ES2934687T3 - Cepas bacterianas probióticas para la prevención y el tratamiento de enfermedades en la cavidad oral - Google Patents
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Abstract
Las composiciones para uso en higiene bucal contienen una cepa de Lactobacillus helveticus. Las composiciones que además contienen una cepa de Lactobacillus plantarum, especialmente Lactobacillus plantarum SD5870, son particularmente eficaces. La combinación de Lactobacillus helveticus LAFTI L10 y Lactobacillus plantarum SD5870 mejora sinérgicamente la higiene bucal. Las composiciones son particularmente útiles contra la caries dental. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Cepas bacterianas probióticas para la prevención y el tratamiento de enfermedades en la cavidad oral
Campo
[0001] La presente invención se refiere a composiciones probióticas para administración oral. En particular, la presente invención se refiere a composiciones probióticas con efectos beneficiosos en el tratamiento o prevención de afecciones o enfermedades de una cavidad oral.
Antecedentes
[0002] Una cavidad oral, por ejemplo, la boca, alberga una flora microbiana numerosa y variada. Cuando el equilibrio está comprometido y cuando aparece un desequilibrio entre las bacterias autóctonas, pueden ocurrir patologías como caries dentales o periodontitis. Los probióticos son microorganismos vivos que pueden conferir un beneficio para la salud del huésped. Los efectos beneficiosos de la terapia probiótica se logran en parte a través de la modulación de la flora microbiana existente asociada con el huésped, logrando así una relación equilibrada y saludable entre los microbios y el huésped. En relación con la cavidad oral, las composiciones probióticas pueden ayudar a restaurar una población bacteriana equilibrada, mejorando así la salud bucal.
[0003] La caries dental es una enfermedad infecciosa ubicua transmitida típicamente a través de los cuidadores en la infancia, que persiste durante toda la vida o hasta el edentulismo completo. La caries dental se maneja predominantemente a través de enfoques preventivos antimicrobianos como el cepillado de dientes o el uso de hilo dental, que son eficaces en gran parte debido a su acción antimicrobiana. Los avances recientes en Cariología han llevado a una mejor comprensión del contexto microecológico más amplio de la formación de caries, que presenta oportunidades para nuevas estrategias y tecnologías de tratamiento profiláctico basadas en microbios que se aplicarán en el manejo de la caries.
[0004] La infección de las bacterias patógenas iniciadoras implicadas en la caries son bacterias del grupo de estreptococos mutans, más notablemente Streptococcus mutans que se encapsula dentro de una biopelícula de exopolisacáridos insolubles autogenerados a partir de sacarosa. Esta placa adherente, proporciona un nicho ecológico donde las bacterias patógenas prosperan y producen diversos ácidos orgánicos a partir de carbohidratos que disuelven progresivamente los minerales de los dientes. La comprensión más contemporánea del desarrollo de la caries ahora incluye el contexto de factores microbianos, ecológicos y ambientales, donde una alteración o desequilibrio en la ecología microfloral predispone a la formación de caries. Con este fin, se ha sugerido que las terapias probióticas tienen potencial para ser un medio eficaz de regular S. mutans y la microflora oral (Caglar 2005a; Saha 2012; Tagg 2003) y ha habido una investigación clínica significativa del uso potencial de cepas individuales como probióticos (Nase 2001; Taipale 2012; Keller 2011; Stecksen-Blicks 2009; Burton 2013; Caglar 2008; Caglar 2006; Caglar 2005b).
[0005] El mecanismo ostensible por el cual varias cepas combaten las caries dentales varía según el caso. Por ejemplo, algunas cepas tienen actividad anti-S. mutans al agregarse con S. mutans, mientras que otras matan o inhiben directamente S. mutans al secretar bacteriocinas específicas, y otras aún colonizan la placa y compiten con S. mutans por su nicho ecológico. Por lo tanto, existe la posibilidad de que la combinación de estos mecanismos tenga efectos sinérgicos complementarios. Por otro ejemplo, dos cepas probióticas pueden secretar bacteriocinas diferentes que, debido a su diana bioquímica variable dentro de S. mutans, pueden tener un mayor efecto de destrucción de S. mutans combinado que cualquiera de ellas solas.
[0006] Las composiciones probióticas también se pueden mejorar en determinadas circunstancias mediante la adición de prebióticos a la composición. Un prebiótico "alimenta" la flora microbiana, con el fin de mejorar una subpoblación bacteriana beneficiosa; un probiótico añade cultivos beneficiosos a las poblaciones de flora microbiana. El término "sinbiótico" describe una composición que contiene tanto prebióticos como probióticos, por ejemplo, uno que contiene tanto fructooligosacáridos (FOS) (un prebiótico) como bifidobacterias (un probiótico). La investigación en el área se dedica a la sinergia entre los tipos de ingredientes para obtener una mejor comprensión de cómo el crecimiento y la supervivencia de los probióticos pueden mejorarse mediante la presencia de ingredientes prebióticos complementarios.
[0007] Aunque se conoce una gran cantidad de composiciones probióticas, cada composición tiene características únicas y beneficios particulares para la salud. Un ejemplo de una composición probiótica con un beneficio para la salud oral se describe en la solicitud provisional de propiedad común USSN 61/674,390 presentada el 22 de julio de 2012, que describe una combinación probiótica que incluye Streptococcus salivarius K12® (BLIS K12®) y al menos cinco bacterias Lactobacillus.08
[0008] Un ejemplo adicional de una composición probiótica conocida se puede encontrar en la solicitud de patente europea e P 2.420.580 A1 que describe una composición que comprende una cantidad eficaz de Lactobacillus plantarum cepa CECT 7481 y Lactobacillus brevis cepa CECT 7480. Dichas cepas presentan diversas propiedades
funcionales que las hacen adecuadas para su uso en la mejora de la salud bucal.
[0009] Sin embargo, siempre hay una necesidad de formulaciones mejoradas de composiciones probióticas, particularmente formulaciones que dan como resultado una o más de la salud oral mejorada, colonización oral mejorada, eficacia mejorada, vida útil mejorada, eficacia para enfermedades orales diferentes y específicas y mejoras adicionales, así como procedimientos de administración o usos de los mismos.
Resumen
[0010] En un aspecto de la invención se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o prevención de afecciones o enfermedades de una cavidad oral, que comprende un probiótico, el probiótico comprende una cepa de Lactobacillus helveticus y una cepa de Lactobacillus plantarum.
