ES2933042T3 - Proteasas de rendimiento mejorado - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a proteasas que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID No. 1, en toda su longitud, y que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una de las posiciones P9, K22, V28, A29, A48, Q62, T78, L82, V84, S87, D101, N130, G131, T133, N144, G166, T215, S216, S224, N240, N252, S260 o Q271, correspondientes en cada caso a la numeración según SEQ ID No. 1. La invención también se refiere a su producción y uso. Dicho tipo de proteasas tienen un rendimiento de limpieza muy bueno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Proteasas de rendimiento mejorado
La invención pertenece al campo de la tecnología de enzimas. La invención se refiere a proteasas de Bacillus pumilus cuya secuencia de aminoácidos, en particular con respecto a su uso en detergentes y agentes de limpieza, ha sido modificada para darles un mejor rendimiento de limpieza a bajas temperaturas (por ejemplo, entre 20 ° C y 40 ° C) y una mayor estabilidad de almacenamiento, y a los ácidos nucleicos que la codifican y a su preparación. La invención se refiere además a los usos de estas proteasas y a los procedimientos en los que se utilizan, así como a las composiciones que las contienen, en particular detergentes y agentes de limpieza.
Las proteasas pertenecen a las enzimas técnicamente más importantes en general. Para detergentes y agentes de limpieza, estas son las enzimas más antiguas contenidas en prácticamente todos los detergentes y agentes de limpieza modernos y de alto rendimiento. Estas causan la degradación de la suciedad que contiene proteínas en el material que va a limpiarse. Entre estas, a su vez, las proteasas del tipo subtilisina (subtilasas, subtilopeptidasas, EC 3.4.21.62) que son particularmente importantes son proteasas de serina debido a los aminoácidos catalíticamente activos. Actúan como endopeptidasas no específicas e hidrolizan enlaces ácidos de amida cualesquiera que se encuentran dentro de péptidos o proteínas. Su pH óptimo suele estar en el rango claramente alcalino. Una visión general de esta familia se ofrece, por ejemplo, en el artículo "Subtilases: Subtilisin-like Proteases" por R. Siezen, página 75-95 en "Subtilisin enzymes", editado por R. Bott y C. Betzel, Nueva York, 1996. Las subtilasas se forman naturalmente por microorganismos. Entre ellos, las subtilisinas formadas y secretadas por las especies de Bacillus deben mencionarse como el grupo más importante dentro de las subtilasas.
Ejemplos de las proteasas del tipo subtilisina utilizadas preferentemente en detergentes y agentes de limpieza son las subtilisinas BPN' y Carlsberg, la proteasa PB92, las subtilisinas 147 y 309, la proteasa de Bacillus lentus, en particular de Bacillus lentus DSM 5483, subtilisina DY y las subtilasas, aunque ya no las enzimas termitasa, proteinasa K y las proteasas TW 3 y TW 7, que deberían clasificarse entre las subtilisinas en el sentido más estrecho, y las variantes de dichas proteasas que tienen una secuencia de aminoácidos alterada en comparación con la proteasa original. Las proteasas se modifican de manera dirigida o aleatoria mediante procedimientos conocidos del estado de la técnica y, por lo tanto, se optimizan, por ejemplo, para su uso en detergentes y agentes de limpieza. Estos incluyen mutagénesis puntual, mutagénesis por deleción o inserción, o fusión con otras proteínas o partes de proteínas. Por lo tanto, para la mayoría de las proteasas conocidas del estado de la técnica se conocen variantes correspondientemente optimizadas. Por los documentos WO 2015/089441, WO 2015/089447 y WO 2011/014278 se conocen varias proteasas de B. akibai, B. clarkii y B. amyloliquefaciens.
En la solicitud de patente europea EP 2016175 A1, por ejemplo, se divulga una proteasa de Bacillus pumilus destinada a detergentes y agentes de limpieza. En general, solo las proteasas seleccionadas son adecuadas para su uso en preparaciones líquidas que contienen surfactante. Muchas proteasas no muestran suficiente rendimiento catalítico en tales preparaciones. Por lo tanto, para la aplicación de proteasas en agentes de limpieza, es particularmente deseable una alta actividad catalítica en condiciones como las presentes durante un ciclo de lavado.
En consecuencia, las formulaciones líquidas que contienen proteasa y surfactante del estado de la técnica tienen la desventaja de que las proteasas contenidas en condiciones de lavado estándar (por ejemplo, en un rango de temperatura de 20 °C a 40 °C) no tienen actividad proteolítica satisfactoria y, por lo tanto, las formulaciones no muestran un rendimiento de limpieza óptimo en suciedad sensible a la proteasa.
Por los documentos WO 2017/162429, WO 2017/162428 y WO 2010/060822 se describen las variantes de la proteasa de B. pumilus. Sin embargo, todavía es necesario mejorar aún más el rendimiento de lavado y/o la estabilidad de almacenamiento de las proteasas en detergentes.
Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que una proteasa de Bacillus pumilus o una proteasa suficientemente similar (con respecto a la identidad de secuencia), que tiene una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones N144 o S224, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO: 1, es mejor en términos de actividad proteolítica en condiciones de lavado estándar y/o con respecto a la estabilidad de almacenamiento en comparación con la forma de tipo silvestre y, por lo tanto, es particularmente adecuada para su uso en detergentes o agentes de limpieza.
Por lo tanto, en un primer aspecto es objeto de la invención una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos especificada en la SEQ ID NO: 1 por toda su longitud y tiene una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones N144 o S224, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO: 1, en cuyo caso se selecciona la al menos una sustitución de aminoácidos del grupo formado por N144K, S224A y S224T, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO: 1.
Otro objeto de la invención es un procedimiento para preparar una proteasa que comprende la sustitución de un aminoácido en al menos una posición correspondiente a las posiciones 144 y 224 en SEQ ID NO:1, en una proteasa
inicial que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO:1 por toda su longitud, preferiblemente de modo que la proteasa tiene la sustitución de aminoácidos N144K, S224A o S224T en al menos una posición.
Por lo tanto, una proteasa en el sentido de la presente solicitud de patente comprende tanto la proteasa misma, como también una proteasa preparada mediante un procedimiento de acuerdo con la invención. Por lo tanto, todas las explicaciones sobre la proteasa se refieren tanto a la proteasa misma, como también a las proteasas preparadas mediante procesos correspondientes.
Otros aspectos de la invención se refieren a los ácidos nucleicos que codifican para estas proteasas, a las células huéspedes no humanas según la invención que contienen las proteasas o los ácidos nucleicos según la invención, así como a los productos que contienen proteasas según la invención, en particular detergentes y agentes de limpieza, a procedimientos de lavado y limpieza, y a usos de las proteasas de la invención en detergentes o agentes de limpieza para eliminar la suciedad que contiene proteínas.
"Al menos uno" como se usa aquí significa uno o más, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más.
La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de los inventores de que una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 144 o 224 de la proteasa de Bacillus pumilus según SEQ ID NO: 1, en una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 1 idéntica a al menos 80% de secuencia de aminoácidos, de tal manera que los aminoácidos 144K, 224A o 224T están presentes en al menos una de las posiciones correspondientes, provoca una mejor actividad catalítica y/o una mejor estabilidad de almacenamiento de esta proteasa modificada en detergentes y agentes de limpieza. Esto es particularmente sorprendente ya que ninguna de las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente se ha asociado previamente con una mayor actividad catalítica y/o una mayor estabilidad de almacenamiento de la proteasa.
Las proteasas de la invención tienen una actividad catalítica aumentada en detergentes o agentes de limpieza. En una variedad de formas de realización, las proteasas de la invención tienen una actividad proteolítica que con respecto a la variante de tipo silvestre de la proteasa (SEQ ID NO: 1) es de al menos 110%, al menos 115%, al menos 120%, al menos 125%, al menos 130%, al menos 135%, al menos 140%, al menos 145%, al menos 150%, al menos 155% o al menos 160%. Estas proteasas de rendimiento mejorado permiten mejores resultados de lavado en suciedad sensible proteolíticamente en diferentes rangos de temperatura, en particular un rango de temperatura de 20 °C a 40 °C.
De modo independiente o adicional al aumento de la actividad catalítica, las proteasas de la invención tienen una estabilidad de almacenamiento mejorada. Tienen una mayor estabilidad en detergentes o agentes de limpieza en comparación con la variante de tipo silvestre de la proteasa (SEQ ID NO: 1), particularmente cuando se almacenan durante 3 o más días, 4 o más días, 7 o más días, 10 o más días, 12 o más días o 14 o más días. Estas proteasas de rendimiento mejorado permiten mejores resultados de lavado en suciedad sensible proteolíticamente en diferentes rangos de temperatura, en particular un rango de temperatura de 20 °C a 40 °C.
