ES2934806T3 - Nanosistemas, que comprenden plata y antibióticos, y su uso para el tratamiento de infecciones bacterianas - Google Patents

Nanosistemas, que comprenden plata y antibióticos, y su uso para el tratamiento de infecciones bacterianas Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende nanopartículas de plata metálica soportadas sobre un vehículo, el vehículo se encuentra en forma de partículas, donde el vehículo se selecciona de un vehículo inerte o un antibiótico, la composición comprende además al menos un antibiótico en el caso el portador es un portador inerte. La invención también divulga un nanosistema que comprende dicha composición o una mezcla de nanopartículas de plata y al menos un antibiótico, para su uso en el tratamiento de una infección causada por al menos una cepa de bacterias resistente a al menos un antibiótico. La invención además divulga composiciones farmacéuticas y métodos para la preparación de las composiciones y nanosistemas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanosistemas, que comprenden plata y antibióticos, y su uso para el tratamiento de infecciones bacterianas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a usos de nanopartículas de plata, en combinación con antibióticos, para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias resistentes, así como a composiciones que comprenden nanopartículas de plata soportadas en antibióticos.
Antecedentes de la invención
Antibióticos y resistencia a los antibióticos
Los antibióticos son medicamentos que se utilizan para prevenir y tratar infecciones bacterianas. Pueden matar (bactericidas) o inhibir el crecimiento de bacterias (bacteriostáticos) y se clasifican según su mecanismo de acción, su estructura química o su espectro de actividad.
La resistencia a los antibióticos ocurre cuando las bacterias cambian en respuesta al uso de estos medicamentos. Las bacterias, ni seres humanos ni animales, se hacen resistentes a los antibióticos. Estas bacterias pueden infectar a seres humanos y a animales, y las infecciones que causan son más difíciles de tratar que las causadas por bacterias no resistentes. Conduce a una reducción de la eficacia de un fármaco, como un antibiótico, para curar una enfermedad o afección. Algunas bacterias son naturalmente resistentes a ciertos antibióticos, mientras que otras pueden adquirir resistencia a través de mutaciones en algunos de sus genes cuando se exponen a un antibiótico. Esta resistencia, natural o adquirida, puede extenderse a otras especies bacterianas ya que las bacterias pueden intercambiar fácilmente material genético de unas a otras, aunque sean de diferentes especies.
La resistencia a los antibióticos está aumentando a niveles peligrosamente altos en todas partes del mundo. Nuevos mecanismos de resistencia emergen y se extienden a nivel mundial, amenazando nuestra capacidad para tratar enfermedades infecciosas comunes. Una lista creciente de infecciones, tales como neumonía, tuberculosis, envenenamiento de la sangre y gonorrea, se están volviendo más difíciles, y a veces imposibles, de tratar ya que los antibióticos utilizados actualmente se vuelven menos efectivos.
Cuando los antibióticos se pueden comprar para uso humano o animal sin receta, la aparición y propagación de la resistencia empeora. Asimismo, en países sin pautas de tratamiento estándar, los trabajadores de la salud y los veterinarios a menudo recetan antibióticos en exceso y el público los usa en exceso.
Es posible que nos estemos dirigiendo hacia una era postantibióticos, en la que las infecciones comunes y las lesiones menores pueden volver a matar. La resistencia a los antibióticos conduce a mayores costes médicos, estancias hospitalarias prolongadas y aumento de la mortalidad.
Por un lado, es necesario cambiar la forma en que se prescriben y utilizan los antibióticos.
Por otro lado, es necesario desarrollar nuevos tratamientos, capaces de tratar infecciones causadas por bacterias resistentes a los antibióticos.
Uso antimicrobiano de la plata
Antes de la introducción de los antibióticos modernos, se usaba plata coloidal como germicida y desinfectante: por ejemplo, en 1920, Searle, A. B. desveló n el "Capítulo VIII: Germicides and Disinfectants". The Use of Colloids in Health and Disease. Gerstein - University of Toronto: Toronto Collection: Londres Constable & Co." que la solución de colosol de plata se mezcló con caldo nutritivo en varias diluciones, se inoculó con bacilo tifoideo y se incubó, demostrando poder germicida. Otros experimentos de naturaleza similar se mencionan en la misma publicación, demostrando el valor de los colosoles de plata como bactericidas que tienen una fuerte acción germicida, a diferencia de otros coloides metálicos que no tienen acción germicida o esta es muy escasa. Asimismo, para estos fines bactericidas se empleó el uso de plata soportada sobre soportes inertes (patente española 135.695 o FR 784959).
Con el desarrollo de los antibióticos modernos en la década de 1940, disminuyó el uso de la plata como agente antimicrobiano.
Más recientemente, en vista de la resistencia a los antibióticos en muchas cepas bacterianas, se está explorando nuevamente el uso de la plata coloidal, especialmente aplicando los desarrollos en el campo de la nanotecnología, siendo el tamaño nanométrico capaz de cambiar las propiedades químicas, físicas y ópticas de los metales. El uso de nanopartículas de plata y plata coloidal como agente antimicrobiano por sí mismo para el tratamiento de infecciones bacterianas se explora en varias publicaciones (véase, por ejemplo, Rai, M. et al. "Silver Nanoparticles as A New Generation of Antimicrobials" Biotechnol. Adv. 2009, 27, 76-83; Rizzello, L. et al. "Nanosilver-Based Antibacterial Drugs and Devices: Mechanisms, Methodological Drawbacks, and Guidelines." Chem. Soc. Rev. 2014, 43, 1501-1518; y documento US2009148484).
Combinaciones de plata y antibióticos
La plata no solo se ha probado para ser utilizada sola como agente antimicrobiano, sino también se ha utilizado en combinación con antibióticos.
Por ejemplo, en 1968 se desarrolló un compuesto que contenía plata y el antibiótico sulfadiazina de sodio, sulfadiazina de plata (SSD) (véase, por ejemplo, Chopra I (2007). "The increasing use of silver-based products as antimicrobial agents: a useful development or a cause for concern?". J. Antimicrob. Chemother. 59 (4): 587-90). Aun así, su uso se ha limitado a aplicaciones tópicas y se ha encontrado que otros antibióticos son más efectivos, por lo que su uso apenas se recomienda. De hecho, su eficacia fue cuestionada en la revisión "Cochrane Database Syst Rev. 2010 17 de marzo;(3):CD006478", en donde se decía que "no hay pruebas suficientes para establecer si los apósitos que contienen plata o los agentes tópicos promueven la cicatrización de heridas o previenen la infección de heridas".
Ha surgido el uso de la plata en una nueva clase de agentes antimicrobianos inorgánicos, a saber, construcciones de nanocluster de plata, repleto de daptomicina. Cada construcción de nanocluster, estando en el intervalo de partículas ultrapequeñas, contiene 16 átomos de plata y 9 ligandos protectores de glutatión. Estos nanoclusters se conjugan homogéneamente con daptomicina en el mismo intervalo de tamaño, a través de un fuerte enlace covalente (véase Zheng et al. "Antimicrobial Cluster Bombs: Silver Nanoclusters Packed with Daptomycin", ACS Nano (2016), 10 (8), 7934-7942). Se afirma que las nanopartículas de plata más voluminosas en lugar de los nanoclusters de plata, junto con daptomicina, reducirían la eficacia antimicrobiana del híbrido.
También se han explorado mezclas físicas de plata coloidal con varios antibióticos. Las nanopartículas de plata, tanto plata elemental como plata elemental recubierta de óxidos de plata, se han mezclado con varios antibióticos y se ha probado su actividad. Se descubrió alguna actividad antimicrobiana aditiva (véase el documento WO2006074117).