[0011] En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o prevención de caries dentales, que comprende un probiótico, el probiótico que comprende Lactobacillus plantarum SD5870 y uno o más de: Streptococcus salivarius, y/o Streptococcus salivarius M18, y/o Streptococcus salivarius K12.
[0012] En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención de la caries dental, que comprende un probiótico, el probiótico que comprende Bifidobacterium longum SD5846.
[0013] En el tratamiento o prevención de afecciones o enfermedades de una cavidad oral, el probiótico comprende o consiste esencialmente en una cepa de Lactobacillus helveticus y una cepa de Lactobacillus plantarum. El probiótico puede comprender o consistir esencialmente en una cepa de Lactobacillus helveticus y una cepa de Lactobacillus plantarum y una o más otras bacterias probióticas, preferentemente de los lactobacilos, bifidobacterias y/o estreptococos genii, más preferentemente uno o más otros lactobacilos, aún más preferentemente otro lactobacilo. El probiótico puede comprender o consistir esencialmente en una cepa de Lactobacillus helveticus y una cepa de Lactobacillus plantarum, especialmente Lactobacillus plantarum SD5870 (conocida comercialmente como Lactobacillus plantarum Lp-2001). La frase "consiste esencialmente en" indica que otras bacterias probióticas no están presentes, o están presentes en cantidades intrascendentes. La cepa de Lactobacillus helveticus comprende preferentemente Lactobacillus helveticus LAFTI L10, Lactobacillus helveticus R0052 o una mezcla de los mismos. La cepa de Lactobacillus helveticus comprende más preferentemente Lactobacillus helveticus LAFTI L10.
[0014] Para tratar o prevenir la caries dental específicamente, el probiótico puede comprender alternativamente Lactobacillus plantarum SD5870 y uno o más de: Streptococcus salivarius, y/o Streptococcus salivarius M18, y/o Streptococcus salivarius K12. Preferentemente, el probiótico consiste esencialmente en Lactobacillus plantarum SD5870 y uno o ambos de Streptococcus salivarius M18 y Streptococcus salivarius K12 de manera que otras bacterias probióticas no están presentes, o están presentes en cantidades intrascendentes. De manera alternativa, el probiótico para tratar o prevenir la caries dental comprende específicamente Bifidobacterium longum SD5846.
[0015] La higiene bucal comprende la prevención o el tratamiento de afecciones o enfermedades de una cavidad oral. Dichas afecciones o enfermedades incluyen, por ejemplo, caries dentales (cavidades), halitosis, gingivitis, úlceras bucales que incluyen estomatitis aftosa (aftas), candidiasis y enfermedades periodontales. La supresión de la población de Streptococcus mutans en la cavidad oral conduce a una mejor salud bucal. En las realizaciones, se previene la caries dental. Los sujetos para los cuales esta invención es útil incluyen, por ejemplo, mamíferos. Los sujetos pueden incluir primates, humanos o animales domesticados. Algunos ejemplos de animales domésticos son perros, gatos y caballos.
[0016] La composición puede comprender de alrededor de 0,0001 % a alrededor de 100 % en peso del probiótico, en función del peso total de la composición. Opcionalmente, el probiótico puede ser de 0,001 % a 50 % en peso, o de 0,001 % a 10 % en peso, o de 0,001 % a 5 % en peso de la composición. Las cantidades eficaces para la higiene oral del probiótico en la composición dependen en cierta medida de la edad del sujeto, el tipo de bacteria probiótica, la frecuencia de dosificación, la forma de dosificación, el procedimiento de administración y la variabilidad en la microflora oral comensal de los sujetos. Por ejemplo, las dosis del probiótico en un intervalo de alrededor de 107 a 1011 unidades formadoras de colonias (CFU) son generalmente adecuadas, particularmente para pastillas, se prefieren las dosis del probiótico en un intervalo de alrededor de 108 a 1010 CFU por pastilla, la cantidad óptima depende de la cepa o cepas de probiótico en la composición y la frecuencia de administración, que puede variar de 1 a 4 pastillas por día. La administración del probiótico se puede realizar en cualquier momento conveniente, por ejemplo, durante o después del cepillado de los dientes, o durante o después de las comidas.
[0017] Las composiciones comprenden el probiótico y pueden comprender otros ingredientes generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, uno o más agentes de remineralización, prebióticos, vehículos, diluyentes, excipientes y similares. Los otros ingredientes son preferentemente farmacéuticamente aceptables o al menos aceptables para su uso en la cavidad oral.
[0018] S. mutans funciona en la descomposición de la matriz dental a través de la secreción de ácidos que disuelven minerales calcio y fosfato. Después de varios meses de secreción ácida, la desmineralización se diseminará al esmalte y, finalmente, a la dentina. Aunque reversible en esta fase, una mayor progresión conducirá a la formación de cavidades y requerirá la restauración dental. La saliva juega un papel muy importante no solo como tampón natural de los ácidos agresivos, sino también como fuente de calcio y fosfato para la remineralización de los dientes, deteniendo o incluso revirtiendo naturalmente la patología. La formación de caries dental es entonces un equilibrio dinámico de desmineralización por bacterias patógenas y remineralización. Las intervenciones y los tratamientos profilácticos a menudo se centran en inclinar la balanza hacia la remineralización mediante la adición de agentes a este efecto. Los agentes de reminerización incluyen, por ejemplo, péptido fosfato de caseína-fosfato de calcio amorfo (CPP-ACP), fosfato de p-tricalcio, nanopartículas de fosfato de calcio amorfo (NACP), hidroxiapatita, glicerofosfato de calcio u otras variantes de calcio y fosfato. El flúor también se agrega a muchos productos dentales, ya que es un catalizador eficaz de remineralización, y se incorpora a la estructura cristalina, lo que resulta en una superficie dental más resistente que la original. En particular, el péptido fosfato de caseína-fosfato de calcio amorfo (CPP-ACP) (véase la patente estadounidense 7.491.694) es particularmente eficaz porque el péptido unido derivado de una proteína de la leche se une y estabiliza el fosfato de calcio en un amorfo soluble del que es fácilmente biodisponible. Se esperaría que la combinación de una formulación probiótica que evita la desmineralización, junto con un agente de remineralización, especialmente CPP-ACP, tuviera una eficacia aún mayor en el tratamiento profiláctico de la caries dental.