Las proteasas de la invención tienen actividad enzimática, es decir, son capaces de hidrólisis de péptidos y proteínas, en particular en un detergente o agente limpiador. Una proteasa según la invención es, por lo tanto, una enzima que cataliza la hidrólisis de amida/ enlaces de péptido en sustratos de proteína/péptido y, por lo tanto, es capaz de disociar proteínas o péptidos. Además, una proteasa según la invención es preferiblemente una proteasa madura; es decir que es la molécula catalíticamente activa sin señal y/o propéptido(s). A menos que se indique lo contrario, las secuencias indicadas también se refieren a enzimas respectivamente maduradas (procesadas).
En diversas formas de realización de la invención, la proteasa es una enzima que se encuentra presente libremente. Esto significa que la proteasa puede actuar directamente con todos los componentes de un agente y, si el agente es un líquido, que la proteasa está en contacto directo con el disolvente del agente (por ejemplo, agua). En otras formas de realización, un agente puede contener proteasas que forman un complejo de interacción con otras moléculas o que contienen una "envoltura". En este caso, una sola o varias moléculas de proteasa puede estar separada de los otros componentes del agente por una estructura circundante. Tal estructura de separación puede surgir, pero sin limitarse, por vesículas como, por ejemplo, una micela o un liposoma. La estructura circundante también puede ser una partícula de virus, una célula bacteriana o una célula eucariota. En diversas formas de realización, un agente puede contener células de Bacillus pumilus o Bacillus subtilus, que expresan las proteasas de la invención, o sobrenadantes de cultivo celular de dichas células.
En otras formas de realización diferentes, la proteasa de la invención tiene sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones P9, S216 y Q271, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO: 1.
En formas de realización preferidas, la proteasa comprende las sustituciones de aminoácidos P9T, S216C y Q271E, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO: 1. En formas de realización preferidas adicionales, la proteasa de la invención contiene una de las siguientes variantes de sustitución de aminoácidos: (i) P9T, S216C,
Q271E, N144K y N252T; ii) P9T, S216C, Q271E y S224T; iii) P9T, S216C, Q271E, T78S y S224A; o iv) P9T, S216C, Q271E; T133R y S224A, en donde la numeración es con respecto a la numeración según el SEQ ID NO:1.
En una forma de realización adicional de la invención, la proteasa comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos especificada en s Eq ID NO: 1 por toda su longitud en por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% y 98,8%, y tiene una o más de las sustituciones de aminoácidos 144K, 224A o 224T en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones 144 o 224 en la numeración según SEQ ID NO:1. En relación con la presente invención, la característica de que una proteasa tiene las sustituciones especificadas significa que contiene al menos uno de los aminoácidos correspondientes en las posiciones correspondientes; es decir que no todas las 10 posiciones están mutadas de otra manera o eliminadas, por ejemplo, por fragmentación de la proteasa. Las secuencias de aminoácidos de tales proteasas, que se prefieren de acuerdo con la invención, se indican en SEQ ID Nos: 2-19.
La determinación de la identidad de las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se lleva a cabo mediante una comparación de secuencias. Esta comparación de secuencias se basa en el algoritmo BLAST establecido en el estado de la técnica y de uso común (véase, por ejemplo, la publicación de Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool". J. Mol. Biol. 215:403-410, y la publicación de Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp.
3389-3402) y sucede en principio por el hecho de que secuencias similares de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se asignan entre sí. Una asignación tabular de las posiciones relevantes se conoce como alineación. Otro algoritmo disponible en el estado de la técnica es el algoritmo FASTA. comparaciones de secuencias (alineaciones), en particular, se generan comparaciones de secuencias múltiples con programas informáticos. Por ejemplo, la serie Clustal se usa con frecuencia (véase, por ejemplo, Chenna et al. (2003): Alineación de secuencia múltiple con la serie de programas Clustal. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500), T-Coffee (véase, por ejemplo, Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol.
302, 205-217) o programas basados en estos programas o algoritmos. También son posibles las comparaciones de secuencias (alineaciones) con el programa informático Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) con los parámetros estándar predeterminados, cuyo módulo AlignX para comparaciones de secuencias se basa en ClustalW. A menos que se indique lo contrario, la identidad de secuencia indicada en este documento se determina utilizando el algoritmo BLAST.
Tal comparación también permite una declaración sobre la similitud de las secuencias comparadas entre sí. Por lo general, se expresa en porcentaje de identidad, es decir, en la proporción de nucleótidos idénticos o residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones o en posiciones correspondientes a una alineación entre sí. El concepto de homología, tomado además en consideración, incluye intercambios de aminoácidos conservados en el caso de secuencias de aminoácidos; es decir, aminoácidos con actividad química similar, ya que estos generalmente ejercen actividades químicas similares dentro de la proteína. Por lo tanto, la similitud de las secuencias comparadas también puede ser indicada como homología porcentual o similitud porcentual. La información de identidad y/u homología se puede hacer por polipéptidos o genes enteros o solo por áreas individuales. Por lo tanto, las regiones homólogas o idénticas de diferentes secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se definen por medio de coincidencias en las secuencias. Tales regiones a menudo tienen funciones idénticas. Pueden ser pequeños y contener sólo unos pocos nucleótidos o aminoácidos. A menudo, estas áreas pequeñas ejercen funciones esenciales para la actividad general de la proteína. Por lo tanto, puede ser útil referir coincidencias de secuencia solo a regiones individuales, opcionalmente pequeñas. Sin embargo, a menos que se indique lo contrario, los datos de identidad u homología en la presente solicitud se refiere a la longitud total de la secuencia de ácido nucleico o de aminoácido respectivamente indicada.
En relación con la presente invención, la indicación de que una posición de aminoácido corresponde a una posición numéricamente designada en SEQ ID NO: 1 significa por lo tanto que la posición correspondiente de la posición numéricamente designada en SEQ ID NO: 1 se asigna a una alineación como se ha definido anteriormente.
En una forma de realización adicional de la invención, la proteasa se caracteriza porque su rendimiento de limpieza no se reduce significativamente en comparación con el de una proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos especificada en el s Eq ID NO: 1, es decir, tiene al menos el 80% del rendimiento de lavado de referencia, preferiblemente al menos 100%, más preferiblemente al menos 110% o más. El rendimiento de limpieza se puede determinar en un sistema de lavado que contiene un detergente en una dosis entre 4,5 y 7,0 gramos por litro de licor de lavado y la proteasa, en donde las proteasas a comparar se utilizan en la misma concentración (con respecto a la proteína activa) y el rendimiento de limpieza frente a la suciedad en algodón se determina midiendo el grado de limpieza de los textiles lavados. Por ejemplo, el procedimiento de lavado se puede llevar a cabo durante 60 minutos a una temperatura de 40 °C y el agua tiene una dureza del agua entre 15,5 y 16,5° (dureza alemana). La concentración de la proteasa en el detergente determinado para este sistema de lavado es de 0,001-0,1 % en peso, preferiblemente 0,01 a 0,06 % en peso, con respecto a la proteína activa y purificada.
Un detergente líquido de referencia para tal sistema de lavado puede estar compuesto de la siguiente manera (todas las indicaciones en porcentaje en peso): 4,4% de ácido alquilbencenosulfónico, 5,6% de otros tensioactivos aniónicos, 2,4% de sales sódicas de ácidos grasos de C12-C18 (jabones), 4,4% de tensioactivos no iónicos, 0,2% de fosfonatos, 1,4% de ácido cítrico, 0,95% de NaOH, 0,01% de antiespumante, 2% de glicerina, 0,08% de conservantes, 1% de etanol, el resto de agua desmineralizada. Preferiblemente, la dosis del detergente líquido se encuentra entre 4,5 y 6,0 gramos por litro de licor de lavado, por ejemplo 4,7, 4,9 o 5,9 gramos por litro de licor de lavado. El lavado se realiza preferiblemente en un rango de pH entre pH 7 y pH 10,5, preferiblemente entre pH 7,5 y pH 8,5.
En el contexto de la invención, la determinación del rendimiento de limpieza se lleva a cabo, por ejemplo, a 20°C o 40°C utilizando un detergente líquido como se indicó anteriormente, en donde el procedimiento de lavado se lleva a cabo preferentemente durante 60 minutos a 600 rpm.
El grado de blancura, es decir, el aclaramiento de la suciedad, como medida del rendimiento de limpieza se determina mediante procedimientos de medición óptica, preferiblemente de modo fotométrico. Un dispositivo adecuado para este propósito es, por ejemplo, el espectrómetro Minolta CM508d. Por lo general, los dispositivos utilizados para la medición se calibran previamente con un estándar blanco, preferiblemente un estándar blanco suministrado.
Mediante el uso idéntico por actividad de la proteasa respectiva se garantiza que incluso en el caso de una posible divergencia en la proporción de sustancia activa a proteína total (los valores de la actividad específica), se comparan las propiedades enzimáticas respectivas, es decir, por ejemplo, el rendimiento de limpieza en determinada suciedad. En general es válido que una actividad baja específica pueda compensarse agregando una mayor cantidad de proteínas.