Más recientemente, la acción de los iones de plata en combinación con antibióticos ha sido probada tanto in vitro y in vivo. Se descubrió que la plata, en forma de iones disueltos, ataca las células bacterianas de dos maneras principales: hace que la membrana celular sea más permeable e interfiere con el metabolismo de la célula, lo que conduce a la sobreproducción de compuestos de oxígeno reactivos, y a menudo tóxicos. (véase "Science Translational Medicine 19 Jun 2013: Vol. 5, Número 190, pág. 190ra81" y el documento WO 2013/063405 A1, del mismo autor). En estos documentos se sugieren más investigaciones que combinen iones de plata y antibióticos. Aun así, no se desvelan resultados para la plata metálica. Dadas las diferencias de comportamiento y propiedades fisicoquímicas entre la plata iónica y la plata metálica, y específicamente las nanopartículas, estos documentos no pueden arrojar luz sobre la utilidad como antibiótico de la plata metálica. Por otro lado, la plata iónica tiene el inconveniente de que se ha descrito que presenta efectos tóxicos cuando se administra a mamíferos, incluidos seres humanos, y puede causar una coloración azul debido a los procesos de reducción que ocurren en el cuerpo vivo.
La resistencia a los antibióticos y por tanto la búsqueda de nuevos antibióticos en los campos de la medicina es una necesidad apremiante que incluso ha sido objeto de un informe específico elaborado y publicado por la Organización Mundial de la Salud en 2014. Es un problema que incluso se discutió dentro de la ONU en septiembre de 2016.
Figuras
La figura 1(a) muestra micropartículas de caolín con nanopartículas de plata depositadas sobre ellas (x8870).
La Figura 1 (b) muestra a x20380 el área resaltada en la Figura 1 (a).
La Figura 1 (c.1) muestra a x66000 el área (c) resaltada en la Figura 1(b). Las nanopartículas de plata se pueden apreciar claramente en la superficie de la estructura laminar del caolín.
La figura 1 (c.2) muestra las nanopartículas de plata (color blanco) cuando se observan bajo electrones retrodispersados, a diferencia de las áreas que no tienen nanopartículas de plata.
La figura 1(d) muestra a x66000 el área (d) resaltada en la figura 1(b). Se pueden apreciar claramente nanopartículas de plata en los bordes de la estructura laminar del caolín.
Sumario de la invención
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar nuevos tratamientos antimicrobianos, debido al aumento de la resistencia bacteriana a los antibióticos. La presente invención proporciona nuevas composiciones y tratamientos de infecciones bacterianas, a saber, se refiere a usos de nanopartículas de plata metálica en combinación con antibióticos, para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias resistentes, así como a composiciones que comprenden nanopartículas de plata metálica y antibióticos.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende nanopartículas de plata metálica que se encuentran soportadas sobre un soporte, estando el vehículo en forma de partículas; dicho vehículo es un antibiótico; en el presente documento se desvelan composiciones en las que el vehículo es un vehículo inerte, en cuyo caso la composición comprende además al menos un antibiótico.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un nanosistema que comprende una composición según el primer aspecto definido anteriormente para su uso en el tratamiento de una infección provocada por al menos una cepa de bacterias resistente a al menos un antibiótico. En el presente documento se desvela el uso de un nanosistema que comprende una mezcla de nanopartículas de plata y al menos un antibiótico, para su uso en el tratamiento de una infección causada por al menos una cepa de bacterias resistente al menos a un antibiótico.
Adicionalmente, la presente invención se refiere a un proceso de preparación de la composición según el primer aspecto de la invención como se ha definido anteriormente.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y una composición que comprende nanopartículas de plata metálica soportadas sobre un vehículo, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, para su uso como medicamento; para su uso en el tratamiento de una infección; y para su uso en el tratamiento de una infección.
Descripción detallada de la invención
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende nanopartículas de plata que se encuentran soportadas sobre un soporte, que está en forma de partículas; dicho vehículo es un antibiótico; en el presente documento se desvelan composiciones en las que el vehículo es un vehículo inerte, en cuyo caso la composición comprende además al menos un antibiótico.
El soporte inerte se selecciona preferentemente entre, pero sin limitación, una arcilla, zeolitas, sílice, alúmina, caolín y óxidos metálicos (por ejemplo, MgO). De acuerdo con una realización preferida, el soporte inerte es el caolín, una roca rica en caolinita, que es un mineral de arcilla con la composición química AhSi2O5(OH)4.
En el contexto de la presente invención, "soportado" significa cualquiera de los adsorbidos en la superficie, impregnado en la superficie, incrustado en la superficie, etc. del soporte pulverizado. es decir, las nanopartículas de plata se adhieren a la superficie del soporte pulverizado, como consecuencia de las energías superficiales. Los átomos en la superficie del soporte (ya sea un soporte inerte o un antibiótico, en el marco de la presente invención) puede atraer y unirse a otros átomos, en este caso átomos de plata, la naturaleza del enlace es fuerzas débiles de van der Waals, enlaces covalentes o atracción electrostática. Por lo tanto, las composiciones de la invención son fáciles de preparar y el soporte, que es un antibiótico, no necesita ligandos adicionales para asociarse efectivamente a las nanopartículas de plata metálica. Las composiciones desveladas en el presente documento, que comprende un soporte inerte, también son simples de preparar, y el soporte inerte no necesita ligandos adicionales para asociarse de manera efectiva a las nanopartículas de plata metálica.
En la presente divulgación, "soporte inerte" se refiere a un soporte sobre el que se soportan las nanopartículas de plata metálica, que no tiene actividad farmacéutica y en concreto no tiene actividad antibiótica.
El soporte se pulveriza preferentemente en micropartículas, un tamaño que permite una interacción eficiente con las nanopartículas de plata metálica, al mismo tiempo que permite sus aplicaciones farmacéuticas.
El diámetro medio típico de las partículas del antibiótico cuando se utiliza como soporte es de 0,1 |jm (micrómetro) o superior. El diámetro medio típico de partícula para el soporte de antibiótico es de 200 jm o menos, preferentemente 100 jm o menos, más preferentemente 50 jm o menos. Lo más preferentemente, el diámetro medio de las partículas está entre 0,1 y 50 jm .
En el presente documento se desvela que el diámetro medio típico de las partículas para el soporte inerte es de 0,1 jm (micrómetro) o superior, preferentemente 0,25 jM o mayor y, más preferentemente, 0,5 jM o mayor. El diámetro promedio típico de partículas para el soporte inerte es de 200 jm o menos, preferentemente 100 jm o menos, más preferentemente 50 jm o menos. Lo más preferentemente, el diámetro medio de las partículas está entre 0,5 y 50 jm .
Las nanopartículas de plata metálica en las composiciones de la presente invención tienen normalmente un diámetro entre 1 y 100 nanómetros. Preferentemente, el diámetro está por encima de aproximadamente 5 nanómetros, más preferentemente por encima de aproximadamente 10 nanómetros, incluso más preferentemente por encima de aproximadamente 15 nanómetros y, más preferentemente, por encima de aproximadamente 20 nanómetros. Lo más preferentemente, el diámetro está entre aproximadamente 20 nanómetros y aproximadamente 50 nanómetros.
El antibiótico de la composición según cualquiera de los aspectos de la presente invención (por ejemplo, primer aspecto o segundo aspecto), ya sea que se use como componente (por ejemplo, mezclado con la nanopartícula de plata metálica sobre un soporte inerte, como se desvela en el presente documento) o si está actuando en sí mismo como el soporte pulverizado de la nanopartícula de plata metálica (es decir, según la presente invención), se selecciona preferentemente entre, pero sin limitación, penicilinas (incluyendo aminopenicilinas, penicilinas antipseudomonas, inhibidores de beta-lactamasa, penicilinas naturales y penicilinas resistentes a la penicilinasa), cefalosporinas, monobactámicos, inhibidores de beta-lactamasa, carbapenémicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas, glucopéptidos, lincomicinas, macrólidos, cetólidos, sulfonamidas, aminoglucósidos, oxazolidinonas o del grupo que comprende colistina, sulfametoxazol/trimetoprima, fosfomicina, nitrofurantoína, cloranfenicol, clindamicina, ácido fusídico, linezolid, mupirocina, daptomicina, clindamicina y rifampicina.
