ES2933558T3 - Proteínas de fusión que comprenden porciones de unión a PDGF y VEGF y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Proteínas de fusión que comprenden porciones de unión a PDGF y VEGF y métodos de uso de las mismas Download PDF

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Abstract

La presente proporciona proteínas de fusión que comprenden porciones de unión a PDGF y VEGF, y partículas virales recombinantes que codifican las proteínas de fusión. También se proporcionan composiciones que comprenden las proteínas de fusión y las partículas víricas, así como los métodos de uso de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión que comprenden porciones de unión a PDGF y VEGF y métodos de uso de las mismas
REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD RELACIONADA
La presente solicitud reivindica el beneficio en virtud de la sección 119(e) del título 35 del USC de la solicitud de patente provisional de EE. UU. previa en tramitación junto con la presente N.° 61/780.914, presentada el 13 de marzo de 2013.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere, en general, a proteínas de fusión que inhiben la vía de PDGF y la vía de VEGF, a composiciones de estas proteínas de fusión, así como a métodos de producción y uso de las mismas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La formación de nuevos vasos sanguíneos, causada por la producción en exceso de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), es un componente clave de enfermedades como el crecimiento tumoral, la degeneración macular senil (DMS) y la retinopatía diabética proliferativa (RDP) (Connolly et al., J Clin Invest., 1989, 84(5):1470-8; Ferrara et al., Biochem Biophys Res Commun., 1989, 161 (2):851 -9; y Ferrara et al., NatMed., 1998, 4(3):336-40). La DMS húmeda es la forma más grave de la enfermedad de DMS que se caracteriza por la neovascularización anormal debajo de la retina y frecuentemente conduce a pérdida de visión permanente. El bloqueo de VEGF con anticuerpos, receptores de VEGF soluble, o la inhibición de la actividad de tirosina cinasas de receptores de VEGF, son estrategias que han mostrado resultados preclínicos y clínicos prometedores en la supresión de la neovascularización retiniana (Aiello et al., PNAS, 1995, 92:10457-10461 y Willet, et al., NatMed., 2004, 10:145-147). Sin embargo, datos clínicos recientes muestran que el nuevo tejido vascular no remite normalmente con la inhibición de VEGF sola, debido a que los pericitos, que interactúan con las células endoteliales y contribuyen al establecimiento de la barrera hematorretiniana, proporcionan señales de supervivencia a las células endoteliales neovasculares y, por lo tanto, hacen que sean resistentes a la retirada de VEGF (Benjamin et al., Development, 1998, 125(9)1591-8 y Patel S., Retina, 2009, 29(6 Suppl):S45-8). Además, la isoforma B del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-B) y el receptor beta de PDGF (PDGFRp), encontrados en membranas retinianas proliferativas, tienen funciones importantes en el reclutamiento de pericitos para la estabilización de la vasculatura en desarrollo (Robbins et al., Invest Opth Vis Sci., 1994, 35(10):3649-63; Lindahl et al., Development, 1997, 124:3943-3953; y Hellstrom et al., Development, 1999, 126:3047-3055).
La función de unión a VEGF de VEGFR1 (Flt-1) ha sido cartografiada en el segundo dominio extracelular (ECD) (Davis-Smyth et al., EMBO J., 1996, 15:4919-4927; Barleon et al., J Biol Chem., 1997, 272:10382-10388; Wiesmann et al., Cell, 1997, 91:695-704; y Davis-Smyth et al., JBiol Chem., 1998, 273:3216-3222). Una forma alternativamente cortada y empalmada que existe de forma natural del receptor de unión a VEGF de alta afinidad, VEGFR1 soluble (sFlt1), existe como una proteína secretada que funciona principalmente como un receptor señuelo (Shibuya et al., Oncogene, 1990, 5:519-524 y Kendall et al., PNAS, 1993, 90:10705-10709). Un receptor soluble, VEGF-Trap, manipulado para uso terapéutico, tiene el segundo dominio de VEGFR1 fusionado con el tercer dominio de VEGFR2 (KDR) y con la región Fc de IgG1 humana (Holash et al. 2002). Se mostró previamente que una región extracelular de PDGFRp antagonizaba respuestas estimuladas por PDGF-B (Duan et al., J Biol Chem, 1991,266(1 )413-8 y Ueno et al., Science, 1991, 252(5007):844-8). Estudios con la quimera PDGFRp-Fc demostraron que los eCD 1 a 3 de PDGFRp humano son suficientes para la unión al ligando PDGF-B de alta afinidad (Heidaran et al., FASEB J., 1995, 9(1): 140-5 y Lokker et al., J Biol Chem, 1997, 272(52):33037-44). Un efecto de predimerización sobre la unión al ligando PDGF-B de alta afinidad también se describió cuando los ECD 1 a 3 de PDGFRp se fusionaron con el dominio de glutatión S-transferasa (GST) (Leppanen et al., Biochemistry, 2000, 39(9):2370-5).
Los actuales tratamientos del ojo requieren inyecciones intravítreas mensuales durante años por un especialista en la retina. Por lo tanto, existe una necesidad de agentes terapéuticos mejorados y un enfoque para administrar dichos agentes terapéuticos a sitios, tales como el ojo.
El documento de patente US 2006/0234347 A1 se refiere a proteínas de receptores solubles multivalentes que se unen a más de un factor angiogénico. El documento de patente US 2011/0177074 A1 se refiere a antagonistas de PDGFRp y VEGF-A, que incluyen neutralizar anticuerpos anti-PDGFRp y anti-VEGF-A, así como a composiciones y métodos relacionados. El documento de patente CA 2831161 A1 se refiere a una proteína de fusión de un receptor de VEGF y receptor de FGF para inhibir la angiogénesis y a usos del mismo. El documento de patente WO 2009/105669 A2 se refiere a un antagonista de fusión de VEGF que comprende un receptor de VEGF fusionado con una molécula de cadena pesada de IgG. Ozawa et al. en: Proceedings of the 100th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 18-22 de abril de 2009; Denver, CO. Philadelphia (PA): Resumen 5609, se refiere a un gen de fusión novedoso de KDR (VEGFR II)-PDGFR-alfa en glioblastoma. El documento de patente CN 102311502 A se refiere a una proteína de fusión que puede inhibir simultáneamente PDGF y VEGF.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
La divulgación en el presente documento se refiere, entre otras cosas, a proteínas de fusión que inhiben la vía de PDGF y la vía de VEGF, a composiciones que comprenden estas proteínas de fusión y a composiciones que comprenden partículas víricas que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión, así como a métodos de producción y uso de estas proteínas de fusión y partículas víricas para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, tal como una enfermedad ocular, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, o cáncer.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende (a) una porción extracelular de un receptor de PDGF, (b) una porción extracelular de un receptor de VEGF y (c) un dominio de multimerización, en donde las proteínas de fusión se unen a un PDGF y un VEGF. Según la invención, la proteína de fusión está dispuesta de extremo N a extremo C en el siguiente orden: (a), (b) y (c). Según la invención, el receptor de PDGF es un PDGFRp. Según la invención, la porción extracelular de PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1 -D3 de PDGFR. En algunas realizaciones en el presente documento, la porción extracelular de PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D4 de PDGFR. En algunas realizaciones en el presente documento, la porción extracelular de PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D5 de PDGFR. En algunas realizaciones en el presente documento, la porción extracelular de PDGFR comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o 3, o una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o 3. Según la invención, la porción extracelular del receptor de VEGF consiste en el dominio de tipo Ig D2. En algunas realizaciones en el presente documento, la porción extracelular del receptor de VEGF consiste en un dominio de tipo Ig D2 de un VEGFR1 (FLT-1). En algunas realizaciones, la porción extracelular del receptor de VEGF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 4. Según la invención, la proteína de fusión comprende un péptido conector entre la porción extracelular de PDGFR y la porción extracelular del receptor de VEGF que comprende Ser9 (SEQ ID NO: 49), y un conector entre el receptor de VEGF y el dominio de multimerización que comprende Gly9 (SEQ ID NO: 47). Según la invención, el dominio de multimerización comprende una región Fc de un anticuerpo IgG1. En algunas realizaciones en el presente documento, la región Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones en el presente documento, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o 15, o una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 13 o 15. En algunas realizaciones en el presente documento, la proteína de fusión está en una forma multimérica. En algunas de las realizaciones en el presente documento, la proteína de fusión está en una forma dimérica.
Una proteína de fusión se puede producir cultivando una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión desveladas en el presente documento en una condición tal que produce la proteína de fusión, y recuperando la proteína de fusión producida por la célula hospedadora.
En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión comprende cualquiera de las proteínas de fusión de la invención.
En otro aspecto más, la invención proporciona una composición que comprende cualquiera de las proteínas de fusión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Aún en otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión de la invención.
En algunos aspectos, la invención también proporciona una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas de fusión de la invención.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método de producción de una proteína de fusión, que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión de la invención en una condición que produce la proteína de fusión, y recuperar la proteína de fusión producida por la célula hospedadora. En realizaciones adicionales, la célula hospedadora es una célula de mamífero. En realizaciones adicionales, la célula hospedadora es una célula bacteriana. En realizaciones adicionales, la célula hospedadora es una célula de Escherichia coli.
Por consiguiente, la invención proporciona una proteína de fusión de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína de fusión al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene degeneración macular o retinopatía diabética proliferativa. En una realización adicional, la degeneración macular es degeneración macular senil húmeda o degeneración macular senil seca. En algunas realizaciones en el presente documento, la proteína de fusión se administra por inyección intravítrea al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene artritis reumatoide, osteoartritis o asma. En algunas realizaciones, el sujeto tiene uveítis o neovascularización de la córnea.
En algunos aspectos, la invención proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas de fusión de la invención. En algunas realizaciones, el vector es un vector vírico. En una realización adicional, el vector vírico es un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV). En realizaciones adicionales, el vector de rAAV comprende una ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R o AAVrh10.
En un aspecto, la invención también proporciona una partícula de rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión de la invención. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R o AA Vrh10. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende una ITR de un serotipo diferente del serotipo de la cápside. En una realización adicional, la ITR es una ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh8R o AA Vrh10.
En otro aspecto más, la invención proporciona un método de producción de una partícula de rAAV, que comprende (a) cultivar una célula hospedadora en una condición tal que se producen partículas de rAAV, en donde la célula hospedadora comprende (i) uno o más genes de encapsidación de AAV, en donde cada uno de dicho gen de encapsidación de AAV codifica una proteína de replicación o encapsidación de AAV; (ii) un pro-vector de rAAV que comprende un nucleótido que codifica cualquiera de las proteínas de fusión de la invención flanqueadas por al menos una ITR de AAV, y (iii) una función auxiliar de AAV; y (b) recuperar las partículas de rAAV producidas por la célula hospedadora. En una realización adicional, las partículas de rAAV se purifican.
La invención proporciona una partícula de rAAV de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la partícula de rAAV al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene degeneración macular o retinopatía diabética proliferativa. En una realización adicional, la degeneración macular es degeneración macular senil húmeda o degeneración macular senil seca. En algunas realizaciones en el presente documento, la partícula de rAAV se administra por inyección intravítrea al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene artritis reumatoide, osteoartritis o asma. En algunas realizaciones, el sujeto tiene uveítis o neovascularización de la córnea.
La memoria descriptiva se considera que es suficiente para permitir a un experto en la técnica poner en práctica la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra la generación de receptores PDGFR-p solubles truncados. A) Esquema de formas de dimerización acopladas a Fc de IgG1 de PDGFR-p Fc, PDGFR(D1-D5)9G-Fc, PDGFR(D1-D2)9G-Fc y PDGFR(D1-D3)9G-Fc así como las formas de receptor monomérico de PDGFR-p, p Dg FR(D1-D4) y PDGFR(DG1-D5). Los bloques blancos indican secuencias de PDGFR-p, que incluyen los dominios extracelulares y el péptido señalizador (sp). Los bloques con sombreado diagonal representan conector de 9Gly y los bloques de puntos oscuros representan dominios CH2 y CH3 de la región Fc de IgG1 humana. B) Transferencias Western de sPDGFR-p monomérico y formas de receptor soluble de dimerización acoplado a Fc de IgG1 en condiciones reductoras (panel izquierdo) y no reductoras (panel derecho). La proteína se detectó con anticuerpo anti-PDGFR-p.
La Figura 2 muestra un ensayo de unión volumétrico a PDGF BB de receptores PDGFR-p solubles truncados.
A) Formas de receptores PDGFR-p solubles monoméricos PDGFR(D1-D4) y PDGFR(D1-D5) en comparación con la forma de dimerización acoplada a Fc de IgG1 de tamaño completo forman PDGFR(D1-D5)9G-Fc. B) Formas de receptores sPDGFR-p solubles acoplados a Fc de IgG1 diméricos PDGFR(D1-D2)9G-Fc y PDGFR(D1 -D3)9G-Fc en comparación con la forma de dimerización acoplada a Fc de IgG1 PDGFR(D1 -D5)9G-Fc. Volúmenes crecientes (gl) de medio acondicionado (CM) que contiene receptores solubles (eje x) de transfecciones representativas se incubaron durante la noche con el ligando PDGF BB humano y la cantidad de ligando sin unir (eje y) se midió por ELISA. Los datos se expresaron como media ± DE (n=3); todos los receptores fueron significativamente diferentes en afinidades de unión a PDGF por ANOVA bifactorial; prueba de Bonferroni; ***p<0,001.
La Figura 3 es un esquema de proteínas híbridas VEGFR1/ PDGFR-p y PDGFR-p/VEGFR1, híbridos 1 a 4, y sus construcciones parentales PDGFR(D1-D5)9G-Fc, PDGFR(D1-D3)9G-Fc y sFLT01. Los bloques blancos indican secuencias de PDGFR-p, los bloques grises indican secuencias de VEGFR1 (Flt-1), que incluyen sus dominios extracelulares y péptidos señalizadores (sp). Los bloques con sombreado diagonal representan conectores de 9Gly o 9Ser y los bloques de puntos oscuros representan dominios CH2 y CH3 de la región Fc de IgG1 humana.
La Figura 4 es una transferencia Western de proteínas híbridas VEGFR1/ PDGFR-p y PDGFR-p/VEGFR1, híbridos 1 a 4, en comparación con la forma de dimerización acoplada a Fc de IgG 1 de tamaño completo PDGFR(D1-D5)9G-Fc (mostrada como (D1-D5)9G-Fc) en condiciones reductoras (panel izquierdo) y no reductoras (panel derecho). La proteína se detectó con anticuerpo anti-PDGFR-p y anticuerpo anti-Flt-1. Las muestras que contienen los híbridos 3 y 4 fueron duplicados de transfecciones individuales.
La Figura 5 muestra gráficos que demuestran la inhibición de la proliferación inducida por VEGF e inducida por VEGF PDGF-p de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) por proteína híbrida, híbridos 1 a 4. A) Ensayo de proliferación de HUVEC con VEGF solo: Se comparó el efecto inhibidor de 5 gl de medio acondicionado (CM) que contenía receptores solubles sobre la proliferación de HUVEC en presencia de VEGF (10 ng/ml) solo. B) Ensayo de proliferación competitivo de HUVEC en presencia de VEGF (10 ng/ml) y PDGF (20 ng/ml): Se comparó el efecto inhibidor de 5 gl de CM que contenía receptores solubles sobre la proliferación de HUVEC en presencia de ambos ligandos, VEGF y PDGF. Las muestras de tres transfecciones independientes (n=3) se evaluaron en un ensayo. Los datos se expresaron como media DE. ANOVA unifactorial; prueba de Tukey; ***p<0,001 para la diferencia entre control positivo VEGF+ solo o VEGF+ en combinación con PDGF BB+ frente a otras muestras. Control = CM de EGFP; VEGF+ = CM de EGFP 10 ng/ml de VEGF; BB+ Solo = CM de EGFP 20 ng/ml; VEGF+BB+ = CM de EGFP 10 ng/ml de VEGF 20 ng/ml de PDGF BB.
La Figura 6 muestra ensayos de unión volumétricos de proteínas híbridas. A) Ensayo de unión volumétrico de PDGF BB de proteínas híbridas 1 a 4 en comparación con PDGFR(D1-D5)9G-Fc. B) Ensayo de unión volumétrico de VEGF de proteínas híbridas 1 a 4 en comparación con sFLT01. Se incubaron volúmenes crecientes de medio acondicionado que contenía receptores solubles (eje x) de transfecciones representativas durante la noche con o ligandos PDGF BB humano o VEGF y se midió la cantidad de ligando sin unir (eje y) por ELISA por triplicado.
La Figura 7 muestra ensayos de unión competitivos sin células de VEGF y PDGF de proteínas híbridas. A) Comparación del híbrido 3 (Híb. N.° 3), híbrido 4 (Híb. N.° 4) y PDGFR(D1-D3)9G-Fc en volúmenes crecientes de medio acondicionado (eje x) y la cantidad de ligando de PDGF no unido (eje y) como se mide por ELISA de PDGF BB. B) Comparación del híbrido 3 (Híb. N.° 3), híbrido 4 (Híb. N.° 4) y sFltT01 en volúmenes crecientes de medio acondicionado (eje x) y la cantidad del ligando de VEGF no unido (eje y) como se mide por ELISA de VEGF.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la eficacia in vivo de la administración intravítrea de AAV2.Híbrido 4 en un modelo de neovascularización coroidea (CNV) de ratón por láser. Se comparó el número de quemaduras sin neovascularización (NV) en el ojo tratado (izquierdo) con AAV2.Híbrido 4 (mostrado como Híbrido 4), AAV2.sFLT02 (mostrado como sFLT02), AAV2.PDGFR (mostrado como PDGf R) con el ojo contralateral no tratado (derecho; Intacto). Los datos de ambos ojos (n=20 ojos por tratamiento) se expresaron como el porcentaje de quemaduras sin CNV. La porción de PDGFR usada para la construcción de AAV2.PDGFR fue PDGFR(D1-D3)9G-Fc.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Las realizaciones y descripciones que ya no se encuentran bajo el alcance de las reivindicaciones adjuntas se consideran simplemente ejemplos adecuados para el entendimiento de la invención y no son parte de la invención. La presente divulgación se refiere, entre otras cosas, a proteínas de fusión, y a composiciones de las mismas, que inhiben la vía de señalización del factor de crecimiento derivado del plasma (PDGF) y la vía de señalización del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Una proteína de fusión de la divulgación como se describe en el presente documento comprende una porción extracelular de un receptor de PDGF (PDGFR), una porción extracelular de un receptor de VEGF (VEGFR) y un dominio de multimerización, en donde la proteína de fusión se une a un PDGF y un VEGF para la inhibición de la actividad de PDGF y la actividad de VEGF, respectivamente. En el presente documento también se desvelan métodos para la producción de las proteínas de fusión, métodos de administración de las proteínas de fusión y métodos de uso de las proteínas de fusión en el tratamiento de enfermedades oculares, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y/o cáncer.
I. Técnicas generales
Las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en el presente documento son, en general, bien entendidos y son empleadas comúnmente usando metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow y Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6a ed., J. Wiley y Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., J. Wiley y Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley y Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Definiciones
Un "vector," como se usa en el presente documento, se refiere a un plásmido o virus recombinante que comprende un ácido nucleico que se va a administrar en una célula hospedadora, ya sea in vitro o in vivo.
El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, pero no se limita a, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o de múltiples cadenas, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, químicamente o bioquímicamente modificadas, no naturales o derivatizadas. El esqueleto del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como se pueden encontrar normalmente en ARN o ADN), o azúcar o grupos fosfato modificados o sustituidos. Alternativamente, el esqueleto del polinucleótido puede comprender un polímero de subunidades sintéticas, tales como fosforamidatos, y así puede ser un fosforamidato de oligodesoxinucleósido (P-NH2) o un oligómero mixto de fosforamidato-fosfodiéster. Además, se puede obtener un polinucleótido bicatenario del producto de polinucleótido monocatenario de la síntesis química ya sea por síntesis de la hebra complementaria e hibridación de las cadenas en condiciones apropiadas, o por síntesis de la hebra complementaria de novo usando una ADN polimerasa con un cebador apropiado.
Un "vector vírico recombinante" se refiere a un vector de polinucleótido recombinante que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia del ácido nucleico no de origen vírico). En el caso de vectores de AAV recombinante, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por al menos una, preferentemente dos, secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR).
Un "vector de AAV recombinante (vector de rAAV)" se refiere a un vector de polinucleótido que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia del ácido nucleico no de origen de AAV) que están flanqueadas por al menos una, preferentemente dos, secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV. Dichos vectores de rAAV pueden ser replicados y encapsidados en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedadora que ha sido infectada con un virus auxiliar adecuado (o que está expresando funciones auxiliares adecuadas) y que está expresando productos del gen rep y cap de AAV (es decir, proteínas Rep y Cap de AAV). Cuando un vector de rAAV se incorpora en un polinucleótido más grande (por ejemplo, en un cromosoma o en otro vector, tal como un plásmido usado para clonación o transfección), entonces el vector de rAAV se puede denominar un "pro-vector" que puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de funciones de encapsidación de AAV y funciones auxiliares adecuadas. Un rAAV puede estar en cualquiera de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cromosomas artificiales lineales, complejado con lípidos, encapsulado dentro de liposomas y, lo más preferible, encapsidado en una partícula vírica, particularmente una partícula de AAV. Un vector de rAAV se puede encapsidar en una cápside de virus AAV para generar una "partícula de virus adenoasociado recombinante (partícula de rAAV)".
"Heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se compara o en la que se introduce o incorpora. Por ejemplo, un polinucleótido introducido por técnicas de ingeniería genética en un tipo de célula diferente es un polinucleótido heterólogo (y, cuando se expresa, puede codificar un polipéptido heterólogo). Similarmente, una secuencia celular (por ejemplo, un gen o porción del mismo) que se incorpora en un vector vírico es una secuencia heteróloga de nucleótidos con respecto al vector.
Una secuencia de "repeticiones terminales invertidas" o "ITR" es un término bien entendido en la técnica y se refiere a secuencias relativamente cortas encontradas en los extremos de los genomas víricos que están en orientación opuesta.
Una secuencia de "repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV", un término bien entendido en la técnica, es una secuencia de aproximadamente 145 nucleótidos que está presente en ambos extremos del genoma de AAV monocatenario nativo. Los 125 nucleótidos más externos de la ITR pueden estar presentes en cualquiera de dos orientaciones alternativas, que conducen a la heterogeneidad entre diferentes genomas de AAV y entre los dos extremos de un único genoma de AAV. Los 125 nucleótidos más externos también contienen varias regiones más cortas de autocomplementariedad, que permiten que ocurra el emparejamiento de bases intracatenario dentro de esta porción de la ITR.
Una "secuencia de resolución terminal" o "trs" es una secuencia en la región D de la ITR de AAV que se escinde por proteínas rep de AAV durante la replicación de ADN vírico. Una secuencia de resolución terminal mutante es resistente a la escisión por proteínas rep de AAV.
Los términos "partículas de genoma (gp)", "equivalentes de genoma" o "copias de genoma", como se usan en referencia a un título vírico, se refieren al número de viriones que contiene el genoma de ADN de AAV recombinante, independientemente de la infectividad o funcionalidad. El número de partículas de genoma en una preparación de vector particular se puede medir mediante procedimientos, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento, o por ejemplo, en Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
Los términos "unidad de infección (iu)", "partícula infecciosa" o "unidad de replicación", como se usan en referencia a un título vírico, se refieren al número de partículas de vector de AAV recombinante infeccioso y competente en la replicación como se mide por el ensayo de centro infeccioso, también conocido como ensayo de centro de replicación, como se describe, por ejemplo, en McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
El término "unidad transductora (tu)", como se usa en referencia a un título vírico, se refiere al número de partículas de vector de AAV recombinante infeccioso que dan como resultado la producción de un producto de transgén funcional como se mide en ensayos funcionales, tal como se describe en Ejemplos en el presente documento o, por ejemplo, en Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; o en Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensayo LFU).
Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que el AAV (que es un parvovirus defectuoso) se replique y sea encapsidado por una célula hospedadora. Se han identificado varios de dichos virus auxiliares, que incluyen adenovirus, virus del herpes y poxvirus, tales como la variolovacuna. Los adenovirus engloban varios subgrupos diferentes, aunque el tipo 5 de adenovirus del subgrupo C (Ad5) es el más comúnmente usado. Se conocen numerosos adenovirus de origen de mamífero humano, no humano y aviar y están disponibles de depósitos tales como la ATCC. Los virus de la familia del herpes, que también están disponibles de depósitos tales como ATCC, incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (VHS), virus de Epstein-Barr (VEB), citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorrabia (VPS).
Una "proteína de fusión" se refiere a una proteína que tiene dos o más porciones ligadas covalentemente juntas, donde cada una de las porciones deriva de diferentes proteínas.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polipéptidos o del ácido nucleico de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de polipéptidos o del ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos o del ácido nucleico se puede lograr de diversas formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando programas de software informático públicamente disponibles, por ejemplo, los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Sup. 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1, y que incluye el software BLAST, BLAST-2, ALIg N o Megalign (DNASTAR). Un programa de alineamiento preferido es ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pensilvania). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. A efectos del presente documento, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede ser expresada alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula del siguiente modo: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de restos de aminoácidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias en ese alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de restos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A efectos del presente documento, el % de identidad de secuencia del ácido nucleico de una secuencia del ácido nucleico C dada con respecto a, con o contra una secuencia del ácido nucleico D dada (que puede expresarse alternativamente como una secuencia del ácido nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia del ácido nucleico con respecto a, con o contra una secuencia del ácido nucleico D dada) se calcula del siguiente modo: 100 veces la fracción W/Z, donde W es el número de nucleótidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias en ese alineamiento de programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que donde la longitud de secuencia del ácido nucleico C no es igual a la longitud de secuencia del ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia del ácido nucleico de C con respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia del ácido nucleico de D con respecto a C.
Una molécula (por ejemplo, ácido nucleico o proteína) o célula "aislada" significa que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados, que incluyen resultados clínicos. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más administraciones. En términos de un estado de enfermedad, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para mejorar, estabilizar o retrasar el desarrollo de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, reducción del grado de enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no empeora), prevención de la diseminación (es decir, metástasis) de la enfermedad, retraso o ralentizamiento de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (tanto parcial como total), tanto detectable como indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.
Referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, la descripción con referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X."
Como se usa en el presente documento, la forma en singular de los artículos "un", "una", "el" y "la" incluye referencias en plural, a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo, la expresión "una partícula de rAAV" incluye una o más partículas de rAAV.
III. Proteínas de fusión y componentes de las proteínas de fusión
Receptor del factor de crecimiento derivado del plasma (PDGF)
Los factores de crecimiento derivados del plasma (PDGF) intervienen en muchas actividades biológicas y participan en varias enfermedades, tales como la aterosclerosis, la glomerulonefritis, la reestenosis vascular tras la angioplastia y el cáncer. Existen al menos cuatro miembros de la familia de proteínas del factor de crecimiento derivado del plasma (PDGF) que regulan la vía de señalización de PDGF, específicamente PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C y PDGF-D. Estos cuatro PDGF se ensamblan en dímeros unidos por disulfuro por homo- o heterodimerización. Se han descrito hasta la fecha al menos cinco isoformas diméricas diferentes de PDGF e incluyen PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD y PDGF-AB, todas las cuales se unen a receptores de PDGF (PDGFR) para activar la vía de señalización de PDGF. Existen al menos dos PDGFR identificados, PDGFR-a y PDGFR-p. Cada PDGFR tiene una región extracelular, un dominio transmembranario y una región intracelular que tiene actividad intracelular de tirosina cinasas. Los PDGFR pueden dimerizar para formar los homodímeros PDGFR-a/PDGFR-a o PDGFR-p/PDGFR-p y el heterodímero PDGFR-a/PDGFR-p. Cada una de estas formas dímeras de PDGFR reconoce diferentes isoformas diméricas de PDGF. Por ejemplo, PDGFR-a/PDGFR-a reconoce los ligandos PDGF-AA, AB, BB y CC, PDGFR-a/PDGFR-p reconoce PDGF-Ab , BB, CC y DD, y PDGFR-p/PDGFR-p reconoce PDGF-BB y d D. La mutagénesis por deleción de los sitios de unión a PDGF-AA y -BB se ha cartografiado en los aminoácidos 1-314 de PDGFR-a, mientras que los sitios de unión a PDGF-BB se han cartografiado en los aminoácidos 1-315 de PDGFR-p. La región extracelular de estos PDGFR, que median en la unión a PDGF, contiene cinco dominios de tipo inmunoglobulina (Ig), cada uno de los cuales varía desde aproximadamente 88 hasta aproximadamente 114 aminoácidos de longitud. Véanse Lokker et al., J Biol Chem., 1997, 272(52):33037-44, Miyazawa et al., J Biol Chem., 1998, 273(39):25495-502; y Mahadevan et al., J Biol Chem., 1995, 270(46):27595-600.
La presente divulgación proporciona una porción extracelular de un receptor de PDGF que puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. Por consiguiente, en un caso, la divulgación proporciona una porción extracelular de un PDGFR que incluye, pero no se limita a, PDGFR-a y PDGFR-p. En algunos de los casos en el presente documento, el PDGFR es de un mamífero, tal como un ser humano. Existen cinco dominios de tipo Ig numerados 1,2, 3, 4 y 5 de extremo N a extremo C de una región extracelular de PDGFR. Como se usa en el presente documento, los términos "porción extracelular de un PDGFR" se refieren a uno o más de los cinco dominios de tipo Ig en la región extracelular de PDGFR. Por ejemplo, "una porción extracelular de un PDGFR" se refiere a uno o más de cualquiera de los cinco dominios de tipo Ig encontrados en la región extracelular de un PDGFR, tales como el dominio de tipo Ig D1, el dominio de tipo Ig D2, el dominio de tipo Ig D3, el dominio de tipo Ig D4 o el dominio de tipo Ig D5. Como se usa en el presente documento, términos tales como "dominio de tipo Ig D1" o "dominio extracelular (ECD) 1" de un PDGFR se refieren específicamente al primer dominio de tipo Ig encontrado en el extremo N de la región extracelular de PDGFR, "dominio de tipo Ig D2" o "ECD 1" de un PDGFR se refiere específicamente al segundo dominio de tipo Ig del extremo N de la región extracelular de PDGFR, etc. En cualquiera de los casos en el presente documento, una porción extracelular de un PDGFR comprende al menos un dominio de tipo Ig de uno o más PDGFR seleccionados del grupo que consiste en PDGFR-a y PDGFR-p. En algunas realizaciones, una porción extracelular de un PDGFR comprende al menos 3, 4, pero no más de 5 dominios de tipo Ig de un PDGFR (es decir, PDGFR-p). Una porción extracelular de un PDGFR puede comprender los dominios de tipo Ig D1 a D3, los dominios de tipo Ig D1 a D4, o los dominios de tipo Ig D1 a D5 de un PDGFR (es decir, PDGFR-p). En la presente invención, la porción extracelular comprende los dominios de tipo Ig D1-D3 de PDGFRp.
En el presente documento se contempla una porción extracelular que comprende cualquier combinación de los cinco dominios de tipo Ig de cada PDGFR. Por consiguiente, en un caso, la presente divulgación proporciona una porción extracelular de un PDGFR que comprende al menos un dominio de tipo Ig de dos PDGFR. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende al menos un dominio de tipo Ig de dos PDGFR seleccionados del grupo que consiste en PDGFR-a y PDGFR-p. Por ejemplo, una proteína de fusión como se describe en el presente documento puede comprender una porción extracelular de un PDGFR que comprende al menos un dominio de tipo Ig de PDGFR-a y al menos un dominio de tipo Ig de PDGFR-p. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, pero no más de 10 dominios de tipo Ig de al menos dos o más PDGFR. En un caso adicional, una porción extracelular de un PDGFR comprende 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 a 2 dominios de tipo Ig de al menos dos o más PDGFR. Para una descripción adicional de dominios de tipo Ig que se pueden usar como parte de una porción extracelular de un PDGFR, véase la patente de EE. UU. número 5.686.572, el documento de patente WO2006113277 y Lokker et al., J Biol Chem. 1997, 272(52):33037-44.
En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-3. Por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, s Eq ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y 8.
También se contemplan variantes de la secuencia de aminoácidos de cualquier porción extracelular de un PDGFR desvelado en el presente documento. Por ejemplo, se pueden mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la porción extracelular de un PDGFR alterando la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína. Las variantes de secuencias de aminoácidos de una porción extracelular de un PDGFR se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína o introduciendo la modificación por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, inserciones en y/o sustituciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la porción extracelular de un PDGFR. Se puede hacer cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción de aminoácidos final de la porción extracelular de un PDGFR, a condición de que la construcción final posea las características deseadas, tales como unión a una proteína de la familia de PDGF y/o inhibición de la activación de la vía de PDGF. Por consiguiente, en el presente documento se desvelan variantes de una porción extracelular de un PDGFR que puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios de tipo Ig D1, D2, D3, D4 o D5 de un PDGFR-a (por ejemplo, PDGFR-a humano). En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios de tipo Ig D1, D2, D3, D4 o D5 de un PDGFR-p (por ejemplo, PDGFR-p humano). En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-3. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y 8.
Sin desear quedar ligado a teoría, se contempla en el presente documento que una porción extracelular de un PDGFR inhibe la activación de la vía de PDGF uniéndose a una proteína de la familia de PDGF para bloquear su interacción con un PDGFR. Sin desear quedar ligado a teoría, también se contempla en el presente documento que una porción extracelular de un PDGFR se puede unir a un PDGFR para la inhibición negativa dominante de la vía de señalización de PDGF. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR se une a la proteína de la familia de PDGF seleccionada del grupo que consiste en PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C y PDGF-D. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR se une al dímero de la proteína de la familia de PDGF seleccionado del grupo que consiste en PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC y PDGF-DD. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR se une al PDGFR seleccionado del grupo que consiste en PDGFR-a y PDGFR-p.
Una porción extracelular de un PDGFR puede o puede no comprender un péptido señalizador que sirve de una secuencia señalizadora de la secreción de la porción extracelular de un PDGFR de una célula hospedadora. El péptido señalizador puede estar unido operativamente a un ácido nucleico que codifica la proteína de interés (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR). En algunas realizaciones, una porción extracelular de un PDGFR comprende un péptido señalizador. En algunas realizaciones, una porción extracelular de un PDGFR no comprende un péptido señalizador.
Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
Existen al menos cinco miembros de la familia de proteínas de VEGF que regulan la vía de señalización de VEGF: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y el factor de crecimiento placentario (PlGF). Además, el corte y empalme alternativo de ARNm que codifica VEGF-A, VEGF-B y PlGF da como resultado la generación de múltiples isoformas de estas proteínas. Por ejemplo, el corte y empalme alternativo de VEGF-A da nueve isoformas diferentes que incluyen las isoformas VEGF121, VEGF165, VEGF189 y VEGF206. La familia de proteínas de VEGF activa la vía de señalización de VEGF uniéndose a la región extracelular de receptores transmembranarios de VEGF. Existen al menos tres receptores de VEGF identificados: VEGFR1 (también conocido como la tirosina cinasa 1 relacionada con fms (Flt-1)), VEGFR2 (también conocido como el receptor del dominio de inserción de cinasas (KDR)) y VEGFR3 (también conocido como la tirosina cinasa 4 de tipo fms (Flt-4)). Los VEGFR contienen cada uno una región extracelular que comprende siete dominios de tipo inmunoglobulina (Ig), un segmento de un único dominio transmembranario, un segmento de yuxtamembrana y un dominio de tirosina cinasa de proteína intracelular. Las regiones extracelulares de VEGFR se unen a diferentes miembros de la familia de proteínas de VEGF. Por ejemplo, VEGFR1 se une a VEGF-A, VEGF-B y PlGF; VEGFR2 se une a todas las isoformas de VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E; y VEGFR3 se une a VEGF-C y VEGF-D. Véase Roskoski, R et al., Crit Rev Oncol Hematol., 2007, 62(3): 179-213, para una revisión de la señalización mediada por VEGF y VEGFR.
La presente divulgación proporciona una porción extracelular de un receptor de VEGF que puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. Por consiguiente, en un caso, la divulgación proporciona una porción extracelular de un VEGFR que incluye, pero no se limita a, VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3. En algunos de los casos en el presente documento, el VEGFR es de un mamífero, tal como un ser humano. Existen siete dominios extracelulares de tipo Ig numerados 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de extremo N a extremo C de una región extracelular de VEGFR. Como se usa en el presente documento, los términos "porción extracelular de un VEGFR" se refiere a uno o más de los siete dominios de tipo Ig en la región extracelular de VEGFR. Por ejemplo, "una porción extracelular de un VEGFR" se refiere a uno o más de cualquiera de los siete dominios de tipo Ig encontrados en la región extracelular de un VEGFR, tal como el dominio de tipo Ig D1, el dominio de tipo Ig D2, el dominio de tipo Ig D3, el dominio de tipo Ig D4, el dominio de tipo Ig D5, el dominio de tipo Ig D6 o el dominio de tipo Ig D7. Como se usa en el presente documento, términos tales como "dominio de tipo Ig D1" o "dominio extracelular (ECD) 1" de un VEGFR se refieren ambos específicamente al primer dominio de tipo Ig encontrado en el extremo N de la región extracelular de VEGFR, "dominio de tipo Ig D2" o "ECD 2" de un VEGFR se refieren ambos específicamente al segundo dominio de tipo Ig del extremo N de la región extracelular de VEGFR, etc. En la presente invención, la porción extracelular de un receptor de VEGF consiste en el dominio de tipo Ig D2. En cualquiera de los casos en el presente documento, una porción extracelular de un VEGFR comprende al menos un dominio de tipo Ig de uno o más VEGFR seleccionados del grupo que consiste en VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3. En algunos casos, una porción extracelular de un VEGFR comprende al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, pero no más de 7 dominios de tipo Ig de un VEGFR (por ejemplo, VEGFR1). En algunos aspectos, una porción extracelular de un VEGFR comprende 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 a 2 dominios de tipo Ig de un VEGFR (por ejemplo, VEGFR1). Por ejemplo, una porción extracelular de un VEGFR puede comprender un dominio de tipo Ig D2 de un VEGFR1. Para una descripción adicional de dominios de tipo Ig que se pueden usar como parte de una porción extracelular de un VEGFR, véanse la patente de EE. UU. número 7.928.072, el documento de patente WO2006113277, Davis-Smyth, T., et al., JBiol Chem, 1998, 273:3216-3222, Holash, J., et al., PNAS, 2002, 99(17):11393-11398 y Pechan, P., et al., Gene Ther, 2009, 16:10-16.
En algunas realizaciones, una porción extracelular de un VEGFR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, una porción extracelular de un VEGFR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Por ejemplo, una porción extracelular de un VEGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento.
También se contemplan variantes de la secuencia de aminoácidos de cualquier porción extracelular de un VEGFR desvelado en el presente documento. Por ejemplo, se pueden mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la porción extracelular de un VEGFR alterando la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína. Las variantes de la secuencia aminoácidos de una porción extracelular de un VEGFR se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o introduciendo la modificación por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, inserciones en y/o sustituciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la porción extracelular de un VEGFR. Se puede hacer cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción de aminoácidos final de la porción extracelular de un VEGFR, a condición de que la construcción final posea las características deseadas, tales como la unión a una proteína de la familia de VEGF y/o inhibición de la activación de la vía VEGF. Por consiguiente, en el presente documento se desvelan variantes de una porción extracelular de un VEGFR que puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. En algunos casos, una porción extracelular de un VEGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios de tipo Ig D1, D2, D3, D4, D5, D6 o D7 de un VEGFR1 (por ejemplo, VEGFR1 humano). En algunos casos, una porción extracelular de un VEGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios de tipo Ig D1, D2, D3, D4, D5, D6 o D7 de un VEGFR2 (por ejemplo, VEGFR2 humano). En algunas realizaciones, una porción extracelular de un VEGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los dominios de tipo Ig D1, D2, D3, D4, D5, D6 o D7 de un VEGFR3 (por ejemplo, VEGFR3 humano). En algunos casos, una porción extracelular de un VEGFR comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 5.
Sin desear quedar ligado a teoría, se contempla en el presente documento que una porción extracelular de un VEGFR inhibe la activación de la vía de VEGF uniéndose a una proteína de la familia de VEGF para bloquear su interacción con un VEGFR. Sin desear quedar ligado a teoría, también se contempla en el presente documento que una porción extracelular de un VEGFR se puede unir a un VEGFR para la inhibición negativa dominante de la vía de señalización de VEGF. En algunos casos, una porción extracelular de un VEGFR se une a la proteína de la familia de VEGF seleccionada del grupo que consiste en VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y PlGF. En algunos casos, una porción extracelular de un v Eg FR se une a VEGFR (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2 y/o VEGFR3).
Una porción extracelular de un VEGFR puede o puede no comprender un péptido señalizador que sirve de secuencia señalizadora de la secreción de la porción extracelular de un VEGFR de una célula hospedadora. Según la invención, una porción extracelular de un VEGFR no comprende un péptido señalizador.
Dominio de multimerización
La presente divulgación proporciona un dominio de multimerización (por ejemplo, una región Fc de un anticuerpo) que puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. Los dominios de multimerización son las porciones de proteínas multiméricas que promueven la asociación de subunidades para formar, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. Como se usa en el presente documento, el término "dominio de multimerización" se puede usar para referirse a un dominio de dimerización, un dominio de trimerización, un dominio de tetramerización, etc. Las proteínas de fusión que comprenden un dominio de multimerización pueden interactuar con otras proteínas de fusión que comprenden un dominio de multimerización para producir multímeros de proteínas de fusión (por ejemplo, dímeros de proteínas de fusión). Por ejemplo, una región Fc de IgG es un dominio de dimerización que se puede fusionar con una porción extracelular de un PDGFR o una porción extracelular de VEGFR como se desvela en el presente documento. Una proteína de fusión que comprende una porción extracelular de un PDGFR y una región Fc de IgG se puede dimerizar con otra proteína de fusión que comprende una región Fc de IgG para producir un dímero de proteína de fusión con multiespecificidad por al menos un PDGF. Se conocen en la técnica dominios de multimerización. Véase la patente de EE. UU. número 7.928.072 y el documento de patente WO2006/113277. Por ejemplo, una región Fc de una cadena pesada lambda de IgG 1, tal como el dominio CH3 solo o ambos dominios CH2 y CH3, se puede usar como dominio de multimerización. En la presente invención, el dominio de multimerización comprende una región Fc de un anticuerpo IgG1. Como se usa en el presente documento, el término "región Fc" se usa para definir una región carboxiterminal de una cadena pesada de la inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de la secuencia nativa y regiones Fc de variante. En una realización, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina carboxiterminal (Lys447) de la región Fc puede o puede no estar presente. Se conocen bien en la técnica las secuencias de aminoácidos que codifican inmunoglobulinas que comprenden regiones Fc. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada lambda de IgG1 se puede encontrar con el N.° de acceso de GenBank CAA75032. Una región Fc de una inmunoglobulina se puede obtener por escisión con la enzima papaína o por otros medios. En algunas realizaciones, la región Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. También se puede usar el dominio de multimerización de un VEGF, tal como el dominio de multimerización de VEGF-A. VEGF-A está codificado por un ácido nucleico mostrado en N.° de acceso de GenBank NM003376. Por ejemplo, el dominio de multimerización de VEGF-A está codificado por el exón 3 de VEGF-A y se puede unir a cualquiera de los componentes de la proteína de fusión desvelados en el presente documento, tal como la porción extracelular de un PDGFR y/o la porción extracelular de un VEGFR.