De lo contrario, los procedimientos para determinar la actividad de la proteasa son familiares para las personas expertas en el campo de la tecnología de enzimas y son utilizados rutinariamente por dichas personas. Por ejemplo, tales procedimientos se divulgan en la publicación Tenside, Volumen 7 (1970), pp. 125-132. Alternativamente, la actividad de la proteasa puede determinarse mediante la liberación del cromóforo para-nitroanilina (pNA) del sustrato suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida (AAPF). La proteasa disocia el sustrato y libera pNA. La liberación de pNA provoca un aumento de la absorbancia a 410 nm, cuyo curso temporal es una medida de la actividad enzimática (cf. Del Mar et al., 1979). La medición se lleva a cabo a una temperatura de 25 °C, a pH 8,6 y una longitud de onda de 410 nm. El tiempo de medición es de 5 min y el intervalo de medición es de 20s a 60s. La actividad de la proteasa generalmente se expresa en unidades de proteasa (PE). Las actividades de proteasa adecuadas son, por ejemplo, 2,25, 5 o 10 PE por ml de licor de lavado. Sin embargo, la actividad de la proteasa no es igual a cero.
Una prueba alternativa para determinar la actividad proteolítica de las proteasas según la invención es un procedimiento de medición óptica, preferiblemente un procedimiento fotométrico. La prueba adecuada para este propósito comprende la disociación dependiente de la proteasa de la proteína sustrato caseína. Esta se disocia por medio de la proteasa en un gran número de subproductos más pequeños. La totalidad de estos subproductos tiene una absorción aumentada a 290 nm en comparación con la caseína no disociada, en donde este aumento de la absorción se puede determinar utilizando un fotómetro y, por lo tanto, se puede sacar una conclusión sobre la actividad enzimática de la proteasa.
La concentración de proteína puede determinarse con ayuda de procedimientos conocidos, por ejemplo, el procedimiento BCA (ácido bicincónico; ácido 2,2'-biquinoil-4,4'-dicarboxílico) o el procedimiento de Biuret (A. G. Gornall, C. S. Bardawill y M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). La determinación de la concentración de proteína activa puede efectuarse a este respecto mediante la titulación de los centros activos utilizando un inhibidor irreversible adecuado y la determinación de la actividad residual (cf. M. Bender et al., J. Am. 88, 24 (1966), págs. 5890 a 5913).
Además de los cambios de aminoácidos explicados anteriormente, las proteasas de la invención pueden tener otros cambios de aminoácidos, en particular sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Tales proteasas se desarrollan, por ejemplo, mediante modificación genética dirigida, es decir, mediante procedimientos de mutagénesis, y se optimizan para ciertas aplicaciones o con respecto a propiedades especiales (por ejemplo, con respecto a su actividad catalítica, estabilidad, etc.). Además, los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden introducirse en depósitos de recombinación y, por lo tanto, utilizarse para producir proteasas u otros polipéptidos completamente nuevos.
El objetivo es introducir mutaciones dirigidas tales como sustituciones, inserciones o deleciones en las moléculas conocidas, por ejemplo, para mejorar el rendimiento de limpieza de enzimas de acuerdo con la invención. Para este propósito, en particular, se pueden cambiar las cargas superficiales y/o el punto isoeléctrico de las moléculas y, por lo tanto, sus interacciones con el sustrato. Por ejemplo, la carga neta de las enzimas se puede cambiar para influir en la unión del sustrato, particularmente para su uso en detergentes y agentes de limpieza. De manera alternativa o complementaria, una o más mutaciones correspondientes pueden aumentar la estabilidad o la actividad catalítica de la proteasa y, por lo tanto, mejorar su rendimiento de limpieza. Las propiedades ventajosas de las mutaciones individuales, por ejemplo, de las sustituciones individuales, pueden complementarse. Por lo tanto, una proteasa ya
optimizada con respecto a determinadas propiedades, por ejemplo, con respecto a su estabilidad durante el almacenamiento, puede desarrollarse adicionalmente en el contexto de la invención.
Para la descripción de las sustituciones que se refieren exactamente a la posición de un aminoácido (intercambios de aminoácidos), se aplica la siguiente convención en la presente invención: primero, el aminoácido naturalmente presente se designa en la forma del código de una letra utilizado internacionalmente, luego sigue la posición de secuencia asociada y finalmente el aminoácido insertado. Varios intercambios dentro de la misma cadena polipeptídica están separados entre sí por barras diagonales. En el caso de las inserciones, los aminoácidos adicionales se nombran según la posición de la secuencia. En el caso de las deleciones, el aminoácido faltante se reemplaza por un símbolo como, por ejemplo, una estrella o un guion, o se indica una A antes de la posición correspondiente. Por ejemplo, P9H describe la sustitución de prolina en la posición 9 por histidina, P9HT describe la inserción de treonina después del aminoácido histidina en la posición 9 y P9* o AP9 describe la deleción de prolina en la posición 9. Esta nomenclatura es conocida por los expertos en el campo de la tecnología de enzimas.
Otro objeto de la invención es, por lo tanto, una proteasa que se caracteriza porque se puede obtener de una proteasa como se describió anteriormente como molécula de partida por medio de una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde la proteasa en la numeración según SEQ ID NO: 1 tiene aún al menos una de las sustituciones de aminoácidos según la invención en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 en SEQ ID NO: 1, como se describió anteriormente. El término "sustitución conservadora de aminoácidos" significa el intercambio (sustitución) de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido, en donde este intercambio no conduce a un cambio en la polaridad o carga en la posición del aminoácido intercambiado, por ejemplo, el intercambio de un residuo de aminoácido no polar por otro residuo de aminoácido no polar. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos en el contexto de la invención comprenden, por ejemplo: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
Como alternativa o como complemento, la proteasa se caracteriza porque se puede obtener de una proteasa de acuerdo con la invención como molécula de partida por medio de mutagénesis por fragmentación, deleción, inserción o sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos que coincide, en una longitud de al menos 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 o 275 aminoácidos unidos, con la molécula de partida, en donde la o las sustituciones de aminoácidos contenida(s) en la molécula de partida en una o más de las posiciones que corresponden a las posiciones 144 y 224 en SEQ ID NO: 1 todavía está (n) presente (s).
Por ejemplo, es posible eliminar aminoácidos individuales en los términos o en los bucles de la enzima sin perder o reducir la actividad proteolítica. Además, por medio de una fragmentación de este tipo, la mutagénesis por deleción, inserción o sustitución puede reducirse, por ejemplo, incluso el potencial alergénico de las enzimas afectadas y, por lo tanto, mejorarse su aplicabilidad global. Ventajosamente, las enzimas conservan su actividad proteolítica incluso después de la mutagénesis; es decir que su actividad proteolítica corresponde al menos a la de la enzima de partida; es decir, en una forma de realización preferida la actividad proteolítica es al menos del 80%, preferiblemente al menos del 90% de la actividad de la enzima de partida. Otras sustituciones también pueden tener efectos ventajosos. Tanto los aminoácidos individuales como también varios aminoácidos relacionados se pueden intercambiar por otros aminoácidos.
De manera alternativa o complementaria, la proteasa se caracteriza porque se puede obtener de una proteasa según la invención como molécula de partida mediante una sustitución conservadora, sencilla o múltiple, de aminoácidos, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO: 1.
En otras formas de realización, la proteasa se caracteriza porque se puede obtener de una proteasa según la invención como molécula de partida por medio de fragmentación, mutagénesis por deleción, inserción o sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos que coincide, en una longitud de al menos 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 o 275 aminoácidos relacionados, con la molécula inicial, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO:1.
Las otras posiciones de aminoácidos se definen aquí por medio de una alineación de la secuencia de aminoácidos de una proteasa según la invención con la secuencia de aminoácidos de la proteasa de Bacillus pumilus, como se especifica en SEQ ID NO: 1. Además, la asignación de las posiciones depende de la proteína madura. Esta asignación debe aplicarse en particular si la secuencia de aminoácidos de una proteasa según la invención comprende un número mayor de residuos de aminoácidos que la proteasa de Bacillus pumilus según SEQ ID NO: 1. Partiendo de las posiciones mencionadas en la secuencia de aminoácidos de la proteasa de Bacillus pumilus, las posiciones de cambio en una proteasa según la invención son las que se asignan a estas posiciones en una alineación.
Las posiciones ventajosas para los cambios de secuencia, en particular las sustituciones, de la proteasa de Bacillus pumilus, que se transfieren a posiciones homólogas de las proteasas según la invención son preferentemente de importancia y confieren a la proteasa propiedades funcionales ventajosas, son por lo tanto las posiciones que corresponden en una alineación a las posiciones 144 y 224 en SEQ ID NO: 1, es decir, en la numeración según SEQ
ID NO: 1. En las posiciones mencionadas, los siguientes residuos de aminoácidos se encuentran en la molécula de tipo silvestre de la proteasa de Bacillus pumilus: N144 y S224.
