipada como la del primer tubo,

- un depósito de 150 L (módulo D en la figura 8) situado al final del circuito que comprendía muestras de acero inoxidable 316L, de acero inoxidable 2507 y de hormigón y un electrodo de referencia ECS.

- el volumen total de los circuitos experimentales es de 150 litros.

[0130] Los depósitos de 150 L simulan el mar, el de 45 L la zona de la estación en la que se inyecta el EPS, y el circuito simula las canalizaciones de la estación de refrigeración. La longitud total del circuito es de 30 metros. Se inyecta el EPS en el módulo B. Por tanto, el módulo A no está nunca en contacto con el EPS. Se llevó un seguimiento de la formación de biopelícula en los diferentes módulos A, B, C y D. La velocidad de circulación en el circuito era de 0,4 m/s.

[0131] Se realizaron tres experimentos en paralelo y simultáneamente:

- un experimento en el que se inyectó el 0,001% en masa de EPS F2 con respecto a la masa total de agua de mar del sistema experimental (es decir, 150 kg) (con el EPS inyectado en forma de solución en el agua de mar) durante 12 horas en el depósito de 45 L (ejemplo según la invención), realizándose una inyección cada dos días (es decir, una repetición de [12 h de inyección de solución de EPS, y después de 36 h sin inyección]),

- un experimento en el que no se inyectó nada (circulación de agua de mar) (control),

- un experimento en el que se inyectó una solución de 5 ppm de hipoclorito de sodio en el agua de mar en modo continuo en el depósito de 45 L (comparación), realizándose cada uno de estos experimentos con un sistema experimental tal como se define anteriormente.

[0132] La figura 9 muestra que la formación de la biopelícula en el tanque de 45 L se desfasa un día cuando se inyecta el EPS con respecto al control de agua de mar. Como se esperaba, el potencial electroquímico permanece constante cuando se inyecta hipoclorito de sodio en modo continuo.

[0133] En el módulo C se constató una evolución del potencial electroquímico que indicaba una formación de biopelícula a partir de 4,5 días para el control de agua de mar. Por el contrario, el potencial electroquímico permaneció estable cuando se inyectó EPS o hipoclorito de sodio (Figura 10)

Ejemplo 3: Prevención del depósito de bioincrustaciones en agua de mar circulante por una combinación de EPS / cloración de choque

[0134] Se realizaron experimentos asociando el tratamiento mediante una solución de EPS con un tratamiento con hipoclorito de sodio (cloración de choque). El objetivo es especialmente disminuir los costes reduciendo aún más la concentración de EPS, a la vez que se mantienen cantidades de hipoclorito de sodio introducidas mínimas con respecto a las cantidades usadas habitualmente para impedir la formación de biopelícula en una estación de refrigeración de una terminal de metano.

[0135] Se usó el sistema experimental descrito en el ejemplo 2.2. anterior. La velocidad de circulación en el circuito era de 30 L/min.

[0136] Se usaron concentraciones de 50 pg/L de EPS F2 en el agua de mar. Estas concentraciones son muy bajas. A estas concentraciones se supone que el EPS interviene sobre los receptores de los microorganismos presentes en el agua tratada (tratamiento del agua y de los microorganismos que contiene). Parece poco probable que pueda formarse una película de EPS en las superficies para concentraciones tan bajas.

[0137] Se realizaron dos experimentos en paralelo y simultáneamente:

- un experimento (ejemplo según la invención) en el que:

- se inyectaron 5o pg/L de EPS F2 con respecto al volumen de agua de mar circulante en el sistema experimental (es decir, 30 L/min) (en forma de solución en agua de mar) en 1 hora en el depósito de 45 L, realizándose una inyección cada dos días (es decir, una repetición de [1 h de inyección de solución de EPS, y después de 23 h sin inyección]),

- se inyectó una solución a 5 ppm en hipoclorito de sodio en agua de mar en 1 hora en el depósito de 45 L, realizándose una inyección cada dos o tres días (es decir, una repetición de [1 h de inyección de solución de hipoclorito de sodio, y después de 47 h o 71 h sin inyección]),

- un experimento en el que se inyectó agua de mar en modo continuo en el depósito de 45 L (control).

[0138] De modo comparativo, la cantidad de hipoclorito de sodio usada en este experimento según la invención es muy inferior a la cantidad introducida habitualmente en las aguas que circulan en las canalizaciones en una estación de refrigeración de una terminal de metano para impedir la formación de biopelícula (habitualmente 2 ppm de hipoclorito de sodio inyectados en modo continuo).

[0139] Las figuras 11 a 14 muestran que los potenciales electroquímicos no varían en el depósito de 45 L y en los módulos B, C y D del sistema experimental en el que se usó la asociación EPS/de hipoclorito de sodio, lo que demuestra que no se forma la biopelícula. Como comparación, el potencial electroquímico en el depósito de 45 L y en los módulos B, C y D del sistema experimental de control de agua de mar aumenta al cabo de 5 días.

Ejemplo 4: Análisis ecotoxicológicos del EPS F2

[0140] Se determinó la inhibición de la movilidad de Daphnia magna por el EPS F2 según las directivas OCDE 202 del 23 de noviembre de 2004, ensayo límite a 100 mg/l, en condiciones estáticas. Se verificó el cumplimiento de los criterios de validez como se indica en la tabla 1. Los resultados se ofrecen en la tabla 2.

Tabla 1: Verificación del cum limiento de los criterios de validez.