[0019] La inclusión de prebióticos en la composición mejora la eficacia probiótica en determinadas circunstancias. Un prebiótico funciona principalmente para alimentar la flora microbiana. El término "sinbiótico" describe una composición que contiene tanto prebióticos como probióticos. Algunos ejemplos de prebióticos que pueden ser útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, mono, di y oligosacáridos tales como fructanos de manosa, fructooligosacáridos (FOS), xilooligosacáridos (XOS), polidextrosa y galactooligosacáridos (GOS), lactulosa, tagatosa, inulina, maltodextrina, lactitol y mezclas de los mismos. En general, la cantidad de prebiótico utilizada es mucho mayor que la cantidad de probiótico, por ejemplo, se pueden usar cantidades de gramos de prebiótico para cantidades de miligramos de probiótico.
[0020] Los vehículos, diluyentes y excipientes para composiciones orales son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, absorbentes, agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, aglutinantes, tampones, recubrimientos, colores, agentes de liberación controlada, vehículos de liberación controlada, diluyentes, desintegrantes, agentes efervescentes, sabores, deslizantes, lubricantes, plastificantes, potenciadores de solubilidad, agentes humectantes, tensioactivos, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, etc. Algunos ejemplos específicos incluyen lactosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, polivinilpirrolidona, celulosa (por ejemplo, celulosa microcristalina), jarabe de agua, agua, agua/etanol, agua/glicol, agua/polietilenglicol, propilenglicol, metilcelulosa, metilhidroxibenzoatos, propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio, aceite mineral o sustancias grasas tales como grasa dura o mezclas adecuadas de los mismos.
[0021] Una clase particularmente preferida de excipientes son los sustitutos del azúcar, que actúan como edulcorantes con un efecto reducido o insignificante en los niveles de glucosa en sangre. Preferentemente, los sustitutos de azúcar no son cariogénicos. Dichos sustitutos del azúcar incluyen, por ejemplo, alcoholes de azúcar (por ejemplo, isomalt), estevia, aspartamo, sucralosa, neotamo, acesulfamo de potasio y sacarina. La estevia y la isomalt son de particular importancia. La estevia se basa en glicósidos de esteviol y comprende un extracto de la planta Stevia rebaudiana. La isomalt es una mezcla equimolar de dos disacáridos, cada uno compuesto por dos azúcares glucosa y manitol (a-D-glucopiranosido-1,6-manitol) y también glucosa y sorbitol (a-D-glucopiranosido-1,6-sorbitol). La isomalt en particular mejora la estabilidad de las composiciones de la presente invención. Ciertos sustitutos del azúcar (por ejemplo, isomalt) también se pueden considerar prebióticos.
[0022] Las composiciones de la presente invención pueden administrarse al sujeto por vía oral en formas de dosificación oral o tópica. Formas de dosificación adecuadas incluyen, por ejemplo, comprimidos (por ejemplo, comprimidos efervescentes y/o comprimidos de múltiples capas), píldoras, polvos, pastillas (que incluyen pastillas de múltiples capas), sobres, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles, cápsulas, pastas (por ejemplo, pasta de dientes), alimentos y dulces (por ejemplo, goma de mascar). La formulación de tales formas de dosificación es bien conocida en la técnica. Las composiciones de la presente invención tienen una buena estabilidad que mantiene un recuento efectivo de CFU de las cepas probióticas durante un período de al menos 24 meses, incluso durante un período de al menos 30 meses, a temperatura ambiente (20-25 °C). La vida útil se puede extender más allá de 36 meses en determinadas condiciones de almacenamiento (por ejemplo, condiciones de refrigeración a 2-8 °C) y/o diversos sistemas de suministro tales como sobres/barras de polvo.
[0023] La composición puede proporcionarse en el mercado en forma de un paquete comercial junto con instrucciones de uso de la composición para la higiene bucal. Los paquetes comerciales incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, blísteres, paquetes, cajas, etc. Las instrucciones pueden proporcionarse, por ejemplo, en formas visuales o de audio, por ejemplo, por escrito, en imágenes, en medios de grabación de sonido y/o video, o combinaciones de los
mismos.
[0024] Otras características de la invención se describirán o se harán evidentes en el transcurso de la siguiente descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
[0025] Con el fin de que la invención pueda entenderse con mayor claridad, las realizaciones de la misma se describirán ahora en detalle a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:
La Fig. 1 representa un diagrama esquemático de placas de cultivo que muestran zonas de hisopado bacteriano y cómo se determinan las zonas de inhibición (ZOI).
La Fig. 2 representa un gel de agarosa al 1,5 % de amplicones de PCR de un segmento de ADN específico de la especie del cromosoma de S. mutans. Se utilizó la cepa tipo S. mutans 25175 como control positivo.
La Fig. 3 representa un gráfico que muestra la cuantificación de experimentos de antagonismo diferido de probióticos individualmente y en todas las combinaciones posibles de dos contra S. mutans 25175. Los experimentos se repitieron al menos 4 veces usando agar BHI pH equilibrado con CaCO3 al 0,1 %.
La Fig. 4 ilustra un gráfico que muestra la cuantificación de experimentos de antagonismo diferido de probióticos individualmente y en todas las combinaciones posibles de dos contra S. mutans recién aislado 13. Los experimentos se repitieron al menos 4 veces usando agar BHI pH equilibrado con CaCO3 al 0,1 %.
La Fig. 5 ilustra un gráfico que muestra la cuantificación de experimentos de antagonismo diferido de probióticos individualmente y en todas las combinaciones posibles de dos contra S. mutans recién aislado 14. Los experimentos se repitieron al menos 4 veces usando agar BHI pH equilibrado con CaCO3 al 0,1 %.
La Fig. 6 ilustra un gráfico que muestra la cuantificación de experimentos de antagonismo diferido de probióticos individualmente y en todas las combinaciones posibles de dos contra S. mutans recién aislado 15. Los experimentos se repitieron al menos 4 veces usando agar BHI pH equilibrado con CaCO3 al 0,1 %.
La Fig. 7 ilustra una tabla que muestra antagonismo sinérgico contra cepas de S. mutans para diferentes combinaciones de cepas probióticas con características antimicrobianas. La comparación se realizó con cepas componentes individualmente mediante ANOVA unidireccional con datos de al menos cuatro experimentos repetidos individualmente.