Una confirmación adicional de la asignación correcta de los aminoácidos que han de cambiarse, es decir, en particular su correspondencia funcional, puede proporcionarse mediante pruebas comparativas, según las cuales las dos posiciones asignadas entre sí sobre la base de una alineación en ambas proteasas comparadas entre sí se cambian de la misma manera y se observa si la actividad enzimática cambia de la misma manera en ambas. Si, por ejemplo, un intercambio de aminoácidos en una determinada posición de la proteasa de Bacillus pumilus según SEQ ID NO:1 va acompañado de un cambio en un parámetro enzimático, por ejemplo con el aumento del valor Km, y se observa un cambio correspondiente en el parámetro enzimático, por ejemplo también un aumento en el valor Km, en una variante de proteasa según la invención, cuyo intercambio de aminoácidos se haya logrado por el mismo aminoácido introducido, Esta es una confirmación de la asignación correcta.
Todos los hechos mencionados también son aplicables a los procedimientos inventivos para la preparación de una proteasa. En consecuencia, un procedimiento según la invención comprende además una o más de las siguientes etapas procedimentales:
a) introducción de una sustitución conservadora de aminoácidos, simple o múltiple, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO:1;
b) modificación de la secuencia de aminoácidos por fragmentación, mutagénesis por deleción, inserción o sustitución de tal manera que la proteasa comprenda una secuencia de aminoácidos que coincida con la molécula original en una longitud de al menos 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 o 275 aminoácidos relacionados, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO: 1.
Todas las formas de realización también son válidas para los procedimientos inventivos.
En otras formas de realización de la invención, la proteasa o la proteasa preparada con un procedimiento según la invención sigue siendo idéntica en al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91.5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94%, 94,5%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% o 98,8% a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 1 en toda su longitud. Alternativamente, la proteasa o la proteasa preparada con un procedimiento según la invención sigue siendo idéntica en al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% o 98% a una de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID Nos: 2 19 en toda su longitud. La proteasa o la proteasa preparada con un procedimiento según la invención comprende una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones N144 o S224, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO:1, en donde la sustitución de aminoácidos, al menos una, se selecciona del grupo formado por N144K, S224A y S224T, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO:1. En otras formas de realización preferidas, la proteasa comprende una de las siguientes variantes de sustitución de aminoácidos: (i) P9T, S216C, Q271E, N144K y N252T; ii) P9T, S216C, Q271E y S224T; iii) P9T, S216C, Q271E, T78S y S224A; y iv) P9T, S216C, Q271E; T133R y S224A, en donde la numeración se refiere en cada caso a la numeración según el SEQ ID NO:1.
Otro objeto de la invención es una proteasa previamente descrita, que se estabiliza adicionalmente, en particular por medio de una o más mutaciones, por ejemplo, sustituciones, o por medio de acoplamiento a un polímero. Un aumento en la estabilidad durante el almacenamiento y/o durante el uso, por ejemplo, durante el procedimiento de lavado, conduce a que la actividad enzimática dura más tiempo y, por lo tanto, se mejora el rendimiento de limpieza. Básicamente, todas las opciones de estabilización descritas en el estado de la técnica y/o las opciones de estabilización convenientes entran en consideración. Se da preferencia a tales estabilizaciones que se logran por medio de mutaciones de la enzima misma, ya que tales estabilizaciones no requieren ningún paso de trabajo adicional después de la obtención de la enzima. Ejemplos de cambios de secuencia adecuados para este propósito se han mencionado antes. Otros cambios de secuencia adecuados se conocen en el estado de la técnica.
Otras posibilidades de estabilización son, por ejemplo:
- modificación del enlace de iones metálicos, en particular los sitios de enlace al calcio, por ejemplo, intercambiando uno o más de los aminoácidos que participan en el enlace de calcio por uno o varios aminoácidos cargados negativamente y/o introduciendo cambios de secuencia en al menos una de las consecuencias de los dos aminoácidos arginina/glicina;
- protección contra la influencia de agentes desnaturalizantes tales como tensioactivos por medio de mutaciones que causan un cambio en la secuencia de aminoácidos en o sobre la superficie de la proteína;
- Intercambio de aminoácidos que están cerca del N-terminal por aquellos que presumiblemente entran en contacto con el residuo de la molécula a través de interacciones no covalentes y de esta manera contribuyen al mantenimiento de la estructura globular.
Son formas de realización preferidas aquellas en las que la enzima se estabiliza de varias maneras, ya que varias mutaciones estabilizadoras actúan de manera aditiva o sinérgica.
Otro objeto de la invención es una proteasa como se describió anteriormente, que se caracteriza porque tiene al menos una modificación química. Una proteasa con un cambio que se designa como derivado; es decir que la proteasa se derivatiza.
A efectos de la presente solicitud, por derivados se entienden, por tanto, proteínas cuya cadena de aminoácidos puros ha sido modificada químicamente. Tales derivatizaciones pueden tener lugar, por ejemplo, in vivo por parte de la célula huésped que expresa la proteína. En este sentido, son particularmente dignos de mención los acoplamientos de compuestos de bajo peso molecular como lípidos u
oligosacáridos. Sin embargo, las derivatizaciones también pueden llevarse a cabo in vitro, por ejemplo, mediante la conversión química de una cadena lateral de un aminoácido o mediante el enlace covalente de otro compuesto a la proteína. Por ejemplo, es posible el acoplamiento de aminas a grupos carboxilo de una enzima para cambiar el punto isoeléctrico. Otro compuesto de este tipo también puede ser otra proteína que está enlazada, por ejemplo, por medio de compuestos químicos bifuncionales a una proteína según la invención. Del mismo modo, se entiende por derivatización el enlace covalente a un portador macromolecular, o también una inclusión no covalente en estructuras de jaula macromoleculares adecuadas. Las derivatizaciones pueden afectar, por ejemplo, la especificidad del sustrato o la fuerza de enlace al sustrato o causar un bloqueo temporal de la actividad enzimática si la sustancia acoplada es un inhibidor. Esto puede ser útil, por ejemplo, para el período de almacenamiento. Tales modificaciones también pueden afectar la estabilidad o la actividad enzimática. También pueden servir para reducir el potencial alergénico y/o la inmunogenicidad de la proteína y, por lo tanto, por ejemplo, para aumentar su compatibilidad cutánea. Por ejemplo, los acoplamientos con compuestos macromoleculares, por ejemplo, polietilenglicol, pueden mejorar la proteína en términos de estabilidad y/o compatibilidad con la piel.
Por derivados de una proteína según la invención también pueden entenderse, en el sentido más amplio, las preparaciones de estas proteínas. Dependiendo de la obtención, procesamiento o preparación, una proteína se puede combinar con otras sustancias diversas, por ejemplo, del cultivo de los microorganismos productores. Una proteína también puede haber sido mezclada específicamente con otras sustancias, por ejemplo, para aumentar su estabilidad de almacenamiento. Todas las preparaciones de una proteína según la invención son, por lo tanto, acordes con la invención. Esto también es independiente de si realmente despliega esta actividad enzimática en una preparación particular o no. Porque puede ser deseable que durante el almacenamiento no tenga o tenga solo poca actividad y solo despliegue su función enzimática en el momento de su uso. Esto puede controlarse, por ejemplo, por medio de sustancias acompañantes correspondientes. En particular, la preparación conjunta de proteasas con inhibidores específicos es posible en este sentido.
Entre todas las proteasas o variantes de proteasas y/o derivados descritos anteriormente, en el contexto de la presente invención particularmente se prefieren aquellos cuya actividad catalítica corresponde a al menos a una de las de las proteasas según los números SEQ ID: 2-19, y/o cuyo rendimiento de limpieza corresponde al menos a uno de los de las proteasas según SEQ ID Nos: 2-19, en donde el rendimiento de limpieza en un sistema de lavado se determina como se describe anteriormente.
Otro objeto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteasa según la invención, y un vector que contiene tal ácido nucleico, en particular un vector de clonación o un vector de expresión.
