ES2932995A1 - Sistema de detección de parásitos oculares - Google Patents
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Abstract
Sistema de detección de parásitos oculares. La invención permite detectar parásitos tales como Pseudomonas y Staphylococcus, así como todas las especies pertenecientes al género de Acanthamoeba, de manera que consiste en un soporte de control sobre el que se establece una solución coloidal de nanopartículas de oro monodispersas. Esta solución presenta una coloración que cambia al entrar en contacto con el ARN del parásito, de manera que el sistema es implantable en diferentes tipos de soporte de forma sencilla y económica, como pueden ser estuches porta-lentes, tiras desechables de aplicación directa sobre la superficie ocular, etc.
Description
DESCRIPCIÓN
Sistema de detección de parásitos oculares
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención consiste en el desarrollo de un sistema de detección precoz de Acanthamoeba spp. y otros parásitos oculares basándose en un cambio colorimétrico mediante el uso de nanopartículas de oro.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las infecciones oculares pueden estar causadas por una amplia variedad de microorganismos: hongos, bacterias, virus o parásitos que pueden provocar casos de conjuntivitis, endoftalmitis, uveítis, queratitis.
Las infecciones pueden ocurrir por microorganismos exógenos cuando el ojo está dañado, lo que permite su entrada en el ojo, o microorganismos presentes habitualmente pueden ser el origen de infecciones oculares, especialmente si se alteran los sistemas defensivos por la presencia de lentes de contacto, operaciones quirúrgicas, u otras técnicas invasivas.
La queratitis microbiana es una de las patologías más peligrosas en usuarios de lentes de contacto. Las bacterias del género Pseudomonas spp. concretamente Pseudomonas aeruginosa son las principales causantes seguidas por Staphylococcus spp. Las infecciones causadas por Acanthamoeba spp y por hongos representan una menor proporción, pero son más graves. Los hongos son gérmenes oportunistas que pueden afectar a la córnea provocando queratitis micóticas. Son producidas fundamentalmente por hongos filamentosos (Fusarium solani y Aspergillus) y levaduras Candida albicans. Su presencia aumenta en caso de lentes de contacto ya que se adhieren con facilidad.
Las amebas de vida libre pertenecientes al género Acanthamoeba son organismos unicelulares, concretamente protozoos cuyo ciclo biológico presenta dos estadios: el trofozoíto, que es la fase activa en la cual la ameba puede replicarse, y el quiste, que es la fase latente que el microorganismo adquiere cuando las condiciones ambientales no son
favorables. Estas amebas pueden vivir en múltiples ambientes: el suelo, polvo, aire y agua.
Además, en las condiciones apropiadas, puede comportarse como parásito en distintos hospedadores. Existen otros parásitos oculares como Toxoplasma gondii, Demodex sp entre otros, pero la Acanthamoeba spp es el único relacionado con el uso de lentes de contacto y el que tiene mayor incidencia en nuestro país.
En el ser humano, Acanthamoeba puede producir diversas patologías. A nivel ocular y en relación con la presente invención, es responsable de la queratitis amebiana (QA), patología que afecta a la superficie corneal. Las especies más comunes que pueden causar esta patología son la Acanthamoeba castellani y la Acanthamoeba polyphaga.
La queratitis por Acanthamoeba cursa con dolor, fotofobia, defecto epitelial, edema y si no se trata de manera adecuada, puede provocar la pérdida completa de la visión.
Existen diferentes factores considerados de riesgo para el desarrollo de la queratitis, entre los que se encuentran traumas, daños de la superficie ocular y el uso de lentes de contacto (LC). Hay numerosos estudios que demuestran una relación entre el uso de lentes de contacto y el desarrollo de QA, llegando a ser considerado como su principal factor de riesgo. Su uso durante el baño, las malas prácticas de higiene, así como su limpieza con agua de grifo incrementan el riesgo de infección.
La incidencia de esta patología es difícil de estimar con precisión debido a variaciones regionales. Aproximadamente un 5% de las queratitis asociadas al uso de lentes de contacto son por Acanthamoeba.
P. aeruginosa es una bacteria gramnegativa versátil que se encuentra en una amplia gama de ambientes, pero también actúa como un patógeno oportunista, causando numerosos tipos de infección. Es responsable de la mayor parte de queratitis bacterianas especialmente en usuario de lentes de contacto.