La Fig. 8 ilustra una tabla que muestra la comparación de la producción relativa de peróxido de hidrógeno de cepas probióticas. ++ dentro de 24 horas, + dentro de 48 horas, dentro de 72 horas, y - sin producción.
La Fig. 9 representa un gráfico que muestra la adhesión de varias cepas probióticas y cepas de S. mutans a la línea celular epitelial bronquial humana 16HBE14o-.
La Fig. 10 representa un gráfico que muestra la comparación de la agregación de diversas cepas probióticas con S. mutans 25175. La comparación se realizó mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Bonferroni (*p<0,05, **p<0,01, ** *p<0,001).
Descripción detallada
[0026] A lo largo de la memoria descriptiva se hace referencia a los nombres de género/especie y a las designaciones de las cepas. De vez en cuando, la clasificación de los organismos cambia y a cualquier organismo dado se le puede asignar un nombre y/o designación de cepa diferente. Los organismos probióticos a los que se hace referencia en la presente invención tienen determinados genomas que permanecerían iguales ya sea que cambie o no el nombre y/o designación de cepa de los organismos. A partir del genoma, un experto en la materia puede determinar fácilmente si cualquier organismo dado, cualquiera que sea el nombre y/o la designación de cepa que lleve, está comprendido por la presente descripción.
Ejemplo 1: aislamiento de S. mutans y extracción de ADN
[0027] La placa se recolectó usando sondas estériles y se extendió directamente sobre agar selectivo de mitis salivarius-bacitracina S. mutans de 4 sujetos diferentes, y luego se incubó durante 48 horas a 37 °C en condiciones microaerofílicas. Luego, las colonias individuales se extendieron por cuadrantes en placas BHYE y luego se incubaron nuevamente durante 48 horas a 37 °C en condiciones microaerofílicas. Se llevó a cabo un genotipado posterior en las colonias aisladas para confirmar su especie. ADN bacteriano fue extraído usando InstaGene Matrix (BioRad) similar a las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recogió una sola colonia y se dispersó en 1 mL de H2O estéril. A continuación, esta mezcla se centrifugó durante 1 minuto a 10.000 rpm y el sobrenadante se descartó. Al sedimento se le añadieron 200 mL de Matriz IntaGene, las muestras se agitaron rápidamente y se incubaron a 55 °C durante 20 minutos en un baño de agua. A continuación, se retiraron las muestras y se incubaron en un baño de agua hirviendo durante 30 minutos. A continuación, las muestras se agitaron de nuevo y luego se centrifugaron durante 3 minutos a 10.000 rpm. Los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -20 °C hasta que se utilizaron para PCR.
[0028] Todos los reactivos de PCR se obtuvieron de Invitrogen. Las muestras de ADN extraído se sometieron a PCR en una mezcla de reacción que contenía 1X de tampón de PCR, 15 mM de MgCI2, 200 mM de mezcla dNTP, 10 mM de cebador MUT-F, 10 mM de cebador MUT-R, 5U de Taq ADN polimerasa, 10 mL de plantilla de ADN y
ddH2O hasta un volumen final de 50 mL. Los cebadores amplifican una región de ADN de 517 bp que codifica la glucosiltransferasa extracelular gtfB de S. mutans (Oho 2000).
MUT-F: 5’ - ACT ACA CTTTCG GGT GGC TTG G - 3’ (SEQ ID NO: 1)
MUT-R: 5’ - CAG TAT AAG CGC CAG TTT CAT C - 3’ (SEQ ID NO: 2)
[0029] Las condiciones de termociclado fueron una desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 minuto, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, recocido a 59 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 1 minuto. Se incluyó una etapa de extensión final a 72 °C durante 5 minutos. Los productos de PCR se mezclaron con tampón de carga de ADN y se separaron con un gel de agarosa al 1,5 % con EtBr al 0,05 % a 100 V durante 45 minutos, y se tomaron imágenes bajo excitación con luz UV.
Ejemplo 2: Antagonismo diferido
[0030] Para probar el antagonismo de los probióticos contra S. mutans, el antagonismo diferido se llevó a cabo esencialmente como se realizó previamente por Tagg y Bannister (Tagg 1979). Cultivos líquidos se inocularon en MRS para lactobacilos o bifidobacterias, y BHYE para estreptococos, y luego se incubaron durante la noche a 37 °C en condiciones microaerofílicas. Con referencia a la Fig. 1, la suspensión durante la noche se aplicó con un hisopo en una placa de BHI o CB con CaCO3 al 0,1 % (p/v) en una extensión de 1 cm de ancho medida con hisopos de algodón estériles. Las placas de BHI contenían 18,5 g de infusión de corazón cerebral (BHI, Difco), 7,5 g de agar (Fisher) y 1 g de CaCO3 (Sigma). Las placas CB contenían 22 g de sangre Columbia (Difco), 7,5 g de agar (Fisher) y 1 g de CaCO3 (Sigma). Las placas se incubaron a continuación a 37 °C en condiciones microaerofílicas. Después de 48 horas, el crecimiento bacteriano se raspó con un portaobjetos de microscopio de vidrio y la placa se volvió a esterilizar con vapores de cloroformo durante 20 minutos. Las suspensiones nocturnas de la cepa tipo S. mutans ATCC25175 y 4 aislamientos frescos se extendieron luego perpendicularmente, y las placas se reincubaron. Después de 48 horas, la zona de inhibición (ZOI) se calculó como la distancia entre las dos áreas de crecimiento bacteriano, menos 1 cm donde el probiótico se colocó directamente en la placa. La estadística se realizó utilizando Prism 4 (GraphPad). Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para comparar entre probióticos específicos y combinaciones de probióticos. El sinergismo se calculó como un cociente sinérgico, que es la suma de los tratamientos individuales divididos por el tratamiento combinado. Los valores A >1 indican sinergia de la combinación (Wang 2012).
[0031] Para determinar las cepas con potencial probiótico en la caries dental, se realizó un cribado de antagonismo de S. mutans para muchas cepas de probióticos comercializadas. En primer lugar, como se describe en el Ejemplo 1, se obtuvieron aislamientos frescos del patógeno mediante la colocación en placas de muestras de placa de 4 individuos en placas de agar de S. mutans mitis salivarius-bacitracina selectiva. Las colonias se genotipificaron para la presencia de una secuencia marcadora específica de S. mutans, que se comparó con la cepa tipo S. mutans ATCC 25175 (Fig. 2). Se seleccionaron cuatro aislamientos (1 por sujeto).