Estas pueden ser moléculas de ADN o ARN. Pueden estar presentes como una sola cadena, como una sola cadena complementaria a esta cadena simple, o como una doble cadena. Particularmente en el caso de las moléculas de ADN, las secuencias de ambas cadenas complementarias deben tenerse en cuenta respectivamente en los tres marcos de lectura posibles. Además, hay que tener en cuenta que diferentes codones, es decir, tripletes de base, pueden codificar los mismos aminoácidos, de modo que una determinada secuencia de aminoácidos puede ser codificada por varios ácidos nucleicos diferentes. Debido a esta degeneración del código genético, en este objeto de invención están incluidas todas las secuencias de ácidos nucleicos que pueden codificar una de las proteasas descritas anteriormente. La persona experta es capaz de determinar estas secuencias de ácidos nucleicos más allá de toda duda, ya que, a pesar de la degeneración del código genético, los aminoácidos definidos pueden asignarse a codones individuales. Por lo tanto, a partir de una secuencia de aminoácidos, la persona experta puede determinar fácilmente los ácidos nucleicos codificantes para esta secuencia de aminoácidos. Además, uno o más codones pueden ser reemplazados por codones sinónimos en ácidos nucleicos según la invención. Este aspecto se refiere en particular a la expresión heteróloga de las enzimas según la invención. Por lo tanto, cada organismo, por ejemplo, una célula huésped de una cepa de producción, tiene un determinado uso de codones. Por uso de codones se entiende la traducción del código genético en aminoácidos por el organismo respectivo. Pueden ocurrir atascos en la biosíntesis de proteínas si los codones que se encuentran en el ácido nucleico se enfrentan a un número comparativamente pequeño de moléculas de ARNt cargadas en el organismo. Aunque codificar para el mismo aminoácido conduce a que en el organismo se traduce un codón de manera menos eficiente que un codón sinónimo que codifica para el
mismo aminoácido. Debido a la presencia de un mayor número de moléculas de ARNt para el codón sinónimo, este se puede traducir de manera más eficiente en el organismo.
La persona experta puede preparar los ácidos nucleicos correspondientes hasta genes completos mediante secuencias conocidas de ADN y/o aminoácidos por medio de procedimientos generalmente conocidos hoy en día, como la síntesis química o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con procedimientos estándar de biología molecular y/o de química de proteínas. Tales procedimientos se conocen, por ejemplo, por la publicación de Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3a edición Cold Spring Laboratory Press.
A los efectos de la presente invención, por vectores se entienden elementos que se componen de ácidos nucleicos que contienen un ácido nucleico según la invención como un rango de ácido nucleico caracterizador. Son capaces de establecerlos como un elemento genético estable en una especie o línea celular por varias generaciones o divisiones celulares. Los vectores son plásmidos especiales, es decir, elementos genéticos circulares, particularmente cuando se usan en bacterias. En el contexto de la presente invención, un ácido nucleico según la invención se clona en un vector. A los vectores pertenecen, por ejemplo, aquellos cuyo origen son plásmidos bacterianos, virus o bacteriófagos, o predominantemente vectores sintéticos o plásmidos con elementos de diversos orígenes. Con los otros elementos genéticos respectivamente presentes, los vectores pueden establecerse como unidades estables en las células huésped en cuestión durante varias generaciones. Pueden estar presentes a nivel extracromosómico como unidades propias o integrarse a un cromosoma o ADN cromosómico.
Los vectores de expresión comprenden secuencias de ácidos nucleicos que les permiten replicarse en las células huésped que los contienen, preferiblemente microorganismos, de modo particularmente preferible bacterias, y expresar un ácido nucleico allí contenido. La expresión está particularmente influenciada por el promotor o los promotores que regulan la transcripción. En principio, la expresión puede ser llevada a cabo por el promotor natural, originalmente localizado antes del ácido nucleico a expresar, pero también por un promotor de la célula huésped, proporcionado en el vector de expresión, o incluso por un promotor modificado o completamente diferente de otro organismo u otra célula huésped. En el presente caso se proporciona al menos un promotor para la expresión de un ácido nucleico según la invención y se utiliza para su expresión. Los vectores de expresión también pueden ser regulables, por ejemplo, cambiando las condiciones de cultivo o al alcanzar una cierta densidad celular de las células huésped que los contienen o añadiendo ciertas sustancias, en particular activadores de la expresión génica. Un ejemplo de tal sustancia es el derivado de galactosa isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG), que se utiliza como activador del operón de lactosa bacteriano (operón lac). A diferencia de los vectores de expresión, el ácido nucleico contenido no se expresa en vectores de clonación.
Otro objeto de la invención es una célula huésped no humana que comprende un ácido nucleico según la invención o un vector según la invención, o que comprende una proteasa según la invención, en particular una que secreta la proteasa en el medio que rodea a la célula huésped. Preferiblemente, un ácido nucleico según la invención o un vector según la invención se transforma en un microorganismo, que luego representa una célula huésped según la invención. Alternativamente, los componentes individuales, es decir, partes de ácido nucleico o fragmentos de un ácido nucleico según la invención pueden introducirse en una célula huésped de tal manera que la célula huésped resultante contenga un ácido nucleico según la invención o un vector según la invención. Este procedimiento es particularmente adecuado si la célula huésped ya contiene uno o más componentes de un ácido nucleico según la invención o de un vector según la invención y los otros componentes se complementan de manera correspondiente. Los procedimientos para transformar células están establecidos en el estado de la técnica y suficientemente conocidos por la persona experta. En principio, todas las células son adecuadas como células huésped, es decir, células procariotas o eucariotas. Se da preferencia a aquellas células huésped que permiten una manipulación genéticamente de manera ventajosa, por ejemplo, la transformación con el ácido nucleico o el vector y su establecimiento estable, por ejemplo, hongos unicelulares o bacterias. Además, las células huésped preferidas se caracterizan por una buena capacidad de manipulación microbiológica y biotecnológica. Esto se refiere, por ejemplo, a la fácil capacidad de cultivo, a las altas tasas de crecimiento, a las bajas demandas de medios de fermentación y a las buenas tasas de producción y secreción de proteínas extrañas. Las células huésped preferidas según la invención secretan la proteína expresada (transgénica) en el medio que rodea a las células huésped. Además, las proteasas pueden ser modificadas por las células que las producen después de su preparación, por ejemplo, mediante conexión de moléculas de azúcar, formilación, aminación, etc. Tales modificaciones postraduccionales pueden afectar funcionalmente a la proteasa.
Otras formas de realización preferidas son aquellas células huésped que son regulables en su actividad debido a elementos reguladores genéticos que se proporcionan, por ejemplo, en el vector, pero también pueden estar presentes desde el principio en estas células. Por ejemplo, mediante la adición controlada de compuestos químicos que sirven como activadores, cambiando las condiciones de cultivo o cuando se alcanza una cierta densidad celular, estos pueden ser estimulados para la expresión. Esto permite una producción económica de las proteínas según la invención. Un ejemplo de tal compuesto es IPTG como se describió anteriormente.
Las células huésped preferidas son células procariotas o bacterianas. Las bacterias se caracterizan por tiempos de generación cortos y bajas demandas en las condiciones de cultivo. Como resultado, se pueden establecer procedimientos de cultivo o procedimientos de fabricación rentables. Además, la persona experta tiene una gran
experiencia en tecnología de fermentación en el caso de bacterias. Para una producción particular, las bacterias gramnegativas o grampositivas pueden ser adecuadas por las más diversas razones que se determinarán experimentalmente en casos individuales, como fuentes de nutrientes, tasa de formación de productos, requisitos de tiempo, etc.
En el caso de bacterias gramnegativas como Escherichia coli, se secreta una gran cantidad de proteínas en el espacio periplásmico, es decir, en el compartimento entre las dos membranas que encierran las células. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. Además, las bacterias gramnegativas también pueden diseñarse de tal manera que descarguen las proteínas expresadas no solo en el espacio periplásmico, sino también en el medio que rodea a la bacteria. Las bacterias grampositivas como, por ejemplo, bacilos o actinomicetos u otros representantes de Actinomycetales, por otro lado, no tienen membrana externa, por lo que las proteínas secretadas se liberan inmediatamente en el medio que rodea a las bacterias, generalmente el medio nutriente, a partir del cual se pueden purificar las proteínas expresadas. Pueden aislarse directamente del medio o seguir procesándose. Además, las bacterias grampositivas están relacionadas con, o son idénticas a, la mayoría de los organismos de origen para enzimas técnicamente importantes y generalmente forman enzimas comparables, de modo que tienen un uso de codón similar y su aparato de síntesis de proteínas está naturalmente alineado en consecuencia.
Las células huésped según la invención pueden ser modificadas con respecto a sus requisitos para las condiciones de cultivo, tener marcadores de selección distintos o adicionales o expresar proteínas distintas o adicionales. En particular, también puede tratarse de tales células huésped que expresan de manera transgénica varias proteínas o enzimas.
La presente invención es en principio aplicable a todos los microorganismos, en particular a todos los microorganismos fermentables, de modo particularmente preferible a los del género Bacillus, y conduce a que las proteínas según la invención pueden ser preparadas por medio del uso de tales microorganismos. Tales microorganismos representan entonces células huésped para los fines de la invención.
En otra forma de realización de la invención, la célula huésped se caracteriza porque es una bacteria, preferiblemente una que se selecciona del grupo de los géneros de Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas y Pseudomonas, más preferiblemente una que se selecciona del grupo de Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor y Stenotrophomonas maltophilia.