La sintomatología asociada cursa con dolor agudo, enrojecimiento y fotofobia. Se forma una úlcera corneal con secreción mucopurulenta en la superficie que puede progresar hasta la perforación corneal. P. aeruginosa es de especial virulencia y de evolución rápida, pudiendo producir la pérdida del globo ocular. Esta bacteria se adhiere a las lentes de contacto, y es
resistente a su limpieza con soluciones de mantenimiento. Las bacterias son responsables de la mayoría de los casos de queratitis microbiana, entre el 70% y 90% según diferentes estudios.
En cuanto al diagnóstico de las infecciones causadas por los diferentes patógenos, es importante que sea temprano, siendo un factor clave para que la infección pueda ser tratada a tiempo y evitar así un peor pronóstico. Es importante hacer un buen diagnóstico diferencial entre queratitis herpética, fúngica, parasitaria o bacteriana.
El diagnóstico in vivo se puede realizar mediante el análisis de la córnea con microscopía confocal. Es una técnica no invasiva, de alta sensibilidad. En el caso de las queratitis por Acanthamoeba sólo detecta de manera fiable los quistes y no puede ser usada para hacer un diagnóstico definitivo. Además, para su realización se necesita un equipo de altas prestaciones y personal cualificado por lo que no siempre es accesible.
Para el diagnóstico in vitro, existen varios métodos. Por un lado, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que tiene alta sensibilidad y es rápida. Sin embargo, especialmente en el caso de usuarios de LC con queratitis por Acanthamoeba el resultado puede ser positivo aun en ausencia de patógeno.
Por otro lado, se puede obtener una muestra mediante raspado corneal o biopsia para la realización de cultivos microbiológicos en placa. Esta técnica es considerada tradicionalmente como la prueba de referencia para la detección de estos patógenos, sin embargo, es un proceso que puede llevar hasta 3 semanas.
La presencia de estos patógenos también puede verificarse mediante el análisis histopatológico de los raspados de córnea que pueden ser teñidos usando diferentes tinciones. La sensibilidad de este método es menor que los anteriores.
Actualmente, la complejidad en el diagnóstico de los diferentes tipos de queratitis hace que sea un proceso lento que dificulta la resolución de la queratitis.
En cuanto a los tratamientos actuales, los antibióticos tópicos siguen siendo el tratamiento de primera línea para la queratitis bacteriana. Las infecciones provocadas por P.aeruginosa deben ser tratadas con una terapia combinada de fármacos porque la bacteria crea
resistencia con rapidez. En algunos casos también se ha visto mejora con el uso de corticosteroides, aunque sigue habiendo controversia.
El tratamiento de las queratitis por hongos a menudo tiene peores resultados que las queratitis bacterianas y hay poca evidencia para guiar el tratamiento. Como tratamiento tópico se usan antifúngicos. Algunos de ellos, sin embargo, tienen poca penetración ocular. Nuevas generaciones de antifúngicos parecen tener mejores resultados de acción como el Voriconazole, que puede ser administrado también de manera oral.
Las opciones de tratamiento actuales para la queratitis por Acanthamoeba utilizan una amplia variedad de activos. El tratamiento suele empezar con el uso de biguadinas generalmente combinadas con diamidina. Actualmente es la única terapia que ha mostrado efectividad contra los quistes de Ameba in vitro. Como fármacos se utilizan antibióticos antiamebianos, y en ocasiones se puede recomendar el uso de corticoides tópicos para disminuir inflamaciones severas. En los casos en los que la infección penetra de forma profunda en córnea la única opción efectiva es la queratoplastia.
Algunos tratamientos quirúrgicos como la crioterapia corneal, el trasplante de membrana amniótica, parecen ser efectivos en AK, restaurando la integridad de la superficie ocular.
Otros tratamientos como el crosslinking parecen tener un posible efecto en el tratamiento de AK, queratitis microbianas y fúngicas.
La búsqueda por conseguir tratamientos más rápidos y eficaces sigue siendo objeto de numerosos estudios.
Por otro lado, el creciente uso de las nanopartículas en el campo de la biomedicina para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades hace que su uso haya sido también probado en el tratamiento contra Acanthamoeba, contra la queratitis fúngica y bacteriana.
Experimentos in vitro muestran que las nanopartículas de cobalto tienen actividad amebicida contra A. castellanii así como las nanoparticulas de óxido de titanio (TiO2) que tienen efecto inhibitorio frente al crecimiento de Acanthamoeba. La conjugación de nanopartículas de oro con ciertos fármacos o compuestos como gluconato de clorhexidina o ácido cinámico han mostrado su efectividad contra A. castellana. Sin embargo, su uso no ha sido estudiado para
la detección de Acanthamoeba ni para el resto de patógenos oculares.