Las aminopenicilinas incluyen, aunque sin limitación, amoxicilina (por ejemplo, Amitron®, Clamoxyl®, Amoxicot®, Moxatag®, Moxilin®, Amoxil®, Apo-Amoxi®, DisperMox®, Trimox®) y ampicilina (Principen®, Totacillin-N®, Omnipen-N®, Britapen®, Gobemicina®, Retarpen®, Amplipeni®, Pembrintin®)
Las penicilinas antipseudomonas incluyen, aunque sin limitación, carbenicilina (por ejemplo, Geocillin®, Carbapen®, Fugacillin®, Geopen®, Pyocianil®), piperacilina (por ejemplo, Pipracil®) y ticarcilina (por ejemplo, Ticar®).
Los inhibidores de betalactamasas incluyen, aunque sin limitación, combinaciones de amoxicilina/clavulanato (por ejemplo, Augmentin®, Augmentine®, Clavulin®, Amoclan®, Curam®, Optamox®, Moxtam®, Cla-Biomox®), ampicilina/sulbactam (por ejemplo, Unasyn®), piperacilina/tazobactam (por ejemplo, Zosyn®) y clavulanato/ticarcilina (por ejemplo, Timentin®).
Las penicilinas naturales incluyen, aunque sin limitación, penicilina V potásica (por ejemplo, Beepen-VK, PC Pen VK, Veetids), penicilina g benzatina (por ejemplo, Bicillin L-A®, Isoject Permapen®), penicilina g de potasio (por ejemplo, Prizerpen®), penicilina procaína (por ejemplo, Wycillin®) y una combinación de penicilina g benzatina/penicilina procaína (por ejemplo, Bicillin CR®).
Las penicilinas resistentes a la penicilinasa incluyen, aunque sin limitación, oxacilina (por ejemplo, Bactocill®), dicloxacilina (por ejemplo, Dycill®, Dynapen®) y nafcilina (por ejemplo, Unipen®).
Las tetraciclinas incluyen, aunque sin limitación, doxiciclina (por ejemplo, Acticlate®, Adoxa®, Adoxa CK®, Adoxa Pak®, Adoxa TT®, Alodox®, Avidoxy®, Doryx®, Doxy 100®, Doxy 200®, Mondoxyne NL®, Morgidox®, Ocudox®, Oracea®, Oraxyl®, Periostat®, Targadox®, Uracil®, Vibra-Tabs®, Vibramycin®), tetraciclina (por ejemplo, Sumycin®, Actisite®, Ala Tet®) y minociclina (por ejemplo, Cleeravue-M®, Dynacin®, Minocin®, Myrac®, Solodyn®, Ximino®).
Hay cinco generaciones de cefalosporinas; generalmente se clasifican en cefalosporinas/inhibidores de betalactamasa, cefalosporinas de primera generación, cefalosporinas de cuarta generación, cefalosporinas de última generación, cefalosporinas de segunda generación y cefalosporinas de tercera generación.
Los inhibidores de las cefalosporinas/betalactamasas incluyen, aunque sin limitación, avibactam/ceftazidima (por ejemplo, Avycaz®) y ceftolozano/tazobactam (por ejemplo, Zerbaxa®).
Las cefalosporinas de primera generación incluyen, aunque sin limitación, cefadroxilo (por ejemplo, Duricef®), cefradina (por ejemplo, Velosef®), cefaclor (por ejemplo, Raniclor®), cefdinir (por ejemplo, Omnicef®), cefazolina (por ejemplo, Ancef®), cefditores (por ejemplo, Spectracef®), cefpodoxima (por ejemplo, Vantin®), cefprozilo (por ejemplo, Cefzil®), ceftibuten (por ejemplo, Cedax®), cefuroxima, por ejemplo (Ceftin®) y cefalexina (por ejemplo, Keflex®, Biocef®, Panixine®).
Las cefalosporinas de cuarta generación incluyen, aunque sin limitación, cefepima (por ejemplo, Maxipime®). Las cefalosporinas de última generación incluyen, aunque sin limitación, ceftarolina (por ejemplo, Teflaro®).
Las cefalosporinas de segunda generación incluyen, aunque sin limitación, loracarbef (por ejemplo, Lorabid®), cefotetán (por ejemplo, Cefotan), cefuroxima (Zinacef®, Ceftin®), cefprozilo (por ejemplo, Cefzil®), cefoxitina (por ejemplo, Mefoxin®) y cefaclor (por ejemplo, Raniclor®).
Las cefalosporinas de tercera generación incluyen, aunque sin limitación, ceftibuten (por ejemplo, Cedax®), ceftriaxona (por ejemplo, Rocephin®), cefotaxima (por ejemplo, Claforan®), cefpodoxima (por ejemplo, Vantin®), cefdinir (por ejemplo, Omnicef®), cefixima (por ejemplo, Suprax®), cefditores (por ejemplo, Spectracef®), ceftizoxima (por ejemplo, Cefizox), cefoperazona (por ejemplo, Cefobid®) y ceftazidima (por ejemplo, Ceptaz®, Fortaz®, Tazicef®).
Las quinolonas incluyen, aunque sin limitación, lomefloxacina (por ejemplo, Maxaquin®), ofloxacina (por ejemplo, Floxin®), norfloxacino (por ejemplo, Noroxin®), gatifloxacino (por ejemplo, Tequin), ciprofloxacino (por ejemplo, Cipro®, Proquín®), moxifloxacino (por ejemplo, Avelox®), levofloxacino (por ejemplo, Levaquin®), gemifloxacino (por ejemplo, Factive®), cinoxacina (por ejemplo, cinobac®), ácido nalidíxico (por ejemplo, NegGram®), trovafloxacino (por ejemplo, Trovan®) y esparfloxacino (por ejemplo, Zagam®),
Las lincomicinas incluyen, aunque sin limitación, lincomicina (por ejemplo, Lincocin®) y clindamicina (por ejemplo, Cleocin®).
Los cetólidos incluyen, aunque sin limitación, telitromicina (por ejemplo, Ketek®).
Los macrólidos incluyen, aunque sin limitación, eritromicina (por ejemplo, Erythrocin®, Ery-Tab®, Eryc®, Ilosone®), azitromicina (por ejemplo, Zmax®, Zithromax®, Zitromax®, claritromicina (por ejemplo, Biaxin®) y fidaxomicina (por ejemplo, Dificid®).
Las sulfonamidas incluyen, aunque sin limitación, sulfizoxazona (por ejemplo, Gantrisin®, Truxazole®), sulfasalazina (por ejemplo, Azulfidine) y una combinación de sulfametoxazol/trimetoprim (por ejemplo, Sulfatrim®, Co-trimoxazole®, Septra®, Bactrim®, Cotrim®).
Los antibióticos glicopéptidos incluyen, aunque sin limitación, vancomicina (por ejemplo, Vancocin®), dalbavancina (por ejemplo, Dalvance®, oritavancina (por ejemplo, Orbactiv®) y telavancina (por ejemplo, Vibativ®)
Los aminoglucósidos incluyen, aunque sin limitación, paromomicina (por ejemplo, Paromicyn®, Humatin®), tobramicina (por ejemplo, Tobi®, Bethkis®, Kitabis®, Nebcin®, TOBI Podhaler®), gentamicina (por ejemplo, Garamycin®), amikacina (por ejemplo, Amikin®), kanamicina (por ejemplo, Kantrex®) y neomicina (Neo-Fradin®, Neo-Tab®).
Los carbapenémicos incluyen, aunque sin limitación, doripenem (por ejemplo, Doribax®), meropenem (por ejemplo, Merrem®), ertapenem (por ejemplo, Inanz®) y una combinación de imipenem/cilastatina (por ejemplo, Primaxin®). Por ejemplo, el antibiótico se selecciona entre penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos, inhibidores de plactamasa, Los carbapenémicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas, glicopéptidos o del grupo que comprende colistina, sulfametoxazol/trimetoprima, fosfomicina, nitrofurantoína, cloranfenicol, clindamicina, ácido fusídico, linezolid, mupirocina, daptomicina, clindamicina y rifampicina.