En algunos casos, las variantes de la secuencia de aminoácidos de un dominio de multimerización se desvelan en el presente documento. Por ejemplo, se puede desear mejorar las propiedades biológicas (por ejemplo, propiedades de multimerización) del dominio de multimerización. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un dominio de multimerización introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína o introduciendo la modificación por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, inserciones en y/o sustituciones dentro de la secuencia de aminoácidos del dominio de multimerización. Se puede hacer cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción de aminoácidos final de la multimerización, a condición de que la construcción final posea las características deseadas, tales como formación de proteínas multiméricas. Por consiguiente, en el presente documento se desvelan variantes de un dominio de multimerización que puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones, una región Fc comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Se conocen bien en la técnica las variantes de los dominios de multimerización. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. N.° 2012/0251531.
Conectores
Componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR, o el dominio de multimerización) se pueden unir por un resto conector, tal como un conector peptídico.
Preferentemente, el conector aumenta la flexibilidad de los componentes de la proteína de fusión y no interfiere significativamente con la estructura de cada componente funcional dentro de la proteína de fusión. En algunos casos, el resto conector es un conector peptídico. En algunos casos, el conector peptídico comprende 2 a 100 aminoácidos.
En algunos casos, el conector peptídico comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, pero no más de 100 aminoácidos. En algunos casos, conector peptídico tiene entre 5 y 75, 5 y 50, 5 y 25, 5 y 20, 5 y 15, 5 y 10 o 5 y 9 aminoácidos de longitud. Los conectores a modo de ejemplo incluyen péptidos lineales que tienen al menos dos restos de aminoácidos, tales como
Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 46). Los péptidos lineales adecuados incluyen poliglicina, poliserina, poliprolina, polialanina y oligopéptidos que consisten en restos de aminoácidos alanilo y/o serinilo y/o prolinilo y/o glicilo. En algunos casos, el conector peptídico comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Gly9 (SEQ ID NO: 47), Glu9 (SEQ ID NO: 48), Ser9 (SEQ ID NO: 49), Glys-Cys-Pro2-Cys (SEQ ID NO: 50), (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 51), Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn (SEQ ID NO: 52), Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn (SEQ ID n O: 53), Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEQ ID NO: 54) y Gly9-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn
(SEQ ID NO: 55).
Los restos conectores también se pueden preparar a partir de otros polímeros, tales como polietilenglicol (no es parte de la invención). Dichos conectores pueden tener desde 10 hasta 1000, 10 hasta 500, 10 hasta 250, 10 hasta 100, o
10 hasta 50 unidades de monómeros de etilenglicol. Los polímeros adecuados deben ser de un tamaño similar al tamaño ocupado por el intervalo apropiado de restos de aminoácidos. Un polímero de tamaño típico proporcionaría una separación de desde aproximadamente 10-25 angstroms.
Los restos conectores se desvelan en Tarn, J.P., et al., J. of Immunol Methods, 1996, 196:17-32.
Los restos conectores se pueden usar para conectar cualquiera de los componentes de las proteínas de fusión desveladas en el presente documento. Por ejemplo, se puede usar un conector peptídico (por ejemplo, Gly9
(SEQ ID NO: 47)) para conectar el extremo C de una porción extracelular de un PDGFR con el extremo N de una porción extracelular de un VEGFR y se puede usar además para conectar el extremo C de la porción extracelular de un VEGR con el extremo N de un dominio de multimerización (por ejemplo, una región Fc de IgG1). En algunos casos, un conector se usa entre una porción extracelular de un PDGFR y un dominio de multimerización. En algunos casos, un conector se usa entre una porción extracelular de un VEGFR y un dominio de multimerización. En algunos casos, un conector se usa entre una porción extracelular de un PDGFR y una porción extracelular de un VEGFR. En algunos casos, la proteína de fusión comprende un conector entre una porción extracelular de un PDGFR y una región extracelular de un VEGFR, y un conector entre la región extracelular del VEGFR y un dominio de multimerización (por ejemplo, región Fc). En la presente invención, la proteína de fusión comprende un péptido conector entre la porción extracelular de PDGFR y la porción extracelular del VEGFR que comprende Ser9 (SEQ ID NO: 49) y un conector entre la porción extracelular del VEGFR y el dominio de multimerización que comprende Gly9 (SEQ ID NO: 47). En algunos casos, una proteína de fusión comprende al menos un conector, pero no más de cuatro conectores. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender (a) una porción extracelular de un PDGFR, (b) una porción extracelular de un VEGFR, (c) un dominio de multimerización (por ejemplo, una región Fc de IgG 1), y al menos un conector desde el extremo N hasta el extremo C en un orden seleccionado del grupo que consiste en: (1) conector, a, conector, b, conector, c, conector; (2) a, conector, b, conector, c, conector; (3) conector, a, conector, b, conector, c; (4) a, conector, b, conector, c; (5) a, conector, b, c; y (6) a, b, conector, c. En otro ejemplo, una proteína de fusión puede comprender
(a) una porción extracelular de un PDGFR, (b) un dominio de multimerización (por ejemplo, una región Fc de IgG1), y al menos un conector desde el extremo N hasta el extremo C en un orden seleccionado del grupo que consiste en: (1) conector, a, conector, b, conector; (2) conector, a, conector, b; (3) a, b, conector; (4) a, conector, b; (5) conector, b, conector, a, conector; (6) conector, b, conector, a; (7) b, a, conector; y (8) b, conector, a.
Proteínas de fusión
En el presente documento se desvelan proteínas de fusión que tienen especificidades de unión por al menos dos componentes de unión diferentes (por ejemplo, PDGF y VEGF). En la presente invención, la proteína de fusión se une a un PDGF y un VEGF. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una primera especificidad de unión por una proteína de la familia de PDGF (por ejemplo, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C o PDGF-D) y una segunda especificidad de unión por un VEGF (por ejemplo, v Eg F-A VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o P1GF). En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una primera especificidad de unión por un dímero de proteína de la familia de PDGF (por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC o PDGF-Dd ) y una segunda especificidad de unión por un V e g F (por ejemplo, v Eg F-A VeGf -B, VEg F-C, VEGF-D o P1GF). En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una primera especificidad de unión por un PDGF de mamífero (por ejemplo, humano) y una segunda especificidad de unión por un VEGF de mamífero (por ejemplo, humano). En algunas realizaciones, la proteína de fusión se une al mismo componente de la vía de PDGF que uno cualquiera de PDGFR-p. En algunas realizaciones, la proteína de fusión se une al mismo PDGF que uno cualquiera de los dímeros PDGFR-p/PDGFR-p o PDGFR-a/PDGFR-p. En algunos casos, una proteína de fusión comprende al menos una porción extracelular de un PDGFR de cualquiera de los PDGFR descritos en el presente documento. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos una porción extracelular de PDGFR-a y al menos una porción extracelular de PDGFR-p. En otro ejemplo, una proteína de fusión puede comprender dos porciones extracelulares de PDGFR-p, tales como el dominio de tipo Ig D1-D3 y el dominio de tipo Ig D1-D5. En algunos casos, una proteína de fusión comprende una porción extracelular de un PDGFR que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 3. En algunos casos, una proteína de fusión se une al mismo componente de la vía de VEGF que cualquiera de los VEGFR descritos en el presente documento. En algunos casos, una proteína de fusión se une al mismo componente de la vía de VEGF que uno cualquiera de VEGFR1, VEGFR2 o VEGFR3. En algunos casos, una proteína de fusión comprende al menos una porción extracelular de un VEGFR de cualquiera de los VEGFR descritos en el presente documento. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos una porción extracelular de VEGFR1 y al menos una porción extracelular de VEGFR2. En otro ejemplo, una proteína de fusión puede comprender dos porciones extracelulares de VEGFR1, tales como el dominio de tipo Ig D2 y el dominio de tipo Ig D1 -D3. En algunos casos, una proteína de fusión comprende una porción extracelular de un VEGFR que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 5. Cualquiera de las proteínas de fusión desveladas en el presente documento que comprenda una porción extracelular de un PDGFR y una porción extracelular de un VEGFR comprende además un dominio de multimerización. El dominio de multimerización es una región Fc de IgG1. En algunas realizaciones, la región Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, la proteína de fusión que comprende una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de VEGFR y un dominio de multimerización inhibe las vías de señalización de PDGF y VEGF (por ejemplo, inhibición de PDGF y actividad de VEGF). Cualquiera de las proteínas de fusión desveladas en el presente documento que comprende una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de VEGFR y un dominio de multimerización comprende además un conector. El conector comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en Gly9 (SEQ ID NO: 47) y Ser9 (SEQ ID NO 49). En algunos casos, la porción extracelular de un PDGFR comprende una porción extracelular de un PDGFR de mamífero (por ejemplo, humano). En algunos casos, la porción extracelular de un VEGFR comprende una porción extracelular de un VEGFR de mamífero (por ejemplo, humano). En algunos casos, una proteína de fusión comprende una porción extracelular de un PDGFR humano (por ejemplo, PDGFR-p humano) y una porción extracelular de un VEGFR humano (por ejemplo, VEGFR1 humano).
En un caso, la divulgación proporciona una proteína de fusión que comprende: a) una porción extracelular de un PDGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,2, 3, 7 u 8; b) una porción extracelular de un VEGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 5; y c) un dominio de multimerización que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende: a) una porción extracelular de un PDGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; b) una porción extracelular de un VEGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y c) un dominio de multimerización que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende: a) una porción extracelular de un PDGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; b) una porción extracelular de un VEGFR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y c) un dominio de multimerización que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En el presente documento se desvelan proteínas de fusión que comprenden una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y un dominio de multimerización en un orden específico. En algunos casos, la proteína de fusión comprende (a) una porción extracelular de un PDGFR, (b) una porción extracelular de un VEGFR, y (c) una región Fc dispuesta desde el extremo N hasta el extremo C en un orden de a, b, c. En algunos de los casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D3 de un PDGFR (por ejemplo, PDGFR-p). En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D4 de un PDGFR (por ejemplo, PDGFR-p). En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D5 de un PDGFR (por ejemplo, PDGFR-p). Una porción extracelular de un VEGFR consiste en el dominio de tipo Ig D2 de un VEGFR (por ejemplo, VEGFR1). Según la invención, un dominio de multimerización comprende la región Fc de un anticuerpo IgG1.
En algunos casos, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En otras realizaciones, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En todavía otros casos, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En aún otras realizaciones, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
También se contemplan proteínas de fusión que comprenden al menos dos o más porciones extracelulares de un PDGFR, dos o más porciones extracelulares de un VEGFR, y/o dos o más dominios de multimerización. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender (a) una porción extracelular de un PDGFR, (b) una porción extracelular de un VEGFR, y (c) una región Fc dispuesta desde el extremo N hasta el extremo C en un orden de a, a, b, c o en un orden de a, b, b, c. Cualquier combinación de al menos una porción extracelular de un PDGFR, al menos una porción extracelular de un VEGFR y al menos un dominio de multimerización se desvela en el presente documento como si cada combinación se hubiera expuesto explícitamente en el presente documento.
También se contemplan proteínas de fusión que comprenden una porción extracelular de un PDGFR y un dominio de multimerización. En algunos casos, la proteína de fusión comprende (a) una porción extracelular de un PDGFR y (b) una región Fc dispuesta desde el extremo N hasta el extremo C en un orden de a y b. En algunos casos, la proteína de fusión comprende (a) una porción extracelular de un PDGFR y (b) una región Fc dispuesta desde el extremo N hasta el extremo C en un orden de b y a. En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D2 de un PDGFR (por ejemplo, PDGFR-p). En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D3 de un PDGFR (por ejemplo, PDGFR-p). En algunos casos, una porción extracelular de un PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D4 de un PDGFR (por ejemplo, PDGFR-p). En algunas realizaciones, una porción extracelular de un PDGFR comprende los dominios de tipo Ig D1-D5 de un PDGFR (por ejemplo, PDGFR-p). Según la invención, un dominio de multimerización comprende la región Fc de un anticuerpo IgG1. Cualquier combinación de al menos una porción extracelular de un PDGFR y al menos un dominio de multimerización se desvela en el presente documento como si cada combinación se hubiera expuesto explícitamente en el presente documento.
En algunos casos, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En algunos casos, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En algunos casos, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
Las proteínas de fusión descritas en la presente divulgación pueden comprender formas modificadas de la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR y/o el dominio de multimerización. Por ejemplo, los componentes de la proteína de fusión pueden tener modificaciones postraduccionales, que incluyen, por ejemplo, glucosilación, sialilación, acetilación y fosforilación.
En algunos casos, variantes de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión se desvelan en el presente documento. Por ejemplo, se puede desear mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR y/o el dominio de multimerización. Se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR y/o el dominio de multimerización, o por introducción a través de la síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, inserciones en y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos de la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR y/o el dominio de multimerización. Se puede hacer cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, a condición de que la construcción final posea las características deseadas (por ejemplo, unión a un PDGF, unión a un VEGF, inhibición de la activación de una vía de PDGF, formación de multímeros y/o inhibición de la activación de una vía de VEGF). En algunos casos, la proteína de fusión comprende al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende cualquier porción extracelular de un PDGFR, porción extracelular de un VEGFR y/o dominio de multimerización como se desvela en el presente documento. En algunos casos, una variante de proteína de fusión comprende al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15. En algunos casos, una variante de proteína de fusión comprende al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9-11.
Las sustituciones de restos de aminoácidos desveladas en el presente documento también incluyen sustituciones conservativas. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 que sigue bajo el encabezado de "Sustituciones conservativas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustanciales, denominados "Sustituciones a modo de ejemplo" en la Tabla 1, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, se pueden introducir y cribar los productos. Las sustituciones de aminoácidos como se muestran en la Tabla 1 o como se describen a continuación en referencia a las clases de aminoácidos se pueden introducir en cualquiera de las proteínas de fusión o componentes de proteína (por ejemplo, porción extracelular de un PDGFR, porción extracelular de un VEGFR, dominio de multimerización, etc.) desvelados en el presente documento.
Tabla 1. Posibles sustituciones de aminoácidos
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Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de las proteínas o polipéptidos se llevan a cabo seleccionando sustituciones que se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar según propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lIe;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe;
(7) hidrófobos grandes: Norleucina, Met, Val, Leu, Ile.
Las sustituciones no conservativas conllevan el intercambio de un miembro de uno de estos restos por otra clase.
Un método útil para la identificación de ciertos restos o regiones de la proteína de fusión que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis con barrido de alanina", como se describe por Cunningham y Wells en Science, 1989, 244:1081-1085. Aquí, un resto o grupo de restos diana se identifica (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituye por un aminoácido neutro o negativamente cargado (lo más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el componente de unión diana. Las localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación en sí no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se realiza mutagénesis con barrido de ala o al azar en el codón o región diana y las variantes de polipéptido de fusión expresadas se criban para la actividad deseada.
Cualquier resto de cisteína que no participe en el mantenimiento de la conformación apropiada de las proteínas de fusión o componentes de la proteína (por ejemplo, porción extracelular de un PDGFR, porción extracelular de un VEGFR, dominio de multimerización, etc.) también se pueden sustituir, en general, con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. En cambio, el (los) enlace(s) de cisteína se pueden añadir a la proteína de fusión o a los componentes de la proteína (por ejemplo, porción extracelular de un PDGFR, porción extracelular de un VEGFR, dominio de multimerización, etc.) para mejorar su estabilidad.
En otros casos, las proteínas o péptidos de la divulgación pueden comprender uno o más aminoácidos que no existen de forma natural o modificados. Un "resto de aminoácido que no existe de forma natural" se refiere a un resto, distinto de los restos de aminoácidos que existen de forma natural enumerados anteriormente, que es capaz de unirse covalentemente a resto(s) de aminoácidos adyacente(s) en una cadena de polipéptidos. Los aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, homo-lisina, homo-arginina, homo-serina, ácido azetidincarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ferc-butilglicina, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, citrulina, pentilglicina, ácido pipecólico y tioprolina. Los aminoácidos modificados incluyen aminoácidos naturales y no naturales que están bloqueados químicamente, reversible o irreversiblemente, o modificados en su grupo amino aminoterminal o sus grupos de cadena lateral, como, por ejemplo, D- y L-aminoácidos N-metilados, grupos funcionales de cadena lateral que están modificados químicamente con otro grupo funcional. Por ejemplo, los aminoácidos modificados incluyen sulfóxido de metionina; metionina sulfona; (éster beta-metílico de) ácido aspártico, un aminoácido modificado de ácido aspártico; N-etilglicina, un aminoácido modificado de glicina; o alanina carboxamida y un aminoácido modificado de alanina. Se conocen en la técnica aminoácidos no naturales y modificados adicionales, y métodos de su incorporación en las proteínas y péptidos (véase, por ejemplo, Sandberg et al., (1998) J. Med. Chem. 41: 2481-91; Xie y Schultz (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 548-554; Hodgson y Sanderson (2004) Chem. Soc. Rev. 33: 422-430.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino-("N") y/o carboxi-("C") terminales que varían en longitud desde un resto hasta cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen una proteína de fusión con un resto metionilo aminoterminal o la proteína de fusión fusionada con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de proteína de fusión incluyen la fusión con el extremo N o C de la proteína de fusión con un polipéptido que permite la formación de multímeros de proteína.
La presente divulgación proporciona un péptido señalizador, también denominado en el presente documento una secuencia señalizadora, que puede ser un componente de cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. Por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y un dominio de multimerización puede comprender además un péptido heterólogo, preferentemente una secuencia señalizadora u otro péptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína de fusión madura. La secuencia señalizadora heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señalizadora) por células hospedadoras eucariotas. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan secuencias señalizadoras nativas de mamífero, la secuencia señalizadora eucariota (es decir, de mamífero) está sustituida por una secuencia señalizadora procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en secuencias conductoras de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o genes de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción de levadura, la secuencia señalizadora nativa se puede sustituir por, por ejemplo, el conductor de invertasa de levadura, conductor de factor (incluyendo conductores de factores de Sacaromyces y Kluyveromyces), o conductor de fosfatasa ácida, el conductor de glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en documento de patente WO 90/13646. En la expresión en células de mamífero, están disponibles secuencias señalizadoras de mamífero, así como conductores secretores virales, por ejemplo, la señal gD del virus del herpes simple. Un péptido señalizador puede ser completamente escindido de la proteína de fusión a medida que se produce de células hospedadoras o puede ser parcialmente escindido. Una población mixta de proteínas de fusión se puede producir a partir de una célula hospedadora, en donde las proteínas de fusión comprenden una secuencia señalizadora completamente escindida (por ejemplo, sin secuencia señalizadora), una secuencia señalizadora parcialmente escindida (por ejemplo, porción de la secuencia señal) y/o una secuencia señalizadora no escindida (por ejemplo, secuencia señalizadora completa). Por ejemplo, una proteína de fusión que comprende además un péptido señalizador en el extremo N puede ser escindido en el extremo N por uno cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 restos de aminoácidos. En algunas realizaciones, cualquier proteína de fusión de la invención comprende un péptido señalizador para la secreción de proteína de una célula. En algunas realizaciones, alguna proteína de fusión de la invención no comprende un péptido señalizador para la secreción de proteína de una célula.
La presente invención proporciona una proteína de fusión dimérica que comprende dos proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión comprende cualquier proteína de fusión de la invención. En una realización, la proteína de fusión dimérica comprende dos proteínas de fusión idénticas. En otra realización, la proteína de fusión dimérica comprende dos proteínas de fusión diferentes. Las proteínas de fusión desveladas en el presente documento pueden formar multímeros de dos o más proteínas de fusión. Los multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc.) se pueden formar a partir de proteínas de fusión idénticas (por ejemplo, homomultímero) o formar proteínas de fusión heterólogas (por ejemplo, heteromultímeros). En otro caso, la proteína de fusión multimérica comprende al menos una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15. En otro caso, la proteína de fusión multimérica comprende al menos una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9-11, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9-11. En un caso, la proteína de fusión se recupera como un multímero de proteína fusión de una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión están glucosiladas. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser glucosilada después de ser liberada de una célula hospedadora en la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR y/o el dominio de multimerización.
En el presente documento también se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para una variedad de modos de administración descritos en el presente documento, que incluyen, por ejemplo, administración sistémica o localizada. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de colirios, disoluciones inyectables, o en una forma adecuada para inhalación (ya sea a través de la boca o la nariz) o administración por vía oral. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable son adecuadas para administración al ser humano. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable son adecuadas para inyección intravítrea o administración tópica al ojo. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, que incluyen los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa, polietilenglicol (PEG) y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. La composición farmacéutica puede comprender además componentes adicionales, por ejemplo, conservantes, tampones, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes humectantes o clarificantes no iónicos, agentes que aumentan la viscosidad y similares. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden envasar en dosis unitarias únicas o en formas multidosis. Las composiciones se formulan, en general, como disolución estéril y sustancialmente isotónica. Las composiciones también se pueden formular para tener valores osmóticos que son compatibles con el humor acuoso del ojo y los tejidos oftálmicos. Dichos valores osmóticos estarán, en general, en el intervalo de desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 400 miliosmoles por kilogramo de agua ("mOsm/kg"), pero preferentemente serán de aproximadamente 300 mOsm/kg. Se considera que la retina tiene un valor osmótico de ~283 mOsm/kg.