Las nanopartículas de metales nobles como las nanopartículas de oro (AuNPs), presentan unas excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas. Una de las propiedades que las hacen especialmente interesantes es la resonancia de plasmón superficial (LSPR). Este plasmón superficial se produce por la oscilación colectiva de los electrones libres de la banda de conducción del oro al ser excitados con un haz de luz incidente de determinada frecuencia. Cuando la frecuencia de la radiación incidente coincide con la frecuencia resonante de la oscilación de los electrones, se produce un fenómeno de absorción. Las nanopartículas de oro son esferas cuya banda de absorción se encuentra dentro del espectro visible. Su diámetro está comprendido generalmente entre 2-50nm, a medida que aumenta su tamaño, la banda de absorción se desplaza a longitud de onda mayores, variando el color de la suspensión coloidal.
Por tanto, el fenómeno de la banda de plasmón superficial está influenciado por el tamaño y la forma de las nanopartículas, así como por otros factores como el disolvente, la concentración, distribución espacial y la distancia entre partículas entre otros. Esta interesante propiedad es la razón de que puedan ser usadas como sensores colorimétricos.
Dado que el diagnóstico de la queratitis por Acanthamoeba y otros parásitos oculares es un proceso complejo y a menudo lento y que no existe un tratamiento estándar definido, la creación de un método de detección precoz es algo esencial para minimizar la severidad de la patología.
Por ello, en la presente invención se describe un sistema para la detección de estos patógenos oculares, con especial atención en aquellos asociados al uso de lentes de contacto, concretamente en la detección de la presencia de Acanthamoeba y Pseudomona aeruginosa.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención consiste en un sistema de detección de la presencia de Acanthamoeba creado con nanopartículas de oro. El sistema permite confirmar la presencia
de dicho patógeno con un cambio de color visible de la muestra.
El sistema para establecer la detección es a través del reconocimiento de ARN de la ameba. La detección consiste en el uso de una molécula de ARN mensajero para detectar secuencias de ARN del parásito. Para hacer los experimentos in vitro, la secuencia de ARN de la ameba se pidió la complementaria en ADN, ya que el ARN se degrada fácilmente. El método usado consiste en poner en contacto el ARN de la Acanthamoeba con nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los oligonucleótidos unidos a las nanopartículas de oro tienen cada uno, una secuencia complementaria a la secuencia de una de las partes del ARN de Acanthamoeba que se quiere detectar. La unión de la secuencia del ADN de Acanthamoeba con los oligonucleótidos complementarios unidos a las nanopartículas de oro se conoce como hibridación, que provoca una agregación de las nanopartículas de oro.
El desarrollo del sistema de detección está basado en la resonancia de plasmón superficial localizada o LSPR de las nanopartículas de oro mencionado con anterioridad. Según el tamaño de las nanopartículas, el color de la suspensión coloidal de nanopartículas varía. En este caso, el color de dicha suspensión es rojo, pero cuando tiene lugar la hibridación de los oligonucleótidos en las nanopartículas con el ácido nucleico, se produce un cambio de color de la suspensión debido a la agregación de las nanopartículas de oro. La banda de absorción se desplaza hacia la derecha y se produce un cambio de color visible que indica la presencia o no de Acanthamoeba en nuestra muestra.
El uso de este sistema en un estuche porta lentes para la detección de Acanthamoeba spp. y otros patógenos infecciosos es sencillo. Las nanopartículas se pueden fijar en la base del estuche de lentes de contacto. De esta manera, en el caso de que las lentes de contacto estén contaminadas con la ameba, ésta permanecerá en el líquido de mantenimiento de las lentes de contacto que se encuentra en el estuche de almacenamiento, produciéndose así un cambio de color a morado-azulado en la base del estuche del porta-lentes indicador de su presencia.
Este método para detectar Acanthamoeba y otras bacterias basado en observar un cambio de color a simple vista es barato, rápido, sin requerimiento de un equipo especializado. Esto lo hace adecuado para su uso en laboratorios de investigación, en clínicas oftalmológicas, hospitales, ópticas, etc.
La invención es aplicable a la detección de Pseudomonas y Staphylococcus, así como todas las especies pertenecientes al género de Acanthamoeba incluyendo Acanthamoeba astronyxis, A. castellanii, A comandoni, A culbertsoni, A. divionensis, A. griffini, A. hatchetti, A. healyi, A. jacobsi, A. lenticulata, A. lugdunensis, A. mauritaniensis, A. palestinensís, A. pearci, A. polyphaga, A. pustulosa, A. quina, A. rhysodes, A.royreba, A. terrcola, A. triangularis y A. tubiashi.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que seguidamente se va a realizar y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del invento, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de planos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático del modelo de unión las sondas 1 y 2 (ADN) a las nanopartículas y el target. La distancia de las secuencias seleccionadas es de 18nm, por lo que el tamaño de la Np debe ser mayor de este para promover la agregación.