En el caso de que el antibiótico sea una penicilina, se selecciona preferentemente entre ampicilina, piperacilina, mezlocilina, oxacilina, penicilina, penicilina G. Aún más preferentemente, es penicilina G.
En el caso de que el antibiótico sea una aefalosporina, se selecciona preferentemente entre cefazolina, cefuroxima, cefpodoxima, cefotaxima, ceftazidima, cefoxitina y cefepima.
En el caso de que el antibiótico sea un monobactámico, es, preferentemente, aztreonam.
En el caso de que el antibiótico sea un inhibidor de la p-lactamasa, se selecciona preferentemente entre amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina/sulbactam, piperacilina/tazobactam, cefotaxima/ácido clavulánico y ceftazidima/ácido clavulánico.
En el caso de que el antibiótico sea un carbapenémico, se selecciona preferentemente entre ertapenem, meropenem e imipenem.
En el caso de que el antibiótico sea un aminoglucósido, se selecciona preferentemente entre amikacina, gentamicina y tobramicina.
En el caso de que el antibiótico sea una quinolona, se selecciona preferentemente entre levofloxacino, ciprofloxacino, moxifloxacino y norfloxacino.
En el caso de que el antibiótico sea una tetraciclina, se selecciona preferentemente entre tetraciclina, tigeciclina, azitromicina y eritromicina.
En el caso de que el antibiótico sea un glicopéptido, se selecciona preferentemente entre vancomicina y teicoplanina. Preferentemente, el antibiótico es vancomicina.
Otros antibióticos preferidos son colistina, trimetoprim/sulfametoxazol, fosfomicina, nitrofurantoína, cloranfenicol, linezolid, mupirocina, daptomicina, clindamicina, rifampicina y ácido fusídico. Preferentemente, el antibiótico se selecciona entre linezolid y daptomicina. Incluso más preferentemente, el antibiótico es linezolid.
Por lo tanto, lo más preferentemente, el antibiótico se selecciona entre ampicilina, piperacilina, mezlocilina, oxacilina, penicilina, penicilina G, cefazolina, cefuroxima, cefpodoxima, cefotaxima, ceftazidima, cefoxitina, cefepima, aztreonam, amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina/sulbactam, piperacilina/tazobactam, cefotaxima/ácido clavulánico y ceftazidima/ácido clavulánico, ertapenem, meropenem, imipenem, amikacina, gentamicina, tobramicina, levofloxacino, ciprofloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, tetraciclina, tigeciclina, azitromicina, eritromicina, vancomicina, teicoplanina, colistina, trimetoprim/sulfametoxazol, fosfomicina, nitrofurantoína, cloranfenicol, linezolid, mupirocina, daptomicina, clindamicina, rifampicina y ácido fusídico.
En la composición desvelada en el presente documento, en donde el soporte es un soporte inerte, cualquiera de los soportes inertes particulares enumerados anteriormente (es decir, una arcilla, zeolitas, sílice, alúmina, caolín y óxidos metálicos (por ejemplo, MgO)) se pueden combinar con cualquiera de los antibióticos particulares enumerados. Aún más, la composición puede comprender uno o más antibióticos particulares seleccionados de los antibióticos enumerados anteriormente, en combinación con cualquiera de los soportes inertes.
Dentro de las composiciones, tanto de acuerdo con la presente invención como según se desvela, la relación en peso de la plata metálica con respecto a la cantidad total de antibióticos está entre 10:100 y 0,1:100.
La composición puede contener además cualquier tipo de al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable conocido en la técnica; será evidente para un experto en la técnica seleccionar el excipiente según la vía de administración elegida. El excipiente puede ser uno o más seleccionados entre uno o más antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, colorantes, disgregantes, aromas, deslizantes, lubricantes, conservantes, sorbentes, edulcorantes o vehículos, como se conoce en la técnica.
La vía de administración puede ser cualquier vía de administración conocida, por ejemplo, una vía de administración seleccionada entre, aunque sin limitaciones, oral, tópica, sublingual, parenteral, administración rectal, por inhalación, o por vía intravenosa, intramuscular, inyección subcutánea.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un nanosistema que comprende una composición según el primer aspecto de la invención tal como se ha definido anteriormente, para su uso en el tratamiento de una infección causada por al menos una cepa de bacterias resistente al menos a un antibiótico.
En el presente documento se desvela un nanosistema que comprende una mezcla de nanopartículas de plata y al menos un antibiótico. En este contexto, las nanopartículas de plata pueden seleccionarse entre nanopartículas de plata en suspensión o plata coloidal.
La plata coloidal en el marco de la presente divulgación es una solución de plata coloidal, es decir, una suspensión de partículas insolubles de plata dispersadas microscópicamente en un líquido, normalmente en agua, que no se asienta o tarda mucho en asentarse apreciablemente. Las partículas de fase dispersa tienen un diámetro entre aproximadamente 1 y 1000 nanómetros. La plata coloidal está disponible comercialmente, por ejemplo, como la marca registrada Collargol (disponible en Laboratorios Argenol).
El antibiótico del nanosistema según el segundo aspecto de la presente invención se selecciona, preferentemente, entre, pero sin limitación, penicilinas (incluyendo aminopenicilinas, penicilinas antipseudomonas, inhibidores de betalactamasa, penicilinas naturales y penicilinas resistentes a la penicilinasa), cefalosporinas, monobactámicos, inhibidores de beta-lactamasa, carbapenémicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas, glucopéptidos, lincomicinas, macrólidos, cetólidos, sulfonamidas, aminoglucósidos, oxazolidinonas o del grupo que comprende colistina, sulfametoxazol/trimetoprima, fosfomicina, nitrofurantoína, cloranfenicol, clindamicina, ácido fusídico, linezolid, mupirocina, daptomicina, clindamicina y rifampicina. Las definiciones, los ejemplos y antibióticos preferidos definidos anteriormente con respecto al primer aspecto de la invención también son aplicables, en todo su alcance y detalle, al segundo aspecto de la invención, y deben considerarse incorporados en el presente documento; también son aplicables a las divulgaciones relativas a la combinación de vehículo inerte y antibióticos.
La cepa bacteriana resistente puede ser una cepa gramnegativa o grampositiva. Una cepa gramnegativa se selecciona preferentemente entre Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa), Escherichia coli (E. coli), Citrobacter freundii (C. freundii), Klebsiella oxitoca (K. oxitoca) y Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae). Una cepa grampositiva se selecciona preferentemente entreStaphylococcus aureus (S. aureus) y Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis).
La expresión "resistente al menos a un antibiótico", significa que la cepa bacteriana tiene una sensibilidad reducida, o incluso ausencia de sensibilidad, contra el único antibiótico, en comparación con una cepa de tipo salvaje. Sensibilidad reducida, en el contexto de la presente invención, se refiere a una CIM que es un 15 % superior a la CIM de la cepa de tipo salvaje, preferentemente a una CIM que está un 25 % por encima de la CIM de la cepa de tipo salvaje, y, lo más preferentemente, a una CIM que está un 50 % por encima de la CIM de la cepa de tipo salvaje.
Los inventores han confirmado la utilidad de las composiciones de la invención, así como de las composiciones desveladas pero no reivindicadas, en el tratamiento de diferentes cepas bacterianas. Por ejemplo, la infección es causada por al menos una cepa de bacterias gramnegativas, que es resistente al menos a un antibiótico. Preferentemente, el antibiótico utilizado corresponde al mismo antibiótico al que la cepa bacteriana es resistente.