IV. Ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras
Ácidos nucleicos
En el presente documento se desvelan ácidos nucleicos aislados que codifican cualquiera de los componentes de proteínas de fusión desveladas en el presente documento, tales como una porción extracelular de un PDGFR, y porción extracelular de un VEGFR, y un dominio de multimerización. Los ácidos nucleicos que codifican PDGFR de mamífero se han descrito para ambos tipos de receptores, PDGFR-a y PDGFR-p. Las secuencias del ácido nucleico a modo de ejemplo se pueden encontrar en, pero no se limitan a, Yarden et al., Nature, 1986, 323:226-232; Matsui et al., Science, 1989, 243: 800-803; la solicitud de patente de EE. Uu . N.° de serie 07/771.829 que es una continuación de la solicitud de patente de EE. UU. N.° de serie 07/309.332, ahora abandonada, la patente de EE. UU. número 5.686.572 y el documento de patente WO2006/113277. El ARNm que codifica PDGFR-a y PDGFR-p humanos se puede encontrar en los N.° de acceso de Genbank NM_006206.4 y n M_002609.3, respectivamente. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una porción extracelular de un PDGFR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-3. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una porción extracelular de un PDGFR que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-3. En algunos casos, el ácido nucleico aislado que codifica una porción extracelular de un PDGFR se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16 y 17. En el presente documento también se desvelan ácidos nucleicos aislados que codifican una porción extracelular de un VEGFR. Los ácidos nucleicos que codifican VEGFR de mamífero se han descrito para todos los tipos de receptor. Las secuencias del ácido nucleico a modo de ejemplo se pueden encontrar en, pero no se limitan a, la patente de EE. UU. número 7.928.072 y el documento de patente WO2006/113277. El ARNm que codifica VEGFR1 y VEGFR2 humanos se puede encontrar en los N.° de acceso de Genbank NM _001159920.1 y NM_002253.2, respectivamente. El ARNm que codifica VEGFR3 humano se puede encontrar en los N.° de acceso de Genbank NM_002020.7 y NM_182925.4. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una porción extracelular de un VEGFR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 5. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una porción extracelular de un VEGFR que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y 5. En el presente documento también se desvelan ácidos nucleicos aislados que codifican un dominio de multimerización (por ejemplo, región Fc). En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica un dominio de multimerización que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica un dominio de multimerización que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6.
También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de fusión de la invención. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9-11. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15. En algunos casos, un ácido nucleico aislado codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9-11. En algunos casos, un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión comprende la secuencia del ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21-24. En algunos casos, un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión comprende la secuencia del ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-20.
Una secuencia del ácido nucleico aislada que codifica una proteína de fusión o un componente de una proteína de fusión (por ejemplo, la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR o el dominio de multimerización) puede incluir además una secuencia del ácido nucleico que codifica un conector. En algunos casos, un ácido nucleico codifica un conector seleccionado del grupo que consiste en Gly9 (SEQ ID NO: 47), G1ug (SEQ ID NO: 48), Ser9 (SEQ ID NO: 49), Glya-Cys-Prog-Cys (SEQ ID NO: 50), (Gly4-Ser)a (SEQ ID NO: 51), Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn (SEQ ID n O: 52), Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn (SEQ ID NO: 53), Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEQ ID NO: 54) y Gly9-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn (SEQ ID NO: 55).
Los ácidos nucleicos aislados pueden incluir además una secuencia que codifica un péptido señalizador que sirve de secuencia señalizadora para secretar la proteína de fusión de las células hospedadoras. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado no comprende una secuencia que codifica un péptido señalizador.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína de fusión o un componente de una proteína de fusión (por ejemplo, la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR, o el dominio de multimerización) pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNnh, ARNt o cualquier otra forma, o en forma de ADN, que incluye, pero no se limita a, ADNc y ADN genómico obtenido clonando o producido sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario, o cualquier combinación de los mismos. Cualquier porción de al menos una cadena del ADN o ARN puede ser la cadena codificante, también conocida como la cadena codificante, o puede ser la cadena no codificante, también denominada la cadena no codificante. Los ácidos nucleicos aislados se pueden obtener de fuentes biológicas usando cualquier número de metodologías de clonación conocidas por los expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos aislados también se pueden preparar por síntesis química directa por métodos conocidos. Los ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión o componente de proteína de fusión (por ejemplo, la porción extracelular de un PDGFR, la porción extracelular de un VEGFR o el dominio de multimerización) se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una variante previamente preparada o una versión no de variante de la proteína de fusión o componente de proteína de fusión. Véanse Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012) y Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003).
Vectores
La presente divulgación contempla el uso de un vehículo de administración del ácido nucleico para la introducción de una o más secuencias del ácido nucleico que codifican una proteína de fusión o componente de la proteína de fusión en una célula para la expresión de dicha proteína. Los ejemplos de vehículos de administración del ácido nucleico son liposomas, polímeros biocompatibles, que incluyen polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipéptidos; polisacáridos; lipopolisacáridos; envolturas víricas artificiales; partículas metálicas; y bacterias, virus, tales como baculovirus, adenovirus y retrovirus, bacteriófago, cósmido, plásmido, vectores fúngicos y otros vehículos de recombinación normalmente usados en la técnica que se han descrito para la expresión en una variedad de hospedadores eucariotas y procariotas. En algunas realizaciones, el vehículo de administración del ácido nucleico es un vector de expresión, tal como un plásmido. El vector puede incluir cualquier elemento para establecer una función convencional de un vector de expresión, por ejemplo, un promotor, elemento de unión al ribosoma, terminador, potenciador, marcador de selección y origen de replicación. El promotor puede ser un promotor constitutivo, inducible o represible. Los promotores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), la LTR del RSV, la LTR del MoMLV, el promotor de la fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor del virus simio 40 (SV40) y un promotor CK6, un promotor de transtirretina (TTR), un promotor TK, un promotor sensible a la tetraciclina (TRE), un promotor HBV, un promotor hAAT, un promotor LSP, promotores quiméricos específicos del hígado (LSP), el promotor E2F, el promotor de la telomerasa (hTERT); el potenciador del citomegalovirus/beta-actina de pollo/promotor de p-globina de conejo (promotor CAG; Niwa et al., Gene, 1991,108(2): 193-9) y el promotor del factor de elongación 1 -alfa (EFl-alfa) (Kim et al., Gene, 1990, 91 (2):217-23 y Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). Se conocen en la técnica varios vectores de expresión capaces de administrar ácidos nucleicos a una célula (por ejemplo, célula bacteriana, célula de levadura, célula de planta o célula de mamífero) y se pueden usar en el presente documento para la producción de una proteína de fusión o componente de la proteína de fusión en la célula. Por ejemplo, se puede usar E. coli para producir una proteína de fusión si se transforma con un plásmido, tal como pBR322 (Mandel et al., J. Mol. Biol., 1970, 53:154), manipulado para comprender un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. Las proteínas de fusión expresadas o los componentes de la proteína de fusión se pueden recoger de las células y purificar según técnicas convencionales conocidas en la técnica y como se describen en el presente documento.
Células hospedadoras
En el presente documento se proporcionan células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) se pueden proporcionar a una célula diana mediante cualquier medio conocido en la técnica. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una proteína de interés (por ejemplo, una proteína de fusión) está en un vector vírico y el vector se ha encapsidado, entonces los viriones se pueden usar para infectar células. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una proteína de interés (por ejemplo, una proteína de fusión) está en un vector de expresión, tal como un plásmido. Los procedimientos de transfección o transformación que son apropiados para las células particulares se pueden usar para introducir un ácido nucleico que codifica una proteína de interés (por ejemplo, proteína de fusión) en una célula diana. Las formulaciones que utilizan polímeros, liposomas o nanoesferas se pueden usar para la administración de ácidos nucleicos que codifican una proteína de interés (por ejemplo, una proteína de fusión). Las células que se pueden transformar o transfectar con construcciones recombinantes según la invención pueden ser cualesquiera que sean convenientes para un experto en la técnica. Los tipos de células a modo de ejemplo que se pueden usar incluyen bacterias, levadura, hongos, células de insecto, planta y de mamífero. Las células de mamífero a modo de ejemplo que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, hepatocitos, células endoteliales, células madre, células hematopoyéticas, células epiteliales, miocitos, células neuronales y queratinocitos. Estirpes celulares de mamífero a modo de ejemplo adicionales que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, células COS, células VERO, células HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), células 293, células NSO, células SP20, células de fibroblasto 3T3, células W138, células BHK, células HEPG2, células DUX y células MDCK. Estas células se pueden usar para producir y recoger la proteína de interés. En algunos casos, se pueden proporcionar células transformadas o transfectadas a una célula u hospedador de mamífero. Células adecuadas para la administración a una célula u hospedador de mamífero incluyen cualquier tipo de célula de mamífero de cualquier órgano, tumor o estirpe celular. Por ejemplo, se pueden usar células humanas, murinas, de cabra, ovinas, bovinas, de perro, gato y porcinas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana. En realizaciones adicionales, la célula hospedadora es una célula de E. coli.
El término "célula hospedadora" incluye una célula que ha sido o puede ser un receptor para un vector(es) de la presente invención y la descendencia de la misma. La descendencia puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en genómica del complemento de ADN total) a la célula parental original debido a mutación natural, accidental o deliberada. Las células hospedadoras son preferentemente células eucariotas, preferentemente células de mamífero, lo más preferentemente células humanas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana. En realizaciones adicionales, la célula hospedadora es una célula de E. coli.
V. Métodos de producción proteínas de fusión y componentes de la proteína de fusión
En el presente documento se desvelan métodos de producción de proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización). En algunos aspectos, se proporciona un método de producción de cualquier proteína de fusión de la invención que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas de fusión de la invención en una condición tal que produce la proteína de fusión, y recuperar la proteína de fusión producida por la célula hospedadora. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-24.
(1) Cultivo de las células hospedadoras
Las células usadas para producir las proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) de la divulgación se cultivan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células hospedadoras seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen FlO de Ham (Sigma), medio esencial mínimo (MEM, Sigma), RPMI 1640 (Sigma), medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) y caldo de Luria (LB). Además, se puede usar cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem,102:255 (1980), las patentes de EE. UU. N.24.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; publicaciones WIPO N.° WO 90/03430; documento de patente WO 87/00195; o la patente de EE. UU. Re. 30.985 como medio de cultivo para las células. Un medio dado se complementa, en general, según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), DHFR, sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos, oligoelementos y glucosa, o una fuente equivalente de energía. También se puede incluir cualquier otro suplemento necesario en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las previamente usadas con la célula seleccionada para la expresión, y serán evidentes para un experto en la técnica. Para el crecimiento en E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida oscila desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 39 °C, más preferentemente desde aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 37 °C, incluso más preferentemente a aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varíe desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo hospedador. Para E. coli, el pH es preferentemente desde aproximadamente 6,8 hasta aproximadamente 7,4, y más preferentemente aproximadamente 7,0. Si un promotor inducible se usa en el vector de expresión, la expresión de proteínas se induce en condiciones adecuadas para la activación del promotor. Por ejemplo, si se usa un promotor PhoA para controlar la transcripción, las células hospedadoras transformadas se pueden cultivar en un medio limitante de fosfato para la inducción. Se puede usar una variedad de otros inductores, según la construcción de vector empleada, como se conoce en la técnica.
(2) Purificación de proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión
Cuando se usan técnicas recombinantes, las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) descritos en el presente documento se pueden producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretar directamente en el medio. Si los polipéptidos se producen intracelularmente, como primera etapa, la recuperación de proteína implica normalmente alterar la célula, en general, por métodos tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez se han alterado las células, se retiran los residuos de las partículas de las células hospedadoras o de los fragmentos lisados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Si los polipéptidos son secretados en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión, en general, se filtran primero y se concentran usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa, tal como PMSF, en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes casuales.
Las composiciones de proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) preparadas a partir de dichas células se pueden purificar usando, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones, se usa proteína A o proteína G como un ligando de afinidad para su uso en la cromatografía de afinidad. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier región Fc de la inmunoglobulina que está presente en las proteínas de fusión (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1 -13 (1983). En algunas realizaciones, la proteína A se usa como un ligando de afinidad para aislar y purificar las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se usa proteína G como un ligando de afinidad para aislar y purificar las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) como se describe en el presente documento. La matriz a la que se une el ligando de afinidad es casi siempre agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli(estireno-divinil)benceno, permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, heparina, SEPHAROSE™, o resinas de intercambio aniónico o catiónico (tales como una columna de ácido poliaspártico), así como cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo de las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) a recuperar. En algunas realizaciones, la proteína de fusión recuperada es sustancialmente pura. En una realización adicional, la proteína de fusión recuperada es al menos cualquiera de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de pureza. Tras cualquier etapa o etapas preliminares de purificación, la mezcla que comprende las proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) de interés y contaminantes se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba a bajo pH usando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, realizada preferentemente a bajas concentraciones de sales (por ejemplo, sal desde aproximadamente 0-0,25 M).
En general, las diversas metodologías para preparar las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión (por ejemplo, una porción extracelular de un PDGFR, una porción extracelular de un VEGFR y/o un dominio de multimerización) para su uso en investigación, ensayo y aplicaciones clínicas están bien establecidas en la técnica, de acuerdo con las metodologías anteriormente descritas y/o según se consideren apropiadas por un experto en la técnica para proteínas de fusión particulares o componentes de la proteína de fusión de interés.
(3) Actividades biológicas de proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión
Las proteínas se pueden purificar e identificar usando métodos comúnmente conocidos, tales como fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una columna de resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; resinas hidrófobas de afinidad, afinidad por ligando usando un componente de unión adecuado inmovilizado sobre una matriz, centrifugación, ELISA, BIACore, ensayo de transferencia Western, secuenciación de aminoácidos y del ácido nucleico, y actividad biológica.
Las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión desvelados en el presente documento se pueden caracterizar o evaluar para actividades biológicas que incluyen, pero no se limitan a, afinidad por un componente de unión diana (por ejemplo, una proteína de la familia PDGF y/o VEGF), unión competitiva (por ejemplo, bloqueo de componente de unión diana a PDGFR o VEGFR), actividad inhibitoria (por ejemplo, inhibición de la activación de la vía de PDGF o VEGF), inhibición de la proliferación celular, inhibición del crecimiento tumoral e inhibición de la angiogénesis (por ejemplo, neovascularización coroidea). En algunos casos, las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión desvelados en el presente documento se pueden evaluar para actividad biológica in vivo o in vitro. En cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento, el ensayo se realiza a una temperatura de 4 °C, 20-28 °C (por ejemplo, 25 °C) o 37 °C.
Las proteínas de fusión o los componentes de la proteína de fusión desvelados en el presente documento se pueden evaluar para su afinidad por un componente de unión, tal como una proteína de la familia de PDGF (por ejemplo, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C o PDGF-D), un dímero de una proteína de la familia de PDGF (por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC o PDGF-DD) o una proteína de la familia de VEGF (por ejemplo, VEGF-A VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o P1GF). Se conocen en la técnica muchos métodos de evaluación de la afinidad de unión y se pueden usar para identificar las afinidades de unión de proteínas de fusión o componentes de la proteína de fusión por un componente de unión. Las afinidades de unión se pueden expresar como valores de la constante de disociación (Kd) o valores de la concentración eficaz al 50 % (CE50). Se conocen bien en la técnica las técnicas para determinar las afinidades de unión (por ejemplo, valores de Kd), tales como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) y BIAcore. Véanse Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, NY (1988); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (2009); Altschuh et al., Biochem., 31:6298 (1992); y el método de BIAcore desvelado por Pharmacia Biosensor. Por ejemplo, las afinidades de unión de las proteínas de fusión por un componente de unión se pueden determinar usando ELISA. En algunos casos, la unión de las proteínas de fusión a PDGF-BB se ensaya usando ELISA. En este ensayo a modo de ejemplo, las proteínas de fusión secretadas se diluyeron sucesivamente, se mezclaron con ligando PDGF-BB humano a una concentración final de 20 pM y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una plataforma de agitador orbital. Después de la incubación, la cantidad de PDGF-BB no unido se mide por una ELISA específico de PDGF humano (DuoSet para PDGF-BB humano, producto N.° DY220, R&D Systems). La significación estadística en afinidades de unión se analiza usando Prism 5.0d (GraphPad Software, Inc) y se calculó usando la prueba de ANOVA bifactorial, seguida de la corrección de Bonferroni. En un ejemplo adicional, la unión de una proteína de fusión a una proteína de la familia de VEGF se ensaya usando ELISA. En un ensayo a modo de ejemplo, las proteínas de fusión secretadas se diluyen sucesivamente, se mezclan con VEGF humano a una concentración final de 20 pM y se incuban durante la noche a temperatura ambiente en una plataforma de agitador orbital. La cantidad de VEGF no unido se mide entonces por un ELISA específico de VEGF humano (kit de ELISA Quantikine para VEGF humano, Cat. N.° DVE00, R&D Systems).
En cualquiera de las realizaciones en el presente documento, una proteína de fusión tiene una CE50 de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10-8 M o menos, por ejemplo, desde 10-8 M hasta 10-13 M, por ejemplo, desde 10-9 M hasta 10-13 M) para la inhibición de una actividad (por ejemplo, inhibición de la actividad de PDGF y/o actividad de VEGF). En cualquiera de las realizaciones en el presente documento, una proteína de fusión tiene una Kd para un componente de unión (por ejemplo, PDGF y/o VEGF) inferior a aproximadamente cualquiera de aproximadamente 1,0 mM, 500 pM, 100 pM, 50pM, 25 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM,95 nM, 90 nM, 85 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 65 nM, 60 nM, 55 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12,5 pM, 6,25 pM, 5 pM, 4 pM o 3 pM, incluidos, que incluye cualquier valor entre estos números. En algunos casos, las variantes de proteína de fusión descritas en el presente documento se unen a un componente de unión con una afinidad mayor en comparación con la unión de una proteína de fusión no mutante descrita en el presente documento. En algunos casos, la variante de proteína de fusión se une a un componente de unión con al menos cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10.000, incluidos, que incluye cualquier valor entre estos números, mayor afinidad en comparación con la unión del componente de unión por una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9-15.
En algunos casos, las proteínas de fusión desveladas en el presente documento se pueden evaluar para actividades antiproliferativas, tales como reducción de la proliferación celular. Muchos métodos para evaluar las propiedades antiproliferativas para una proteína de fusión se conocen en la técnica. En un ensayo a modo de ejemplo, se pueden usar células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) para demostrar la inhibición de la proliferación celular dependiente de VEGF y/o dependiente de PDGF por una proteína de fusión descrita en el presente documento. En este ensayo, la proteína de fusión se aplica a HUVEC en presencia de VEGF y/o PDGF y se mide la proliferación celular. Por ejemplo, se siembran HUVEC (HUVEC- Cambrex Bio Science Walkersville, Inc) en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2.000 células/pocillo en medio 199 (Invitrogen) complementado con 5 % de suero bovino fetal (Invitrogen) y se deposita durante la noche. Después de la incubación, los medios se sustituyen por medio 199 (Invitrogen) complementado con 5 % de suero bovino fetal (Invitrogen) que contiene un volumen igual (5 pl) de cultivo celular recogido y ligando hVEGF-165 recombinante solo a una concentración final de 10 ng/ml (R&D Systems, Cat. N.° 293-VE), o en combinación con ligando PDGF-BB a una concentración final de 20 ng/ml (R&D Systems, Cat. N.° 220-BB) en un volumen final de 100 pl por pocillo. Las células se incuban a 37 °C en 5 % de CO2 durante tres a cuatro días. Se añade Cell Titer 96 AQueous One Solution Reagent (Promega, Cat. N.° G3580) a 20 pl/pocillo y se toma la absorbancia a 490 nm cuatro horas después para determinar la inhibición de la proliferación celular por la proteína de fusión. En algunos casos, se miden las propiedades antiangiogénicas para una proteína de fusión usando técnicas bien conocidas en la técnica. En un ensayo a modo de ejemplo, se usa un modelo animal de degeneración macular senil húmeda para ensayar la inhibición de la neovascularización en el ojo por la proteína de fusión. En este ensayo, los ojos de ratones adultos normales se tratan con una inyección intravítrea única de una proteína de fusión o una partícula de rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión en el ojo izquierdo (OS) en el día de estudio 0 mientras que el ojo derecho (OD) se deja intacto al tratamiento. Se induce la CNV en ambos ojos usando un láser (por ejemplo, 3 quemaduras dispuestas por ojo. Potencia 200 mW, lugar de 50 pm, 100 ms) en el día de estudio 28. Los ratones se perfunden con FITC-dextrano y se sacrifican en el día de estudio 42. Los ojos se recogen, se fijan en 10 % de formol neutro tamponado y posteriormente se preparan montajes planos coroideos para examinar el grado de neovascularización. El número de quemaduras sin CNV en el ojo tratado (OS) se compara con el ojo contralateral (OD) para determinar la eficacia de la proteína de fusión. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 5.