[0032] Se llevaron a cabo ensayos de antagonismo diferido contra estos 4 aislados y S. mutans 25175 en dos tipos de medios para cribar rápidamente cepas probióticas con cualquier antagonismo. La Tabla 1 indica la presencia o ausencia de una zona de inhibición (ZOI) para cualquier réplica y para cualquiera de las 5 cepas ensayadas en estos experimentos. Se observó que las cepas Streptococcus salivarius K12, Streptococcus salivarius M18, Lactobacillus plantarum SD5870, L. helveticus R0052 y Bifidobacteria longum SD5846 (conocida comercialmente como Bifidobacteria longum BI-05) tenían antagonismo en ambos tipos de agar, mientras que para Lactobacillus helveticus el antagonismo LAFTI L10 solo fue evidente en el agar BHI. Por lo tanto, el agar BHI se utilizó en experimentos posteriores de antagonismo diferido cuantitativo. Para cuantificar el antagonismo, el experimento se repitió para cada bacteria probiótica en al menos cuatro y hasta ocho experimentos separados, y se midió específicamente la zona de inhibición. Se evaluaron mezclas iguales de todas las cepas bacterianas probióticas en todas las combinaciones posibles de 2 para evaluar los posibles efectos sinérgicos. La ZOI de cinco cepas patógenas se midió y promedió en cuatro experimentos. Los resultados se indican de la Fig. 3 a la Fig. 6.
[0033] En general, la cepa de recolección de cultivo de S. mutans demostró ser mucho más resistente a los factores antagónicos secretados por los probióticos en comparación con los aislados frescos (Fig. 3). Por ejemplo, en experimentos con probióticos individuales, no se observó ningún antagonismo en absoluto para S. mutans 25175, mientras que para S. mutans 13, los 6 probióticos excepto B. longum SD5846 fueron antagónicos. Como una única cepa, L. helveticus LAFTI L10 y L. helveticus R0052 fueron capaces de antagonizar los cuatro S. mutans recién aislados, mientras que S. salivarius K12 y L. plantarum SD5870 antagonizaron tres de cuatro. S. salivarius M18 antagonizó dos de los cuatro aislados patógenos, y B. longum SD5846 solo uno, y la ZOI promedio para estos fue, en todos los casos, comparativamente más débil que otras cepas probióticas.
Tabla 1
[0034] La ZOI media fue en muchos casos mayor cuando dos cepas se combinaron juntas en cantidades iguales y ciertas bacterias parecieron combinarse mejor que otras. Para el aislado S. mutans 15, por ejemplo, (Fig. 6), de las 15 combinaciones posibles de 2 cepas, 7 fueron mayores que la ZOI de L. helveticus R0052, el mayor probiótico individual inhibidor. De estas 7 combinaciones, seis contenían una L. helveticus LAFTI L10 o una L. plantarum SD5870. Esto resultó ser cierto en todas las cepas patógenas; en cada instancia de inhibición de los aislados de S. mutans 13, 14, 15 y 17, o incluso de S. mutans 25175, las 4 ZOI más grandes siempre fueron combinaciones que contenían una L. helveticus LAFTI L10 o una L. plantarum SD5870.
[0035] La Fig. 7 indica la zona de inhibición (ZOI) promedio junto con el sinergismo calculado del antagonismo. Se indica la diferencia significativa de la ZOI calculada por Anova unidireccional para combinaciones en comparación con sus cepas componentes individualmente. El cociente sinérgico (SQ) indica la sinergia relativa dividiendo la ZOI para combinaciones de probióticos por la suma de su componente ZOI medida individualmente. Las combinaciones con un sinergismo superior al 50 % (SQ >1.5) se indican en negrita. NA indica que no hay antagonismo, mientras que US indica sinergia indeterminada, ya que el antagonismo solo se observó en combinación. La combinación de L. helveticus LAFTI L10 con B. longum SD5846 y la combinación de L. plantarum SD5870 con L. helveticus R0052 fueron significativamente más antagónicas contra cepas de S. mutans que sus componentes individuales. La combinación de L. helveticus LAFTI L10 con B. longum SD5846 fue muy sinérgica con US, 1,8, 3,7, 2,4 y 2,2 cuando se evaluó contra las cepas de S. mutans 25175, 13, 14, 15 y 17, respectivamente. L. plantarum SD5870 con L. helveticus R0052 también fue sinérgico, presentando un SQ de NA, 3,3, 1,5, 1,8 y 1,6, respectivamente.
[0036] Curiosamente, sin embargo, las bacterias componentes de cada una de estas dos combinaciones sinérgicas (L. helveticus LAFTI L10 y L. plantarum SD5870) dieron como resultado una actividad particularmente fuerte
y sinergismo cuando se combinan. La ZOI para estas 2 cepas combinadas fue el antagonismo más alto por un margen significativo para las cinco cepas de S. mutans. La ZOI para L. helveticus LAFTI L10 y L. plantarum SD5870 fue de hecho más alta que la ZOI para las dos cepas agregadas individualmente para todas las cepas de S. mutans, lo que resultó ser altamente significativo por ANOVA unidireccional. Para S. mutans 25175 no hubo inhibición en absoluto por ninguna cepa probiótica individualmente, pero una inhibición muy significativa (aproximadamente 20 mm) cuando las dos cepas se combinaron juntas. Esto sugiere fuertemente la actividad sinérgica entre los probióticos, y de hecho los cocientes sinérgicos fueron US, 3,4, 3,9, 4,2 y 4,2 para las cepas de S. mutans 25175, 13, 14, 15 y 17, respectivamente.