En la Figura 2 se muestra el cambio de color que se aprecia al producirse la hibridación, con el target (ADN Acanthamoeba) sintético y como consecuencia, la agregación de las nanopartículas de oro. El resultado es tras 10min de añadir el target a la solución.
En la Figura 3 se muestra el cambio de color de la solución coloidal de nanopartículas de oro al detectar la presencia de Acanthamoeba. La muestra utilizada es una solución con Acanthamoeba extraída directamente de cultivos realizados. Se produce la hibridación, y como consecuencia, la agregación de las AuNPs obteniendo un cambio de color visible.
Figura 4. Espectro de absorción de las nanopartículas de oro tras la adicción de Acanthamoeba (representada en línea discontinua) que muestra el cambio en el pico de absorción producido por su agregación.
Figura 5. Ilustración de cómo funciona el estuche porta-lentes como dispositivo de
detección. A la izquierda tenemos el estuche con la superficie del fondo con nanopartículas funcionalizadas. Si las lentes de contacto no están contaminadas el color que se ve es rojo. A la derecha tenemos el estuche cuando las lentes de contacto están contaminadas con el patógeno, produciéndose un cambio de color en el fondo del estuche a morado confirmando su presencia.
MODO DE REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Las nanopartículas empleadas en la invención son nanoesferas de oro. El tamaño de las nanopartículas es 15nm y 70 nm siendo preferible tamaño entre 15 y 35nm.
El método usado para sintetizar las nanopartículas de oro está basado en la reducción del citrato, de acuerdo con procesos conocidos.
Se obtiene una solución coloidal de nanopartículas de oro monodispersas estables con un tamaño que puede ser entre 1nm y 150nm, en este caso se eligió 25nm. Las nanopartículas de oro adecuadas también pueden conseguirse en casas comerciales.
Caracterización de las nanopartículas:
La resonancia de plasmón superficial localizada o LSPR de las nanopartículas de oro da como resultado una fuerte banda de absorbancia en la región visible (500 nm-600 nm), que se puede medir mediante espectroscopía UV-Vis.
La concentración final de nanopartículas de oro (1) se calculó usando la Ley de Beer-Lambert.
Con el fin de obtener nanopartículas más concentradas, la solución se centrifuga. Para la selección del tamaño de nanopartículas a utilizar, se consideró la longitud de la secuencia de reconocimiento (ARN de Acanthamoeba= target) que utilizamos. El tamaño de las nanopartículas de oro (1) debe ser mayor que la longitud del target (2) (en este caso, 18 nm) para obtener el efecto de acoplamiento del plasmón, todo ello tal y como se muestra en la figura 1.
En cuanto a la funcionalización de las nanopartículas, las nanopartículas se funcionalizaron
con oligonucleótidos modificados con grupos tiol es sus extremos 3’ y 5’ para permitir la unión. La mitad de las partículas se funcionalizan con ADN monocatenario terminado en tiol con una secuencia de bases complementaria a un extremo del target; la otra mitad está funcionalizada de manera similar, pero con una secuencia de bases complementaria al otro extremo del target. El tiol se une al oro.
La secuencia de bases de ADN es diferente. Se consideró una ratio teórico oligonucleótidos / partícula de acuerdo con publicaciones relativas existentes.
En la siguiente tabla se detalla los valores para dos tamaños seleccionados.
Funcionalización con una primera sonda.
El objetivo de este método es disminuir la repulsión de cargas con la agregación de sal, la cual se añade lentamente para mantener la estabilidad de las nanopartículas de oro.
Para ello, se preparó una solución que contenía nanopartículas de oro (10.85 nM), SDS (0.1%) y PB (0.01 M), se añadió la primera sonda hasta alcanzar concentración final de 44 ^M, con un RATIO 4055 oligonucleótidos / nanopartículas. La mezcla de oligonucleótidos y nanopartículas de oro se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. Para mejorar la unión del oligonucleótido a la superficie la nanopartícula, se añadió sal a la solución de nanopartículas con oligonucleótidos. La solución de NaCl (2 M), SDS (0,01%) y PB (0,01 M) se añadió progresivamente en pasos de: 1, 1, 2, 2 y 4 ^L alcanzando una concentración final de NaCl de 0,2 M. Después de cada adición, la mezcla se sonicó durante 10 segundos seguido de un período de incubación de 20 minutos a temperatura ambiente y 350 rpm. La solución final fue incubada durante 12 horas para dejar tiempo a la unión.