Por ejemplo, la composición desvelada en el presente documento pero no reivindicada, en donde el soporte es un soporte inerte, preferentemente, caolín, en combinación con un antibiótico, preferentemente una penicilina, aún más preferentemente penicilina G, es para su uso en el tratamiento de una infección causada por una cepa bacteriana gramnegativa, preferentemente una cepa seleccionada entre E. coli, C. freundii, K. pneumoniae o PD. aeruginosa, aún más preferentemente E.coli ATCC 8739, E.coli no BLEE, E. coli H24 BLEE+, E. coli C93 BLEE+, E. coli W207 BLEE+, C. freundii H44 BLEE+, K. pneumoniae ATCC 700603, K. pneumoniae (BLEE+), Ps. aeruginosa PAO1, Ps. aeruginosa OPRD, Ps. aeruginosa MEXR o Ps. aeruginosa VIM2, en donde BLEE+ significa cepa productora de p-lactamasa de espectro extendido.
Por ejemplo, la composición de acuerdo con el primer aspecto de la invención, preferentemente una penicilina, aún más preferentemente penicilina G, es para su uso en el tratamiento de una infección causada por una cepa bacteriana gramnegativa, preferentemente una cepa seleccionada entre E. coli, C. freundii, K. pneumoniae o PD. aeruginosa, aún más preferentemente E. coli AC8 BLEE+, E. coli H24 BLEE+, E. coli C93 BLEE+, E. coli W207 BLEE+, C. freundii BLEE+, K. pneumoniae ATCC700603 BLEE+, K. pneumoniae BLEE+, Ps. aeruginosa PAO1, Ps. aeruginosa OPRD, Ps. aeruginosa MEXR, Ps. aeruginosa DACB o Ps. aeruginosa VIM2, en donde BLEE+ significa cepa productora de p-lactamasa de espectro extendido.
Por ejemplo, cuando el nanosistema desvelado pero no reivindicado de la invención, que comprende nanopartículas de plata (ya sea en suspensión o en forma de plata coloidal) en combinación con un antibiótico, el antibiótico preferentemente seleccionado entre ampicilina, piperacilina, mezlocilina, oxacilina, penicilina, penicilina G, cefazolina, cefuroxima, cefpodoxima, cefotaxima, ceftazidima, cefoxitina, cefepima, aztreonam, amoxicilina/ácido clavulánico, ampicilina/sulbactam, piperacilina/tazobactam, cefotaxima/ácido clavulánico y ceftazidima/ácido clavulánico, ertapenem, meropenem, imipenem, amikacina, gentamicina, tobramicina, levofloxacino, ciprofloxacino, moxifloxacino, norfloxacino, tetraciclina, tigeciclina, azitromicina, eritromicina, vancomicina, teicoplanina, colistina, trimetoprim/sulfametoxazol, fosfomicina, nitrofurantoína, cloranfenicol, linezolid, mupirocina, daptomicina, clindamicina, rifampicina y ácido fusídico, es para su uso en el tratamiento de una infección, causada por una cepa bacteriana resistente al menos a un antibiótico, ya sea una cepa gramnegativa (seleccionada entre Ps. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae o K. oxitocca), o una cepa grampositiva (S. aureus o S. epidermidis); preferentemente, una infección causada por una cepa gramnegativa, resistente al menos a un antibiótico, incluso más preferentemente una cepa bacteriana gramnegativa seleccionada entre Pseudomonas VIM2 Mutante (productora de metalo-p-lactamasa), Pseudomonas OrpD mutante (deficiente en porina), Presudomonas MexR mutante (sobreexpresión de la bomba de eflujo), Pseudomonas DacB mutante (AMPC hiperproductor), E. coli BLEE+ y Klebsiella BLEE+.
Adicionalmente, los inventores han confirmado la utilidad de las composiciones de la invención en el tratamiento de infecciones provocadas por bacterias no resistentes, lo que posibilita el tratamiento de dichas infecciones con dosis del antibiótico inferiores a las generalmente prescritas o recomendadas; el uso de dosis más bajas de antibióticos en el tratamiento de infecciones reduciría la aparición de resistencia bacteriana a los antibióticos, debido a la menor exposición al antibiótico y, por lo tanto, al uso de dosis de antibiótico más bajas que las generalmente prescritas o recomendadas, en combinación con nanopartículas de plata soportadas sobre el antibiótico, de acuerdo con la presente invención, también se pretende que esté dentro del alcance de la presente invención. Se desvela, pero no se reivindica, el uso de dosis más bajas de antibiótico que las generalmente prescritas o recomendadas, en combinación con nanopartículas de plata en mezcla con el antibiótico.
De forma adicional, la presente invención se refiere a un proceso de preparación de la composición según el primer aspecto de la invención como se ha definido anteriormente, que comprende las etapas de:
a) preparar una disolución de un ion de plata;
b) añadir dicha disolución de iones de plata a un antibiótico en forma de partículas; y
c) añadir un agente reductor a la mezcla obtenida en b), para obtener plata metálica soportada sobre dicho antibiótico.
Las composiciones de la invención en donde las nanopartículas de plata metálica están soportadas sobre un antibiótico se pueden obtener por el método anterior.
Se desvela, pero no se reivindica, un método de preparación que comprende las etapas de:
a) preparar una disolución de un ion de plata;
b) añadir dicha disolución de iones de plata a un soporte inerte en forma de partículas;
c) añadir un agente reductor a la mezcla obtenida en b), para obtener plata metálica soportada sobre dicho soporte inerte; y
d) mezclar el soporte inerte soportado en plata metálica con al menos un antibiótico para obtener la composición en la que el soporte es un soporte inerte.
Las composiciones desveladas pero no reivindicadas, en donde las nanopartículas de plata metálica están soportadas sobre un soporte inerte, puede obtenerse así por el método anterior.
En el contexto de la presente invención, los iones de plata se pueden obtener disolviendo cualquier sal inorgánica, por ejemplo, una sal seleccionada del grupo que consiste en cloruro de plata, sulfuro de plata, carbonato de plata o nitrato de plata. Los iones de plata también se pueden obtener utilizando óxido de plata. Preferentemente, los iones de plata se obtienen utilizando óxido de plata o nitrato de plata. El más preferido es el óxido de plata.
El agente reductor utilizado en la presente invención se puede seleccionar, pero sin limitación, entre el grupo que consiste en hidroquinona, formol, sulfato de hidrazina, ácido ascórbico y azúcares reductores. Los agentes reductores preferibles son sulfato de hidrazina y ácido ascórbico.
Los procesos antes mencionados comprenden las etapas esenciales para llevar a cabo la invención; en lo sucesivo, se describe un proceso más detallado, que comprende además, etapas intermedias no esenciales. En la etapa (a) se disuelve un ion de plata, utilizando la cantidad necesaria para obtener la concentración deseada de plata en el producto final. Una vez disuelto, el óxido de plata se precipita añadiendo un agente basificante adecuado, tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, en una cantidad adecuada determinada por el experto en la técnica, hasta que no se observe más precipitación. Dicho precipitado se redisuelve añadiendo amoníaco, para obtener una solución clara de un complejo de plata amoniacal. A continuación, en la etapa b), esta solución se añade al soporte inerte en polvo, en un reactor, a temperatura ambiente y bajo agitación, y se mantuvo en agitación durante varias horas. La cantidad de soporte inerte se calcula en función de la cantidad de plata que se va a soportar. Luego, en la etapa a) se añade el agente reductor, para reducir la plata iónica (depositada sobre el soporte inerte) a plata metálica. Dicho agente reductor puede ser un compuesto reductor, o una mezcla de compuestos reductores, según el Estado de la técnica. Finalmente, se elimina la mayor cantidad de agua posible del sólido obtenido, por ejemplo por centrifugación o filtrado. Posteriormente, el producto se seca a una temperatura algo superior a la temperatura ambiente en un dispositivo de secado adecuado.
En lo sucesivo, la presente invención se describirá incluso con más detalle basándose en ejemplos; no obstante, en ningún caso el alcance de la presente invención debe limitarse a los ejemplos.