Ejemplo 3: Producción de peróxido de hidrógeno
[0037] Para probar la producción de peróxido de hidrógeno, se empleó una metodología comúnmente utilizada que es muy similar a la utilizada recientemente por Kang y col (Kang 2011). Esencialmente, el medio de crecimiento de agar estándar (MRS para lactobacilos o bifidobacterias, y BHYE para estreptococos) se modificó mediante la adición de 0,25 mg/mL de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y 0,1 ng/mL de peroxidasa. En resumen, 0,125 g de TMB y 5 mg de peroxidasa se disolvieron en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) y agua, respectivamente. Estas soluciones se esterilizaron usando filtros de jeringa de 0,2 mm y se añadieron a 0,5 L de medio de agar líquido inmediatamente después del enfriamiento posterior al autoclave a < 50 °C. A continuación, se vertieron las placas. Las colonias individuales de probióticos se recogieron de una placa madre y se extendieron directamente en TMB/agar peroxidasa y placas de control de agar estándar usando un bucle de inoculación. A continuación, las placas se dejaron a 37 °C en condiciones microaerofílicas durante 72 horas. Las colonias y el agar circundante se evaluaron para detectar cualquier cambio de color a azul o rojo cada 24 horas mediante comparación con una placa de control extendida MRS o BHYE normal. Cada experimento se repitió tres veces.
[0038] Dado que muchos lactobacilos producen peróxido de hidrógeno como un agente antagonista contra las bacterias circundantes, se analizó la producción de peróxido de hidrógeno de las cepas. Se confirmó que 10 de las 11 cepas de lactobacilos analizadas produjeron algo de peróxido de hidrógeno. S. salivarius no lo hizo mientras que los dos S. thermophilus y las 5 bifidobacterias produjeron grados variables de H2O2 (Fig. 8). Todas las cepas que se observó que tenían antagonismo de S. mutans se encontraban entre las más rápidas en producir H2O2, habiéndose observado que lo hacían dentro de las 24 horas posteriores a la colocación en placas, con la excepción de S. thermophilus.
Ejemplo 4: Adhesión a la superficie celular
[0039] Los reactivos de cultivo celular se obtuvieron de GIBCO a menos que se indique lo contrario. La línea celular epitelial bronquial humana inmortalizada 16HBE14o- se cultivó en medios MEM complementados con 10 % de FBS y 2 mM de L-glutamina, y se mantuvo utilizando procedimientos de cultivo celular estándar a 37 °C y 5 % de CO2. Las células se sembraron en pocillos de una placa de 24 pocillos tratada con cultivo tisular a una concentración de 1x105 células/pocillo y se dejaron crecer hasta confluencia (alrededor de 48 horas, aproximadamente 5 x 105 células/pocillo). Luego se aspiró el medio celular y se reemplazó con 500mL de medio fresco que contenía diluciones 100 veces de las diversas suspensiones celulares bacterianas de fase estacionaria, que se cultivaron durante la noche en MRS (lactobacilos y bifidobacterias) o BHYE (estreptococos). Las placas se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de 5 horas, se aspiró el medio de cultivo y las monocapas se lavaron minuciosamente tres veces con PBS para eliminar las bacterias que no se habían adherido sueltamente. Las células eucariotas se interrumpieron mediante la adición de Triton™ X-100 a una concentración final de 0,1 %. El recuento de las CFU adherentes restantes contenidas en la suspensión de lisis se llevó a cabo mediante el procedimiento de placa de gota. Se realizaron diluciones en serie de hasta 10-6 en una placa de 96 pocillos en etapas de 10 veces, con 10mL de las diversas diluciones y luego se mancharon por triplicado en agar apropiado (MRS para lactobacilos y bifidobacterias, y BHYE para estreptococos). Las placas de agar se incubaron a 37 °C en condiciones microaerofílicas durante 24 horas, después de lo cual se enumeraron las CFU. La adhesión se informó como CFU totales divididas por el número de células bronquiales en el pocillo y determinado por los recuentos celulares de un pocillo de control libre de bacterias de células 16HBE14o.
[0040] Para entregar sus efectos, la bacteria tendría que colocalizarse con los S. mutans dentro de la cavidad oral. Para probar el potencial de las bacterias probióticas para permanecer dentro de la cavidad oral, se realizaron ensayos de afinidad de unión (Fig. 9). El ensayo probó la adherencia de la bacteria a una monocapa de células epiteliales bronquiales humanas 16HBE14o, que comparten un linaje celular con células epiteliales orales y se asemejan a ellas en el fenotipo. Las bacterias se sembraron en medio MEM y se dejaron crecer durante 5 horas antes de que las bacterias libres se lavaran, y se realizaron recuentos de CFU de la mezcla de células eucariotas y bacterianas alteradas restantes. Se descubrió que, en general, los patógenos de S. mutans no se adhirieron bien a las células, ni tampoco los lactobacilos analizados (Fig. 9). Los S. salivarius, que fueron originalmente aislados de la garganta humana, sin embargo, se adhirieron muy fuertemente en comparación.
Ejemplo 5: Coagregación con S. mutans
[0041] Las diversas bacterias probióticas o S. mutans se inocularon en 1 mL de MRS líquida para lactobacilos o bifidobacterias, o BHYE para estreptococos, y luego se incubaron durante la noche a 37 °C en condiciones microaerofílicas. Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min y el sobrenadante se aspiró, y luego se volvió a suspender en 1 mL de PBS. Esta etapa se repitió 3 veces. Las células suspendidas luego se diluyeron en serie en PBS de 100mL hasta 128 veces en etapas de dilución en serie de 2 veces en una placa de 96 pocillos. La absorbancia se leyó de la placa a 600 nm usando un lector de microplacas EON (BioTek). A partir de los datos resultantes, se crearon curvas de absorbancia frente a dilución, y la dilución para una absorbancia de 0,3 se extrapoló para cada bacteria analizada. Los pocillos triplicados que contenían 200mL de bacterias suspendidas se diluyeron directamente en una placa de 96 pocillos según la extrapolación. Para cada bacteria, también se añadieron 100mL de la misma dilución junto con 100mL de S. mutans diluido. Las mezclas se dispersaron uniformemente pipeteando los pocillos hacia arriba y hacia abajo con una pipeta multicanal. A continuación, la placa se selló con una película de plástico transparente estéril y, a continuación, se incubó inmediatamente en el lector de microplacas a 37 °C junto con un blanco de PBS. Los pocillos se leyeron a 600 nm después de 6 horas.
[0042] También se evaluó el potencial de las cepas para adherirse e interactuar directamente con el S. mutans a través de un ensayo de agregación (Fig. 10). Se analizaron las cepas individuales y también las mezclas de partes iguales con S. mutans para determinar los cambios de absorbancia a 600 nm cuando se incubaron a 37 °C. Una absorbancia elevada indica una sedimentación más rápida como resultado de la agregación, en comparación con cualquiera de las cepas individualmente. El experimento muestra que S. mutans no se autoagrega sin una biopelícula. Sin embargo, la adición de cualquiera de las cepas de L. helveticus (LAFTI L10 o R0052) condujo a un aumento significativo de la absorbancia en comparación con cualquier bacteria sola.