La célula huésped también puede ser una célula eucariótica que se caracteriza porque tiene un núcleo celular. Otro objeto de la invención es, por lo tanto, una célula huésped que se caracteriza porque tiene un núcleo celular. A diferencia de las células procariotas, las células eucariotas son capaces de modificar la proteína formada después de la traducción. Algunos ejemplos son hongos como Actinomycetes o levaduras como Saccharomyces o Kluyveromyces. Esto puede ser particularmente ventajoso, por ejemplo, si las proteínas van a sufrir modificaciones específicas en relación con su síntesis que permiten tales sistemas. Las modificaciones que realizan los sistemas eucariotas, particularmente en relación con la síntesis de proteínas, incluyen, por ejemplo, la unión de compuestos de bajo peso molecular, como anclajes de membrana u oligosacáridos. Tales modificaciones de oligosacáridos pueden ser deseables, por ejemplo, para reducir el potencial alergénico de una proteína expresada. La coexpresión con las enzimas formadas naturalmente por tales células, como las celulasas, también puede ser ventajosa. Además, por ejemplo, los sistemas de expresión fúngicos termófilos pueden ser particularmente adecuados para la expresión de proteínas, o variantes, resistentes a la temperatura.
Las células huésped de la invención se cultivan y fermentan de la manera habitual, por ejemplo, en sistemas discontinuos o continuos. En el primer caso, se inocula un medio de cultivo adecuado con las células huésped y el producto se cosecha del medio después de un período de tiempo a determinar experimentalmente. Las fermentaciones continuas se caracterizan por lograr un equilibrio de flujo en el que las células mueren parcialmente durante un período de tiempo comparativamente largo, pero también vuelven a crecer y, al mismo tiempo, la proteína formada puede eliminarse del medio.
Las células huésped según la invención se utilizan preferentemente para preparar proteasas según la invención. Otro objeto de la invención es, por lo tanto, un procedimiento para preparar una proteasa que comprende
a) Cultivar una célula huésped según la invención, y
b) Aislar la proteasa del medio de cultivo o de la célula huésped.
Este objeto de la invención comprende preferentemente procedimientos de fermentación. Los procedimientos de fermentación se conocen per se a partir del estado de la técnica y representan la etapa de producción propia a gran escala, generalmente seguida de un procedimiento de purificación adecuado del producto preparado; por ejemplo, las proteasas según la invención. Todos los procedimientos de fermentación basados en un procedimiento
correspondiente para preparar una proteasa según la invención representan formas de realización de este objeto de la invención.
Los procedimientos de fermentación que se caracterizan porque la fermentación se lleva a cabo a través de una estrategia de alimentación son particularmente relevantes. En tal caso se agregan los componentes de los medios que son consumidos por el cultivo continuo. Como resultado se pueden lograr aumentos considerables tanto en la densidad celular como también en la masa celular o masa seca y/o en particular en la actividad de la proteasa de interés. Además, la fermentación también se puede diseñar para que los productos metabólicos no deseados se filtren o neutralicen agregando reguladores o contraiones adecuados.
La proteasa preparada se puede cosechar del medio de fermentación. Tal procedimiento de fermentación es preferible al aislamiento de la proteasa de la célula huésped, es decir, a una preparación de producto a partir de la masa celular (masa seca), pero requiere la provisión de células huésped adecuadas o de uno o más marcadores o mecanismos de secreción adecuados y/o de sistemas de transporte para que las células huésped secreten la proteasa en el medio de fermentación. Sin secreción, puede tener lugar alternativamente el aislamiento de la proteasa de la célula huésped, es decir, una purificación de la misma a partir de la masa celular, por ejemplo, por medio de precipitación con sulfato de amonio o etanol, o por medio de purificación cromatográfica.
Todos los hechos expuestos anteriormente pueden combinarse en procedimientos para preparar proteasa según la invención.
Otro objeto de la invención es un agente que se caracteriza porque contiene una proteasa según la invención como se describió anteriormente. El agente es preferido como detergente o agente de limpieza.
Esta invención incluye todos los tipos concebibles de detergentes o agentes de limpieza, tanto concentrados como también productos sin diluir, para su uso a escala comercial, en la lavadora o en el lavado o limpieza de manos. Estos incluyen, por ejemplo, detergentes para textiles, alfombras o fibras naturales, para los cuales se utiliza el término detergente. Estos incluyen, por ejemplo, detergentes lavavajillas para máquinas lavavajillas o detergentes para lavar manualmente vajillas o limpiadores para superficies duras como metal, vidrio, porcelana, cerámica, azulejos, piedra, superficies lacadas, plásticos, madera o cuero, para los cuales se utiliza el término agente de limpieza, es decir, además de detergentes manuales y mecánicos para lavavajillas también, por ejemplo, abrasivos, limpiacristales, descargadores de fragancias de inodoros, etc. Los detergentes y agentes de limpieza en el contexto de la invención también incluyen auxiliares de lavado que se añaden al propio detergente en el lavado textil manual o mecánico para lograr un efecto adicional. Además, los detergentes y agentes de limpieza en el contexto de la invención también incluyen agentes de pretratamiento y postratamiento de textiles, es decir, aquellos agentes con los que el artículo de lavandería se pone en contacto antes del propio lavado, por ejemplo, para disolver la suciedad persistente, y también aquellos agentes que confieren propiedades deseables adicionales tales como agarre agradable, libertad de arrugas o baja carga estática en una etapa posterior al propio lavado textil. Este último medio, entre otros, incluye suavizantes de telas.
Los detergentes o agentes de limpieza según la invención, que pueden presentarse como sólidos en polvo, en forma de partículas compactadas posteriormente, como soluciones homogéneas o suspensiones, pueden contener, además de una proteasa según la invención, todos los ingredientes conocidos y habituales en tales agentes; preferiblemente al menos un ingrediente adicional está presente en la composición. Los agentes de la invención pueden contener en particular tensioactivos, agentes secuestrantes (sustancias estructurales), compuestos de peroxígeno o activadores de blanqueamiento. Además, pueden contener disolventes orgánicos miscibles en agua, otras enzimas, agentes secuestrantes, electrolitos, reguladores de pH y/u otras sustancias auxiliares como abrillantadores ópticos, inhibidores de manchas grises y reguladores de espuma, así como colorantes y fragancias y combinaciones de los mismos.
En particular, una combinación de una proteasa según la invención con uno o más ingredientes adicionales del agente es ventajosa, ya que tal agente en configuraciones preferidas según la invención tiene un rendimiento de limpieza mejorado por las sinergias resultantes. En particular, mediante la combinación de una proteasa según la invención con un tensioactivo y/o un secuestrante (sustancia de estructura) y/o un compuesto de peroxígeno y/o un activador de blanqueamiento, se puede lograr tal sinergia. Sin embargo, en formas de realización preferidas, el agente según la invención puede no contener ácido bórico.
Los ingredientes ventajosos de los agentes según la invención se divulgan en la solicitud internacional de patente WO2009/121725, comenzando allí en la página 5, penúltimo párrafo, y terminando en la página 13 después del segundo párrafo. Se hace referencia explícita a esta divulgación y el contenido de la divulgación en ella se incluye en la presente solicitud de patente.
Un agente según la invención contiene ventajosamente la proteasa en una cantidad de 2 |jg a 20mg, preferiblemente de 5 jg a 17,5mg, más preferiblemente de 20 jg a 15mg y más preferiblemente de 50 jg a 10mg por g del agente. Además, la proteasa contenida en el agente, y/u otros ingredientes del agente, pueden recubrirse con una sustancia impermeable a la enzima a temperatura ambiente o en ausencia de agua, que se vuelve permeable a la enzima en condiciones de uso del agente. Por tanto, tal forma de realización de la invención se caracteriza porque la proteasa
está recubierta con una sustancia impermeable a la proteasa a temperatura ambiente o en ausencia de agua. Además, el detergente o el agente de limpieza mismos pueden envasarse en un recipiente, preferiblemente un recipiente permeable al aire, del que se liberan poco antes de su uso o durante el procedimiento de lavado.
En otras formas de realización de la invención, el agente se caracteriza porque
a) está en forma sólida, en particular como polvo de flujo libre con una densidad aparente de 300 g/l a 1200 g/l, en particular de 500 g/l a 900 g/l, o
b) está en forma pastosa o líquida, y/o
c) está en forma de gel o de bolsa de dosificación (pouches), y/o
d) está disponible como sistema monocomponente, o
e) se divide en varios componentes.