Ejemplos
EJEMPLO 1: Antibiogramas de penicilina G sola y en combinación con nanopartículas de plata soportadas en caolín
En el ejemplo 1 se probó la actividad antimicrobiana contra bacterias gramnegativas de penicilina G sola y penicilina G en combinación con nanopartículas de plata soportadas en caolín, mediante antibiogramas. Para dichas pruebas se han utilizado diversas cepas de especies bacterianas Gramnegativas. Se seleccionaron tanto cepas de referencia (ATCC) como cepas con alguna resistencia o mutación (por ejemplo, productoras de betalactamasas, resistentes a vancomicina). Las cepas utilizadas se enumeran a continuación en la Tabla 1:
Tabla 1. Lista características de las ce as Gramne ativas
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continuación
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De los cultivos de stock, que se mantuvieron a -80 ± 5 °C, revitalización de las cepas (TSB, TSA y cultivos de agar sangre, se realizó incubación a 37 °C, 24 h) y preparación de cultivos de trabajo (mantenimiento a 5 °C ± 3 °C).
El estudio de la actividad microbiana de los productos se realizó por el método de difusión en agar (antibiogramas). Se realizaron experimentos preliminares para ajustar la concentración de cada cepa para obtener un campo homogéneo y seleccionar el medio de cultivo adecuado (en este caso, agar Mueller Hinton). Siempre que fue posible, se utilizaron placas de Petri grandes (135 mm de diámetro), pero cuando el halo era demasiado grande, se utilizaron varios platos de 90 mm de diámetro para ensayar todos los productos. El procedimiento fue el siguiente:
- Preparación de cultivos frescos de cada una de las cepas en agar (37 °C, 24 h).
- Transferir a caldo BHI (37 °C, 24 h) y ajustar el inóculo, y realizar diluciones seriadas en caldo Mueller Hinton. Adición de 1-2 ml de la dilución correspondiente a placas Petri estériles (según tamaño) y posterior vertido de agar Mueller Hinton, templado a 45 °C. Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente y luego practicar pocillos en los que se colocarán los productos a ensayar.
- Preparar las sustancias de ensayo en la concentración adecuada (suspensión de 1 mg/ml en agua estéril y diluciones seriadas). Colocar 50 |jl de la concentración elegida en cada pocillo (se hizo un estudio previo para determinar qué concentración proporcionaba los halos más adecuados en cada cepa). Como control positivo, se utilizó penicilina G (a la misma concentración).
- Incubación de las placas a 37 ± 1 °C durante 24 horas. Luego se midieron los halos de inhibición observados en cada pocillo y se reunieron en la Tabla 2 a continuación.
La Tabla 2 a continuación muestra los halos de inhibición observados para cada una de las cepas (la concentración del producto utilizado se indica entre paréntesis, como en el caso de las cepas resistentes se tuvo que usar una concentración más alta).
T l 2. H l inhi i i n mm l r r r ri r mn iv
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EJEMPLO 2: Antibiogramas de penicilina G sola y penicilina G con nanopartículas de plata soportadas sobre ella (según la invención)
En el ejemplo 2 se probó la actividad antimicrobiana contra bacterias gramnegativas de penicilina G sola y penicilina G con nanopartículas de plata soportadas, mediante antibiogramas. Se utilizaron varias cepas de especies bacterianas Gramnegativas. Se seleccionaron tanto las cepas de referencia (ATCC) como las cepas que tienen alguna resistencia o mutación (por ejemplo, productoras de betalactamasas, resistentes a vancomicina). Véase la Tabla 3 a continuación:
T l . Li r rí i l r mn iv iliz n l m l
Figure imgf000011_0001
De los cultivos de stock, que se mantuvieron a -80 ± 5 °C, revitalización de las cepas (TSB, TSA y cultivos de agar sangre, se realizó incubación a 37 °C, 24 h) y preparación de cultivos de trabajo (mantenimiento a 5 °C ± 3 °C).
El estudio de la actividad microbiana de los productos se realizó por el método de difusión en agar (antibiogramas). Se realizaron experimentos preliminares para ajustar la concentración de cada cepa para obtener un campo homogéneo y se seleccionó el medio de cultivo adecuado (en este caso, agar Mueller Hinton). Siempre que fue posible, se utilizaron placas de Petri grandes (diámetro de 135 mm), pero cuando el halo era demasiado grande, se utilizaron varios platos de 90 mm de diámetro para ensayar todos los productos. El procedimiento fue el siguiente:
- Preparación de cultivos frescos de cada una de las cepas en agar (37 °C, 24 h).
- Transferir a caldo BHI (37 °C, 24 h) y ajustar el inóculo, realizando diluciones seriadas en caldo Mueller Hinton. Adición de 1-2 ml de la dilución correspondiente a placas Petri estériles (según tamaño) y posterior vertido de agar Mueller Hinton, templado a 45 °C. Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente y luego practicar pocillos en los que se colocarán los productos a ensayar.
- Preparar las sustancias de ensayo en la concentración adecuada (suspensión de 1 mg/ml en agua estéril y diluciones seriadas). Colocar 50 |j¡ de la concentración elegida en cada pocillo (se hizo un estudio previo para ver qué concentración proporcionaba los halos más adecuados en cada cepa). Como control positivo se utilizó Penicilina G (a la misma concentración).
- Incubación de las placas a 37 ± 1 °C durante 24 horas. Luego se midieron los halos de inhibición observados en cada pocillo y se reunieron en la Tabla 4 a continuación.
La Tabla 4 a continuación muestra los halos de inhibición observados para cada una de las cepas (la concentración del producto utilizado se indica entre paréntesis, como en el caso de las cepas resistentes se tuvo que usar una concentración más alta).
T l 4. H l inhi i i n mm l r r r ri r mn iv
Figure imgf000011_0002
continuación
Figure imgf000012_0001
EJEMPLO 3: Determinación de CIM y CBM para Colargol (plata coloidal)
En el Ejemplo 3 se determinaron los valores de CIM (Concentración Inhibitoria Mínima) y CBM (Concentración Bactericida Mínima) de Colargol (plata coloidal) tanto para cepas Grampositivas como Gramnegativas, utilizando la técnica de la placa de microdilución.
CIM: concentración mínima que inhibe el crecimiento de microorganismos (ausencia de turbidez)
CBM: concentración mínima que destruye el 99,9 % de la población microbiana inicial (requiere contar la población superviviente y compararla con la concentración inicial de microorganismos)
Se han utilizado cepas de microorganismos Grampositivos y Gramnegativos, que presentan varios tipos de resistencia, así como cepas de referencia (ATCC), con fenotipos no resistentes. Las especies incluidas en las pruebas se indican en la Tabla 5 a continuación:
Tabla 5. Lista características de las ce as Gramne ativas utilizadas en el estudio
Figure imgf000012_0002
continuación
Figure imgf000013_0001
A continuación se proporcionan algunos detalles adicionales sobre las cepas:
- Pseudomonas aeruginosa resistente a los B-lactámicos:
Se usaron 5 cepas de Ps aeruginosa, incluyendo una cepa de referencia que tiene un fenotipo de tipo salvaje (no resistente) y 4 mutantes derivados de la misma, que son resistentes a los antibióticos B-lactámicos por diferentes mecanismos (sobreexpresión de la bomba de expulsión, deficiencia en porinas, producción de metalo B-lactamasas, etc.).
Se realizó un estudio de sensibilidad antibiótica por el método Vitek, obteniendo los siguientes perfiles:
PAO1: sensible a la mayoría de los antibióticos probados
PAOD1: resistente a carbapenem (impermeabilidad)
PAOAmexZ:Gm: resistencia adquirida a la penicilinasa resistencia a los carbapenémicos
PAOlADacB: resistencia a B-lactámicos de alto nivel
PAO1 pUCP24/VIM2: productor de carbapenemasas (metalo-U OXA)
- E. coli y Klebsiella pneumoniae resistentes a cefalosporinas:
Se utilizaron 2 cepas de Enterobacteriaceae productoras de B-lactamasas de espectro extendido (BLEE).