VI. Partículas víricas y métodos de producción de partículas víricas
En el presente documento también se desvelan partículas víricas que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión descrita en el presente documento. Los vectores víricos se pueden usar para la administración de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión o componente de la proteína de fusión para la expresión de la proteína en una célula diana dentro de un tejido diana particular (por ejemplo, un tejido enfermo). Se conocen muchas especies de virus, y se han estudiado muchas para los fines de administración de ácidos nucleicos a células diana. El ácido nucleico exógeno se puede insertar en un vector, tal como adenovirus, adenovirus parcialmente delecionado, adenovirus completamente delecionado, virus adenoasociado (AAV), retrovirus, lentivirus, etc., para la administración a una célula. En algunos casos, la célula está en un individuo y el virus se administra por una vía intravenosa, intramuscular, intraportal u otra vía de administración. Los vectores víricos más comúnmente usados incluyen los derivados de adenovirus, virus adenoasociados (AAV) y retrovirus, que incluyen lentivirus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Para vectores víricos a modo de ejemplo, véase la patente de EE. UU. N.° 7.928.072 y el documento de patente WO2006/113277.
En algunas realizaciones, la partícula vírica es una partícula de AAV recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende una o dos ITR de AAV y una secuencia que codifica una proteína de fusión de la invención flanqueada por una o dos ITR. El ácido nucleico está encapsidado en la partícula de AAV. La partícula de AAV también comprende proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende componentes operativamente unidos en la dirección de transcripción, secuencias de control que incluyen secuencias de iniciación y terminación de la transcripción, y la(s) secuencia(s) codificante(s) de la proteína de interés (por ejemplo, ácido nucleico que codifica una proteína de fusión). Estos componentes están flanqueados en el extremo 5' y 3' por secuencias funcionales de ITR de AAV. Por "secuencias funcionales de ITR de AAV" se indica que las secuencias de ITR funcionan como se prevé para el rescate, la replicación y la encapsidación del virión de AAV. Véanse Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; y Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16. Para poner en práctica algunos aspectos de la invención, los vectores recombinantes comprenden al menos todas las secuencias de AAV esenciales para la encapsidación y las estructuras físicas para la infección por el rAAV. Las ITR de AAV para su uso en los vectores de la invención no necesitan tener una secuencia de nucleótidos no mutante (por ejemplo, como se describe en Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), y se pueden alterar por la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos o las ITR de AAV pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV. Actualmente se conocen más de 40 serotipos de AAV, y siguen identificándose nuevos serotipos y variantes de serotipos existentes. Véanse Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081 -6; y Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. El uso de cualquier serotipo de AAV se considera dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, un vector de rAAV es un vector derivado de un serotipo de AAV, que incluye sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh8R, AAVrh.10, AAV11 o AAV12. En algunas realizaciones, el ácido nucleico en el AAV comprende una ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh8R, AAVrh.10, AAV11 o AAV12. En algunos casos, un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15 está flanqueado por al menos una ITR de AAV. En algunos casos, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21-24. En realizaciones adicionales, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, a Av 9, AAVrh.8, AAVrh8R, AAVrh.10, AAV11 o AAV12. En realizaciones adicionales, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo de AAV de los clados A-F (Gao, et al. J. Virol.
2004, 78(12) :6381).
Se usan diferentes serotipos de AAV para optimizar la transducción de células diana particulares o para dirigirse a tipos específicos de células dentro de un tejido diana particular (por ejemplo, un tejido enfermo). Una partícula de rAAV puede comprender proteínas víricas y ácidos nucleicos víricos del mismo serotipo o un serotipo mixto. Por ejemplo, una partícula de rAAV puede comprender proteínas de la cápside de AAV2 y al menos una ITR de AAV2 o puede comprender proteínas de la cápside de AAV2 y al menos una ITR de AAV1. En otro ejemplo, una partícula de rAAV puede comprender proteínas de la cápside de AAV1 y al menos una ITR de AAV2. En otro ejemplo más, una partícula de rAAV puede comprender proteínas de la cápside de tanto AAV1 como AAV2, y comprender además al menos una ITR de AAV2. Cualquier combinación de serotipos de AAV para la producción de una partícula de rAAV se desvela en el presente documento como si cada combinación se hubiera expuesto explícitamente en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención proporciona partículas víricas que comprenden un genoma auto-complementante recombinante. Las partículas víricas de AAV con genomas auto-complementantes y métodos de uso de genomas de AAV auto-complementantes se describen en las patentes de EE. UU. N.° 6.596.535; 7.125.717; 7.765.583; 7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; y 8.361.457; y Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111. Un rAAV que comprende un genoma auto-complementante formará rápidamente una molécula de ADN bicatenario en virtud de sus secuencias parcialmente complementantes (por ejemplo, hebras codificantes y no codificantes complementantes de un transgén). En algunos casos, la divulgación proporciona una partícula vírica de AAV que comprende un genoma de AAV, en donde el genoma de rAAV comprende una primera secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, una hebra codificante de la proteína de fusión) y una segunda secuencia de polinucleótidos heteróloga (por ejemplo, una hebra no codificante o antisentido de la proteína de fusión) en donde la primera secuencia de polinucleótidos heteróloga puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia de polinucleótidos a lo largo de la mayoría o toda su longitud. En algunos casos, la primera secuencia de polinucleótidos heteróloga y una segunda secuencia de polinucleótidos heteróloga se unen por una secuencia que facilita el apareamiento de bases intracatenario; por ejemplo, una estructura de horquilla ADN. Las estructuras de horquilla se conocen en la técnica, por ejemplo, en moléculas de ARNip. En algunos casos, la primera secuencia de polinucleótidos heteróloga y una segunda secuencia de polinucleótidos heteróloga se unen por una ITR mutada (por ejemplo, la ITR derecha). En algunos casos, la ITR comprende la secuencia de polinucleótidos 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACT GAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3' (SEQ ID NO: 41). La ITR mutada comprende una deleción de la región D que comprende la secuencia de resolución terminal. Como resultado, con la replicación de un genoma vírico de AAV, las proteínas rep no se escindirán del genoma vírico en la ITR mutada y, como tales, un genoma vírico recombinante que comprende lo siguiente en el orden 5' a 3' se encapsidará en una cápside vírica: una ITR de AAV, la primera secuencia de polinucleótidos heteróloga que incluye secuencias reguladoras, la ITR de AAV mutada, el segundo polinucleótido heterólogo en orientación inversa al primer polinucleótido heterólogo y una tercera ITR de AAV. En algunos casos, la divulgación proporciona partículas víricas de AAV que comprenden un genoma vírico recombinante que comprende una ITR de AAV2 funcional, una primera secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de fusión, una ITR de AAV2 mutada que comprende una deleción de la región D y que carece de una secuencia de resolución terminal funcional, una segunda secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia complementaria a la secuencia que codifica la proteína de fusión de la primera secuencia de polinucleótidos y una ITR de AAV2 funcional.
Las partículas de rAAV se pueden producir usando métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 6.566.118, 6.989.264, 6.995.006. En la práctica de la invención, las células hospedadoras para producir partículas de rAAV incluyen células de mamífero, células de insecto, células vegetales, microorganismos y levadura. Las células hospedadoras también pueden ser células de encapsidación en las que los genes rep y cap de AAV se mantienen establemente en la célula hospedadora o células productoras en las que el genoma del vector de AAV se mantiene establemente. Las células de encapsidación y productoras a modo de ejemplo derivan de células 293, A549 o HeLa. Los vectores de AAV se purifican y formulan usando técnicas convencionales conocidas en la técnica.
En algunos aspectos, se proporciona un método de producción de cualquier partícula de rAAV de la invención en el presente documento que comprende (a) cultivar una célula hospedadora en una condición tal que se producen las partículas de rAAV, en donde la célula hospedadora comprende (i) uno o más genes de encapsidación de AAV, en donde cada dicho gen de encapsidación de AAV codifica una proteína de replicación o encapsidación de AAV; (ii) un pro-vector de rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica cualquier proteína de fusión de la invención flanqueada por al menos una ITR de AAV, y (iii) una función auxiliar de AAV; y (b) recuperar las partículas de rAAV producidas por la célula hospedadora. En algunos casos, un ácido nucleico codifica una proteína de fusión seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12-15. En algunas realizaciones, dicha al menos una ITR de AAV se selecciona del grupo que consiste en ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh8R y AAVrh.10. En algunas realizaciones, dicha proteína de encapsidación se selecciona del grupo que consiste en proteína de la cápside de AAV1, AAV2, Aa V3, AAV4, AAV5, a A6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh8R, AAVrh10, AAV10, AAV11, AAV12 y similares. En realizaciones adicionales, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo de AAV de los clados A-F. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una cápside de AAV9 y un genoma auto-complementante recombinante que comprende ITR de AAV2, una ITR de AAV2 mutante y un transgén que codifica una proteína de fusión. En una realización adicional, las partículas de rAAV se purifican. El término "purificado", como se usa en el presente documento, incluye una preparación de partículas de rAAV que carece de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes donde ocurren naturalmente las partículas de rAAV o se preparan inicialmente a partir de ellas. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden preparar partículas de rAAV aisladas usando una técnica de purificación para enriquecerlas de una mezcla fuente, tal como un lisado de cultivo o sobrenadante de cultivo de producción. El enriquecimiento se puede medir en una variedad de formas, tales como, por ejemplo, por la proporción de partículas resistentes a DNasa (DRP) o copias de genoma (gc) presentes en una disolución, o por infectividad, o se puede medir en relación con una segunda sustancia, posiblemente interferente o presente en la mezcla fuente, tal como contaminantes, que incluyen contaminantes de cultivo de producción o contaminantes en el proceso, que incluyen virus auxiliares, componentes de medios y similares.
En el presente documento también se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una partícula de rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para una variedad de modos de administración descritos en el presente documento, que incluyen, por ejemplo, administración sistémica o localizada. Una composición farmacéutica de un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión descrita en el presente documento se puede introducir por vía sistémica, por ejemplo, por inyección intravenosa, por catéter, véase la patente de EE. UU. N.° 5.328.470, o por inyección estereotáctica, Chen et al., 1994, PNAS, 91: 3054-3057. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de colirios, disoluciones inyectables, o en una forma adecuada para inhalación o administración por vía oral. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un rAAV descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable son adecuadas para administración a seres humanos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un rAAV descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable son adecuadas para inyección intravítrea o administración tópica al ojo. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, que incluyen los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa, polietilenglicol (PEG) y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. La composición farmacéutica puede comprender además componentes adicionales, por ejemplo conservantes, tampones, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes humectantes o clarificantes no iónicos, agentes que aumentan la viscosidad y similares. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden envasar en dosis unitarias únicas o en formas multidosis. Las composiciones también se pueden formular para tener valores osmóticos que son compatibles con el humor acuoso del ojo y los tejidos oftálmicos. Dichos valores osmóticos estarán, en general, en el intervalo de desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 400 mOsm/kg, pero preferentemente serán de aproximadamente 300 mOsm/kg. Las disoluciones oftálmicas útiles para almacenar y/o suministrar vectores de expresión o vectores víricos se han desvelado, por ejemplo, en el documento de patente WO03077796A2.
VII. Proteínas de fusión y partícula vírica para su uso en métodos de tratamiento
Los métodos de la presente divulgación usan cualquier proteína de fusión desvelada en el presente documento. En algunos casos, la proteína de fusión se une a una proteína PDGF o una proteína VEGF. En algunos casos, la proteína de fusión se une a una proteína PDGFR y a una proteína VEGFR. Las proteínas de fusión descritas en el presente documento pueden tener una o más de las siguientes características: (a) se unen a una o más proteínas de la familia de PDGF, tales como PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C o PDGF-D; (b) se unen a una o más proteínas de la familia de VEGF, tales como VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o PIGF; (c) bloquean la unión de una proteína de la familia PDGF a un receptor de PDGF; (d) bloquean la unión de una proteína de la familia de VEGF a un receptor de VEGF; (e) inhiben la activación de la vía de señalización de PDGF y/o la vía de señalización de VEGF; (f) son adecuadas para tratar y/o prevenir una enfermedad, tal como una enfermedad ocular, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria, o cáncer. Las actividades de las proteínas de fusión se pueden medir in vitro y/o in vivo.
La presente divulgación proporciona proteínas de fusión para su uso en métodos de tratamiento de una enfermedad (tal como una enfermedad ocular, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, o cáncer) administrando una cantidad eficaz de cualquier proteína de fusión descrita en el presente documento a un individuo. En la presente invención, se proporciona una proteína de fusión de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína de fusión al sujeto. En algunas realizaciones, el método de tratamiento de una enfermedad comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende la proteína de fusión a un individuo. En algunas realizaciones, el método de tratamiento de una enfermedad comprende administrar una cantidad eficaz de un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión a un individuo. En algunas realizaciones, el método de tratamiento o prevención de uno o más aspectos o síntomas de una enfermedad comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende la proteína de fusión a un individuo. En algunas realizaciones, el método de tratamiento o prevención de uno o más aspectos o síntomas de una enfermedad comprende administrar una cantidad eficaz de un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión a un individuo.
Los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para el tratamiento de una variedad de enfermedades, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad inflamatoria, enfermedad ocular, enfermedad autoinmunitaria, o cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad que se va a tratar incluye, pero no se limita a, artritis reumatoide, artritis inflamatoria, osteoartritis, cáncer, degeneración macular senil (DMS) (tal como DMS húmeda o DMS seca), enfermedad ocular caracterizada por neovascularización (tal como neovascularización coroidea), uveítis (tal como uveítis anterior o uveítis posterior), retinitis pigmentosa y retinopatía diabética.
En ciertas realizaciones, los métodos y las composiciones se pueden usar para tratar una enfermedad autoinmunitaria. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide, esclerosis múltiple o lupus eritematoso sistémico. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmunitaria crónica que conduce a inflamación de las articulaciones. Aunque la AR afecta principalmente a las articulaciones sinoviales, puede afectar a los tejidos y órganos circundantes. La patología de la AR implica un proceso inflamatorio que puede conducir a la destrucción de cartílago y a la anquilosis (fusión) de articulaciones. Otras manifestaciones patológicas de la AR incluyen vasculitis (inflamación de los vasos sanguíneos), que puede afectar a casi cualquier sistema de órganos y puede causar complicaciones adicionales, que incluyen polineuropatía, ulceración cutánea e infarto visceral. Las manifestaciones pleuropulmonares incluyen pleuritis, fibrosis intersticial, síndrome de Caplan, nódulos pleuropulmonares, neumonitis, enfermedad pulmonar reumatoide y arteritis. Otras manifestaciones incluyen el desarrollo de nódulos reumatoides inflamatorios en una variedad de estructuras periarticulares, tales como amplias superficies, así como en la pleura y la meninges. La debilidad y la atrofia del músculo esquelético son comunes.
En ciertas realizaciones, los métodos y las composiciones se pueden usar para tratar una enfermedad inflamatoria. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria es artritis inflamatoria, osteoartritis, psoriasis, inflamación crónica, enfermedad del intestino irritable, inflamación del pulmón o asma. La artritis inflamatoria se refiere a inflamación de las articulaciones que puede resultar de una enfermedad autoinmunitaria, tal como, por ejemplo, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, artritis psoriásica, artritis reactiva, esclerodermia, síndrome de Sjogren, enfermedad de Still y lupus eritematoso sistémico. La artritis inflamatoria también puede ser causada por ciertos tipos de bacterias (tales como con la artritis reactiva) o por depósitos de estructuras cristalinas en las articulaciones (tales como con la gota y la seudogota). Los síntomas característicos de la artritis inflamatoria son dolor e hinchazón de una o más articulaciones, que pueden estar más calientes que las otras articulaciones. La rigidez de las articulaciones tras una inactividad prolongada (tal como por la mañana o después de estar sentado durante un tiempo) es un síntoma muy común. Los pacientes con artritis inflamatoria normalmente tienen múltiples enfermedades de las articulaciones. La osteoartritis, también conocida como artritis degenerativa o enfermedad degenerativa de las articulaciones, es un grupo de anomalías mecánicas que implican la degradación de las articulaciones, que incluyen cartílago articular y hueso subcondral. Los síntomas pueden incluir dolor articular, dolor con la palpación, rigidez, inmovilización, y algunas veces un derrame (es decir, la presencia de elevado líquido intrarticular). Una variedad de causas, por ejemplo, hereditarias, del desarrollo, metabólicas, relacionadas con la obesidad y mecánicas, pueden iniciar procesos que conducen a la pérdida de cartílago. Como los productos de degradación del cartílago se liberan en el espacio sinovial, las células que revisten la articulación intentan retirarlos. Se pueden formar nuevas excrecencias óseas, o “espolones”. Frecuentemente, cuando el hueso está menos protegido por el cartílago, el hueso se puede exponer y dañar. Estos cambios óseos, en combinación con la inflamación de la articulación, causan dolor. Como resultado de la disminución del movimiento secundario al dolor, los músculos regionales se pueden atrofiar, y los ligamentos se pueden volver más laxos.
La angiogénesis persistente y no regulada ocurre en una multiplicidad de estados de enfermedad, tales como el cáncer. En el cáncer, las células se dividen y crecen incontrolablemente, formando tumores malignos, que vascularizan e invaden partes del cuerpo cercanas. El cáncer también se puede diseminar (metastatizar) a partes más distantes del cuerpo a través del sistema linfático o la circulación sanguínea. Las causas del cáncer pueden ser medioambientales (debido a la exposición a sustancias químicas, radiación o debido al estilo de vida), hereditarias o infecciosas. En algunas realizaciones, los métodos y las composiciones se pueden usar para tratar cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de hígado, cáncer de las vías urinarias (por ejemplo, cáncer de vejiga), cáncer de riñón, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer de tiroides, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma), cánceres hematopoyéticos de linaje linfoide o mieloide, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo (CNF), glioblastoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, adenocarcinoma, cánceres de origen mesenquimatoso, tales como un fibrosarcoma o rabdomiosarcoma, sarcoma de tejido blando y carcinoma, coriocarcinoma, hepatoblastoma, sarcoma de Karposi o tumor de Wilms.
Otras enfermedades que están asociadas con la angiogénesis se pueden tratar con los métodos y las composiciones desvelados en el presente documento. Estas enfermedades incluyen aterosclerosis, fibroplasia retrolentral, hiperplasias tiroideas (incluyendo enfermedad de Graves), síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, derrame pericárdico (tal como asociado a pericarditis) y derrame pleural.
En algunas realizaciones, los métodos y las composiciones se pueden usar para tratar una enfermedad ocular. En algunas realizaciones, la enfermedad ocular es DMS, tal como DMS húmeda o DMS seca, uveítis, retinitis pigmentosa, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, y otras enfermedades oculares que implican un proceso inflamatorio local. En algunas realizaciones, la enfermedad ocular se caracteriza por neovascularización, tal como neovascularización coroidea. En algunas realizaciones, la enfermedad ocular es un resultado de trasplante de córnea. La invención se refiere a tratar o prevenir uno o más aspectos o síntomas de una enfermedad ocular que incluye, pero no se limita a, formación de drusas oculares, inflamación en el ojo o tejido del ojo, y pérdida de visión. En ciertas realizaciones, las composiciones y los métodos se pueden usar para detectar y/o tratar uveítis, es decir, inflamación de la úvea, la capa media del ojo debajo de la esclerótica. Se estima que la uveítis es responsable de aproximadamente el 10 %-20 % de la ceguera en los Estados Unidos. La úvea se divide tradicionalmente en 3 áreas, desde la parte delantera a la trasera, el iris, el cuerpo ciliar y la coroides. Las funciones principales de la úvea son la nutrición y el intercambio de gases, la absorción de luz y la secreción del humor acuoso por los procesos ciliares. La uveítis está asociada normalmente a la exposición a toxinas, infección y/o trastornos autoinmunitarios. Sin embargo, en muchos casos, la causa es desconocida. La uveítis puede afectar a uno o a ambos ojos. Los síntomas se pueden desarrollar rápidamente y pueden incluir visión borrosa, manchas oscuras volantes en el campo de visión, dolor de ojos, rojez de los ojos y sensibilidad a la luz. La forma más común de la uveítis es la uveítis anterior, o iritis, que implica la inflamación del iris. Pars plana se refiere a la inflamación de la úvea en el centro del ojo, es decir, entre el iris y la coroides. La uveítis posterior afecta a la parte posterior del ojo, es decir, a la coroides. La inflamación asociada a la uveítis posterior también puede afectar a la retina (retinitis) o a los vasos sanguíneos en la parte posterior del ojo (vasculitis).
En ciertas realizaciones, los métodos y las composiciones se pueden usar para tratar retinitis pigmentosa (RP). La RP es una enfermedad ocular hereditaria que es causada por anomalías de los fotorreceptores (bastones y conos) o el epitelio pigmentario retiniano de la retina. La enfermedad puede conducir a pérdida progresiva de la visión y frecuentemente a ceguera. Los síntomas de la RP incluyen disminución de la visión por la noche o con poca luz, pérdida de la visión lateral (periférica) y, en casos avanzados, pérdida de visión central. El diagnóstico de la RP se basa en la documentación de la pérdida progresiva en función de las células fotorreceptoras por pruebas del campo visual y electrorretinografía. Se conoce que al menos 35 lugares genéticos provocan la "retinitis pigmentosa no sindrómica" (es decir, la RP que no es el resultado de otra enfermedad o parte de un síndrome más amplio).
En ciertas realizaciones, los métodos y las composiciones se pueden usar para tratar retinopatía diabética. La retinopatía diabética se refiere al daño a la retina causado por las complicaciones de la diabetes. Específicamente, las paredes vasculares se comprometen por hiperglucemia, cambiando la formación de la barrera hematorretiniana y haciendo que los vasos sanguíneos retinianos sean más permeables. Los vasos sanguíneos dañados derraman líquido y lípidos en la mácula, lo que hace que se hinche la mácula (es decir, edema macular), que nubla la vista. A medida que progresa la enfermedad, entra en una etapa proliferativa, en la que los vasos sanguíneos crecen a lo largo de la retina y en el humor vítreo que llena el ojo. Estos vasos sanguíneos pueden sangrar, nublar la vista y, por ejemplo, destruir la retina, provocar desprendimiento de retina, o provocar glaucoma neovascular.