Estas formas de realización de la presente invención comprenden todas las formas farmacéuticas sólidas, en polvo, líquidas, en gel o pastosas de los agentes según la invención, que opcionalmente también pueden componerse de varias fases y pueden estar presentes en forma comprimida o no comprimida. El agente puede estar presente como un polvo de flujo libre, en particular con una densidad aparente de 300 g/l a 1200 g/l, en particular 500 g/l a 900 g/l o 600 g/l a 850 g/l. Las formas de dosificación sólidas del agente también incluyen extrudidos, gránulos, tabletas o bolsas. Alternativamente, el agente también puede ser líquido, tener forma de gel o de pasta, por ejemplo, estar en forma de detergente líquido no acuoso o de pasta no acuosa o en forma de detergente líquido acuoso o de pasta acuosa. Además, el agente puede estar presente como un sistema de un solo componente. Dichos agentes se componen de una fase. Alternativamente, un agente también puede componerse de varias fases. Por lo tanto, dicho agente se divide en varios componentes.
Los detergentes o agentes de limpieza según la invención pueden contener exclusivamente una sola proteasa. Alternativamente, también pueden contener otras enzimas hidrolíticas u otras enzimas en una concentración conveniente para la eficacia del agente. Otra forma de realización de la invención representa por tanto agentes que comprenden además una o más enzimas adicionales. Otras enzimas adecuadas utilizadas preferiblemente son todas las enzimas que pueden desplegar actividad catalítica en el agente inventivo, en particular lipasa, amilasa, celulasa, hemicelulasa, mananasa, tannasa, xilanasa, xantanasa, xiloglucanasa, 13-glucosidasa, pectinasa, carragenasa, perhidrolasa, oxidasa, oxidorreductasa u otras proteasas distinguibles de la proteasa según la invención, y mezclas de las mismas. Otras enzimas están ventajosamente contenidas en el agente en una cantidad de 1*10'8 a 5 por ciento en peso con respecto a la proteína activa. Progresivamente se prefiere que cada enzima adicional esté contenida en una cantidad de 1 x 10-7-3 % en peso, de 0,00001-1 % en peso, de 0,00005-0,5 % en peso, de 0,0001 a 0,1 % en peso y de modo particularmente preferible de 0,0001 a 0,05 % en peso en agentes según la invención, con respecto a la proteína activa. De modo particularmente preferible, las enzimas muestran un rendimiento de limpieza sinérgico frente a determinada suciedad o determinadas manchas, es decir, las enzimas contenidas en el agente se apoyan mutuamente en su rendimiento de limpieza. De modo muy particularmente preferible, tal sinergismo está presente entre la proteasa contenida según la invención y una enzima adicional de un agente según la invención, incluyendo en particular entre dicha proteasa y una amilasa y/o una lipasa y/o una mananasa y/o una celulasa y/o una pectinasa. Los efectos sinérgicos pueden ocurrir no solo entre diferentes enzimas, sino también entre una o más enzimas y otros ingredientes del agente según la invención.
En los agentes de limpieza descritos en la presente invención, las enzimas que se utilizarán también pueden prepararse junto con las sustancias acompañantes, por ejemplo, por medio de la fermentación. En formulaciones líquidas, las enzimas se utilizan preferentemente como formulación o formulaciones enzimáticas líquidas.
Las enzimas generalmente no se proporcionan en forma de proteína pura, sino más bien en forma de preparaciones estabilizadas, almacenables y transportables. Estas preparaciones realizadas previamente incluyen, por ejemplo, las preparaciones sólidas obtenidas mediante granulación, extrusión o liofilización o, en particular en el caso de agentes líquidos o en forma de gel, soluciones de las enzimas, ventajosamente tan concentradas como sea posible, bajas en agua y/o mezcladas con estabilizadores u otros auxiliares.
Alternativamente, las enzimas pueden encapsularse tanto para la forma de presentación sólida como también para la líquida, por ejemplo, mediante secado por pulverización o extrusión de la solución enzimática junto con un polímero preferiblemente natural o en forma de cápsulas, por ejemplo, aquellas en las que las enzimas están encerradas como en un gel solidificado o en aquellas del tipo núcleo-cáscara, en las que un núcleo que contiene enzimas está revestido con una capa protectora impermeable al agua, al aire y/o a productos químicos. En capas depositadas, pueden aplicarse adicionalmente otros ingredientes activos, por ejemplo, estabilizadores, emulsionantes, pigmentos, blanqueadores o colorantes. Cápsulas de este tipo se aplican mediante procedimientos conocidos per se, por ejemplo, mediante granulación con agitación o rodillo o en procedimientos de lecho fluidizado. Aplicando formadores de película poliméricos, por ejemplo, los gránulos de este tipo son ventajosamente bajos en polvo y estables debido al recubrimiento.
Además, es posible combinar dos o más enzimas juntas, de modo que un solo granulado presente varias actividades enzimáticas.
Las enzimas también se pueden introducir en películas solubles en agua, como las que se utilizan, por ejemplo, en la preparación de detergentes y agentes de limpieza en forma de dosis unitarias. Una película de este tipo permite la liberación de las enzimas después del contacto con el agua. Tal como se usa aquí, "soluble en agua" se refiere a una estructura de película que es de preferencia completamente soluble en agua. Preferiblemente, dicha película se compone de polialcohol vinílico (PVA (total o parcialmente hidrolizado).
Otro objeto de la invención es un procedimiento para limpiar textiles o superficies duras, que se caracteriza porque en al menos una etapa procedimental se utiliza un agente según la invención, o porque en al menos una etapa del procedimiento una proteasa según la invención se vuelve catalíticamente activa, en particular de modo que la proteasa se utilice en una cantidad de 40 |jg a 4g, preferiblemente de 50 |jg a 3g, de modo particularmente preferible de 100 |jg a 2g y de modo muy particularmente preferible de 200 jg a 1g.
En diversas formas de realización, el procedimiento descrito anteriormente se caracteriza porque la proteasa se usa a una temperatura de 0-100 °C, preferiblemente 0-60 °C, más preferiblemente 20-40 °C y del modo más preferible a 20 °C.
Esto incluye tanto los procedimientos manuales como también los mecánicos, en cuyo caso se prefieren los procedimientos mecánicos. Los procedimientos para limpiar textiles generalmente se caracterizan porque se aplican diversas sustancias activas de limpieza al material que debe limpiarse en varias etapas procedimentales y se lavan después del tiempo de exposición, o porque el material que debe limpiarse se trata de otra manera con un detergente o una solución o dilución de este agente. Lo correspondiente es válido para los procedimientos de limpieza de todos los materiales que no sean textiles, en particular las superficies duras. Todos los procedimientos concebibles de lavado o limpieza pueden enriquecerse en al menos una de las etapas procedimentales mediante la aplicación de un detergente o agente de limpieza según la invención o de una proteasa según la invención y entonces representan formas de realización de la presente invención. Todos los hechos, objetos y formas de realización descritos para la proteasa según la invención y para los agentes que la contienen también son aplicables a este objeto de la invención. Por lo tanto, en este punto se hace referencia expresa a la divulgación en el lugar correspondiente con la indicación de que esta divulgación también se aplica a los procedimientos anteriores según la invención.
Dado que las proteasas según la invención naturalmente ya tienen una actividad hidrolítica y también la despliegan en medios que de otro modo no tienen poder de limpieza como, por ejemplo, en mero regulador, una única y/o la única etapa de tal procedimiento puede consistir en que, como único componente activo de limpieza, una proteasa según la invención se pone en contacto con la suciedad, preferiblemente en una solución reguladora o en agua. Esto representa otra forma de realización de este objeto de la invención.
Las formas de realización alternativas de este objeto de la invención también representan procedimientos para el tratamiento de materias primas textiles o para el cuidado de textiles, en cuyo caso, en al menos una etapa del procedimiento, se activa una proteasa según la invención. Entre estos se prefieren procedimientos para materias primas textiles, fibras o textiles con componentes naturales, y muy particularmente para aquellos con lana o seda.
Finalmente, la invención también incluye el uso de las proteasas descritas en la presente publicación en detergentes o agentes de limpieza, por ejemplo, como se describió anteriormente, para la eliminación (mejorada) de suciedad que contiene proteínas, por ejemplo, en textiles o superficies duras.
Todos los hechos, objetos y formas de realización descritos para la proteasa según la invención y las agentes que la contienen también son aplicables a este objeto de la invención. Por lo tanto, en este punto se hace referencia expresa a la divulgación en el lugar correspondiente con la indicación de que esta divulgación también se aplica al uso anterior según la invención.