Tabla 2: % de Dafnias inmovilizadas a 24 h o a 48 h en el agua de dilución y en una muestra que comprende 100 m /l de EPS F2

[0141] Se concluyó que las concentraciones que permiten inmovilizar el 50% de las Dafnias después de 24 h (EC50-24 h) y 48 h (EC50-48 h) son superiores a la concentración de ensayo, en concreto 100 mg/l.

[0142] Además, se determinaron los efectos del EPS F2 en el crecimiento del alga verde unicelular Pseudokirchneriella subcapitata según la directiva OCDE 201 de marzo de 2006, revisada el 28 de julio de 2011, ensayo límite a 100 mg/l.

[0143] Se verificó el cumplimiento de los criterios de validez como se indica en la tabla 3.

Tabla 3: Verificación del cum limiento de los criterios de validez.

[0144] Las toxicidades estimadas son:

para la tasa de crecimiento específica media: ErC50 (0-72 h) > 100 mg

para el rendimiento: EyC50 (0-72 h) > 100 mg.

[0145] Además, se determinaron los efectos del EPS F2 en el pez Danio rerio según la directiva OCDE 203 del 17 de julio de 1992, ensayo límite a 100 mg/l, en condiciones estáticas. Se evaluó la concentración de EPS F2 que mata al 50% de los peces después de 24, 48, 72 y 96 h para una concentración de ensayo de 100 mg/l. Estas concentraciones se definen como concentraciones letales LC50-24h, LC50-48h, LC50-72h y LC50-96h.

[0146] Se verificó el cumplimiento de los criterios de validez como se indica en la tabla 4.

Tabla 4: Verificación del cum limiento de los criterios de validez.

[0147] Los resultados de la prueba se ofrecen en las tablas 5 y 6.

T l : M r li l n l nr l n n m r m r n 1

Tabla 6: concentraciones letales LC⁵⁰-24h LC⁵⁰-48h LC⁵⁰-72h LC⁵⁰-96h

[0148] De ello se concluye que la concentración letal a 96 h es superior a la concentración de ensayo de 100,0 mg/l.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de prevención del depósito de bioincrustaciones en una superficie de un material en contacto con un medio acuoso o con el aire cuya humedad relativa es superior o igual al 90%, que comprende el tratamiento de la superficie con un exopolisacárido:

- que tiene una masa molecular pico medida por cromatografía líquida de exclusión estérica superior a 1.000.000 Da,

- que comprende menos del 5% en masa, preferentemente menos del 1% en masa, de sulfato con respecto a la masa en seco del exopolisacárido, y

- obtenido por fermentación de una bacteria del género Vibrio parahaemolyticus.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la bacteria del género Vibrio parahaemolyticus se extrae de un medio marino no atípico, en el que un medio marino no atípico es un medio en el que:

- la temperatura está comprendida entre 5 y 40°C, y/o

- la presión está comprendida entre 0,1 y 5 bares, y/o

- el pH está comprendido entre 3 y 10, y/o

- la salinidad está comprendida entre 10 y 75 g/l, y/o

- la presión parcial de oxígeno disuelto es superior o igual al 10%.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el exopolisacárido comprende unidades de N-acetil glucosamina, y preferentemente comprende:

- unidades de N-acetil glucosamina, galactosa y glucosa,

- o unidades de N-acetil glucosamina y ácido galacturónico.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el exopolisacárido se obtiene por fermentación de una bacteria elegida entre dos bacterias depositadas en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos:

- el 23 de diciembre de 2015 con el número de orden CNCM I-5036 con la referencia de identificación ENGIE 1-5 PB, o

- el 23 de diciembre de 2015 con el número de orden CNCM I-5037 con la referencia de identificación ENGIE 1-12 PB.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el exopolisacárido está en forma de solución, preferentemente acuosa, a una concentración del 10'7% al 0,02% en peso con respecto al peso de la solución.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tratamiento de la superficie con el exopolisacárido es puntual o repetido.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la eliminación parcial o total de las bioincrustaciones presentes en la superficie del material, especialmente por un agente biocida, por ejemplo, por cloración.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, que comprende:

- el tratamiento repetido de la superficie con el exopolisacárido con una frecuencia de tratamiento mediante el exopolisacárido de una vez por hora a una vez por semana, preferentemente de una vez cada 12 horas a una vez cada tres días, por ejemplo, una vez al día, y

- el tratamiento repetido de la superficie con un agente biocida con una frecuencia de tratamiento mediante el agente biocida de una vez por hora a una vez por semana, preferentemente de una vez al día a una vez cada cinco días, por ejemplo, una vez cada dos días.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que:

- el exopolisacárido está en forma de solución, preferentemente acuosa, a una concentración del 1 * 10'6% al 1 * 10'3% en peso con respecto al peso de la solución, y/o

- el agente biocida está en forma de solución, preferentemente acuosa, a una concentración del 1 * 10'5% al 5 * 10'3% en peso con respecto al peso de la solución.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el seguimiento del depósito de bioincrustaciones en la superficie del material.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la superficie es eléctricamente conductora y el seguimiento del depósito de bioincrustaciones se realiza siguiendo:

- la evolución de la densidad de corriente de la superficie eléctricamente conductora en el tiempo, y/o

- la evolución en el tiempo del potencial electroquímico de la superficie eléctricamente conductora con respecto a un electrodo de referencia.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material es el material de una canalización, de una terminal de metano o de una central térmica.