Para eliminar el exceso de oligonucleótidos, la solución se centrifuga y se redispersa en SDS 0.01%.
Como control se prepara la misma solución sin ADN.
Funcionalización con una segunda sonda.
La base de este método es la protonación de las bases de ADN para disminuir su repulsión con las nanopartículas de oro para ello se realizó un protocolo de regulación del pH.
Se preparó una solución buffer de citrato (9.2mM) (PH: 3) y DNA 2 (6.6uM) La solución fue sonicada durante 3min antes de añadir las nanopartículas de oro alcanzando una concentración final de 4.6nM y un Ratio =1442. La solución final se incubó durante 2horas en el thermomixer: 22 °C y 350rpm.
Para eliminar el exceso de ADN la muestra se centrifuga y se redispersa en 10mM PB.
Como control se prepara la misma solución sin DNA.
Hibridación.
La hibridación se produce cuando el material genético de la Acanthamoeba se une a las secuencias sonda complementarias que están ya unidas cada una a una nanopartícula de oro. La secuencia de Acanthamoeba a detectar, fue seleccionada según la literatura existente y se obtuvo de la casa comercial Stab-Vida. De aquí en adelante denominada “target”.
El target se une por un extremo al a la primera sonda junto con la nanopartícula funcionalizada y por el otro extremo se une a la segunda sonda produciendo la agregación de las nanopartículas de oro debido a esta unión. Se produce entonces un cambio significativo en las propiedades dieléctricas del medio que rodea las nanopartículas y se detecta un cambio de color visible de rojo a morado.
Las nanopartículas funcionalizadas con ADN 1 y ADN 2 se mezclan en presencia de sal para promover la agregación con el target. La velocidad de hibridación puede aumentarse aumentando la concentración de NaCl.
Se prepara una mezcla con las nanopartículas funcionalizadas con los dos tipos de
oligonucleótidos alcanzando una concentración final de 1nM. La concentración de nanopartículas también es un factor ajustable, según su tamaño, e influye en la facilidad para detectar cambio de color visible.
Para ayudar a la unión con el target se añade sal (NaCl 2M+10mMPB) hasta alcanzar una concentración final de 0.25M. La concentración de sal se selecciona en base a la concentración de nanopartículas de oro. Finalmente se añade el target, alcanzando una concentración final mínima determinada para observar el cambio de color de la solución.
Este mismo proceso se prueba con muestras reales de Acanthamoeba. Para ello se realizaron cultivos mono-axénicos de la ameba. Una vez extraída se agregó a la solución de Nanoparticulas funcionalizadas. En lugar del target sintético se añadió la muestra con amebas reales produciéndose un cambio de color visible. En función de la concentración de amebas el cambio puede ser detectado a los 5minutos.
La misma técnica usada sirve con otras secuencias de ARN Pseudomonas y Staphylococcus.
El sistema así descrito puede integrarse en un estuche porta-lentes (3), con solución de mantenimiento, como el mostrado en la figura 5, en el que se define una zona (4) a través de la que puede visualizarse la reacción anteriormente descrita ante unas lentes de contacto que hayan estado en contacto con el patógeno, o bien puede integrarse en tiras desechables con la solución descrita, que se aplican directamente sobre la superficie ocular.
Claims (3)
1a.- Sistema de detección de parásitos oculares, parásitos tales como Pseudomonas y Staphylococcus, así como todas las especies pertenecientes al género de Acanthamoeba, caracterizado por que consiste en un soporte de control sobre el que se establece una solución coloidal de nanopartículas de oro monodispersas, cuya coloración es susceptible de cambiar al entrar en contacto con el ARN del parásito.
2a.- Sistema de detección de parásitos oculares, según reivindicación 1a, caracterizado por que el soporte de control se integra en la base de un estuche de lentes de contacto.
3a.- Sistema de detección de parásitos oculares, según reivindicación 1a, caracterizado por que el soporte de control se integra en unas tiras desechables de aplicación directa sobre la superficie ocular.
4a- Sistema de detección de parásitos oculares, según reivindicación 1a, caracterizado por que las nanopartículas de oro se materializan en nanoesferas de oro, con un tamaño de entre 15nm y 70 nm.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2932995 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20230130 |
|
| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20230130 |