Ejemplos
Resumen general de las mutaciones:
Esta invención se refiere a una proteasa alcalina del tipo subtilisina de Bacillus pumilus. Las variantes de esta proteasa se prepararon por mutagénesis aleatoria y luego se clasificaron, entre otras cosas, para mejorar el rendimiento de lavado. De esta manera, se generaron mutantes mejorados tanto en rendimiento como en estabilidad a partir de la proteasa de tipo silvestre mencionada anteriormente (SEQ ID NO: 1) mediante mutagénesis propensa a errores seguida de recombinación. A uno de estos mutantes (mutante 1; SEQ ID NO: 2), que, aunque de igual rendimiento, mejoró significativamente en su estabilidad, se aplicaron dos rondas independientes propensas a error. Por lo tanto, todos los mutantes 2-18 mencionados aquí también portan las mutaciones del mutante 1. Los mutantes 2, 4, 8 y 9 son acordes con la invención.
continuación
Ejemplo 1: Prueba de lavado
Matriz de detergente utilizada
Esta es la matriz detergente (disponible comercialmente, sin enzimas, abrillantador óptico, perfumes y colorantes) utilizados para la prueba de lavado:
Ensayos de actividad de la proteasa
La actividad de la proteasa se determina por medio de la liberación del cromóforo para-nitroanilina del sustrato succinilo alanina-alanina-prolina-fenilalanina para-nitroanilida (AAPFpNA; Bachem L-1400). La liberación de pNA provoca un aumento de la absorbancia a 410 nm, cuyo curso temporal es una medida de la actividad enzimática.
La medición se llevó a cabo a una temperatura de 25 °C, a pH 8,6 y una longitud de onda de 410 nm. El tiempo de medición fue de 5 min con un intervalo de medición de 20 a 60 segundos.
Enfoque de medición:
10 |jL de solución de AAPF (70 mg/ml)
1000 j L Tris/HCI (0,1 M; pH 8,6 con Brij 35 al 0,1%)
10 j L de solución diluida de proteasa
Cinética creada durante 5 min a 25 °C (410 nm)
Prueba de lavado y resultados
Prueba de lavado con sobrenadantes de cultivo de Bacillus subtilis que contienen mutantes de proteasa tamizados por medio de expresión heteróloga. Los sobrenadantes se utilizan con la misma actividad que el punto de referencia
= molécula de partida para esta ronda de mutagénesis (mutante 1 según SEQ ID NO:2) con una concentración disponible comercialmente para proteasas en detergentes.
Condiciones: 40°C, 16°dH agua, 1 h
Suciedad:
1. CFT CS038
2. CFT PC-10
3. WfK 10N
4. CFT C-03
5. EMBA 112
6. CFT C-05
Poner telas perforadas (diámetro=10 mm) en placa de microtitulación, ajustar previamente la temperatura del licor de lavado a 40 °C, concentración final 4,7 g/L, proporcionar lejía y enzima a la suciedad, incubar durante 1 h a 40 °C y 600 rpm, luego enjuagar la suciedad varias veces con agua limpia, dejar secar y determinar la claridad con un colorímetro. Cuanto más clara se vuelve la tela, mejor es el rendimiento de limpieza. Aquí se mide el valor L = claridad, cuanto más alto, más claro. Se indica la suma de las 6 suciedades en % con respecto al mutante según SEQ ID NO:2.
Todas las variantes muestran un mayor rendimiento de lavado en comparación con la variante estabilizada (mutante 1 según SEQ ID NO:2).
Ejemplo 2: Estabilidad durante almacenamiento de las enzimas en detergentes
Ensayos de actividad de proteasa
El ensayo de actividad de la proteasa se realiza como se describió anteriormente.
Matriz de detergente utilizada
Se utiliza la misma matriz de detergente descrita anteriormente. Esta matriz está provista de ácido bórico al 1% para las mediciones con estabilizador.
Resultados de las pruebas de almacenamiento
Al mismo nivel de actividad, las proteasas se introducen revolviendo en una matriz detergente y se almacenan a 30 °C. Mediante un ensayo de actividad habitual para proteasas (hidrólisis de suc-AAPFpNA), la actividad inicial y la actividad residual de la proteasa se mide después de 4 semanas de almacenamiento a 30 °C.
Para generar condiciones adversas, las proteasas se almacenan una vez en una matriz detergente sin estabilizador (ácido bórico) y para comparación una vez con ácido bórico.
Las proteasas están presentes en sobrenadantes de Bacillus subtilis generados en matraces sacudidos. Se diluyen a un mismo nivel de actividad. La matriz detergente al 50% /- ácido bórico se mezcla con el sobrenadante de proteasa de Bacillus subtilis correspondientemente diluido al 50% y se mezcla bien. Los frascos sellados se incuban a 30°C. En el momento de la toma de muestra, se toma una cierta cantidad de mezcla matriz/proteasa y se disuelve agitando durante 20 min a temperatura ambiente en el regulador de la muestra (Tris/HCI de 0,1 M, pH 8,6). Luego, el ensayo AAPF se realiza como se describió anteriormente.
Se ha demostrado que 12 mutantes son ventajosos, la actividad se muestra en % del valor inicial, con respecto al tipo silvestre. Este se midió directamente después de mezclar las proteasas con la matriz y se establece respectivamente al 100%.
Se puede ver claramente que todos los mutantes muestran una estabilidad muy mejorada sin adición de ácido bórico en comparación con el tipo silvestre y también tienen una estabilidad mejorada en comparación con el mutante inicial para esta ronda propensa a errores (es decir, mutante 1 según SEQ ID NO: 2). Los mutantes generados también son mucho más estables con ácido bórico que el tipo silvestre o el mutante 1. Todos los mutantes muestran un rendimiento de lavado comparable al del tipo silvestre, es decir, son como máximo un 10% peores en el rendimiento de lavado, lo cual está en el marco de la fluctuación de medición (resultados no mostrados).
Claims (12)
1. Proteasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO:1 en toda su longitud y tiene una sustitución de aminoácidos en al menos una de las posiciones correspondientes a las posiciones N144 o S224, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO: 1, en donde la al menos una sustitución de aminoácido se selecciona del grupo formado por N144K, S224A y S224T, cada uno con respecto a la numeración según SEQ ID NO:1.
2. Proteasa según la reivindicación 1, en donde la proteasa comprende una de las siguientes variantes de sustitución de aminoácidos, cada una con respecto a la numeración según SEQ ID NO: 1:
i) P9T, S216C, Q271E, N144K y N252T;
ii) P9T, S216C, Q271E y S224T;
iii) P9T, S216C, Q271E, T78S y S224A; o
iv) P9T, S216C, Q271E; T133R y S224A.
3. Proteasa, caracterizada porque
(a) se puede obtener de una proteasa según la reivindicación 1 o 2 como molécula de partida por medio de una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO: 1; y/o
(b) se puede obtener de una proteasa según la reivindicación 1 o 2 como molécula de partida por medio de fragmentación, mutagénesis por deleción, inserción o sustitución y comprende una secuencia de aminoácidos que coincide con la molécula de partida en una longitud de al menos 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 o 275 aminoácidos relacionados, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones, correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO:1.
4. Procedimiento para preparar una proteasa que comprenda la sustitución de un aminoácido al menos en una de las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 en SEQ ID NO: 1, en una proteasa inicial que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos especificada en SEQ ID NO: 1 en toda su longitud, preferiblemente de tal manera que la proteasa comprenda en al menos una posición la sustitución de aminoácidos N144K, S224A o S224T.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, que comprende además una o ambas de las siguientes etapas procedimentales:
a) sustituir al menos un aminoácido por medio de sustitución conservadora sencilla o múltiple de aminoácidos, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO:1;
b) cambiar la secuencia de aminoácidos por medio de fragmentación, mutagénesis por deleción, inserción o sustitución de tal manera que la proteasa comprenda una secuencia de aminoácidos que coincida con la molécula original en una longitud de al menos 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 o 275 aminoácidos relacionados, en donde la proteasa comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos N144K, S224A o S224T en las posiciones correspondientes a las posiciones 144 y 224 según SEQ ID NO: 1.
6. Ácido nucleico que codifica una proteasa según una de las reivindicaciones 1-3 o que codifica una proteasa obtenible por medio de un procedimiento según una de las reivindicaciones 4-5.
7. Vector que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 6, en particular un vector de clonación o un vector de expresión.
8. Célula huésped no humana que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 6 o un vector según la reivindicación 7, o que comprende una proteasa según una de las reivindicaciones 1-3, o que comprende una proteasa obtenible por medio de un procedimiento de las reivindicaciones 4-5.
9. Procedimiento de preparación de una proteasa que comprende
a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 8; y
b) aislar la proteasa del medio de cultivo o de la célula huésped.
10. Agente, en particular un detergente o un agente de limpieza, caracterizado porque contiene al menos una proteasa según una de las reivindicaciones 1-3 o una proteasa obtenible por medio de un procedimiento de las reivindicaciones 4-5.
11. Procedimiento para limpiar textiles o superficies duras, caracterizado porque en al menos una etapa del procedimiento se aplica un agente según la reivindicación 10, o porque en al menos una etapa del procedimiento se aplica una proteasa según una de las reivindicaciones 1-3 o una proteasa obtenible por medio de un procedimiento de las reivindicaciones 4-5.
12. Uso de una proteasa según una de las reivindicaciones 1-3 o de una proteasa obtenible por medio de un procedimiento de las reivindicaciones 4-5 en un detergente o un agente limpiador para eliminar la suciedad que contiene péptidos o proteínas.
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