Ejemplo 6: Discusión de los efectos in vitro
[0043] Se ha demostrado aquí que las propiedades únicas de cepas particulares de bacterias tienen el potencial de modificar el entorno microfloral oral para la mejora de la salud oral y la reducción de la caries dental que causa S. mutans. Esta conclusión se basa en el hallazgo específico de que las cepas de las especies L. helveticus (LAFTI L10 y R0052) inhiben los patógenos S. mutans mejor que todas las cepas analizadas, incluidas S. salivarius M18 y L. rhamnosus GG, que son cepas bien establecidas en el tratamiento de la caries dental.
[0044] En segundo lugar, existe una sinergia sustancial y significativa entre las cepas L. plantarum SD5870 y L. helveticus LAFTI L10 en su capacidad combinada para inhibir cinco cepas de S. mutans recién aisladas, así como una cepa de S. mutans que es muy patógena. La coagregación de L. helveticus LAFTI L10 con S. mutans in vitro subraya aún más su fuerte potencial para localizar y administrar sus efectos en la cavidad oral. Finalmente, se demostró que la combinación probiótica tiene un potencial sinérgico de reducción de S. mutans cuando se combina en un modelo in vitro de caries dental. Este hallazgo es inesperado ya que habíamos observado previamente que la combinación de dos o más probióticos diferentes normalmente resultó en una inhibición más pobre que cualquiera de los probióticos solos. Las combinaciones generalmente pueden conducir a una inhibición más pobre porque los diferentes probióticos en la combinación pueden competir entre sí, así como inhibirse entre sí. Incluso mantener la inhibición al mismo nivel en comparación con un solo probiótico es inesperado, y mucho menos encontrar sinergia entre las combinaciones de probióticos.
[0045] Se ha demostrado con fiabilidad que varias cepas bacterianas afectan a los patógenos de la caries dental a través de diversos mecanismos. En particular, se demostró que S. salivarius M18 tiene una actividad anti-S. mutans tanto en estudios clínicos como in vitro. También hubo un considerable interés en la investigación clínica que demuestra que el probiótico Lactobacillus rhamnosus GG tiene efectos anticaries dentales en estudios a corto y largo plazo. En la presente invención se demostró que varias cepas de bacterias probióticas excedieron estos probióticos en su antagonismo con S. mutans. Si bien no se observó antagonismo de las cepas de S. mutans utilizando L. rhamnosus GG, se observó un antagonismo considerable utilizando S. salivarius M18. Sin embargo, es notable que se observó que varias cepas de probióticos analizadas, incluidas L. plantarum SD5870 y B. longum SD5846, y la cepa relacionada S. salivarius K12, tenían mayor antagonismo que S. salivarius M18 para al menos una cepa de S. mutans, mientras que las dos cepas de L. helveticus estudiadas (LAFTI L10 y R0052) tenían de hecho un antagonismo mayor o igual para todas las cepas analizadas.
[0046] De mayor interés es que cuando la cepa L. helveticus LAFTI L10 se combinó con L. plantarum SD5870, se observó un fuerte sinergismo anti-S. mutans para los cinco patógenos probados. El antagonismo observado fue más fuerte para esta combinación que para cualquier otra cepa probiótica individual o combinación probada, y fue al menos tres veces más eficaz en la antagonización que los dos probióticos individuales agregados juntos, para las cinco cepas de S. mutans.
[0047] Aunque se desconoce qué mecanismos metabólicos subyacen al sinergismo, se sabe que algunas cepas de L. helveticus secretan bacteriocinas como la helveticina J y la helveticina V-1829, así como cepas de L. plantarum tienen una variedad de bacteriocinas y otras sustancias antimicrobianas codificadas en el pin locus, cuya secreción se regula a través de un mecanismo de quórum. Aunque se desconoce si L. plantarum SD5870 expresa algún factor antimicrobiano, se cree que su expresión, aunque variable, es relativamente común entre las cepas de
L. plantarum. Los péptidos antimicrobianos que antagonizan a S. mutans pueden ser particularmente eficaces en combinaciones de letalidad complementaria cuando son secretados por los dos probióticos.
[0048] Es interesante que las 4 cepas no estreptococos que tenían antagonismo con S. mutans se encontraban entre los productores de H2O2 más fuertes. Si bien S. salivarius K12 y M18 pueden ejercer actividad anti-S. mutans a través de la secreción de bacteriocinas específicas, parece probable que L. plantarum SD5870 y Lactobacillus helveticus LAFTI L10 lo hagan al menos parcialmente a través de la secreción de H2O2. Se reporta que S. mutans es capaz de producir y degradar peróxido de hidrógeno, pero sin embargo también es fácilmente susceptible a él, presumiblemente a concentraciones umbral. Los niveles de peróxido de hidrógeno localizados alrededor de S. mutans in vivo, pueden aumentarse adicionalmente por la agregación directa que se observó de L. helveticus LAFTI L10 con S. mutans, y, por lo tanto, actuar como un factor adicional por el cual se logra un alto grado de antagonismo.
[0049] Los hallazgos aquí respaldan la conclusión de que L. helveticus tiene un antagonismo significativo contra S. mutans, y además que la combinación específica de L. helveticus LAFTI L10 y L. plantarum SD5870 actúan sinérgicamente para antagonizar e inhibir el crecimiento de S. mutans en un modelo in vitro de salud oral. Estos hallazgos tienen implicaciones significativas para las estrategias de tratamiento de base microbiológica de la caries dental.
Ejemplo 7: Efectos in vivo
[0050] Los efectos in vivo se pueden determinar de la siguiente manera. Se lleva a cabo un ensayo clínico aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo con 30-40 sujetos por grupo. Los sujetos se tratan con dosis iguales de un mínimo de 1.000 millones de CFU L. helveticus LAFTI I10 y L. plantarum SD5870 dos veces al día en una pastilla probiótica después del cepillado durante un período de 28-30 días. Se puede esperar una disminución en la detección de una superficie desmineralizada precaria de > 20 % según lo determinado mediante radiometría fototérmica infrarroja de dominio de frecuencia altamente sensible y luminiscencia modulada. También se espera una disminución en los niveles de S. mutans y de placa.