En ciertas realizaciones, los métodos y las composiciones se pueden usar para tratar degeneración macular senil (DMS). La DMS se caracteriza por una pérdida progresiva de la visión central que ocurre como resultado del daño a las células fotorreceptoras en un área de la retina denominada la mácula. La DMS se ha clasificado ampliamente en dos estados clínicos: una forma húmeda y una forma seca, representando la forma seca hasta el 80-90 % de los casos totales. La DMS seca se caracteriza por la formación de drusas maculares, acumulaciones amarillas o blancas minúsculas de material extracelular que se forma entre la membrana de Bruch y el epitelio pigmentario de la retina del ojo. La DMS húmeda, que representa aproximadamente el 90 % de la pérdidas de visión graves, está asociada con neovascularización, en donde los vasos sanguíneos crecen desde la coroides debajo de la retina, y con la fuga de estos nuevos vasos. La acumulación de sangre y líquido puede causar el desprendimiento de retina, seguido de la rápida degeneración de los fotorreceptores y la pérdida de visión en cualquier forma de DMS. En general, se acepta que la forma húmeda de la DMS va precedida de y surge a partir de la forma seca.
En el presente documento se desvelan métodos de administración de una cantidad eficaz de una proteína de fusión a un sujeto. La proteína de fusión se puede administrar a un sujeto en una composición. La proteína de fusión también se puede administrar a un sujeto por un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. En el presente documento se contemplan composiciones que comprenden la proteína de fusión o el rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar a un individuo por cualquier vía, que incluye, pero no se limita a, intravenosa (por ejemplo, por bombas de infusión), intraperitoneal, intraocular, intrarterial, intrapulmonar, oral, inhalación, intravesicular, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intraocular, intratecal, transdérmica, transpleural, intrarterial, tópica, inhalacional (por ejemplo, como nieblas de esprays), mucosa (tal como por la mucosa nasal), subcutánea, transdérmica, gastrointestinal, intrarticular, intracisternal, intraventricular, intracraneal, intrauretral, intrahepática e intratumoral. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía intravascular, tal como por vía intravenosa (IV) o por vía intrarterial. En algunas realizaciones, las composiciones se administran directamente en las arterias. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía sistémica (por ejemplo, por inyección intravenosa). En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía local (por ejemplo, por inyección intrarterial o intraocular).
En algunas realizaciones, las composiciones se administran directamente al ojo o al tejido del ojo. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por vía tópica al ojo, por ejemplo, en colirios. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por inyección al ojo (inyección intraocular) o a los tejidos asociados al ojo. Las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, por inyección intraocular, inyección periocular, inyección subrretiniana, inyección intravítrea, inyección transeptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconjuntiva, inyección subtenoniana, inyección retrobulbar, inyección peribulbar, o administración yuxtaescleral posterior. Estos métodos se conocen en la técnica. Por ejemplo, para una descripción de vías perioculares a modo de ejemplo para la administración de fármaco retiniano, véase Raghava et al., Expert Opin. Drug Deliv., 2004, 1(1):99-114. Las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, al humor vítreo, acuoso, esclerótica, conjuntiva, el área entre la esclerótica y la conjuntiva, los tejidos coroideos de la retina, la mácula, u otra área en o próxima al ojo de un individuo. Las composiciones también se pueden administrar al individuo como un implante. Los implantes preferidos son formulaciones biocompatibles y/o biodegradables de liberación sostenida que liberan gradualmente los compuestos durante un periodo de tiempo. Los implantes oculares para la administración de fármaco se conocen bien en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 5.501.856, 5.476.511 y 6.331.313. Las composiciones también se pueden administrar al individuo usando iontoforesis, que incluye, pero no se limita a, los métodos iontoforéticos descritos en la patentes de EE. UU. N.° 4.454.151 y las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.22003/0181531 y 2004/ 0058313.
La cantidad eficaz óptima de las composiciones se puede determinar empíricamente y dependerá del tipo y la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, la progresión de la enfermedad y la salud, la masa y el área corporal del individuo. Dichas determinaciones están dentro de la experiencia de un experto en la técnica. Por ejemplo, cuando se administra por vía intraocular, la cantidad de un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión descrita en el presente documento se puede administrar a un individuo como un título resistente a partículas de DNasa (drps) de aproximadamente 104 a aproximadamente 1014 drps por dosis. En algunas realizaciones, la cantidad de un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se puede administrar a un individuo a aproximadamente 105 a aproximadamente 1013, aproximadamente 106 a aproximadamente 1012, aproximadamente 107 a aproximadamente 1011, aproximadamente 108 a aproximadamente 1010, aproximadamente 109 a aproximadamente 1010, aproximadamente 1010 a aproximadamente 1011, o aproximadamente 1011 a aproximadamente 1012 drps por dosis.
Las composiciones que comprenden una proteína de fusión se pueden administrar en una dosis única diaria, o la dosis diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Las composiciones que comprenden una proteína de fusión también se pueden administrar seis veces a la semana, cinco veces a la semana, cuatro veces a la semana, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses, una vez cada nueve meses, o una vez al año. Las composiciones que comprenden un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión se pueden administrar menos frecuentemente, por ejemplo, una vez cada tres meses, cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses, una vez cada siete meses, una vez cada ocho meses, una vez cada nueve meses, una vez cada diez meses, una vez cada once meses, o una vez al año. En algunas realizaciones, una dosis única de una composición que comprende un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión descrita en el presente documento se administra una vez al año. Las composiciones también se pueden administrar en una formulación de liberación sostenida, tal como en un implante que libera gradualmente la composición para su uso durante un periodo de tiempo, y que permite que la composición se administre menos frecuentemente, tal como una vez al mes, una vez cada 2-6 meses, una vez al año, o incluso una administración única. Los dispositivos de liberación sostenida (tales como pellas, nanopartículas, micropartículas, nanoesferas, microesferas y similares) se pueden administrar por inyección o implantados quirúrgicamente en diversas localizaciones en el ojo o tejido asociado al ojo, tal como intraocular, intravítrea, subrretiniana, periocular, subconjuntiva o subtenoniana.
Las composiciones de la invención (por ejemplo, una proteína de fusión o un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión) se pueden usar tanto solas como en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden administrar solas o en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos por tener un efecto beneficioso sobre la degeneración macular senil (DMS), fijación de retina o tejido retiniano dañado. Los agentes terapéuticos a modo de ejemplo incluyen inhibidores del complemento, antiangiogénicos, agentes anti-VEGF (que incluyen, pero no se limitan a, Macugen (pegaptanib sodio), Eylea (VEGF Trap-Eye) y anticuerpo anti-VEGF, tal como Lucentis® o Avastin®), y agentes anti-PDGF (tal como Fostiva™). Las composiciones de la invención se pueden administrar en combinación con suplementos nutricionales que se ha mostrado que son beneficiosos en la reducción del riesgo de degeneración macular que progresa hacia estados avanzados, por ejemplo, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, óxido de cinc y cobre. Otros cofactores útiles incluyen cofactores que alivian síntomas, que incluye antisépticos, antibióticos, antivíricos y antifúngicos, y analgésicos y anestésicos. En algunas realizaciones, se proporciona una combinación como una administración simultánea, en donde una proteína de fusión o un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión y al menos un agente terapéutico se administran juntos en la misma composición o se administran simultáneamente en diferentes composiciones. En algunas realizaciones, se proporciona una combinación como una administración separada, en donde la administración de una proteína de fusión o un rAAV que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión puede ocurrir antes de, simultáneamente y/o tras la administración de al menos un agente terapéutico. El intervalo entre la administración secuencial puede ser en términos de al menos (o, alternativamente, menos de) minutos, horas o días.
Las composiciones descritas en el presente documento también se pueden usar junto con otras terapias para la DMS, tales como terapia fotodinámica. La terapia fotodinámica implica la administración intravenosa de Visudyne (verteporfin), después de que luz de una longitud de onda específica se aplique a los vasos sanguíneos anormales. La luz activa el Visudyne y destruye los vasos. Alternativamente, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar junto con terapia con láser, que implica el uso de un haz de láser de alta energía para destruir vasos sanguíneos anormales debajo de la mácula.
VIII. Artículos de fabricación y kits
También se desvelan kits o artículos de fabricación que comprenden las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, proteínas de fusión o partículas de rAAV) en envase adecuado. El envase adecuado para las composiciones (tales como composiciones oftálmicas) descritas en el presente documento se conoce en la técnica, e incluye, por ejemplo, viales (tales como viales precintados), recipientes, ampollas, botellas, frascos, envase flexible (por ejemplo, bolsas precintadas de Mylar o de plástico), y similares. Estos artículos de fabricación se pueden esterilizar además y/o cerrar herméticamente.
La presente divulgación también proporciona kits que comprenden las composiciones descritas en el presente documento y pueden comprender además instrucciones sobre los métodos de uso de la composición, tal como usos descritos en el presente documento. Los kits descritos en el presente documento pueden incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para realizar cualquier método descrito en el presente documento. Por ejemplo, en algunos casos, el kit comprende una proteína de fusión descrita en el presente documento y/o un rAAV que codifica una proteína de fusión descrita en el presente documento, un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección intraocular, y uno o más de: un tampón, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa y un prospecto con instrucciones para realizar la inyección intraocular.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Producción de proteínas de fusión sPDGFR-P/Fc.
El ectodominio del receptor de PDGF-beta (PDGFR-p) contiene 5 dominios extracelulares (ECD) numerados 1 a 5 del extremo N al extremo C de la proteína. Se usó el ectodominio de PDGFR-p de longitud completa para generar varias proteínas monoméricas y diméricas truncadas PDGFR-p solubles (PDGFR-p) (Fig. 1A).
Se prepararon dos construcciones monoméricas PDGFR-p que contenían un péptido señalizador (SP) PDGFR-p en el extremo N del ectodominio de PDGFR-p de longitud completa, PDGFR(D1-D5) (SEQ ID NO: 7), o en el extremo N de un ectodominio de PDGFR-p que contenía los cuatro primeros ECD, PDGFR(D1-D4) (SEQ ID NO: 8). Se produjeron tres construcciones dimericas de PDGFR-p fusionando los cinco, tres primeros, o tres primeros dominios del ectodominio (ECD) de PDGFR-p con el extremo N del fragmento de la cadena pesada de la inmunoglobulina G1 humana (Fc de IgG1) por un conector peptídico que consistía en nueve restos de glicina (9Gly) y se denominaron PDGFR(D1 -D5)9G-Fc (SEQ ID NO: 9), PDGFR(D1 -D3)9G-Fc (SEQ ID NO: 10) y PDGFR(D1 -D2)9G-Fc (SEQ ID NO: 11), respectivamente. Similar a las construcciones monoméricas, todas las construcciones diméricas contuvieron un SP en el extremo N de los ectodominios de PDGFR-p de longitud completa o truncados fusionados. Para la construcción de PDGFR(D1-D2)9G-Fc, el plásmido pCMV6-XL5-PDGFRB (Cat. N.° SC309979; Origene, Rockville, MD) se usó como molde junto con cebadores que introdujeron los sitios de restricción Spel (PDGFRBPR6SpeI F: 5'- GACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG (SEQ ID NO: 25) y Agel (PDGFRBPR7AgeI R: 5'-ACCGGTGGATGACACCTGGAGTCTG (SEQ ID NO: 26) en el molde. La amplificación de los productos de PCR se logró con los siguientes parámetros de ciclado: 1 ciclo a 50 °C durante 2 min, 1 ciclo a 95 °C durante 10 min; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s. El producto de PCR se insertó en el plásmido pCR-Blunt II-TOPO usando el kit de clonación TOPO (Invitrogen) y la secuencia del inserto del producto de PCR se verificó por secuenciación antes de la subclonación en los sitios SpeI y Agel del plásmido pCMV/K-D2-9Gly-Fc (véase Pechan P., et al. Gene Ther. (2009), 16:10-16, para una descripción de pCMV/K-D2-9Gly-Fc) para generar el plásmido pCMV-PDGFR-S-(D1-D2)-9Gly-Fc con el marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D2)9G-Fc (SEQ ID NO: 20) bajo el control del promotor del CMV y la secuencia de poliadenilación de SV40. Para la construcción de PDGFR(D1-D5)9G-Fc, el plásmido pCMV6-xL5-PDGFRB (Cat. N.° SC309979; Origene, Rockville, MD) se usó como molde junto con cebadores que introdujeron los sitios de restricción AccI (PDGFRB-PR1-Acc F: 5'-CTATGTCTACAGACTCCAGGTGTC (SEQ ID NO: 27) y Agel (D5-PR9-AgeI-Rev R: 5'-ACCGGTAAAGGGCAAGGAGTGTGGC (SEQ ID NO: 28) en el molde. La amplificación de los productos de PCR se logró con los siguientes parámetros de ciclado: 1 ciclo a 50 °C durante 2 min, 1 ciclo a 95 °C durante 10 min; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s. El producto de PCR se insertó entonces en el plásmido pCR-Blunt II-TOPO usando el kit de clonación TOPO (Invitrogen) y la secuencia del inserto del producto de PCR en el pTOPO-PDGFRB (D3-D5) se verificó por secuenciación. El fragmento SpeI-AccI de 622 pares de bases (pb) del plásmido pCMV-PDGFR-S-(D1 -D2)-9Gly-Fc se insertó en sitios SpeI y AccI del plásmido pTOPO-PDGFRB (d 3-5) para generar el plásmido pTOPO-PDGFR(D1 -D5). El fragmento SpeI-AgeI de 1.596 pb del plásmido pTOPO-PDGFR(D1-D5) se insertó entonces en los sitios SpeI y Agel del plásmido pCMV-PDGFR-S-(D1 -D2)-9Gly-Fc para generar el plásmido pCMV-PDGFR-(D1 -D5)-9Gly-Fc con el marco de lectura abierto de PDGFR(D1 -D5)9G-Fc (SEQ ID NO: 18) bajo el control del promotor del CMV y la secuencia de poliadenilación del SV40. Para la construcción de PDGFR(D1-D3)9G-Fc, el plásmido pCMV-PDGFR (D1-5)9G-Fc se usó como molde junto con cebadores que introdujeron los sitios de restricción SpeI (PDGF02 F: 5'-CCTCCACCGGTGTAGCCGCTCTCAACCACGGT (SEQ ID NO: 29) y Agel (PDGF03 R: 5'-CCCGGGACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG (SEQ ID NO: 30) en la plantilla. La amplificación del producto de PCR se logró con los siguientes parámetros de ciclado: 1 ciclo a 95 °C durante 1 min; 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min. El producto de PCR se insertó en los sitios Spe I y AgeI del plásmido pCMV-PDGFR (D1-5)9G-Fc para completar el marco de lectura abierto de PDGFR (D1-3)9G-Fc (SEQ ID NO: 19). Para la construcción de PDg Fr (D1-D5), el fragmento AgeI-EagI de 5307 pb del plásmido pCMV-sPDGFR(D1-D5)-9G-Fc se unió con un fragmento de oligonucleótido hibridado que consistía en los oligonucleótidos D5-SV40 F: CCGGTTAGGGA (SEQ ID NO: 31) y D5-SV40 B-2: GGCCTCCCTAA (SEQ ID NO: 32) para generar el plásmido pCMVPDGFRB (D1-D5) con el marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D5) (SEQ ID n O: 16) bajo el control del promotor del CMV y la secuencia de poliadenilación del SV40. Para la construcción PDGFR(D1-D4), se unió un fragmento BbvCI-EagI de 4924 pb del plásmido pCMV-sPDGFR(D1 -D5)-9G-Fc con un fragmento de oligonucleótido hibridado que consistía en los oligonucleótidos D4-SV40 F : TGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAG TAGC (SEQ ID NO: 33) y D4-SV40 B: GGCCGCTACTCCAGCACTCGGACAGGGACATTGATCTGTAGCTGGAAGGAGAGC TGGACC (SEQ ID NO: 34) para generar el plásmido pCMV-PDGFRB (D1-D4) con el marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D4) (SEQ ID NO: 17) bajo el control del promotor del CMV y la secuencia de poliadenilación del SV40.
Los pesos moleculares predichos para las proteínas maduras, excluyendo la región del SP, fueron 56,2 kDa para PDGFR(D1 -D5) y 43,6 kDa para PDGFR(D1 -D4). Los pesos moleculares predichos para las proteínas maduras como monómeros, que excluyen la región de SP, fueron 82,7 kDa para PDGFR(D1-D5)9G-Fc, 46,7 kDa para PDGFR(D1-D2)9G-Fc y 58,2 kDa para PDGFR(D1-D3)9G-Fc. Los plásmidos que codifican estas construcciones de proteína se usaron para la transfección de células 293. El medio del que se recogieron las células 72 horas después de la transfección y el medio acondicionado (CM) en bruto se usó para el análisis de las proteínas secretadas PDGFR(D1-D5), PDGFR(D1-D4), PDGFR(D1 -D5)9G-Fc, PDGFR(D1 -D2)9G-Fc y PDGFR(D1 -D3)9G-Fc. La producción de los homodímeros de proteína PDGFR(D1-D5)9G-Fc, PDGFR(D1-D2)9G-Fc y PDg Fr (D1-D3)9G-Fc por células transfectadas con sus construcciones respectivas se confirmó por análisis de transferencia Western. Brevemente, las proteínas secretadas purificadas de medio de cultivo celular se cargaron en geles reductores o no reductores de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). También se cargó la proteína verde fluorescente potenciada (EGFP) purificada de medio de cultivo celular de células transfectadas con una construcción de EGFP sobre los geles y se usó como control. Después de separar las proteínas sobre los geles de SDS-PAGE (NuPAGE Novex 4-12 % de Bis-Tris, Invitrogen), las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sondaron con un anticuerpo biotinilado anti-PDGFR-p humano de cabra (R&D Systems), seguido de marcado con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (R&D Systems) y se reveló con reactivo de quimioluminiscencia (ThermoScientific Pierce) antes de la obtención de imágenes. La movilidad de las proteínas PDGFR(D1-D5)9G-Fc, PDGFR(D1-D2)9G-Fc y PDGFR(D1-D3)9G-Fc cambió en condiciones reductoras y no reductoras, mientras que la movilidad de las proteínas monoméricas PDGFR(D1-D5) y PDGFR(D1-D4) siguió invariable, que indica que las proteínas de fusión PDGFR-p/Fc formaron homodímeros (Fig. 1B).
La afinidad de unión relativa entre el ligando PDGF BB y las proteínas monoméricas y dimericas PDGFR-p se determinó usando un sistema de ensayo de unión a PDGF volumétrico sin células (Fig. 2). Para la producción de proteínas monoméricas y dimericas PDGFR-p, se transfectaron células 293 con plásmidos que codificaban proteínas PDGFR(D1-D5), PDGFR(D1-D4), PDGFR(D1 -D5)9G-Fc, PDGFR(D1 -D2)9G-Fc o PDGFR(D1 -D3)9G-Fc y el medio de cultivo celular se recogió 72 horas después de la transfección. La presencia de proteínas monoméricas y dimericas PDGFR-p secretadas se confirmó por ELISA y análisis de transferencia Western antes del análisis de afinidad de unión. Las proteínas secretadas se diluyeron sucesivamente, se mezclaron con ligando PDGF BB humano (concentración final 20 pM) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una plataforma de agitador orbital. La cantidad de PDGF BB no unido se midió entonces por un ELISA específico de PDGF humano (Human PDGF-BB DuoSet, producto N.° DY220, R&D Systems). La significación estadística en afinidades de unión se analizó usando Prism 5.0d (GraphPad Software, Inc) y se calculó usando la prueba de ANOVA bifactorial, seguido de la corrección de Bonferroni. El análisis de afinidad de unión mostró que la proteína monomérica PDGFR(D1-D4) se unió a PDGF con afinidad significativamente mayor (***p<0,001) que la proteína monomérica PDGFR(D1-D5) que contuvo los 5 ECD (Fig. 2A). Sin embargo, la proteína PDGFR(D1-D5)9G-Fc dimérica de longitud completa, que sirvió de control positivo para la unión de PDGF, fue un ligante de PDGF significativamente mejor (***p<0,001) que tanto PDGFR(D1-D4) como PDGFR(D1-D5) monomérico (Fig. 2A). De tres construcciones dimericas de PDGFR-p acopladas a Fc de IgG1, la construcción con los tres primeros ECD, PDGFR(D1-D3)9G-Fc, fue un ligante de PDGF significativamente mejor (***p<0,001) que la proteína PDGFR(D1-D5)9G-Fc de tamaño completo, mientras que la construcción con los dos primeros ECD, PDGFR(D1-D2)9G-Fc, no mostró afinidad de unión a PDGF (Fig. 2B).
Ejemplo 2: Generación de proteínas híbridas VEGFR1/ PDGFR-p y PDGFR-p/VEGFR-1.
El ectodominio del receptor de Flt-1 (VEGFR-1) contiene 7 dominios extracelulares (ECD) numerados 1 a 7 del extremo N al extremo C de la proteína. Para bloquear tanto los ligandos PDGF BB como VEGF, se generaron proteínas de fusión que comprendían ECD de PDGFR-p y VEGFR1 y se denominaron proteínas híbridas (Fig. 3).