- Staphylococcus aureus resistente a meticilina:
Se usaron 2 cepas de S. aureus de referencia (ATCC), resistente a la meticilina. Uno también tiene resistencia intermedia a vancomicina.
Se realizó la revitalización de las cepas (cultivos en TSB y TSA, incubación a 37 °C, 24 h), se verificaron sus características (pruebas bioquímicas y de sensibilidad antibiótica por el método automatizado Vitek), y se prepararon los cultivos de trabajo (mantenimiento ± 3 °C a 5 °C) y cultivos madre (-80 ± 5 °C mantenimiento).
El procedimiento para determinar la CIM y la CBM de Colargol (plata coloidal) fue el siguiente:
- Preparación de cultivos frescos de cada una de las cepas en agar TSA (37 °C, 24 h).
- Transferir a caldo BHI (infusión cerebro corazón) (37 °C, 24 h) y ajustar el inóculo en un espectrofotómetro a 600 nm, para obtener una concentración de aproximadamente 1,0 x 108 UFC/ml. Del inóculo ajustado, se preparó una dilución 1/100 y se determinó la concentración inicial de cada microorganismo por conteo en placa (diluciones seriadas y siembra por duplicado en agar TSA).
- Preparación de placas de microtitulación estériles de 96 pocillos con cada una de las cepas (ensayos por triplicado para cada una de las condiciones ensayadas; cuando se obtuvieron diferencias de más de un pocillo de las tres repeticiones, se repitió el ensayo). A cada pocillo (excepto el control negativo) 0,1 ml del inóculo preparado (concentración inicial en cada pocillo alrededor de 1,0 x 105 UFC/ml) se añadió:
• Colargol 70 %: diluciones dobles en caldo Mueller Hinton (490 ppm a 0,12 ppm o mg/ml) microorganismo • Control positivo: Microorganismo caldo de Mueller Hinton
• Control negativo: solo caldo Mueller Hinton
- Incubación de las placas (37 °C, 24 h) y determinación de la CIM por observación de la turbidez (concentración mínima a la que no se observa crecimiento).
- Con el fin de determinar la CBM, la siembra se realizó en agar TSA de cada uno de los pocillos (5-6 diluciones).
Después de incubar a 37 °C durante 24 h y contar las UFC (expresadas en UFC/ml), se determinó la concentración que destruye el 99,9 % de la población (en comparación con el recuento inicial de cada microorganismo).
La Tabla 6 a continuación muestra el valor promedio obtenido en las tres réplicas por cepa y condición.
Tabla 6. Lista características de las ce as Gramne ativas utilizadas en el estudio
Figure imgf000014_0001
Ejemplo 4: Estudio de interacción plata-antibióticos
Se ensayó el efecto de concentraciones subinhibitorias de plata coloidal (es decir, diluciones 1/2 y 1/10 de la CIM obtenida en el Ejemplo 3) en presencia de diferentes tipos de antibióticos.
Para ello, se utilizó un equipo automatizado MicroScan AutoScan 4 (Siemens), utilizando tarjetas Gramnegativas (Becman Coulter NM37) y Gram positivas (Becman Coulter PM28). Los antibióticos analizados se muestran en la Tabla 7.
El procedimiento fue el siguiente:
Se realizaron pruebas por triplicado con inóculos preparados en diferentes días:
- Preparación de cultivos frescos de cada una de las cepas en agar TSA (37 °C, 24 h).
- Preparación de 3 frascos de prompt system-D (Beckman Coulter) para cada cepa:
• Control sin plata
• Plata a 1/2 CIM
• Plata a 1/10 CIM
- Inoculación de los frascos con lancetas estériles para obtener una concentración equivalente a 0,5 McFarland. Cada uno de estos caldos sirvió como inóculo para las tarjetas con antibióticos (para cada cepa se prepararon 3 tarjetas).
- Incubación de las placas con antibióticos (en presencia y ausencia de plata) a 37 °C durante 24 h.
- Lectura de las tarjetas mediante el uso del software LabPro, e interpretación de los valores obtenidos de CIM (determinar si la plata reduce la CIM inicial de cada antibiótico).
Tabla 7. Lista de antibióticos utilizados en e ui os MicroScan
Figure imgf000015_0001
continuación
Figure imgf000016_0001
Efecto contra bacterias Gramnegativas
En general se observa que en el caso de las cepas ATCC de referencia, el efecto de la plata es moderado, solo algo de CIM mejora en 1 o 2 diluciones. Sin embargo, se observa que la plata tiene un efecto positivo en las cepas con fenotipo resistente, logrando un cambio de un perfil resistente (o intermedio) a un perfil sensible frente a varios antibióticos. El efecto se observa con la mayor concentración de plata (dilución de 1/2 CIM), aunque en algunos casos también se observa en presencia de concentración 1/10 CIM.
Los resultados obtenidos se detallan a continuación:
- Pseudomonas VIM2 mutante (productora de metalo-p-lactamasa):
sensibilidad a las penicilinas (Piperacilina y Mezlocilina), cefalosporinas (Cefepima), inhibidores de la p-lactamasa (Amp/sulbac y Piperacilina/tazobactam), Carbapenémicos (meropenem e imipenem) y Fosfomicina.
- Pseudomonas OrpD Mutante (deficiente en porina):
en este caso, la concentración de plata 1/10 CIM logró sensibilidad a las penicilinas (mezlocilina y piperacilina) y a los inhibidores de la p-lactamasa (piperacilina/tazobactam). Por otro lado, en presencia de 1/2 CIM de concentración de plata, se logró sensibilidad frente a las cefalosporinas (ceftazidima, cefepima), monobactámicos (aztreonam) y fosfomicina.
- Pseudomonas MexR Mutante (sobreexpresión de la bomba de expulsión):
en presencia de plata a una concentración de 1/2 CMI, se observa sensibilidad a fosfomicina, y mejora de la CIM de cefotaxima, amp/sulbac y colistina.
- Pseudomonas DacB mutante (hiperproductor de AMPC):
la plata tiene un efecto positivo, logrando un cambio a sensible a fosfomicina y aztreonam, y un efecto moderado mejorando los valores de CIM para piperacilina, cefepima, piperacilina/tazobactam y colistina.
- E. coli BLEE +:
la cepa se vuelve sensible a penicilinas y cefalosporinas, inhibidores de betalactamasas (Amp/sulbac), aminoglucósidos (gentamicina y tobramicina), quinolonas, tetraciclina y trim/sulfa.
- Klebsiella BLEE +:
la cepa se vuelve sensible a las penicilinas, la mayoría de las cefalosporinas, al aztreonam, Amp/sulbac, quinolonas, tetraciclina y trim/sulfa.
Por lo tanto, la plata mejora la acción de los antibióticos con los que se combina, sobre bacterias que presentan resistencia a los antibióticos.
Efecto contra bacterias Grampositivas
Se observa una sensibilidad mejorada hacia las quinolonas (incluida la vancomicina). En el caso de, por ejemplo, la cepa SA700698, se observa que la plata también favorece la acción de los carbapenémicos.
EJEMPLO 5: Evaluación de la presencia de un efecto aditivo o sinergia para Collargol en combinación con antibióticos mediante epsilometría E-test
Se realizó un E-test de epsilometría para determinar la presencia de un efecto aditivo o sinérgico de Collargol en combinación con antibióticos. Se usaron cepas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis de origen clínico, presentando una CIM elevada a vancomicina (>1,5 mg/ml). (Tabla 1).
Tabla 8. Lista características de las ce as Gramne ativas utilizadas en el estudio
Figure imgf000017_0002
Para evaluar la sinergia de collargol-antibióticos se realizó una prueba E de epsilometría. Dicha prueba se basa en el método de difusión en agar y consiste en utilizar una tira con un gradiente constante predefinido de 15 concentraciones del antibiótico ensayado. Después del crecimiento de la cepa, un halo elíptico de inhibición, siendo la CIM la concentración de antibiótico correspondiente al punto de corte.