[0051] Se anticipa que la adición de péptido fosfato de caseína-fosfato de calcio amorfo (CPP-ACP) u otro agente de remineralización demostrará efectos in vivo significativos de la siguiente manera. Se lleva a cabo un ensayo clínico aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo con 30-40 sujetos por grupo. El estudio comprendería 4 brazos de la siguiente manera: un primer grupo de tratamiento donde los sujetos se tratan con dosis iguales de un mínimo de 1.000 millones de CFU de L. helveticus LAFTI I10 y L plantarum SD5870; un segundo grupo de tratamiento donde los sujetos se tratan con una combinación de 1.000 millones de CFU de L. helveticus LAFTI I10 y L plantarum SD5870 y una dosis eficaz de CPP-ACP u otro agente de remineralización; un tercer grupo de tratamiento donde los sujetos se tratan con una dosis efectiva de CPP-ACP u otro agente de remineralización; y un cuarto grupo de tratamiento donde los sujetos se tratan con un control con placebo. El estudio continuaría con dosis dos veces al día en pastillas probióticas después del cepillado durante un período de 28-30 días. Se puede esperar una disminución en la detección de una superficie desmineralizada precaria de > 20 % según lo determinado mediante radiometría fototérmica infrarroja de dominio de frecuencia altamente sensible y luminiscencia modulada. También se espera una disminución en los niveles de S. mutans y de placa.
Ejemplo 8 - Formulación y estabilidad de la pastilla
[0052] Pastillas redondas de 7/16 pulgadas se formulan según la Tabla 2.
Tabla 2
continuación
[0053] Los paquetes sellados de las pastillas se almacenan a temperatura ambiente (20-25 °C) a una humedad ambiente de 60-65 %. Las bacterias se cultivan a partir de las pastillas en instantes de tiempo definidos según un procedimiento de placa de extensión selectiva estándar de la industria. Por lo tanto, las pastillas se disuelven en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se diluyen en serie y se colocan en placas en agar selectivo para placas de agar de S. salivarius (CABK12) y Lactobacilli (Rogosa) por triplicado. Los recuentos de CFU se realizan después de 48 horas de incubación a 37 °C en condiciones microaerofílicas. Incluso después de 27 meses, todavía hay cepas probióticas vivas sustanciales con al menos aproximadamente 4x108 CFU/pastilla. Hay un número sustancial y adecuado de bacterias vivas para proporcionar beneficios para la salud de los probióticos.
Ejemplo 9 - Antagonismo diferido en productos de la técnica anterior
[0054] Los productos probióticos comercialmente disponibles se probaron con el ensayo de antagonismo diferido descrito anteriormente. La Tabla 3 proporciona la composición bacteriana probiótica para cada producto.
Tabla 3
[0055] En resumen, una pastilla de cada producto se disolvió en 5 mL de 1X PBS mediante agitación durante 2 h a 37 °C en condiciones estériles. Luego, con la ayuda de un hisopo de algodón, la disolución se extendió dentro de una extensión de 1 cm de ancho a través del diámetro de BHI y BHI complementado con placas de agar CaCO3. Estas placas se incubaron durante 48 h a 37 °C en condiciones microaerofílicas, luego se retiraron las bacterias cultivadas y el agar se esterilizó. Después, se tomaron 5 cepas diferentes de S. mutans (cepa ATCC y aislados de Integra 13, 14, 15 y 17) a través de las placas, perpendicularmente a la extensión probiótica y se dejaron crecer durante otras 48 h. Este procedimiento se repitió dos veces, cada una de ellas utilizando triplicados para cada condición. A diferencia de las composiciones de la presente invención, no se observó inhibición del crecimiento para ninguna de las seis réplicas de cada afección para ninguno de los productos probióticos comercialmente disponibles analizados.
[0056] También cabe señalar que el recuento bacteriano probiótico de aproximadamente 4x108 CFU/pastilla después de 27 meses de almacenamiento de una pastilla de la presente invención como se describe en el Ejemplo 8 se compara muy favorablemente con los productos de la técnica anterior que se analizaron, y es considerablemente mejor que más de la mitad de los productos de la técnica anterior analizados.
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Claims (15)
1. Una composición para su uso en el tratamiento o prevención de afecciones o enfermedades de una cavidad oral, que comprende un probiótico, donde el probiótico comprende una cepa de Lactobacillus helveticus y una cepa de Lactobacillus plantarum.
2. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde la cepa de Lactobacillus helveticus es Lactobacillus helveticus LAFTI L10, Lactobacillus helveticus R0052 o una mezcla de estas.
3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la afección o enfermedad de una cavidad oral se selecciona de entre caries dental, halitosis, gingivitis, úlceras bucales que incluyen estomatitis aftosa, candidiasis y/o enfermedad periodontal.
4. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la cepa de Lactobacillus helveticus comprende Lactobacillus helveticus LAFTI L10.
5. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la cepa de Lactobacillus plantarum comprende Lactobacillus plantarum SD5870.
6. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el probiótico comprende además otra bacteria probiótica.
7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el probiótico comprende además uno o más otros lactobacilos.
8. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el probiótico consiste esencialmente en la cepa Lactobacillus helveticus y una cepa Lactobacillus plantarum, preferentemente donde el probiótico consiste esencialmente en la cepa Lactobacillus helveticus y Lactobacillus plantarum SD5870.
9. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde el probiótico consiste esencialmente en Lactobacillus helveticus LAFTI L10 y Lactobacillus plantarum SD5870; o donde el probiótico consiste esencialmente en Lactobacillus helveticus R0052 y Lactobacillus plantarum SD5870.
10. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el probiótico comprende además una o más bifidobacterias.
11. Una composición para su uso en el tratamiento o prevención de caries dentales, que comprende un probiótico, el probiótico que comprende Lactobacillus plantarum SD5870 y uno o más de: Streptococcus salivarius, y/o Streptococcus salivarius M18, y/o Streptococcus salivarius K12.
12. Una composición para su uso en el tratamiento o prevención de caries dentales, que comprende un probiótico, el probiótico comprende Bifidobacterium longum SD5846.
13. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además un agente de remineralización, preferentemente donde el agente de remineralización comprende péptido fosfato de caseína-fosfato de calcio amorfo.
14. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además un prebiótico.
15. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además un vehículo, diluyente, excipiente o cualquier mezcla de los mismos.
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