Se usó una proteína de unión a VEGF previamente generada, sFLT01, que consiste en ECD 2 de VEGFR1 humano unido a un fragmento de la cadena pesada de la inmunoglobulina G1 humana (Fc de IgG 1) para generar construcciones de ADN que codificaban las proteínas híbridas VEGFR1/ PDGFR-p o PDGFR-p/VEGFR1. Véase Pechan P., et al. Gene Ther. (2009), 16:10-16, para una descripción de la proteína sFLT01. Se construyó el híbrido 1 de VEGFR1/ PDGFR-p (SEQ ID n O: 12) uniendo un fragmento de sFLT01 que contenía el péptido señalizador (SP) de VEGFR1 y el ECD 2 de VEGFR1 con el extremo N de PDGFR-p ECD 1 -5 por un conector peptídico que consistía en nueve restos de serina (9Ser) que se unió además a Fc de IgG1 por un conector peptídico que consistía en nueve restos de glicina (9Gly). El híbrido 2 de PDGFR-p/VEGFR1 (SEQ ID NO: 13) se construyó uniendo PDGFR-p ECD 1­ 5 y el SP de PDGFR-p con el extremo N de ECD 2 de VEGFR1 por un conector peptídico de 9Ser que se unió además a Fc de IgG1 por un conector peptídico de 9Gly. El híbrido 3 de VEGFR1/ PDGFR-p (SEQ ID n O: 14) y el híbrido 4 de PDGFR-p/VEGFR1 (SEQ ID NO: 15) tuvieron composiciones similares a los híbridos 1 y 2, respectivamente, con la excepción que se usó PDGFR-p ECD 1-3 en lugar de PDGFR-p ECD 1-5. Para la construcción del híbrido 1 de VEGFR1/PDGFR-p, se insertó un fragmento SpeI-XhoI de 372 pb Kozak-SP-D2-9Ser que codificaba un péptido señalizador VEGFR1 fusionado con un dominio D2 de VEGFR1 que comprendía un conector de 9-Serina (9Ser) (SEQ ID NO: 35) en sitios SpeI y XhoI del plásmido pTOPO-PDGFR(D1-D5) para generar el plásmido pTOPO-(D2-9Ser)-PDGFR(D1-D5). El fragmento SpeI-AgeI del plásmido pTOPO-(D2-9Ser)-PDGFR(D1-D5) se insertó en sitios SpeI-Agel del plásmido pCMV-PDGFR-(D1 -D5)-9Gly-Fc para crear pCMV-F(D2-9S)-P(D1 -D5)-9G-Fc o pCMV-Híbrido 1 con el marco de lectura abierto del híbrido 1 de VEGFR1/PDGFR-p (SEQ ID NO: 21) bajo el control de promotor del CMV y secuencia de poliadenilación del SV40. Para la construcción del híbrido 2 de PDGFR-p/VEGFR1, un fragmento BstBI-BmgXI de 678 pb que contenía ADN sintético (GenScript) (SEQ ID NO: 36) se unió con el fragmento BstBI-BmgXI de 5626 pb del plásmido pCMV-sPDGFR(D1 -D5)-9G-Fc para crear pCMV-P(D1 -D5)-9S-F(D2)-9G-Fc o pCMV-Híbrido 2 con un marco de lectura abierto del híbrido 2 de PDGFR-p/VEGFR-1 (SEQ ID NO: 22) bajo el control de promotor del CMV y secuencia de poliadenilación del SV40. Para la construcción del híbrido 3 de VEGFR1/PDGFR-p, un fragmento de BmgBI-PshAI de 452 pb que contenía el ADN sintético (GenScript) (SEQ ID NO: 37) se unió con el fragmento BmgBI-PshAI de 5334 pb del plásmido pCMV- P(D1-D5)-9S-F(D2)-9G-Fc o pCMV-Híbrido 2 para crear pCMV-F(D2-9S)-P(D1-D3)-9G-Fc o pCMV-Híbrido 3 con el marco de lectura abierto del híbrido 3 de VEGFR1/PDGFR-p (SEQ ID NO: 23) bajo el control del promotor del CMV y la secuencia de poliadenilación del SV40. Para la construcción del híbrido 4 de PDGFR-p/VEGFR1, un fragmento de BmgBI-PshAI de 758 pb que contenía ADN sintético (GenScript) (SEQ ID NO: 38) se unió con el fragmento BmgBI-PshAI de 5021 pb del plásmido pCMV-P(D1-D5)-9S-F(D2)-9G-Fc o pCMV-Híbrido 2 para crear pCMV-P(D1 -D3)-9S-F(D2)-9G-Fc o pCMV-Híbrido 4 con el marco de lectura abierto del híbrido 4 de PDGFR-p/VEGFR1 (SEQ ID NO: 24) bajo el control de promotor del CMV y secuencia de poliadenilación del SV40.
La producción de los homodímeros de proteína el híbrido 1, el híbrido 2, el híbrido 3 y el híbrido 4 por células transfectadas con sus construcciones respectivas se confirmó por análisis de transferencia Western. Brevemente, las proteínas secretadas del medio de cultivo celular se cargaron en geles reductores o no reductores de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La proteína PDGFR(D1-D5)9G-Fc también se cargó sobre los geles y se usó como control. Después de separar las proteínas sobre los geles de SDS-PAGE (NuPAGE Novex 4-12 % de Bis-Tris, Invitrogen), las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sondaron con un anticuerpo biotinilado anti-PDGFR-p humano de cabra (R&D Systems), seguido de marcado con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (R&D Systems) y se revelaron con reactivo de quimioluminiscencia (ThermoScientific Pierce) antes de la obtención de imágenes. La movilidad de proteína de los híbridos 1, 2, 3 y 4 en condiciones no reductoras en comparación con condiciones reductoras confirmó que las proteínas híbridas dimerizaron (Fig. 4). PDGFR(D1-D5)9G-Fc y los híbridos 1 y 2, que contienen todos cinco ECD de PDGFR-p, mostraron dos bandas positivas para PDGFR en condiciones reductoras, lo que indica una posible escisión proteolítica de estas proteínas en el área del quinto ECD de PDGFR-p (Fig. 4, panel izquierdo). Los híbridos 3 y 4, que solo contienen los tres primeros ECD de PDGFR-p, no parecen escindirse, lo que indica que no contienen el sitio de escisión proteolítica observado en los híbridos 1 y 2 (Fig. 4, panel izquierdo).
Ejemplo 3: Inhibición de la proliferación de HUVEC por proteínas híbridas PDGFR-p/VEGFR1.
Se probaron las proteínas híbridas PDGFR-p/ VEGFR1 para su capacidad para inhibir la proliferación inducida por VEGF y/o PDGFR-p de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Para la producción de proteínas híbridas, se transfectaron células 293 con construcciones que codificaban el híbrido 1, híbrido 2, híbrido 3 o híbrido 4 y el medio de cultivo celular que contenía las proteínas híbridas secretadas se recogió 72 horas después de la transfección. El cultivo celular recogido se aplicó a HUVEC en presencia de ligando de VEGF. Se sembraron HUVEC (HUVEC- Cambrex Bio Science Walkersville, Inc) en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2.000 células/pocillo en medio 199 (Invitrogen) complementado con 5 % de suero bovino fetal (Invitrogen) y sedimentaron durante la noche. Después de la incubación, el medio se sustituyó con medio 199 (Invitrogen) complementado con 5 % de suero bovino fetal (Invitrogen) que contenía un volumen igual (5 pl) de cultivo celular recogido generado de tres transfecciones independientes de receptor o control junto con ligando de hVEGF-165 recombinante solo a una concentración final de 10 ng/ml (R&D Systems, Cat. N.° 293-VE), o en combinación con ligando de PDGF-BB a una concentración final de 20 ng/ml (R&D Systems, Cat. N.° 220-BB) en un volumen final de 100 pl por pocillo. Los controles negativos consistieron en un volumen igual (5 pl) de cultivo celular recogido de células transfectadas con una construcción de EGFP en un volumen final de 100 pl por pocillo. Los controles positivos incluyeron cultivo celular recogido de un volumen igual (5 pl) de células transfectadas con una construcción de EGFP en presencia de ligando de VEGF o ligando de VEGF y PDGF BB en 100 pl de volumen final por pocillo. Las células se incubaron a 37 °C en 5 % de CO2 durante tres a cuatro días. Se añadió Cell Titer 96 AQueous One Solution Reagent (Promega, Cat. N.° G3580) a 20 pl/pocillo y se tomó la absorbancia a 490 nm cuatro horas después. En el ensayo de proliferación de HUVEC dependiente de VEGF, el híbrido 2, el híbrido 3 y el híbrido 4 bloquearon significativamente la proliferación de HUVEC con los híbridos 2 y 4 que tenían una potencia similar a sFLT01 (Fig. 5A). En comparación con los híbridos 2, 3 y 4, el híbrido 1 no bloqueó la proliferación de HUVEC inducida por VEGF y tuvo niveles similares de actividad antiproliferativa a la proteína la PDGFR(D1-D5)9G-Fc que carece de ECD de VEGFR1 (Fig. 5A). La escisión proteolítica de la secuencia de Fc de IgG 1 dimerizante en el híbrido 1 eliminó probablemente su capacidad de unión a VEGF, debido a que la dimerización es un factor limitante para la unión de VEGF mediada por VEGFR1 D2 cuando otros ECD no están presentes (Pechan P., et al. Gene Ther. (2009), 16:10-16). En el híbrido 2, sin embargo, la escisión proteolítica separó la molécula en unidades que contenían ECD de PDGFR-p y sFLT01 que todavía fueron capaces de unirse a VEGF (Fig. 5A). Las proteínas híbridas PDGFR-p/VEGFR1 recogidas también se probaron en un ensayo de proliferación competitiva de HUVEC. En este ensayo, el cultivo celular recogido se aplicó a HUVEC en presencia de tanto el ligando de VEGF como el ligando de PDGF BB como se ha descrito anteriormente. Los resultados de este ensayo fueron similares al ensayo previo en el que el híbrido 2 y el híbrido 4 bloquearon significativamente la proliferación de HUVEC con los híbridos 2 y 4 que tienen una potencia similar a sFLT01 (Fig. 5B). El híbrido 1 tampoco bloqueó la proliferación de HUVEC en presencia de ambos ligandos. A diferencia del último ensayo, el híbrido 3 tuvo menor potencia antiproliferativa en presencia de ambos ligandos y fue comparable a la actividad de la proteína PDGFR(D1 -D5)9G-Fc que carece de ECD de VEGFR1 (Fig. 5B). La significación estadística para ambos ensayos de proliferación de HUVEC se analizó usando Prism 5.0d (GraphPad Software Inc) y se calculó usando la prueba de ANOVA unifactorial, seguida de la prueba de Tukey.
Ejemplo 4: Afinidades de unión para proteínas híbridas PDGFR-0/VEGFR1.
Se determinaron las afinidades de unión relativas entre tanto los ligandos VEGF y PDGF BB como las proteínas híbridas PDGFR-p/VEGFR1 usando un sistema de ensayo de unión de PDGF o VEGF volumétrico sin células (Fig. 6). Para la producción de proteínas híbridas PDGFR-p/VEGFR1, se transfectaron células 293 con plásmidos que codificaban el híbrido 1, híbrido 2, híbrido 3 o híbrido 4. Las células también se transfectaron con plásmidos que codificaban proteínas PDGFR(D1 -D5)9G-Fc o sFLT01 para su uso como controles de unión. El medio de cultivo celular se recogió 72 horas después de la transfección y la presencia de proteínas secretadas se confirmó por ELISA y análisis de transferencia Western antes del análisis de afinidad de unión. Las proteínas secretadas se diluyeron sucesivamente, se mezclaron con el ligando VEGFR1 humano (concentración final 20 pM) o el ligando PDGF BB humano (concentración final 80 pm) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una plataforma de agitador orbital. La cantidad de PDGF BB no unido se midió entonces por un ELISA específico de VEGF humano (kit de ELISA Quantikine para VEGF humano, Cat. N.° DVE00, R&D Systems) o un ELISA específico de PDGF humano (Human PDGF-BB DuoSet, R&D Systems). La comparación de los cuatro híbridos en el ensayo de unión de VEGF mostró que el híbrido 1 era el ligante de VEGF más débil (Fig. 6A). La comparación de unión a VEGF del híbrido 3, híbrido 4 y sFLT01 en medio acondicionado recogido de tres transfecciones individuales en un ensayo mostró que el híbrido 4 se unió a VEGF similarmente a sFLT01 y fue un ligante de VEGF más fuerte que el híbrido 3 (Fig. 6A). La comparación de los cuatro híbridos en el ensayo de unión a PDGF demostró que el híbrido 1 también era el ligante de PDGF más débil, mientras que el híbrido 4 demostró la mejor unión de los cuatro híbridos (Fig. 6B).
Se realizaron ensayos de unión competitiva sin células de VEGF y PDGF usando medio acondicionado recogido de células 293 transfectadas con construcciones que codificaban el híbrido 3, el híbrido 4, proteínas PDGFR(D1-D3)9G-Fc o sFLT01. El medio de cultivo celular se recogió 72 horas después de la transfección y la presencia de proteínas secretadas se confirmó por ELISA y análisis de transferencia Western antes del análisis de afinidad de unión. Las proteínas secretadas se diluyeron sucesivamente, se mezclaron con tanto ligando PDGF BB humano (concentración final 20 pM) como ligando VEGFR1 humano (concentración final 20 pM) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una plataforma de agitador orbital. La cantidad de ligandos PDGF-BB y VEGF no unidos se midió posteriormente por un ELISA específico de VEGF humano (kit de ELISA Quantikine para VEGF humano, Cat. N.° DVE00, R&D Systems) o un ELISA específico de PDGF humano (Human PDGF-b B DuoSet, R&D Systems). La comparación del híbrido 3 y el híbrido 4 con el control de unión de PDGF BB (PDGFR(D1-D3)9G-Fc) y el control de unión de VEGF (sFLT01) mostró que el híbrido 3 y el híbrido 4 se unieron ambos a los ligandos PDGF BB (Fig. 7A) y VEGF (Fig. 7B), demostrando el híbrido 4 una mayor afinidad de unión por ambos ligandos. La comparación de la unión de PDGF usando medio de cultivo celular de células que expresan el híbrido 3, el híbrido 4, PDGFR(D1 -D5)9G-Fc o PDGFR(D1-D3)9G-Fc demostró que el híbrido 4 tenía una afinidad similar por el mejor ligante de PDGF, PDGFR(D1-D3)9G-Fc (Fig. 7A), mientras que PDGFR(D1-D5)9G-Fc fue un ligante de PDGF significativamente más débil que todos los híbridos 1 a 4 (Fig. 6B) o PDGFR(D1 -D3)9G-Fc (Fig. 2B).
Ejemplo 5: Inhibición de la CNV inducida por láser en ratones por proteínas híbridas PDGFR-p/VEGFR1.
Los vectores de virus adenoasociado (AAV) son herramientas atractivas para la administración génica intraocular debido a su naturaleza no patógena, toxicidad mínima e inmunogenicidad, su capacidad para transducir células no divisoras y sus posibilidades de una expresión de por vida de una proteína terapéutica (Ali et al. 1996; Ali et al. 1997; Ali et al., 1998; Lai et al. 2005).
Para la administración medida por virus adenoasociado del híbrido 4, el promotor del CMV se sustituyó por un intrón/potenciador de CMV del promotor de beta-actina de pollo y se insertó el casete de expresión que comprendía el promotor y el fragmento que codificaba el híbrido 4 en los sitios RsrII y MluI de un vector plasmídico prevírico pAAVSP70. Véase Ziegler et al. Mol Ther., 2004; 9: 231-240. El tamaño total del genoma del Aa V resultante en el plásmido sp70.BR/híbrido 4 fue 4,6 kb. El vector recombinante AAV2.Híbrido 4 se produjo por transfección triple de células 293 usando plásmidos auxiliares p5rep-D-CMVcap y pHelper (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.), y se purificó según el protocolo de fabricación usando un gradiente de etapa de iodixanol y la columna HiTrap Heparin (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, EE. UU.) en un sistema ÁKTA FPLC (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Véase Vincent at al., J Virol., 1997; 71: 1897-1905. La preparación vírica AAV2.Híbrido 4 tuvo un título de 2,2E12 drps (partículas resistentes a DNasa) por ml. Los títulos víricos se determinaron usando un ensayo de PCR en tiempo real TaqMan (ABI Prism 7700; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). AAV2.sFLT02 se construyó como se describe previamente en la patente de EE. UU. número 7.928.072 usando un ácido nucleico (SEQ ID NO: 40) que codifica la proteína VEGFR1 D2-9Gly-CH3 (SEQ ID NO: 39). AAV2.Híbrido 4, AAV2.sFLT02, o AAV2.PDGFR (p Dg f R = PDGFR(D1-D3)9G-Fc) se administró por administración intravítrea en un modelo de neovascularización coroidea (CNV) de ratón por láser para evaluar la eficacia in vivo del híbrido 4 en la inhibición de CNV. Brevemente, los ojos de ratones C57BL/6 adultos normales se trataron con una inyección intravítrea única de 1 E9 drps de AAV2.Híbrido 4, AAV2.sFLT02 o AAV2.PDGFR en el ojo izquierdo (OS) en el día de estudio 0 mientras que el ojo derecho (OD) se dejó intacto al tratamiento. La CNV se indujo en ambos ojos usando un láser (3 quemaduras dispuestas por ojo. Potencia 200 mW, lugar de 50 pm, 100 ms) en el día de estudio 28. Los ratones se perfundieron con 5 mg/ml de 2,0 x 106 de peso molecular de FITC-dextrano y se sacrificaron en el día de estudio 42. Los ojos se recogieron, se fijaron en 10 % de formol tamponado neutro y posteriormente se prepararon en montajes planos coroideos preparados para examinar el grado de neovascularización. El número de quemaduras sin CNV en el ojo tratado (OS) se comparó con el ojo contralateral (OD). El análisis de la eficacia in vivo demostró que una única inyección intravítrea de AAV2.Híbrido 4 fue más eficaz que AAV2.sFLT02 en la inhibición de la neovascularización retiniana (Fig. 8). Además, AAV2.PDGFR no inhibió la neovascularización retiniana en el modelo de CNV murina inducida por láser (Fig. 8).