Se realizó para los antibióticos vancomicina, linezolid y tedizolid, en ausencia y presencia de plata (1/2 y 1/10 CIM). El procedimiento fue el siguiente:
- Preparación de cultivos frescos de cada una de las cepas en agar sangre (37 °C, 24 h).
- Preparación de placas de agar Mueller-Hinton (MH), sin plata y suplementado con 1/2 y 1/10 CIM (MH-1/2; MH-1/10), determinado para cada cepa en ensayos previos (3 placas de cada tipo por cepa).
- Preparar para cada una de las cepas una suspensión 0,5 McFarland (frascos de inoculación Promp system-D) y extender el inóculo sobre la superficie de las placas de agar MH.
- Colocar las tiras de E-test e incubar a 37 °C, 24 h.
- Determinar la CIM de cada antibiótico en presencia y ausencia de plata, según el punto de corte en el halo elíptico obtenido.
La Tabla 9 a continuación muestra el valor CIM (punto de corte) obtenido en las tres placas MH por cepa y antibiótico. Tabl . V l r IM ni n l n E- n n i r n i l 12 11 IM l rgol)
Figure imgf000017_0001
NP: No realizado
Las áreas sombreadas en gris muestran las cepas para las que se observó una CIM reducida en presencia de plata. En la mayoría de las cepas se observó una disminución de la CIM en presencia de plata (1/2 CIM). Se seleccionaron aquellas cepas que mostraron una marcada disminución de la CIM frente a vancomicina y algo moderada en comparación con otros antibióticos. Por lo tanto, las cepas 3, 9, 10, 11 y 14 (marcadas en negrita y cursiva) fueron seleccionadas para el estudio de sinergia Checkerboard.
Para determinar la existencia de actividad sinérgica entre el collargol y la vancomicina, se usó una prueba de tablero de ajedrez utilizando placas que tienen un fondo en forma de "U" (TPP) de 96 pocillos. Se prepararon diluciones seriales subinhibitorias dobles de los dos antimicrobianos, de modo que la concentración de collargol disminuyó verticalmente (arriba-abajo) y la concentración de vancomicina disminuyó horizontalmente (izquierda - derecha). Véase la Tabla 10 a continuación.
Figure imgf000018_0001
Para cuantificar la actividad sinérgica de los dos compuestos combinados, se usó el parámetro Índice de concentración inhibidora fraccional (IFIC). Este índice relaciona la CIM del antimicrobiano 1 con el antimicrobiano 2 solo y en combinación, según la siguiente fórmula:
CIM (antimicrobiano 1 en la combinación) CIM (antimicrobiano 2 en la combinación)
IFIC =
CIM (antimicrobiano 1) + CIM (antimicrobiano 2)
Se considera que hay efecto sinérgico si el valor IFIC es <0,5. Otros posibles resultados son:
0,5 <IFIC<1: efecto aditivo
IFIC= 1: sin efecto
IFIC > 1: antagonismo
El procedimiento fue el siguiente:
- Preparación de cultivos frescos de cada una de las cepas en agar sangre (37 °C, 24 h). Preparar el inóculo, suspensión de colonias en caldo MH, hasta obtener una DO600nm de 0,085 (dilución 1/50 de la suspensión). - Preparar soluciones de collargol y vancomicina, considerando la CIM obtenida para cada cepa evaluada.
- Preparar los pocillos de la siguiente manera:
• Filas AF: Preparar diluciones dobles de collargol en MH, a partir del CMI (hasta la columna 10 inclusive). • Columnas 1 a 10: añadir las diluciones dobles preparadas de vancomicina, comenzando desde el CMI (hasta e incluyendo la fila F).
• Controles: Solo collargol de la fila G (control CIM); Fila H vancomicina solamente (control CIM); columna 11 control de crecimiento positivo MH inóculo); columna 12 control negativo (MH);
- Añadir el inóculo preparado a cada pocillo (excepto columna de control negativo) e incubar las placas a 37 °C durante 20-24 h.
- Determinar para cada producto, solo o combinado, la CIM (concentración más baja en la que no se observa crecimiento) y calcule la IFIC para cada fila (último pocillo en el que no se observa crecimiento). Se elige el pocillo donde se obtiene el valor mínimo de IFIC.
En la anterior Tabla 10, las celdas sombreadas representan pocillos en los que se observó crecimiento.
Los resultados obtenidos para cada cepa se muestran en la Tabla 11 a continuación. En la mayoría de las celdas se observó un efecto aditivo, y algunas están en el límite de la sinergia (IIFIC= 0.5)
Figure imgf000019_0001
EJEMPLO 6: Caracterización estructural de caolín soportado con nanopartículas de plata
En cuanto a la caracterización de la plata soportada sobre caolín, se ha realizado un análisis del tamaño de partícula de los mismos por absorción de rayos X, y se han obtenido imágenes por microscopia electrónica de barrido por emisión de campo (FESEM), para conocer la morfología del caolín, así como la forma en que se deposita la plata sobre los mismos.
La figura 1 comprende imágenes en las que se observan nanopartículas de plata esferoidal sobre la estructura laminar de micropartículas de caolín.
Por análisis EDX, se ha identificado plata en dichas nanopartículas, teniendo un tamaño de alrededor de 30 nm.
La Figura 1 representa la imagen FESEM del caolín:
La figura 1(a) muestra micropartículas de caolín con nanopartículas de plata depositadas sobre ellas (x8870). La Figura 1 (b) muestra a x20380 el área resaltada en la Figura 1 (a).
La Figura 1 (c.1) muestra en x66000 el área (c) resaltada en la Figura 1 (b). Las nanopartículas de plata se pueden apreciar claramente en la superficie de la estructura laminar del caolín.
Las nanopartículas de plata (color blanco) se pueden apreciar aún más en la Figura 1 (c.2) cuando se observan bajo electrones retrodispersados, a diferencia de las áreas que no tienen nanopartículas de plata.
La figura 1(d) muestra a x66000 el área (d) resaltada en la figura 1(b). Se pueden apreciar claramente nanopartículas de plata en los bordes de la estructura laminar del caolín.
La presencia de nanopartículas de plata para las áreas blancas en la Figura 1 (c.2), fue confirmada por espectros EDX.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición, que comprende nanopartículas de plata metálica soportadas en un soporte, estando el soporte en forma de partículas, siendo el soporte un antibiótico.
2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las partículas tienen un diámetro medio de entre 0,1 micrómetros y 200 micrómetros.
3. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en la que el antibiótico se selecciona entre: penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos, inhibidores de beta-lactamasa, carbapenémicos, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas, glicopéptidos o del grupo que comprende colistina, sulfametoxazol/trimetoprima, fosfomicina, nitrofurantoína, cloranfenicol, clindamicina, ácido fusídico, linezolid, mupirocina, daptomicina, clindamicina y rifampicina.
4. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la relación en peso de plata con respecto a la cantidad total de antibióticos está entre 10:100 y 0,1:100.
5. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas de plata metálica está comprendido entre 1 y 100 nanómetros, preferentemente entre 10 y 90 nanómetros, aún más preferentemente, entre 10 y 70 nanómetros, incluso más preferentemente entre 10 y 50 nanómetros y mucho más preferentemente entre 20 y 30 nm.
6. Un nanosistema, que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de una infección causada por al menos una cepa de bacterias resistente al menos a un antibiótico.
7. El nanosistema para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la infección es causada por al menos una cepa de bacterias gramnegativas, resistentes al menos a un antibiótico.
8. Proceso de preparación de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de:
a) preparar una disolución de un ion de plata;
b) añadir dicha disolución de iones de plata a un antibiótico en forma de partículas;
c) añadir un agente reductor a la mezcla obtenida en b), para obtener plata metálica apoyada sobre dicho soporte.
9. Una composición farmacéutica, que comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso como medicamento.
10. Una composición farmacéutica, que comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de una infección.
11. Una composición farmacéutica, que comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso oral en el tratamiento de una infección.
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