SECUENCIAS
Secuencia de aminoácidos de la región extracelular D1-D3 de PDGFR
LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTN
LTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPC
RYTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYV
YRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTD
FLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGY (SEQ ID
NO:l)
Secuencia de aminoácidos de la región extracelular D1-D4 de PDGFR
LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTN
LTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPC
RVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYV
YRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTD
FLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEV
GTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSE
LTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLE (SEQ ID NO:2)
Secuencia de aminoácidos de la región extracelular D1-D5 de PDGFR
LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTN
LTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPC
RVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYV
YRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTD
FLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYYRLLGEV
GTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSE
LTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCR
GRGMPQPNIIWS ACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEES QLETNVT YWEEEQEFEVVSTL
RLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFK (SEQ ID NO:3)
Secuencia de aminoácidos de la región extracelular D2 de VEGFR1
RPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFII
SNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT (SEQ ID NO:4)
Secuencia de aminoácidos de la región extracelular D1-D3 de VEGFR1
PELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSKESERLSITKSACGRNGKQF
CSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHM
TEGRELYIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEA
TVN GHLYKTN YLTHRQTNTIID V QISTPRP VKLLRGHTL VLN CT ATTPLNTR V QMTW
SYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVN
TSVHIYDK (SEQ ID NO:5)
Secuencia de aminoácidos de la región Fc de IgG1
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK (SEQ ID NO:6)
Secuencia de aminoácidos de PDGFR(D1-D5) con péptido secretor (subrayado)
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPOISOGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSA
PVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERK
RLYIF VPDPTV GFLPND AEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLV YTLHEKKGD V ALP VP YD
HQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENIT
LMCIYIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTC
NVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTV
LWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAE
VQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELP
PTLLGN S SEEES QLETN VT YWEEEQEFE V VSTLRLQH VDRPLS VRCTLRN A V GQDT Q
EVIVVPHSLPFK (SEQ ID NO:7)
Secuencia de aminoácidos de PDGFR(D1-D4) con péptido secretor (subrayado)
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISOGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSA
PVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERK
RLYIF VPDPTV GFLPND AEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLV YTLHEKKGD V ALP VP YD
HQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENIT
LMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTC
NVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTV
LWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAE
VQLSFQLQINVPVRVLE (SEQ ID NO:8)
Secuencia de aminoácidos de PDGFR(D1 -D5)9G-Fc con péptido secretor (subrayado)
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPOISOGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSA
PVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERK
RLYIF VPDPTV GFLPND AEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDV ALP VP YD
HQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENIT
LMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTC
NVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTV
LWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAE
VQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELP
PTLLGN S SEEES QLETN VT YWEEEQEFE V VSTLRLQH VDRPLS VRCTLRN A V GQDT Q
EVIVVPHSLPFKGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI
SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV
LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:9)
Secuencia de aminoácidos de PDGFR(D1-D3)9G-Fc con péptido secretor (subrayado)
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPOISOGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSA
PVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERK
RLYIF VPDPTV GFLPND AEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLV YTLHEKKGD V ALP VP YD
HQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENIT
LMCIYIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTC
NVTESVNDHQDEKAINITVVESGYGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 10)
Secuencia de aminoácidos de PDGFR(D1-D2)9G-Fc con péptido secretor (subrayado)
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPOISOGLVVTPPGPELVLNYSSTFVLTCSGSA
PVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERK
RLYIF VPDPTV GFLPND AEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDV ALP VP YD
HQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSGGGGGGGGGPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ
ID NO: 11)
Secuencia de aminoácidos del híbrido 1
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITV
TLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT
SSSSSSSSSQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKA
QDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEE
LFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIG
DREVDSD A YYVYRLQVSSINVS VN A V QTV VRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPR
KESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITV
VESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIAL
STRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSE
SHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTY
WEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFTGGGGGGG
GGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWY VDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK (SEQ ID NO: 12)
Secuencia de aminoácidos del híbrido 2
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSA
PVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERK
RLYIF VPDPTV GFLPND AEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLV VTLHEKKGD V ALP VP YD
HQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENIT
LMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTC
NVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTV
LWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAE
VQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELP
PTLLGN S SEEES QLETN VT YWEEEQEFE V VSTLRLQH VDRPLS VRCTLRN AY GQDT Q
EVIVVPHSLPFSSSSSSSSSRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPL
DTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTGGGGGG
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13)
Secuencia de aminoácidos del híbrido 3
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITV
TLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT
SSSSSSSSSQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKA
QDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEE
LFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIG
DREVDSD A YYV YRLQVSSINVS VN A V QTV VRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPR
KESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITV
VESGYTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEYHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW
LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14)
Secuencia de aminoácidos del híbrido 4
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSA
PVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERK
RLYIF YPDPT Y GFLPND AEELFIFLTEITEITIPCR VTDPQLV VTLHEKKGD V ALP VP YD
HQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENIT
NVTESVNDHQDEKAINITVVESGYSSSSSSSSSRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCR
VTSPNrrVTLKKFPLDTLIPDGKRHWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTN
YLTHRQTGGGGGGGGGPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
VTC V V VD V S HEDPE VKFNWY VDG VEVHN AKTKPREEQ YNST YRV V S VLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLV
KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 15)
Marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D5)
ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGC
TGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCC
CCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGG
GTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGG
CCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGG
GCT AG ACACGGGAGAAT ACTTTTGC ACCCAC AATGACTCCCGTGGACTGGAGAC
CGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTC
CCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCA
TTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAG
GGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTT
GAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCT
GATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACG
CAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGAT
CGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCG
GCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCC
ATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAAT
GTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTG
GTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCT
GAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCC
ACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAA
ATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACA
CTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATG
AGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGT
GCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCG
TGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAA
AAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGA
GAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGT
GGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCAC
GCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTC
CTTGCCCTTTT A A (SEQ ID NO: 16)
Marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D4)
ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGC
TGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCC
CCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGG
GTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGG
CCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGG
GCT AG ACACGGGAGAAT ACTTTTGC ACCCAC AATGACTCCCGTGGACTGGAGAC
CGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTC
CCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCA
TTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAG
GGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTT
GAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCT
GATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACG
CAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGAT
CGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCG
GCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCC
ATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAAT
GTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTG
GTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCT
GAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCC
ACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAA
ATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACA
CTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATG
AGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGT
GCTGGAGTAG (SEQ ID NO: 17)
Marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D5)9G-Fc
ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGC
TGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCC
CCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGG
GTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGG
CCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGG
GCT AG AC ACGGG AG A AT ACTTTTGC ACCC AC A ATG ACTCCCGTGG ACTGGAG AC
CGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTC
CCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCA
TTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAG
GGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTT
GAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCT
GATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACG
CAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGAT
CGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCG
GCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCC
ATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAAT
GTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTG
GTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCT
GAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGGTAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCC
ACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAA
ATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACA
CTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATG
AGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGT
GCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCG
TGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAA
AAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGA
GAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGT
GGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCAC
GCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTC
CTTGCCCTTTACCGGTGG ACiGTGG AGGTGCi A C i C i T C i C t AGGTCCT A A ATCTTGTG AC
AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA
GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG
AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCA
ACTGGT ACGTGGACGGCGTGG AGGTGC AT A ATGCC A AG AC A A AGCCGCGGG AGG
AGCAGT ACAAC AGC ACGT ACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG
ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAG
CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG
TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA
ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG
GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG
GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG (SEQ ID NO: 18)
Marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D3)9G-Fc
ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGC
TGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCC
CCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGG
GTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGG
CCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGG
h v_iv p _^ t x n a h v a j p v a n j r \ z n j v n j n \ n u n \ n a t x a r v r \ ^ 'T x T x T x T x v n j v r ^ r a v v n ^ n v ^ n v ^ a r u p ^ a r v r a v t x p v , j / a x p u t x p p p p x t v j p v j p n v â p x t v p j \ / j / x í a \ j n p v â p
CGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTC
CCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCA
TTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAG
GGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTT
GAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCT
GATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACG
CAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGAT
CGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCG
GCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCC
ATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAAT
GTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTG
GTTG AGAGCGGCT AC ACCGGTGGAGGTGG AGGTGGAGGTGGAGGTCCT A AATCT
TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA
CCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA
AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC
GGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC
TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAAC
CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCA
GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA
GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC
CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA
GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC
ACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG (SEQ ID NO: 19)
Marco de lectura abierto de PDGFR(D1-D2)9G-Fc
ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGC
TGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCC
CCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGG
GTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGG
CCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGG
GCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCACCCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGAC
CGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTC
CCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCA
TTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAG
GGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTT
GAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCT
GATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCACCGGTGGAGGTGGAGGTG
GAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG
CACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA
CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC
CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT
AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC
AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC
AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAG
CTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG
ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG
TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG
AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATA
G (SEQ ID NO:20)
Marco de lectura abierto del híbrido 1
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGC TTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAAT TATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCT AACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAA AACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACA AAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGA CAAACTATCTCACACATCGACAAACCTCGAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCCA GATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTC TCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGA TGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCA GCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCAC CCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTT GTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCT TTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCT GGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGA TC ACC AACGTGGCTTTTTTGGT ATCTTTG AGGAC AGAAGCT ACATCTGC AAA ACC ACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGG TGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGA GAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGG ACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTC TTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAG AAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGG ATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGG GAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCTGAGCTGCATCGGAGCCGGACACTGCAGG TAGTGTTCGAGGCCTACCCACCGCCCACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCAC CCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAAATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGA GACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACACTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGG CCACTACACCATGCGGGCCTTCCATGAGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAG CTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACA GTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCGTGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCA TCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAAAAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCT GCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTG GGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGA
TCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCA
GGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTACCGGTGGAGGTGGAGGTGGA
GGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA
CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA
CCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA
CGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGG AGGTGCAT AA
TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG
CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA
GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA
AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCT
GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA
CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA
CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGA
GGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG
(SEQ ID N0:21)
Marco de lectura abierto del híbrido 2
ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGC
TGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCC
CCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGG
GTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGG
CCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGG
GCT AG AC ACGGG AG A AT ACTTTTGC ACCC AC A ATG ACTCCCGTGG ACTGG AG AC
CGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTC
CCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCA
TTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAG
GGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTT
GATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACG
CAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGAT
CGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCG
GCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCC
ATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAAT
GTGACG G AG AG TG TG AATG ACCATCAG G ATG AAAAG G CCATCAACATCACCG TG
GTTGAGAGCGGCTACGTGCGGCTCCTGGGAGAGGTGGGCACACTACAATTTGCT
G AGCTGC ATCGGAGCCGG ACACTGC AGGT AGTGTTCG AGGCCT ACCC ACCGCCC
ACTGTCCTGTGGTTCAAAGACAACCGCACCCTGGGCGACTCCAGCGCTGGCGAA
ATCGCCCTGTCCACGCGCAACGTGTCGGAGACCCGGTATGTGTCAGAGCTGACA
CTGGTTCGCGTGAAGGTGGCAGAGGCTGGCCACTACACCATGCGGGCCTTCCATG
AGGATGCTGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGT
GCTGGAGCTAAGTGAGAGCCACCCTGACAGTGGGGAACAGACAGTCCGCTGTCG
TGGCCGGGGCATGCCCCAGCCGAACATCATCTGGTCTGCCTGCAGAGACCTCAA
AAGGTGTCCACGTGAGCTGCCGCCCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGA
GAGCCAGCTGGAGACTAACGTGACGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGT
GGTGAGCACACTGCGTCTGCAGCACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCAC
GCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGGACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTC
CTTGCCCTTTAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGCCTTTCGTAGAGATGTACA
GTGAAATCCCCG AAATTATACACATG ACTG AAG G AAG G G AG CTCG TCATTCCCT
GCCGGGTTACG TCACCTAACATCACTG TTACTTTAAAAAAG TTTCCACTTG ACAC
TTTG ATCCCTG ATG G AAAACG CATAATCTG G G ACAG TAG AAAG G G CTTCATCATA
TC AAATG C AAC G T AC A A A G A A A T AGGGCTTCTGACCTGTGAAGC AAC AGTC A A T
G G G CATTTG TATAAG ACAAACTATCTCACACATCG ACAAACCG G TG G AG G TG G A
GGTG GAGG TG GAG GTCCTAAATCTTG TGACAAAACTCACACATG CCCACCGTGC
CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA
AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGT
GAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT
GC A T A ATGCC A AG AC A A AGCCGCGGG AGG AGC AG T AC A AC AGC ACGT ACCGTGT
GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA
GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA
AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA
TGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCC
AGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGG CAGCCG GAG AACAACTACAA
GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC
ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG
CATGAGGCTCTGCAC AACC AC T ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT A
AA TA G (SEQ ID NO:22)
Marco de lectura abierto del híbrido 3
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGC
TTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAAT
TATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCT
AACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAA
AACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACA
AAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGA
CAAACTATCTCACACATCGACAAACCTCGAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCCA
GATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCCCCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTC
TCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGGGTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGA
TGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGGCCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCA
GCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGGGCTAGACACGGGAGAATACTTTTGCAC
CCACAATGACTCCCGTGGACTGGAGACCGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTT
GTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTCCCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCT
TTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCATTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCT
GGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAGGGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGA
TC ACC AACGTGGCTTTTTTGGT ATCTTTG AGGAC AGAAGCT ACATCTGC AAA ACC
ACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCTGATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGG
TGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACGCAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGA
GAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGG
ACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTC
TTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAG
AAGACTCGGGGACCTACACCTGCAATGTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGG
ATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGAGCGGCTACACCGGTGGAGGTG
GAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT
GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC
CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA
CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGC AT A ATGCC A AG AC A A AGCCGCGGG AGG AGC AGT AC A AC AGC ACGT ACC
GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT
ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCT
CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC
GGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT
ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT
ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA
GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT
GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCG
GGTAAATAG (SEQ ID NO:23)
Marco de lectura abierto del híbrido 4
ATGCGGCTTCCGGGTGCGATGCCAGCTCTGGCCCTCAAAGGCGAGCTGCTGTTGC
TGTCTCTCCTGTTACTTCTGGAACCACAGATCTCTCAGGGCCTGGTCGTCACACCC
CCGGGGCCAGAGCTTGTCCTCAATGTCTCCAGCACCTTCGTTCTGACCTGCTCGG
GTTCAGCTCCGGTGGTGTGGGAACGGATGTCCCAGGAGCCCCCACAGGAAATGG
CCAAGGCCCAGGATGGCACCTTCTCCAGCGTGCTCACACTGACCAACCTCACTGG
GCT AG AC ACGGG AG A AT ACTTTTGC ACCC AC A ATG ACTCCCGTGG ACTGG AG AC
CGATGAGCGGAAACGGCTCTACATCTTTGTGCCAGATCCCACCGTGGGCTTCCTC
CCTAATGATGCCGAGGAACTATTCATCTTTCTCACGGAAATAACTGAGATCACCA
TTCCATGCCGAGTAACAGACCCACAGCTGGTGGTGACACTGCACGAGAAGAAAG
GGGACGTTGCACTGCCTGTCCCCTATGATCACCAACGTGGCTTTTTTGGTATCTTT
GAGGACAGAAGCTACATCTGCAAAACCACCATTGGGGACAGGGAGGTGGATTCT
GATGCCTACTATGTCTACAGACTCCAGGTGTCATCCATCAACGTCTCTGTGAACG
CAGTGCAGACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGAT
CGGGAATGAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCG
GCTGGTGGAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCC
ATCCTGCACATCCCCAGTGCCGAGTTAGAAGACTCGGGGACCTACACCTGCAAT
GTGACGGAGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTG
GTTGAGAGCGGCTACAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGAGACCTTTCGTAG
AGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCG
TCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCA
CTTG AC ACTTTGATCCCTGATGGAA AACGC AT AATCTGGG AC AGT AGAAAGGGC
TTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCA
ACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGT
GGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGC
CCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC
CAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG
TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
GCGTGGAGGTGCAT AATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGG AGC AGT ACAAC AGC
ACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA
AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA
CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC
CATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG
GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA
ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA
CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG
CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGT A A AT AG (SEQ ID NO:24)
Cebador del ácido nucleico PDGFRBPR6SpeI F
GACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG (SEQ ID NO: 25)
Cebador del ácido nucleico PDGFRBPR7AgeI R
ACCGGTGGATGACACCTGGAGTCTG (SEQ ID NO: 26)
Cebador del ácido nucleico PDGFRB-PR1-Acc F
CTATGTCTACAGACTCCAGGTGTC (SEQ ID NO: 27)
Cebador del ácido nucleico D5-PR9-AgeI-Rev R
ACCGGTAAAGGGCAAGGAGTGTGGC (SEQ ID NO: 28)
Cebador del ácido nucleico PDGF02 F
CCTCCACCGGTGTAGCCGCTCTCAACCACGGT (SEQ ID NO: 29)
Cebador del ácido nucleico PDGF03 R
CCCGGGACTAGTATGCGGCTTCCGGGTG (SEQ ID NO: 30)
Cebador del ácido nucleico D5-SV40 F
CCGGTTAGGGA (SEQ ID NO: 31)
Cebador del ácido nucleico D5-SV40 B-2
GGCCTCCCTAA (SEQ ID NO: 32)
Cebador del ácido nucleico D4-SV40 F TGAGGTCCAGCTCTCCTTCCAGCTACAGATCAATGTCCCTGTCCGAGTGCTGGAG TAGC (SEQ ID NO:33)
Cebador del ácido nucleico D4-SV40 B
GGCCGCT ACTCC AGCACTCGGAC AGGG AC ATTGATCTGT AGCTGGAAGGAGAGC TGGACC (SEQ ID NO:34)
Fragmento de ácido nucleico sintético de Kozak-SP-D2-9Ser
ACT AGTGGCGGCCGCCACCATGGTC AGCT ACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTG
CGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATG
TACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATT
CCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTG
ACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCA
TCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAG
TC AATGGGC ATTTGT AT AAG ACAA ACT ATCTCAC ACATCGAC AAACCTCGAGTTC
CAGCTCCTCTTCCTCAAGCCAGATCT (SEQ ID NO:35)
Fragmento de ácido nucleico sintético de D2-2220-2908
CCACGCTGCTGGGGAACAGTTCCGAAGAGGAGAGCCAGCTGGAGACTAACGTGA
CGTACTGGGAGGAGGAGCAGGAGTTTGAGGTGGTGAGCACACTGCGTCTGCAGC
ACGTGGATCGGCCACTGTCGGTGCGCTGCACGCTGCGCAACGCTGTGGGCCAGG
ACACGCAGGAGGTCATCGTGGTGCCACACTCCTTGCCCTTTAGTTCCAGCTCCTC
TTCCTCAAGCTCGAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATA
CAC ATGACTGAAGG AAGGGAGCTCGTC ATTCCCTGCCGGGTT ACGTCACCT AACA
TCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACG
CAT AATCTGGGAC AGT AGAAAGGGCTTC ATC ATATCAAATGC A ACGT ACAAAGA
AATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAA
CTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAA
ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG
GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCC
GGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG (SEQ ID NO:36)
Fragmento de ácido nucleico sintético de D3-Fc
GACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAAT
GAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTG
GAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGC
ACATCCCC AGTGCCGAGTT AGAAG ACTCGGGGACCT ACACCTGC AATGTG ACGG
n a v r: j n a v r j .T i v r. j T i r v . j r a v r a v t x p v . j a a n ^ n a at x p v _ a , r n x v n j v j a n t x n v j r a v r a v r a x r a x v n j v n j v r ^ ' v r ^ ' r a v t x taata x tcarrr.T x r v . j r v . j T x T x r v . j r a v v r: j r a v
GCGGCTACACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACA
AAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAG
TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGA
GGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG (SEQ ID NO:37)
Fragmento de ácido nucleico sintético de D3-F(D2)
GACTGTGGTCCGCCAGGGTGAGAACATCACCCTCATGTGCATTGTGATCGGGAAT
GAGGTGGTCAACTTCGAGTGGACATACCCCCGCAAAGAAAGTGGGCGGCTGGTG
GAGCCGGTGACTGACTTCCTCTTGGATATGCCTTACCACATCCGCTCCATCCTGC
ACATCCCC AGTGCCGAGTT AGAAG ACTCGGGGACCT ACACCTGC AATGTG ACGG
AGAGTGTGAATGACCATCAGGATGAAAAGGCCATCAACATCACCGTGGTTGAGA
GCGGCTACAGTTCCAGCTCCTCTTCCTCAAGCTCGAGACCTTTCGTAGAGATGTA
CAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCC
CTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGAC
ACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATC
ATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTC
AATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGT
GGAGGTGGAGGTGGAGGTCCTAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCG
TGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAAC
CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG
ACGTG (SEQ ID NO:38)
Secuencia de aminoácidos de sFLT02 (D2-9Gly-CH3)
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITV
TLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQT
GGGGGGGGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS
PGK (SEQ ID NO:39)
Marco de lectura abierto de sFLT02 (D2-9Gly-CH3)
ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGC
TTCTCACAGGATCTGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAAT
TATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCT
AACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAA
AACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACA
AAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGA
CAAACTATCTCACACATCGACAAACCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTC
AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCA
AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAA
GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT
GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG (SEQ ID
NO:40)
Secuencia del ácido nucleico de ITR mutada
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCC
CACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG (SEQ ID N0:41)
Secuencia de aminoácidos del híbrido 1 sin péptido secretor
RPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELYIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFII
SN AT YKEIGLLTCE AT VN GHLYKTN YLTHRQTS SSSSSSSS QIS QGLV VTPPGPELVLN
VSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTH
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FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
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SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:42)
Secuencia de aminoácidos del híbrido 2 sin péptido secretor
LVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTN
LTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPC
RVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFFGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYV
YRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTD
FLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEV
GTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSE
LTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCR
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VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:43)
Secuencia de aminoácidos del híbrido 3 sin péptido secretor

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión que comprende (a) una porción extracelular de un receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRp) que comprende los dominios de tipo Ig D1-D3 del PDGFRp, (b) una porción extracelular de un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y (c) un dominio de multimerización que comprende una región Fc de un anticuerpo IgG1, en donde la proteína de fusión se une a un PDGF y un VEGF, en donde la proteína de fusión está dispuesta de extremo N a extremo C en el siguiente orden: (a), (b) y (c), en donde la proteína de fusión comprende un péptido conector entre (a) y (b) que comprende Ser9 (SEQ ID NO: 49), en donde la proteína de fusión comprende un conector entre (b) y (c) que comprende Gly9 (SEQ ID NO: 47), y en donde la porción extracelular de un receptor de VEGF consiste en el dominio de tipo Ig D2.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la porción extracelular de PDGFR comprende:
(a) dominios de tipo Ig D1-D5 de PDGFRp;
(b) una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o 3; o
(c) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o 3.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la porción extracelular del receptor de VEGF comprende:
(a) una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 4; o
(b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
4. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio de multimerización comprende:
(a) una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 6; o
(b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 15, 43 o 45 o una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 85 % de identidad con SEQ ID NO: 13, 15, 43 o 45.
6. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la proteína de fusión está en una forma dimérica o multimérica.
7. Una composición que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
9. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
10. Un método de producción de una proteína de fusión, que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una condición que produce la proteína de fusión, y recuperar la proteína de fusión producida por la célula hospedadora.
11. Una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína de fusión al sujeto.
12. La proteína de fusión para su uso según la reivindicación 11, en donde el sujeto tiene degeneración macular, degeneración macular senil húmeda, degeneración macular senil seca, retinopatía diabética proliferativa, cáncer, artritis reumatoide, osteoartritis, asma, uveítis o neovascularización de la córnea, y en donde la proteína de fusión se administra opcionalmente por inyección intravítrea al sujeto.
13. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
14. Una partícula de vector de virus recombinante adenoasociado (rAAV) que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5.
15. Un método de producción de una partícula de rAAV, que comprende:
(a) cultivar una célula hospedadora en una condición tal que se producen partículas de rAAV, en donde la célula hospedadora comprende (i) uno o más genes de encapsidación de AAV, en donde cada dicho gen de encapsidación de AAV codifica una proteína de replicación o encapsidación de AAV; (ii) un pro-vector de rAAV que comprende un nucleótido que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 flanqueada por al menos una ITR de AAV, y (iii) una función auxiliar de AAV; y
(b) recuperar las partículas de rAAV producidas por la célula hospedadora.
16. Una partícula de rAAV de la reivindicación 14 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde el método comprende administrar una cantidad eficaz de la partícula de rAAV al sujeto.
17. La partícula de rAAV para su uso según la reivindicación 16, en donde el sujeto tiene degeneración macular, degeneración macular senil húmeda, degeneración macular senil seca, retinopatía diabética proliferativa, cáncer, artritis reumatoide, osteoartritis, asma, uveítis o neovascularización de la córnea, y en donde la partícula de rAAV se administra opcionalmente por inyección intravítrea al sujeto.
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